A.niger Wall

7/29/2019 A.niger Wall

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B i o c h e m . J . ( 1 9 6 5 ) 9 6 , 6 5 1

The C o m p o s i t i o n o f t h e C e l l W a l l o f A s p e r g i l l i u s n i g e rBy I. R . JOHNSTOND e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y , U n i v e r 8 i ty C o l l e g e L o n d o n , G o w e r S t r e e t , L o n d o n , W.C. 1

( R e c e i v e d 2 5 J a n u a r y 1 9 6 5 )

1 . The c e l l - w a l l c o m p o s i t i o n o f A s p e r g i l l u s n i g e r h a s b e e n i n v e s t i g a t e d . A n a l y s i ss h o w s t h e presence o f s i x sugars, g l u c o s e , g a l a c to s e , mannose, a r ab i no s e , g l u c o s-amine and g a l a c t o s a m i n e , a l l i n t h e D - c o nf i g ur a t i o n , e x c e p t t h a t a s m a l l amounto f L - g a l a c t o s e maybe p r e s e n t . S i x t e e n commonamino a c i d s are a l s o p r e s e n t . 2 . T h e -w a l l c o n s i s t s c h i e f l y o f n e ut r a l c a r b o h y d r a t e ( 7 3 - 8 3 % ) and h e x o s a m i n e ( 9 - 1 3 % ) ,w i t h s m a l l e r amounts o f l i p i d ( 2 - 7 % ) , p r o t e i n ( 0 . 5 - 2 . 5 % ) and p h o s p h o r u s ( l e s s t h a n0 1% ) . The a c e t y l c o n t e n t ( 3 - 0 - 3 . 4 %) c o r r e s p o n d s t o 1 O 0 m o l e / m o l e o f hexosaminen i t r o g e n . 3 . A f r a c t i o n a t i o n o f t h e c e l l - w a l l c o m p l e x was a c h i e v e d , w i t h or w i t h o u ta p r e l i m i n a r y p h e n o l e x t r a c t i o n , by u s i n g N - s o d i u m h y d r o x i d e . Though t h i s c a u s e dsome d e g r a d a t i o n , 30-60% o f t h e w a l l c o u l d b e s o l u b i l i z e d ( d e p e n d i n g on t h ep r e p a r a t i o n ) . A n a l y s e s on s e v e r a l f r ac t i o n s s ug g e s t t h a t f r a c t i o n a t i o n p r o c e d u r e sb r i n g a b o u t some s e p a r a t i o n o f components a l t h o u g h not i n a c l e a r - c u t f a s h i o n .4 . C e l l - w a l l p r e p a r a t i o n s were shown t o y i e l d a f r a c t i o n h a v i n g [ O C ] D approx. + 2 4 0 0( i n N - s o d i u m h y d r o x i d e ) and c o n si s ti n g l a r g e l y o f g l u c o s e . T h i s was s e p a r a t e d i n t otwo s u b f r a c t i o n s , one o f which had [ M ] D + 2 8 1 0 ( i n N-sodium h y d r o x i d e ) and h adp r o p e r t i e s r e s e m b l i n g t h e p o l y s a c c h a r i d e n i g e r a n ; t h e o t h e r had [ O C ] D + 2 3 1 0 ( i nN - s o d i u m h y d r o x i d e ) . I t i s s u g g e s t e d t h a t n i g e r a n i s a c e l l - w a l l c o m p o n e n t .

P r e v i o u s s t u d i e s on t h e c h e m i c a l c o m p o s i t i o n o ft h e f u n g u s c e l l w a l l r e l a t e d m a i n l y t o y e a s t s ( s e eC r o o k & J o h n s t o n , 1 9 6 2 ) . More r e c e n t l y s e v e r a lp a p e r s h a v e b e e n c o n c e r n e d w i t h t h e c h e m i s t r y o ft h e c e l l w a l l i n f i l a m e n t o u s s p e c i e s ( A r o n s o n &M a c h l i s , 1 9 5 9 ; B a r t n i c k i - G a r c i a & N i c k e r s o n ,1 9 6 2 a , b , c , d ; H a m i l t o n & K n i g h t , 1 9 6 2 ; H o r i k o s h i& A r i m a , 1 9 6 2 ; H o r i k o s h i & I i d a , 1 9 6 4 ; P a r k e r ,P r e s t o n & F o g g , 1 9 6 3 ; R u s s e l l , S t u r g e o n & W a r d ,1 9 6 4 ; S t u r g e o n , 1 9 6 4 ) . I n a p r e v i o u s p a p e r ( C r o o k& J o h n s t o n , 1 9 6 2 ) i t was shown t h a t t h e q u a l i t a t i v ec o m p o s i t i o n o f t h e c e l l w a l l o f A 8 p e r g i l l u , 8 n i g e r wasr e p r e s e n t a t i v e o f t h at f o u n d i n s e v e r a l s p e c i e s o fA s c o m y c e t e s . I t was t h e r e f o r e d e c i d e d t o e x a m i n et h e w a l l s o f t h i s s p e c i e s i n more d e t a i l .

MATERIALS AND GENERAL METHODSG r o w t h o f A . n i g e r a n d p r e p a r a t i o n o f c e l l w a l l 8 . T h eb a t c h e s o f A . n i g e r ( n o . 1 7 4 5 4 o f t h e C o m m o n w e a l t h M y c o -l o g i c a l I n s t i t u t e , K e w , S u r r e y ) w e r e g r o w n a n d t h e c e l l w a l l si s o l a t e d f r o m them a s d e s c r i b e d b y J o h n s t o n ( 1 9 6 3 ) . Fromc u l t u r a l r e c o r d s ( s e e T a b l e 2 ) a n d a c o m p a r i s o n o f we t y i e l d so f m y c e l i u m , p r e p a r a t i o n s 3 , 4 , 5 a n d 6 ( 6 0 g . ) w e r e d e r i v e df r o m p h y s i o l o g i c a l l y s i m i l a r c u l t u r e s , p r e p a r a t i o n s 1 a n d 2( 4 0 - 5 0 g . ) r e p r e s e n t e d y o u n g e r c e l l w a l l s , a n d p r e p a r a t i o n 7( a b o u t 7 0 g . ) o l d e r c e l l w a l l s . P r e p a r a t i o n s 8 a n d 9 w e r e f r o my o u n g m y c e l i u m . P r e p a r a t i o n s 1 a n d 2 w e r e s l o w - g r o w i n g ,

h a v i n g b e e n s t a r t e d f r o m s l o p e s , 8 a n d 7 w e e k s o l d r e s p e c -t i v e l y . By s e r i a l t r a n s f e r , a l l o t h e r c u l t u r e s were s t a r t e d

f r o m m a t e r i a l t h a t h a d b e e n b r o ug h t t o a m a x i m a l r a t e o fg r o w t h .P a p e r c h r o m a t o g r a p h y a n d e l e c t r o p h o r e s i s . T h e s e w e r e b yt h e m e t h o d s g i v e n b y C r o o k & J o h n s t o n ( 1 9 6 2 ) . A d d i t i o n a ls o l v e n t s w e r e a s f o l l o w s : s o l v e n t A , b u t a n - l - o l - e t h a n o l -w a t e r ( 5 : 1 : 4 , b y v o l . ) ; s o l v e n t B , e t h y l a c e t a t e - p y r i d i n e -w a t e r ( 8 : 2 : 1 , b y v o l . ) ; s o l v e n t C , b u t a n - l - o l - p y r i d i n e -w a t e r ( 6 : 4 : 3 , b y v o l . ) ; s o l v e n t D , p r o p a n - 2 - o l - w a t e r ( 9 : 1 ,v l v ) ; s o l v e n t E , p e n t a n - l - o l - a c e t i c a c i d - w a t e r ( 4 : 1 : 5 , b yv o l . ) . T h e M G , , , v a l u e i n p a p e r e l e c t r o p h o r e s i s i s e l e c t r o -p h o r e t i c m o b i l i t y r e l a t i v e t o g l u c o s e ( F o s t e r , 1 9 5 7 ) c o r r e c te df o r e l e c t r o e n d o s m o s i s .H y d r o l y 8 i s c o n d i t i o n s . F o r a m i n o a c i d s h e a t i n g w a s i n5 - 6 N - H C I a t 1 0 5 0 f o r 1 8 h r . ; a m i n o s u g a r s w e r e r e l e a s e d a sd e s c r i b e d b y J o h n s t o n ( 1 9 6 3 ) ; n e u t r a l - s u g a r h y d r o l y s a t e sw e r e p r e p a r e d b y s o a k i n g m a t e r i a l i n 70 % ( v / v ) H 2 S O 4 a t 0 0

t o -5 o v e r n i g h t , d i l u t i n g t o 2 N - a c i d a n d h e a t i n g f o r 4 h r . a t1 0 0 0 t o p r o d u c e ma x i mu m r e l e a s e o f r e d u c i n g p o w e r .N e u t r a l i z a t i o n w a s w i t h B a ( O H ) 2 , 5% ( v / v ) t r i - n - o c t y l -a m i n e i n C H C 1 3 , o r D e - A c i d i t e FF ( C O 3 2 - f o r m ) .A n a l y t i c a l m e t h o d 8 . T h e f o l l o w i n g w e r e u s e d : t o t a ln i t r o g e n w a s d e t e r m i n e d a s d e s c r i b e d b y C r o o k & J o h n s t o n( 1 9 6 2 ) ; p r o t e i n w a s t a k e n a s t o t a l n i t r o g e n m i n u s h e x o s -a m i n e n i t r o g e n m u l t i p l i e d b y 6 - 2 5 ; t o t a l h e x o s a m i n e w a sd e t e r m i n e d b y t h e m e t h o d o f B o a s ( 1 9 5 3 ) ; l i p i d w a s ' f r e el i p i d ' e x t r a c t e d i n b o i l i n g e t h e r ( 3 x 1 5 m l . / 5 0 m g . o f w a l l s )p l u s ' b o u n d l i p i d ' e x t r a c t e d a t 2 1 0 w i t h e t h e r - e t h a n o l -c o n c . HCI ( 1 0 0 : 1 0 0 : 1 , b y v o l . ) ; n e u t r a l c a r b o h y d r a t e w a se s t i m a t e d b y a n a n t h r o n e m e t h o d ( C h e n , 1 9 5 9 ) o r t h eo r c i n o l - H 2 S O 4 method ( F r a n 9 o i s , M a r s h a l l & N e u b e r g e r ,1 9 6 2 ) ; a c e t y l w a s d e t e r m i n e d a f t e r t o t a l o x i d a t i o n w i t h 5 N -c h r o m i c a c i d ( P r e g l , 1 9 5 1 ) a n d d i s t i l l a t i o n o f t h e v o l a t i l e

6 5 1


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I . R . JOHNSTONa c i d s i n a Markham s t i l l ; O - a c y l w a s d e t e r m i n e d a s d e s c r i b e db y A b r a m s ( 1 9 5 8 ) ; t o t a l p h o s p h o r u s w a s d e t e r m i n e d b y t h em e t h o d o f C h e n , T o r i b a r a & W a r n e r ( 1 9 5 6 ) a f t e r d i g e s t i o nw i t h H2SO4-60% ( w / w ) H C 1 0 4 ( 3 : 2 , v / v ) ; t o t a l n u c l e i c a c i dw a s e x t r a c t e d a n d d e t e r m i n e d f r o m i t s e x t i n c t i o n a t 2 6 0 m pa s d e s c r i b e d b y O g u r & R o s e n ( 1 9 5 0 ) ; n e u t r a l - s u g a r c o m -p o s i t i o n o f t h e c e l l w a l l s a n d f r a c t i o n s was d e t e r m i n e d b yt h e m e t h o d o f W i l s o n ( 1 9 5 9 ) ; a s h was t h e r e s i d u e a f t e rh e a t i n g , w i t h 2 o r 3 d r o p s o f c o n c . H2SO4 a t r e d h e a t , t oc o n s t a n t w e i g h t .I s o l a t i o n o f 8 u g a r s . F o r n e u t r a l s u g a r s t h i s w a s a c c o m -p l i s h e d b y u s i n g a c e l l u l o s e c o l u m n ( 4 c m . x 3 4 c m . ) w i t hs o l v e n t D , o r , a f t e r r e m o v a l o f a l l b u t a t r a c e o f g l u c o s e , b yc h r o m a t o g r a p h y o n Whatman n o . 1 7 p a p e r w i t h s o l v e n t B .R e m o v a l o f g l u c o s e was a c h i e v e d w i t h g l u c o s e o x i d a s e( E C 1 . 1 . 3 . 4 ) a t room t e m p e r a t u r e . A 1 5 m l . p o r t i o n o fF e r m c o z y m e ( s o l u t i o n a s s u p p l i e d b y H u g h e s a n d H u g h e sL t d . , L o nd o n , W . 1 ) w a s a d d e d t o t h e s u g a r s , f r o m a h y d r o -l y s a t e o f a b o u t 6 - 5 g . o f c e l l w a l l s , i n 1 5 0 m l . o f w a t e r , a n d30 % ( w / v ) H 2 0 2 was a d d e d d r o p w i s e ( t o s u p p l y o x y g e n ;S c o t t & Hammer, 1 9 6 2 ) . T h e n u-NaOH was a d d e d t om a i n t a i n t h e pH n e a r 5 - 2 u n t i l , a s j u d g e d b y a t r i a l r u n , m o s to f t h e g l u c o s e was o x i d i z e d ( 1 - 0 - 1 - 5 h r . ) . T h e s o l u t i o nw a s t h e n b o i l e d , d e p r o t e i n i z e d w i t h 5% Z n S O 4 a n d 0 - 3 N -B a ( O H ) 2 a n d d e i o n i z e d w i t h A m b e r l i t e I R - 1 2 0 ( H + f o r m )a n d D e - A c i d i t e F F ( C O 3 2 - f o r m ) . T h e r e s u l t i n g s o l u t i o n w a smade 1 N w i t h r e s p e c t t o H 2 S O 4 a n d b o i l e d f o r 3 h r . t oc o m p l e t e h y d r o l y s i s o f t h e g l u c o n o l a c t o n e . N e u t r a l i z a t i o nw a s e f f e c t e d w i t h D e - A c i d i t e F F ( C O 3 2 - f o r m ) a n d , whenf r e e f r o m a c i d , t h e s o l u t i o n w a s c o n c e n t r a t e d a n d c h r o m a t o -g r a p h e d .Amino s u g a r s w e r e i s o l a t e d o n a Dowex 5 0 c o l u m n( G a r d e l l , 1 9 5 3 ) . S u g a r s w e r e i s o l a t e d a s a m o r p h o u s s o l i d so r a s s y r u p s , b u t g l u c o s a m i n e h y d r o c h l o r i d e w a s o b t a i n e da s t h e a - D - a n o m e r .

F o r o p t i c a l r o t a t i o n s , c o n c e n t r a t i o n s w e r e e s t i m a t e d b yw e i g h t f o r g l u c o s e a n d g l u c o s a m i n e ; f o r t h e r e m a i n i n gs u g a r s a n a p p r o p r i a t e e s t i m a t i o n w a s u s e d ( s e e t h e ' A na -l y t i c a l m e t h o d s ' s e c t i o n ) .EXPERIMENTAL AND RESULTS

C o m p o n e n t s o f t h e c e l l w a l lAmino a c i d s . The 1 6 amino a c i d s f o u n d w e r e t h e

same a s t h o s e d e t e c t e d i n a n o t h e r s t r a i n o f A . n i g e r( C r o o k & J o h n s t o n , 1 9 6 2 ) , n a m e l y a s p a r t i c a c i d ,g l u t a m i c a c i d , g l y c i n e , a l a n i n e , s e r i n e , t h r e o n i n e ,l e u c i n e , i s o l e u c i n e , v a l i n e , t y r o s i n e , p h e n y l a l a n i n e ,p r o l i n e , c y s t i n e , a r g i n i n e , l y s i n e and h i s t i d i n e .Amino s u g a r s a n d n e u t r a l s u g a r s . P a p e r c h r o -m a t o g r a p h y w i t h s o l v e n t C showed g l u c o s a m i n eand a s m a l l amount o f g a l a c t o s a m i n e . T h e s e w e r ec o n f i r m e d b y : ( a ) i o n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y( Z e o - K a r b 2 2 5 ; G a r d e l l , 1 9 5 3 ) , t h e e l u t i o n v o l u m e so f t h e o n l y two p e a k s , 5 9 and 7 0 m l . , b e i n g t h e same( 1 m l . ) a s t h o s e f o r a u t h e n t i c g l u c o s a m i n e andg a l a c t o s a m i n e ; ( b ) n i n h y d r i n o x i d a t i o n ( S t o f f y n &J e a n l o z , 1 9 5 4 ) o f i s o l a t e d s a m p l e s o f g l u c o s a m i n eand g a l a c t o s a m i n e , w h i c h g a v e a r a b i n o s e and l y x o s er e s p e c t i v e l y ; ( c ) N - a c e t y l a t i o n and e l e c t r o p h o r e s i s( C r u m p t o n , 1 9 5 9 ) , when t h e m o b i l i t i e s o f t h e N -

a c e t y l d e r i v a t i v e s o f t h e i s o l a t e d h e x o s a m i n e s w e r et h e same a s t h o s e o f a u t h e n t i c N - a c e t y l - g l u c o s a m i n ea n d - g a l a c t o s a m i n e r e s p e c t i v e l y .P a p e r c h r o m a t o g r a p h y i n s o l v e n t s A and Bs h o w e d t h e p r e s e n c e o f g l u c o s e , g a l a c t o s e , mannoseand t r a c e s o f a r a b i n o s e , a s w e l l a s t r a c e s o f twos u b s t a n c e s w i t h RF v a l u e s 0 - 4 0 and 0 - 7 8 i n s o l v e n t A .A s m a l l s p e c i m e n o f a r a b i n o s e f r o m 200mg. o f c e l lw a l l s had M G 1 C 0 - 9 7 , s i m i l a r t o t h a t o f t h e a u t h e n t i cs u g a r . The s u b s t a n c e w i t h R . 0 - 7 8 r e a c t e d o n l yw i t h a n i l i n e h y d r o g e n p h t h a l a t e a n d a l k a l i n e s i l v e rn i t r a t e , had M G I C l e s s t h a n 0 - 0 5 , and R t e t m m e t h y l g l u c o s e0 - 9 7 i n s o l v e n t A . The s u b s t a n c e c o u l d b e f u r f u r a lo r 5 - h y d r o x y m e t h y l f u r f u r a l [ T a u f e l & R e i s s ( 1 9 5 7 )r e c o r d R, 0 - 9 f o r t h e l a t t e r i n b u t a n - l - o l - a c e t i ca c i d - w a t e r ] . The s u b s t a n c e w i t h R . 0 - 4 r e a c t e do n l y w i t h a l k a l i n e s i l v e r n i t r a t e ( n e g a t i v e f o r a l d o s e ,k e t o s e and d e o x y s u g a r s ) and had a m o b i l i t y i ns o l v e n t A i d e n t i c a l w i t h t h a t o f a u t h e n t i c l a e v o -g l u c o s a n ( f l - 1 , 6 - a n h y d r o g l u c o p y r a n o s e , an a c i dr e v e r s i o n p r o d u c t o f g l u c o s e ; P e a t , W h e l a n ,Edwards & O w e n , 1 9 5 8 ) . S i n c e l a e v o g l u c o s a n h a san R . c l o s e t o t h a t o f rhamnose i n s e v e r a l s o l v e n t s ,i t c o u l d b e m i s t a k e n f o r r h a m n o s e i n c a s e s w h e r eo n l y a l k a l i n e s i l v e r n i t r a t e was u s e d a s d e t e c t i n gr e a g e n t ( H a m i l t o n & K n i g h t , 1 9 6 2 ) .C h r o m a t o g r a p h i c a l l y p u r e s a m p l e s o f a l l s i xs u g a r s were o b t a i n e d . T h e s e a r e l i s t e d b e l o w . Forg l u c o s e a n d t h e s m a l l s a m p l e o f g a l a c t o s e , 5 0 0 m g . ,a n d f o r t h e r e m a i n i n g s u g a r s , 5 - l O g . o f c e l l w a l l swere u s e d . Amounts i s o l a t e d a r e g i v e n i n p a r e n -t h e s e s . D e r i v a t i v e s were u s u a l l y r e c r y s t a l l i z e dt w i c e . M e l t i n g p o i n t s a r e not c o r r e c t e d . R o t a t i o n swere e q u i l i b r i u m v a l u e s d e t e r m i n e d a t 2 1 - 2 5 .D - G l u c o s e ( 1 3 4 m g . ) had [ O C ] D + 5 2 0 ( c 1 - 6 i n w a t e r ) ;Pigman ( 1 9 5 7 ) g i v e s + 5 2 - 7 ; N - p - n i t r o p h e n y l -g l u c o p y r a n o s y l a m i n e had m . p . and mixed m . p .1 8 3 - 1 8 4 ( d e c o m p . ) ( B a r k e r , F o s t e r , S i d d i q u i &S t a c e y , 1 9 5 8 ) .D - M a n n o s e ( 4 5 m g . ) had b o c ] D + 1 4 + 2 0 ( c 1 - 0 i nw a t e r ) ; Pigman ( 1 9 5 7 ) g i v e s + 1 4 . 6 0 ; N - p - n i t r o -p h e n y l m a n n o p y r a n o s y l a m i n e had m . p . a n d mixedm . p . 2 1 9 0 ( d e c o m p . ) ( B a r k e r e t a l . 1 9 5 8 ) .D - A r a b i n o s e ( 1 8 m g . ) had [ O C ] D - 1 0 6 + 6 0 ( c 0 - 7 i nw a t e r ) ; a u t h e n t i c L - a r a b i n o s e had [ X ] D + 1 0 4 0 . Thet o l u e n e - p - s u l p h o n y l h y d r a z o n e o f t h e i s o l a t e d a r a -b i n o s e had m . p . 1 5 4 - 1 5 5 ( d e c o m p . ) ; t h e d e r i v a -t i v e o f t h e a u t h e n t i c L - s u g a r had m . p . 1 5 4 - 1 5 5 ( E a s t e r b y , Hough & J o n e s , 1 9 5 1 ) .D - G l u c o s a m i n e ( 5 7 7 m g . a s h y d r o c h l o r i d e ) had[ X ] D + 7 2 . 1 0 ( c 1 . 8 i n w a t e r ) , t h e v a l u e f o r t h e a u t h e n -t i c m a t e r i a l b e i n g + 7 1 . 8 0 . The 2 - h y d r o x y - 1 -n a p h t h y l m e t h y l e n e d e r i v a t i v e had m . p . and mi x edm . p . 1 9 9 - 2 0 2 ( d e c o m p . ) ( J o l l e s & M o r g a n , 1 9 4 0 ) .D - G a l a c t o s a m i n e ( 1 6 m g . a s h y d r o c h l o r i d e ) had[ c X l D + 9 7 0 ( c 0 - 9 i n w a t e r ) , t h e a u t h e n t i c m a t e r i a ls h o w i n g + 9 6 . The 2 - h y d r o x y - 1 - n a p h t h y l m e t h y l -e n e d e r i v a t i v e had m . p . 1 7 5 - 1 7 7 0 ( d e c o m p . ) ; t h e

1 9 6 55 2


3/8

ASPERGILLUS NIGER CELL WALLST a b l e 1 . P e r c e n t a g e c o m p o s i t i o n o f A . n i g e r c e l l w a l l s

P r e p a r a t i o n s 1 , 2 a n d 7 w e r e m a d e i n t h e B r a u n c e l lh o m o g e n i z e r a n d p r e p a r a t i o n s 3 , 4 , 5 a n d 6 i n t h e M i c k l ec e l l d i s i n t e g r a t o r . A n a l y s e s a r e b a s e d o n m a t e r i a l d r i e di n v a c u o o v e r P 2 0 5 . P e r c e n t a g e c o m p o s i t i o nP r e p . n o . . . .

P r o t e i nH e x o s a m i n eN e u t r a l c a r b o h y d r a t eL i p i dA c e t y lT o t a l p h o s p h o r u sA s hN u c l e i c a c i d

. . . 1,2and7 3 , 4 , 5 a n d 60 - 5 6 - 2 - 59 - 1 - 9 - 97 3 - 7 86 - 7 - 7 - 0

0 - 0 2 5 - 0 - 0 60 - 1 - 0 - 30 - 2 - 0 - 3 5

R e c o v e r y . . . . . . 9 2 - 2 - 9 4 - 9

0 - 4 5 - 1 - 1 01 1 - 9 - 1 3 - 17 8 - 8 31 - 2 - 2 - 030-340 - 0 2 - 0 - 0 30 - 4 5 - 0 - 8< 0 - 1

9 6 - 7 - 1 0 2 - 1

T a b l e 2 . P e r c e n t a g e o f m a n n o s e , g a l a c t o s e a n d g l u c o s ei n t h e n e ut ra l - c ar b o h y d r at e p o r t i o n o f A . n i g e r c e l lw a l l s .A n a l y se s w e r e b y W i l s o n ' s ( 1 9 5 9 ) m e t h o d . I n m o s t c a s e sf o u r o r f i v e d e t e r m i n a t i o n s w e r e u s e d t o c o m p u t e a v a l u e ,s t a n d a r d d e v i a t i o n s b e i ng w i t h i n t h e r a n g e + 2 - 5 % .

G r o w t h c o n d i t i o n sD u r a t i o nP e r c e n t a g e c o m p o s i t i o n o f, - ' ~ - - - - - - - - - - -- s h a k i n gP r e p . n o . M a n n o s e G al a c t o s e G l u c o s e ( h r . ) T e m p .

1 5 - 1 2 2 - 1 7 2 - 8 5 2 3 0 03 , 4 , 5 a n d 6 3 - 1 - 4 - 7 1 3 - 6 - 1 6 - 3 8 0 - 8 2 - 4 5 4 3 07 3 - 1 59 9 1 - 0 5 4 3 3

a u t h e n t i c d e r i v a t i v e had m.p. 1 7 5 - 1 7 8 ( J o l l e s &M o r g a n , 1 9 4 0 ) .G a l a c t o s e ( 1 1 6 m g . ) had [ a ] D + 6 6 + 2 ' ( c 1 - 2 6 i nw a t e r ) ; t h e d i e t h y l d i t h i o a c e t a l had m.p. 1 4 0 - 1 4 2

( d e c o m p . ) ( W o l f r o m , 1 9 3 0 ) . A second s a m p l e( 1 0 m g . ) a l s o had [ a ] D + 6 6 + 4 . Authentic D -g a l a c t o s e had [ O C ] D + 8 6 0 .Q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f t h e c e l l w a l l s

G e n e r a l c o m p o s i t i o n . T h i s i s shown i n T a b l e 1 .A c y l groups i n t h e c e l l w a l l . The a c y l c o n t e n t ,c a l c u l a t e d as a c e t y l , f o r f o u r p r e p a r a t i o n s was 3 - 0 -3 - 4 % o f t h e w a l l , c o r r e s p o n d i n g t o 1 - 0 + 0 - 0 4 m o l eo f a c e t y l / m o l e o f hexosamine n i t r o g e n . Valuesf o r O - a c y l i n t h e s e same p r e p a r a t i o n s ( a b o u t0 - 0 3 , u m o l e / m g . o f w a l l ) were o n l y 4-5%f t h e t o t a la c e t y l v a l u e s .The a c y l group was i d e n t i f i e d as a c e t y l by p o o l i n gt i t r a t e d d i s t i l l a t e s and t r e a t i n g as d e s c r i b e d byBergmann & S e g a l ( 1 9 5 6 ) , e x c e p t t h a t , a f t e r e s t e r i -f i c a t i o n with d i a z o m e t h a n e , 2 m l . o f t h e s u p e r n a t a n ts o l u t i o n o f a mixture o f 2 N - h y d r o x y l a m i n e h y d r o -c h l o r i d e and 3 - 5N-sodium h y d r o x i d e ( 1 : 1 , v / v ) , bothi n 95% ( v / v ) m e t h a n o l , was a d d e d , and t h a t , a f t e rhydroxamate f o r m a t i o n , sodium h y d r o x i d e wasp r e c i p i t a t e d by t h e a d d i t i o n o f s e v e r a l p e l l e t s o fs o l i d carbon d i o x i d e . A f t e r c e n t r i f u g a t i o n , th ea l c o h o l i c s u p e r n a t a n t was re m ov ed a nd reduced i nvolume f o r c h r o m a t o g r a p h y . The removal ofe xc e s s o f a l k a l i as sodium carbonate s t r i k i n g l yimproved c h r o m a t o g r a p h i c s e p a r a t i o n over t h e o r i -g i n a l method ( r u n a g a i n s t markers o f f o r m h y d -roxamic a c i d and a c e t o h y d r o x a m i c a c i d ; s o l v e n t E ) .C o m p o s i t i o n o f n e u tr a l - c a r b o h y d r a t e f r a c t i o n . T h emolar p e r c e n t a g e s o f mannose, g a l a c t o s e and g l u -cose were determined w i t h i n th e n e u t r a l - c a r b o -h y d r a t e p o r t i o n o f t h e c e l l w a l l , which did noti n c l u d e a s h , l i p i d or h e x o s a m i n e . ( A r a b i n o s e ,

r e p r e s e n t i n g o n l y a b o u t 0 . 3 % o f t h i s p o r ti o n o f t h ew a l l , was n o t i n c l u d e d . ) The r e s u l t s f o r s e v e r a lp r e p a r a t i o n s a r e g i v e n i n T a b l e 2 .I t i s e v i d e n t t h a t w i t h i n t h e g r o u p o f p r e p a r a t i o n s3 - 6 , o f s i m i l a r p h y si o l o g i c a l a g e , o n l y minor v a r i a -t i o n s i n c o m p o s i t i o n o c c u r . B y c o m p a r i s o n , i n p r e p a -r a t i o n 1 ( y o u n g e r c u l t u r e ) and p r e p a r a t i o n 7 ( o l d e r ) ,t h e mannose c o n t e n t a p p e a r s t o f a l l b u t s l i g h t l yw i t h a g e , w h e r e a s g a l a c t o s e i s d i l u t e d a b o u t f o u r -f o l d and t h e r e i s a r e l at i v e l y l a r g e i n c r e a s e i n g l u c o s e .T h i s s u g g e s t s t h a t p o l y s a c c h a r i d e s r i c h i n g l u c o s ea r e d i s t i n c t f r o m t h o s e c o n t a i n i n g g a l a c t o s e i n t h ec e l l w a l l , and m ay e v e n t u a l l y s u p e r s e d e t h e l a t t e ra s t h e p r i n c i p a l b i o s y n t h e t i c p r o d u c t . T h e r e i ssome p r e l i m i n a r y i n d i c a t i o n t h a t a f r a c t i o n c o n -t a i n i n g a b o u t 9 0 % o f g l u c o s e d o e s i n c r e a s e i nq u a n t i t y i n t h e c e l l w a l l w i t h a g e .

F r a c t i o n a t i o n o f t h e c e l l w a l lB e f o r e e x t r a c t i o n , p r e p a r a t i o n s were r e f l u x e dw i t h e t h e r o r w i t h e t h e r - m e t h a n o l ( 1 : 1 , v / v ) and

d r i e d . The e f f e c t i v e n e s s o f v a r i o u s r e a g e n t s i ns o l u b i l i z i n g t h e c e l l w a l l s i s shown i n T a b l e 3 .Whereas p h e n o l , d i m e t h y l s u l p h o x i d e and 0 - 0 1 N -s o d i u m h y d r o x i d e remove o n l y a s m a l l p o r t i o n o ft h e w a l l , N - s o d i u m h y d r o x i d e a n d , t o a s m a l l e re x t e n t , 5 % ( w / v ) t r i c h l o r o a c e t i c a c i d were muchmore e f f e c t i v e . The l o w e r y i e l d s o f e x t r a c t e dm a t e r i a l o b t a i n e d w i t h N - s o d i u m h y d r o x i d e i nE x p t s . 3 and 9 ( y o u n g e r w a l l s ) c o m p a r e d w i t hE x p t . 8 ( o l d e r ) a r e p r o b a b l y r e l a t e d t o t h e p h y s i o -l o g i c a l a g e o f t h e c u l t u r e s u s e d ( s e e y i e l d s o f f r a c t i o nIV i n Scheme 1 and t h e D i s c u s s i o n s e c t i o n ) a s w e l l a s ,i n E x p t s . 3 and 9 w h e r e 1 1 g . and 2 8 g . o f w a l l s weree x t r a c t e d , t o t h e a l k a l i n e d e g r a d a t i o n o f f r a c t i o n V ,d i s c u s s e d b e l o w . F u r t h e r , t h e r e si d u a l f r a c t i o na p p e a r s s m a l l e r i n o l d e r ( 3 8 % ; E x p t . 8 ) c o m p a r e dw i t h y o u n g e r m y c e l i u m ( 5 0 % ; E x p t . 9 ) . The r e s i -d u e i n E x p t . 3 ( 4 0 - 5 % ) i s , h o w e v e r , somewhat

V o l . 9 6 6 5 3


4/8

T a b l e 3 . E x t r a c t i o n o f A . n i g e r c e U l w a l l s w i t h v a r i o us r e a g e n t sP r e p a r a t i o n s w e r e made i n t h e B r a u n c e l l h o m o g e n i z e r . A b o u t 5 - l O m l . o f r e a g e nt w a s u s e d / 5 0 - 2 0 0 m g . o f w a l l .F o r E x p t s . 1 , 5 , 6 , 7 a n d 8 , 5 0 m g . , E x p t s . 2 a n d 4 , a b o u t 5 0 0 m g . , E x p t . 3 , 1 1 g . , a n d E x p t . 9 , 2 8 g . o f w a l l s w e r e

u s e d . A l k a l i e x t r a c t i o n s w e r e d o n e u n d e r 0 2 - f r e e N 2 . C o nd i t i o n s o f e x t r a c t i o n a r e i n c l ud e d .S o l v e n t

P h e n o l - w a t e r ( 9 : 1 , w / w ) : 7 0 9 9 f o r 2 - 4 h r .D i m e t h y l s u l p h o x i d e :2 1 0 f o r 1 6 h r .9 9 0 f o r 8 h r .T r i c h l o r o a c e t i c a c i d ( 5 % , w / w ) 9 0 f o r 1 5 m i n .

0 - 0 1 x - N a O H : 2 5 0 f o r 3 h r .N - N a O H : 2 5 0 f o r 2 h r .N-NaOH: 2 5 0 f o r 2 h r .N-NaOH: 2 5 0 f o r 2 h r .

E x t r a c t e d ( % ) R e s i d u e ( % ) R e c o v e r y ( % ) E x p t . n o .3 0 - 5 - 6 9 2 4 - 9 5 - 3 9 5 4 - 1 0 1 1 , 2 a n d 3

6 - 19 - 02 455 93 03 3 - 6

8 4 - 15 79 33 85 04 0 - 5

9 0 - 28 19 89 78 07 8 - 1

4567893

C e l l w a l lE x t r a c t i o n w i t h p h e n o l - w a t e r ( 9 : 1 , w / w )a t 9 9 ' f o r 2 h r .

4S u p e r n a t a n tA d d i t i o n o f w a t e r a n d e x t r a c t i o no f p h e n o l w i t h e t h e r

W a t e r - i n s o l u b l ep r e c i p i t a t e ( I )( 2 . 1 - 2 - 5 % )

IW a t e r - s o l u b l em a t e r i a l ( I I )( 2 - 0 - 3 - 5 0, )

Removal o f excess of p h e n o l w i t h e t h e r ande x t r a c t i o n o f r e s i d u e w i t h N - N a O H a t 2 5 ' f o r 2 h r . ;c e n t r i f u g a t i o n a t 1 0 0 O O g f o r 2 0 m i n .

- S u p e r n a t a n tN e u t r a l i z a t i o n t o pH 7 ( a c e t i c a c i d )an d c e n t r i f u g a t i o n a t 1 2 0 0 g f o r 1 0 i m m i n .

F i n a l r e s i d u e ( I I I )40.5%38%50 %

P r e c i pi t at e ( I V )30.3%42%2 6 %

D i a l y s i s f o r 4 8 - 7 2 h r .

N o n - d i a l y s a b l e ( V )3.3% ( E x p t . 3 )1 7% ( E x p t . 8 )3 8%(Expt. 9 )

Scheme 1 . V a l u e s are based on t h r e e e x p e r i m e n t s ; t h o s e f o r f r a c t i o n s I I I , IV andV are g i v e n s e p a r a t e l y . D i a l y s i s ,a t 2 0 , was a g a i n s t s e v e r a l c h a n g e s o f d i s t i l l e d w a t e r . E x t r a c t i o n w i t h N - N aO H was u n d e r 0 2 - f r e e N 2 . I n E x p t s . 8and 9 , t h e c e l l walls were e x t r a c t e d d i r e c t l y w i t h N-NaOH. C e n t r i f u g a t i o n o f t h e a l k a l i e x t r a c t was done i ns e c u r e l y c a p p e d t u b e s i n an A n g l e 1 7 c e n t r i f u g e ( M e a s u r i n g and S c i e n t i f i c Equipment C o . L t d . , C r a w l e y , S u s s e x ) .

sm a l l e r than e x p e c t e d . S i n c e , h o w e v e r , N-sodiumh y d r o x i d e c o u l d s o l u b i l i z e up t o 6 0 % o f t h e w a l l ,i t s use was c o n t i n u e d . A f r a c t i o n a t i o n p r o c e d u r e

t h a t was u s e d ( o m i t t i n g p h e n o l e x t r a c t i o n i n somee x p e r i m e n t s ) t o o b t a i n t h e v a r i o u s f r a c t i o n s I- V f o rf u r t h e r a n a l y s i s i s shown i n Scheme 1 .

R e s i d u e( 9 2 9 4 - 9 5 X 3 % )

I . R . JOHNSTON 1 9 6 55 4


5/8

ASPERGILLUS NIGER CELL WALLSHot p h e n o l was i n c l u d e d i n Scheme 1 s i n c e i t

removed RNA and p r o t e i n i m p u r i t i e s , u n a v o i d a b l yp r e s e n t t o a s m a l l e x t e n t i n l a r g e - s c a l e e x t r a c t i o n s .The y i e l d o f f r a c t i o n I I I ( 3 8 - 5 0 % ) a p p e a r s t od e c r e a s e a s t h at o f f r a c t i o n IV ( 2 6 - 4 2 % ) i n c r e a s e s ,and t o g e t h e r t h e s e a c c o u n t f o r 70-80% o f t h e w a l l .A l k a l i d o e s n o t a p p e a r t o d e g r a d e f r a c t i o n I V , s i n c ei t c o u l d b e o b t a i n e d f r o m t h e same c e l l - w a l l p r e p a r a -t i o n i n 4 2 % y i e l d b o t h w i t h a 2 h r . and a 3 - 2 5 h r .e x t r a c t i o n i n N - s o d i u m h y d r o x i d e . F u r t h e r e x -t r a c t i o n o f f r a c t i o n I I I ( f i n a l r e s i d u e ) w i t h N -s o d i u m h y d r o x i d e y i e l d e d no m ore f r a c t i o n I V ,a l t h o u g h d u r i n g t h e p r o c e s s f r a c t i o n I I I was d e -g r a d e d ( m a t e r i a l n o t p r e c i p i t a t e d on n e u t r a l i z a t i o nand n o t r e t a i n e d by t h e d i a l y s i s b a g ) t o t h e e x t e n to f 5% o f t h e t o t a l w a l l . A l k a l i n e d e g r a d a t i o n p r o -b a b l y a l s o a c c o u n t s f o r t h e v a r i a b l e y i e l d o f f r a c t i o nV . Thus f r o m 5 0 m g . o f w a l l s , 1 7 % , f r o m 1 - 5 g . ,8 . 2 % , and f r o m 2 8 g . , 3-8% o f f r a c t i o n V wereo b t a i n e d , t h e more p r o l o n g e d m a n i p u l a ti o n t i m e sw i t h t h e l a r g e r s a m p l e s c l e a r l y d e c r e a s i n g t h e y i e l d .The d e g r a d a t i o n o f f r a c t i o n I I I ( 5 % ) t a k e n w i t ht h a t o f f r a c t i o n V ( a p p r o x . 1 4 % ) w o u l d a l m o s ta c c o u n t f o r t h e 8 0 % r e c o v e r y i n some e x p e r i m e n t s .The a n a l y s i s o f s e v e r a l f r a c t i o n s i s o l a t e d a s i nScheme 1 a r e g i v e n i n T a b l e 4 . T h o u g h a l l s i xs u g a r s o f t h e w a l l o c c u r i n e v e r y f r a c t i o n , s u g g e s t i n gt h a t t h e f r a c t i o n a t i o n p r o c e d u r e h a s ' c u t t h r o u g h 's e v e r a l p o l y m e r s , e n r i c h m e n t i n some f r a c t i o n sh a s b e e n a c h i e v e d . Some c o n c e n t r a t i o n o f t h ea r a b i n o s e ( f r a c t i o n I ) , h e x o s a m i n e ( f r a c t i o n I I I ) ,g l u c o s e ( f r a c t i o n I V ) and g a l a c t o s e ( f r a c t i o n VS) i sa p p a r e n t . Bound l i p i d h a s not b e e n e s t i m a t e d ,a l t h o u g h i t s p r e s e n c e i n f r a c t i o n V S c o u l d a c c o u n tf o r t h e s o l u b i l i t y o f t h i s s m a l l b u t r e p r o d u c i b l ef r a c t i o n i n 85% ( v / v ) e t h a n o l . I n f r a c t i o n s w h e r ep r o t e i n i s i n d i c a t e d , i t was shown q u a l i t a t i v e l y

t h a t t h e amino a c i d s o f t h e c e l l w a l l w e r e p r e s e n t .E x t r a c t s o b t a i n e d w i t h d i m e t h y l s u l p h o x i d e s h o w e d ,on h y d r o l y s i s , n e u t r a l and amino s u g a r s and a minoa c i d s ; t r i c h l o r o a c e t i c a c i d e x t r a c t e d a f r a g m e n tc o n t a i n i n g n e u t r a l and amino s u g a r s .I n an e x p e r i m e n t w h e r e f r a c t i o n VP was i s o l a t e di n 6 - 7 % y i e l d , t h e a p p r o x i m a t e m a n n o s e : g a l a c -t o s e : g l u c o s e m o l a r p r o p o r t i o n s w e r e 1 - 0 : 3 - 0 : 1 4 - 0 ,b u t when i s o l a t e d ( f r o m a d i f f e r e n t w a l l p r e p a r a t i o n )i n 3-1% y i e l d t h e v a l u e s w e r e 1 - 0 : 6 - 0 : 4 - 0 . T h i swould i n d i c a t e t h e l o we r y i e l d s o f f r a c t i o n V t o b edue t o s e l e c t i v e a l k a l i n e c l e a v a g e o f t h e g l u c o s e ,s i n c e f o r o t h e r f r a c t i o n s t h e g l u c o s e c o n t e n t d i d n o tv a r y by more t h a n +5% b e t w e e n d i f f e r e n t w a l lp r e p a r a t i o n s .

F u r t h e r s t u d y o f f r a c t i o n IVS i n c e f r a c t i o n IV r e p r e s e n t e d a l a r g e componento f t h e c e l l w a l l ( 2 6 - 4 2 % ; Scheme 1 ) , i t s n a t u r e was

f u r t h e r e x a m i n e d . I t was f o u n d t o e x h i b i t a h i g hd e x t r o r o t a t i o n i n N - s o d i u m h y d r o x i d e ( w h i c h ,m o r e o v e r , was s t i l l c o n s t a n t a f te r 5 d a y s) . For twos a m p l e s [ C ] 2 4 was + 2 3 8 0 and + 2 4 4 0 ( c o n c e n t r a t i o nd e t e r m i n e d by w e i g h t , on p o r t i o n s o f a q u e o u s s u s -p e n s i o n d r i e d a t 8 0 0 ) r e s p e c t i v e l y . I t i s a l r e a d yknown t h a t t h e p o l y s a c c h a r i d e n i g e r a n o c c u r s i nt h e m y c e l i u m o f c e r t a i n s s t r a i n s o f A . n i g e r ( B a r k e r ,Bourne & S t a c e y , 1 9 5 2 , 1 9 5 3 ; B a r k e r , B o u r n e ,O ' M a n t & S t a c e y , 1 9 5 7 ; Dox & N e i d i g , 1 9 1 4 ;Y u i l l , 1 9 5 2 ) , a n d t h e f r a c t i o n was t e s t e d f o r i t sp r e s e n c e by b o i l i n g w i t h w a t e r and f i l t e r i n g w h i l eh o t . On c o o l i n g t h e r e a p p e a r e d a f l o c c u l e n t w h i t ep r e c i p i t a t e w i t h a p e l l i c l e t y p i c a l o f n i g e r a n ( Y u i l l ,1 9 5 2 ) . The f l o c c u l e n t m a t e r i a l was g i v e n two f u r t h e rt r e a t m e n t s ( b o i l i n g i n w a t e r and f i l t r a t i o n ) i n t h i sw a y . I t t h e n s h o w e d [ a ] 1 4 + 2 8 1 0 ( c 0 - 1 8 4 i n N -

T a b l e 4 . A n a l y s e s o f f r a c t i o n s o b t a i n e d f r o m A . n i g e r c e l l w a l l sM o l a r r a t i o s ( t o t h e n e a r e s t 0 - 1 m o l e ) a n d r e l a t i v e p r o p o r t i o n s ( s c o r e d f r o m a c h r o m a t o g r a m ) a r e f r o m p r e p a r a -t i o n s 8 a n d 9 . U n d e r p e r c e n t a g e c o m p o s i t i o n i s i n c l u d e d t h e r a n g e o f v a l u e s f o u n d f o r t h e p a r t i c u l a r f r a c t i o n i ns e v e r a l e x p e r i m e n t s ( e x c e p t w h e r e a s i n g l e v a l u e i s s t a t e d ) . F r a c t i o n VP i s t h e p o r t i o n o f f r a c t i o n V t h a t i s

i n s o l u b l e , a n d V S t h e p o r t i o n ( a b o u t 25% o f t h e f r a c t i o n ) t h a t i s s o l u b l e , i n 85% ( v / v ) e t h a n o l . P e r c e n t a g e v a l u e sa r e n o t c o r r e c te d f o r t h e d e st r uc t i o n o f n e u t r a l o r a m i n o s u g a r s a n d a c i d h y d r o l y s i s ( a p p r o x . 5 a n d 1 2 - 5 % r e s p e c -t i v e l y ) . +, P r e s e n t b u t n o t e s t i m a t e d . P e r c e n t a g e c o m p o s i t i o nM o l a r p r o p o r t i o n s R e l a t i v e p r o p o r t i o n s f -r A- - *- - , % I---- - - -- N e u t r a lF r a c t i o n M a n n o s e G a l a c t o s e G l u c o s e A r a b i n o s e G l u c o s a m i n e G a l a c t o s a m i n e c a r b o h y d r a t e

I 1 - 0 0 - 8 6 - 4 0 - 5 + T r a c e 5 1 * - 9 8I I 1 - 0 1 - 3 3 - 4 T r a c e + T r a c e 4 0 * - 7 6I I I 1 - 0 3 - 0 1 4 - 0 T r a c e + + + + + + + 6 0 - 7 5 - 4IV 1 - 0 3 - 0 9 6 - 0 T r a c e + ++ 8 9 - 3 - 9 4VP 1 - 0 6 - 0 4 - 0 T r a c e T r a c e + 6 1 - 3 - 8 7V S 1 - 0 4 - 0 0 - 4 T r a c e T r a c e T r a c e 4 0 - 4 7

P r o t e i n

N i l0 - 0 - 96 - 4 - 7 - 03 1 - 5

H e x o s a m i n e1 - 80 - 91 8 - 5 - 2 3 - 6

0 - 9 - 3 - 41 - 2 - 1 - 60 - 2

* T h e s e v a l u e s a r e l o w o w i n g t o p r o t e i n i m p u r i t y e x t r a c t e d f r o m a l a r g e b a t c h ( 1 1 g . ) o f w a l l s .

V o l . 9 6 6 5 5


6/8

I . R . JOHNSTONs o d i u m h y d r o x i d e ; c o n c e n t r a t i o n e s t i m a t e d byh y d r o l y s i s t o g l u c o s e ; a l s o c h e c k e d by d r y w e i g h t ) .B a r k e r e t a t . ( 1 9 5 2 ) g i v e [ X 0 ] D + 2 8 3 0 f o r n i g e r a n i nN - s o d i u m h y d r o x i d e . With a c e t i c a n h y d r i d e a n dp y r i d i n e ( W u r z b u r g , 1 9 6 4 ) i t g a v e an a c e t a t e ( 9 5 % )h a v i n g [a]9+ 1 5 6 ' ( c 0 - 4 9 i n c h l o r o f o r m ) ( F o u n dC , 5 0 . 3 % ; H, 5 . 9 % ; a t r i a c e t y l g l u c a n r e q u i r e sC , 5 0 . 0 % ; H , 5 . 6 % ) . B a r k e r e t a t . ( 1 9 5 2 ) g i v e[ o c ] 1 7 + 1 5 7 0 f o r t h e t r i a c e t a t e o f n i g e r a n . The p o l y -s a c c h a r i d e on p a r t i a l a c i d h y d r o l y s i s ( N - s u l p h u r i ca c i d f o r 1 h r . a t 9 9 0 ) showed t h e p r e s e n c e , on p a p e rc h r o m a t o g r a p h y w i t h s o l v e n t C , o f a p p r o x i m a t e l ye q u a l q ua n t i t i e s o f n i g e r o s e and m a l t o s e , t h e l a t t e rg i v i n g t h e t y p i c a l b l u e c o l o ur ( s h o w n a l s o bya u t h e n t i c m a l t o s e ) w i t h a n i l i n e - d i p h e n y l a m i n e( S c h w i m m e r & B e v e n u e , 1 9 5 6 ) . On c o m p l e t e h y d r o -l y s i s g l u c o s e was p r e s e n t a s t h e m a j o r s u g a r ; w i t hh e a v i e r l o a d i n g s ( 1 0 - 1 5 m g . ) t r a c e s o f g a l a c t o s e andmannose, e s t i m a t e d t o occupy t o g e t h e r l e s s t h a n0 - 5 % o f t h e t o t a l h e x o s e , were s e e n .

To t h e f r a c t i o n ( 5 7 - 2 m g . , e s t i m a t e d by h y d r o l y s i st o g l u c o s e ) w i t h O C D + 2 8 1 0 , s u s p e n d e d i n 2 5 m l . o fw a t e r , 40mM-sodium m e t a p e r i o d a t e ( 2 5 m l . ) wasa d d e d , and t h e m i x t u r e g e n t l y s h a k e n i n t h e d a r ka t room t e m p e r a t u r e . At i n t e r v a l s , p o r t i o ns ( 5 m l . )were r e m o v e d , c e n t r i f u g e d i f n e c e s s a r y ( t h e m a t e r i a lwent i n t o s o l u t i o n i n a b o u t 3 0 h r . ) , and 2 m l . o ft h e s u p e r n a t a n t was t i t r a t e d w i t h 35mN-sodiumt h i o s u l p h a t e , a f t e r t h e a d d i t i o n o f p o t a s s i u m i o d i d eand 2 N - s u l p h u r i c a c i d . The u p t a k e o f meta-p e r i o d a t e , e x p r e s s e d a s m o l e s / m o l e o f C 6 H 1 o 0 5 ,was a s f o l l o w s : 6 h r . , 0 - 3 5 ; 2 4 - 5 h r . , 0 - 5 2 ; 4 9 - 5 h r . ,0 - 5 2 ; 1 2 1 h r . , 0 - 5 2 . For t h r e e e x p e r i m e n t s , w i t h upt o 1 1 3 m g . o f m a t e r i a l , 0 - 5 1 + 0 - O l m o l e o f p e r i o d a t ewas c o n s u m e d / m o l e o f C 6 H 1 0 0 5 . T h i s i s c o n s i s t e n tw i t h t h e p r e s e n c e o f 51 % o f ( 1 - 4 ) - l i n k a g e s [ s e eP e a t , W h e l a n , T u r v e y & Morgan ( 1 9 6 1 ) on i s o -l i c h e n i n ] . The e v i d e n c e t a k e n t o g e t h e r i n d i c a t e st h e p o l y s a c c h a r i d e t o b e n i g e r a n .The r e s i d u e o f f r a c t i o n IV ( r e f e r r e d t o a s I V R ) ,a f t e r r e p e a t e d r e m o v a l o f m a t e r i a l s o l u b l e i nb o i l i n g w a t e r u n t i l t h e e x t r a c t s g a v e a n e g a t i v er e a c t i o n i n t h e p h e n o l - s u l p h u r i c a c i d t e s t ( D u b o i s ,G i l l e s , H a m i l t o n , R e b e r s & S m i t h , 1 9 5 6 ) , was s t i l la l k a l i - s o l u b l e and p r e c i p i t a b l e on n e u t r a l i z a t i o n .I t had [ x ] ' + 2 3 1 0 ( c 0 - 1 0 6 i n N - s o d i u m h y d r o x i d e )and c o n t a i n e d g l u c o s e , g a l a c t o s e and mannose i nt h e a p p r o x i m a t e p r o p o r t i o n s 9 7 : 2 : 1 [ W i l s o n ' s( 1 9 5 9 ) m e t h o d ] .T h e r e i s no e v i d e n c e o f any o t h e r component i nf r a c t i o n I V . From t h e v a l u e s o f o p t i c a l r o t a t i o n ,t h e s a m p l e o f f r a c t i o n IV h a v i n g [ c ] D + 2 3 8 0 c o n -t a i n e d a b o u t 1 4 % o f n i g e r a n , and t h a t o f [ O C ] D + 2 4 4 2 6 % o f n i g e r a n . Wh en n i g e r a n and f r a c t i o n IVRwere e x t r a c t e d from w h o l e m y c e l i u m ( t h e sameb a t c h a s t h a t g i v i n g r i s e t o f r a c t i o n I V o f [ O C ] D + 2 4 4 0 ) ,n i g e r a n c o n s t i t u t e d a p p r o x . 2 3 % o f t h e t o t a l y i e l do f t h e two f r a c t i o n s .

DISCUSSIONE x c l u d i n g g a l a c t o s e , a l l t h e s u g a r s o f t h e w a l l a r eo f t h e D - c o n f i g u r a t i o n ; D - a r a b i n o s e o c c u r s r a r e l y i nN a t u r e b u t h a s b e e n f o u n d i n p o l y s a c c h a r i d e s o fN o c a r d i a a s t e r o i d e 8 ( B i s h o p & B l a n k , 1 9 5 8 ) andM y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i 8 ( H a w o r t h , Kent &

S t a c e y , 1 9 4 8 ) a s w e l l a s i n t h e a l o i n s ( G i b s o n &S i m o n s e n , 1 9 3 0 ) . G a l a c t o s e i n two p r e p a r a t i o n sa p p e a r s t o c o n t a i n a b o u t 1 0 % o f t h e L - s u g a r . Thep o i n t h a s n o t b e e n f u r t h e r s t u d i e d .C a r b o h y d r a t e i s t h e c h i e f component ( 7 3 - 8 3 % )o f t h e w a l l , and t o g e t h e r w i t h h e x o s a m i n e ( 9 . 1 -1 3 - 1 %) a c c o u n t s f o r t h e m a j o r p a r t o f t h e c e l l w a l l .P h o s p h o r u s ( 0 . 0 2 - 0 . 0 6 % ) and p r o t e i n ( 0 . 4 5 - 2 . 5 % )a r e o f m i n o r s i g n i f i c a n c e . I t was f o u n d t h a t w a s h i n gp r e p a r a t i o n s w i t h a c i d ( p H 2 - 4 ; p r e p a r a t i o n 5 ) o ra l k a l i n e (pH 1 0 - 0 ; p r e p a r a t i o n 6 ) f l u i d s had noe v i d e n t e f f e c t on w a l l c o m p o s i t i o n . I n p a r t i c u l a rt h i s i n d i c a t e s p r o t e i n c o n t a m i n a t i o n t o b e m i n i m a la n d i t s p r e s e n c e i n t h e p r e p a r a t i o n s m ay b e o fs t r u c t u r a l s i g n i f i c a n c e . Both t h e h e x o s a m i n e( 9 . 1 - 9 . 9 % ) and n e u t r a l - c a r b o h y d r a t e ( 7 2 - 7 8 % )c o n t e n t s o f Braun p r e p a r a t i o n s a r e s l i g h t l y l o w e rt h a n t h e c o r r e s p o n d i n g v a l u e s f o r M i c k l e p r e p a r a -t i o n s ( 1 1 . 9 - 1 3 . 1 and 78-83% r e s p e c t i v e l y ) . Theh i g h e r t o t a l l i p i d o f Braun p r e p a r a t i o n s w i l l p a r t l ye x p l a i n t h i s d i l u t i o n , b u t t h e v a l u e s f o r h e x o s a m i n ea r e b e l i e v e d t o v a r y w i t h t h e a g e o f t h e c u l t u r e u s e d( t h i s h a s b e e n d i s c u s s e d by J o h n s t o n , 1 9 6 3 ) .A l t h o u g h a s i g n i f i c a n t l y h i g h e r p r o t e i n c o n t e n t d o e sn o t accompany t h e e x c e s s o f l i p i d o f t h e Braunp r e p a r a t i o n s , n u c l e i c a c i d c o n t e n t i s r e l a t i v e l yh i g h e r . P r o b a b l y c y t o p l a s m i c c o n t a m i n a t i o n i sg r e a t e r w i t h t h i s m a c h i n e .S i n c e one c e l l - w a l l p r e p a r a t i o n ( p r e p a r a t i o n 8 ,grown f o r 4 7 h r . a t 3 0 0 ) y i e l d e d 30 % w h e r e a s ano l d e r p r e p a r a t i o n ( p r e p a r a t i o n 7 , grown f o r 5 4 h r .a t 3 3 0 ) y i e l d e d 4 2 % o f f r a c t i o n I V , i t e v i d e n t l yi n c r e a s e s w i t h t h e a g e o f t h e c u l t u r e . As i t c o n s i s t so f more t h a n 90% o f g l u c o s e , i t c o u l d a c c o u n t f o rt h e r e l a t i v e i n c r e a s e i n g l u c o s e i n t h e n e u t r a l - s u g a rp o r t i o n o f t h e c e l l w a l l ( T a b l e 2 ) .With r e g a r d t o t h e h e x o s a m i n e c o n t e n t o f t h ef i n a l i n so l u bl e r e s i d u e ( f r a c t i o n I I I , w h i c h c o n t a i n smost o f t h e c e l l - w a l l h e x o s a m i n e ) , i t h a s b e e n e s t a b -l i s h e d t h a t when t h e n e u t r a l c a r b o h y d r a t e o f t h ef r a c t i o n was d e c r e a s e d t o 55% ( b y e x t r a c t i o n w i t ht r i c h l o r o a c e t i c a c i d , t h e n N - s o d i u m h y d r o x i d e ) t h eh e x o s a m i n e c o n t e n t r o s e t o 3 4 - 4 % , s u g g e s t i n g t h ep r e s e n c e o f a r e s i s t a n t p o l y h e x o s a m i n e , p r o b a b l yc h i t i n . X - r a y e v i d e n c e h as b e e n o b t a i n e d f o r t h ep r e s e n c e o f c h i t i n i n t h e c e l l w a l l s o f A . n i g e r( K h o u v i n e , 1 9 3 2 ) and o f A 8 p e r g t l l u 8 o r y z a e . Theo r i g i n o f t h e g a l a c t o s a m i n e r e s i d u e s i s unknown,a l t h o u g h a g a l a c t o s a m i n e p o l y m e r , i n d e g r a d e df o r m , h a s b e e n i s o l a t e d f r o m t h e c e l l w a l l s o fN e u r o s p o r a c r a s s a ( H a r o l d , 1 9 6 2 ) , w h i c h m i g h t be

6 5 6


7/8

V o l . 9 6 ASPERGILLUS NIGER CELL WALLS 6 5 7e x p e c t e d t o b e s i m i l a r t o t h o s e o f A . n i g e r ( C r o o k &J o h n s t o n , 1 9 6 2 ) .H o r i k o s h i & Arima ( 1 9 6 2 ) h a v e p r o v i d e d e v i d e n c ef o r t h e e x i s t e n c e o f a f l - ( 1 - 3 ) - g l u c a n i n A . o r y z a ec e l l w a l l s . S u c h a p o l y m e r , w i t h a f r e e r e d u c i n gg r o u p , c o u l d a c c o u n t f o r t h e a l k a l i - l a b i l i t y o ff r a c t i o n VP ( W h i s t l e r & B e M i l l e r , 1 9 5 8 ) .The most i m p o r t a n t f e a t u r e o f t h e c e l l w a l lr e v e a l e d by t h e p r e s e n t s t u d y i s t h e p r e s e n c e o fh i g h l y d e x t r o r o t a t o r y f r a c t i o n ( I V ) , w h i c h h a s b e e ns e p a r a t e d i n t o two f u r t h e r f r a c t i o n s , o n e w i t h[ L O ] D + 2 8 1 and t h e o t h e r w i t h [ O C ] D + 2 3 l I ( b o t h i nN - s o d i u m h y d r o x i d e ) . T h a t o f h i g h e r r o t a t i o nr e s e m b l e s and i s a s s u m e d t o b e n i g e r a n , w h i c h h a su n e q u i v o c a l l y b e e n shown t o b e a l i n e a r g l u c a n i nw h i c h o c - ( 1- 3 ) - l i n k s a l t e r n a t e w i t h a c - ( 1 - - 4 ) . l i n k s( B a r k e r e t a l . 1 9 5 2 , 1 9 5 3 , 1 9 5 7 ) . E v i d e n c e i n t h en e x t p a p e r ( J o h n s t o n , 1 9 6 5 ) s h o w s t h a t t h e f r a c t i o no f l o w e r r o t a t i o n c o n s i s t s p r e d o m i n a n t l y o f o - ( 1 - + 3 ) -l i n k e d g l u c o s e u n i t s . I t seems p r o b a b l e t h a tn i g e r a n i s a c e l l - w a l l c o m p o n e n t . I t h a s b e e n shown(Dox & N e i d i g , 1 9 1 4 ; Y u i l l , 1 9 5 2 ) t h a t t h e amount o fn i g e r a n ( c a l l e d ' m y c o d e x t r a n ' by Dox & N e i d i g ,1 9 1 4 ) p e r c u l t u r e f l a s k r e m a i n s c o n s t a n t when t h em y c e l i u m o f A . n i g e r i s s t a r v e d . The f a c t t h a tn i g e r a n c a n n o t r e a d i l y b e u s e d a s a s o u r c e o f g l u c o s ed u r i n g s t a r v a t i o n s u g g e s t s a s t r u c t u r a l r a t h e r t h a na r e s e r v e f u n c t i o n f o r t h i s p o l y s a c c h a r i d e . I n as h a k e n ( s u b m e r g e d ) c u l t u r e o f A . n i g e r , t h e c e l l w a l li s t h e most e v i d e n t s t r u c t u r a l f e a t u r e . F o r a g i v e nb a t c h o f m y c e l i u m t h e r a t i o o f n i g e r a n t o f r a c t i o nIV R ( 2 6 : 7 4 , d e t e r m i n e d f r o m o p t i c a l r o t a t i o n s i nN - s o d i u m h y d r o x i d e ) e x t r a c t e d f r o m a c e l l - w a l lp r e p a r a t i o n was a l m o s t t h e same a s t h a t ( 2 3 : 7 7 ,e s t i m a t e d by w e i g h t ) f o r t h e s u b s t a n c e s i s o l a t e df r o m t h e w h o l e m y c e l i u m . T h i s s u g g e s t s t h a tn i g e r a n i s i n t i m a t e l y a s s o c i a t e d w i t h t h e c e l l - w a l lc o m p l e x d u r i n g t h e i s o l a t i o n p r o c e d u r e . F u r t h e r ,t h e r e s i du al f r a c ti o n IVR and n i g e r a n h a v e s e v e r a lf e a t u r e s i n common. Both f r a c t i o n s c o n t a i n a h i g hp r o p o r t i o n o f a - ( 1 - 3 ) - l i n k e d D - g l u c o s e u n i t s , andb o t h a l s o c o n t a i n s m a l l amounts o f g a l a c t o s e andmannose. I n t h e n i g e r a n f r a c t i o n t h e s e were p r e s e n teven a f t e r t h r e e ' r e c r y s t a l l i z a t i o n s ' f r o m h o t w a t e r .F u r t h e r , a l t h o u g h f r a c t i o n IV R was r e p e a t e d l ye x t r a c t e d w i t h b o i l i n g w a t e r ( a u t o c l a v i n g ) u n t i l t h es u p e r n a t a n t y i e l d e d no more n i g e r a n , i t s t i l l c o n -t a i n e d a - ( 1 - 4 ) - l i n k a g e s ( i s o l a t e d a s m a l t o s e ;J o h n s t o n , 1 9 6 5 ) a l t h o u g h i n much s m a l l e r amountst h a n i n n i g e r a n . T h e s e f a c t s t a k e n t o g e t h e r s u g g e s tt h a t f r a c t i o n IV R and n i g e r a n a r e f r a c t i o n s u s u a l l ya s s o c i a t e d w i t h one a n o t h e r , F i n a l l y , t h e f a c t t h a tn i g e r a n i s s o l u b l e i n h o t w a t e r and t h a t a u t o c l a v i n gi n water ( r a t h e r t h a n u s i n g e x t r e m e s o f pH) s u f f i c e st o r e l e a s e i t from c e l l - w a l l p r e p a r a t i o n s c a n n o t b eh e l d t o i n d i c a t e t h a t i t i s n o t a c e l l - w a l l c o m p o n e n t ,s i n c e P e a t , Whelan & Edwards ( 1 9 6 1 ) were a b l e t os o l u b i l i z e t h e c e l l - w a l l mannan o f y e a s t by h e a t i n g

i n an a u t o c l a v e a t pH 7 - 0 . The i s o l a t e d mannan i sknown t o b e f r e e l y s o l u b l e i n w a t e r .B y t a k i n g i n t o a c c o u n t t h e n i g e r a n c o n t e n t s o ft h e tw o s a m p l e s o f f r a c t i o n IV s t u d i e d , 1 4 a n d 2 6 %r e s p e c t i v e l y , a n d t h e p r o p o r t i o n o f t h e c e l l w a l l t h a tt h e s e r e p r e s e n t e d ( 3 0 . 3 a n d 2 6% r e s p e c t i v e l y ) , t h i sc o r r e s p o n d s t o t h e p r e se nc e o f a b o u t 4 -6% o fn i g e r a n i n t h e s e c e l l - w a l l p r e p a r a t i o n s . A l t h o u g h i nsome s t r a i n s o f A . n i g e r n i g e r a n c a n o c c u p y a s mucha s 30% o f t h e m y c e l i a l d r y w e i g h t , i t i s a b s e n tc o m p l e t e l y f r o m o t h e r s ( Y u i l l , 1 9 5 2 ) . The p r o p o r -t i o n m ay a l s o v a r y , p a r t i c u l a r l y i n t h e youngm y c e l i u m , w i t h t h e a g e o f t h e c u l t u r e ( s e e , e . g . ,Dox & N e i d i g , 1 9 1 4 ) .The c e l l w a l l o f A . n i g e r , l i k e t h o s e o f o t h e ro r g a n i s m s , i s c l e a r l y o n e o f g r e a t c o m p l e x i t y . C h i t i n ,a g l u c a n c o n s i s t i n g l a r g e l y o f ( 1 - 3 ) - l i n k e d r e s i d u e s ,and p r o b a b l y n i g e r a n a r e p r e s e n t . The p o s s i b i l i t yo f a l - ( 1 - 3 ) - g l u c a n a n d a g a l a c t o s a m i n e p o l y m e rm ay a l s o h a v e t o b e c o n s i d e r e d . B e c a u s e o f t h ef a c t t h a t a l l s i x s u g a r s o f t h e w a l l o c c u r i n a l l t h ef r a c t i o n s shown i n T a b l e 4 , i t i s e v i d e n t t h a t t h er e g i o n s o f ' h o m o g e n e i t y ' a r e i n t i m a t e l y a s s o c i a t e dw i t h o n e a n o t h e r ( t h e y m ay n e v e r t h e l e s s e x i s t i nd i f f e r e n t l a y e r s o f t h e w a l l ) , p o s s i b l y l i n k e d byb r i d g i n g u n i t s o f g a l a c t o s e , m a n n o s e , a r a b i n o s e ande v e n p r o t e i n .

I t h a n k P r o f e s s o r E . M . C r o o k f o r a d v i c e a n d e n c o u r a g e -ment d u r i n g t h e g r e a t e r p a r t o f t h i s w o r k , Mr D . J . Thomasf o r t e c h n i c a l a s s i s t a n c e , a n d t h e C e n t r a l R e s e a r c h Fund o fL o n d o n U n i v e r s i t y f o r a g r a n t f o r e q u i p m e n t .

REFERENCESA b r a m s , A . ( 1 9 5 8 ) . J . b i o l . C h e m . 2 3 0 , 9 4 9 .A r o n s o n , J . M . & M a c h l i s , L . ( 1 9 5 9 ) . A m e r . J . B o t . 4 6 , 2 9 2 .B a r k e r , S . A . , B o u r n e , E . J . , O ' M a n t , D . M . & S t a c e y , M .( 1 9 5 7 ) . J . c h e m . S o c . p . 2 4 4 8 .B a r k e r , S . A . , B o u r n e , E . J . & S t a c e y , M . ( 1 9 6 2 ) . C h e m . &I n d . p . 7 5 6 .B a r k e r , S . A . , B o u r n e , E . J . & S t a c e y , M . ( 1 9 5 3 ) . J . c h e m .S o c . p . 3 0 8 4 .B a r k e r , S . A . , F o s t e r , A . B . , S i d d i q u i , I . R . & S t a c e y , M .( 1 9 5 8 ) . J . c h e m . S o c . p . 2 3 5 8 .B a r t n i c k i - G a r c i a , S . & N i c k e r s o n , W. J . ( 1 9 6 2 a ) . B i o c h i m .b i o p h y 8 . A c t a , 5 8 , 1 0 2 .B a r t n i c k i - G a r c i a , S . & N i c k e r s o n , W. J . ( 1 9 6 2 b ) . B i o c h i m .b i o p h y 8 . A c t a , 6 4 , 5 4 8 .B a r t n i c k i - G a r c i a , S . & N i c k e r s o n , W. J . ( 1 9 6 2 c ) . J . B a c t .8 4 , 8 2 9 .B a r t n i c k i - G a r c i a , S . & N i c k e r s o n , W. J . ( 1 9 6 2 d ) . J . B a c t .8 4 , 8 4 1 .B e r g m a n n , F . & S e g a l , R . ( 1 9 5 6 ) . B i o c h e m . J . 6 2 , 5 4 2 .B i s h o p , C . T . & B l a n k , F . ( 1 9 5 8 ) . C a n a d . J . M i c r o b i o l . 4 , 3 5 .B o a s , N . F . ( 1 9 5 3 ) . J . b i o l . C h e m . 2 0 4 , 5 5 3 .C h e n , P . S . , T o r i b a r a , T . Y . & W a r n e r , H . ( 1 9 5 6 ) . A n a l y t .C h e m . 2 8 , 1 7 5 6 .C h e n , S . L . ( 1 9 5 9 ) . B i o c h i m . b i o p h y 8 . A c t a , 3 2 , 4 8 0 .C r o o k , E . M . & J o h n s t o n , I . R . ( 1 9 6 2 ) . B i o c h e m . J . 8 3 , 3 2 5 .


8/8

6 5 8 I . R . JOHNSTON 1 9 6 5C r u m p t o n , M . J . ( 1 9 5 9 ) . B i o c h e m . J . 7 2 , 4 7 9 .D o x , A . W. & N e i d i g , R . E . ( 1 9 1 4 ) . J . b i o l . C h e m . 1 8 , 1 6 7 .D u b o i s , M . , G i l l e s , K . A . , H a m i l t o n , J . K . , R e b e r s, P . A . &S m i t h , F . ( 1 9 5 6 ) . A n a l y t . C h e m . 2 8 , 3 5 0 .E a s t e r b y , D . G . , H o u g h , L . & J o n e s , J . K . N . ( 1 9 5 1 ) . J .c h e m . S o c . p . 3 4 1 6 .F o s t e r , A . B . ( 1 9 5 7 ) . A d v a n c . C a r b o h y d . C h e m . 1 2 , 8 1 .F r a n 9 o i s , C . , M a r s h a l l , R . D . & N e u b e r g e r , A . ( 1 9 6 2 ) .B i o c h e m . J . 8 3 , 3 3 5 .G a r d e l l , S . ( 1 9 5 3 ) . A c t a c h e m . 8 c a n d . 7 , 2 0 7 .G i b s o n , C . S . & S i m o n s e n , J . T . ( 1 9 3 0 ) . J . c h e m . S o c . p . 5 5 3 .H a m i l t o n , P . B . & K n i g h t , S . G . ( 1 9 6 2 ) . A r c h . B i o c h e m .B i o p h y 8 . 9 9 , 2 8 2 .H a r o l d , F . M . ( 1 9 6 2 ) . B i o c h i m . b i o p h y s . A c t a , 5 7 , 5 9 .H a w o r t h , W. N . , K e n t , P . W. & S t a c e y , M . ( 1 9 4 8 ) . J . c h e m .S o c . p . 1 2 1 1 .H o r i k o s h i , K . & A r i m a , K . ( 1 9 6 2 ) . B i o c h i m . b i o p h y s . A c t a ,5 7 , 3 9 2 .H o r i k o s h i , K . & I i d a , S . ( 1 9 6 4 ) . B i o c h i m . b i o p h y s . A c t a ,8 3 , 1 9 7 .J o h n s t o n , I . R . ( 1 9 6 3 ) . B i o c h e m . J . 8 6 , 2 5 4 .J o h n s t o n , I . R . ( 1 9 6 5 ) . B i o c h e m . J . 9 6 , 6 5 9 .J o l l e s , Z . E . & M o r g a n , W. T . J . ( 1 9 4 0 ) . B i o c h e m . J . 3 4 , 1 1 8 3 .K h o u v i n e , Y . ( 1 9 3 2 ) . C . R . A c a d . S c i . , P a r i s , 1 9 5 , 3 9 6 .O g u r , M . & R o s e n , G . ( 1 9 5 0 ) . A r c h . B i o c h e m . 2 5 , 2 6 2 .P ar ke r , B . C . , P r e s t o n , R . D . & F o g g , G . E . ( 1 9 6 3 ) . P r o c .R o y . S o c . B , 1 5 8 , 4 3 5 .

P e a t , S . , W h e l a n , W. J . & E d w a r d s , T . E . ( 1 9 6 1 ) . J . c h e m .S o c . p . 2 9 .P e a t , S . , W h e l a n , W. J . , E d w a r d s , T . E . & O w e n , 0 . ( 1 9 5 8 ) .J . c h e m . S o c . p . 5 8 6 .P e a t , S . , W h e l a n , W. J . , T u r v e y , J . R . & M o r g a n , K . ( 1 9 6 1 ) .J . c h e m . S o c . p . 6 2 3 .P i g m a n , W. ( 1 9 5 7 ) . T h e C a r b o h y d r a t e s , p . 8 0 . N ew Y o r k :A c a d e m i c P r e s s I n c .P r e g l , F . ( 1 9 5 1 ) . Q u a n t i t a t i v e O r g a n i c M i c r o - a n a l y s i 8 , 5 t hE n g l i s h e d . , p . 1 9 9 . R e v i s e d b y G r a n t , J . L o n d o n : J . a n dA . C h u r c h i l l L t d .R u s s e l l , D . W . , S t u r g e o n , R . J . & W a r d , V . ( 1 9 6 4 ) . J . g e n .M i c r o b i o l . 3 6 , 2 8 9 .S c h w i m m e r , S . & B e v e n u e , A . ( 1 9 5 6 ) . S c i e n c e , 1 2 3 , 5 4 3 .S c o t t , D . & H a m m e r , F . E . ( 1 9 6 2 ) . A n a l y t . B i o c h e m . 3 , 1 3 .S t o f f y n , P . J . & J e a n l o z , R . W. ( 1 9 5 4 ) . A r c h . B i o c h e m .B i o p h y s . 5 2 , 3 7 3 .S t u r g e o n , R . ( 1 9 6 4 ) . B i o c h e m . J . 9 2 , 6 0 P .T a u f e l , K . & R e i s s , R . ( 1 9 5 1 ) . Z . a n a l y t . C h e m . 1 3 4 , 2 5 2 .W h i s t l e r , R . L . & B e M i l l e r , J . M . ( 1 9 5 8 ) . A d v a n c . C a r b o h y d .C h e m . 1 3 , 2 8 9 .W i l s o n , C . M . ( 1 9 5 9 ) . A n a l y t . C h e m . 3 1 , 1 1 9 9 .W o l f r o m , M . L . ( 1 9 3 0 ) . J . A m e r . c h e m . S o c . 5 2 , 2 4 6 6 .

W u r z b u r g , 0 . ( 1 9 6 4 ) . I n M e t h o d s i n C a r b o h y d r a t e C h e m i s t r y ,v o l . 4 , p . 2 8 6 . E d . b y W h i s t l e r , R . L . & W o l f r o m , M . L .L o n d o n : A c a d e m i c P r e s s ( I n c . ) L t d .Y u i l l , J . L . ( 1 9 5 2 ) . C h e m . & I n d . p . 7 5 5 .

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