Ảnh Hưởng Của Môi Trường Và Giá Thể Mô Rễ Đến Khả Năng Nhân Sinh Khối Cộng Sinh Nấm Rễ AM (Arbuscular Mycorhiza) in Vitro

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN THỊ GIANG

NGHIÊN CỨU

ẢNH HƢỞNG CỦA MÔI TRƢỜNG VÀ GIÁ THỂ MÔ RỄ ĐẾN

KHẢ NĂNG NHÂN SINH KHỐI CỘNG SINH NẤM RỄ AM

(ARBUSCULAR MYCORRHIZA)IN VITRO

Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC

Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS.LÊ QUỐC HUY

Hà Nội– Năm 2012


LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận

được nhiều sự giúp đỡ của các thầy cô, các anh chị và gia đình.

Với tất cả tấm lòng chân thành, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.

Lê Quốc Huy, Phòng Công nghệ vi sinh và Sinh học môi trường, Trung tâm Công

nghệ sinh học Lâm nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, người đã tận

tình giúp đỡ, chỉ bảo, hướng dẫn tôi thực hiện nghiên cứu, góp ý và sửa chữa để tôi

hoàn thiện luận văn này.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tập thể cán bộ, giáo viên bộ môn Vi

sinh vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, những người Thầy đã giúp đỡ,

động viên tôi trong suốt quá trình học tập, tạo mọi thuận lợi cho tôi trong quá trình

thực hiện và hoàn thành luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Đào Tạo sau Đại Học

Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã

tạo điều kiện thuận lợi, hướng dẫn,giúp đỡ tôi thực hiện luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn CN. Ngô Thị Thanh Huệ và tập thể cán bộ Phòng

Công nghệ vi sinh và Sinh học môi trường cũng như tập thể cán bộ thuộc Trung

tâm Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã

dành cho tôi sự giúp đỡ quý báu và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài.

Xin cảm ơn các bạn đã động viên, ủng hộ tôi trong quá trình học tập.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới gia đình thân yêu của

tôi,những người đã luôn ở bên tôi, ủng hộ, động viên và là chỗ dựa vững chắc để

tôi yên tâm học tập hoàn thành khóa học này./.

Hà Nội, ngày 15 tháng 11 năm 2012

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Giang


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi.

Các số liệu và kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai

công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác./.

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Giang


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU………………………………………………………………………. 1

1.1. Đặt vấn đề……………………………………………………………….. 2

1.2. Mục tiêu đề tài…………………………………………………………... 2

1.2.1. Mục tiêu chung………………….……….……………………….. 2

1.2.2. Mục tiêu cụ thể…………...…...………………………………….. 2

1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài……………………………….. 2

1.3.1. Ý nghĩa khoa học…………………………………………………. 2

1.3.1. Ý nghĩa thực tiễn…………………………………………………. 2

1.4. Phạm vi nghiên cứu……………………………………………………... 2

Chƣơng 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU………………………... 3

1.1. Tổng quan về nấm rễ nội cộng sinh AM...……………………………… 3

1.1.1. Khái niệm…………………………………………………………. 3

1.1.2. Đặc điểm của Nấm rễ nội cộng sinh AM(Arbuscular mycorrhiza)……. 4

1.1.3. Vai trò của nấm rễ nội cộng sinh với cây chủ…………………….. 9

1.2. Tổng quan về vi khuẩn Agrobacterium rhizogense…………………… 12

1.3. Nghiên cứu nẫm rễ nội cộng sinh trên Thế giới và Việt Nam………….. 13

1.3.1. Trên thế giới ……………………………………………………... 13

1.3.2. Trong nước ……………………………………………………… 19

Chƣơng 2. VẬT LIỆU - NỘI DUNG - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU… 22

2.1. Vật liệu nghiên cứu……………..……………………………………… 22

2.2. Nội dung nghiên cứu...…………………………………………………. 23

2.2.1. Nghiên cứu tạo vật liệu giá thể mô rễ in vitro………………….. 23

2.2.2. Đánh giá ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân sinh

khối cộng sinh nấm rễ AM in vitro………………….……………………..

23

2.2.3. Đánh giá ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân

sinh khối cộng sinh nấm rễ AM in vitro…………………………………

23

2.2.4. Đánh giá ảnh hưởng của giá thể mô rễ đến khả năng nhân sinh khối

cộng sinh nấm rễ AM in vitro…………………………………..…………

23

2.3. Phương pháp nghiên cứu...……………………………………………. 24


2.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm…………………………………... 24

2.3.2. Phương pháp tạo vật liệu mô rễ in vitro ………………………… 24

2.3.3. Phương pháp cấy chuyển và nhân sinh khối mô rễ ……………… 28

2.3.4. Phương pháp tạo cộng sinh AM in vitro………………………… 28

2.3.5. Phương pháp nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro …………….. 29

2.3.6. Phương pháp thu thập, phân tích và xử lý thống kê số liệu thí

nghiệm………………………………………………………………………….

29

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN……………………………………… 31

3.1. Kết quả tạo vật liệu giá thể mô rễin vitro ………..…………………… 31

3.2.Đánh giá ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng

sinh AM in vitro………………………………………………………………..

32

3.3. Đánh giá ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng

sinh AM in vitro…………………………………………………………..

38

3.4. Đánh giá ảnh hưởng của giá thể mô rễ đến nhân sinh khối cộng sinh AM

in vitro…………………………………………………………………….

44

Chƣơng 4. KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ………………………..... 50

4.1. Kết luận………………………………………………………………… 50

4.2. Tồn tại và kiến nghị……………………………………………….......... 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………............................................. 52

PHỤ LỤC………………………........................................................................ 58


BẢNG NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

STT Viết tắt Viết đầy đủ

1 AM Arbuscular mycorrhiza

2 EM Ectomycorrhiza

3 IBA Indole butylic acid

4 IP Infective propagules

5 M Minimal medium

6 MS Murashige and Skoog medium

7 MSR Strullu and Romand medium

8 PCR Polymerase chain reaction

9 Ri-tDNA Root inducing –transfer Deoxyribonucleic acid

10 rRNA Ribosomal Ribonucleic acid

11 TY trypton-yeast extract medium

12 VAM Vesicular arbuscular mycorrhiza

13 VM Vesicular mycorrhiza


DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh

AM in vitrogiữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri-

tDNA…………………………………………………………………………

32


AM in vitrogiữa chủng M7 với giá thể mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri-

tDNA………………………………………………………………………….

34


AM in vitro giữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Medicago chuyển gen Ri-

tDNA……………………………………………………………………........

35


AM in vitrogiữa chủng M7 với giá thể mô rễ Medicago chuyển gen Ri-

tDNA………………………………………………………………………….

36

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng

sinh AM in vitrogiữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri-

tDNA…………………………………………………………………………

38


sinh AM in vitrogiữa chủng M7 với giá thể mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri-

tDNA…………………………………………………………………………

40

Bảng 3.7:Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng

sinh AM in vitro giữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Medicago chuyển gen Ri-

tDNA……………………………………………………………………………..

41


sinh AM in vitrogiữa chủng M7 với giá thể mô rễ Medicago chuyển gen Ri-

tDNA…………………………………………………………………….........

42

Bảng 3.9: Ảnh hưởng của các loại giá thể mô rễ khác nhau đến nhân sinh

khối cộng sinh AM in vitro trên chủng 41833………………………………..

45

Bảng 3.10: Ảnh hưởng của các loại giá thể mô rễ khác nhau đến nhân sinh

khối cộng sinh AM in vitro trên chủng M7…………………………………..

48


DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ3.1: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng

sinh AM in vitrogiữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri-

tDNA………………………………………………………………………….

33



tDNA………………………………………………………………………….

35

Biểu đồ3.3: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM

in vitro giữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Medicago chuyển gen Ri-

tDNA………………………………………………………………………….

36



tDNA………………………………………………………………………….

37

Biểu đồ 3.5: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối

cộng sinh AM in vitro giữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Cà rốt chuyển gen

Ri-tDNA………………………………………………………………………

39

Biểu đồ3.6: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng


tDNA………………………………………………………………………

41

Biểu đồ3.7:Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh

AM in vitro giữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Medicago chuyển gen Ri-tDNA….

42

Biểu đồ3.8: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng


tDNA………………………………………………………………….

43

Biểu đồ3.9: Kết quả nhân sinh khối AM in vitro của 41833-Cà rốt Ri-tDNA,

M7-Cà rốt Ri-tDNA, 41833-Medicago Ri-tDNA, M7-Medicago Ri-tDNA

trên môi trường MSR 0,5% agar, pH 5,5……………………………………..

44

Biểu đồ3.10: Ảnh hưởng của các loại giá thể mô rễ khác nhau đến nhân sinh

khối cộng sinh AM in vitro trên chủng 41833………………………………..

46

Biểu đồ3.11: Kết quả nhân sinh khối AM in vitro của 4 loại giá thể mô rễ


cộng sinh với chủng 41833 trên môi trường MSR 0,5% agar, pH 5,5……… 47

Biểu đồ3.12: Ảnh hưởng của các loại giá thể mô rễ khác nhau đến nhân sinh

khối cộng sinh AM in vitro trên chủng M7…………………………………..

49

Biểu đồ3.13: Kết quả nhân sinh khối AM in vitro của 4 loại giá thể mô rễ

cộng sinh với chủng M7 trên môi trường MSR 0,5% agar, pH 5,5………….

49


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cây phân loại nấm rễ nội cộng sinh AM……………………...…......….5

Hình 1.2.a: Búi sợi nấm (Arbuscules)…………………..…………………...……6

Hình 1.2.b: Túi sợi nấm (Vesicules)…………………..…………......................…6

Hình 1.3.a : Sợi nấm ngoại bào(extraradical hyphae) …………………...………..7

Hình 1.3.b : Bào tử (spores) ……………………………………...……………......7

Hình 1.4: Sơ đồ cấu trúc AM điển hình……………………………………………8

Hình 1.5.a: Cây Medicago truncatula phát triển bình thường…………..........…..11

Hình 1.5.b: Cây Medicago truncatula có cộng sinh nấm rễ…………….……......11

Hình 1.6: Cấu trúc vòng Ri-plasmids của vi khuẩn A. rhizogenes(Veena and

Taylor 2007)………..……………………………………………………..………13

Hình 2.1.a: Gieo hạt Medicago……………………..……………...………..…....24

Hình 2.1.b: Rễ Medicago phát triển sau 5 ngày………………...…….……….....24

Hình 2.2.a: Hạt Cà rốt nảy mầm sau 4 ngày gieo hạt.............................................25

Hình 2.2.b: Rễ Cà rốt không chuyển gen Ri-tDNA phát triển sau 30 ngày...........25

Hình 3.1.a : Rễ Cà rốt không có gen Ri-tDNA......................................................31

Hình 3.1.b :Rễ Cà rốt có gen Ri-tDNA.................................................................31

Hình 3.2. Phân tích PCR cho mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri-tDNA và không chuyển

gen Ri-tDNA. Băng 1: có gen rolB; băng 2: có gen rolC (cho mẫu chuyển gen);

băng 3 và 4: không có gen rolB và rolC (cho mẫu không chuyển gen); M: DNA

thang chuẩn 100 bp (Fermentas).......................................................................32

Hình 3.3.a: Rễ Medicago không có gen Ri-tDNA.................................................32

Hình 3.3.b: Rễ Medicago có gen Ri-tDNA...........................................................32

Hình 3.4.a: Rễ cộng sinh phát triển trên môi trường MSR 0,5% agar………..….37

Hình 3.4.b: Rễ cộng sinh phát triển trên môi trường MSR lỏng……..……...…...37

Hình 3.4.c: Rễ cộng sinh phát triển trên môi trường MS 0,5% agar....……….….37

Hình 3.5.a: AM cộng sinh vào rễ Cà rốt và sinh trưởng sợi nấm mới……..….....45

Hình 3.5.b: AM cộng sinh vào rễ Medicago và sinh trưởng sợi nấm mới…….....45

Hình 3.6.a: Sinh sản bào tử AM trên giá thể Cà rốt có Ri-tDNA sau 1 tháng.......50

Hình 3.6.b: Sinh sản bào tử AM trên giá thể Cà rốt có Ri-tDNA sau 4 tháng.......50


MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề

Ngày nay, nhân loại đang rất nỗ lực trong việc giải quyết 3 vấn đề lớn, đó là

(i) Tăng sinh trưởng và năng suất cây trồng, đảm bảo an ninh lương thực và năng

lượng, (ii) Giảm thiểu thiên tai, ô nhiễm môi trường và thích ứng với biến đổi khí

hậu, (iii) Phát triển bền vững và nâng cao chất lượng cuộc sống(AFCconference

2012).

Các giải pháp sinh học theo hướng ―tiếp cận xanh‖ (Green approach) được

nghiên cứu và hưởng ứng áp dụng mạnh mẽ nhằm làm tăng năng suất cây trồng,

vật nuôi, giảm thiểu thiên tai, ô nhiễm môi trường và thích ứng tốt nhất với biến

đổi khí hậu. Nghiên cứu phát triển ứng dụng các chế phẩm sinh học, vi sinh, dần

thay thế các loại sản phẩm hóa học cho tăng năng suất cây trồng và bảo vệ môi

trường đang ngày càng được quan tâm và đầu tư phát triển.

Nâm rễ nội cộng sinh AM (Arbuscular mycorrhiza) được nghiên cứu sử dụng

như một loại phân bón sinh học, một mặt có tác dụng làm tăng cường hấp thụ dinh

dưỡng của cây trồng, đặc biệt là hấp thụ Lân và giữ nước trên những lập địa thoái

hóa, do đó làm tăng sinh trưởng và năng suất, mặt khác nó cũng có tác dụng làm

ổn định cấu trúc, đặc tính sinh học của đất và là yếu tố chỉ thị cho mức độ suy

thoái của môi trường đất.

Tuy nhiên, các nghiên cứu ứng dụng nấm rễ nội cộng sinh AM mới chỉ tập

trung nhiều cho các cây trồng ngắn ngày, công nghệ chế phẩm AM vẫn phổ biến

áp dụng ở dạng thô sơ truyền thống là ―chất nhiễm đất‖ (soil innoculum), bẫy thực

vật (AM trap plant), chưa đáp ứng được các nhu cầu đòi hỏi của xản xuất cả về mặt

số lượng, chất lượng sản phẩm, cũng như quy mô và hiệu quả của việc áp dụng vào

sản xuất. Do vậy, hướng đi đột phá mới trong nghiên cứu AM là công nghệ nhân

sinh khối AMinvitrocó khả năng góp phần giải quyết được các vấn đề tồn tại nêu

trên của các loại chế phẩm AM truyền thống, trong đó môi trường nuôi cấy và giá

thể rễ thực vật chủ là những yếu tố rất quan trọng trong nghiên cứu về công nghệ

nhân sinh khối AM invitro.


Nhằm góp phần giải quyết các vấn đề tồn tại đã nêu trên của nghiên cứu ứng

dụng công nghệ AM, đặc biệt trong lĩnh vực Lâm nghiệp, Đề tài nghiên cứu Thạc

sĩ ―Nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng và giá thể mô rễ đến khả năng

nhân sinh khối cộng sinh nấm rễ AM (Arbuscular mycorhiza) in vitro ‖đã được

đề xuất thực hiện. Đề tài Thạc sĩ này của tôi được thực hiện trong khuôn khổ Đề tài

cấp Nhà nước về ―Nghiên cứu sản xuất nấm rễ nội cộng sinh AM (Arbuscular

mycorrhiza) cho cây Lâm nghiệp‖thuộc Chương trình trọng điểm phát triển và

ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn

đến năm 2020.

1.2. Mục tiêu của đề tài

1.2.1. Mục tiêu chung

Nhằm nghiên cứu một số cơ sở khoa học cho công nghệ nhân sinh khối cộng

sinh AM invitro và sản xuất chế phẩm ứng dụng cho cây trồng và bảo vệ môi

trường.

1.2.2. Mục tiêu cụ thể

- Nhằm nghiên cứu lựa chọn được môi trường phù hợp cho hình thành cộng

sinh và nhân sinh khối cộng sinh nấm rễ AM in vitro.

- Nhằm nghiên cứu lựa chọn được giá thể mô rễ phù hợp cho nhân sinh khối

cộng sinh nấm rễ AM in vitro.

1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

1.3.1.Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các cơ sở khoa học quan trọng

cho công nghệ nhân sinh khối cộng sinh AM invitro và sản xuất chế phẩm ứng

dụng cho cây trồng và bảo vệ môi trường.

1.3.2.Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ đề xuất được loại môi trường và giá thể mô

rễ phù hợp nhất cho công nghệ nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro, làm nguyên

liệu sản xuất chế phẩm AM phục vụ gây trồng cây lâm nghiệp.

1.4. Phạm vi nghiên cứu

Đề tài được tiến hành nghiên cứu trong phạm vi phòng thí nghiệm.


Chƣơng 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1. Tổng quan về nấm rễ nội cộng sinh AM

1.1.1.Khái niệm

Mycorrhiza là thể cộng sinh giữa hệ sợi nấm trong đất với rễ của thực vật bậc

cao.Frank là người đầu tiên phát hiện ra đặc điểm kết hợp đặc biệt này ở rễ của cây

Cupulifereae vào năm 1885 và gọi đó là mycorrhiza. Từ ―mycorrhiza‖ có nghĩa là

―nấm- rễ‖, tác giả đã dùng từ này để nhấn mạnh mối quan hệ giữa nấm và rễ cây

(Roger et al. 2004a).

Nấm rễ nội cộng sinh AM được xác định là mối quan hệ không thể thiếu ở

hầu hết các loài thực vật (hơn 90% các loài thực vật có khả năng hình thành cộng

sinh AM). Sự kết hợp đó mang lại lợi ích cho cả thực vật và vi sinh vật, qua đó,

nấm có được các hợp chất đồng hóa từ thực vật để sống, đồng thời nấm lại giúp rễ

cây tăng cường khả năng hấp thụ nước, các chất hữu cơ hòa tan trong đất đặc biệt

là phospho, chống chịu các yếu tố bệnh hại cũng như các chất độc kim loại nặng.

Do đó, có tác dụng cải tạo và ổn định cấu trúc đất, cân bằng hệ sinh thái.Quan hệ

cộng sinh này đặc biệt thể hiện vai trò trên những vùng đất khô cằn, hệ sinh thái bị

xáo trộn nghiêm trọng, nghèo dinh dưỡng hay có tiềm năng độc hại cao. Vì vậy

công nghệ AM có khả năng áp dụng rộng cho nhiều loài cây lâm nghiệp, không chỉ

giúp tạo ra được nguyên liệu cây trồng rừng có chất lượng cao, khả năng thích nghi

và năng suất tốt trên những lập địa cằn cỗi mà còn đáp ứng tốt nhất cho nhu cầu sử

dụng hiệu quả nguồn tài nguyên đất đai theo mục tiêu mở rộng diện tích cây trồng

rừng nhưng không cạnh tranh với đất trồng cây nông nghiệp, tăng cường hiệu quả

sử dụng các vùng đất hoang hóa theo cách bền vững và thân thiện với môi trường.

Mycorrhiza có phân bố ở hầu khắp các nơi, thấy ở cây cỏ, rêu, dương xỉ, một

số cây lá kim, và hầu hết các cây lá rộng. Sự phổ biến cùng với những vai trò tích

cực của nấm rễ đã kích thích việc nghiên cứu về mycorrhiza ngày càng mở rộng và

sâu sắc hơn. Trong khoảng 20 năm trở lại đây, những nghiên cứu cơ bản được thực

hiện bởi hàng trăm các nhà nghiên cứu từ các nước khác nhau trên thế giới đã đem

lại nhiều kết quả hết sức ý nghĩa cho ứng dụng mycorrhiza trong hệ sinh thái nông

nghiệp,lâm nghiệp và môi trường.


Dựa trên đặc điểm xâm nhiễm của nấm vào rễ cây chủ, mycorrhiza được phân

thành 2 nhóm chính là ngoại cộng sinh (Ectomycorrhiza, EM), và nội cộng sinh

(Endomycorrhiza, AM).

Ectomycorrhiza:Ectomycorrhiza có ở những cây gỗ lớn, điển hình là thông,

sồi, cáng lò, những cây có giá trị kinh tế cao, tuy nhiên ectomycorrhiza có tính đặc

trưng loài. Đặc điểm của ectomycorrhiza là sợi nấm nội bào chỉ xâm nhập vào

khoảng gian bào của các tế bào vùng vỏ rễ và sợi nấm ngoại bào phân nhánh mạnh

tạo thành lớp vỏ bao quanh rễ nên làm biến đổi hình thái bên ngoài của rễ. Hầu hết

ectomycorrhiza thuộc LớpBasidiomycetes như Agaricales, số ít thuộc

LớpAscomycetes.

Endomycorrhiza:Hình thành ở khoảng 80% thực vật bậc cao. Đặc điểm của

endomycorrhyza là sợi nấm của chúng xâm nhập vào bên trong tế bào vỏ rễ của

thực vật bậc cao và không gây nên những biến đổi hình thái bên ngoài của rễ,

thường có một phần của sợi nấm còn nằm phía ngoài nhưng chúng không tạo lớp

vỏ bao ngoài rễ. Cấu trúc điển hình của endomycorrhiza là sự hình thành những

cấu trúc đặc biệt vesicules và arbuscules. Ở một số nhóm endomycorrhiza người ta

quan sát thấy có vesicules(Vesicular mycorrhiza, VM) hoặc arbuscules

(Arbuscular mycorrhiza, AM) hoặc đồng thời cả hai cấu trúc này trong tế bào vỏ rễ

(Vesicular arbuscular mycorrhiza, VAM).

Vậy AMlà thể cộng sinh giữa nấm với rễ cây ở thực vật bậc cao mà hình thành

nên cấu trúc đặc biệt vesicules, arbuscules trong tế bào vỏ rễ và không gây biến đổi

hình thái ngoài của rễ.

Do tính phổ biến, có lợi và không cố hữu cho 1 loài nên nhóm

vesiculesarbuscular mycorrhiza rất được quan tâm nghiên cứu để ứng dụng trong

nông nghiệp cũng như trong lâm nghiệp.

1.1.2. Đặc điểm của Nấm rễ nội cộng sinh AM (Arbuscular mycorrhiza)

a. Phân loại

Trong một thời gian dài AM được xếp vào ngành phụ nấm tiếp hợp

(Zygomycota) do cấu trúc sợi nấm không có vách ngăn, lớp nấm tiếp hợp

(Zygomycetes). Hiện nay, bằng những nghiên cứu mức độ phân tử hệ thống phát


sinh loài đã cho thấy Zygomycota là ngành đa hệ (poli-phyletic), do đó nấm AM

được tách ra khỏi ngành Zygomycota hình thành lên ngành mới là Glomeromycota.

Phân loại đến cấp họ cho AM được dựa trên 4 tiêu chí cơ bản:

- Cấu trúc mycorrhiza cộng sinh trong rễ.

- Phương thức hình thành bào tử khi được phân lập trong đất.

- Cấu trúc nội bào tử.

- Phương thức nảy mầm bào tử.

Hệ thống phân loại AM hiện nay ( dựa trên trình tự của rRNA ) được tóm tắt

trong hình sau:

(Nguồn:http://www.google.com.vn/url?source=imglanding&ct=img&q=http://invam.caf.

wvu.edu/fungi/taxonomy)

b. Cấu trúc

Nấm rễ nội cộng sinh (AM) có cấu tạo điển hình bao gồm cấu trúc nội bào

(arbuscules, vesicules, sợi nấm nội bào) và cấu trúc ngoại bào (sợi nấm ngoại bào,

bào tử).

Hình 1.1: Cây phân loại nấm rễ nội cộng sinh AM

N


Nhóm cấu trúc nội bào:

Hinh 1.2: Bui sơi nấm (Arbuscules) (a)

Tui sơi nấm (Vesicules) (b) Nguồn:(Hà 2011)

- Arbuscules: là thể giác mút, lưỡng phân, dạng như lông bàn chải, là phần

trao đổi dinh dưỡng chính giữa thực vật chủ và nấm (Gianinazzi et al. 2002).Chúng

được hình thành bên trong tếbào vỏ rễ(Mosse and Hepper 1975b) và là dấu hiệu

cho biết có hoạt động của mycorrhiza. Tùy vào từng loài khác nhau mà arbuscules

cũng có những đặc trưng riêng về hình dạng và sự phân nhánh.

- Vesicules: có dạng hình cầu hoặc trứng, có thành tế bào dày, là cơ quan dự

trữ dinh dưỡng cho nấm, có chứa lipit và glycolipit (Mosse and Thompson 1981a).

Nó được tạo thành bởi đoạn giữa hay đầu lồi tận cùng của sợi nấm nội bào, phân

bố trong khoảng gian bào hoặc bên trong tế bào vỏ rễ.

- Sợi nấm nội bào: sợi nấm nội bào không có vách ngăn,dạng thẳng hoặc phân

nhánh hình chữ H hoặc Y,chúng cũng hình thành dạng cuộn, tần số xuất hiện của

chúng phụ thuộc vào vị trí trong rễ và đặc điểm của từng loài nấm (Morton2000).

Sợi nấm vừa là phần chứa chất dự trữ vừa là một phần của con đường vận chuyển

các chất hấp thụ bởi các sợi nấm bên ngoài từ đất tới arbuscules hoặc trực tiếp tới

tế bào rễ của cây chủ (Bieleski 1973).

a b


Nhóm cấu trúc ngoại bào:

Hinh 1.3: a: Sơi nâm ngoai bao (extraradical hyphae)

b: Bao tư (spores) Nguồn: (Hà 2011)

- Sợi nấm ngoại bào:Sợi nấm ngoại bào không có vách ngăn, vai trò làm tăng

rõ rệt diện tích hấp thụ của rễ cây (Bieleski 1973), cầu sợi nấm hình thành con

đường vận chuyển chất dinh dưỡng giữa thực vật cộng sinh và khối đất bám quanh

rễ (Koske and Gemma 1989). Sợi nấm ngoại bào tạo ra chỗ cư ngụ quan trọng của

hệ nấm rễ (Jasper et al. 1989, 1991).

- Bào tử:Bào tử có thể dạng đơn hoặc đa bào, chủ yếu hình thành ở đầu của

sợi sinh bào tử nối tiếp với sợi nấm ngoại bào, đôi khi bào tử cũng xuất hiện bên

trong rễ (Koske et al. 1985), trên bề mặt đất (BeCard and Fortin 1988), trên bề mặt

thực vật hay các mảnh phân giải (Blaszkowski et al. 1998). Số lượng bào tử hình

thành phụ thuộc vào từng loài nấm (Blaszkowski, 1993), loài cây chủ và tính đa

dạng của nó (Blaszkowski1993; Hetrick and Bloom1986), độ màu mỡ của đất và

chế độ phân bón (Koske et al. 1989), đặc điểm vật hậu của cây chủ (Giovannetti

and Avio 2002), cường độ ánh sáng (Daft and El Giahmi 1978), và khả năng cạnh

tranh của từng loài nấm (Koske et al. 1989). Bào tử có kích thước tương đối lớn

(50 ÷ 500 µm), lớn hơn nhiều so với bào tử của những loại nấm khác. Vai trò của

bào tử là phát tán đến nơi sống mới, và khởi đầu quá trình sinh trưởng khi được

tách ra từ cơ thể mẹ. Do đặcđiểm cấu trúc các thành phần cấu tạo nên bào tử ổn

a b


định trong những điều kiện sinh thái khác nhau nên chúng được coi là tiêu chí quan

trọng trong phân loại AM.

Hình 1.4: Sơ đồ cấu truc AM điển hình

(Bao gồm arbuscules, vesicles, sơi nấm ngoại bào và bào tư)

(Nguồn: http://mycorrhizas.info/vam/vamsoil2.gif)

c. Sinh trưởng

AM là thể cộng sinh bắt buộc. AM có thể tồn tại một thời gian dài trong đất,

thậm chí khi đất bị hạn hay băng giá dưới dạng các mảnh sợi nấm trong các rễ chết

hoặc tự do trong đất. Tuy nhiên, để sinh trưởng được trong một thời gian dài AM

cần có cây chủ để thu nhận cacbon và năng lượng cần thiết. Do đặc điểm này mà

không thể tiến hành nuôi cấy AM trực tiếp trên môi trường nhân tạo mà cần phải

có giá thể là rễ của thực vật bậc cao.

d. Chu trình sinh sản và vòng đời

Không có chứng liệu về sự sinh sản hữu tính của AM. Nghiên cứu bằng chỉ

thị phân tử đã xác định không có sự tái tổ hợp hoặc ở mức độ rất thấp (Kuhn et al.


2001). Vì thế thường giả định rằng bào tử được hình thành bằng sinh sản vô tính

bằng bào tử hoặc sợi nấm.

Phương thưc nay mâm cua bào tử: Trong nhưng điêu kiên nhiêt đô thich hơp ,

bào tử AM sẽ nảy mầm trong đất , trên rê cây chu , hình thành sợi nấm tạo mạng

lươi hê sơi phân bô trong đât va ăn sâu vao rê cây chu . Bào tử có thể tạo ra hệ sợi

nâm bên trong cung như bên ngoai rê.

Sinh san băng sơi nâm: Nhiêu loai AM co thê nhân lên tư manh sơi nâm trong

đât hoăc trưc tiêp tư thê công sinh trên rê cây. Đặc điểm của nấm rễ nội cộng sinh AM

là thể cộng sinh bắt buộc với rễ cây chủ, do đo nêu không co rê cây chu cho cac sơi

nâm nay mâm va công sinh thi sinh trương cua nâm se bi ngưng trê lai sau môt thơi

gian va tê bao chât co thê co lai bên trong bao tư.

Phương thưc nuôi cây: Đê nuôi cây nâm rê nôi công sinh AM , có thể sử dụng

hai phương thưc nuôi cây , đo la: nuôi cây in vitro và in vivo. Đối với nuôi cấy in

vivo, có thể nuôi cấy trong chậu bằng đất hiện trường có chứa bào t ử hay sợi nấm

(Bianciotto va công sư , 2000; Hijri va công sư , 2002). Còn đối với nuôi cấy in

vitro, có thể tạo ra một số lượng lớn nấm rễ thông qua nuôi cấy mô rễ trên môi

trương nuôi cây nhân tao (Fortin et al. 2002). Đặc biệt là trong nuôi cấy mô rễ, sinh

khôi nâm rê tao ra thương không chưa tap chât va cac vi sinh vât khac nên phương

pháp này được sử dụng nhiều.

1.1.3. Vai trò của nấm rễ nội cộng sinh với cây chủ

Nấm rễ là thể sống cộng sinh bắt buộc. Những hoạt động của nấm cũng như

của thực vật có vai trò hỗ trợ cho nhau. Nấm sử dụng nguồn cacbon từ thực vật

dưới dạng đường hexoses và các vitamin. Sự vận chuyển cacbon từ thực vật sang

nấm được thực hiện nhờ arbuscules hoặc các sợi nấm nội bào. Tại các sợi nấm nội

bào diễn ra quá trình biến đổi dinh dưỡng thứ cấp để cung cấp glycogen, pentose,

lipit… cho hoạt động của nấm (Turmel 2004). Gần 20% cacbon do thực vật tổng

hợp được chuyển sang nấm và khoảng 25% cacbon nguồn gốc từ thực vật được

nấm biến đổi và dự trữ ở những sợi nấm ngoại bào, việc này góp phần làm tăng

thêm nguồn hữu cơ trong đất.


Lợi ích của AM đối với thực vật chủ yếu là tăng cường cải thiện hấp thụ các

chất dinh dưỡng và nước, trong đó quan trọng nhất là tăng cường hấp thụ dinh

dưỡng lân (P), hấp thụ nước, chống chịu với các yếu tố bất lợi của môi trường, đặc

biệt trên các hiện trường đất đai cằn cỗi, khô hạn. Hoạt động này được tăng cường

là do nấm rễ nội cộng sinh hình thành nhiều hệ sợi nấm phân nhánh mảnh tạo

thành vô số cầu nối giữa môi trường đất với các tế bào rễ, tăng diện tích tiếp xúc

với đất, biến đổi môi trường quanh rễ làm cho các chất trở nên linh động và thực

vật có thể hấp thụ được (đến 80% nhu cầu về P và 25% nhu cầu về N của cây được

cung cấp nhờ nấm) (Turmel 2004). Sợi nấm có thể lan rộng đến 8cm quanh rễ và

hấp thụ chất dinh dưỡng vận chuyển lại vào rễ, tăng khả năng hấp thụ các chất dinh

dưỡng cao hơn so với lông rễ 10 lần. Tốc độ thâm nhập của P qua sợi nấm cao gấp

6 lần so với qua các lông rễ.

Không những thế, thực vật còn được hưởng lợi nhờ được tăng cường khả

năng hấp thụ nước và bảo vệ rễ khỏi nguồn bệnh. AM có vai trò kích thích sinh

trưởng thực vật bằng cách tiết ra rất nhiều các chất kích thích sinh trưởng như

auxins, cytokinins, gibberellic acids và một số chất kháng sinh để bảo vệ cây chủ

chống lại các mầm bệnh từ trong đất.

Sự cộng sinh AM có thể làm tăng cường sinh trưởng của cây con lên đến

400%, giúp cây có khả năng chống chịu với điều kiện khô hạn và nghèo dinh

dưỡng (Pope 2007). Thực tế ở những loài gỗ lớn có cộng sinh AM cho thấy cây

vẫn tồn tại và sinh trưởng trong điều kiện độ ẩm rất thấp trong khi những cây

không có cộng sinh thì không sống được hoặc sinh trưởng yếu. Kết quả nghiên cứu

cũng cho thấy, sinh trưởng của cây con những loài gỗ lớn có sự cộng sinh AM đạt

ngang với cây không có sự cộng sinh nhưng chúng chỉ sử dụng lượng dinh dưỡng

bằng một nửa. Những loài sống phụ thuộc vào AM chủ yếu là ở những nơi đất

chặt, khô cằn, có hệ rễ ít phân nhánh vì lúc đó lượng chất dinh dưỡng tồn tại nhiều

ở dạng khó tiêu, rễ cây không thể hấp thụ được mà phải nhờ đến sự lan rộng của hệ

sợi nấm.


Hình 1.5. Cây Medicago truncatula phát triển bình thường (a)

Cây Medicago truncatula có cộng sinh nấm rễ (b)

Nguồn:(Lan 2011)

Nấm AM không phải là một thành phần chính trong đất nhưng có vai trò

quan trọng trong sự điều chỉnh hoạt tính sinh học của đất nhờ sự phân bố rộng

khắp của hệ sợi nấm AM trong lớp đất tầng mặt. Nấm AM hấp thụ trực tiếp hợp

chất carbon do cây cố định và cấu thành đầu vào chính của carbon và năng lượng

trong đất, chúng phân phối carbon này khắp cả khu vực đất quanh rễ cây cho vi

sinh vật đất sử dụng. Lượng cacbon đáng kể được vận chuyển bằng hệ sợi nấm từ

cây này sang cây khác đã được xác định (Simard et al. 1997). Điều này giúp giảm

sự cạnh tranh giữa các loài khác nhau và góp phần vào tính ổn định và đa dạng của

hệ sinh thái.

AM tham gia vào biến đổi mối quan hệ đất- cây- nước, tăng cường sự thích

nghi của thực vật với các điều kiện bất lợi (khô hạn, nhiễm kim loại). Ở những nơi

có hàm lượng kim loại nặng cao, AM có vai trò khử độc môi trường giúp cây sinh

trưởng tốt (Songul and Sevinc 2002).Bắt đầu từ cải thiện hấp thụ nước và các chất

dinh dưỡng quan trọng cho sự sinh trưởng của cây sẽ dẫn tới tăng hiệu suất quang

hợp, sự vận chuyển chất dinh dưỡng và sự trao đổi chất của cây. Cây sinh trưởng

nhanh, giảm bớt việc sử dụng phân bón hóa học (đôi khi lên tới một nửa lượng dự

kiến) dẫn tới tăng thu nhập cho nông dân. Kết quả thử nghiệm phân bón sinh học

mycorrhiza trên cây Asparagus đã chứng minh được điều đó, khi những nông dân

sử dụng lượng phân bón hóa học cùng với phân bón sinh học mycorrhiza thì năng

a b


suất cây trồng được cải thiện hơn 50% và thu nhập của nông dân tăng 61% so với

khi sử dụng chỉ mỗi phân bón hóa học.

1.2. Tổng quan về vi khuẩn Agrobacterium rhizogenses

Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenses lần đầu tiên được phát hiện cách đây

hơn 70 năm (Riker et al. 1930, Hildebrand 1934, White 1972) như một yếu tố gây

nên bệnh ―lông rễ― (hairy-root disease) ở một số thực vật. A. rhizogenses thuộc

Chi Agrobacterium, là vi khuẩn đất, gram âm, có hình que. A. rhizogenses có quan

hệ gần gũi với vi khuẩn A. tumefaciens, một loại vi khuẩn được biết nhiều đến vì

gây nên bệnh ―u biếu thực vật― (crown gall disease) rất phổ biến (Conn 1942).

Cơ chế nhiễm thông qua quá trình tiếp xúc, vi khuẩn A. rhizogenses chuyển

một đoạn T-DNA, trong đó có mang các gen liên quan đến tạo lông rễ(rol-genes),

gen liên quan tới quá trình sinh tổng hợp và cả các gen chưa xác định được chức

năng trong vòng Ri- Plasmid của chúng vào bộ gen của tế bào thực vật chủ; các

gen (rol-genes) trong T-DNA tương tác với gen của thực vật chủ để tạo ra lông rễ.

Các biểu hiện gen có chứa các thông tin được mã hóa trong T-DNA này đã thúc

đẩy quá trình phát triển và sản xuất ra lông rễ với hầu hết các thực vật hai lá mầm

(Veena and Taylor 2007) (Hình 1.6). Quá trình chuyển các gen (rol-genes) trong T-

DNA từ vi khuẩn A. rhizogenses sang thực vật chủ có thể được xảy ra ngẫu nhiên,

cũng có thể được thực hiện bằng các kỹ thuật đồng nuôi cấy đơn giản với các

chủng A. rhizogenses hoang dại tự nhiên (Abdoulaye 2003, Chabaud et al. 2006),

và cũng có thể thực hiện bằng kỹ thuật biến nạp gen hiện đại (Pak et al. 2009, Park

et al. 2011).

Vi khuẩn A. rhizogenses tiếp cận chuyển gen T-DNA sang thực vật chủ

thông qua các ―vết thương―, các hợp chất phenolic tiết ra từ các vết thương của tế

bào thực vật đã hấp dẫn A. rhizogenses, sau quá trình nhiễm là quá trình hợp nhất

các nguyên liệu di truyền T-DNA của A. rhizogenses với hệ gen thực vật chủ, và

kết quả tạo nên bệnh lông rễ (Veena and Taylor 2007). Về hình thái học, lông rễ

tạo ra do vi khuẩn A. rhizogenes có hình dạng và cấu trúc rất giống với các loại rễ

thông thường, tuy nhiên nó có những tính trạng rất đặc trưng, dễ dàng nhận biết là:


tóc rễ dài, sinh khối rễ lớn, phân nhánh nhiều, tóc rễ phát triển nghiêng và không

có tính hướng đất (negative geotropism)

Bệnh lông rễ từ vi khuẩn A. rhizogenses được nghiên cứu áp dụng rộng rãi

như một công cụ hữu hiệu cho các nghiên cứu trao đổi chất thứ cấp, chức năng

gen, cộng sinh vi khuẩn cố định đạm rhizobium, nấm rễ nội cộng sinh AM

(Abuscular mycorhizae), và các đặc tính sinh học rễ thực vật khác (Tsuro et al.

2005, Chabaud et al. 2006, Veena and Taylor 2007, Sidwa-Gorycka et al. 2009,

Park et al. 2011).

Hình 1.6:Cấu trúc vòng Ri-plasmids của vi khuẩn A. rhizogenes

(Veena and Taylor 2007)

1.3. Nghiên cứu nấm rễ nội cộng sinh trên Thế giới và Việt Nam

1.3.1. Trên Thế giới

Giai đoạn đầu, các nghiên cứu về AM trên thế giới tập trung ở các mặt: đa

dạng sinh học của các chủng bản địa, phân loại, chọn lọc các chủng hiệu lực với

từng đối tượng cây trồng và đất trồng khác nhau, đồng thời phát triển những

phương pháp để định lượng và nhân nhanh chúng. Phương pháp nhân sản xuất chất


nhiễm AM truyền thống là sử dụng các thực vật chủ (trap plant) để nhân AM trong

nhà kính, vườn ươm từ hệ rễ của chúng trên các giá thể gây trồng khác nhau (in

vivo). Bằng phương pháp này, chất nhiễm AM thu được còn được gọi là ―soil

innoculum‖ ở dạng thô, thường có độ sạch AM không cao, số lượng, chất lượng

AM (IP- infective propagules) và hiệu quả áp dụng còn bị hạn chế. Vấn đề đặt ra là

cần có một công nghệ cao hơn, hiệu quả hơn để có thể nhân sinh khối lớn, sản xuất

chế phẩm chất nhiễm AM thuần khiết, chất lượng và có hiệu quả áp dụng cao cho

tăng sinh trưởng, chất lượng sản phẩm cây trồng và bảo vệ môi trường đất. Trong

công nghệ này, chúng ta cần phải chú ý tới một đặc tính quan trọng của nấm rễ nội

cộng sinh AM, đó là, trong bất kỳ điều kiện nuôi cấy nào, ở bên ngoài môi trường

đất (in vivo) hay trong điều kiện nuôi cấy vô trùng (invitro), sinh khối của chúng

chỉ có thể được nhân lên khi hình thành được cộng sinh với tế bào vỏ rễ của các

thực vật chủ. Do đó, việc sử dụng môi trường dinh dưỡng nhân tạo không có giá

thể mô rễ không đáp ứng được nhu cầu sinh trưởng, phát triển của AM (Roger et

al. 2004b).

Nghiên cứu về AM thường xuyên bị cản trở bởi đặc tính cộng sinh bắt buộc

của chúng (Bago and Bécard 2002). Một hướng nghiên cứu mới đó là, nuôi cấy in

vitro đã phát huy được rất nhiều lợi thế, nó cho phép nghiên cứu được cơ bản

những đặc tính sinh lý của sự cộng sinh nấm-rễ. Những nghiên cứu thử nghiệm

đầu tiên đã được tiến hành, có thể kể đến như (Mosse and Hepper 1975a). Sau đó

được bổ sung bởi (Fortin et al. 2002)(Declerck et al. 2005).

Trong những năm 1980, sự phát triển công nghệ nuôi cấy mô rễ đã mở ra

một hướng đi mới, cho phép nuôi cấy thành công một số chủng AM trong điều

kiện in vitro. Sử dụng phương pháp này, nấm AM và rễ cây được nhân lên đồng

thời và nhanh chóng qua một số lần cấy chuyển, thời gian được rút ngắn rất nhiều

và đảm bảo được độ thuần khiết cao (Fortin et al. 1996b).

Hai loại môi trường được sử dụng thường xuyên nhất trong nuôi cấy AM in

vitro là môi trường M(BeCard and Fortin 1988) và môi trường MSR (Strullu and

Romand 1986, Declerck et al. 1998). Cả hai loại môi trường này đều có chứa các

nguyên tố đa lượng, vi lượng, vitamin và đường (Cranenbrouck et al. 2005). Đồng


thời, chúng có thể được làm rắn bởi hợp chất Agargel hoặc Phytagel. Năm 2006,

nhóm nghiên cứu của Gadkar và cộng sự (Gadkar et al. 2006) đã tiến hành nuôi cấy

AM trên môi trường M lỏng bằng phương pháp chia ngăn. Theo đó, một ngăn của đĩa

petri nuôi cấy nấm có cung cấp thêm đường, ngăn còn lại không có đường cũng như

vitamin. Giống như trong phương pháp nuôi cấy in vivo, việc cung cấp đầy đủ ôxi cho

môi trường lỏng là việc làm cần thiết trong nuôi cấy in vitro(Jolicoeur et al. 1999).

Tuy nhiên, một vài nghiên cứu đã chỉ ra rằng, môi trường MSR (Strullu and

Romand 1986, Declerck et al. 1998) là môi trường đã được biến đổi thành phần với

mục đích tối ưu hóa cho sự phát triển của nấm rễ trong điều kiện in vitro. Trong đó,

thành phần đa lượng của MSR là tương tự trong môi trường M (Minimal medium).

Sự khác nhau giữa hai loại môi trường này là ở thành phần vitamin: MSR vừa thiếu

iốt, myo-inositol và glycin còn trong thành phần vitamin của môi trường M thiếu

panthotenate, biotin và cyanocobalamine. Tuy nhiên, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng,

sự vắng mặt của những thành phần này không có hiệu quả tiêu cực rõ rệt đến sự

cộng sinh AM.

Trong những năm 2000, rất nhiều nghiên cứu về công nghệ nuôi cấy AM in

vitro được tiến hành trên môi trường MSR (Strullu and Romand 1986, Declerck et

al. 1998) không bổ sung đường và vitamin (Voets et al. 2005a)(De Boulois et al.

2006)và được làm rắn bởi Phytagel hoặc Agargel. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng, việc

bổ sung đường và vitamin là không cần thiết trong hệ thống nuôi in vitro vì thực

vật có khả năng tự quang hợp tạo đường và chuyển hóa vitamin cần thiết cho sự

phát triển của chúng. Nghiên cứu của (Declerck et al. 2009) cũng sử dụng MSR mà

không có đường và vitamin.

Năm 1996, St-Arnaud và cộng sự (St-Arnaud et al. 1996) lần đầu tiên sử

dụng phương pháp chia ngăn. Trong phương pháp này, đĩa petri được chia thành

hai ngăn riêng biệt, một ngăn có chứa giá thể rễ, ngăn còn lại chỉ có AM phát triển.

Sử dụng phương pháp phân chia đĩa, (Douds 2002a) đã chứng minh được rằng, bào

tử AM tiếp tục được hình thành sau khi có sự bổ sung môi trường có đường từ

ngăn chứa giá thể rễ.


Việc nghiên cứu về AM được thực hiện bởi rất nhiều nhà khoa học, có thể

kể đến như (Chabot et al. 1992)(Declerck et al. 2001)(Douds 2002b)(St-Arnaud et

al. 1996). Giá thể đầu tiên được sử dụng cho nuôi cấy này là rễ Cà rốt. Tuy nhiên,

trong những năm gần đây, nhiều loại giá thể khác nhau đã được đưa vào sử dụng

thành công như Chicory (Cichorium intybus L.) và Medicago(Medicago truncatula

Gaertn)(Boisson-Dernier et al. 2001)(Fontaine et al. 2004). Tuy nhiên, việc sử

dụng các loại giá thể khác nhau có ảnh hưởng khác nhau đến việc sản sinh bào tử

AM (Tiwari and Adholeya 2003). Voets và cộng sự, 2005 (Voets et al. 2005b) đã

nghiên cứu sử dụng giá thể là rễ cây khoai tây (Solanum tuberosum L.) và thu được

gần 12.000 bào tử/ đĩa petri sau 12 tuần nuôi cấy. Gần đây, một kết quả nghiên cứu

khác đã thu được gần 50.000 bào tử/đĩa petri khi cộng sinh giữa chủng G.

intraradices (MUCL 41.833) với rễ cây Medicago sau 14 tuần nuôi cấy. Một số giá

thể khác như chuối (Koffi et al. 2009) hay nho cũng có khả năng cộng sinh với AM

nhưng không đáp ứng được nhu cầu áp dụng sản xuất bào tử trên quy mô lớn.

Năm 1996, Fortin và cộng sự (Fortin et al. 1996a) đã trình bày phương pháp

nuôi cấy AM in vitro sử dụng 2 nguồn nguyên liệu là rễ đã được chuyển gen Ri-

tDNA hoặc chưa được chuyển gen. Phương pháp chọn cây chủ, kỹ thuật cộng sinh

rễ AM, thành phần môi trường nuôi cấy. Nghiên cứu cũng đồng thời trình bày khả

năng nuôi cấy và tạo bào tử liên tục trong môi trường in vitro, phương pháp bảo

quản bào tử trong thời gian dài. Những lợi ích khi nuôi cấy AM in vitro, cho phép

phát triển nghiên cứu sâu và rộng hơn như hình thái AM, phân loại và tìm hiểu cơ

chế cộng sinh với rễ.

Trong nghiên cứu nhân sinh khối rễ có mang Ri-plasmid của vi khuẩn

Agrobacterium rhizogenes, nhóm tác giả (Mugnier and Mosse 1987) đã quan sát

thấy có sự hình thành nhiều lông rễ trong môi trường nhân tạo và đã thúc đẩy cơ sở

cho nhân sinh khối AM in vitro. Tác giả đã quan sát thấy sự cộng sinh hình thành

giữa AM và rễ chuyển gen khi nuôi cấy cùng với bào tử Glomus mosseae. Tuy

nhiên đã có sự sinh trưởng giới hạn và chu trình sinh trưởng phát triển hoàn chỉnh

của AM trong môi trường in vitro chưa được hoàn thiện. Trong nhiều nghiên cứu

sau đó, các nhóm tác giả đã nghiên cứu AM in vitro theo nhiều hướng khác nhau


nhằm tìm ra điều kiện để thu hồi được sinh khối AM chất lượng nhiều nhất trong

thời gian ngắn nhất. Các nghiên cứu bao gồm thành phần môi trường nuôi cấy,

phương thức cộng sinh, phương thức nuôi cấy, phương thức thu hồi AM… Một

trong những kết quả nổi bật có thể kể đến là (Fortin et al. 1996b) đã thu hồi được

30.000 bào tử sau 6 tuần nuôi cấy AM in vitro qua rễ Cà rốt có chuyển gen Ri trên

đĩa petri và thu hồi được 120.000 bào tử AM sau 2 tháng nuôi cấy bằng bioreator.

Đây là kết quả hết sức có ý nghĩa để phát triển và hoàn thiện công nghệ nhân

nhanh AM in vitro.

(Jolicoeur et al. 1999) đã công bố sản suất chế phẩm từ loài Glomus

intraradices bằng bioreactor. Bằng phương pháp nuôi cấy Glomus intraradices với

rễ cây Cà rốt được chuyển gen Ri-tDNA của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

trên đĩa petri và bioreactor đã cho kết quả tăng sinh khối AM cực đại đạt ~ 0,6g

sinh khối khô trong 1lít môi trường, khi phát triển quả giá trị đó sinh trưởng của rễ

sẽ bị suy giảm. Trong điều kiện tối thích nuôi cấy trên đĩa petri, tốc độ sinh trưởng

rễ tối đa và bào tử G. intraradices lần lượt là 0,021 và 0,035/ngày. Nghiên cứu

bước đầu nhân sinh khối AM trong bioreactor luân chuyển khí đã cho kết quả thấp

hơn so với nuôi cấy trên đĩa petri 10 lần và cũng thấy sự hình thành cộng sinh ít

hơn (0,13g sinh khối khô trong 1 lít môi trường). Kết quả nghiên cứu đã mở ra khả

năng nhân nhanh bào tử AM bằng bioreactor.

Gần đây, tháng 1 năm 2009, nhóm tác giả Venter, Marianne, Wilma đã báo

cáo kết quả nghiên cứu trình bày thông tin khá đầy đủ và toàn diện về nhân sinh

khối AMin vitro,bao gồm: phương pháp tạo cộng sinh AM, nhân sinh khối bào tử

AM trong môi trường in vitro, các bước phân lập bào tử từ môi trường nuôi cấy.

Nghiên cứu cũng tạo ra hạt bào tử có nhiều đặc điểm ưu trội như mật độ bào tử

cao, có tính ổn định và phân tán tốt trong môi trường đất. Hạt bào tử có thể áp

dụng trong sản xuất nông lâm nghiệp như một loại chế phẩm có thể dùng trực tiếp.

Nghiên cứu cũng đề cập đến một số thành phần có thể bổ sung vào hạt bào tử làm

tăng tác dụng ở hiện trường như chất kích thích sinh trưởng, các chất trao đổi thứ

cấp.

Công nghệ nhân sinh khối AMinvitro và chế phẩm AM tinh khiết của Viện


Năng lượng và Tài nguyên (TERI), Ấn Độ là một bước đột phá công nghệ quan

trọng trong lịch sử nghiên cứu AM trên thế giới, đã mang lại cơ hội áp dụng lớn

hơn và hiệu quả hơn. Công nghệ AM in vitro đã được TERI chuyển giao áp dụng

tới 5 nước khác trên thế giới, hiệu quả cho gây trồng nhiều loài cây nông lâm

nghiệp, trong đó có Cọc rào, đặc biệt hiệu quả cho các vùng sinh thái suy thoái

nghiêm trọng như vùng cát khô cằn, bãi thải khai thác và vùng ô nhiễm chất

thải(Adholeya and Singh 2006).

Trong nghiên cứu nấm rễ nội cộng sinh AM in vitro, mô rễ Cà rốt (Daucus

carrota L.) chuyển gen Ri-tDNA được sử dụng khá phổ biến và hiệu quả cho các

nghiên cứu cộng sinh AM in vitro, sản xuất sinh khối AM invitro và sản xuất chế

phẩm AM (Declerck et al. 1996, Douds Jr 1997, Abdoulaye 2003, Ijdo et al.

2011).

Mặc dù, hiện nay, phương pháp nuôi cấy AM in vitro vẫn còn một vài hạn

chế như việc cần đầu tư khá tốn kém về nhân lực cũng như trang thiết bị phục vụ

cho nghiên cứu nhưng với những ưu thế của nó, đặc biệt là việc có thể kiểm soát

chất lượng chế phẩm AM cũng như giảm nguy cơ ô nhiễm thì trong tương lai, đây

sẽ là một hướng đi mới có khả năng đáp ứng được tiêu chuẩn chất lượng cho sản

xuất thương mại hàng loạt.

Trong những thập kỷ qua, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về AM theo

cả chiều rộng lẫn chiều sâu. Với hơn 40 bằng sáng chế liên quan đến AM, trong đó

có nghiên cứu về những đặc tính có lợi của AM. Một số nghiên cứu lại tập trung

vào kỹ thuật nuôi cấy (Sylvia and Jarstfer 1992), một số khác nghiên cứu các ứng

dụng của nó (Cano and Bago 2007)(Fernandez et al. 2006), và phương pháp nuôi

cấy trên các loại giá thể khác nhau (Mosse and Thompson 1981b) hoặc nuôi cấy

trong điều kiện in vitro(Declerck et al. 1996)(Cranenbrouck et al. 2005)(Declerck

et al. 2009)(Fortin et al. 1996b)(Mugnier et al. 1986)(Wang 2003).

Hiện nay trên thế giới, nghiên cứu phát triển công nghệ AM cho mục tiêu

phục vụ cây trồng nông lâm nghiệp, làm tăng sinh trưởng, năng suất và chất lượng

sản phẩm cũng như phục vụ các mục tiêu làm sạch môi trường, góp phần làm cân

bằng ổn định các hệ sinh thái đang ngày càng được quan tâm đầu tư nhiều hơn về


mọi khía cạnh, nghiên cứu chuyên sâu và mở rộng lĩnh vực áp dụng công nghệ và

sản phẩm. Nhiều trung tâm nghiên cứu lớn về AM trên thế giới được thành lập để

tiếp tục phát triển và ứng dụng không chỉ những sản phẩm AM mà còn cả những

giải pháp công nghệ cho thực tiễn sản xuất, các hệ sinh thái và môi trường sống.

Một số trung tâm lớn có thể kể đến như INVAM (Mỹ), GINCO (Canada),

CESAMM (Bỉ), Mycorrhiza Association (Úc), TERI (Ấn Độ), ACT (Đài Loan)

v.v.

1.3.2. Trong nước

Ứng dụng nấm rễ ngoại cộng sinh Ectomycorrhiza cho sản xuất cây con thông

nhựa đã được nghiên cứu bằng việc sử dụng đất mùn rừng thông như một loại chất

nhiễm tự nhiên (natural soil innoculum) và tuyển chọn sản xuất chất nhiễm nhân

tạo (Giao and Nhâm 1988). Tuy nhiên, quy mô & kết quả áp dụng còn rất hạn chế.

Lê Quốc Huy với nghiên cứu kỹ thuật mycorrhiza cho lâm nghiệp (Viện

nghiên cứu năng lượng TATA, New Delhi - Ấn Độ, 1999)(Huy 1999) đã đưa ra

một hướng đi mới cho nghiên cứu mycorrhiza ở Việt Nam

Nghiên cứu Ectomycorrhiza cho Bạch đàn và Phi lao (Phạm Quang Thu, Viện

Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, (Nguyễn Văn Mão, Trường Đại học Lâm nghiệp)

đã có những kết quả bước đầu ứng dụng thử nghiệm vườn ươm và rừng trồng .Sản

xuất chế phẩm nấm cộng sinh đa chủng chức năng cho cây Lâm nghiệp (Phạm

Quang Thu, 2001- 2004). Đề tài đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm nấm cộng sinh

cho Thông và Bạch đàn dưới dạng bột chứa bào tử hữu tính của nấm Pisolithus

tinctorius và một số vi sinh vật chức năng. Hiệu quả của chế phẩm khi nhiễm cho

bạch đàn PN2 trồng trên các lập địa thoái hoá cho thấy có sự khác biệt rõ rệt so với

đối chứng.Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh hỗn hợp dạng viên nén

cho bạch đàn và thông trên các lập địa thoái hoá, nghèo chất dinh dưỡng(Thu

2006-2010).

Chế phẩm nấm rễ ngoại cộng sinh (ECM) dạng viên nang (gel) đã được

nghiên cứu và áp dụng thử nghiệm cho đối tượng cây Sao đen (Hopea odorata),

nhằm tăng sinh trưởng, sản xuất cây con Sao đen chất lượng cao cung cấp cho

trồng rừng. Kết quả áp dụng đã làm tăng sinh trưởng cây con sao đen tại vườn ươm


lên 50-80% so với đối chứng. Tuy nhiên, vấn đề tồn tại cần được tiếp tục nghiên

cứu giải quyết đối với chế phẩm ECM dạng này đó là tỷ lệ sống sót của các sợi

nấm ECM trong viên Gel giảm nhanh chóng sau một thời gian bảo quản, và làm

sao để bảo quản cho sử dụng dạng chế phẩm này trong một thời gian dài, tối thiểu

là 6 tháng cũng đã được đặt ra (Châu and Huy 2007).

Các nghiên cứu trên chủ yếu tập trung nấm rễ ngoại cộng sinh

Ectomycorrhiza. Dotính chất đặc biệt của Nấm rễ nội cộng sinh Abuscular

mycorrhiza (AM), việc nghiên cứu AM cần có phương pháp tiếp cận khác; các

chủng AM phân lập tuyển chọn từ một đối tượng cây chủ này có khả năng ứng

dụng hiệu quả cho nhiều loài cây trồng khác, nghiên cứu và ứng dụng AM trong

lâm nghiệp hiện nay tại Việt Nam là một đòi hỏi hết sức cần thiết.

Đề tài Nghiên cứu, áp dụng kỹ thuật phát triển cộng sinh mycorhiza cho một

số cây trồng chính tại một số vùng sinh thái phục vụ sản xuất nông nghiệp bền

vững ở Việt Nam (Viện Thổ Nhưỡng Nông Hoá 2004 -2006) đã cho thấy vai trò

của cộng sinh nấm rễ cây không chỉ thúc đẩy sinh trưởng mà còn ảnh hưởng tốt

đến năng suất cây trồng nông và lâm nghiệp.

Nghiên cứu sự đa dạng nấm cộng sinh Arbuscular mycorrhiza ở cỏ Vetiver từ

đất ô nhiễm chì(Chính and Cường 2007).

Nghiên cứu phương pháp nuôi cấy dung dịch lỏng (MS cải tiến) in vitro Keo

lai và Keo tai tượng (hay gọi là phương pháp ―nuôi cấy trên cầu giấy‖) nhằm làm

nảy mầm bào tử AM và xúc tiến quá trình hình thành cộng sinh AM trong rễ Keo

đã được tiến hành thành công(Huy and Châu 2004). Kết quả phương pháp là một

cơ sở quan trọng cho thử nghiệm phát triển phương pháp nuôi cấy nhân nhanh sinh

khối AM in vitro và Bioreactor cải tiến cho sản suất chế phẩm AM.

Những kết quả bước đầu về phân lập, tuyển chon các chủng AM cho sản xuất

thử chế phẩm in vivo và nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của bón nhiễm một số loại

chế phẩm AM tới sinh trưởng và năng suất quả hạt của cây Cọc rào tại vườn ươm

và rừng trồng rất khả quan (thực hiện tại Trung tâm CNSH Lâm nghiệp, Viện

Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam). Tại vườn ươm, khi áp dụng bón nhiễm chế

phẩm AM 25mg/cây (200IP) đạt được phản ứng sinh trưởng cao nhất của cây con

Cọc rào về đường kính (D), chiều cao (H) và sinh khối (P) sau 24 tuần thí nghiệm,


tăng hơn so với đối chứng tương ứng cho các chỉ tiêu là 18,8%, 27,4% và 63% (Vũ

Quý Đông, 2009).

Tương tự, kết quả đánh giá mức độ cộng sinh AM trong tế bào rễ cây Cọc rào

vườn ươm với các loại chế phẩm AM và công thức nhiễm khác nhau đã được

nghiên cứu tiến hành tại Trung tâm CNSH Lâm nghiệp: công thức FM1 25mg/cây

(≈200IP), loại chế phẩm AM in vitro của TERI cho thấy mức độ cộng sinh AM - rễ

cao nhất (F: 96,67%, và A: 39,79%, cao hơn so với đối chứng (F: 83,33% và A:

16,62%) (Vũ Quý Đông, 2009).

Kết quả áp dụng bón nhiễm chế phẩm AM cho Cọc rào trồng rừng tại vùng cát

khô hạn Ninh Phước, Ninh Thuận sau 01 năm trồng đã làm tăng năng suất hạt

trung bình đạt 25-35% so với đối chứng không bón nhiễm(Huy et al. 2009).

Tuy nhiên những nghiên cứu về nấm rễ nội cộng sinh AM mới chỉ khởi đầu,

chưa có những nghiên cứu chuyên sâu và hệ thống về công nghệ chế phẩm AM in

vitro và do đó kết quả và sự ứng dụng còn rất hạn chế.Phát triển nghiên cứu ứng

dụng công nghệ AM trong nông lâm nghiệp, phục vụ gây trồng rừng, quản lý phục

hồi sinh thái là một hướng đi quan trọng, phù hợp với những nỗ lực phát triển trên

thế giới.

Chƣơng 2: VẬT LIỆU -NỘI DUNG - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU


2.1. Vật liệu nghiên cứu

- Hạt Cà rốt (Daucus carrota L.), hạt Medicago (Medicago truncatula) được

sử dụng để tạo vật liệu mô rễ in vitro không có gen Ri-tDNA tại Trung tâm Công

nghệ sinh học Lâm nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam.

- Mô rễ Cà rốt (Daucus carrota L.)in vitro được nghiên cứu tạo ra tại Phòng

thí nghiệmCông nghệ vi sinh và Sinh học môi trường, Trung tâm Công nghệ sinh

học Lâm nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam; trong khi đó mô rễ

Medicago ( Medicago truncatula) in vitro có Ri-tDNA được cung cấp từ Phòng thí

nghiệm AM của Trung tâm CESSAM (Trung tâm nghiên cứu Nấm rễ nội cộng

sinh in vitro, Đại học Catholique, Louvain-la-Neuve, Vương quốc Bỉ).

- Chủng AM sử dụng cho nghiên cứu bao gồm (i) chủng 41833 (Glomus

intraradices)được cung cấp từ trung tâm CESAMM (Trung tâm nghiên cứu Nấm

rễ nội cộng sinh in vitro, Đại học Catholique, Louvain-la-Neuve, Vương quốc Bỉ),

trong báo cáo này được gọi tắt là chủng AM 41 (ii) chủng M7 (Glomus sp.) là

chủng bản địa được phân lập, tuyển chọn tại Phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh

và Sinh học môi trường, Trung tâm Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Viện Khoa

học Lâm nghiệp Việt Nam, trong báo cáo này được gọi tắt là chủng AM7.

- Chủng AM sử dụng cho nghiên cứu bao gồm (i) chủng 41833 (Glomus

intraradices) được cung cấp từ trung tâm CESAMM (Trung tâm nghiên cứu Nấm

rễ nội cộng sinh in vitro, Đại học Catholique, Louvain-la-Neuve, Vương quốc Bỉ),

(ii) chủng M7 (Glomus sp.) là chủng bản địa được phân lập, tuyển chọn tại Phòng

thí nghiệm Công nghệ vi sinh và Sinh học môi trường, Trung tâm Công nghệ sinh

học Lâm nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam.

- Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenses: Chủng A4 từ Phòng thí nghiệm

CESAMM (Trung tâm nghiên cứu Nấm rễ nội cộng sinh in vitro, Đại học

Catholique, Louvain-la-Neuve, BELGIUM).

2.2. Nội dung nghiên cứu


2.2.1. Nghiên cứu tạo vật liệu giá thể mô rễ in vitro

- Nghiên cứu tạo vật liệu giá thể mô rễ Cà rốt (Daucus carrota L.) và

Medicago (Medicago truncatula) in vitro không có gen Ri-tDNA.

- Nghiên cứu tạo vật liệu mô rễ Cà rốt (Daucus carrota L.) in vitro có gen

Ri-tDNA.

2.2.2. Đánh giá ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân sinh

khối cộng sinh nấm rễ AM in vitro

CTTN Môi trƣờng

CT1 MSR 0,5% agar

CT2 MSR lỏng (không agar)

CT3 MS 0,5% agar

2.2.3. Đánh giá ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân

sinh khối cộng sinh nấm rễ AM in vitro

CTTN pH

CT1 5,0

CT2 5,5

CT3 6,0

2.2.4. Đánh giá ảnh hưởng của giá thể mô rễ đến khả năng nhân sinh khối cộng

sinh nấm rễ AM in vitro

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

CTTN Loại giá thể mô rễ

CT1.1 Mô rễ Cà rốt có gen Ri-tDNA

CT1.2 Mô rễ Cà rốt không gen

CT2.1 Mô rễ Medicago có gen Ri-tDNA

CT2.2 Mô rễ Medicago không gen


2.3.1.Phương pháp bố trí thí nghiệm

- Trong thí nghiệm về Đánh giá ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả

năng nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro, sử dụng giá thể là mô rễ Cà rốt và

Medicago có chuyển gen Ri-tDNA cộng sinh với chủng 41833 và chủng M7.

- Trong thí nghiệm về Đánh giá ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng

nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro, sử dụng môi trưởng MSR 0,5% agar (là loại

môi trường đã được lựa chọn với mục đích tối ưu hóa cho khả năng nhân sinh khối

cộng sinh AM in vitro trong thí nghiệm ở mục 2.2.2).

- Trong thí nghiệm về Đánh giá ảnh hưởng của giá thể mô rễ đến khả năng

nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro, sử dụng môi trường nuôi cấy là môi trường

MSR 0,5% agar, pH 5,5.

2.3.2. Phương pháp tạo vật liệu mô rễ in vitro

a. Tạo vật liệu mô rễ không chuyển gen Ri-tDNA(Abdoulaye 2003, Chabaud et al.

2006)

Hình 2.1: Gieo hạt Medicago (a)

Rễ Medicago phát triển sau 5 ngày (b)

- Hạt Cà rốt và Medicago đều được khử trùng bề mặt bằng cách ngâm 15

phút trong cồn etanol 700, sau đó ngâm trong dung dịch Sodium hypochlorite 5%

trong 30 phút, tiếp theo là rửa kỹ nhiều lần bằng nước cất vô trùng.

- Hạt đã vô trùng bề mặt được cấy vào đĩa thạch 0,5% agar (5 g/lít; thực hiện

trong bốc cấy vô trùng), 5-7 hạt/đĩa, đậy kín parafin và úp ngược trong tủ ấm

270C và theo dõi nảy mầm trong thời gian 10 ngày.

a b


- Sau 7-10 ngày, hạt nảy mầm với đoạn rễ dài khoảng 3 - 5 cm, dùng panh

và dao vô trùng cắt đoạn rễ (khoảng 3 - 4 đốt phân nhánh) và chuyển sang môi

trường MS (Murashige and Skook 1962)có bổ sung IBA (Indole butylic acid) với

nồng độ 1,5 ppm, cấy chuyển và lựa chọn được các dòng mô rễ Cà rốt và

Medicago in vitro thuần, có sinh trưởng tốt nhất để sử dụng cho các thí nghiệm

tiếp theo.

b. Tạo vật liệu mô rễ chuyển gen Ri - tDNA

Tạo mô rễ invitro(Abdoulaye 2003, Chabaud et al. 2006):

Hình 2.2: Hạt Cà rốt nảy mầm sau 7 ngày gieo hạt (a)

Nhân rễ Cà rốt (b)

- Hạt Cà rốt (Daucus carrota L.) được khử trùng bề mặt bằng cách ngâm 15

phút trong cồn etanol 700, sau đó ngâm 30 phút trong dung dịch Sodium

hypochlorite 5%; tiếp theo là rửa kỹ nhiều lần bằng nước cất vô trùng.

- Hạt Cà rốt đã vô trùng bề mặt được cấy vào đĩa thạch 0,5% agar (5 g/lít;

thực hiện trong bốc cấy vô trùng), đậy kín, parafin và úp ngược trong tủ ấm 270C

và chờ nảy mầm trong 10 ngày.

- Sau khoảng 10 ngày, hạt nảy mầm với rễ trụ khoảng 1 cm, dùng panh và

dao vô trùng cắt bỏ đầu rễ (khoảng 2 mm) và chuyển sang cấy nhiễm vi khuẩn

Agrobacterium rhizogenseschủng A4 bằng cách ngâm nhúng và phủ toàn bộ bề

mặt rễ trụ và vết cắt vào dung dịch vi khuẩn A. rhizogense với nồng độ tế bào 8

triệu cfu/ml.

Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn Agrobacterium rhizogensesChủng A4

(Abdoulaye 2003, Chabaud et al. 2006):

a b


Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenses Chủng A4được duy trì nuôi cấy trên

môi trườngTY/calcium [5g/l Bacto-tryptone, 3g/l Yeast extract, 6mM CaCl2 (được

bổ sung sau khi hấp vô trùng); pH = 7,2; Agar 15g/l] . Sau 48 giờ nuôi cấy trên

môi trường TY/calcium, sinh khối khuẩn lạc A. rhizogenses được sử dụng cho cấy

nhiễm mô rễ invitro với nồng độ tế bào là 8 triệu cfu/ml.

Cấy nhiễm, đồng nuôi cấy A. rhizogenses với mô rễ invitro và chuyển gen:

- Sử dụng môi trường nuôi cấy mô rễ cấy nhiễm A. Rhizogenses là môi

trường MS (Murashige and Skoog 1962) (đa lượng, vi lượng, vitamin, không chất

kích thích sinh trưởng thực vật) 0,5% agar (Park et al. 2011).

- Hạt Cà rốt nảy mầm với rễ trụ đã cắt bỏ típ rễ được ngâm nhúng trong sinh

khối khuẩn lạc A. rhizogenses (sau 48 giờ nuôi cấy) trong 5 - 7 phút, và được phủ 1

lớp vi khuẩn, sau đó được cấy chuyển vào môi trường trên nuôi cấy trong tủ ấm

250C trong 48 giờ (tối).

- Cấy chuyển sang môi trường MS mới (0,5% agar), bổ sung kháng sinh

carbenicillin (500 mg/lít) để loại bỏ vi khuẩn A. rhizogenes và nuôi cấy phòng sinh

trưởng 200C, quang chu kỳ là 16 giờ trong 5 - 7 ngày.

- Theo dõi và chọn lựa giá thể mô rễ có sự hình thành phát triển lông rễ tốt

sau khoảng 7 - 21 ngày.

Nuôi cấy trên môi trường chọn lọc có kháng sinh và tạo ―dòng thuần mô rễ

invitro có Ri-tDNA―:

- Sau 48 giờ đồng nuôi cấy với vi khuẩn A. rhizogenses, chủng A4 trong tủ

ấm 250C (tối), Các mô rễ Cà rốt được cấy chuyển sang môi trường MS mới (0,5%

agar), bổ sung kháng sinh carbenicillin (500 mg/lít) để loại bỏ vi khuẩn A.

rhizogenes còn lại và nuôi cấy phòng sinh trưởng 20 - 250C, quang chu kỳ là 16

giờ: đánh giá hiệu quả loại bỏ vi khuẩn A. rhizogensescủa kháng sinh carbenicillin

bằng phân tích PCR (polymerase chain reaction) (Sidwa-Gorycka et al. 2009).

- Các mô rễ hình thành và phát triển lông rễ tốt nhất, phân nhánh và nhiều

nhất (dấu hiệu hình thái là đã được chuyển gen Ri-tDNA từ vi khuẩn A.

rhizogenses) được chọn lọc, cắt và cấy chuyển sang môi trường MS mới (0,5%

agar), bổ sung kháng sinh carbenicillin (500 mg/lít) để tiếp tục loại bỏ vi khuẩn A.


rhizogenes và nuôi cấy phòng sinh trưởng 20 - 250C (tối) để tạo các ―dòng thuần

mô rễ Cà rốt invitro có Ri-tDNA― (cấy 1 mô rễ 3cm/đĩa petri) (Abdoulaye 2003,

Sidwa-Gorycka et al. 2009).

- Các ―dòng thuần mô rễ invitro có Ri-tDNA― (không còn vi khuẩn A.

rhizogenes) sau đó được cấy chuyển trên môi trường MSR (0,5% agar), nuôi duy

trì trong phòng sinh trưởng hoặc tủ ấm 270C và sử dụng làm giá thể cho nghiên

cứu cộng sinh AM (Abuscular mycorrhizae) invitro(Declerck et al. 1998, Ijdo et al.

2011).

Kiểm tra mô rễ chuyển gen Ri-tDNA và hiệu quả loại bỏ vi khuẩn A.

rhizogensescủa kháng sinh carbenicillin bằng phân tích PCR (polymerase

chain reaction):

- Tách DNA từ mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri-tDNA và rễ Cà rốt không

chuyển gen Ri-tDNA (đối chứng) bằng kit tách chiết GeneJET Plant Genomic

DNA Purification Mini Kit (Fermentas), các bước thực hiện theo hướng dẫn của

nhà sản xuất và có bổ sung 1% PVP vào Lysis Buffer.. DNA sau đó được điện di

trên gen agarose 1% để kiểm tra chất lượng và được đo trên máy quang phổ

NanoDrop ND1000 để kiểm tra độ tinh sạch của mẫu. Phản ứng PCR được thực

hiện trên máy luân nhiệt C1000 Thermal Cycler (BioRad). Thành phần và chu

trình nhiệt của phản ứng PCR được thực hiện theo Krolicka et al. (2001). Tổng thể

tích cho mỗi phản ứng là 20 l với thành phần bao gồm 10 l PCR Master Mix

(Fermentas), 2 l mỗi mồi (10 pmol), 2 l của DNA (10 ng/l) và 6 l nước khử

ion vô trùng. Chu trình nhiệt gồm: 940C - 3 phút, sau đó lặp lại 35 chu kỳ của 94

0C

- 1 phút, 540C – 1 phút. 72

0C – 1 phút, cuối cùng là 72

0C – 10 phút và lưu ở 12

0C.

Sử dụng các mồi 5‗-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3‗ và 5‗-

GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3‗ để phát hiện các gen rolB và 5‗-

CTCCTGACATCAAACTCGTC-3‗và 5‗-TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3‗

trong phản ứng PCR để phát hiện các gen rolC của vi khuẩn A. rhizogenses (có

trên đoạn T-DNA) trong bộ gen của mô rễ Cà rốt.

- Nhằm khẳng định các mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri-tDNA hoàn toàn sạch vi

khuẩn A. rhizogenes, phản ứng PCR được tiến hành với các mồi virG5‗-


ACTGAATATCAGGCAACGCC-3‗và5‗-CGTCAAAGAAATAGCCAGC 3‗

(Aoyama et al. 1989) để xác định có hay không các gen virG (gen nằm trên vòng

Ri plasmid, ngoại trừ đoạn T-DNA) được chuyển sang mô rễ: Chu trình nhiệt gồm:

940C - 3 phút, sau đó lặp lại 35 chu kỳ của 94

0C - 1 phút, 54

0C – 1 phút. 72

0C – 1

phút, cuối cùng là 720C – 10 phút và lưu ở 12

0C

2.3.3. Phương phápcấy chuyển và nhân sinh khối mô rễ

- Rễ phát triển sau khoảng 15 ngày trên môi trường phù hợp, tiến hành cấy

chuyển để nhân nhanh sinh khối rễ, các bước tiến hành như sau:

- Đốt dụng cụ trên ngọn lửa đèn cồn.

- Quan sát bằng kính hiển vi để chọn lựa những đĩa petri chứa mẫu tốt,

không bị nhiễm tạp khuẩn.

- Đánh dấu những đoạn rễ để cấy chuyển ( màu trắng hoặc vàng nhạt, có

phân nhánh cấp 1 hoặc 2, đường kính trội hơn).

- Dùng dao cắt đoạn rễ đã xác định dài khoảng 3-5 cm.

- Dùng kẹp gắp mảnh rễ cấy chuyển sang đĩa petri đã có sẵn môi trường,

mỗi đĩa petri cấy 2 đoạn rễ với chiều ngược nhau.

- Bọc kín bằng parafilm.

- Ghi đầy đủ thông tin trên đĩa petri (loại mẫu, ngày/tháng/năm cấy chuyển).

- Đưa vào tủ nuôi cấy trong điều kiện tối ở 270C.

- Thực hiện cấy chuyển nhiều lần trong bốc cấy vô trùng để nhân sinh khối

mô rễ tạo nguồn vật liệu đưa vào cộng sinh với AM.

2.3.4.Phương pháp tạo cộng sinh AM in vitro

- Trên đĩa thạch chứa môi trường, cắt bỏ mảnh thạch ở phần chính giữa đĩa.

- Trên đĩa thạch chứa vật liệu AM vô trùng đã nảy mầm, cắt lấy AM sao cho

mảnh nguyên liệu nằm trọn bên trong phần thạch đã loại bỏ ở đĩa môi trường.

Dùng dao cẩn thận chuyển vật liệu AM đặt vừa vào phần thạch vừa loại bỏ trên

môi trường MSR (the modified Strullu Romand) (Strullu and Romand 1986,

Declerck et al. 1998). Cấy chuyển đoạn rễ in vitro lên đĩa thạch chứa AM sao cho

chiều hướng phát triển của rễ mới sẽ chạm sợi nấm.


- Nuôi cấy trong điều kiện thích hợp, trong tối, ở 270C. Theo dõi tiến triển

của rễ, sợi nấm, cộng sinh và sinh bào tử mới trên đĩa cấy.

2.3.5. Phương pháp nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro

Sau thời gian 4-5 tháng, sử dụng nguồn vật liệu AM đã cộng sinh với rễ làm

nguyên liệu AM vô trùng tạo cộng sinh với rễ in vitro trong bước tiếp theo với mục

tiêu nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro. Các bước tiến hành như sau:

- Trên đĩa thạch chứa môi trường, cắt bỏ mảnh thạch ở phần chính giữa đĩa.

- Trên đĩa thạch chứa vật liệu AM vô trùng đã nảy mầm, cắt lấy AM sao cho

mảnh nguyên liệu nằm trọn bên trong phần thạch đã loại bỏ ở đĩa môi trường.

Dùng dao cẩn thận chuyển vật liệu AM đặt vừa vào phần thạch vừa loại bỏ trên

môi trường MSR (the modified Strullu Romand) (Strullu and Romand 1986,

Declerck, Stullu et al. 1998). Cấy chuyển đoạn rễ in vitro lên đĩa thạch chứa AM

sao cho chiều hướng phát triển của rễ mới sẽ chạm sợi nấm.

- Nuôi cấy trong điều kiện thích hợp, trong tối, ở 270C. Theo dõi tiến triển

của rễ, sợi nấm, cộng sinh và sinh bào tử mới trên đĩa cấy.

2.3.6. Phương pháp thu thập, phân tích và xư lý thống kê số liệu thí nghiệm

a. Phương pháp thu thập số liệu

Số lượng bào tử (bt/đĩa petri): Đếm trực tiếp bằng quan sát trên kính hiển vi

soi nổi trên các ô đếm được thiết kế sẵn, tổng các ô quan sát bằng 2/3 diện tích đĩa

petri, thu số lượng bào tử ở các khoảng thời gian 1 tháng, 2 tháng, 3 tháng, 4 tháng

và 5 tháng sau khi tiến hành cộng sinh giá thể rễ với chủng AM tương ứng, trong

báo cáo này các khoảng thời gian trên được gọi tắt tương ứng là T1, T2, T3, T4 và

T5.

b. Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu thu được sẽ được xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS 20. So sánh

ý nghĩa khác biệt các giá trị trung bình của các công thức thí nghiệm bằng phân

tích ANOVA Post Hoc Multiple Comparison Test theo tiêu chuẩn Bonferroni và

Duncan nếu phương sai bằng nhau và Tamhane‘s T2 nếu phương sai không bằng

nhau, p<0,05 được xem là có ý nghĩa.


Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Kết quả tạo vật liệu giá thể mô rễ in vitro


Hình 3.1: Rễ Ca rốt không có gen Ri-tDNA (a)

Rễ Ca rốt có gen Ri-tDNA (b)

Bằng các phương pháp thí nghiệm và kỹ thuật khử trùng bề mặt hạt, kỹ thuật

nuôi cấy trên môi trường thạch agar, chúng tôi đã tạo được vật liệu giá thể rễ Cà

rốt (Daucus carrota L.) và Medicago (Medicago truncatula) in vitro không có gen

Ri-tDNA để sử dụng cho các nghiên cứu của đề tài.

Bằng kỹ thuật đồng nuôi cấy với A. rhizogenes trên môi trường MS 0,5 % agar,

và sau đó môi trường MS 0,5 % bổ sung 500 mg Canbenicilin/lít để chọn lọc và

loại bỏ vi khuẩn A. rhizogenes, chúng tôi đã nghiên cứu tạo được vật liệu giá thể rễ

Cà rốt (Daucus carrota L.) in vitro chuyển gen Ri-tDNA hoàn toàn sạch khuẩn.

Vật liệu giá thể rễ Cà rốt (Daucus carrota L.) in vitro chuyển gen Ri-tDNA được

khẳng định về mặt di truyền bằng phản ứng PCR. Kết quả PCR xác định trong bộ

gen của các giá thể mô rễ Cà rốt invitro này đều phát hiện thấy có các gen rolB và

rolC của vi khuẩn A. rhizogenses (có trên đoạn T-DNA) ở các vị trí khoảng 380bp

(cho gen rolB) và 580bp (cho gen rolC) (Hình 3.2), đây là vị trí biểu hiện sự có

mặt hay không có mặt của 2 gen rolB và rolC trong cây chuyển gen Ri-tDNA

(Veena and Taylor 2007) còn trên cây đối chứng (không chuyển gen) thì không

thấy có sự xuất hiện của 2 gen này. Như vậy về mặt di truyền đã khẳng định là các

giá thể mô rễ Cà rốt invitro này đã được chuyển gen Ri-tDNA từ vi khuẩn A.

rhizogenes thông qua đồng nuôi cấy.

a b


Hình 3.3: Rễ Medicago không có gen Ri-tDNA (a)

Rễ Medicago có gen Ri-tDNA (b)

3.2. Đánh giá ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng

sinh AM in vitro

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM

in vitro giữa chủng 41833 với giá thể rễ Cà rốt chuyển gen Ri-tDNA

Công thức Số lƣợng bào tử

T1 T2 T3 T4 T5

CT1 1809a ± 47 3453

a ± 62 5057

a ± 43 8938

a ± 64 10363

a ± 77

CT2 147b ± 8 263

b ± 6 330

b ± 10 402

b ± 3 636

b ± 8

CT3 644c ± 9 1226

c ± 14 1465

c ± 24 1805

c ± 8 2021

c ± 17

Post Hoc Test: Giá trị trong cùng cột thời gian có chữ cái giống nhau là khác biệt không ý nghĩa, α=0,05

CT1: MSR 0,5% agar CT2: MSR lỏngCT3: MS 0,5% agar

T1: tháng thứ nhất, T2: tháng thứ 2, T3: tháng thứ 3; T4: tháng thứ 4, T5: tháng thứ 5

Sau thời gian 5 tháng tiến hành bố trí và theo dõi thí nghiệm, kết quả ở Bảng

3.1 cho thấy, từ tháng thứ nhất đến tháng thứ năm số lượng bào tử trung bình cao

Hình 3.2: Phân tích PCR cho mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri-tDNA và không chuyển

gen Ri-tDNA. Băng 1: có gen rolB; băng 2: có gen rolC (cho mẫu chuyển gen);

băng 3 va 4: không có gen rolB va rolC (cho mẫu không chuyển gen); M: DNA

thang chuẩn 100 bp (Fermentas)

580 bp

380 bp

a b


nhất thu được là ở CT1. Số lượng bào tử sản sinh ở mức độ bình thường trong các

tháng thứ nhất, tháng thứ hai và tháng thứ ba, sản sinh nhiều nhất ở tháng thứ tư,

và sau đó giảm dần ở tháng thứ năm. Trong tháng thứ 5 (tháng cuối), số lượng bào

tử đạt cao nhất ở CT1 (trung bình đạt 10363 bào tử/petri), tiếp theo là CT3 (2021

bào tử/petri) và thấp nhất ở CT2 (chỉ đạt trung bình 636 bào tử/petri).

Kết quả phân tích Post Hoc Test về ý nghĩa khác biệt của số lượng bào tử

trong các công thức thí nghiệm cho thấy rằng, số lượng bào tử giữa các công thức

thí nghiệm CT1, CT2 và CT3 khác biệt có ý nghĩa (α=0,05) trong tất cả các tháng

thí nghiệm từ T1 đến T5. Điều này có nghĩa rằng, yếu tố thí nghiệm môi trường

nuôi cấy đã ảnh hưởng quan trọng tới sự sản sinh bào tử in vitro của chủng 41833

cộng sinh với giá thể rễ Cà rốt có gen Ri-tDNA.

Biểu đồ 3.1:Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM

in vitro giữa chủng 41833 với giá thể rễ Cà rốt chuyển gen Ri-tDNA

Bảng 3.2:Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in

vitro giữa chủng M7 với giá thể rễ Cà rốt chuyển gen Ri-tDNA


T1 T2 T3 T4 T5

CT1 2061a ± 45 4031

a ± 8 7055

a ± 12 9238

a ± 31 9948

a ± 31

CT2 120c ± 3 252

c ± 3 308

c ± 6 493

c ± 13 575

c ± 14

CT3 722b ± 5 1245

b ± 32 1455

b ± 18 1804

b ± 8 2049

b ± 40

Post Hoc Test: Giá trị trong cùng cột thời giancó chữ cái giống nhau là khác biệt không ý nghĩa, α=0,05

CT1: MSR 0,5% agar CT2: MSR lỏng CT3: MS 0,5% agar


0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

CT1 CT2 CT3

10363

636

2021

Số l

ƣợ

ng b

ào t

ử/d

ia p

etri

Cà rốt - 41833













nuôi cấy đã ảnh hưởng quan trọng tới sự sản sinh bào tử in vitro của chủng M7



in vitro giữa chủng M7 với giá thể rễ Cà rốt chuyển gen Ri-tDNA


vitro giữa chủng 41833 với giá thể rễ Medicago chuyển gen Ri-tDNA


T1 T2 T3 T4 T5

CT1 1632a ± 11 3354

a ± 25 4025

a ± 52 7110

a ± 16 8271

a ± 12

CT2 81c± 5 169

c± 5 217

c± 5 288

c± 6 407

c± 6

CT3 408b ± 6 1056

b ± 36 1250

b ± 12 1411

b ± 8 1740

b ± 6




0

2000

4000

6000

8000

10000

CT1 CT2 CT3

9948

575

2049

Số

lƣ

ợn

g b

ào

tử

/dia

pet

ri

Cà rốt - M7














cộng sinh với giá thể rễ Medicago có gen Ri-tDNA.


in vitro giữa chủng 41833 với giá thể rễ Medicago chuyển gen Ri-tDNA


vitro giữa chủng M7 với giá thể rễ Medicago chuyển gen Ri-tDNA


T1 T2 T3 T4 T5

CT1 1949a ± 23 3656

a ± 39 5873

a ± 74 8266

a ± 75 9229

a ± 29

CT2 104c ± 3 218

c ± 6 254

c ± 6 406

c ± 7 457

c ± 6

CT3 548b ± 8 1123

b ± 4 1356

b ± 13 1704

b ± 12 1827

b ± 10




0

2000

4000

6000

8000

10000

CT1 CT2 CT3

8271

407

1740

Số l

ƣợ

ng b

ào t

ử/p

etri

Medicago - 41833
















in vitro giữa chủng M7 với giá thể rễ Medicago chuyển gen Ri-tDNA

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

CT1 CT2 CT3

9229

457

1827

Số l

ƣợ

ng b

ào t

ử/

pet

ri

Medicago - M7


Hình3.4: Rễ cộng sinh phát triển trên môi trường MSR đặc (a), trên môi trường

MSR lỏng (b), trên môi trường MS đặc (c)

Kết quả số lượng bào tử thu được trong thí nghiệm môi trường sau 5 tháng

tiến hành thí nghiệm trên 4 loại giá thể Cà rốt-41833, Cà rốt-M7, Medicago-41833,

Medicago-M7 tương đương với những kết quả nghiên cứu trước đây (Declerck,

D‘Or et al. 2001) về môi trường nuôi cấy AM in vitro. Kết quả ở CT1 cho thấy,

môi trường MSR có bổ sung 0,5% agar phù hợp hơn cho nuôi cấy AM so với môi

trường cùng loại MSR lỏng bởi AM cần có sự cố định tốt để phát triển, so với môi

trường MS, thành phần dinh dưỡng trong MSR đã được biến đổi với mục đích tối

ưu hóa cho sự phát triển của AM, hạn chế một số chất gây ức chế sự cộng sinh.

Môi trường MS tốt cho sự sinh trưởng của rễ, do đó giảm sự phụ thuộc của rễ vào

quan hệ cộng sinh với AM, từ đó làm giảm mức độ cộng sinh nấm - rễ. Trong

nghiên cứu này, chúng tôi cần lựa chọn được loại môi trường tối ưu cho khả năng

nhân sinh khối cộng sinh AM. Vì vậy, môi trường MSR có bổ sung 0,5% agar là

loại môi trường được lựa chọn và sử dụng cho những thí nghiệm nghiên cứu tiếp

theo.

Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng, sử dụng môi trường MSR không có đường

cho kết quả cộng sinh AM tốt hơn khi sử dụng môi trường MSR có bổ sung đường

(Ijdo, Cranenbrouck et al. 2011). Tuy nhiên, trong phương pháp này, Ijdo và cộng

sự đã sử dụng đĩa petri có cấu trúc 2 ngăn, trong đó, một ngăn có bổ sung đường để

cung cấp dinh dưỡng cho giá thể rễ phát triển, ngăn còn lại là môi trường không

đường cho sự phát triển của nấm, đồng thời có sự bổ sung môi trường theo từng

đợt. Việc áp dụng phương pháp này còn hạn chế ở Việt Nam do vấn đề về việc cần

đầu tư trang thiết bị rất tốn kém và yêu cầu cao về công nghệ. Do vậy, kết quả

b c a


nghiên cứu của chúng tôi là phù hợp với việc tiếp cận nghiên cứu theo hướng kỹ

thuật đơn giản.

3.3. Đánh giá ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng

sinh AM in vitro

Bảng 3.5:Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh

AM in vitro giữa chủng 41833 với giá thể rễCà rốt chuyển gen Ri-tDNA


T1 T2 T3 T4 T5

CT1 1108b± 25 2127

c ± 20 3147

c ± 14 4216

c ± 17 5412

c ± 7

CT2 1809a ± 47 3453

a ± 60 5057

a ± 43 8938

a ± 64 10363

a ± 78

CT3 1025b ± 8 2523

b ± 18 4357

b ± 31 6164

b ± 71 7138

b ± 14


CT1: pH = 5,0 CT2: pH = 5,5CT3: pH = 6,0








bào tử/petri) và thấp nhất ở CT1(chỉ đạt trung bình 5412 bào tử/petri).



thí nghiệm CT1và CT2 , giữa CT2 và CT3 khác biệt có ý nghĩa (α=0,05) trong tất

cả các tháng thí nghiệm từ T1 đến T5. Sự khác biệt có ý nghĩa giữa CT1 và CT3

xảy ra từ T2 đến T5. Điều này có nghĩa rằng, yếu tố thí nghiệm pH môi trường




Biểu đồ 3.5:Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh

AM in vitro giữa chủng 41833 với giá thể rễ Cà rốt chuyển gen Ri-tDNA


AM in vitro giữa chủng M7 với giá thể rễ Cà rốt chuyển gen Ri-tDNA


T1 T2 T3 T4 T5

CT1 1072b± 14 2060

c± 32 2953

c± 18 4041

c± 22 5207

c± 4

CT2 2061a ± 45 4031

a ± 8 7055

a ± 12 9238

a ± 32 9948

a ± 31

CT3 949c ± 30 2352

b ± 40 4153

b ± 34 6046

b ± 27 7043

b ± 13


CT1: pH = 5,0 CT2: pH = 5,5CT3: pH = 6,0












0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

CT1 CT2 CT3

5412

10363

7138

Số

lƣ

ợn

g b

ào

tử

/pet

riCà rốt - 41833


thí nghiệm từ T1 đến T5. Điều này có nghĩa rằng, yếu tố thí nghiệm pH môi trường




AM in vitro giữa chủng M7 với giá thể rễ Cà rốt chuyển gen Ri-tDNA


AM in vitro giữa chủng 41833 với giá thể rễ Medicago chuyển gen Ri-tDNA


T1 T2 T3 T4 T5

CT1 533c± 23 1362

c± 13 2469

c± 22 3655

c ± 45 4161

c ± 22

CT2 1632a ± 11 3354

a ± 25 4052

a ± 52 7110

a ± 16 8271

a ± 12

CT3 749b ± 5 1816

b ± 12 3377

b ± 24 4998

b ± 32 5738

b ± 32


CT1: pH = 5,0 CT2: pH = 5,5CT3: pH = 6,0







0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

CT1 CT2 CT3

5207

9948

7043

Số

lƣ

ợn

g b

ào

tử

/ p

etri

Cà rốt - M7











AM in vitro giữa chủng 41833 với giá thể rễ Medicago chuyển gen Ri-tDNA


AM in vitro giữa chủng M7 với giá thể rễ Medicago chuyển gen Ri-tDNA


T1 T2 T3 T4 T5

CT1 663c± 34 1537

c± 25 2589

c± 56 3934

c ± 70 4342

c ± 15

CT2 1949a ± 23 3656

a ± 39 5873

a ± 74 8266

a ± 75 9229

a ± 28

CT3 822b ± 9 2051

b ± 38 3560

b ± 17 4947

b ± 35 5531

b ± 19


CT1: pH = 5,0 CT2: pH = 5,5CT3: pH = 6,0


0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

CT1 CT2 CT3

4161

8271

5738

Số l

ƣợ

ng b

ào t

ử/

pet

ri

Medicago - 41833















Biểu đồ 3.8:Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh

AM in vitro giữa chủng M7 với giá thể rễ Medicago chuyển gen Ri-tDNA

Kết quả về nội dung Đánh giá ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng

nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro, với việc sử dụng giá thể rễ có gen Ri-DNA

trên môi trường MSR 0,5% agar cho thấy, số lượng bào tử thu được cao nhất ở

mức pH 5,5 trên cả 4 loại giá thể Cà rốt-41833, Cà rốt-M7, Medicago-41833,

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

CT1 CT2 CT3

4342

9229

5531

Số l

ƣợ

ng b

ào t

ử/p

etri

Medicago - M7


Medicago-M7. Như vậy, mức pH tối ưu cho sự phát triển của AM là 5,5. Với mức

pH 6,0, số lượng bào tử thu được cao hơn so với mức pH 5,0. Điều này được giải

thích là do AM chịu bazơ tốt hơn axit (Hawkins and George 1997).


Biểu đồ 3.9: Kết quả nhân sinh khối AM in vitro của 41833-Cà rốt Ri-tDNA, M7-

Cà rốt Ri-tDNA, 41833-Medicago Ri-tDNA, M7-Medicago Ri-tDNA trên môi

trường MSR 0,5% agar, pH 5,5

Kết quả tổng hợp trong biểu đồ 3.9 cho thấy, sau 5 tháng tiến hành thí

nghiệm trên môi trường MSR 0,5% agar, pH 5,5 năng suất nhân sinh khối bào tử

AM in vitro của chủng 41833 cao hơn chủng M7 khi cộng sinh với giá thể rễ Cà

rốt có Ri-tDNA. Kết quả thu được ngược lại khi tiến hành cộng sinh 2 chủng AM

trên với giá thể rễ Medicago có Ri-tDNA (kết quả trong bảng 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5,

3.6, 3.7 và 3.8). Điều đó có nghĩa rằng, các chủng AM có ảnh hưởng khác nhau

đến năng suất nhân sinh khối bào tử AM in vitro khi cộng sinh với các loại giá thể

mô rễ khác nhau.

41833-Cà rốt

Ri-tDNA

M7-Cà rốt

Ri-tDNA

41833-Medicago

Ri-tDNA

M7-Medicago

Ri-tDNA

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

T1 T2 T3 T4 T5

Số l

ƣợ

ng b

ào t

ử/p

etri


Kết quả tổng hợp trong biểu đồ 3.9 cũng chỉ ra rằng, năng suất nhân sinh

khối bào tử AM in vitro của giá thể rễ Cà rốt có Ri-tDNA cao hơn giá thể rễ

Medicago có Ri-tDNA khi cộng sinh trên cùng chủng 41833. Kết quả thu được

tương tự khi tiến hành cộng sinh 2 loại giá thể trên chủng M7 (kết quả trong bảng

3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5,3.6, 3.7 và 3.8). Điều đó có nghĩa rằng, giá thể mô rễ Cà rốt

có Ri-tDNA phù hợp hơn cho nhân sinh khối AM in vitro trong nghiên cứu này.

Hình 3.5: AM cộng sinh vào rễ va sinh trưởng sơi nấm mới trên rễ Cà rốt (a),

trên rễ Medicago (b)

3.4.Đánh giá ảnh hưởng của giá thể mô rễ đến khả năng nhân sinh khối cộng

sinh AM in vitro

Bảng 3.9: Ảnh hưởng của các loại giá thể mô rễ khác nhau đến nhân sinh khối

cộng sinh AM in vitro trên chủng 41833


T1 T2 T3 T4 T5

CT1.1 1809a ± 47 3454

a ± 61 5057

a ± 43 8938

a ± 64 10363

a ± 78

CT 1.2 282c ± 23 646

c ± 30 1066

c ± 34 1527

c ± 13 2119

c ± 22

CT 2.1 1456b ± 38 2756

b ± 47 4053

b ± 28 7110

b ± 16 8271

b ± 12

CT 2.2 225c ± 8 527

c ± 20 847

d ± 5 1226

d ± 11 1720

d ± 20



CT 1.1: Cà rốt có Ri-tDNACT 1.2: Cà rốt không Ri-tDNA

CT 2.1: Medicago có Ri-tDNACT 2.2: Medicago không Ri-tDNA

Sau thời gian 5 tháng tiến hành bố trí và theo dõi thí nghiệm, kết quả ở Bảng 3.9

cho thấy, từ tháng thứ nhất đến tháng thứ năm số lượng bào tử trung bình cao nhất


thu được là ở CT1.1. Số lượng bào tử sản sinh ở mức độ bình thường trong các



tử đạt cao nhất ở CT1.1 (trung bình đạt 10363 bào tử/petri), tiếp theo là CT2.1

(8271 bào tử/petri), sau đó là CT 1.2 (2119 bào tử/petri), thấp nhất ở CT2.2(chỉ

đạt trung bình 1720 bào tử/petri).

Kết quả phân tích Post Hoc Test về ý nghĩa khác biệt của số lượng bào tử trong các

công thức thí nghiệm cho thấy rằng, số lượng bào tử giữa các công thức thí nghiệm

CT1.1 và CT1.2, giữa CT2.1 và CT2.2, giữa CT1.1 và CT2.1 khác biệt có ý nghĩa

(α=0,05) trong tất cả các tháng thí nghiệm từ T1 đến T5. Sự khác biệt có ý nghĩa

(α=0,05) giữa CT1.2 và CT2.2 xảy ra từ T3 đến T5. Điều này có nghĩa rằng, yếu tố

thí nghiệm pH môi trường nuôi cấy đã ảnh hưởng quan trọng tới sự sản sinh bào tử

in vitro của chủng 41833 cộng sinh với giá thể rễ Cà rốt và Medicago có gen Ri-

tDNA và không gen Ri-tDNA.

Biểu đồ3.10: Ảnh hưởng của các loại giá thể mô rễ khác nhau đến nhân sinh khối

cộng sinh AM in vitro trên chủng 41833

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

CT1.1 CT1.2 CT2.1 CT2.2

10363

2119

8328

1720Số l

ƣợ

ng b

ào

tử

/petr

i

Chủng 41833



Biểu đồ 3.11: Kết quả nhân sinh khối AM in vitro của 4 loại giá thể mô rễ cộng

sinh với chủng 41833 trên môi trường MSR 0,5% agar, pH 5,5

Kết quả tổng hợp trong biểu đồ 3.11 cho thấy, năng suất nhân sinh khối bào

tử AM in vitro trên giá thể mô rễ Cà rốt có Ri-tDNA cao hơn rất nhiều trên giá thể

mô rễ Cà rốt không Ri-tDNA (cao hơn khoảng 5 lần ở T5). Điều này đúng cho cả 2

loại giá thể mô rễ Medicago có Ri-tDNA và không có Ri-tDNA (kết quả trong

bảng 3.9). Điều này có nghĩa rằng, sử dụng giá thể rễ mô rễ có chuyển gen Ri-

tDNA cho hiệu quả nhân sinh khối bào tử AM in vitro tốt hơn giá thể mô rễ không

chuyển gen Ri-tDNA.


khối bào tử AM in vitro trên giá thể rễ Cà rốt có Ri-tDNA cao hơn trên giá thể mô

rễ Medicago có Ri-tDNA. Điều này đúng cho cả hai loại giá thể mô rễ Cà rốt

không có Ri-tDNA và Medicago không có Ri-tDNA (kết quả trong bảng 3.9). Điều

này có nghĩa rằng, trong nghiên cứu này, giá thể mô rễ Cà rốt phù hợp hơn giá thể

mô rễ Medicago cho nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro.

41833-Cà rốt

Ri-tDNA

41833-Cà rốt

không

Ri-tDNA

41833-Medicago

Ri-tDNA

41833-Medicago

không

Ri-tDNA

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

T1 T2 T3 T4 T5

Số

lƣ

ợn

g b

ào

tử

/petr

i


Bảng 3.10: Ảnh hưởng của các loại giá thể mô rễ khác nhau đến nhân sinh khối

cộng sinh AM in vitro trên chủng M7


T1 T2 T3 T4 T5

CT1.1 2060a ± 47 4031

a ± 8 7055

a ± 12 9238

a ± 32 9948

a ± 31

CT 1.2 170c ± 26 534

c ± 6 926

c ± 21 1341

c ± 24 1918

c ± 19

CT 2.1 944b ± 39 2059

b ± 19 3208

b ± 158 8266

b ± 75 9229

b ± 29

CT 2.2 135c ± 6 430

d ± 17 743

c ± 11 1075

d ± 9 1534

d ± 6



CT 1.1: Carot có Ri-tDNA

CT 1.2: Carot không Ri-tDNA

CT 2.1: Medicago có Ri-tDNA

CT 2.2: Medicago không Ri-tDNA



nhất thu được là ở CT1.1. Số lượng bào tử sản sinh ở mức độ bình thường trong

các tháng thứ nhất, tháng thứ hai và tháng thứ ba, sản sinh nhiều nhất ở tháng thứ

tư, và sau đó giảm dần ở tháng thứ năm. Trong tháng thứ 5 (tháng cuối), số lượng

bào tử đạt cao nhất ở CT1.1 (trung bình đạt 9948 bào tử/petri), tiếp theo là CT2.1

(9229 bào tử/petri), sau đó là CT 1.2 (1918 bào tử/petri), thấp nhất ở CT2.2(chỉ

đạt trung bình 1534 bào tử/petri).



thí nghiệm CT1.1 và CT1.2, giữa CT2.1 và CT2.2, giữa CT1.1 và CT2.1 khác biệt

có ý nghĩa (α=0,05) trong tất cả các tháng thí nghiệm từ T1 đến T5. Sự khác biệt

có ý nghĩa (α=0,05) giữa CT1.2 và CT2.2 xảy ra từ T2 đến T5. Điều này có nghĩa

rằng, yếu tố thí nghiệm pH môi trường nuôi cấy đã ảnh hưởng quan trọng tới sự

sản sinh bào tử in vitro của chủng M7 cộng sinh với giá thể rễ Cà rốt và Medicago

có gen Ri-tDNA và không gen Ri-tDNA.


Biểu đồ3.12: Ảnh hưởng của các loại giá thể mô rễ khác nhau đến nhân sinh khối

cộng sinh AM in vitro trên chủng M7


Biểu đồ 3.13: Kết quả nhân sinh khối AM in vitro của 4 loại giá thể mô rễ cộng

sinh với chủng M7 trên môi trường MSR 0,5% agar, pH 5,5

Kết quả tổng hợp trong biểu đồ 3.13 cho thấy, năng suất nhân sinh khối bào

tử AM in vitro trên giá thể mô rễ Cà rốt có Ri-tDNA cao hơn rất nhiều trên giá thể

mô rễ Cà rốt không Ri-tDNA (cao hơn khoảng 5 lần ở T5). Điều này đúng cho cả 2

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

CT1.1 CT1.2 CT2.1 CT2.2

9948

1918

7119

1534S

ố l

ƣợ

ng

bà

o t

ử/p

etri

Chủng M7

M7-Cà rốt

Ri-tDNA

M7-Cà rốt không

Ri-tDNA

M7-Medicago

Ri-tDNA

M7-Medicago

không

Ri-tDNA0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

T1 T2 T3 T4 T5

Số l

ƣợ

ng b

ào t

ử/p

etri


loại giá thể mô rễ Medicago có Ri-tDNA và không có Ri-tDNA (kết quả trong

bảng 3.10). Điều này có nghĩa rằng, sử dụng giá thể rễ mô rễ có chuyển gen Ri-

tDNA cho hiệu quả nhân sinh khối bào tử AM in vitro tốt hơn giá thể mô rễ không

chuyển gen Ri-tDNA.


khối bào tử AM in vitro trên giá thể rễ Cà rốt có Ri-tDNA cao hơn trên giá thể mô

rễ Medicago có Ri-tDNA. Điều này đúng cho cả hai loại giá thể mô rễ Cà rốt

không có gen Ri-tDNA và Medicago không có gen Ri-tDNA (kết quả trong bảng

3.10). Điều này có nghĩa rằng, trong nghiên cứu này, giá thể mô rễ Cà rốt phù hợp

hơn Medicago cho nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro.

Hình 3.6: Sinh sản bào tư AM sau 1 tháng (a), sau 4 tháng (b) trên giá thể Cà

rốt có Ri-tDNA

Một kết quả theo dõi quan trọng đã đạt được trong nghiên cứu này của chúng

tôi, đó là, trong tất cả các môi trường nuôi cấy thí nghiệm, đặc biệt trong môi

trường MSR 0,5% agar với 10 gam đường/lít môi trường: trong các tháng đầu thí

nghiệm (T1, T2), khi hàm lượng đường trong môi trường còn cao, quá trình hình

thành cộng sinh và nhân sinh khôi AM in vitro diễn ra chậm và thấp; tuy nhiên quá

trình này bắt đầu tăng mạnh trong tháng thứ 3 và đặc biệt tăng rất đột biến trong

tháng thứ 4, và giảm dần trong tháng cuối thí nghiệm, tháng thứ 5. Điều này được

giải thích là trong các tháng sau đó (T3, T4) hàm lượng đường trong môi trường

MSR giảm mạnh do giá thể rễ tiêu thụ trực tiếp, và do đó không còn ức chế quá

trình nhân sinh khối AM in vitro.

a b


Chƣơng 4: KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

- Đề tài đã nghiên cứu tạo được vật liệu giá thể rễ Cà rốt (Daucus carrota L.)

in vitrochuyển gen Ri-tDNA hoàn toàn sạch khuẩn bằng kỹ thuật đồng nuôi cấy

với A. rhizogenes trên môi trường MS 0,5% agar, không chất kích thích sinh

trưởng và chọn lọc, loại bỏ vi khuẩn A. rhizogenes trên môi trường MS 0,5% agar

bổ sung 500 mg Cacbenicilin/lít. Bằng phản ứng PCR, vật liệu giá thể rễ Cà rốt

này được xác định có các gen rolB và rolC của vi khuẩn A. rhizogenses(có trên

đoạn T-DNA) ở các vị trí khoảng 380bp (cho gen rolB) và 580bp (cho gen rolC).

- Sau 5 tháng nuôi cấy, nhân sinh khối cộng sinh AM in vitrotrên các loại

môi trường thí nghiệm khác nhau, sinh khối bào tử cao nhất đạt được là với môi

trường MSR 0,5% agar cho cả 2 chủng AM thí nghiệm 41833 & M7 khi cộng sinh

với 2 loại giá thể rễ chuyển gen Ri-tDNA là Cà rốt (Daucus carrota L.) và

Medicago (Medicago truncatula) với số liệu số lượng bào tử/đĩa petri tương ứng là

10363, 9948, 8271 và 9229; và sinh khối bào tử thấp nhất là với môi trường MSR

lỏng, không agar.

- Sau 5 tháng nuôi cấy, nhân sinh khối cộng sinh AM in vitrovới các loại giá

thể rễ in vitro khác nhau, số lượng bào tử cao nhất đạt được là với giá thể rễ Cà rốt

chuyển gen Ri-tDNA, tiếp theo là giá thể rễ Medicago chuyển gen Ri-tDNA và số

lượng bào tử thấp nhất là với 2 loại giá thể rễ Cà rốt và Medicago không có gen Ri-

tDNA, kết quả này đúng cho cả 2 chủng AM thí nghiệm là 41833 và M7 (kết quả

trong bảng 4.9 và bảng 4.10).Kết quả tổng hợp cho thấy một điều rõ ràng rằng, sử

dụng giá thể rễ chuyển gen Ri-tDNA cho mục tiêu nhân sinh khối cộng sinh AM in

vitro mang lại hiệu quả cao hơn rất nhiều so với giá thể rễ không chuyển gen Ri-

tDNA; điều này đúng cho cả 2 loại giá thể rễ là Cà rốt và Medicago, và cả 2 chủng

AM thí nghiệm là 41833 và M7.

- Trong số các thí nghiệm về ảnh hưởng của pH môi trường MSR 0,5% agar

đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro,số lượng bào tử AM đạt được cao nhất

trong môi trường có pH là 5,5 và thấp nhất trên môi trường có pH 5,0. Kết quả này


đúng cho cả 2 chủng AM thí nghiệm là 41833 & M7 khi cộng sinh tương ứng với

2 loại giá thể rễ in vitro là Cà rốt chuyển gen Ri-tDNAvà Medicago chuyển gen

Ri-tDNA (kết quả trong bảng 4.5; 4.6; 4.7 và 4.8).

4.2. Tồn tại và kiến nghị

Do những hạn chế về thời gian và dụng cụ thiết bị công nghệ, đề tài không

tiến hành được thí nghiệm nghiên cứu hình thành và nhân sinh khối cộng sinh AM

in vitro trên đĩa petri 2 ngăn với 2 loại môi trường MSR khác nhau là MSR agar có

đường và MSR agar không có đường, nhằm tăng cường hơn khả năng nhân sinh

khối cộng sinh AM trên môi trường MSR không đường. Tác giả luận văn đề xuất

tiếp tục thí nghiệm nghiên cứu bổ sung về điều chỉnh giảm hàm lượng đường trong

môi trường MSR 0,5% agar để giảm ức chế và kích thích quá trình hình thành

cộng sinh và nhân sinh khối AM in vitro ngay từ những tháng đầu của thí nghiệm;

và do đó có thể thay thế việc phải sử dụng loại dụng cụ đĩa petri 2 ngăn (giá đắt và

quy trình phức tạp hơn).


TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Tiếng Việt

1) Nguyễn Minh Châu, Lê Quốc Huy, 2007. Kết quả nghiên cứu áp dụng thử

nghiệm chế phẩm nấm rễ ECM dạng viên nang (Alginate beads) cho cây con

Sao đen (Hopea odorata). Tạp chí KH & CN, Bộ NN&PTNT 18:81-86.

2) Tăng Thị Chính, Bùi Văn Cường, 2007. Nghiên cứu sự đa dạng nấm cộng

sinh Arbuscular mycorrhiza ở cỏ Vetiver từ đất ô nhiễm chì. Báo cáo khoa

học về Sinh thái và Tài nguyên sinh vât, Hội nghị khoa học toàn quốc lần

thứ hai, Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật 1:216-221.

3) Nguyễn Sĩ Giao, Nguyễn Thị Nhâm, 1988. Nghiên cứu sử dụng nấm rễ cộng

sinh cho sản xuất cây thông con vườn ươm có chất lượng cao.

4) Lê Thị Hà, 2011. Phân lâp, xác định nhóm bào tử và nhân nuôi bảo tồn nấm

rê nôi công sinh (Arbuscular Mycorrhiza) tạo cơ sơ ưng dung cho cây trông

nông – lâm nghiêp.

5) Lê Quốc Huy, Nguyễn Minh Châu, 2004. Công nghệ nấm rễ ứng dụng keo

lai và keo tai tượng vườn ươm và rừng trồng. Tạp chí KH & CN, Bộ

NN&PTNT 3:400-404.

6) Lê Quốc Huy, Ngô Thị Thanh Huệ, Lê Thành Công, 2009. Một số kết quả

nghiên cứu gây trồng cây Jatropha (Jatropha curcas L.) làm nguyên liệu cho

sản xuất dầu diesel sinh học tại Việt Nam. Tạp chí KH & CN, Bộ

NN&PTNT tháng 2/2009:107-112.

7) Thu, P. Q. 2006-2010. Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh hỗn

hợp dạng viên nén cho bạch đàn và thông trên các lập địa thoái hóa, nghèo

chất dinh dưỡng.


Tài liệu Tiếng Anh

8) Abdoulaye, T. 2003. In vitro culture of arbuscular mycorrhizal fungi:

advances and future prospects African Journal of Biotechnology 2 (12):692-

697.

9) Adholeya, A. and R. Singh. 2006. Jatropha for wasteland development :

TERI‘s Mycorrhiza Technology In: Bhajvaid, P.P. Editor. Biofuels:

towards a greener and secure energy future.

10) AFCconference. 2012. The Hanoi Communiqué: Key Messages. The 2nd

Global Conference on Agriculture, Food Security and Climate Change,

Hanoi.

11) Aoyama, T., T. Hirayama, S. Tamamoto, and A. Oka. 1989. Putative start

codon TTG for the regulatory protein VirG of the hairy-root inducing

plasmid pRiA4. . Gene 78:173–178.

12) Bago, B. and G. Bécard. 2002. Bases of the obligate biotrophy of arbuscular

mycorrhizal fungi. In: Gianinazzi S, Schüepp H, Barea JM, Haselwandter K

(eds) Mycorrhiza technology in agriculture: from genes to bioproducts—

achievements and hurdles in arbuscular mycorrhizal research. Birkhauser-

Verlag:33–48.

13) BeCard, G. and J. A. Fortin. 1988. Early events of vesicular–arbuscular

mycorrhiza formation on Ri T-DNA transformed roots. New Phytologist

108:211-218.

14) Blaszkowski, J., M. Tadych, and T. Madej. 1998. Endogone maritima, a new

species in the Endogonales from Poland. Mycological Research 102:1096-

1100.

15) Boisson-Dernier, A., M. Chabaud, F. Garcia, G. Bécard, C. Rosenberg, and

D. Barker. 2001. Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago

truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal

symbiotic associations. Mol Plant Microb Interact 14:695-700.

16) Cano, C. and A. Bago. 2007. Aseptic mycorrhization inoculant and in vitro

and ex vitro application methods. WO/2007/014974.

17) Chabaud, M., A. Boisson-Dernier, J. Zhang, C. G. Taylor, O. Yu, and D. G.

Barker. 2006. Agrobacterium rhizogenes-mediated root transformation

18) Chabot, S., G. Bécard, and Y. Piché. 1992. Life cycle of Glomus intraradix

in root organ culture. Mycologia 84:315-321.


19) Cranenbrouck, S., L. Voets, C. Bivort, L. Renard, D.-G. Strullu, S. Declerck,

and J. A. Fortin. 2005. Methodologies for in Vitro Cultivation of Arbuscular

Mycorrhizal Fungi with Root Organs

20) In Vitro Culture of Mycorrhizas. Pages 341-375. Springer Berlin

Heidelberg.

21) De Boulois, H. D., L. Voets, B. Delvaux, I. Jakobsen, and S. Declerck. 2006.

Transport of radiocaesium by arbuscular mycorrhizal fungi to Medicago

truncatula under in vitro conditions. Environmental Microbiology 8:1926-

1934.

22) Declerck, S., D. D‘Or, S. Cranenbrouck, and E. Le Boulengé. 2001.

Modelling the sporulation dynamics of arbuscular mycorrhizal fungi in

monoxenic culture. Mycorrhiza 11:225-230.

23) Declerck, S., M. Ijdo, K. Fernamdez Suarez, L. Voets, and I. de la

providencia. 2009. Method and system fo in vitro mass production of

arbuscular mycorrhizal fungi. WO/2009/09220.

24) Declerck, S., D. Strullu, and J. Fortin. 2005. In vitro culture of mycorrhizas.

Soil biology series, vol. 4. Springer, Berlin Heidelberg New York.

25) Declerck, S., D. G. Strullu, and C. Plenchette. 1996. In vitro mass-

production of the arbuscular mycorrhizal fungus, Glomus versiforme,

associated with Ri T-DNA transformed carrot roots. Mycological Research

100:1237-1242.

26) Declerck, S., D. Stullu, and C. Plenchette. 1998. Monoxenic culture of the

intraradical forms of Glomus sp. isolated from a tropical ecosystem: a

proposed methodology for germplasm collection. Mycologia 90:579–585.

27) Douds, D. J. 2002a. Increased spore production by Glomus intraradices in

the split-plate monoxenic culture system by repeated harvest, gel

replacement, and resupply of glucose to the mycorrhiza. Mycor- rhiza

12:163-167.

28) Douds, D. J. 2002b. Increased spore production by Glomus intraradices in

the split-plate monoxenic culture system by repeated harvest, gel

replacement, and resupply of glucose to the mycorrhiza. Mycorrhiza 12:163-

167.


29) Douds Jr, D. D. 1997. A procedure for the establishment of Glomus mosseae

in dual culture with Ri T-DNA-transformed carrot roots. Mycorrhiza 7:57-

61.

30) Fernandez, F., J. Dellamico, and Y. Perez. 2006. Inoculum mycorhizogene

liquide. WO/2006/060968.

31) Fontaine, J., A. Grandmougin-Ferjani, V. Glorian, and R. Durand. 2004. 24-

Methyl:methylene sterols increase in monoxenic roots after colonization

by arbuscular mycorrhizal fungi. New Phytol 163:159-167.

32) Fortin, J. Andre, St-arnaud, Marc, Hamel, Chantal, Jolicoeur, and Mario.

1996a. Aseptic in vitro endomycorrhizal spore mass production. United

States Patent 5554530.

33) Fortin, J., G. Becard, S. Declerck, Y. Dalpe, M. St-Arnaud, A. Coughlan,

and Y. Piche. 2002. Arbuscular mycorrhiza on root-organ cultures. Can J

Bot 80:1-20.

34) Fortin, J. A., M. St-Arnaud, C. Hamel, C. Chaverie, and M. Jolicoeur.

1996b. Aseptic in vitro endomycoddhizal mass production. US Pat. No

5554530.

35) Gadkar, V., J. D. Driver, and M. C. Rillig. 2006. A novel in vitro cultivation

system to produce and isolate soluble factors released from hyphae of

arbuscular mycorrhizal fungi. Biotechnology Letters 28:1071-1076.

36) Gianinazzi, S., H. Schüepp, J. Barea, and K. Haselwandter. 2002.

Mycorrhizal technology in agriculture: from genes to bioproducts

Birkhauser, Basel

37) Giovannetti, M. and L. Avio. 2002. Biotechnology of arbuscular

mycorrhizas. Pages 275-310 in G. K. George and K. A. Dilip, editors.

Applied Mycology and Biotechnology. Elsevier.

38) Huy, L. Q. 1999. Mycorrhizal techniques for Forestry (unpublished paper).

The TATA Energy Research Institue (TERI) New Delhi, India.Ijdo, M., S.

Cranenbrouck, and S. Declerck. 2011. Methods for large-scale production of

AM fungi: past, present, and future. Mycorrhiza 21:1-16.

39) Jolicoeur, M., R. Williams, C. Chavarie, J. Fortin, and J. Archambault. 1999.

Production of Glomus intraradices propagules, an arbuscular mycorrhizal

fungus, in an airlift bioreactor. Biotechnol Bioeng 63:224-232.


40) Koffi, M., I. de la Providencia, A. Elsen, and S. Declerck. 2009.

Development of an in vitro culture system adapted to banana

mycorrhization. Afr J Biotechnol 8:2750-2756.

41) Koske, R. E., C. F. Friese, P. D. Olexia, and R. L. Hauke. 1985. Vesicular-

arbuscular mycorrhizas in Equisetum. Transactions of the British

Mycological Society 85:350-353.

42) Koske, R. E. and J. N. Gemma. 1989. A modified procedure for staining

roots to detect VA mycorrhizas. Mycological Research 92:486-488.

43) Koske, R. E., J. N. Gemma, and W. C. Mueller. 1989. Observations on

‗sporocarps‘ of the VA mycorrhizal fungus Rhizophagus litchii.

Mycological Research 92:488-490.

44) Krolicka, A., I. Staniszewska, K. Bielawski, E. Malin ´ski, J. Szafranek, and

E. Lojkowska. 2001. Establishment of hairy root cultures of Ammi majus.

Plant Sci 160:259–264.

45) Mosse, B. and C. Hepper. 1975a. Vesicular-arbuscular infections in root–

organ cultures. Physiol Plant Pathol 5:215–233.

46) Mosse, B. and C. Hepper. 1975b. Vesicular-arbuscular infections in root–

organ cultures. Physiol Plant Pathol 5:215–233.

47) Mosse, M. and J. Thompson. 1981a. Production of mycorrhizal fungi. Us

Pat No 4294037.

48) Mosse, M. and J. Thompson. 1981b. Production of mycorrhizal fungi. Us

Pat No. 4294037.

49) Mugnier, J., G. Jung, and J.-L. Prioul. 1986. Method of producing

endomycorrhizan fungi with arbuscular and vesicles in vitro. Us Pat No.

4599312.

50) Mugnier, J. and B. Mosse. 1987. Vesicular–arbuscular mycorrhizal infec-

tion in transformed root-inducing T-DNA roots grown axenically. .

Phytopathology 77:1045–1050.

51) Murashige, T. and F. Skook. 1962. A revised medium for rapid growth and

bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15:3:473-497.

52) Roger, T., Koide, Barbara, and B. Mosse. 2004a. A history of research on

arbuscular mycorrhiza. Springer-Verlag 14:145–163.

53) Roger, T., Koide, and M. Barbara. 2004b. A history of research on

arbuscular mycorrhiza. Mycorrhiza. Springer-Verlag 14:145-163.


54) Sidwa-Gorycka, M., A. Krolicka, A. Orlita, E. Malinski, M. Golebiowski, J.

Kumirska, A. Chromik, E. Biskup, P. Stepnowski, and E. Lojkowska. 2009.

Genetic transformation of Ruta graveolens L. by Agrobacterium rhizogenes:

hairy root cultures a promising approach for production of coumarins and

furanocoumarins. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 97:59-69.

55) Songul, C. D. and A. Sevinc. 2002. Effects of Vesicular-Arbuscular

Mycorrhizae on The Growth and Uptake of Some Heavy Metals by

Oat(Avena Sativa. L.). International Conference On Sustainable Land Use

And Management Canakkale.

56) St-Arnaud, M., C. Hamel, B. Vimard, M. Caron, and J. Fortin. 1996.

Enhanced hyphal growth and spore production of the arbuscular mycorrhizal

fungus Glomus intraradices in an in vitro system in the absence of host

roots. Mycol Res 100:328-332.

57) Strullu, D. and C. Romand. 1986. Méthode d‘obtention d‘endomycorhizes a

vesicules et arbuscules en condition axeniques. C R de Acad Sci 303:245–

250.

58) Sylvia, D. and A. Jarstfer. 1992. Sheared roots as a VA-mycorrhizal

inoculum and methods for enhancing growth. Us Pat No. 5096481.

59) Tiwari, P. and A. Adholeya. 2003. Host dependent differential spread of

Glomus intraradices on various Ri T-DNA transformed root in vitro. Mycol

Prog 2:171-177.

60) Turmel, M. S. 2004. Exposing the Mycorrhizaes in Agriculture. Dept. of

Plant Science, University of Manitoba.

61) Veena, V. and C. Taylor. 2007. Agrobacterium rhizogenses: recent

developments and promising applications. In Vitro Cellular &

Developmental Biology - Plant 43:383-403.

62) Voets, L., H. Dupre de Boulois, L. Renard, D.-G. Strullu, and S. Declerck.

2005a. Development of an autotrophic culture system for the in vitro

mycorrhization of potato plantlets. FEMS Microbiology Letters 248:111-

118.

63) Voets, L., H. Dupré de Boulois, L. Renard, D. Strullu, and S. Declerck.

2005b. Development of an autotrophic culture system for the in vitro

mycorrhization of potato plantlets. FEMS Microbiol Lett 248:111-118.


64) Wang, W. 2003. Method of facilitating mass production and sporulation of

arbuscular mycorrhizal fungi aseptic. Us Pat No. 6759232.

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Kết quả phân tích các đại lƣợng đặc trƣng của số lƣợng bào tử

trong thí nghiệm môi trƣờng trên giá thể rễ Cà rốt cộng sinh với chủng 41833

N Mean Std.

Deviation

Std.

Error

95% Confidence

Interval for Mean Minimum Maximum

Lower

Bound

Upper

Bound

Số lƣợng bào tử 1

1 3 1809.00 47.149 27.221 1691.88 1926.12 1776 1863

2 3 147.00 7.937 4.583 127.28 166.72 138 153

3 3 644.00 9.165 5.292 621.23 666.77 636 654

Total 9 866.67 739.190 246.397 298.47 1434.86 138 1863


1 3 3453.00 61.828 35.697 3299.41 3606.59 3383 3498

2 3 263.00 6.245 3.606 247.49 278.51 258 270

3 3 1226.00 13.937 8.047 1191.38 1260.62 1217 1242

Total 9 1647.33 1417.353 472.451 557.86 2736.81 258 3498


1 3 5057.00 43.405 25.060 4949.18 5164.82 5007 5085

2 3 330.00 7.937 4.583 310.28 349.72 324 339

3 3 1465.00 24.109 13.919 1405.11 1524.89 1448 1493

Total 9 2284.00 2137.179 712.393 641.22 3926.78 324 5085


1 3 8938.33 63.721 36.789 8780.04 9096.62 8892 9011

2 3 402.00 3.000 1.732 394.55 409.45 399 405

3 3 1805.33 7.506 4.333 1786.69 1823.98 1798 1813

Total 9 3715.22 3964.314 1321.438 667.98 6762.46 399 9011


1 3 10362.50 77.397 44.685 10170.24 10554.76 10305 10451

2 3 636.00 7.937 4.583 616.28 655.72 627 642

3 3 2021.50 17.385 10.037 1978.31 2064.69 2006 2040

Total 9 4340.00 4556.718 1518.906 837.40 7842.60 627 10451


Phụ lục 2: Kết quả phân tích Post Hoc Test về số lƣợng bào tử của các công

thức thí nghiệm môi trƣờng trên giá thể rễ Cà rốt-41833

Dependent Variable (I)

CT

(J)

CT

Mean

Difference

(I-J)

Std.

Error Sig.

95% Confidence Interval

Lower Bound Upper Bound

Số lƣợng bào tử 1 Bonferroni

1 2 1662.000* 22.949 .000 1586.56 1737.44

3 1165.000* 22.949 .000 1089.56 1240.44

2 1 -1662.000* 22.949 .000 -1737.44 -1586.56

3 -497.000* 22.949 .000 -572.44 -421.56

3 1 -1165.000* 22.949 .000 -1240.44 -1089.56

2 497.000* 22.949 .000 421.56 572.44


1 2 3190.000* 30.022 .000 3091.30 3288.70

3 2227.000* 30.022 .000 2128.30 2325.70

2 1 -3190.000* 30.022 .000 -3288.70 -3091.30

3 -963.000* 30.022 .000 -1061.70 -864.30

3 1 -2227.000* 30.022 .000 -2325.70 -2128.30

2 963.000* 30.022 .000 864.30 1061.70


1 2 4727.000* 23.703 .000 4649.08 4804.92

3 3592.000* 23.703 .000 3514.08 3669.92

2 1 -4727.000* 23.703 .000 -4804.92 -4649.08

3 -1135.000* 23.703 .000 -1212.92 -1057.08

3 1 -3592.000* 23.703 .000 -3669.92 -3514.08

2 1135.000* 23.703 .000 1057.08 1212.92


1 2 8536.333* 30.279 .000 8436.79 8635.87

3 7133.000* 30.279 .000 7033.46 7232.54

2 1 -8536.333* 30.279 .000 -8635.87 -8436.79

3 -1403.333* 30.279 .000 -1502.87 -1303.79

3 1 -7133.000* 30.279 .000 -7232.54 -7033.46

2 1403.333* 30.279 .000 1303.79 1502.87


1 2 9726.500* 37.581 .000 9602.95 9850.05

3 8341.000* 37.581 .000 8217.45 8464.55

2 1 -9726.500* 37.581 .000 -9850.05 -9602.95

3 -1385.500* 37.581 .000 -1509.05 -1261.95

3 1 -8341.000* 37.581 .000 -8464.55 -8217.45

2 1385.500* 37.581 .000 1261.95 1509.05

*. The mean difference is significant at the 0,05 level.



trong thí nghiệm môi trƣờng trên giá thể rễ Cà rốt cộng sinh với chủng M7

N Mean Std.

Deviation

Std.

Error

95% Confidence


Lower

Bound

Upper

Bound


1 3 2061.00 45.398 26.211 1948.22 2173.78 2025 2112

2 3 120.00 3.000 1.732 112.55 127.45 117 123

3 3 722.00 4.583 2.646 710.62 733.38 717 726

Total 9 967.67 860.740 286.913 306.04 1629.29 117 2112


1 3 4030.50 8.352 4.822 4009.75 4051.25 4023 4040

2 3 252.00 3.000 1.732 244.55 259.45 249 255

3 3 1244.50 32.392 18.702 1164.03 1324.97 1211 1275

Total 9 1842.33 1696.547 565.516 538.25 3146.41 249 4040


1 3 7055.00 12.031 6.946 7025.11 7084.89 7043 7067

2 3 308.00 6.245 3.606 292.49 323.51 303 315

3 3 1454.50 17.514 10.112 1410.99 1498.01 1436 1470

Total 9 2939.17 3126.561 1042.187 535.88 5342.45 303 7067


1 3 9238.00 31.261 18.049 9160.34 9315.66 9204 9266

2 3 492.67 12.741 7.356 461.02 524.32 478 501

3 3 1804.00 7.937 4.583 1784.28 1823.72 1798 1813

Total 9 3844.89 4084.532 1361.511 705.24 6984.54 478 9266


1 3 9947.50 30.790 17.776 9871.01 10023.99 9914 9974

2 3 575.00 13.528 7.810 541.40 608.60 561 588

3 3 2049.00 39.686 22.913 1950.41 2147.59 2004 2079

Total 9 4190.50 4364.747 1454.916 835.46 7545.54 561 9974



thức thí nghiệm môi trƣờng trên giá thể rễ Cà rốt-M7


CT

(J)

CT

Mean

Difference

(I-J)

Std.

Error Sig.




1 2 1941.000* 21.556 .000 1870.14 2011.86

3 1339.000* 21.556 .000 1268.14 1409.86

2 1 -1941.000* 21.556 .000 -2011.86 -1870.14

3 -602.000* 21.556 .000 -672.86 -531.14

3 1 -1339.000* 21.556 .000 -1409.86 -1268.14

2 602.000* 21.556 .000 531.14 672.86


1 2 3778.500* 15.832 .000 3726.45 3830.55

3 2786.000* 15.832 .000 2733.95 2838.05

2 1 -3778.500* 15.832 .000 -3830.55 -3726.45

3 -992.500* 15.832 .000 -1044.55 -940.45

3 1 -2786.000* 15.832 .000 -2838.05 -2733.95

2 992.500* 15.832 .000 940.45 1044.55

So luong bao tu 3 Bonferroni

1 2 6747.000* 10.440 .000 6712.68 6781.32

3 5600.500* 10.440 .000 5566.18 5634.82

2 1 -6747.000* 10.440 .000 -6781.32 -6712.68

3 -1146.500* 10.440 .000 -1180.82 -1112.18

3 1 -5600.500* 10.440 .000 -5634.82 -5566.18

2 1146.500* 10.440 .000 1112.18 1180.82


1 2 8745.333* 16.347 .000 8691.59 8799.08

3 7434.000* 16.347 .000 7380.26 7487.74

2 1 -8745.333* 16.347 .000 -8799.08 -8691.59

3 -1311.333* 16.347 .000 -1365.08 -1257.59

3 1 -7434.000* 16.347 .000 -7487.74 -7380.26

2 1311.333* 16.347 .000 1257.59 1365.08


1 2 9372.500* 24.522 .000 9291.88 9453.12

3 7898.500* 24.522 .000 7817.88 7979.12

2 1 -9372.500* 24.522 .000 -9453.12 -9291.88

3 -1474.000* 24.522 .000 -1554.62 -1393.38

3 1 -7898.500* 24.522 .000 -7979.12 -7817.88

2 1474.000* 24.522 .000 1393.38 1554.62




trong thí nghiệm môi trƣờng trên giá thể rễ Medicago cộng sinh với chủng 41833

N Mean Std.

Deviation

Std.

Error

95% Confidence


Lower

Bound

Upper

Bound


1 3 1632.00 10.817 6.245 1605.13 1658.87 1623 1644

2 3 81.00 5.196 3.000 68.09 93.91 78 87

3 3 408.00 6.000 3.464 393.10 422.90 402 414

Total 9 707.00 708.084 236.028 162.72 1251.28 78 1644


1 3 3353.50 25.159 14.526 3291.00 3416.00 3338 3383

2 3 169.00 4.583 2.646 157.62 180.38 165 174

3 3 1056.00 36.000 20.785 966.57 1145.43 1020 1092

Total 9 1526.17 1423.474 474.491 431.99 2620.35 165 3383


1 3 4052.00 51.752 29.879 3923.44 4180.56 4001 4104

2 3 217.00 4.583 2.646 205.62 228.38 213 222

3 3 1249.67 11.590 6.692 1220.87 1278.46 1239 1262

Total 9 1839.56 1718.734 572.911 518.42 3160.69 213 4104


1 3 7110.33 16.258 9.387 7069.95 7150.72 7092 7123

2 3 288.00 6.000 3.464 273.10 302.90 282 294

3 3 1411.33 7.638 4.410 1392.36 1430.31 1403 1418

Total 9 2936.56 3167.914 1055.971 501.48 5371.63 282 7123


1 3 8271.00 11.715 6.764 8241.90 8300.10 8258 8279

2 3 407.00 6.245 3.606 391.49 422.51 402 414

3 3 1740.00 6.245 3.606 1724.49 1755.51 1733 1745

Total 9 3472.67 3644.753 1214.918 671.06 6274.27 402 8279



thức thí nghiệm môi trƣờng trên giá thể rễ Medicago-41833


CT

(J)

CT

Mean

Difference (I-

J)

Std. Error Sig.




1 2 1551.000* 6.325 .000 1530.21 1571.79

3 1224.000* 6.325 .000 1203.21 1244.79

2 1 -1551.000* 6.325 .000 -1571.79 -1530.21

3 -327.000* 6.325 .000 -347.79 -306.21

3 1 -1224.000* 6.325 .000 -1244.79 -1203.21

2 327.000* 6.325 .000 306.21 347.79


1 2 3184.500* 20.817 .000 3116.07 3252.93

3 2297.500* 20.817 .000 2229.07 2365.93

2 1 -3184.500* 20.817 .000 -3252.93 -3116.07

3 -887.000* 20.817 .000 -955.43 -818.57

3 1 -2297.500* 20.817 .000 -2365.93 -2229.07

2 887.000* 20.817 .000 818.57 955.43


1 2 3835.000* 25.094 .000 3752.51 3917.49

3 2802.333* 25.094 .000 2719.84 2884.83

2 1 -3835.000* 25.094 .000 -3917.49 -3752.51

3 -1032.667* 25.094 .000 -1115.16 -950.17

3 1 -2802.333* 25.094 .000 -2884.83 -2719.84

2 1032.667* 25.094 .000 950.17 1115.16


1 2 6822.333* 8.928 .000 6792.98 6851.68

3 5699.000* 8.928 .000 5669.65 5728.35

2 1 -6822.333* 8.928 .000 -6851.68 -6792.98

3 -1123.333* 8.928 .000 -1152.68 -1093.98

3 1 -5699.000* 8.928 .000 -5728.35 -5669.65

2 1123.333* 8.928 .000 1093.98 1152.68


1 2 7864.000* 6.916 .000 7841.26 7886.74

3 6531.000* 6.916 .000 6508.26 6553.74

2 1 -7864.000* 6.916 .000 -7886.74 -7841.26

3 -1333.000* 6.916 .000 -1355.74 -1310.26

3 1 -6531.000* 6.916 .000 -6553.74 -6508.26

2 1333.000* 6.916 .000 1310.26 1355.74




trong thí nghiệm môi trƣờng trên giá thể rễ Medicago cộng sinh với chủng M7

N Mean Std.

Deviation

Std.

Error

95% Confidence


Lower

Bound

Upper

Bound


1 3 1949.00 22.913 13.229 1892.08 2005.92 1929 1974

2 3 104.00 3.464 2.000 95.39 112.61 102 108

3 3 548.00 7.550 4.359 529.25 566.75 540 555

Total 9 867.00 834.053 278.018 225.89 1508.11 102 1974


1 3 3656.00 39.125 22.589 3558.81 3753.19 3623 3699

2 3 218.00 6.245 3.606 202.49 233.51 213 225

3 3 1123.00 3.775 2.179 1113.62 1132.38 1119 1127

Total 9 1665.67 1543.459 514.486 479.26 2852.07 213 3699


1 3 5873.00 73.856 42.641 5689.53 6056.47 5792 5936

2 3 254.00 6.245 3.606 238.49 269.51 249 261

3 3 1355.50 12.933 7.467 1323.37 1387.63 1344 1370

Total 9 2494.17 2578.895 859.632 511.85 4476.48 249 5936


1 3 8265.67 74.969 43.283 8079.43 8451.90 8196 8345

2 3 405.67 6.658 3.844 389.13 422.21 398 410

3 3 1703.67 11.930 6.888 1674.03 1733.30 1690 1712

Total 9 3458.33 3649.244 1216.415 653.28 6263.39 398 8345


1 3 9229.00 28.710 16.576 9157.68 9300.32 9206 9261

2 3 457.00 6.245 3.606 441.49 472.51 450 462

3 3 1827.50 9.644 5.568 1803.54 1851.46 1817 1835

Total 9 3837.83 4086.722 1362.241 696.50 6979.17 450 9261



thức thí nghiệm môi trƣờng trên giá thể rễ Medicago-M7


CT

(J)

CT

Mean

Difference (I-

J)

Std.

Error Sig.




1 2 1845.000* 11.489 .000 1807.23 1882.77

3 1401.000* 11.489 .000 1363.23 1438.77

2 1 -1845.000* 11.489 .000 -1882.77 -1807.23

3 -444.000* 11.489 .000 -481.77 -406.23

3 1 -1401.000* 11.489 .000 -1438.77 -1363.23

2 444.000* 11.489 .000 406.23 481.77


1 2 3438.000* 18.762 .000 3376.32 3499.68

3 2533.000* 18.762 .000 2471.32 2594.68

2 1 -3438.000* 18.762 .000 -3499.68 -3376.32

3 -905.000* 18.762 .000 -966.68 -843.32

3 1 -2533.000* 18.762 .000 -2594.68 -2471.32

2 905.000* 18.762 .000 843.32 966.68


1 2 5619.000* 35.468 .000 5502.40 5735.60

3 4517.500* 35.468 .000 4400.90 4634.10

2 1 -5619.000* 35.468 .000 -5735.60 -5502.40

3 -1101.500* 35.468 .000 -1218.10 -984.90

3 1 -4517.500* 35.468 .000 -4634.10 -4400.90

2 1101.500* 35.468 .000 984.90 1218.10


1 2 7860.000* 35.923 .000 7741.91 7978.09

3 6562.000* 35.923 .000 6443.91 6680.09

2 1 -7860.000* 35.923 .000 -7978.09 -7741.91

3 -1298.000* 35.923 .000 -1416.09 -1179.91

3 1 -6562.000* 35.923 .000 -6680.09 -6443.91

2 1298.000* 35.923 .000 1179.91 1416.09


1 2 8772.000* 14.577 .000 8724.08 8819.92

3 7401.500* 14.577 .000 7353.58 7449.42

2 1 -8772.000* 14.577 .000 -8819.92 -8724.08

3 -1370.500* 14.577 .000 -1418.42 -1322.58

3 1 -7401.500* 14.577 .000 -7449.42 -7353.58

2 1370.500* 14.577 .000 1322.58 1418.42




trong thí nghiệm pH môi trƣờng trên giá thể rễ Cà rốt cộng sinh với chủng 41833

N Mean Std.

Deviation

Std.

Error

95% Confidence


Lower

Bound

Upper

Bound


1 3 1108.33 25.423 14.678 1045.18 1171.49 1079 1124

2 3 1809.00 47.149 27.221 1691.88 1926.12 1776 1863

3 3 1025.33 8.327 4.807 1004.65 1046.02 1016 1032

Total 9 1314.22 373.804 124.601 1026.89 1601.55 1016 1863


1 3 2127.33 19.655 11.348 2078.51 2176.16 2115 2150

2 3 3453.33 61.647 35.592 3300.19 3606.47 3383 3498

3 3 2523.33 17.898 10.333 2478.87 2567.79 2508 2543

Total 9 2701.33 590.445 196.815 2247.48 3155.19 2115 3498


1 3 3147.00 13.748 7.937 3112.85 3181.15 3135 3162

2 3 5057.00 43.405 25.060 4949.18 5164.82 5007 5085

3 3 4357.33 30.665 17.704 4281.16 4433.51 4322 4377

Total 9 4187.11 837.300 279.100 3543.51 4830.72 3135 5085


1 3 4216.33 16.921 9.770 4174.30 4258.37 4202 4235

2 3 8938.33 63.721 36.789 8780.04 9096.62 8892 9011

3 3 6164.33 70.571 40.744 5989.02 6339.64 6114 6245

Total 9 6439.67 2055.654 685.218 4859.55 8019.78 4202 9011


1 3 5412.33 6.658 3.844 5395.79 5428.87 5408 5420

2 3 10362.67 77.681 44.849 10169.70 10555.64 10305 10451

3 3 7138.00 13.528 7.810 7104.40 7171.60 7125 7152

Total 9 7637.67 2176.428 725.476 5964.72 9310.62 5408 10451



thức thí nghiệm pH môi trƣờng trên giá thể rễ Cà rốt-41833


CT

(J)

CT

Mean

Difference (I-J)

Std.

Error Sig.




1 2 -700.667* 25.555 .000 -784.68 -616.66

3 83.000 25.555 .053 -1.01 167.01

2 1 700.667* 25.555 .000 616.66 784.68

3 783.667* 25.555 .000 699.66 867.68

3 1 -83.000 25.555 .053 -167.01 1.01

2 -783.667* 25.555 .000 -867.68 -699.66


1 2 -1326.000* 31.647 .000 -1430.04 -1221.96

3 -396.000* 31.647 .000 -500.04 -291.96

2 1 1326.000* 31.647 .000 1221.96 1430.04

3 930.000* 31.647 .000 825.96 1034.04

3 1 396.000* 31.647 .000 291.96 500.04

2 -930.000* 31.647 .000 -1034.04 -825.96


1 2 -1910.000* 25.877 .000 -1995.07 -1824.93

3 -1210.333* 25.877 .000 -1295.40 -1125.26

2 1 1910.000* 25.877 .000 1824.93 1995.07

3 699.667* 25.877 .000 614.60 784.74

3 1 1210.333* 25.877 .000 1125.26 1295.40

2 -699.667* 25.877 .000 -784.74 -614.60


1 2 -4722.000* 45.527 .000 -4871.67 -4572.33

3 -1948.000* 45.527 .000 -2097.67 -1798.33

2 1 4722.000* 45.527 .000 4572.33 4871.67

3 2774.000* 45.527 .000 2624.33 2923.67

3 1 1948.000* 45.527 .000 1798.33 2097.67

2 -2774.000* 45.527 .000 -2923.67 -2624.33


1 2 -4950.333* 37.303 .000 -5072.96 -4827.70

3 -1725.667* 37.303 .000 -1848.30 -1603.04

2 1 4950.333* 37.303 .000 4827.70 5072.96

3 3224.667* 37.303 .000 3102.04 3347.30

3 1 1725.667* 37.303 .000 1603.04 1848.30

2 -3224.667* 37.303 .000 -3347.30 -3102.04




trong thí nghiệm pH môi trƣờng trên giá thể rễ Cà rốt cộng sinh với chủng M7

N Mean Std. Deviation Std. Error

95% Confidence Interval for

Mean Min Max



1 3 1071.67 14.012 8.090 1036.86 1106.47 1058 1086

2 3 2061.00 45.398 26.211 1948.22 2173.78 2025 2112

3 3 948.67 30.072 17.362 873.96 1023.37 927 983

Total 9 1360.44 528.857 176.286 953.93 1766.96 927 2112


1 3 2060.33 32.130 18.550 1980.52 2140.15 2024 2085

2 3 4030.67 8.622 4.978 4009.25 4052.08 4023 4040

3 3 2352.33 40.017 23.104 2252.93 2451.74 2313 2393

Total 9 2814.44 921.256 307.085 2106.30 3522.58 2024 4040


1 3 2953.33 17.616 10.171 2909.57 2997.09 2939 2973

2 3 7055.33 12.014 6.936 7025.49 7085.18 7043 7067

3 3 4153.00 33.719 19.468 4069.24 4236.76 4124 4190

Total 9 4720.56 1826.620 608.873 3316.49 6124.62 2939 7067


1 3 4041.33 22.301 12.875 3985.93 4096.73 4016 4058

2 3 9238.33 31.533 18.206 9160.00 9316.67 9204 9266

3 3 6045.67 26.633 15.377 5979.51 6111.83 6023 6075

Total 9 6441.78 2270.013 756.671 4696.89 8186.66 4016 9266


1 3 5206.67 4.163 2.404 5196.32 5217.01 5202 5210

2 3 9948.00 30.790 17.776 9871.51 10024.49 9914 9974

3 3 7043.33 12.503 7.219 7012.27 7074.39 7031 7056

Total 9 7399.33 2070.414 690.138 5807.87 8990.79 5202 9974



thức thí nghiệm pH môi trƣờng trên giá thể rễ Cà rốt-M7


CT

(J)

CT

Mean Difference

(I-J) Std. Error Sig.


Lower Bound Upper

Bound


1 2 -989.333* 26.506 .000 -1076.47 -902.19

3 123.000* 26.506 .011 35.86 210.14

2 1 989.333* 26.506 .000 902.19 1076.47

3 1112.333* 26.506 .000 1025.19 1199.47

3 1 -123.000* 26.506 .011 -210.14 -35.86

2 -1112.333* 26.506 .000 -1199.47 -1025.19


1 2 -1970.333* 24.531 .000 -2050.98 -1889.69

3 -292.000* 24.531 .000 -372.65 -211.35

2 1 1970.333* 24.531 .000 1889.69 2050.98

3 1678.333* 24.531 .000 1597.69 1758.98

3 1 292.000* 24.531 .000 211.35 372.65

2 -1678.333* 24.531 .000 -1758.98 -1597.69


1 2 -4102.000* 18.807 .000 -4163.83 -4040.17

3 -1199.667* 18.807 .000 -1261.49 -1137.84

2 1 4102.000* 18.807 .000 4040.17 4163.83

3 2902.333* 18.807 .000 2840.51 2964.16

3 1 1199.667* 18.807 .000 1137.84 1261.49

2 -2902.333* 18.807 .000 -2964.16 -2840.51


1 2 -5197.000* 22.116 .000 -5269.70 -5124.30

3 -2004.333* 22.116 .000 -2077.04 -1931.63

2 1 5197.000* 22.116 .000 5124.30 5269.70

3 3192.667* 22.116 .000 3119.96 3265.37

3 1 2004.333* 22.116 .000 1931.63 2077.04

2 -3192.667* 22.116 .000 -3265.37 -3119.96


1 2 -4741.333* 15.788 .000 -4793.24 -4689.43

3 -1836.667* 15.788 .000 -1888.57 -1784.76

2 1 4741.333* 15.788 .000 4689.43 4793.24

3 2904.667* 15.788 .000 2852.76 2956.57

3 1 1836.667* 15.788 .000 1784.76 1888.57


2 -2904.667* 15.788 .000 -2956.57 -2852.76


Phụ lục 13: Kết quả phân tích các đại lƣợng đặc trƣng của số lƣợng bào tử trong

thí nghiệm pH môi trƣờng trên giá thể rễ Medicago cộng sinh với chủng 41833

N Mean Std.

Deviation

Std.

Error


for Mean Minimum Maximum

Lower

Bound

Upper

Bound


1 3 533.00 22.517 13.000 477.07 588.93 510 555

2 3 1632.00 10.817 6.245 1605.13 1658.87 1623 1644

3 3 749.00 4.583 2.646 737.62 760.38 744 753

Total 9 971.33 504.410 168.137 583.61 1359.06 510 1644


1 3 1362.33 12.583 7.265 1331.08 1393.59 1349 1374

2 3 3354.00 25.159 14.526 3291.50 3416.50 3338 3383

3 3 1816.33 11.930 6.888 1786.70 1845.97 1803 1826

Total 9 2177.56 904.097 301.366 1482.60 2872.51 1349 3383


1 3 2469.33 22.030 12.719 2414.61 2524.06 2448 2492

2 3 4052.33 51.501 29.734 3924.40 4180.27 4001 4104

3 3 3377.33 23.756 13.715 3318.32 3436.35 3350 3393

Total 9 3299.67 688.602 229.534 2770.36 3828.97 2448 4104


1 3 3654.67 45.347 26.181 3542.02 3767.31 3627 3707

2 3 7211.33 77.391 44.682 7019.08 7403.58 7122 7258

3 3 4997.67 32.332 18.667 4917.35 5077.98 4963 5027

Total 9 5287.89 1556.118 518.706 4091.75 6484.03 3627 7258


1 3 4161.33 22.234 12.837 4106.10 4216.56 4148 4187

2 3 8271.33 11.590 6.692 8242.54 8300.13 8258 8279

3 3 5735.33 31.565 18.224 5656.92 5813.74 5705 5768

Total 9 6056.00 1795.972 598.657 4675.49 7436.51 4148 8279



thức thí nghiệm pH môi trƣờng trên giá thể rễ Medicago-41833


CT

(J)

CT

Mean

Difference (I-

J)

Std.

Error Sig.




1 2 1551.000* 6.325 .000 1530.21 1571.79

3 1224.000* 6.325 .000 1203.21 1244.79

2 1 -1551.000* 6.325 .000 -1571.79 -1530.21

3 -327.000* 6.325 .000 -347.79 -306.21

3 1 -1224.000* 6.325 .000 -1244.79 -1203.21

2 327.000* 6.325 .000 306.21 347.79


1 2 3184.500* 20.817 .000 3116.07 3252.93

3 2297.500* 20.817 .000 2229.07 2365.93

2 1 -3184.500* 20.817 .000 -3252.93 -3116.07

3 -887.000* 20.817 .000 -955.43 -818.57

3 1 -2297.500* 20.817 .000 -2365.93 -2229.07

2 887.000* 20.817 .000 818.57 955.43


1 2 3835.000* 25.094 .000 3752.51 3917.49

3 2802.333* 25.094 .000 2719.84 2884.83

2 1 -3835.000* 25.094 .000 -3917.49 -3752.51

3 -1032.667* 25.094 .000 -1115.16 -950.17

3 1 -2802.333* 25.094 .000 -2884.83 -2719.84

2 1032.667* 25.094 .000 950.17 1115.16


1 2 6822.333* 8.928 .000 6792.98 6851.68

3 5699.000* 8.928 .000 5669.65 5728.35

2 1 -6822.333* 8.928 .000 -6851.68 -6792.98

3 -1123.333* 8.928 .000 -1152.68 -1093.98

3 1 -5699.000* 8.928 .000 -5728.35 -5669.65

2 1123.333* 8.928 .000 1093.98 1152.68


1 2 7864.000* 6.916 .000 7841.26 7886.74

3 6531.000* 6.916 .000 6508.26 6553.74

2 1 -7864.000* 6.916 .000 -7886.74 -7841.26

3 -1333.000* 6.916 .000 -1355.74 -1310.26

3 1 -6531.000* 6.916 .000 -6553.74 -6508.26


2 1333.000* 6.916 .000 1310.26 1355.74


Phụ lục 15: Kết quả phân tích các đại lƣợng đặc trƣng của số lƣợng bào tử trong

thí nghiệm pH môi trƣờng trên giá thể rễ Medicago cộng sinh với chủng M7

N Mean Std.

Deviation

Std.

Error

95% Confidence


Lower

Bound

Upper

Bound


1 3 663.00 33.808 19.519 579.02 746.98 624 684

2 3 1949.00 22.913 13.229 1892.08 2005.92 1929 1974

3 3 822.00 9.000 5.196 799.64 844.36 813 831

Total 9 1144.67 607.526 202.509 677.68 1611.65 624 1974


1 3 1537.33 24.583 14.193 1476.27 1598.40 1509 1553

2 3 3656.33 38.850 22.430 3559.82 3752.84 3623 3699

3 3 2050.67 37.501 21.651 1957.51 2143.82 2013 2088

Total 9 2414.78 957.789 319.263 1678.56 3151.00 1509 3699


1 3 2589.33 56.146 32.416 2449.86 2728.81 2553 2654

2 3 5873.33 73.793 42.604 5690.02 6056.64 5792 5936

3 3 3560.33 17.243 9.955 3517.50 3603.17 3545 3579

Total 9 4007.67 1461.816 487.272 2884.02 5131.32 2553 5936


1 3 3934.00 70.235 40.550 3759.53 4108.47 3853 3978

2 3 8315.33 82.008 47.347 8111.61 8519.05 8234 8398

3 3 4947.33 35.445 20.464 4859.28 5035.38 4923 4988

Total 9 5732.22 1987.215 662.405 4204.71 7259.73 3853 8398


1 3 4342.33 14.640 8.452 4305.97 4378.70 4329 4358

2 3 9229.33 28.431 16.415 9158.71 9299.96 9206 9261

3 3 5531.33 19.296 11.141 5483.40 5579.27 5516 5553

Total 9 6367.67 2207.218 735.739 4671.05 8064.28 4329 9261



thức thí nghiệm pH môi trƣờng trên giá thể rễ Medicago-M7


CT

(J)

CT

Mean

Difference (I-J)

Std.

Error

Sig. 95% Confidence Interval



1 2 -1286.000* 19.715 .000 -1350.81 -1221.19

3 -159.000* 19.715 .001 -223.81 -94.19

2 1 1286.000* 19.715 .000 1221.19 1350.81

3 1127.000* 19.715 .000 1062.19 1191.81

3 1 159.000* 19.715 .001 94.19 223.81

2 -1127.000* 19.715 .000 -1191.81 -1062.19

Số lƣợng bao tu 2 Bonferroni

1 2 -2119.000* 27.968 .000 -2210.94 -2027.06

3 -513.333* 27.968 .000 -605.28 -421.39

2 1 2119.000* 27.968 .000 2027.06 2210.94

3 1605.667* 27.968 .000 1513.72 1697.61

3 1 513.333* 27.968 .000 421.39 605.28

2 -1605.667* 27.968 .000 -1697.61 -1513.72

So luong bào tử 3 Bonferroni

1 2 -3284.000* 44.460 .000 -3430.16 -3137.84

3 -971.000* 44.460 .000 -1117.16 -824.84

2 1 3284.000* 44.460 .000 3137.84 3430.16

3 2313.000* 44.460 .000 2166.84 2459.16

3 1 971.000* 44.460 .000 824.84 1117.16

2 -2313.000* 44.460 .000 -2459.16 -2166.84


1 2 -4381.333* 53.572 .000 -4557.45 -4205.22

3 -1013.333* 53.572 .000 -1189.45 -837.22

2 1 4381.333* 53.572 .000 4205.22 4557.45

3 3368.000* 53.572 .000 3191.89 3544.11

3 1 1013.333* 53.572 .000 837.22 1189.45

2 -3368.000* 53.572 .000 -3544.11 -3191.89


1 2 -4887.000* 17.607 .000 -4944.88 -4829.12

3 -1189.000* 17.607 .000 -1246.88 -1131.12

2 1 4887.000* 17.607 .000 4829.12 4944.88

3 3698.000* 17.607 .000 3640.12 3755.88

3 1 1189.000* 17.607 .000 1131.12 1246.88

2 -3698.000* 17.607 .000 -3755.88 -3640.12



Phụ lục 17: Bảng kết quả các đại lƣợng đặc trƣng về số lƣợng bào tử của các

loại giá thể rễ cộng sinh với chủng 41833

N Mean Std.

Deviation Std. Error


for Mean Min Max

Lower

Bound

Upper

Bound


1.1 3 1809.00 47.149 27.221 1691.88 1926.12 1776 1863

1.2 3 282.00 23.431 13.528 223.79 340.21 255 297

2.1 3 1456.33 38.004 21.942 1361.93 1550.74 1413 1484

2.2 3 225.00 7.937 4.583 205.28 244.72 219 234

Total 12 943.08 732.759 211.529 477.51 1408.66 219 1863


1.1 3 3454.00 61.286 35.384 3301.76 3606.24 3384 3498

1.2 3 646.00 30.050 17.349 571.35 720.65 612 669

2.1 3 2755.67 46.758 26.996 2639.51 2871.82 2712 2805

2.2 3 527.00 19.975 11.533 477.38 576.62 510 549

Total 12 1845.67 1341.412 387.232 993.37 2697.96 510 3498


1.1 3 5057.00 43.405 25.060 4949.18 5164.82 5007 5085

1.2 3 1066.00 33.719 19.468 982.24 1149.76 1029 1095

2.1 3 4053.33 28.449 16.425 3982.66 4124.00 4034 4086

2.2 3 847.00 4.583 2.646 835.62 858.38 843 852

Total 12 2755.83 1917.429 553.514 1537.56 3974.11 843 5085


1.1 3 8938.33 63.721 36.789 8780.04 9096.62 8892 9011

1.2 3 1526.67 12.741 7.356 1495.02 1558.32 1512 1535

2.1 3 7110.33 16.258 9.387 7069.95 7150.72 7092 7123

2.2 3 1226.33 10.693 6.173 1199.77 1252.90 1217 1238

Total 12 4700.42 3538.592 1021.503 2452.10 6948.73 1217 9011


1.1 3 10362.67 77.681 44.849 10169.70 10555.64 10305 10451

1.2 3 2119.33 21.939 12.667 2064.83 2173.83 2102 2144

2.1 3 8327.67 13.317 7.688 8294.59 8360.75 8313 8339

2.2 3 1720.33 19.858 11.465 1671.00 1769.66 1706 1743

Total 12 5632.50 3952.807 1141.077 3121.01 8143.99 1706 10451


Phụ lục 18: Kết quả phân tích Post Hoc Test về số lƣợng bào tử của các loại

giá thể mô rễ cộng sinh với chủng 41833


CT

(J)

CT

Mean

Difference

(I-J)

Std.

Error Sig.




1.1

1.2 1527.000* 26.706 .000 1434.09 1619.91

2.1 352.667* 26.706 .000 259.76 445.57

2.2 1584.000* 26.706 .000 1491.09 1676.91

1.2

1.1 -1527.000* 26.706 .000 -1619.91 -1434.09

2.1 -1174.333* 26.706 .000 -1267.24 -1081.43

2.2 57.000 26.706 .392 -35.91 149.91

2.1

1.1 -352.667* 26.706 .000 -445.57 -259.76

1.2 1174.333* 26.706 .000 1081.43 1267.24

2.2 1231.333* 26.706 .000 1138.43 1324.24

2.2

1.1 -1584.000* 26.706 .000 -1676.91 -1491.09

1.2 -57.000 26.706 .392 -149.91 35.91

2.1 -1231.333* 26.706 .000 -1324.24 -1138.43


1.1

1.2 2808.000* 34.748 .000 2687.12 2928.88

2.1 698.333* 34.748 .000 577.45 819.22

2.2 2927.000* 34.748 .000 2806.12 3047.88

1.2

1.1 -2808.000* 34.748 .000 -2928.88 -2687.12

2.1 -2109.667* 34.748 .000 -2230.55 -1988.78

2.2 119.000 34.748 .054 -1.88 239.88

2.1

1.1 -698.333* 34.748 .000 -819.22 -577.45

1.2 2109.667* 34.748 .000 1988.78 2230.55

2.2 2228.667* 34.748 .000 2107.78 2349.55

2.2

1.1 -2927.000* 34.748 .000 -3047.88 -2806.12

1.2 -119.000 34.748 .054 -239.88 1.88

2.1 -2228.667* 34.748 .000 -2349.55 -2107.78


1.1

1.2 3991.000* 25.336 .000 3902.86 4079.14

2.1 1003.667* 25.336 .000 915.53 1091.81

2.2 4210.000* 25.336 .000 4121.86 4298.14

1.2

1.1 -3991.000* 25.336 .000 -4079.14 -3902.86

2.1 -2987.333* 25.336 .000 -3075.47 -2899.19

2.2 219.000* 25.336 .000 130.86 307.14



2.1

1.1 -1003.667* 25.336 .000 -1091.81 -915.53

1.2 2987.333* 25.336 .000 2899.19 3075.47

2.2 3206.333* 25.336 .000 3118.19 3294.47

2.2

1.1 -4210.000* 25.336 .000 -4298.14 -4121.86

1.2 -219.000* 25.336 .000 -307.14 -130.86

2.1 -3206.333* 25.336 .000 -3294.47 -3118.19


1.1

1.2 7411.667* 27.693 .000 7315.33 7508.01

2.1 1828.000* 27.693 .000 1731.66 1924.34

2.2 7712.000* 27.693 .000 7615.66 7808.34

1.2

1.1 -7411.667* 27.693 .000 -7508.01 -7315.33

2.1 -5583.667* 27.693 .000 -5680.01 -5487.33

2.2 300.333* 27.693 .000 203.99 396.67

2.1

1.1 -1828.000* 27.693 .000 -1924.34 -1731.66

1.2 5583.667* 27.693 .000 5487.33 5680.01

2.2 5884.000* 27.693 .000 5787.66 5980.34

2.2

1.1 -7712.000* 27.693 .000 -7808.34 -7615.66

1.2 -300.333* 27.693 .000 -396.67 -203.99

2.1 -5884.000* 27.693 .000 -5980.34 -5787.66


1.1

1.2 8243.333* 34.369 .000 8123.77 8362.90

2.1 2035.000* 34.369 .000 1915.43 2154.57

2.2 8642.333* 34.369 .000 8522.77 8761.90

1.2

1.1 -8243.333* 34.369 .000 -8362.90 -8123.77

2.1 -6208.333* 34.369 .000 -6327.90 -6088.77

2.2 399.000* 34.369 .000 279.43 518.57

2.1

1.1 -2035.000* 34.369 .000 -2154.57 -1915.43

1.2 6208.333* 34.369 .000 6088.77 6327.90

2.2 6607.333* 34.369 .000 6487.77 6726.90

2.2

1.1 -8642.333* 34.369 .000 -8761.90 -8522.77

1.2 -399.000* 34.369 .000 -518.57 -279.43

2.1 -6607.333* 34.369 .000 -6726.90 -6487.77


Phụ lục 19: Bảng kết quả các đại lƣợng đặc trƣng về số lƣợng bào tử của các

loại giá thể rễ cộng sinh với chủng M7

N Mean Std.

Deviation

Std.

Error

95% Confidence


Lower

Bound

Upper

Bound


1.1 3 2059.67 47.014 27.144 1942.88 2176.46 2021 2112

1.2 3 170.00 26.211 15.133 104.89 235.11 141 192

2.1 3 944.00 39.038 22.539 847.02 1040.98 906 984

2.2 3 135.00 6.000 3.464 120.10 149.90 129 141

Total 12 827.17 816.863 235.808 308.16 1346.18 129 2112


1.1 3 4030.67 8.622 4.978 4009.25 4052.08 4023 4040

1.2 3 534.00 6.000 3.464 519.10 548.90 528 540

2.1 3 2059.33 18.610 10.745 2013.10 2105.56 2042 2079

2.2 3 430.00 17.059 9.849 387.62 472.38 411 444

Total 12 1763.50 1524.165 439.988 795.09 2731.91 411 4040


1.1 3 7055.33 12.014 6.936 7025.49 7085.18 7043 7067

1.2 3 926.00 21.284 12.288 873.13 978.87 903 945

2.1 3 3208.00 158.329 91.411 2814.69 3601.31 3102 3390

2.2 3 743.00 10.536 6.083 716.83 769.17 732 753

Total 12 2983.08 2657.779 767.235 1294.41 4671.76 732 7067


1.1 3 9238.33 31.533 18.206 9160.00 9316.67 9204 9266

1.2 3 1341.00 24.062 13.892 1281.23 1400.77 1316 1364

2.1 3 8265.67 74.969 43.283 8079.43 8451.90 8196 8345

2.2 3 1075.67 9.292 5.364 1052.59 1098.75 1068 1086

Total 12 4980.17 3957.272 1142.366 2465.84 7494.50 1068 9266


1.1 3 9948.00 30.790 17.776 9871.51 10024.49 9914 9974

1.2 3 1918.33 18.610 10.745 1872.10 1964.56 1901 1938

2.1 3 9229.00 28.710 16.576 9157.68 9300.32 9206 9261

2.2 3 1534.00 6.245 3.606 1518.49 1549.51 1529 1541

Total 12 5657.33 4117.040 1188.487 3041.49 8273.18 1529 9974


Phụ lục 20: Kết quả phân tích Post Hoc Test về số lƣợng bào tử của các loại

giá thể mô rễ cộng sinh với chủng M7


CT

(J)

CT

Mean

Difference (I-J) Std. Error Sig.




1.1

1.2 1889.667* 27.256 .000 1794.85 1984.49

2.1 1115.667* 27.256 .000 1020.85 1210.49

2.2 1924.667* 27.256 .000 1829.85 2019.49

1.2

1.1 -1889.667* 27.256 .000 -1984.49 -1794.85

2.1 -774.000* 27.256 .000 -868.82 -679.18

2.2 35.000 27.256 1.000 -59.82 129.82

2.1

1.1 -1115.667* 27.256 .000 -1210.49 -1020.85

1.2 774.000* 27.256 .000 679.18 868.82

2.2 809.000* 27.256 .000 714.18 903.82

2.2

1.1 -1924.667* 27.256 .000 -2019.49 -1829.85

1.2 -35.000 27.256 1.000 -129.82 59.82

2.1 -809.000* 27.256 .000 -903.82 -714.18


1.1

1.2 3496.667* 11.163 .000 3457.83 3535.50

2.1 1971.333* 11.163 .000 1932.50 2010.17

2.2 3600.667* 11.163 .000 3561.83 3639.50

1.2

1.1 -3496.667* 11.163 .000 -3535.50 -3457.83

2.1 -1525.333* 11.163 .000 -1564.17 -1486.50

2.2 104.000* 11.163 .000 65.17 142.83

2.1

1.1 -1971.333* 11.163 .000 -2010.17 -1932.50

1.2 1525.333* 11.163 .000 1486.50 1564.17

2.2 1629.333* 11.163 .000 1590.50 1668.17

2.2

1.1 -3600.667* 11.163 .000 -3639.50 -3561.83

1.2 -104.000* 11.163 .000 -142.83 -65.17

2.1 -1629.333* 11.163 .000 -1668.17 -1590.50


1.1

1.2 6129.333* 65.544 .000 5901.31 6357.35

2.1 3847.333* 65.544 .000 3619.31 4075.35

2.2 6312.333* 65.544 .000 6084.31 6540.35

1.2

1.1 -6129.333* 65.544 .000 -6357.35 -5901.31

2.1 -2282.000* 65.544 .000 -2510.02 -2053.98

2.2 183.000 65.544 .141 -45.02 411.02

2.1 1.1 -3847.333* 65.544 .000 -4075.35 -3619.31

1.2 2282.000* 65.544 .000 2053.98 2510.02



2.2 2465.000* 65.544 .000 2236.98 2693.02

2.2

1.1 -6312.333* 65.544 .000 -6540.35 -6084.31

1.2 -183.000 65.544 .141 -411.02 45.02

2.1 -2465.000* 65.544 .000 -2693.02 -2236.98

Sốlƣợng bào tử 4 Bonferroni

1.1

1.2 7897.333* 34.833 .000 7776.15 8018.51

2.1 972.667* 34.833 .000 851.49 1093.85

2.2 8162.667* 34.833 .000 8041.49 8283.85

1.2

1.1 -7897.333* 34.833 .000 -8018.51 -7776.15

2.1 -6924.667* 34.833 .000 -7045.85 -6803.49

2.2 265.333* 34.833 .000 144.15 386.51

2.1

1.1 -972.667* 34.833 .000 -1093.85 -851.49

1.2 6924.667* 34.833 .000 6803.49 7045.85

2.2 7190.000* 34.833 .000 7068.82 7311.18

2.2

1.1 -8162.667* 34.833 .000 -8283.85 -8041.49

1.2 -265.333* 34.833 .000 -386.51 -144.15

2.1 -7190.000* 34.833 .000 -7311.18 -7068.82


1.1

1.2 8029.667* 18.963 .000 7963.70 8095.64

2.1 719.000* 18.963 .000 653.03 784.97

2.2 8414.000* 18.963 .000 8348.03 8479.97

1.2

1.1 -8029.667* 18.963 .000 -8095.64 -7963.70

2.1 -7310.667* 18.963 .000 -7376.64 -7244.70

2.2 384.333* 18.963 .000 318.36 450.30

2.1

1.1 -719.000* 18.963 .000 -784.97 -653.03

1.2 7310.667* 18.963 .000 7244.70 7376.64

2.2 7695.000* 18.963 .000 7629.03 7760.97

2.2

1.1 -8414.000* 18.963 .000 -8479.97 -8348.03

1.2 -384.333* 18.963 .000 -450.30 -318.36

2.1 -7695.000* 18.963 .000 -7760.97 -7629.03


Documents

Ảnh Hưởng Của Môi Trường Và Giá Thể Mô Rễ Đến Khả Năng Nhân Sinh Khối Cộng Sinh Nấm Rễ AM (Arbuscular Mycorhiza) in Vitro