UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

“ALTERACIONES EN LA NEUROTRANSMISIÓN GLUTAMATÉRGICA EN EL NÚCLEO ACCUMBENS, COMO UN MARCADOR TEMPRANO EN LA

CONDUCTA DE ADICCIÓN A LA COMIDA GRASA”.

Por

CARLOS RAFAEL VEGA HERRERA

DIRECTOR: Dr. Alberto Camacho Morales

CODIRECTOR: Dra. Ilse Delint Ramírez

Anteproyecto de tesis como requisito para obtener el Título de QUIMICO BACTERIOLOGO PARASITOLOGO

13/02/2014

DISCIPLINA Y CAMPO DE INVESTIGACIÓN: Biología, Neurociencias.

LUGAR DE TRABAJO: Centro de Investigación De Ciencias de la Salud (CIDICS),

Campus Ciencias de la Salud UANL.

FECHA DE INICIO: Diciembre 2013

DURACIÓN PROBABLE: 6 meses

INTRODUCCIÓN

La Organización Mundial de la Salud define la obesidad como "una condición de la acumulación anormal o excesiva de grasa en el tejido adiposo, en la medida en que la salud podría verse afectada". Una forma simple de medir la obesidad es el índice de masa corporal (IMC), esto es el peso de una persona en kilogramos dividido por el cuadrado de la talla en metros. Una persona con un IMC igual o superior a 30 es considerada obesa y con un IMC igual o superior a 25 es considerada con sobrepeso. A nivel mundial, el 44% de la diabetes, el 23% de las cardiopatías isquémicas y 7-41% de determinados cánceres son atribuibles al sobrepeso y la obesidad. Alguna vez considerados problemas de países con ingresos altos, la obesidad y el sobrepeso están en aumento en los países con ingresos bajos y medios, especialmente en las áreas urbanas. En 2008, 1400 millones de adultos (de 20 y más años) tenían sobrepeso. Dentro de este grupo, más de 200 millones de hombres y cerca de 300 millones de mujeres eran obesos. El 65% de la población mundial vive en países donde el sobrepeso y la obesidad se cobran más vidas de personas que la insuficiencia ponderal. Al menos 2,8 millones de personas cada año mueren como resultado de tener sobrepeso u obesidad. La prevalencia de obesidad se ha duplicado entre 1980 y 2008. A nivel mundial, más de 40 millones de niños en edad preescolar tenían sobrepeso en 2008. La obesidad infantil es uno de los más graves problemas de salud pública del siglo 21. Los niños con sobrepeso son propensos a convertirse en adultos obesos. Ellos tienen más probabilidades que los niños sin sobrepeso de desarrollar diabetes y enfermedades cardiovasculares a una edad más joven, que a su vez se asocian con una mayor probabilidad de muerte prematura y discapacidad. Para un individuo, la obesidad suele ser el resultado de un desequilibrio entre las calorías consumidas y las calorías gastadas. En el mundo, se ha producido un aumento en la ingesta de alimentos hipercalóricos que son ricos en grasa, sal y azúcares pero pobres en vitaminas, minerales y otros micronutrientes, y un descenso en la actividad física como resultado de la naturaleza cada vez más sedentaria de muchas formas de trabajo, de los nuevos modos de desplazamiento y de una creciente urbanización. (1)

Otras causas indirectas incluyen entornos obesogénicas que promueven el exceso de consumo de alimentos azucarados o grasos, susceptibilidad genética, disfunciones biológicas y los factores psicosociales como la depresión, el bajo nivel socioeconómico o el abuso de sustancias. El vínculo con el abuso de sustancias, así como las similitudes entre el comportamiento de las personas que comen en exceso y los que abusan de las drogas o el alcohol, ha llevado a la sugerencia de que comer en exceso debe ser tratada como una forma de “adicción a la comida”. ¿Comer en exceso es un trastorno neurológico como la adicción a las drogas o el alcohol? Los recientes avances en la neurociencia sugieren que podría ser, lo que podría tener consecuencias profundas para el tratamiento de las personas obesas y las políticas de salud pública para hacer frente a la creciente epidemia de obesidad. La obesidad no se incluye como un trastorno de la alimentación en el diagnóstico de la American Psychiatric Association's Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders 4th Edition (DSM-IV), que las clases de trastornos como "perturbaciones graves en la conducta alimentaria" de la alimentación. En la actualidad, los trastornos alimenticios en el DSM-IV incluyen la anorexia nerviosa y la bulimia nerviosa, pero algunos han propuesto la inclusión de comer en exceso como un trastorno adictivo en el próximo DSM-V. (2)

En el consumo de alimentos y drogas ambos resultan en la liberación de dopamina en las regiones mesolímbico y el grado de liberación se correlaciona con la recompensa subjetiva de alimentos y el consumo de drogas. Patrones similares de activación cerebral en respuesta a la alimentación y las señales de drogas también se ha encontrado. (3)

Nuestro cerebro está programado para responder y buscar recompensas inmediatas. Aunque la ingesta de alimentos y el peso corporal están bajo la regulación homeostática, cuando la comida muy apetitosa está disponible, la capacidad de resistir el impulso de comer depende de autocontrol. No hay regulador homeostático para comprobar el consumo de drogas (incluido el alcohol). Hay evidencia creciente de que la interrupción de la homeostasis de energía puede afectar a los circuitos de recompensa y que el consumo excesivo de comida gratificante puede conducir a cambios en el circuito de recompensa que resultan en la ingesta de comida compulsiva similar al fenotipo visto con la adicción. La investigación en la adicción ha producido nuevas evidencias que alude a características comunes significativas entre los sustratos neurales que subyacen a la enfermedad de la adicción y al menos algunas formas de obesidad. (4)

El sistema mesolímbico se compone de áreas cerebrales interconectadas, incluyendo el área ventral tegmental, la corteza prefrontal medial (mPFC), y el núcleo accumbens (NAC). En conjunto, estas áreas del cerebro que median comportamientos naturales de gratificación incluyendo alimentación, el consumo, la conducta materna, la vinculación social, y el comportamiento sexual. (5)

El núcleo accumbens (NAC) es una estructura cerebral localizado en el cerebro anterior basal de los vertebrados, y ha sido el blanco de las drogas adictivas. Los diferentes sistemas de neurotransmisores a nivel de los circuitos NAC se han vinculado a los diferentes problemas de adicción a las drogas, al igual que el uso compulsivo y la recaída. El sistema del glutamato se ha relacionado principalmente a la recaída después de la extinción de búsqueda de drogas. El sistema de la dopamina se ha relacionado principalmente con el uso compulsivo de la droga. La hipótesis de la homeostasis del glutamato se centra en la dinámica de los niveles sinápticos y extrasinápticos de glutamato, y su impacto en los circuitos de la corteza prefrontal (PFC) para el NAC. (6)

DEFINICION DEL PROBLEMA y JUSTIFICACIÓN:

La obesidad es problema de importancia mundial que está afectando a millones de personas, que se está relacionando cada vez con diferentes enfermedades. Este trabajo es una aportación al conocimiento relacionado con la obesidad clasificándolo como un trastorno mental y debe ser tratado como una adicción. Contribuyendo a reforzar la teoría que establece que realmente existe una adicción a la dieta grasa mediante medición de la expresión de los receptores glutamatergicos, que ya está muy bien conocido en las drogas de abuso.

OBJETIVO GENERAL:

Encontrar patrones de adicción en la expresión de los receptores glutamatergicos.

OBJETIVOS PARTICULARES:

Alimentar ratones con dieta grasa durante 6 semanas para obtener ratones obesos.

Separar los ratones con comportamiento adictivo, no adictivos y control mediante la prueba de Preferencia de Lugar.

Obtener el núcleo accumbens del cerebro del ratón y aislar los sinaptosomas.

Comparar la expresión de los receptores glutamatergicos de los ratones adictos, no adictos y control mediante la técnica de Western Blot.

HIPOTESIS:

Se espera un porcentaje de adicción del 70% de ratones adictos y una relación AMPA / NMDA en los receptores glutamatergicos.

ANTECEDENTES

En la actualidad, el DSM-IV define la dependencia de sustancias que cumplen con tres o más de los siguientes siete criterios: tolerancia, abstinencia; sustancia tomada en cantidades mayores o por más tiempo de lo previsto; persistente el deseo de reducir la ingesta o esfuerzos infructuosos para limitar o controlar el uso; gran cantidad de tiempo dedicado a la obtención, uso o recuperación de la sustancia; abandono de las actividades sociales, laborales o recreativas debido al uso, y el uso continuo a pesar de un "problema físico o psicológico recurrente causado o exacerbado por la sustancia". Joan Ifland, presidenta de la Fundación refinado Adicción a la Comida Research, una organización de beneficencia con sede en Texas, EE.UU., han aplicado estos criterios a la sobrealimentación de los alimentos refinados por las personas que son clasificados como "adictos a la comida. Como tal, ellos argumentan que estas personas cumplen con los criterios del DSM-IV para la dependencia de sustancias. Hay también pruebas neurológicas que apoyan para su discusión a partir de las similitudes de comportamiento observadas entre comer en exceso y la dependencia de sustancias, los resultados neurobiológicos de los modelos animales, los estudios de neuroimagen en humanos y la investigación genética de la susceptibilidad a la obesidad. (2)

La evidencia sugiere que ciertos estilos de comer, como comer en exceso, comer compulsivo y comer en exceso crónico, se asemejan a la conducta de las personas adictas a las drogas. De hecho, las similitudes entre algunas formas de comer en exceso y la adicción a las drogas pueden derivar del mismo desequilibrio en ciertas vías neuronales que median la motivación para comer determinados alimentos o tomar drogas, y los que controlan estos impulsos. El sistema de recompensa de dopamina es fundamental para este comportamiento dirigido a un objetivo: actividades placenteras como comer, el sexo o el consumo de drogas desencadenan la liberación de dopamina en un área del cerebro medio llamada el núcleo accumbens. Esta liberación de dopamina señala que estas actividades son vale la pena repetir. (2)

Otras ideas sobre las bases neurológicas de la obesidad provienen de estudios realizados en animales de consumo excesivo de azúcar. Después de períodos de ayuno, el acto de atracones de azúcar provoca niveles excesivos de dopamina y la liberación de opioides en el cerebro que se asocian con el consumo patológico. Del mismo modo, la administración crónica de una dieta alta en azúcar reduce la actividad de la dopamina en la vía de recompensa límbico; un cambio también se asocia con un aumento en los umbrales necesarios para entregar recompensa tal como se mide por la estimulación eléctrica del cerebro. Esta evidencia sugiere que las ratas expuestas crónicamente al azúcar desarrollan un estado de deficiencia de recompensa similar a la observada en los casos de adicción a las drogas. La interrupción brusca del consumo crónico de azúcar también produce síntomas conductuales similares a abstinencia de la heroína en los animales, como castañeteo de dientes y los indicadores de ansiedad. Muchas de las observaciones realizadas en modelos animales han sido apoyadas por estudios de neuroimagen humanos. La resonancia magnética funcional (fMRI) durante la presentación de los alimentos claves para las personas con trastornos que

comen compulsivamente, por ejemplo, se encontró patrones de activación en las regiones del cerebro similares a los observados en las personas adictas que responden a las señales relacionadas con las drogas. Las personas obesas también comparten varias características de personalidad con los toxicómanos. (2)

El consumo de alimentos, más que comer por hambre, y algunas drogas son impulsados inicialmente por sus propiedades de recompensa, lo que en ambos casos implica la activación de vías de la dopamina (DA) mesolímbica. Alimentos y drogas de abuso activan vías DA diferente. La alimentación activa el circuito de recompensa del cerebro, tanto a través de la palatabilidad (implica los opioides endógenos y cannabinoides) y a través de aumentos en la glucosa y las concentraciones de insulina (implica los aumentos de DA), mientras que las drogas activan este mismo circuito a través de sus efectos farmacológicos (a través de efectos directos sobre las células DA o indirectamente a través de los neurotransmisores que modulan las células DA como los opiáceos, la nicotina, el ácido γ-aminobutírico o cannabinoides). (4)

El glutamato es el principal neurotransmisor excitador en el sistema nervioso central (SNC) y ejerce sus efectos a través de la activación de varios subtipos de receptores. El glutamato media la transmisión sináptica excitatoria rápida entre las neuronas a través de los receptores ionotrópicos de α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoazolepropionicacid (AMPA), N-metil-D-aspartato (NMDA) y los receptores de kainato. Además, el glutamato ejerce un papel modulador importante del tono excitador rápido establecido por los receptores ionotrópicos por la activación de la familia receptores de glutamato metabotrópico (mGluR). Receptores ionotrópicos y metabotrópicos de glutamato interactúan en el ajuste fino de las respuestas neuronales en diferentes condiciones de actividad y su co-localización indica que el glutamato modula la neurotransmisión y la excitabilidad neuronal en las mismas sinapsis. (7)

En el caso específico de la cocaína, se ha demostrado que la exposición aguda y crónica de drogas aumenta la relación de los receptores de AMPA y NMDA corrientes mediadas en diferentes áreas del cerebro, lo que sugiere un aumento de la eficacia sináptica en las entradas excitadoras. Junto con los cambios en el AMPA y del receptor de NMDA mediada por la transmisión, la exposición al fármaco altera la plasticidad sináptica dependiente de mGluR. mGluRs-I y-II mGluRs han sido implicados en estos fenómenos, así como en la adaptación del comportamiento evocada-drogas. (8)

MATERIAL Y MÉTODOS:

Se utilizara un grupo de 25 ratones durante 6 semanas.

20 ratones serán alimentados con dieta grasa (45% grasa) y dieta control (10% grasa). Tendrán libre acceso a las dietas que estarán colocadas en compartimientos, cada uno separados a los extremos de la jaula donde se encontrara el ratón colocado individualmente.

Los 5 ratones restantes se utilizaran como controles y solo serán alimentados con dieta control.

Se pesara el consumo de cada dieta cada tercer día durante el experimento. Al igual el peso del ratón al principio y al final del experimento para medir el incremento de peso.

Pasadas las 6 semanas se realizara la prueba de condicionamiento de lugar, que es utilizada para evaluar la condición de adicción del ratón.

Prueba de condicionamiento de lugar

La prueba se lleva a cabo en un total de 14 días

1er día. Pre condicionamiento

Se coloca al ratón en el compartimiento que se encuentra en medio de la cámara clara y la oscura con las puertas cerradas. Las cámaras no contienen dieta alguna.

Después se abren las puertas y el ratón tiene libre acceso a las dos cámaras, se mide el tiempo que permanece en cada una durante 20min.

El ratón naturalmente tiene preferencia por estar en lugares oscuros con sus excepciones.

Día 2 al 13. Entrenamiento

Los ratones alimentados con comida grasa son separados en grupos según su preferencia de permanecer más tiempo en la cámara oscura o clara.

Cada ratón permanecerá durante 6 días en la cámara clara y al igual 6 días en la cámara oscura con la puerta cerrada durante 30min, tendrá acceso a dieta grasa en el compartimiento al que permaneció por menor tiempo y dieta control al compartimiento que permaneció por más tiempo. A los ratones control se les colocara igualmente dieta control en la cámara clara y oscuro durante los 12 días, no tendrán acceso a dieta grasa durante el experimento.

Día 14. Preferencia de lugar

Se coloca al ratón en el compartimiento que se encuentra en medio de la cámara clara y la oscura con las puertas cerradas. Las cámaras no contienen dieta alguna.

Después se abren las puertas y el ratón tiene libre acceso a las dos cámaras, se mide el tiempo que permanece en cada una durante 20min.

Se evalúa el cambio de tiempo en comparación con el primer día de pre condicionamiento. Si el ratón cambio de preferencia y ahora permanece en la cámara que originalmente no era de su agrado se le puede considerar al ratón como adicto.

Aislamiento de sinaptosomas

Después de finalizada la prueba de preferencia de lugar, se sacrifican los ratón por dislocación cervical. Se extrae el cerebro manteniéndolo con solución salina y en hielo.

Después se procede a separar el núcleo accumbens que se encuentra en el área tegmental ventral.

Buffer A sin Tritón. Buffer B sin sacarosa, Tritón 1%. Diluir pastilla en 1mL, solo dura 15 días viable la pastilla. Pastilla de inhibidores, 200uL por cada 10mL.

Se obtienen las fracciones que se encuentran en la sinapsis: perisinapsis, somas, Densidad postsinaptica (PSD). Se procede a realizar la prueba de Western Blot para cada fracción.

Western Blot

Se hace cuantificación de proteínas para cada una de las fracciones, para después igualar las concentraciones de proteínas que se van a cargar en el gel.

Las muestras preparadas con laembli buffer serán cargadas en el gel de poliacrilamida de 8%.

Se trataran de cargar en cada gel muestras que procedentes de ratones adictos, no adictos y control para su comparación.

Después de cargar las muestras en el gel, se hace el corrimiento en la cámara de electroforesis a 90mV por 1hr aproximadamente.

Terminada la electroforesis se procede a hacer la trasferencia a una membrana de Nitrocelulosa dejando la trasferencia en hielo durante 2hrs a 130 o 12hrs a 30mV.

Después de que se han trasferido las proteínas a la membrana se retira de la cámara desechando el gel, y se bloquea la membrana con TBS-Tween BSA 5% por una hora a temperatura ambiente.

Ya bloqueada la membrana se incuba con los anticuerpos de interés:

- NR2A- NR2B- GLUR1- mGLUR2-3- NR1- Actina

Los anticuerpos primarios se diluyen con TBS-Tween BSA 1% y el respectivo anticuerpo secundario con TBS-Tween BSA 5%, durante una hora a temperatura ambiente o a 4°C por 12hrs.

Después de aplicar el anticuerpo primario se realizan 4 lavados de 5 min con TBS-Tween, y para el anticuerpo secundario 3 lavados de 5 min con TBS-Tween y uno con TBS.

Después de realizados los lavados se revelan las membranas usando una solución quimioluminiscente en el equipo Chemidoc, donde se obtienen imágenes de la expresión de las bandas de las proteínas de interés.

Al final las bandas se analizan con un programa que mide la densidad de pixeles de cada una de las bandas y se compara con el control de carga, en este caso utilizare la actina.

La prueba de Western Blot me servirá para analizar los patrones de expresión de los receptores glutamatergicos. Por ejemplo la relación NMDA/AMPA que se observa en la adicción y los receptores metabotrópicos.

LITERATURA CITADA:

1. World Health Organization (WHO). http://www.who.int/en/

2. Natalia M. Lee, Adrian Carter, Neville Owen & Wayne D. Hall. 2012. The neurobiology of overeating. EMBO Rep. 13(9): 785–790.

3. Ashley N. Gearhardt, MS, MPhil; Sonja Yokum, PhD; Patrick T. Orr, MS, MPhil; Eric Stice, PhD; William R. Corbin, PhD; Kelly D. Brownell, PhD. 2011. Neural Correlates of Food Addiction. Arch Gen Psychiatry. 2011; 68(8): 808-816.

4. Nora D. Volkow, Gene-Jack Wang, Dardo Tomasi, Ruben D. Baler. 2013. The Addictive Dimensionality of Obesity. Volume 73, Issue 9, Pages 811-818.

5. Kyle K. Pitchers, Susanne Schmid, Andrea R. Di Sebastiano, Xu Wang, Steven R. Laviolette, Michael N. Lehman, Lique M. Coolen. 2012. Natural Reward Experience Alters AMPA and NMDA Receptor Distribution and Function in the Nucleus Accumbens. PLoS One; 7(4): e34700.

6. Gabriel C Quintero. 2013. Role of nucleus accumbens glutamatergic plasticity in drug addiction. Neuropsychiatr Dis Treat. 2013; 9: 1499–1512.

7. N Hovelsø, F Sotty, L.P Montezinho, P.S Pinheiro, K.F Herrik, and A Mørk. 2012. Therapeutic Potential of Metabotropic Glutamate Receptor Modulators. Curr Neuropharmacol; 10(1): 12–48.

8. Camilla Bellone and Manuel Mameli. 2012. mGluR-dependent synaptic plasticity in drug-seeking. Front Pharmacol; 3: 159.