8/21/2019 Antimicrobial activity of borate buffer

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V o l . 2 9 , N o . 5N T I M I C R O B I A L AGENTS AND C H E M O T H E R A P Y , May 1 9 8 6 , p . 8 0 3 - 8 0 60 0 6 6 - 4 8 0 4 / 8 6 / 0 5 0 8 0 3 - 0 4 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t D 1 9 8 6 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

A n t i m i c r o b i a l A c t i v i t y o f B o r a t e - B u f f e r e d S o l u t i o n sR . DENNIS HOULSBY,* MINA GHAJAR, AND GUADALUPE CHAVEZ

M i cr o b i o l o g y D e p a r t m e nt , C o o p e r V i s i o n O p h t h a l m i c P r o d u c t s , M o u i n t a i n V i e w , C a l i f o r n i a 9 4 0 3 9R e c e i v e d 2 5 November 1 9 8 5 / A c c e p t e d 3 0 J a n u a r y 1 9 8 6

A m i n i m a l s a l t s medium a d j u s t e d t o p h y s i o l o g i c a l pH a n d o s m o l a l i t y was b u f f e r e d w i t h e i t h e r 0.3p h o s p h a t e o r 1 . 2 b o r a t e a n d e v a l u a t e d f o r a n t i m i c r o b i a l a c t i v i t y . T h e b o r a t e - b u f f e r e d m e d i u m , e i t h e r w i t ho r w i t h o u t a c a r b o n source, e x h i b i t e d s i g n i f i c a n t a n t i m i c r o b i a l a c t i v i t y a g a i n s t 1 5 P s e u d o m o n a s s t r a i n s , 1 2s t r a i n s o f e n t e r i c b a c t e r i a , a n d 7 s t r a i n s o f s t a p h y l o c o c c i . T h e b o r a t e - b u f f e r e d s y s t e m a p p e a r s s u i t a b l e f o r u seas a g e n e r i c v e h i c l e f o r o p h t h a l m i c p h a r ma c e u t i ca l a g e n t s .

I n 1 9 5 8 , K i n g m a s u m m a r i z e d t h e p h a r m a c o l o g y a n d t o x -i c o l o g y o f b o r o n c o m p o u n d s ( 1 0 ) . Known a s s a l s e d a t i v u m ,b o r a t e s w e r e u s e d i n t h e e i g h t e e n t h c e n t u r y t o s o o t h e t h es k i n . E v e n b e f o r e t h i s t i m e , b o r a t e s w e r e u s e d a s c l e a n s i n ga g e n t s a n d b y A r a b p h y s i c i a n s , who u s e d t h e m a s e a r l y a s8 7 5 A . D . f o r i n t e r n a l m e d i c a t i o n .More r e c e n t l y p h y s i c i a n s h a v e u s ed b o r i c a c i d t o p r o d u c eb o t h m i c r o b i o s t a t i c a n d m i c r o b i c i d a l e f f e c t s . B o r i c a c i ds o l u t i o n s h a v e b ee n u s e d t o s o f t e n a n d d r y i r r i t a t e d a n di n f e c t e d t i s s u e s . I n a d d i t i o n , b o r a t e s a t c o n c e n t r a t i o n s o f0 . 7 5 t o 3 h a v e b e e n f o u n d t o e x e r t m a r k e d b a c t e r i o s t a t i ca n d w e a k b a c t e r i c i d a l e f f e c t s when a d d e d t o n u t r i e n t b r o t hc u l t u r e s o f S t a p h y l o c o c c u i s a u - r e u t s , S t a p h y l o c o c c u i s h a e m o -l y t i c u s , a n d E s c h e r i c h i a c o l i ( 1 0 ) . T h e s e f i n d i n g s a g r e e w i t h

a p r e v i o u s s t u d y b y F i s h e r ( 4 ) , w h i c h d e s c r i b e s t h e p r o -n o u n c e d b a c t e r i o s t a t i c a c t i o n o f b o r at e s a t c o n c e n t r a t i o n s o f0 . 2 t o 4 a g a i n s t co m m o n m i c r o b i a l c o n t a m i n a n t s a n dp a t h o g e n s f o u n d i n many m e d i a u s e d i n w e t d r e s s i n g s .M o r e o v e r , S w a t e a n d Weed f o u n d t h a t 4 0 p a t i e n t s w i t hv u l v o v a g i n a l c a n d i d i a s i s r e s p o n d e d w e l l t o t r e a t m e n t s w i t h6 0 0 m g o f b o r i c a c i d i n p e s s a r i e s a n d o i n t m e n t s c o n t a i n i n g5 b o r i c a c i d i n l a n o l i n ( 1 5 ) .D u r i n g t h e l a s t 1 5 y e a r s new u s e s f o r b o r a t e s h a v e b e e nd i s c o v e r e d . F a y i n k a ( 3 ) , P o r t e r a n d B r o d i e ( 1 3 ) , a n d W a t s o na n d D u e r d e n ( 1 6 ) h av e u s e d b o r a t e s t o p r e s e r v e u r i n es a m p l e s f o r 2 4 h b e f o r e c u l t u r i n g . T h e s e a u t h o r s h a v e f o u n dt h a t t h e o p t i m u m b o r i c a c i d c o n c e n t r a t i o n w a s a p p r o x i -m a t e l y 2 f o r u r i n e p r e s e r v a t i o n a t room t e m p e r a t u r e .L o n g e r e x p o s u r e t i m e s o r h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s , e s p e c i a l l ya b o v e 3 , c a n c a u s e r e d u c t i o n s i n g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a .Some t o x i c m a n i f e s t a t i o n s o f b o r a t e u s e h a v e b e e n r e -p o r t e d . M o s t o f t h e s e t o x i c r e a c t i o n s c a n b e t r a c e d t oi n a p p r o p r i a t e u s e o r a c c i d e n t a l i n g e s t i o n . T h e r e v i e w b yK i n g m a i n 1 9 5 8 d e s c r i b e d c a s e s i n w h i c h b o r i c a c i d c o m -p o u n d s w e r e a c c i d e n t a l l y f e d t o c h i l d r e n , g i v e n a s a n t i -e p i l e p t i c r e m e d i e s , g i v e n b y i n j e c t i o n s t h a t r e s u l t e d i n o v e r -d o s e , a n d u s e d f o r w o u n d a n d b l a d d e r i r r i g a t i o n . E x t e r n a lp o i s o n i n g r e s u l t e d f r o m a p p l i c a t i o n t o i n f a n t s w i t h e x t e r n a la r e a s o f a t o p i c e c z e m a , t o p a t i e n t s w i t h l a r g e a r e a s o f b u r n e ds k i n , a n d t o a d u l t s w i t h g e n e r a l i z e d e x u d a t i v e o r e x f o l i a t i v ed e r m a t i t i s . A d d i t i o n a l c a s e s o f a c c i d e n t a l p o i s o n i n g i n i n -f a n t s w e r e r e p o r t e d b y G i n s b u r g ( 6 ) , A d e l h a r d t ( 1 ) ,O ' S u l l i v a n a n d T a y l o r ( 1 1 ) , a n d B o s i o a n d B e r t o n c i n i 2 ) .H o w e v e r , t h e s a f e t y o f b o r i c a c i d i n o r d i n a r y u s e i s s u p -p o r t e d b y a s u r v e y o f d e r m a t o l o g i s t s 4 ) , b y r e c e n t s t u d i e s o fo p h t h a l m i c o i n t m e n t s ( 8 ) , b y d e r m a t o l o g i c u s e o f o i n t m e n t s

* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .

o n n e o n a t e s ( 5 ) , a n d b y t w o p h a r m a c o k i n e t i c s t u d i e s o f o r a l( 1 4 ) a n d i n t r a v e n o u s ( 9 ) a d m i n i s t r a t i o n .T h e p r e s e n t s t u d y e v a l u a t e d t h e a n t i m i c r o b i a l a c t i v i t y o f1 . 2 2 b o r a t e b u f f e r i n a m i n i m a l s a l t s m e d i u m , w i t h a n dw i t h o u t a c a r b o n s o u r c e ( g l u c o s e ) . F o r c o m p a r i s o n , p h o s -p h a t e - b u f f e r e d a n d u n b u f f e r e d m i n i m a l s a l t s m e d i a w e r e a l s oe v a l u a t e d . T h e a n t i m i c r o b i a l a c t i v i t y o f t h e s o l u t i o n s w a se v a l u a t e d a s a f u n c t i o n o f t h e l o g c h a n g e i n v i a b l e c e l l c o u n to v e r 2 8 d a y s . T h e s i g n i f i c a n c e o f t h e r e s u l t s a s t h e y r e l a t e t ot h e p r e s e r v a t i v e e f f e c t i v e n e s s t e s t d e s c r i b e d b y t h e U n i t e dS t a t e s P h a r m a c o p e i a ( U S P X X I ) a n d t h e i r a p p l i c a t i o n t oo p h t h a l m i c p h a r m a c e u t i c a l s i s d i s c u s s e d .

MATERIALS A N D M E THODSM i c o o r g a n i s m s . T h e m i c r o o r g a n i s m s t h a t w e r e t e s t e d a r el i s t e d i n T a b l e s 1 t o 4 . T h e y w e r e o b t a i n e d f r o m s e v e r a ld i f f e r e n t s o u r c e s , i n c l u d i n g c l i n i c a l , e n v i r o n m e n t a l , a n dp r o d u c t i s o l a t e s .D e f i n e d m e d i a . M i n i m a l m e d i a u s e d w i t h t h e P s e u d o m o -n a s s t r a i n s c o n t a i n e d 0 . 0 4 ( N H 4 ) 2 S O 4 a n d 0 . 0 5 M g S O 4 ,e i t h e r u n b u f f e r e d , b u f f e r e d w i t h 0 . 1 0 KH2PO4 7 H 2 0 a n d0 . 0 2 N a 2 H P O 4 , o r b u f f e r e d w i t h 1 . 0 0 b o r i c a c i d a n d0 . 2 2 N a 2 B 4 0 7 1 0 H 2 0 . T h e m i n i m a l m e d i u m f o r t h ee n t e r i c b a c t e r i a a n d s t a p h y l o c o c c i c o n t a i n e d 0 . 0 4( N H 4 ) 2 S O 4 , 0 . 0 2 MgSO4 7 H 2 O , 0 . 0 2 C a C 1 2 2 H 2 0 ,0 . 0 0 2 5 Na,MoO4 2 H 2 0 , a n d 1 . 0 0 v i t a m i n s o l u t i o n . T h ev i t a m i n s o l u t i o n wa s p r e p a r e d s e p a r a t e l y a t 1 0 O x c o n c e n -t r a t i o n a n d f i l t e r s t e r i l i z e d . T h e f i n a l c o n c e n t r a t i o n s w e r e0 . 0 0 0 5 c a l c i u m p a n t o t h e n a t e , 0 . 0 0 0 1 t h i a m i n e h y d r o -c h l o r i d e , 0 . 0 0 0 1 p y r i d o x i n e h y d r o c h l o r i d e , 0 . 0 0 0 1 b i o -t i n , a n d 0 . 0 0 0 1 n i c o t i n i c a c i d .E a c h s o l u t i o n wa s made i s o t o n i c w i t h 0 . 9 N a C l b yc a l c u l a t i n g t h e s a l t e q u i v a l e n t o f e a c h i n g r e d i e n t a n d a d d i n gt h e a p p r o p r i a t e amount o f N a C l . T h e pH o f e a c h s o l u t i o nw a s a d j u s t e d t o 7 . 0 0 0 . 2 w i t h h y d r o c h l o r i d e o r KOH. T h e

g l u c o s e , M g S O 4 , C a C l 2 , a n d NaMoO4 w e r e a u t o cl a v ed s e p -a r a t e l y a t 1 0 O x c o n c e n t r a t i o n a n d t h e n a s e p t i c a l l y t r a n s -f e r r e d t o t h e m i n i m a l m e d i a .T h e m i c r o o r g a n i s m s w e r e t r a n s f e r r e d f r o m n u t r i e n t b r o t ht o t h e d e f i n e d m i n i m a l medium c o n t a i n i n g p h o s p h a t e a n dg l u c o s e . A f t e r t h e m i c r o o r g a n i s m s a d a p t e d a n d b e g a n g r o w -i n g i n t h e m i n i m a l m e d i u m , a s e c o n d 2 4 - h c u l t u r e was u s e df o r e a c h e x p e r i m e n t . T h e r e s p e c t i v e c u l t u r e s w e r e h a r v e s t e db y c e n t r i f u g a t i o n , w a s h e d t h r e e t i m e s i n d i s t i l l e d w a t e r , a n ds t a n d a r d i z e d a t A 5 0 0 t o g i v e a p p r o x i m a t e l y 1 0 6 C F U / m l .T h e s t a p h y l o c o c c i w e r e u n a b l e t o g r o w i n t h e m i n i m a lmedium w i t h o u t t h e a d d i t i o n o f a m i n o a c i d s . T h e y w e r et h e r e f o r e h a r v e s t e d d i r e c t l y f r o m t h e t r y p t i c s o y b r o t h ,w a s h e d t h r e e t i m e s i n d i s t i l l e d w a t e r , a n d s t a n d a r d i z e d b y8 0 3

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A N T I M I C R O B . AGENTS C H E M O T H E R .

0 . 4 0

0 . 3 0

o 0

D H i l - l CL W - 5 2 1 7 81 5 4 4 2D H 9 - 1 6S U H 5 1 2 7 8D H 8 - 1 1 XH - 2 3 7 7 89 0 2 7M 8 - ED H 8 - 9 2c e p a c i a M 8 - FD H 9 - 1 9D H 1 1 - 71 9 4 2 9s t u t z e r iS M C 9 2 4 8 2

0 . 1 0

2 4 6 8 0 1 0 0I n c u b a t i o n T i m e ( H o u r s )

F I G . 1 . G r o w t h response o f P s e u d o m o n a s s t r a i n s i n m i n i m a ls a l t s m e d i u m c o n t a i n i n g p h o s p h a t e a n d g l u c o s e a t 3 2 t o 3 4 C . P .a e r u g i n o s a s t r a i n s d e s i g n a t e d b y n u m b e r o n l y .o p t i c a l d e n s i t y measurements t o g i v e a p p r o x i m a t e l y 1 0 6CFU/ml o f s a m p l e . From 0 . 1 t o 0 . 5 m l o f t h e s t a n d a r d i z e ds u s p e n s i o n was t h e n a d d e d t o e a c h 1 0 0 - m l p o r t i o n o f m i n i -m a l m e d i u m . T h e medium was i n c u b a t e d a t 3 2 t o 3 4 C f o r 2 8d a y s . A p p r o p r i a t e d i l u t i o n s o f e a c h medium w e r e s u b c u l -t u r e d i n pou r p l a t e s o f n u t r i e n t agar a t v a r i o u s t i m e s f o r 2 8d a y s . G r o w t h o r s u r v i v a l i n e a c h m i n i m a l medium wase v a l u a t e d b y t h e c h a n g e i n v i a b l e c e l l c o u n t .

RESULTST h e P s e u d o m o n a s s t r a i n s a n d e n t e r i c b a c t e r i a g r e w w e l li n t h e m i n i m a l s a l t s m e d i a c o n t a i n i n g p h o s p h a t e a n d g l u c o s e .T h e i r g r o w t h response d u r i n g t h e f i r s t 1 0 0 h o f i n c u b a t i o n i sg i v e n i n F i g . 1 a n d 2 . T h e g r o w t h response o f t h e s t a p h y l o -c o c c i c o u l d n o t b e m e a s u r e d b e c a u s e o f t h e i r r e q u i r e m e n t o fa m i n o a c i d s u p p l e m e n t s . T h e s e s u p p l e m e n t s w e r e p u r p o s e l yo m i t t e d so as n o t t o i n t e r f e r e w i t h t h e e x p e r i m e n t . T h u s , t h e

m i n i m a l s a l t s medium s e r v e d m e r e l y t o m a i n t a i n t h e s t a p h -y l o c o c c i .The g r o w t h response o f 1 3 s t r a i n s o f P s e u d o m o n a s ae r u-g i n o s a was e v a l u a t e d b y l o g d i f f e r e n c e i n C F U pe r m i l l i l i t e ro v e r 2 8 d a y s ( T a b l e 1 ) . T h e 2 8 - d a y i n t e r v a l was c h o s e n i na c c o r d a n c e w i t h t h e i n d u s t r i a l s t a n d a r d f o r p r e s e r v a t i v ee v a l u a t i o n d e s c r i b e d b y US P X X I . P . a e r u g i n o s a i n c r e a s e di t s g r o w t h b y a n a v e ra g e o f 3 . 1 l o g s i n t h e medium c o n t a i n i n gp h o s p h a t e a n d g l u c o s e . T h e pre s en c e o f p h o s p h a t e a l o n er e s u l t e d i n a s l i g h t i n c r e a s e o f 0 . 6 l o g , s i m i l a r t o t h e s l i g h ti n c r e a s e o b s e r v e d i n t h e m i n i m a l medium a l o n e or whenc o m b i n e d w i t h g l u c o s e . P . a e r u g i n o s a appears t o r e q u i r eb o t h a s ou rc e o f c a r b o n a n d p h o s p h a t e t o p r o l i f e r a t e i n t h em i n i m a l s a l t s m e d i u m . W h en t h e p h o s p h a t e b u f f e r i s r e -p l a c e d w i t h a b o r a t e b u f f e r , t h e Pseudomonas s t r a i n s d i e

0 . 4 0

S . e n t e r i t i d i sE cloacae

0 . 3 0S . marcescensS marcescens

E . c o l i35}. 2 0 . |

S . m a r c e s c e n sS . m a r c e s c e n sP vulgaris

E hafniae 1 E colil

0 . 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0I nc u b a t i o n T i me ( H o u r s )

F I G . 2 . G r o w t h response o f e n t e r i c b a c t e r i a i n m i n i m a l s a l t sm e d i u m c o n t a i n i n g p h o s p h a t e a n d g l u c o s e a t 3 2 t o 3 4 0 C .

s l o w l y . M o r e o v e r , w i t h t h e a d d i t i o n o f a c a r b o n sou rce,g l u c o s e , t o t h e b o r a t e - b u f f e r e d m i n i m a l m e d i u m , t h e b ac t e -r i a ar e r e d u c e d a n average o f 5 . 0 l o g s i n 2 8 d a y s . T h i sr e d u c t i o n w a s i n m a r k e d c o n t r a s t t o an average r e d u c t i o n o f

T A B L E 1 . G r o w t h r e sp o n se o f P . a e r u g i n o s a s t r a i n s i np h o s p h a t e - a n d b o r a t e - b u f f e r e d m e d i a aG r o w t h d i f f e r e n t i a l

P . a e r u g i n o s a P h o s p h a t e B o r a t es t r a i n P h o s p h a t e b u f f e r B o r a t e b u f f e r No G l u c o s eb u f f e r p l u s b u f f e r p l u s a d d i t i v e s o n l yg l u c o s e g l u c o s e9 0 2 7 0 . 4 3 . 0 - 0 . 6 - 4 . 0 0 . 2 0 . 31 5 4 4 2 0 . 4 2 . 7 - 0 . 4 - 3 . 5 0 . 0 1 . 5S U H - 5 1 2 7 8 1 . 4 4 . 3 - 5 . 0 - 5 . 0 1 . 1 1 . 7H - 2 3 7 7 8 0 . 9 3 . 4 - 5 . 4 - 5 . 4 1 . 2 2 . 2M 8 - E 0 . 2 3 . 2 - 1 . 0 - 5 . 9 - 0 . 2 0 . 6L W - 5 2 1 7 8 0 . 4 3 . 4 - 0 . 5 - 5 . 8 - 0 . 2 0 . 8D H 9 - 1 9 1 . 1 - 5 . 6 c - 2 . 0 - 5 . 6 0 . 1 - 1 . 3DH8-11X 0 . 1 2 . 5 - 4 . 2 - 4 . 2 0 . 6 1 . 5D H 1 1 - 1 C - 0 . 1 2 . 3 - 1 . 0 - 4 . 9 0 . 1 0 . 1D H 9 - 1 6 0 . 1 2 . 1 - 0 . 5 - 6 . 3 0 . 1 - 0 . 1D H 8 - 9 2 2 . 0 3 . 8 - 2 . 4 - 4 . 4 1 . 6 1 . 6D H 1 1 - 7 0 . 7 2 . 9 - 0 . 4 - 4 . 5 0 . 3 0 . 21 9 4 2 9 0 . 7 3 . 1 - 0 . 4 - 5 . 2 0 . 1 0 . 8X 0 . 6 3 . 1 - 1 . 8 - 5 . 0 0 . 4 0 . 8S E M 0 . 2 0 . 9 - 0 . 5 - 1 . 4 0 . 1 0 . 2R e l a t i v e 3 0 2 9 2 8 2 8 2 9 2 8S E M ( )

a B u f f e r s a n d g l u c o s e w e r e a d d e d t o m i n i m a l s a l t s m e d i a ; s t r a i n s w e r eg r o w n 2 8 d a y s a t 3 2 t o 3 4 C .b L o g d i f f e r e n c e s a r e r e p o r t e d i n C F U p e r m i l l i l i t e r o n d ay 2 8 c o m p a r e dw i t h d a y 0 .c D a t a e x c l u d e d f r o m c a l c u l a t i o n s .

8 0 4 HOULSBY E T A L .

8/21/2019 Antimicrobial activity of borate buffer

3/4

ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF BORA T E -B U F F E R ED SO LU TIO N S 8 0 5T ABLE 2 . G r o w t h r e s p o n s e o f P . c e p a c i a a n d P . s t u t z e r i i np h o s p h a t e - a n d b o r a t e - b u f f e r e d m e d i a a

G r o w t h d i f f e r e n t i a l bP s e u d o m o n a s P h o s p h a t e B o r a t es p e c i e s P h o s p h a t e b u f f e r B o r a t e b u f f e r No G l u c o s eb u f f e r p l u s b u f f e r p l u s a d d i t i v e s o n l yg l u c o s e g l u c o s eP . c e p a c i a - 1 . 0 2 . 1 - 2 . 3 - 2 . 5 - 2 . 5 - 2 . 7P . s t u t z e r i 1 . 0 2 . 6 - 5 . 3 - 5 . 3 - 5 . 3 - 5 . 3

a B u f f e r s a n d g l u c o s e w e r e a d d e d t o m i n i m a l s a l t s m e d i a ; b a c t e r i a w e r eg r o w n 2 8 d a y s a t 3 2 t o 3 4 Cb L o g d i f f e r e n c e s a r e r e p o r t e d i n C F U p e r m i l l i l i t e r o n d a y 2 8 c o m p a r e dw i t h d a y 0 .

1 . 8 l o g s o v e r t h a t t i m e i n t h e a b s e n c e o f t h e g l u c o s e . T h es u b s t r a t e - a c c e l e r a t e d d e a t h ( 1 2 ) w a s o b s e r v e d f o r e a c hs t r a i n o f P . a e r u g i n o s a e x p o s e d t o t h e b o r a t e b u f f e r . How-e v e r , t h e a d d i t i o n o f g l u c o s e d i d n o t i n c r e a s e t h e d e a t h r a t eo f Pseudomonas c e p a c i a o r Pseudomonas s t u t z e r i ( T a b l e 2 ) .T h e 1 2 s t r a i n s o f e n t e r i c b a c t e r i a w e r e m o r e s u s c e p t i b l e t ot h e p r e s e n c e o f b o r a t e s t h a n w e r e t h e o t h e r b a c t e r i a ( T a b l e3 ) . T h e y s h o w e d a n a ve r a g e d e c r e a s e o f 5 . 1 t o 5 . 4 l o g s a f t e r2 8 d a y s i n t h e b o r a t e - b u f f e r e d m i n i m a l m e d i u m . A l t h o u g ht h e e f f e c t o f g l u c o s e c o u l d n o t b e o b s e r v ed a f t e r 2 8 d a y s o fe x p o s u r e , t h e i n t e r m i t t e n t r e c o v e r i e s o f t h e e n t e r i c b a c t e r i ar e v e a l e d t h a t s u b s t r a t e - a c c e l e r a t e d d e a t h d i d o c c u r . E n t e r i cb a c t e r i a i n t h e u n b u f f e r e d m e d i u m a l s o a p p e a r e d t o d i e m o r er a p i d l y w h e n g l u c o s e w a s p r e s e n t , a s s h o w n b y a m e a nd e cr e as e o f 4 . 1 l o g s i n t h e p r e s e n c e o f g l u c o s e , i n c o n t r a s t t oa mean i n c r e a s e o f 0 . 3 1 l o g i n t h e a b s e n c e o f g l u c o s e . T h ep h o s p h a t e - b u f f e r e d m i n i m a l m e d i u m p r o v i d e d t h e s a m e d e -g r e e o f s u r v i v a l , e x c e p t f o r E n t e r o b a c t e r h a f n i a e ( H a f n i a ea l v e i ) , t h a t t h e u n b u f f e r e d m i n i m a l m e d i u m d i d : a f t e r 2 8d a y s , t h e r e wa s a mean i n c r e a s e o f 0 . 3 l o g i n g r o w t h o f

T ABLE 3 . G r o w t h r e s p o n s e o f e n t e r i c b a c t e r i a i n p h o s p h a t e - a n db o r a t e - b u f f e r e d m e d i a aG r o w t h d i f f e r e n t i a l b

E n t e r i c b a c t e r i a P h o s p h a t e B o r a t es p e c i e s P h o s p h a t e b u f f e r B o r a t e b u f f e r No G l u c o s eb u f f e r p l u s b u f f e r p l u s a d d i t i v e s o n l yg l u c o s e g l u c o s eE . c o l i 1 . 9 - 4 . 5 - 4 . 5 - 4 . 5 0 . 2 - 3 . 9E . c o l i 0 . 0 - 0 . 3 - 4 . 6 - 5 . 8 0 . 2 - 5 . 8S . m a r c e s c e n s - 0 . 3 2 . 1 - 5 . 9 - 4 . 3 0 . 0 - 6 . 3S . m a r c e s c e n s - 0 . 1 2 . 7 - 4 . 8 - 6 . 2 - 0 . 1 - 6 . 2S . m a r c e s c e n s 0 . 1 2 . 1 - 5 . 9 - 5 . 9 0 . 1 - 5 . 9S . m a r c e s c e n s 1 . 5 4 . 6 - 4 . 6 - 4 . 9 1 . 3 - 2 . 1S . m a r c e s c e n s 0 . 1 2 . 2 - 5 . 9 - 5 . 9 0 . 2 - 5 . 9P . v u l g a r i s 1 . 5 - 4 . 5 - 4 . 5 - 4 . 5 1 . 4 - 4 . 5S . e n t e r i t i d i s - 0 . 7 - 6 . 0 - 6 . 0 - 6 . 0 0 . 0 - 1 . 9S . e n t e r i t i d i s 0 . 2 - 6 . 2 - 6 . 2 - 6 . 2 - 0 . 2 - 6 . 2E . h a f n i a e - 0 . 1 - 3 . 6 - 5 . 8 - 5 . 8 5 . 8 c - 0 . 2E . c l o a c a e 0 . 0 2 . 9 - 2 . 0 - 5 . 2 0 . 1 - 1 . 2X 0 . 3 - 0 . 7 - 5 . 1 - 5 . 4 0 . 3 - 4 . 1S E M 0 . 2 1 . 1 0 . 3 0 . 2 0 . 2 0 . 7R e l a t i v e 6 7 1 5 7 6 4 6 7 1 7S E M ( )

a B u f f e r s a n d m e d i a w e r e a d d e d t o m i n i m a l s a l t s m e d i a ; b a c t e r i a w e r eg r o w n 2 8 d a y s a t 3 2 t o 3 4 C . L o g d i f f e r e n c e s a r e r e p o r t e d i n C F U p e r m i l l i l i t e r o n d a y 2 8 c o m p a r e dw i t h d a y 0 .c D a t a e x cl u d ed f r o m c a l c u l a t i o n s

T ABLE 4 . G r o w t h r e s p o n s e o f S t a p h y l o c o c c u s s p p . i np h o s p h a t e - a n d b o r a t e - b u f f e r e d m e d i a 'G r o w t h d i f f e r e n t i a l b

S t a p h y l o c o c c u s P h o s p h a t e B o r a t es p e c i e s P h o s p h a t e b u f f e r B o r a t e b u f f e r N o G l u c o s eb u f f e r p l u s b u f f e r p l u s a d d i t i v e s o n l yg l u c o s e g l u c o s eS . a u r e u s - 6 . 3 - 6 . 3 - 6 . 3 - 6 . 3 - 6 . 3 - 6 . 3S . a u r e u s - 6 . 2 - 6 . 2 - 6 . 2 - 6 . 2 - 6 . 2 - 6 . 2S . a u r e u s - 6 . 2 - 6 . 2 - 6 . 2 - 6 . 2 - 6 . 2 - 6 . 2S . a u r e u s - 6 . 2 - 6 . 2 - 6 . 2 - 6 . 2 - 6 . 2 - 6 . 2S . e p i d e r m i d i s - 5 . 9 - 5 . 9 - 6 . 2 - 5 . 9 - 5 . 9 - 5 . 9S . e p i d e r m i d i s - 6 . 2 - 6 . 2 - 6 . 2 - 6 . 2 - 6 . 2 - 6 . 2S . e p i d e r m i d i s - 6 . 0 - 5 . 0 - 6 . 0 - 6 . 0 - 6 . 0 - 6 . 0X - 6 . 1 - 6 . 0 - 6 . 1 - 6 . 1 - 6 . 1 - 6 . 1S E M 0 . 1 0 . 2 0 . 1 0 . 1 0 . 1 0 . 1R e l a t i v e 1 3 1 1 1 1S E M ( )

a B u f f e r s a n d g l u c o s e w e r e a d d e d t o m i n i m a l s a l t s m e d i a ; b a c t e r i a w e r eg r o w n 2 8 d a y s a t 3 2 t o 3 4 C .b L o g d i f f e r e n c e s a r e r e p o r t e d i n C F U p e r m i l l i l i t e r o n d a y 2 8 c o m p a r e dw i t h d a y 0 .

b a c t e r i a i n b o t h m e d i a . T h e a d d i t i o n o f g l u c o s e t o t h ep h o s p h a t e - b u f f e r e d m e d i u m g a v e m i x e d r e s u l t s . A l l s t r a i n sp r o l i f e r a t e d d u r i n g t h e f i r s t 1 0 0 h ( F i g . 2 ) , a l t h o u g h s u r v i v a lf o r 2 8 d a y s a t l e v e l s a b o v e t h e i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n o c c u r r e df o r o n l y 6 o f t h e 1 2 s t r a i n s t e s t e d . O f t h e s i x s t r a i n s , f i v e w e r ed i f f e r e n t s t r a i n s o f S e r r a t i a m a r c e s c e n s . S i g n i f i c a n t d e -c r e a s e s w e r e o b s e r v e d f o r E . c o l i , P r o t e u s v u l g a r i s , E .h a f n i a e , a n d t w o s t r a i n s o f S a l m o n e l l a e n t e r i t i d i s .T h e s e v e n s t r a i n s o f s t a p h y l o c o c c i n e i t h e r p r o l i f e r a t e di n i t i a l l y n o r s u r v i v e d w e l l d u r i n g 2 8 d a y s o f e x p o s u r e t o a n yo f t h e c o m b i n a t i o n s o f m i n i m a l m e d i a ( T a b l e 4 ) . T h e r e c o v -e r i e s m a d e b e t w e e n 0 a n d 2 8 d a y s i n d i c a t e d t h a t s t a p h y l o -c o c c i may d i e s l i g h t l y s o o n e r i n t h e b o r a t e - b u f f e r e d m e d i u mt h a n i n t h e p h o s p h a t e - b u f f e r e d o r u n b u f f e r e d m e d i a .

DISCUSSIONT h e p u r p o s e o f t h i s s t u d y w a s t o i n v e s t i g a t e t h e s u i t a b i l i t yo f a g e n e r i c , b o r a t e - b u f f e r e d v e h i c l e a s a p r e s e r v a t i v e s y s -t e m f o r o p h t h a l m i c p h a r m a c e u t i c a l a g e n t s . T h e d u r a t i o n o ft h e s t u d y a n d c e l l r e c o v e r y c o r r e s p o n d e d t o t e r m s s p e c i f i e db y t h e US P p r e s e r v a t i v e e f f e c t i v e n e s s t e s t . M i n i m a l m e d i ac o n t a i n i n g t r a c e s a l t s n e c e s s a r y f o r t h e g r o w t h o f P s e u d o m o -n a s s t r a i n s , e n t e r i c b a c t e r i a , a n d m a i n t e n a n c e o f s t a p h y l o -c o c c i w e r e c h o s e n t o p o s e a w o r s t - c a s e c h a l l e n g e f o r ap r e s e r v a t i v e s y s t e m . T h e b u f f e r s t r e n g t h , p H , a n d o s m o l a l -i t y o f t h e m i n i m a l m e d i a w e r e a d j u s t e d t o c o n d i t i o n s f o u n d i nmany o p h t h a l m i c f o r m u l a t i o n s .G r a m - n e g a t i v e r o d s , e s p e c i a l l y P . a e r u g i n o s a a n d S .m a r c e s c e n s , r e p r e s e n t s o m e o f t h e m o s t co m m on c o n t a m i -n a n t s o f c o m m e r c i a l l y p r o d u c e d e y e c a r e p r o d u c t s . Many o ft h e s e p r o d u c t s a r e f o r m u l a t e d i n a p h o s p h a t e b u f f e r p r e -s e r v e d w i t h b e n z a l k o n i u m c h l o r i d e . O t h e r s , d e s i g n e d f o r u s ew i t h h y d r o g e l c o n t a c t l e n s e s , a r e p r e s e r v e d w i t h t h i m e r o s a l ,c h l o r h e x i d i n e , o r s o r b i c a c i d . I n e x p e n s i v e a n d w i d e l y a v a i l -a b l e , t h e s e e y e c a r e p r o d u c t s a r e o f t e n s u b j e c t e d t o w i d e -s p r e a d c o n s u m e r a b u s e . T h e i r p r e s e r v a t i v e s y s t e m s a r ew e a k i n c o m p a r i s o n t o t h o s e o f t o p i c a l p r o d u c t s b e c a u s e o ft h e e x t r e m e s e n s i t i v i t y o f o cu la r t i s s u e s t o c h e m i c a l s i ng e n e r a l . T h e b o r a t e - b u f f e r e d v e h i c l e i n v e s t i g a t e d i n t h i ss t u d y a p p e a r s b e t t e r s u i t e d f o r u s e i n o p h t h a l m i c p r o d u c t st h a n p h o s p h a t e - b u f f e r e d f o r m u l a t i o n s . A l l o f t h e m i c r o o r -

V O L . 2 9 , 1 9 8 6

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4/4

A N T I M I C R O B . A G E N T S C H E M O T H E R .g a n i s m s e v a l u a t e d - 1 5 P s e u d o m o n a s s t r a i n s , 1 2 e n t e r i cb a c t e r i a s t r a i n s , a n d 7 S t a p h y l o c o c c u s s t r a i n s - d e c r e a s e d i nn u m b e r w h e n e x p o s e d t o a b o r a t e - b u f f e r e d m i n i m a l m e d i u m .E v e n i n t h e p r e s e n c e o f a c a r b o n s o u r c e , t h e v i a b l e c e l l sd e c r e a s e d , o f t e n t o a s i g n i f i c a n t e x t e n t .T h e l a c k o f p r o l i f e r a t i o n a n d s u r v i v a l o f t h e s e m i c r o o r g a n -i s m s i n a b o r a t e - b u f f e r e d v e h i c l e p r o v i d e s a n i n c r e a s e d l e v e lo f s a f e t y f o r o p h t h a l m i c p r o d u c t s . H o w e v e r , t h i s p r e s e r v a -t i v e s y s t e m d o e s n o t , b y i t s e l f , m e e t t h e c r i t e r i a f o r e f f e c -t i v e n e s s g i v e n b y US P X X I . T h e k i l l r a t e o f t h e v e h i c l e i s t o os l o w e v e n a t t h e e l e v a t e d t e m p e r at u r e s o f 3 2 t o 3 4 C . T h u s ,t h e b o r a t e b u f f e r r e q u i r e s a u g m e n t a t i o n b y o t h e r a g e n t s ,p r o b a b l y a t v e r y l o w c o n c e n t r a t i o n s , t o m e e t US P s p e c i f i -c a t i o n s . F u r t h e r m o r e , o t h e r i n g r e d i e n t s i n t h e f o r m u l a t i o nmay i n t e r f e r e w i t h t h e p r e s e r v a t i v e s y s t e m . T h u s , t h e i n g r e -d i e n t s o f e a c h f o r m u l a t i o n m u s t b e b a l a n c e d t o a c h i e v e t h ed e s i r e d k i l l r a t e .

A C K N O W L E D G M E N T SW e a r e g r a t e f u l t o C l i f f a n d C h a r m a i n e H a r r i s f o r s u p p l y i n g m a n yo f t h e c l i n i c a l i s o l a t e s u s e d i n t h i s s t u d y .

LITERATURE CITED1 . A d e l h a r d t , M . , a n d A . F o g h . 1 9 8 3 . I s b o r a x d a n g e r o u s ? U g e s k rL a e g . 1 4 5 : 3 8 0 9 - 3 8 1 0 .2 . B o s i o , M . , a n d L . B e r t o n c i n i . 1 9 8 3 . A c u t e b o r i c a c i d i n t o x i c a t i o nw i t h a p o t e n t i a l l y l e t h a l d o s e i n a n e o n a t e : r e p o r t o f a c a s es u c c e s s f u l l y t r e a t e d w i t h p e r i t o n e a l d i a l y s i s a n d r e v i e w o f t h el i t e r a t u r e . M i n e r v a P e d i a t r . 3 5 : 1 0 2 1 - 1 0 2 5 .3 . F a y i n k a , 0 . A . 1 9 7 1 . B o r i c a c i d - a u s e f u l p r e s e r v a t i v e f o r u r i n es a m p l e s . A f r . J . M e d . S c i . 2 : 3 7 7 - 3 8 5 .

4 . F i s h e r , R . S . 1 9 5 6 . T h e u s e o f b o r i c a c i d i n d e r m a t o l o g i cp r a c t i c e . A r c h . D e r m a t o l . 7 3 : 3 3 6 - 3 4 1 .5 . F r i i s - H a n s e n , B . 1 9 8 2 . U n a f f e ct e d b l o od b o r o n l e v e l s i n n e w -b o r n i n f a n t s t r e a t e d w i t h a b o r i c a c i d o i n t m e n t . F o o d C h e m .T o x i c o l . 2 0 : 4 5 1 - 4 5 4 .6 . G i n s b u r g , F . 1 9 7 1 . B o r i c a c i d m y s t e r y : w h y d o e s a n y o n e s t i l lu s e i t ? M e d . H o s p . 1 1 7 : 1 4 0 .7 . G u p t a , S . R . , H . R . P r a s a n n a , L . V i s w a n a t h a n , a n d T . A .V e n k i t a s u b r a m a n i a n . 1 9 7 5 . S y n t h e s i s o f a f l a t o x i n s b y t h en o n g r o w i n g m y c e l i a o f A s p e r g i l l u s p a r a s i t i c u s a n d t h e e f f e c t o fi n h i b i t o r s . J . G e n . M i c r o b i o l . 9 1 : 4 1 7 - 4 2 0 .8 . H a n n a , C . , F . T . F r a u n f e l d e r , M. C a b l e , a n d R . E . H a r d b e r g e r .1 9 7 3 . T h e e f f e c t o f o p h t h a l m i c o i n t m e n t s o n c o r n e a l woundh e a l i n g . Am. J . O p h t h a l m o l . 7 6 : 1 9 3 - 2 0 0 .9 . J a n s e n , J . A . , J . A n d e r s e n , a n d J . S . S c h o u . 1 9 8 4 . B o r i c a c i ds i n g l e d o s e p h a r m a c o k i n e t i c s a f t e r i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n .A r c h . T o x i c o l . 5 5 : 6 4 - 6 7 .1 0 . K i n g m a , H . 1 9 5 8 . T h e p h a r ma c o l o g y a n d t o x i c o l o g y o f b n r o nc o m p o u n d s . C a n . M e d . A s s o c . J . 7 8 : 6 2 0 - 6 2 2 .1 1 . O ' S u l l i v a n , K . , a n d M. T a y l o r . 1 9 8 3 . C h r o n i c b o r i c a c i d p o i s o n -i n g i n i n f a n t s . A r c h . D i s . C h i l d . 5 8 : 7 3 7 - 7 4 9 .1 2 . P i r t , J . S . 1 9 7 5 . C u l t u r e s a t l o w a n d z e r o g r o w t h r a t e s , p .1 8 6 - 1 9 3 . I n P r i n c i p l e s o f m i c r o b e a n d c e l l c u l t i v a t i o n . J o h nW i l e y S o n s , I n c . , N e w Y o r k .1 3 . P o r t e r , I . A . , a n d J . B r o d i e . 1 9 6 9 . B o r i c a c i d p r e s e r v a t i o n o fu r i n e s a m p l e s . B r . M e d . J . 2 : 3 5 2 - 3 5 5 .1 4 . S c h o u , J . S . , J . A . J a n s e n , a n d B . A g g e r b e c k . 1 9 8 4 . Humanp h a r m a c o k i n e t i c s a n d s a f e t y o f b o r i c a c i d . A r c h . T o x i c o l .S u p p l . 7 : 2 3 2 - 2 3 5 .1 5 . S w a t e , T . E . , a n d J . C . W e e d . 1 9 7 4 . B o r i c a c i d t r e a t m e n t o fv u l v o v a g i n a l c a n d i d i a s i s . O b s t e t . G y n e c o l . 4 3 : 8 9 3 - 8 9 5 .1 6 . W a t s o n , P . G . , a n d B . I . D u e r d e n . 1 9 7 7 . L a b o r a t o r y a s s e s s m e n to f p h y s i c a l a n d c h e m i c a l m e t h o d s o f p r e s e r v i n g u r i n e s p e c i -m e n s . J . C l i n . P a t h o l . 3 0 : 5 3 2 - 5 3 6 .

8 0 6 HOULSBY E T A L .