Angle- Of DNA Fibers

8/3/2019 Angle- Of DNA Fibers

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B i o p h y s i c a l J o u r n a l V o l u m e 7 3 S e p t e m b e r 1 9 9 7 1 5 3 9 - 1 5 5 2

C o n f o r m a t i o n a l T r a n s i t i o n s o f t h e P h o s p h o d i e s t e r Backbone i n N a t i v eDNA: T w o - D i m e n s i o n a l M a g i c - A n g l e - S p i n n i n g 31P-NMR o f D N A F i b e r sZ h i y a n S o n g , O l e g N . A n t z u t k i n , Young K . L e e , S . C . S h e k a r , A l l a n R u p p r e c h t , a n d M a l c o l m H . L e v i t tD i v i s i o n o f P h y s i c a l C h e m i s t r y , A r r h e n i u s L a b o r a t o r y , U n i v e r s i t y o f S t o c k h o l m , S - 1 0 6 9 1 S t o c k h o l m , SwedenABSTRACT S o l i d - s t a t e 3 1 P - N M R i s u s e d t o i n v e s t i g a t e t h e o r i en t a ti o n o f t h e p h o s p h o d i e s t e r backbone i n N a D N A - , L i D N A - ,MgDNA-, a n d N a D N A -n e t r o p s i n f i b e r s . Th e r e s u l t s f o r A - a n d B - D N A agree w i t h p r e v i o u s i n t e r p r e t a t i o n s . We v e r i f y t h a t t h eb i n d i n g o f n e t r o p s i n t o N a D N A s t a b i l i z e s t h e B f o r m , a n d f i n d t h a t i n NaDNA, m o s t o f t h e p h o s p h a t e groups a d o p t ac o n f o r m a t i o n t y p i c a l o f t h e A f o r m , a l t h o u g h t h e r e are m i n o r c o m p o n e n t s w i t h p h o s p h a t e o r i e n t a t i o n s c l o s e t o t h e B f o r m .F o r L i D N A a n d M g D N A s a m p l e s , o n t h e o t h e r h a n d , we f i n d p h o s p h a t e c o n f o r m a t i o n s t h a t ar e i n v a r i a n c e w i t h p r e v i o u sm o d e l s . T h e s e s a m p l e s d i s p l a y x - r a y d i f f r a c t i o n p a t t e r n s t h a t c o r r e s p o n d t o C-DNA. H o w e v e r , we f i n d two d i s t i n c t p h o s p h a t eo r i e n t a t i o n s i n t h e s e s a m p l e s , o n e r e s e m b l i n g t h a t i n B - D N A , a n d o n e d i s p l a y i n g a t w i s t o f t h e P04groups a b o u t t h e 0 3 - P - 0 4b i s e c t o r s . T h e l a t t e r c o n f o r m a t i o n i s n o t i n a c c o r d a n c e w i t h p r e v i o u s m o d e l s o f C-DNA s t r u c t u r e .INTRODUCTIONI t i s w e l l known t h a t t h e DNA d o u b l e h e l i x a d o p t s a v a r i e t yo f s e c o n d a r y s t r u c t u r e s , s u c h a s t h e r i g h t - h a n d e d A , B , a n dC f o r m s , a n d t h e l e f t - h a n d e d Z f o r m ( S a e n g e r , 1 9 8 4 ) . T h e s eDNA c o n f o r m a t i o n s a r e c h a r a c t e r i z e d b y d i f f e r e n t m o l e c u -l a r s t r u c t u r a l p a r a m e t e r s , s u c h a s t h e h e l i c a l p i t c h , t h e a x i a lr i s e p e r b a s e p a i r , t h e g r o o v e s i z e , t h e b a s e t i l t , t h e s u g a rp u c k e r i n g , a n d t h e o r i e n t a t i o n o f t h e p h o s p h a t e g r o u p s . T h ee x i s t e n c e o f a p a r t i c u l a r c o n f o r m a t i o n d e p e n d s o n t h e DNAs e q u e n c e a n d t h e e n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s , s u c h a s t h er e l a t i v e h u m i d i t y , t h e n a t u r e o f t h e c o u n t e r i o n s , t h e s a l tc o n c e n t r a t i o n , a n d t h e b i n d i n g o f l i g a n d s ( S a e n g e r , 1 9 8 4 ) .

M o s t o f o u r k n o w l e d g e o f DNA m o l e c u l a r s t r u c t u r ed e r i v e s f r o m x - r a y d i f f r a c t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e c r y s t a l sa n d o f f i b e r s . T h e m o s t p r e c i s e i n f o r m a t i o n i s o b t a i n e d f r o mx - r a y c r y s t a l l o g r a p h y o f o l i g o n u c l e o t i d e s , m a i n l y i n A , B ,a n d Z f o r m s o r D N A - d r u g c o m p l e x e s ( H e i n e m a n n e t a l . ,1 9 9 4 ; W a h l a n d S u n d a r a l i n g a m , 1 9 9 5 ) . H o w e v e r , t h i sm e t h o d i s l i m i t e d t o r a t h e r s h o r t n u c l e o t i d e s e q u e n c e s , a n dc e r t a i n f o r m s o f DNA , s u c h a s t h e C f o r m , h a v e n e v e r b e e nc r y s t a l l i z e d .

X - r a y f i b e r d i f f r a c t i o n p a t t e r n s o f DNA c a n b e a n a l y z e dt o o b t a i n t h e h e l i x p a r a m e t e r s , s u c h a s t h e t i l t o f t h e b a s ep l a n e s , t h e p i t c h o f t h e h e l i x , a n d t h e h e l i x r i s e p e r b a s e p a i r( L a n g r i d g e e t a l . , 1 9 6 0 ; M a r v i n e t a l . , 1 9 6 1 ; F u l l e r e t a l . ,1 9 6 5 ; A r n o t t a n d H u k i n s , 1 9 7 3 ) . H o w e v e r , t h e i n f o r m a t i o na b o u t t h e c o n f o r m a t i o n o f s u g a r s a n d t h e p h o s p h a t e b a c k -

R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 1 3 F e b r u a r y 1 9 9 7 a n d i n f i n a l f o r m 2 0 May 1 9 9 7 .A d d r e s s r e p r i n t r e q u e s t s t o D r . M a l c o l m H . L e v i t t , D i v i s i o n o f P h y s i c a lC h e m i s t r y , A r r h e n i u s L a b o r a t o r y , U n i v e r s i t y o f S t o c k h o l m , S - 1 0 6 9 1S t o c k h o l m , S w e d e n . T e l . : 4 6 - 8 - 1 6 2 3 7 3 ; F a x : 4 6 - 8 - 1 5 2 1 8 7 ; E - m a i l :m h l @ p h y s c . s u . s e .Y o u n g K . L e e ' s c u r r e n t a d d r e s s i s Q u a n t u m M a g n e t i c s , 7 4 0 K e n a m a rC o u r t , S a n D i e g o , CA 9 2 1 2 1 .S . C . S h e k a r ' s c u r r e n t a d d r e s s i s D e p a r t m e n t o f M o l ec u l a r B i o p h y s i c s a n dB i o c h e m i s t r y , Y a l e U n i v e r s i t y , N e w H a v e n , CT 0 6 5 2 0 - 8 1 1 4 .i ) 1 9 9 7 b y t h e B i o p h y s i c a l S o c i e t y0 0 0 6 - 3 4 9 5 / 9 7 / 0 9 / 1 5 3 9 / 1 4 $ 2 . 0 0

b o n e i s l i m i t e d b y r e l a t i v e l y p o o r r e s o l u t i o n o f x - r a y f i b e rd i f f r a c t i o n d a t a , a n d i s " m o d e l d e p e n d e n t " ( F u l l e r e t a l . ,1 9 6 5 ; A r n o t t , 1 9 8 0 ; P o h l e e t a l . , 1 9 8 4 ) . T h e m e t h o d i sd i f f i c u l t t o a p p l y i f t h e s a m p l e c o n s i s t s o f a m i x t u r e o fd i f f e r e n t c o n f o r m a t i o n s , o r i f t h e c r y s t a l l i n i t y o f DNA f i b e r si s p o o r .

T h e c o m b i n e d l i m i t a t i o n o f t h e s e x - r a y m e t h o d s h a s l e dt o a l a c k o f d e t a i l e d k n o w l e d g e a s t o t h e c o n f o r m a t i o n o f t h es u g a r - p h o s p h a t e b a c k b o n e i n t h o s e f o r m s o f DNA t h a t d on o t f o r m d i f f r a c t a b l e c r y s t a l s . A c a s e i n p o i n t i s C-DNA,w h i c h f o r m s u n d e r c o n d i t i o n s o f r a t h e r l o w r e l a t i v e h u m i d -i t y , i n a s s o c i a t i o n w i t h r a t h e r l o w c o n c e n t r a t i o n s o f s t r o n g l yb i n d i n g m e t a l i o n s s u c h a s L i + , M g + 2 , a n d N a + ( R u p p r e c h ta n d F o r s l i n d , 1 9 7 0 ; A r n o t t a n d S e l s i n g , 1 9 7 5 ) . C-DNA i si d e n t i f i e d i n x - r a y f i b e r d i f f r a c t i o n p a t t e r n s a s a d i s t i n c tf o r m w i t h a 3 1 - A h e l i x p i t c h a n d 9 . 3 3 b a s e p a i r s p e r t u r n( M a r v i n e t a l . , 1 9 6 1 ) . T h e b a s e - s t a c k i n g p a r a m e t e r s may b eu s e d t o b u i l d a s t r u c t u r a l m o d e l o f C - D N A t h a t i s v e r ys i m i l a r t o t h a t o f B - D N A ( M a r v i n e t a l . , 1 9 6 1 ; A r n o t t a n dS e l s i n g , 1 9 7 5 ) . I n d e e d , C-DNA i s u s u a l l y c l a s s i f i e d a s as l i g h t l y d i s t o r t e d f o r m o f B-DNA.

G i v e n t h e l a c k o f e x p e r i m e n t a l t o o l s f o r e x a m i n i n g t h i sq u e s t i o n , t h e r e h a v e b e e n f e w c h a l l e n g e s t o t h i s v i e w o fC-DNA. On e o f t h e f e w i n d e p e n d e n t s t u d i e s , w h i c h d i d n o tr e l y o n m o d e l b u i l d i n g f r o m t h e f i b e r d i f f r a c t i o n c o n -s t r a i n t s , u s e d i n f r a r e d l i n e a r d i c h r o i s m o f DNA f i b e r s t oe v a l u a t e t h e o r i e n t a t i o n o f t h e p h o s p h o d i e s t e r g r o u p s ( P o h l ee t a l . , 1 9 8 4 ) . T h e s e w o r k e r s f o u n d a p h o s p h o d i e s t e r g r o u po r i e n t a t i o n t h a t i s s i m i l a r t o t h a t f o u n d i n B-DNA, a c o n -c l u s i o n t o b e c h a l l e n g e d l a t e r i n t h i s p a p e r .A d i f f e r e n t a p p r o a c h f o r s t u d y i n g t h e m o l e c u l a r s t r u c t u r e

o f DNA f i b e r s i s s o l i d - s t a t e NMR ( A l a m a n d D r o b n y ,1 9 9 1 ) . F o r e x a m p l e , 3 1 P - N M R o f o r i e n t e d DNA f i b e r s c a nr e v e a l t h e o r i e n t a t i o n o f t h e 3 1 p c h e m i c a l s h i f t t e n s o r s w i t hr e s p e c t t o t h e h e l i x a x i s b e c a u s e t h e o r i e n t a t i o n o f t h e 3 1 pc h e m i c a l s h i f t a n i s o t r o p y ( C S A ) t e n s o r s w i t h r e s p e c t t o t h ep h o s p h o d i e s t e r l i n k a g e i s k n o w n t o a g o o d a p p r o x i m a t i o n .T h i s i n f o r m a t i o n i s c o m p l e m e n t a r y t o t h a t o b t a i n e d f r o m

1 5 3 9


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V o l u m e 7 3 S e p t e m b e r 1 9 9 7x - r a y d i f f r a c t i o n s t u d i e s , w h i c h a r e m a i n l y s e n s i t i v e t o t h eb a s e o r i e n t a t i o n s .S o l i d - s t a t e 3 1 P - N M R may b e p e r f o r m e d o n b o t h s t a t i ca n d r o t a t i n g s a m p l e s . T h e e a r l i e s t s t u d i e s u s e d s t a t i c DNAf i b e r s , w i t h t h e s a m p l e s m o u n t e d i n a v a r i e t y o f d i r e c t i o n sw i t h r e s p e c t t o t h e m a g n e t i c f i e l d . T h e o r i e n t a t i o n o f t h ep h o s p h o d i e s t e r b a c k b o n e w a s e s t i m a t e d f o r b o t h A - a n dB - D N A s a m p l e s ( N a l l e t a l . , 1 9 8 1 ; S h i n d o e t a l . , 1 9 8 5 ;F u j i wa r a a n d S h i n d o , 1 9 8 5 ) .

G r e a t e r s e n s i t i v i t y a n d r e s o l u t i o n a r e a c h i e v e d b y e m -p l o y i n g a r o t a t i n g s a m p l e i n s t e a d o f a s t a t i c o n e . I n m a g i c -a n g l e - s p i n n i n g (MAS) NMR, t h e s a m p l e i s r o t a t e d a t af r e q u e n c y o f s e v e r a l kHz a r o u n d a n a x i s t i l t e d b y t h e" m a g i c - a n g l e , " 5 4 . 7 4 , w i t h r e s p e c t t o t h e s t a t i c m a g n e t i cf i e l d . I n t h e p r e s e n c e o f s t r o n g r f f i e l d s a t t h e L a r m o rf r e q u e n c y o f t h e a b u n d a n t p r o t o n s ( " p r o t o n d e c o u p l i n g " ) ,t h e 3 1 P - N M R s i g n a l a p p e a r s a s a s e t o f " r o t a t i o n a l e c h o e s . "T h e s e e c h o e s a r i s e b e c a u s e t h e d i s p e r s e d p r e c e s s i n g m a g -n e t i z a t i o n v e c t o r s c o m e b a c k i n t o p h a s e e v er y t i m e t h es a m p l e c o m p l e t e s a f u l l r o t a t i o n . F o u r i e r t r a n s f o r m a t i o n o ft h e s i g n a l y i e l d s a s p e c t r u m w i t h s h a r p , i n t e n s e s p i n n i n gs i d e b a n d s s p a c e d a t t h e s p i n n i n g f r e q u e n c y f o r e a c h n u c l e a rs i t e ( M a r i c q a n d W a u g h , 1 9 7 9 ) .

H a r b i s o n a n d S p i e s s d e r i v e d a t w o - d i m e n s i o n a l s p e c t r o -s c o p i c s c h e m e i n v o l v i n g s y n c h r o n i z a t i o n o f t h e r a d i o - f r e -q u e n c y p u l s e s e q u e n c e w i t h t h e s a m p l e r o t a t i o n f o r i n v e s -t i g a t i n g m o l e c u l a r o r i e n t a t i o n s i n p a r t i a l l y o r d er e d s y s t e m s( S c h m i d t - R o h r a n d S p i e s s , 1 9 9 4 ; H a r b i s o n a n d S p i e s s ,1 9 8 6 ; H a r b i s o n e t a l . , 1 9 8 7 ; B l u m i c h e t a l . , 1 9 8 7 ; T a n g e ta l . , 1 9 8 9 , 1 9 9 0 ; J u a n g e t a l . , 1 9 9 5 ) . I n t h i s s y n c - 2 D - M A Se x p e r i m e n t , t h e o r d e r e d s a m p l e i s l o a d e d a t a k n o w n a n g l er e l a t i v e t o t h e r o t o r a x i s . T h e r a d i o - f r e q u e n c y p u l s e s e -q u e n c e i s s y n c h r o n i z e d w i t h t h e s a m p l e r o t a t i o n b y u s i n g a no p t i c a l s i g n a l r e f l e c t e d f r o m t h e s a m p l e r o t o r . T h e d e l a yb e t w e e n t h e s y n c h r o n i z a t i o n t i m e p o i n t a n d i n i t i a t i o n o f t h ep u l s e s e q u e n c e i s v a r i e d i n a t w o - d i m e n s i o n a l d a t a a c q u i -s i t i o n s c h e m e ( E r n s t e t a l . , 1 9 8 7 ) . O r i e n t a t i o n a l o r d e r o f t h es a m p l e i s i n d i c a t e d b y p e a k s i n t h e 2D s p e c t r u m S ( c l , w 2 )a t f r e q u e n c y c o o r d i n a t e s c , 0 0 .T h e a m p l i t u d e s o f t h e 2D s p e c t r a l p e a k s may b e a n a l y z e dt o o b t a i n t h e o r i e n t a t i o n d i s t r i b u t i o n f u n c t i o n ( O D F ) o f 3 1 pCSA o r i e n t a t i o n s w i t h r e s p e c t t o t h e h e l i x a x i s ( H a r b i s o n e ta l . , 1 9 8 7 ; S c h m i d t - R o h r a n d S p i e s s , 1 9 9 4 ) . T h e OD F h a sp e a k s c o r r e s p o n d i n g t o t h e p r e f e r e n t i a l 3 1 p CSA o r i e n t a -t i o n s . A p a r t i c u l a r l y i m p o r t a n t f e a t u r e o f t h e NMR m e a -s u r e m e n t i s t h a t i t i s n o t n e c e s s a r y t o a s s u m e a s i n g l ep r e f e r e n t i a l o r i e n t a t i o n f o r t h e p h o s p h o d i e s t e r g r o u p s . A ne n t i r e d i s t r i b u t i o n f u n c t i o n i s o b t a i n e d e x p e r i m e n t a l l y a n d ,t h e r e f o r e , t h e p r e s e n c e o f many d i f f e r e n t P 0 4 o r i e n t a t i o n s a tt h e s a m e t i m e i s r e a d i l y d e t e c t e d . T h e r e s u l t s s h o w n b e l o wc l e a r l y d i s p l a y r e s o l u t i o n o f a t l e a s t t h r e e d i s t i n c t p h o s -p h o d i e s t e r b o n d o r i e n t a t i o n s i n t h e s a m e s a m p l e .

T h e o r i e n t a t i o n d i s t r i b u t i o n s o f CSA t e n s o r s c a n a l s o b ee x p l o r e d b y a r o t o r s y n c h r o n i z e d t w o - d i m e n s i o n a l p h a s e -a d j u s t e d s p i n n i n g s i d e b a n d ( P A S S ) p u l s e s e q u e n c e ( S o n g e ta l . , 1 9 9 6 ) . T h i s s y n c - 2 D - P A S S m e t h o d u s e s f i v e r a d i o -

s y n c h r o n i z a t i o n s c h e m e , t o s e p a r a t e t h e s i d e b a n d s a s s o c i -a t e d w i t h m o l e c u l a r o r d e r . I d e a l l y , t h e s i d e b a n d a m p l i t u d e sa n d p h a s e s i n s y n c - 2 D - P A S S spectrum are i d e n t i c a l t o t h o s ep r o v i d e d b y s y n c - 2 D - M A S , a n d may b e a n a l y z e d i n as i m i l a r f a s h i o n . T h e s y n c - 2 D - P A S S m e t h o d h a s t h e a d v a n -t a g e o f a v o i d i n g t h e o v e r l a p o f s p i n n i n g s i d e b a n d m a n i -f o l d s , w h i c h i s p a r t i c u l a r l y i m p o r t a n t f o r s y s t e m s c o n t a i n i n gmany r e s o l v e d c h e m i c a l s i t e s . I n t h e p r e s e n t 3 1 P - N M R s t u d i e so f o r i e n t e d DNA, t h e a d v a n t a g e s o f s y n c - 2 D - P A S S ar e n o t s op r o n o u n c e d , s i n c e o n l y o n e 3 1 p s p e c t r a l l i n e i s r e s o l v e d . How-e v e r , we s t i l l f o u n d s y n c - 2 D - P A S S t o b e u s e f u l , e s p e c i a l l yw h e n t h e p e a k s a r e i n h o m o g e n e o u s l y b r o a d e n e d , s u c h as i n t h ecase o f Mg D N A . I n t h e s t u d y d e s c r i b e d b e l o w , we u s e d b o t hm e t h o d s more or l e s s i n t e r c h a n g e a b l y .

O r i e n t e d DNA s a mp l e s p r ep a r e d b y t h e w e t - s p i n n i n gm e t h o d ( R u p p r ec h t , 1 96 6, 1 9 7 0 ; R u p p r e c h t e t a l . , 1 9 9 1 ) arew e l l s u i t e d f o r s t r u c t u r a l a n d d y n a m i c i n v e s t i g a t i o n s o f h i g hm o l e c u l a r w e i g h t DNA. H a r b i s o n a n d c o - w o r k e r s per-f o r m e d b o t h 3 1 p a n d 1 3 C MAS i n v e s t i g a t i o n s o f o r i e n t e dw e t - s p u n DNA f i b e r s ( T a n g e t a l . , 1 98 9 , 1 99 0; J u a n g e t a l . ,1 9 9 5 ) . F o r t h e A a n d B f o r m s o f D N A , t h e o r i e n t a t i o n o f t h ep h o s p h o d i e s t e r b a c k b o n e was f o u n d t o c o r r e s p o n d w e l l t ot h e e x i s t i n g m o d e l s o f DNA c o n f o r m a t i o n . I t was a l s op o s s i b l e t o d e m o n s t r a t e d i s t o r t i o n o f t h e p h o s p h o d i e s t e rb a c k b o n e b y t h e b i n d i n g o f a n i n t e r c a l a t i n g d r u g .I n t h e p r e s e n t s t u d y , we e x a m i n e t h e i n f l u e n c e o f m e t a li o n b i n d i n g o n t h e o r i e n t a t i o n o f t h e p h o s p h o d i e s t e r group s.Of s p e c i a l i n t e r e s t i s t h e o r i e n t a t i o n o f t h e p h o s p h a t e l i n k -ag e i n LiDNA a n d MgDNA s a m p l e s i d e n t i f i e d a s C- D N Ab y t h e i r x-ray f i b e r d i f f r a c t i o n p a t t e r n s . F o r t h e s e s a m p l e s ,we f i n d a p h o s p h a t e g r o u p OD F w i t h two d i s t i n c t p e a k s .T h e p h o s p h a t e g ro u ps a p p a r e n t l y a d o p t two d i s t i n c t o r i e n -t a t i o n s . I n o n e o f t h e s e o r i e n t a t i o n s , t h e O 3 - P - O 4 planes ar ea l m o s t p a r a l l e l w i t h t h e h e l i x a x i s , a s i t u a t i o n t h a t i s veryd i s t i n c t f r o m b o t h A - a n d B-DNA. Th e s e c o n d group o fp h o s p h a t e s a d o p t s a n o r i e n t a t i o n t h a t i s s i m i l a r , b u t n o ti d e n t i c a l , t o t h a t o f B-DNA.I n a d d i t i o n , we f i n d e v i d e n c e f o r c o n s i d e r a b l e amounts o fC - f o r m DNA c o e x i s t i n g w i t h t h e A - f o r m i n a s a m p l e o fN a D N A . We a l s o s h o w r e s u l t s f o r DNA c o m p l e x e d w i t h t h em i n o r g ro o ve b i n d e r n e t r o p s i n . T h e 3 1 p ODF p l o t s c o n f i r mt h a t n e t r o p s i n s t a b i l i z e s t h e B - f o r m o f D N A .

MATERIALS AND METHODSSample p r e p a r a t i o nF o u r k i n ds o f o r i e n t e d DNA s a m p l e s w e r e p r e p a r e d w i t h t h e we t s p i n n i n gm e t h o d ( R u p p r e c h t , 1 9 6 6 , 1 9 7 0 ; R u p p r e c h t e t a l . , 1 9 9 1 ) , a l l w i t h l ow s a l tc o n t e n t s : Li D N A a n d MgDNA f r o m h i g h m o l e c u l a r w e i g h t ( 1 . 1 7 X 1 0 7 )c a l f - t h y m u s NaDNA ( P h a r m a c i a B i o t e c h Norden A B , S o l l e n t u n a , Swe-d e n ) , a n d N a D N A a n d N a D N A - n e t r o p s i n c o m p l e x from h i g h m o l e c u l a rw e i g h t s a l m o n t e s t e s NaDNA ( F l u k a Chemie A G , B u c h s , S w i t z e r l a n d ) .F o r t h e LiDNA s a m p l e , NaDNA w a s f i r s t d i a l y z e d t h r e e t i m e s a g a i n s t 2 ML i C l , a n d t h e n s p un as Li D N A t o a c h i e v e m o l e c u l a r o r i e n t a t i o n . Th ec y l i n d e r w i t h s p un d e p o s i t o f Li D N A was f i n a l l y b a t h e d o v e r n i g h t i naqueous e t h a n o l s o l u t i o n c o n s i s t i n g o f 80% e t h a n o l + 0 . 0 2 ML i C l . A l l t h eo t h e r s a m p l e s we r e spun as N a D N A . F o r t h e NaDNA s a m p l e , t h e c y l i n d e rf r e q u e n c y T r - p u l s e s , i n c o m b i n a t i o n w i t h a s p e c i f i c r o t o r

1 5 4 0 B i o p h y s i c a l J o u r n a l

w i t h s p u n d e p o s i t was f i n a l l y b a t h e d i n 75% e t h a n o l + 0 . 0 3 M N a C l .


3/14

3 1 P - N M R o f D N A F i b e r sO r i e n t e d MgDNA was o b t a i n e d b y b a t h i n g a c y l i n d e r w i t h s p u n d e p o s i t o fNaDNA f o r f o u r d a y s i n 7 5 % e t h a n o l s o l u t i o n c o n t a i n i n g 0 . 5 M M g C l 2 ,t h e r e b y e x c h a n g i n g t h e c o u n t e r i o n s ( R u p p r e c h t e t a l . , 1 9 9 1 ) , a n d f o l l o w e db y b a t h i n g i n 7 5 % e t h a n o l + 0 . 0 0 5 M M g C l 2 . R e s e a r c h - g r a d e n e t r o p s i nh y d r o c h l o r i d e ( C 1 8 H 2 6 N 1 0 O ; 3 2 H C l , see F i g . 1 ) w a s o b t a i n e d f r o m S e r v aF e i n b i o c h e m i c a ( H e i d e l b e r g , G e r m a n y ) . Th e o r i e n t e d N a D N A - n e t r o p s i nc o m p l e x was p r e p a r e d b y b a t h i n g a c y l i n d e r w i t h spun d e p o s i t o f NaDNAf o r o n e month i n 7 5 % e t h a n o l s o l u t i o n c o n t a i n i n g 2 mM n e t r o p s i n + 0 . 0 3M N a C l . Th e n e t r o p s i n i n p u t was - 0 . 3 6 d r u g / b a s e p a i r , d e t e r m i n e d b ym e a s u r i n g t h e o p t i c a l d e n s i t y ( a t 3 0 0 . 9 n m ) o f t h e n e t r o p s i n s o l u t i o n a f t e rb a t h i n g , t h e n c o r r e l a t i n g w i t h a p r e - c a l i b r a t e d a b s o r b a n c e - c o n c e n t r a t i o nc u r v e , a s s u m i n g t h a t t h e m o l e c u l a r w e i g h t was 662 p e r n u c l e o t i d e b a s e p a i ro f NaDNA ( F a l k , 1 9 6 6 ) . I n a l l c a s e s , t h e s p un d e p o s i t s w e r e f i n a l l y s l o w l yd r i e d i n a d e s i c c a t o r a t +5C w h e r e b y t h e f i b e r s o n t h e c y l i n d e r m e r g e di n t o a f i l m o f o r i e n t e d m a t e r i a l . A f t e r t r a n s f e r o f t h e d e s i c c a t o r t o roomt e m p e r a t u r e , t h e f i l m was r e l e a s e d f r o m t h e c y l i n d e r , a n d e q u i l i b r a t e d i n a na t m o s p h e r e o f 7 5% r e l a t i v e h u m i d i t y , as p r o v i d e d b y s a t u r a t e d aqueousNaCl s o l u t i o n . Th e s a l t c o n t e n t s o f t h e LiDN A a n d NaDNA s a m p l e s w e r ee s t i m a t e d a s 0.6% L i C l a n d 1 . 3 % N a C l , r e s p e c t i v e l y , b y w e i g h t o f t h e d r ys a m p l e ( R u p p r e c h t a n d F o r s l i n d , 1 9 7 0 ) . T h i s c o r r e s p o n d s t o - 0 . 0 9 L i +a n d 0 . 1 4 Na+ i o n s , r e s p e c t i v e l y , p e r DNA b a s e p a i r .

X-Ray d i f f r a c t i o nx - r a y d i f f r a c t i o n measurements w e r e p e r f o r m e d t o c h e c k t h e c r y s t a l l i n i t ya n d c o n f o r m a t i o n s o f t h e s a m p l e s a t 7 5 % r e l a t i v e h u m i d i t y . T h e o r i e n t e dDNA f i l m s w e r e f o l d e d i n t o p a c k s ( 0. 3 mm t h i c k n e s s ) u s i n g a s p e c i a lf o l d i n g a p p a r a t u s , a n d mounted i n a s p r i n g - l o a d e d h o l d e r ( R u p p r e c h t a n dF o r s l i n d , 1 9 7 0 ) . A f l a t x - r a y d i f f r a c t i o n c a m e r a ( T y p e PW 1 0 3 0 ) w i t hCuKa r a d i a t i o n a n d a c o l l i m a t o r o f 500 , u m was u s e d t o o b t a i n t h e x-rayp a t t e r n s . Th e s p e c i m e n - t o - f i l m d i s t a n c e was 5 2 . 2 mm a n d t h e e x p o s u r et i m e -1 h . Th e x - r a y d i f f r a c t i o n p a t t e r n s f o r t h e N a D N A - n e t r o p s i n ,N a D N A , LiDNA, a n d MgDNA s a m p l e s ar e shown i n F i g . 2 . T h e y d i s p l a yt y p i c a l B - , A - , C - , C - t y p e DNA d i f f r a c t i o n p a t t e r n s , r e s p e c t i v e l y ( S a e n g e r ,1 9 8 4 ) .

M a g i c - A n g l e - S p i n n i n g 31P-N MRF o r m a g i c - a n g l e - s p i n n i n g e x p e r i m e n t s , t h e 1 0 - m m - w i d e o r i e n t e d DNAf i l m s w e r e f o l d e d i n t o 1 0 X 1 . 8 x 1 . 8 m m 3 p a c k s , w h i c h w e r e s l i g h t l yp r e s s e d t o make t h e f i l m l a y e r s s t i c k t o g e t h e r . Th e p a r a l l e l - e p i p e d i c s a m -p l e s w e r e s t o r e d i n a d e s i c c a t o r a t 75 % r e l a t i v e h u m i d i t y f o r a f e w d a y s .J u s t b e f o r e t h e NMR m e a s u r e m e n t , e a c h s a m p l e was t i g h t l y c o v e r e d w i t h

+

0

CH 3 /H

FIGURE 1 Molecular structure of n e t r o p s i n .

t h i n p a r a f i l m , t h e n l o a d e d i n t o a s t a n d a r d B r u k e r d o u b l e - b e a r i n g 4-mmZ r O 2 r o t o r w i t h t h e f i b e r a x i s a t 9 0 0 r e l a t i v e t o t h e r o t o r a x i s . T h er e m a i n i n g space w a s f i l l e d w i t h A 1 2 0 3 p o w d e r t o f i x t h e DNA s a m p l e a n dt o o b t a i n g o o d m e c h a n i c a l b a l a n c e . T h e a c c u r a t e o r i e n t a t i o n o f t h e DNAf i b e r s wa s v e r i f i e d b y t h e a l m o s t v a n i s h i n g s p i n n i n g s i d e b a n d a m p l i t u d e sa t o d d m u l t i p l e s o f t h e s p i n n i n g f r e q u e n c y i n t h e sync-2D-MAS e x p e r i -m e n t s . A m o d i f i e d B r u k e r MSL 2 0 0 s p e c t r o m e t e r ( m a g n e t i c f i e l d B o = 4 . 7T ) wa s u s e d , o p e r a t i n g a t a L a r m o r f r e q u e n c y | w o / 2 7 r I = 8 1 . 0 1 5 M H z f o r3 1 P . Th e s p i n n i n g s p e e d was s t a b i l i z e d t o 2 H z b y a h o m e - b u i l t d e v i c e .

Th e r o t o r - s y n c h r o n i z e d 2 D - M A S p u l s e sequence i s i l l u s t r a t e d i n F i g . 3 .R f f i e l d s a t t h e ' H L a r m o r f r e q u e n c y a r e d e n o t e d I , w h i l e r f f i e l d s a t t h e 3 1 pLarmor f r e q u e n c y a r e d e n o t e d S . T h e p o s i t i o n o f t h e r o t a t i n g s a m p l e h o l d e ri s d e n o t e d s c h e m a t i c a l l y b y t h e a r r o w e d d i s k s . T h e e x p e r i m e n t s t a r t s w h e nt h e r o t o r r e a c h e s a d e f i n e d p o s i t i o n i n d i c a t e d b y t h e s h a d e d s y m b o l ( i np r a c t i c e , t h i s i s d e f i n e d b y t h e p o s i t i o n o f t h e p en m a r k o n t h e r o t o r ) . A" s y n c h r o n i z a t i o n d e l a y " T s y n c i s i n s e r t e d b e f o r e a s t a n d a r d c r o s s - p o l a r i z a -t i o n sequence ( m a r k ed " C P ") t r a n s f e r s p o l a r i z a t i o n f r o m t h e I - s p i n s ( ' H ) t ot h e S - s p i n s ( 3 1 p ) .T y p i c a l l y , we u s e d a s p i n n i n g f r e q u e n c y j w I 2 i r r j = 2 . 0 0 0 k H z , ac r o s s - p o l a r i z a t i o n p e r i o d o f 2 m s , a n d a c q u i r e d 2 4 3 t r a n s i e n t s w i t h d i f f e r -e n t p u l s e p h a s e s f o r e a c h i n c r e m e n t i n t h e 2D s i g n a l a c q u i s i t i o n s c h e m e .E a c h s i g n a l t r a n s i e n t l a s t e d 1 7 m s . T h e 3 1 P r f f i e l d c o r r e s p o n d e d t o a 7 r / 2p u l s e d u r a t i o n o f - 3 , i s . F o r e a c h s y n c - 2 D - M A S e x p e r i m e n t , T y n c w a si n c r e m e n t e d i n 1 6 s t e p s b e t w e e n 0 a n d T r = 1 2 T 7 r / c r j . S e v e r a l e x p e r i m e n t swe r e a l s o p e r f o r m e d a t t h e s p i n n i n g f r eq u en c i es o f j c t y 2 i r j = 1 . 6 0 0 a n d1 . 4 0 0 k H z . T h e d e r i v e d ODF's w e r e r e a s o n a b l y c o n s i s t e n t a t a l l s p i n n i n gf r e q u e n c i e s . O n l y t h e r e s u l t s a t 2 . 0 0 0 kHz a r e s h o w n i n t h i s p a p e r .We a l s o p e r f o r m e d s y n c - 2 D - P A S S e xp e r i m en t s u s i n g t h e p u l s e s e -

quence d e s c r i b e d i n S o n g e t a l . ( 1 9 9 6 ) w i t h 2 5 6 t , i n c r e m e n t s . T h e r e s u l t s( n o t s h o w n ) a l s o gave ODF's t h a t w e r e h i g h l y c o n s i s t e n t w i t h t h e sy nc-2 D - M A S r e s u l t s . Th e c o n s i s t e n c y o f e x p e r i m e n t a l r e s u l t s o v e r s e v e r a l d a y so f c o n s e c u t i v e measurements i s e v i d e n c e t h a t t h e s a m p l e h u m i d i t y wasm a i n t a i n e d s u f f i c i e n t l y w e l l f o r t h e purposes o f t h i s s t u d y .

A n a l y s i s o f t h e r e s u l t s r e q u i r e s a n e s ti m a t e o f t h e p r i n c i p a l v a l u e s o f t h e3 1 p CSA t e n s o r . I n d e p e n d e n t o n e - d i m e n s i o n a l m a g i c - a n g l e - s p i n n i n g ex-p e r i m e n t s we r e p e r f o r m e d o n r a n d o m l y o r i e n t e d NaDNA, LiDNA,M g D N A , a n d N a D N A - n e t r o p s i n s a m p l e s a t t h e s p i n n i n g f re qu en c i esw 2 , I 2 i r = 2 . 0 0 0 , 1 . 7 0 0 , 1 . 4 0 0 , a n d 1 . 0 0 0 k H z . Th e s p i n n i n g s i d e b a n da m p l i t u d e s w e r e a n a l y z e d u s i n g a n e w l y d e v e l o p e d f i t t i n g p r o c e d u r e( A n t z u t k i n e t a l . , u n p u b l i s h e d o b s e r v a t i o n s ) t o d e r i v e t h e CS A a a n i s O = U , z z- o i s - a n d t h e a s y m m e t r y p a r a m e t e r - q = ( o - a -o x ) / ( o z z -o i s . ) , w h e r eC i s o = / 3 ( o ( . . +o ( y y +u 0 0 ) and a x . , o ( y y , a , , a re t he CSA p r i n c i p a l values.F o r e a c h s a m p l e , t h e d e r i v e d CS A a n d i q v a l u e s a t d i f f e r e n t s p i n n i n gf r e q u e n c i e s w e r e h i g h l y c o n s i s t e n t . T h e r e was no e v i d e n c e f o r s p i n n i n g -i n d u c e d s a m p l e o r i e n t a t i o n e f f e c t s , as d e s c r i b e d i n G a b r i e l s e e t a l . ( 1 9 9 6 ) .Th e e s t i m a t e d s h i e l d i n g a n i s o t r o p y p a r a m e t e r s ( 0 7 a n i s w q ) a n d t h e i r s t a n -d a r d d e v i a t i o n s w e r e a s f o l l o w s : ( 9 3 . 9 + 0 . 7 p p m , 0 . 6 5 +0 . 0 3 ) f o rN a D N A - n e t r o p s i n ; ( 9 8 . 8 + 0 . 7 p p m , 0 . 6 5 + 0 . 0 3 ) f o r N a D N A ; ( 9 2 . 5 +0 . 6 p p m , 0 . 6 4 0 . 0 3 ) f o r LiDNA. T h e s h i e l d i n g p a r a m e t e r s f o r MgDNAw e r e more d i f f i c u l t t o e s t i m a t e b e c a u s e o f t h e r e l a t i v e l y b r o a d p e a k s . Weu s e d t h e same v a l u e s as f o r LiDNA, w h i c h w e r e c o n s i s t e n t w i t h t h eMgDNA MAS d a t a w i t h i n e x p e r i m e n t a l e r r o r . I n t h e s i m u l a t i o n s , we u s e dCSA v a l u e s c o r r e s p o n d i n g t o t h e c e n t e r o f t h e r e l e v a n t d i s t r i b u t i o n s , f o re x a m p l e ( 9 3 . 9 p p m , 0 . 6 5 ) f o r N a D N A - n e t r o p s i n . We c h e c k e d t h a t t h er e s u l t s f o r t h e ODF w e r e i n s e n s i t i v e t o t h e a s s u m e d CS A a n d - q v a l u e sw i t h i n e x p e r i m e n t a l e r r o r .

+ ANALYSIS OF TH E 2D S PECTRA. N H 2 The 2D s p e c t r a o b t a in e d b y th e sync-2D-MAS or s y n c - 2 D -

PASS e x p e r i m e n t s w e r e a n a l y z e d t o o b t a i n e s t i m a t e d o r i -e n t a t i o n d i s t r i b u t i o n f u n c t i o n s ( O D F ' s ) o f t h e 3 1 p CS At e n s o r s with r e s p e c t t o t h e DNA h e l i x a x i s . I f t h e p r i n c i p a la x i s s y s t e m of t h e 3 1 p CSA t e n s o r i s d e f i n e d P , a n d ar e f e r e n c e s y s t e m with z - a x i s a l o n g t h e h el i x l o n g a x i s i sdefined H, theODFor the P *-> Htransformation is denoted

S o n g e t a l . 1 5 4 1


4/14

V o l u m e 7 3 S e p t e m b e r 1997

a

FIGURE 2 X - r a y d i f f r a c t i o n p a t t e r n s o f DNA f i b e r s ( l o w s a l tc o n t e n t s ) a t 75% r e l a t i v e h u m i d i t y . ( a ) N a D N A - n e t r o p i n ; ( b )NaDNA; ( c ) LiDNA; ( d ) M g D N A .

P ( 1 P H ) , w h e r e PH i n d i c a t e s t h e t h r e e E u l e r a n g l e s Q P H =( a P H , ( 3 P H ' Y P H ) . T h e s e E u l e r a n g l e s are d e f i n e d a s i nV a r s h a l o v i c h e t a l . ( 1 9 8 8 ) . T h e p r i n c i p a l a x i s system P i sb r o u g h t i n t o c o i n c i d e n c e w i t h t h e h e l i x a x i s s y s t e m H b y t h ef o l l o w i n g s e r i e s o f r o t a t i o n s : 1 ) a r o t a t i o n a r o u n d t h e z a x i so f t h e s y s t e m P t h r o u g h t h e a n g l e aP H; 2 ) a r o t a t i o n a r o u n dt h e " n e w " y a x i s t h r o u g h t h e a n g l e ! P 3 P H ; a n d 3 ) a r o t a t i o na r o u n d t h e z a x i s o f t h e s y s t e m H t h r o u g h t h e a n g l e Y P H .T h e a n g l e , B PHi S s u b t e n d e d b y t h e z axes o f P a n d H .

2 1 / 2

Tsync -T

R O t = O

ROTORH F 1 RFl 3 S y n c -D-NIAS p L I s c ' s e q u e n i c e .

b

c d

T h e d i s t r i b u t i o n f u n c t i o n o f P ( f P H ) i s t h e j o i n t p r o b a b i l -i t y d i s t r i b u t i o n o f t h e t h r e e r a n d o m v a r i a b l e s aPH, cos ( 3 P H ,and Y P H : P ( Q P H ) = P ( a P H , C O S I 3 P H ' ' Y P H ) . Pe a k s i n t h ep r o b a b i l i t y d i s t r i b u t i o n r e f l e c t p r e f e r e n t i a l o r i e n t a t i o n s o f3 1 p CS A t e n s o r s w i t h r e s p e c t t o t h e DNA h e l i x . I f a na s s u m p t i o n i s m a d e a s t o t h e l o c a l CSA o r i e n t a t i o n w i t hr e s p e c t t o t h e p h o s p h o d i e s t e r l i n k a g e ( s e e b e l o w ) , t h i s OD Fr e f l e c t s d i r e c t l y t h e o r i e n t a t i o n s o f t h e p h o s p h o d i e s t e rgroup s w i t h r e s p e c t t o t h e h e l i x , a n d p r o v i d e s s t r o n g s t r u c -t u r a l c o n s t r a i n t s o n t h e g e o m e t r y o f t h e p h o s p h o d i e s t e r -s u g a r b a c k b o n e .

T h e d e t a i l s o f ou r a n a l y s i s m e t h o d w i l l b e p r e s e n t e d f u l l ye l s e w h e r e ( L e v i t t , u n p u b l i s h e d o b s e r v a t i o n s ) . I n l a r g e p a r t ,t h e a n a l y s i s f o l l o w s t h a t o f H a r b i s o n e t a l . ( 1 9 8 7 ) , b u t t h e r ear e some d i f f e r e n c e s , w h i c h are i n d i c a t e d b r i e f l y b e l o w .

F o l l o w i n g H a r b i s o n e t a l . ( 1 9 8 7 ) , we w r i t e a n e x p r e s s i o nof the P *->HODFn terms of o r t h o g o n a l Wigner functions:

L m a x LP(fpH) E E P H q ' D q q ' ( f l P H )

L=O q , q ' = - L( 1 )

w h e r e t h e OD F c o m p o n e n t s P P H q , ar e a s s u m e d t o b e n e g l i -g i b l e a b o v e a c e r t a i n rank L > L n a X . T h e OD F i s d e t e r -m i n e d b y e s t i m a t i n g a l i m i t e d n u m b e r o f s p h e r i c a l c o m p o -n e n t s p P H w h i c h ar e c o m p l e x n u m b e r s i n g e n e r a l .

a



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3 1 P - N M R o f D N A F i b e r sT h e d i s t r i b u t i o n f u n c t i o n P ( M P H ) i s n o t d i r e c t l y a c c e s s i -b l e b y e x p e r i m e n t . T h e d i r e c t l y a c c e s s i b l e d i s t r i b u t i o n f u n c -t i o n i s P ( f P D ) , w h i c h a p p l i e s t o t h e t r a n s f o r m a t i o n f r o m t h eCSA p r i n c i p a l a x i s f r a m e t o a d i r e c t o r f r a m e D w i t h z a x i s

a l o n g t h e f i b e r a x i s . T h e o r i e n t a t i o n s o f t h e DNA m o l e c u l e sw i t h r e s p e c t t o t h e f i b e r a x i s ar e g o v e r n e d b y a f u r t h e rd i s t r i b u t i o n P ( M H D ) ) I f t h e P ( Q P H ) a n d P ( f H D ) d i s t r i b u t i o n sare s t a t i s t i c a l l y i n d e p e n d e n t , t h e f o l l o w i n g c h a i n r u l e f o r t h es p h e r i c a l components a p p l i e s ( L e v i t t , u n p u b l i s h e d o b s e r v a -t i o n s ) :

p P D _ EpPH p H D ( 2L 2L+1 L q q " L q ' ()q " fTo simp lify the analysis, weassumethat themomentsof theH - > Dtransformation areHl D - 8 q l l o s 8 q ' o f o r L e v e nLq=q l 0 f o r L o d d

m a t i o n . I n p a r t i c u l a r , t h e ' Y P H p a r t o f t h e d i s t r i b u t i o n i si n a c c e s s i b l e t o e x p e r i m e n t , a n d o n l y components o f e v e nr a n k L may b e d e r i v e d . A d d i t i o n a l s y m m e t r i e s i n t h e s p i ni n t e r a c t i o n s f u r t h e r r e s t r i c t t h e amount o f a c c e s s i b l e i n f o r -m a t i o n . A s s h o w n e l s e w h e r e ( L e v i t t , u n p u b l i s h e d o b s e r v a -t i o n s ) , o n l y t h e r e a l p a r t s o f t h e moments P 0 H ( L a n d qe v e n ) are e x p e r i m e n t a l l y a c c e s s i b l e . H e n c e a p e a k i n t h ed e t e r m i n e d P ( a P H , C O S I 3 P H ) d i s t r i b u t i o n a t a n g l e s ( a P H ,I 3 P H ) may i n f a c t b e d u e t o 8 p o s s i b l e d i s t i n c t o r i e n t a t i o n s o ft h e 31P CSA t e n s o r : ( a P H , I 3 P H ) , ( 7 T aPH, 3 P H ) ( aPH,7 T -3PH) a n d ( X T a P H , W - 1 3 P H ) . T h i s a m b i g u i t y s h o u l db e b o r n e i n m i n d w h e n b a s i n g s t r u c t u r a l m o d e l s o n t h er e s u l t s s h o w n b e l o w .

F o l l o w i n g H a r b i s o n e t a l . ( 1 9 8 7 ) , t h e n u m b e r s R e { P H 0 }ar e d e t e r m i n e d f r o m t h e b e s t f i t t o t h e e q u a t i o n

L m a x Laklk2 E E aR L q e { p L q o }

L = 0 , 2 q = 0 , 23 )

T h i s c o r r e s p o n d s t o p e r f e c t l y u n i a x i a l l y o r i e n t e d f i b e r s ,w i t h n o p r e f e r e n t i a l d i r e c t i o n f o r t h e d o u b l e h e l i x w i n d i n ga x i s . I n p r a c t i c e , s t a t i c 3 ' P - a n d 2 H - N M R i n d i c a t e a s p r e a di n PD o f u p t o 1 0 0 ( B r a n d e s e t a l . , 1 9 8 8 a , b ; N a l l e t a l . ,1 9 8 1 ) , s o o u r f i n a l OD F i s a l s o e x p e c t e d t o h a v e a n accu-racy o f u p t o 00 .The above property ofH - > Dtransformation limits our

knowledge of the structurally significant P Htransfor-

a . 6

- 6- 1 5 - 1 0 - 5 0 5 1 0 1 5

( 4 )

w h e r e a k l k 2 are e x p e r i m e n t a l s i d e b a n d a m p l i t u d e s d e r i v e db y e i t h e r s y n c - 2 D - M A S o r s y n c - 2 D - P A S S , a n d a j k 2 are" s u b s p e c t r a l s i d e b a n d a m p l i t u d e s , " d e r i v e d b y n u m e r i c a lc o m p u t a t i o n . T h e i n d i c e s k , a n d k 2 are t h e s i d e b a n d coor-d i n a t e s i n t h e 2D s p e c t r u m i n u n i t s o f t h e s p i n n i n g f r e -quency. I n a l l c a s e s , we i n t e g r a t e d t h e e n t i r e s p e c t r a l s i d e -b a n d s , i g n o r i n g i n h o m o g e n e o u s a m p l i t u d e d i s t r i b u t i o n s ,w h i c h s o m e t i m e s g i v e r i s e t o a d i s p e r s i o n - l i k e appearance.

a 64

2

-2

-4-6

- 1 5 - 1 0 - 5 5 1 0 1 5b b4

- 2 koA--v A . - 2- 4

- n I

- 1 5 - 1 0 - 5 0 5 1 0 1 50 ) 2 / 2 n ( k H z )

FIGURE 4 Sync-2D-MAS 3 1 p s p e c t r a o f o r i e n t e d DNA f i b e r s , o b t a i n e da t 7 5 % r e l a t i v e h u m i d i t y , 2 0 0 0 H z s p i n n i n g f r e q u e n c y , a n d w i t h t h e f i b e ra x i s o r i e n t e d a t i r / 2 r e l a t i v e t o t h e r o t o r a x i s . ( a ) N a D N A - n e t r o p s i n ; ( b )N a D N A .

b4

2

. A - -- - - - 4- 6

1 1 1 1 1- 1 5 - 1 0 - 5 0 5 1 0 1 5( 0 2 / 2 n ( k H z )

FIGURE 5 S y n c - 2 D - M A S 3 1 p s p e c t r a o f o r i e n t e d DNA f i b e r s , o b t a i n e du n d e r t h e s a m e c o n d i t i o n s a s i n F i g . 4 . ( a ) L i D N A ; ( b ) M gD N A .

1 5 4 3

I I I ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~

- Al l - -

S o n g e t a l .

W 4 1 d A


6/14

V o l u m e 7 3 S e p t e m b e r 1 9 9 7

N a D N A - n e t r o p s i n N a D N Aa

( ) I , I I

0 0b'1 ' 1 1

9 0 9 0 g3 0 6 0O I ' t I

9 00 3 0 ( t i ) I I 6 0

FIGURE 6 OD F o f t h e 3 1 p CSA t e n s o r s w i t h r e s p e c t t o t h e D N A h e l i xa x i s i n N a D N A - n e t r o p s i n f i b e r s . ( a ) C o n t o u r p l o t ; ( b ) p o l a r s u r f a c e p l o t .

I n a d d i t i o n , we i m p l e m e n t e d a new a l g o r i t h m f o r s i m u l a t i o no f t h e s u b s p e c t r a l a m p l i t u d e s a k , 2 . H a r b i s o n e t a l . ( 1 9 8 7 )e v a l u a t e d t h e s e a m p l i t u d e s b y a t h r e e - d i m e n s i o n a l i n t e g r a -t i o n o v e r t h r e e a n g l e s , w h i c h i s very t i m e - c o n s u m i n g a n dp o t e n t i a l l y i n a c c u r a t e f o r h i g h r a n k L . We u s e d i d e n t i t i e sf r o m a n g u l a r m o m e n t u m g r o u p t h e o r y t o r e d u c e t h e s e am-p l i t u d e s t o c o mb i n a t i o n s o f t wo -d i me n s i o n a l i n t e g r a l s ,w h i c h may b e e v a l u a t e d f a s t e r a n d more a c c u r a t e l y . Web e l i e v e t h a t t h e i m p r o v e d s i m u l a t i o n p r o c e d u r e , w h i c h a l -l o w s a c c u r a t e e v a l u a t i o n o f a k k o u t t o r a n k s L- 1 2 , i s o n eo f t h e f a c t o r s l e a d i n g t o t h e h i g h q u a l i t y o f o u r d e r i v e dd i s t r i b u t i o n f u n c t i o n s . D e t a i l s w i l l b e p u b l i s h e d e l s e w h e r e( L e v i t t , u n p u b l i s h e d o b s e r v a t i o n s ) .A f u r t h e r i n n o v a t i o n i s t h a t we d o n o t d e r i v e t h e b e s t f i t

t o E q . 4 b y d i r e c t i n v e r s i o n o f t h e l i n e a r s y s t e m o f t h e

FIGURE 7 OD F o f t h e 3 1 p CS A t e n s o r s w i t h r e s p e c t t o t h e DNA h e l i xa x i s i n N a D N A f i b e r s . ( a ) C o n t o u r p l o t ; ( b ) p o l a r s u r f a c e p l o t .

e q u a t i o n s , as r e c o m m e n d e d b y S c h m i d t - R o h r a n d S p i e s s( 1 9 9 4 ) . I n p r a c t i c e , we f o u n d t h a t t h i s " d i r e c t " m e t h o de a s i l y o v e r - i n t e r p r e t s t h e e x p e r i m e n t a l d a t a , g i v i n g r i s e t op h y s i c a l l y u n r e a s o n a b l e p r o b a b i l i t y d i s t r i b u t i o n s t h a t ar en e g a t i v e i n some r e g i o n s o f o r i e n t a t i o n a l s p a c e . I n s t e a d , weu s e d a n i t e r a t i v e s e a r c h m e t h o d f o r t h e b e s t f i t , g r a d u a l l yi n t r o d u c i n g more r a n k s L u n t i l t h e f i t n o l o n g e r i m p r o v e ss i g n i f i c a n t l y , a l l t h e t i m e p e n a l i z i n g n e g a t i v e p r o b a b i l i t i e s .T h e r e s u l t s o f t h i s n o n l i n e a r f i t ar e a l w a y s p h y s i c a l l y r e a -s o n a b l e , a n d we u s u a l l y a t t a i n a f i n a l f i t t o t h e e x p e r i m e n t a la m p l i t u d e s t h a t i s as g o o d as w i t h t h e d i r e c t m e t h o d , w i t h i ne x p e r i m e n t a l e r r o r s .One f i n a l p r o b l e m s h o u l d a l s o b e m e n t i o n e d . As p o i n t e do u t b y S c h m i d t - R o h r a n d S p i e s s ( 1 9 9 4 ) , t h e s i g n s o f t h e

a j'1 i l

b

9 0 0


* - l l


7/14

S o n g e t a l . ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 3 1-NMR o f D N A F i b e r s 14LiDNA

0

/3PHE l 0

9 C , 0 0 2 0 4 0 c 6 0 0O e P H

/ 3 P H -

0 0b

30 60(I p I . .

FIGURE 8 ODFf the 3 1 P CSA tensors with respect to theDNAhelixaxis in LiDNA fib e r s . (a ) Contour p l o t ; (b ) p o l a r surface p l o t .

e x p e r i m e n t a l a m p l i t u d e s a k , k 2 cannot be determined unam-biguously. If the orientation of the fiber in the rotor withrespect to the optical s y n c h r o ni z a ti o n system is unknown,each set of e x p e r i m e n t a l results has two p o s s i b l e interpre-tations, related by si gn inversion of peaks with evenindexk , in the 2Ds p e c t r a . Typically, these two interpretationsg i v e very different orientation distribution functions. Inpractice, wes i m p l y performed the analysis t wic e , u s i n g twodistinct si gn interpretations, and rejected orientation di s t r i -bution functions that wereo b v io u s l y unreasonable. In a l lcases we examined, the correct choice was c l e a r . Thisa m b i g u i t y m i g h t be resolved in the future by d et ermi nin gthe orientation of the fiber in the rotor independently.

FIGURE 9 ODFf the 3 1 P CSA tensors with respect to theDNAhelixaxis in MgDNA f i b e r s . ( a) Contour p l o t ; (b ) p o l a r surface p l o t .

The above p r o c e d u r e leads to a distribution functionp ( a P H , COS I 3 P H ) for the orientation of the 3 1 P CSAtensorswith r e s p e c t to the helix, bearing in mind the a m b i g u i t y inaPH, and IPH, as mentioned above. In the results section,these distribution functions are r e p r e s e n t e d in two ways: 1)as contour plots, with light re gion s de n o t in g h i g h p r o b a b i l -i t y and dark r e g i o n s re p re s e nting low probability; and 2) asp o l a r surface plots, in which the radius from the origin isp ro p ortiona l to the probability den sity ( t h e enclosed volumeof the plotted surface is e q u a l to o n e ) . The contour plotsg i v e amoreaccurate estimation of c o o r din a t e s , while thep o l a r surface p l o t s are morevisually accessible.

Interpretation of these results in terms of the molecularstructure ofDNAequires additional a s s u m p t i o n s as to the

a a MgDNA

b

. . . . . . .

4PH1 H o :

9 0 ,0 030

9 06 0

S o n g e t a l . 1 5 4 5


8/14


*....... . . .

----

I!:i

i.

: i_ i

g O

0

0 ( 1 1 3 1 HFIGURE 1 1 P o l a r s c a t t e r p l o t o f t h e E u l e r a n g l e s o f t h e p h o s p h a t e s i ns i x o l i g o n u c l e o t i d e - n e t r o p s i n c o m p l e x e s . E a c h s e t o f E u l e r a n g l e s i s r e p -r e s e n t e d a s a d o t l y i n g o n t h e s p h e r i c a l s u r f a c e .

Pfi

B-DNAb

FIGURE 1 0 V i e w o f t h e p r e d o m i n a n t p h o s p h a t e o r i e n t a t i o n s , d e d u c e df r o m F i g s . 6 a n d 7 . ( a ) A-DNA; ( b ) B-DNA. T h e a t t a c h e d a x i s s y s t e m ( x ,y , z ) c o r r e s p o n d s t o t h e a s s u m e d o r i e n t a t i o n s o f t h e 3 1 p CSA p r i n c i p a l a x e s .

l o c a l o r i e n t a t i o n o f t h e 3 1 p CSA w i t h r e s p e c t t o t h e p h o s -p h o d i e s t e r l i n k a g e . H e r z f e l d e t a l . ( 1 9 7 8 ) u s e d a s i n g l ec r y s t a l o f b a r i u m d i e t h y l p h o s p h a t e ( B D E P ) a s a m o d e lc o m p o u n d t o i n v e s t i g a t e t h e " s t a n d a r d o r i e n t a t i o n s " o f 3 1 Ps h i e l d i n g t e n s o r s i n t h e p h o s p h o d i e s t e r l i n k a g e . T h e p r i n c i -p a l a x i s o f t h e 3 1 p s h i e l d i n g t e n s o r s i n BDEP w a s f o u n d t ob e - 1 0 0 a w a y f r o m t h e l o c a l m o l e c u l a r s y m m e t r y a x e s o ft h e a p p r o x i m a t e l y t e t r a h e d r a l p h o s p h a t e g r o u p , w i t h 1 ) t h el e a s t - s h i e l d e d 5 ? a x i s a p p r o x i m a t e l y p e r p e n d i c u l a r t o t h e0 3 - P - 0 4 p l a n e f o r m e d b y t h e p h o s p h o r u s a n d t h e t w o u n -s u b s t i t u t e d o x y g e n s ; 2 ) t h e i n t e r m e d i a t e - s h i e l d e d 9 P a x i sn e a r t h e b i s e c t o r o f t h e 0 3 - P - 0 4 b o n d s o n t h e p l a n e ; a n d 3 )t h e m o s t - s h i e l d e d z P a x i s p e r p e n d i c u l a r t o 1 P a n d 9 .I n t h e f o l l o w i n g d i s c u s s i o n , i t i s a s s u m e d t h a t i n DNA t h ep r i n c i p a l a x e s o f t h e 3 1 p CSA t e n s o r s h a v e t h e same r e l a -t i o n s h i p t o t h e l o c a l P 0 4 g r o u p s y m m e t r y a x e s w i t h i n - 2 0 d e v i a t i o n . T h i s a s s u m p t i o n s e e m s r e a s o n a b l e i n v i e w o f t h e

f a c t t h a t t h e p r i n c i p a l v a l u e s o f t h e 3 1 p CSA t e n s o r s a r e v e r ys i m i l a r i n DNA a n d BDEP, a n d d o n o t c h a n g e v e r y muchb e t w e e n d i f f e r e n t f o r m s o f DNA. T h e a s s u m p t i o n i s a l s os u p p o r t e d b y t h e f a c t t h a t a t l e a s t f o r A - a n d B-DNA, b o t hH a r b i s o n a n d c o - w o r k e r s ( T a n g e t a l . , 1 9 8 9 , 1 9 9 0 ; J u a n g e ta l . , 1 9 9 5 ) a n d o u r s e l v e s d e r i v e d P 0 4 o r i e n t a t i o n s i n g o o da g r e e m e n t w i t h i n d e p e n de n t m et h o d s .I n o n e c a s e , we a l s o s h o w 3 1 p o r i e n t a t i o n d i s t r i b u t i o n sd e r i v e d f r o m x - r a y c r y s t a l l o g r a p h y o f o l i g o n u c l e o t i d e s . F o re a c h c r y s t a l s t r u c t u r e , t h e o r i e n t a t i o n s o f t h e l o c a l s y m m e t r ya x e s o f t h e P 0 4 g r o u p s w e r e d e r i v e d f r o m t h e a t o m i cc o o r d i n a t e s . T h e h e l i x a x i s w a s d e t e r m i n e d f a i r l y c r u d e l y b yd e t e r m i n i n g t h e i n e r t i a l t e n s o r a n d u s i n g t h e p r i n c i p a l a x i sa s s o c i a t e d w i t h t h e s m a l l e s t e i g e n v a l u e . T h e p r i n c i p a l a x e so f t h e c h e m i c a l s h i f t t e n s o r s w e r e a t t a c h e d t o t h e P 0 4g r o u p s u s i n g t h e l o c a l o r i e n t a t i o n s g i v e n a b o v e . T h i s a l -l o w e d E u l e r a n g l e s f P H t o b e e s t i m a t e d f o r t h e 2 0 - 2 4 P O 4g r o u p s i n e a c h c r y s t a l s t r u c t u r e . T h e p l o t t e d a n g l e a l o n g t h ea P H a x i s i s a c t u a l l y T r - m o d ( a P H , i ) i n t h e c a s e o fm o d ( a p H , i r ) > 7 r / 2 , a n d m o d ( a P H , 7 r ) o t h e r w i s e . T h e s a m ea p p l i e s t o l 3 P H . T h i s m a n i p u l a t i o n m a t c h e s t h e a m b i g u i t y i nt h e E u l e r a n g l e d i s t r i b u t i o n d e r i v e d f r o m t h e NMR r e s u l t s( s e e a b o v e ) . T h e c r y s t a l E u l e r a n g l e s d i s p l a y c o n s i d e r a b l es c a t t e r . I n p a r t t h i s i s b e c a u s e o f t h e r a t h e r c r u d e d e t e r m i -n a t i o n o f t h e h e l i x a x i s , b u t t h e m a i n c a u s e s o f t h e s c a t t e ra r e p r o b a b l y e n d e f f e c t s i n t h e s e s m a l l m o l e c u l e s a n d d i s -t o r t i o n s c a u s e d b y c r y s t a l p a c k i n g ( C h a n d r a s e k a r a n a n dA r n o t t , 1 9 9 6 ) . T y p i c a l l y , t h e e x p e r i m e n t a l l y d e t e r m i n e dP 0 4 o r i e n t a t i o n s i n t h e DNA f i b e r s a r e much more s h a r p l yd e f i n e d t h a n t h o s e o b s e r v e d i n o l i g o n u c l e o t i d e c r y s t a l s .RESULTS A N D DISCUSSION2D-MAS s p e c t r aF i g s . 4 a n d 5 s h o w 2D-MAS s p e c t r u m f o r N a D N A - n e t r o p -s i n , NaDNA, L i D N A , a n d MgDNA, a l l a t 75% r e l a t i v eh u m i d i t y , a n d o b t a i n e d a t a s p i n n i n g f r e q u e n c y o f 2 0 0 0 H z .

a A- D N A1 5 4 6 B i o p h y s i c a l J o u r n a l

.1

- r " ,

! I


9/14

3 1 P - N M R o f D N A F i b e r s

B-DNA0

1 0

2 0

30

40

50

6 07 0

8 090

0 10 20 30 40 50 6 0 7 0 8 0 9 0

O P HFIGURE 1 2 E s t i m a t e d p h o s p h a t e group o r i e n t a t i o n s i n B - D N A f i b e r s , o b t a i n e d b y v a r i o u s m e t h o d s . A l l methods have a n error m a r g i n of - 1 0 - 2 0 .

T h e s p e c t r a s h o w s p i n n i n g s i d e b a n d s a l o n g t h e h o r i z o n t a la x i s , a n d r e s o l u t i o n o f s i d e b a n d s r e p r e s e n t i n g t h e m o l e c u l a ro r d e r a l o n g t h e v e r t i c a l a x i s , i n d e x e d b y t h e i n t e g e r k l . O n l ye v e n - n u m b e r e d s l i c e s are s h o w n . Th e o d d s l i c e s c o n t a i na l m o s t n o s i g n a l s i n c e t h e s a m p l e s w e r e m o u n t e d s u c h t h a tt h e a n g l e b e t w e e n t h e f i b e r a x i s a n d r o t o r a x i s was 7 T / 2 .M o s t o f t h e s p e c t r a h a v e a r a t h e r s i m i l a r a p p e a r a n c e ,a l t h o u g h e x a m i n a t i o n s h o w s t h a t t h e s p i n n i n g s i d e b a n da m p l i t u d e s a r e q u i t e v a r i a b l e . A n e x c e p t i o n i s t h e MgDNAs p e c t r u m ( F i g . 5 b ) , w h i c h h a s m uch b r o a d e r p e a k s . I t wasv e r i f i e d b y s p i n e c h o e x p e r i m e n t s t h a t t h e m a j o r source o fb r o a d e n i n g i n MgDNA i s i n h o m o g e n e o u s . T h i s i s p o s s i b l yd u e t o l o c a l i n t e r a c t i o n s o f t h e d i v a l e n t M g + 2 i o n s w i t h t h ep h o s p h a t e groups, l e a d i n g t o a h e t e r o g e n e i t y i n t h e i s o t r o p i c3 1 p c h e m i c a l s h i f t s . T h e s y n c - 2 D - P A S S m e t h o d was p a r t i c -u l a r l y u s e f u l i n t h i s case f o r r e s o l v i n g t h e p a r t i a l l y o v e r l a p -p i n g s p i n n i n g s i d e b a n d p a t t e r n s ( s p e c t r a n o t s h o w n ) .3 1 p CS A o r i e n t a t i o n d i s t r i b u t i o n f u n c t i o n sF i g s . 6 - 9 s h o w t h e O D F ' s o f t h e 3 1 p CS A t e n s o r s w i t hr e s p e c t t o t h e h e l i x a x i s , d e r i v e d f r o m s y n c - 2 D - M A S s pec-t r a , f o r t h e N a D N A - n e t r o p s i n , NaDNA, L i D N A , a n dMgDNA s a m p l e s , r e s p e c t i v e l y . T h e d a r k areas i n t h e c o n-t o u r p l o t s c o r r e s p o n d t o l o w e r o r i e n t a t i o n p r o b a b i l i t i e s ,w h i l e t h e l i g h t areas s h o w t h e most p r o b a b l e o r i e n t a t i o n s .T h e p o l a r s u r f a c e p l o t s h a v e t h e a d v a n t a g e o f r e m o v i n g t h e

d i s t o r t i o n s a s s o c i a t e d w i t h p r o j e c t i n g t h e s p h e r i c a l o r i e n t a -t i o n a l space o n t o a p l a n e .N a D N A - n e t r o p s i nT h e 3 1 p OD F f o r N a D N A - n e t r o p s i n ( F i g . 6 ) d i s p l a y s , t o ag o o d a p p r o x i m a t i o n , a s i n g l e s t r o n g o r i e n t a t i o n a l p e a k c e n -t e r e d a t ( a P H , I 3 P H ) - ( O , 5 3 ) . T h i s i s i n g o o d a g r e e m e n tw i t h e a r l i e r s y n c - 2 D - M A S s t u d i e s ( T a n g e t a l . , 1 9 9 0 ; J u a n ge t a l . , 1 9 9 5 ) , who o b t a i n e d maximum p r o b a b i l i t y ( a p H = 5 0 ,I 3 P H = 5 5 0 ) f o r p u r e B - f o r m LiDNA a n d a s i m i l a r r e s u l t f o rt h e g r o o v e - b i n d i n g d a u n o m y c i n - D N A c o m p l e x . As d i s -c u s s e d b e l o w , t h i s s t r o n g p e a k c o r r e s p o n d s t o t h e o r i e n t a -t i o n o f t h e p h o s p h o d i e s t e r l i n k a g e i n t h e B f o r m o f D N A .N e t r o p s i n i s known t o s t a b i l i z e t h e B f o r m b y b i n d i n g t o t h em i n o r g r o o v e ( W a r t e l l e t a l . , 1 9 7 4 ; F l a n a g a n e t a l . , 1 9 9 5 ;K o p k a e t a l . , 1 9 8 5 a , b ; R h e e e t a l . , 1 9 9 3 ; P a t e l a n d S h a p i r o ,1 9 8 5 ; C o l l e t a l . , 1 9 8 9 ) . T h e b i n d i n g o f n e t r o p s i n c a u s e s apartial ort o t a l s u p p r e s s i o n of the B->Aconformationalt r a n s i t i o n a t l o w r e l a t i v e h u m i d i t y ( F r i t z s c h e , 1 9 9 4 ;F r i t z s c h e e t a l . , 1 9 8 4 a , b , 1 9 9 2 ; P o h l e a n d F r i t z s c h e , 1 9 8 4 ) .E a c h b o u n d n e t r o p s i n m o l e c u l e s p a n s -4-5 A-T b a s e p a i r s ,b u t i t s e f f e c t t o s t a b i l i z e B - D N A may e x t e n d t o -24 b a s e -pairs a l o n g the helix. The s u p p r e s s i o n of the B ->At r a n s i t i o n i s c o m p l e t e when t h e n e t r o p s i n i n p u t i n N a D N Af i b e r s i s - 0 . 1 d r u g / b a s e p a i r ( F r i t z s c h e e t a l . , 1 9 8 4 a ) . S i n c eo u r s a m p l e was p r e p a r e d w i t h 0 . 3 6 d r u g / b a s e p a i r , t h e r e was

1 5 4 7

PH

o X - r a y ( A r n o t t , 1 9 7 2 )o X - r a y ( P r e m i l a t , 1 9 8 3 )N X - r a y ( A r n o t t , 1 9 6 9 )v X - r a y ( C h a n d r a s e k a r a n , 1 9 9 6 )A S t a t i c N M R ( S h i n d o , 1 9 8 5 )* M A S N M R ( T a n g , 1 9 9 0 )* M A S N M R ( O u r s )A I R L D ( P o h l e , 1 9 8 4 )v I R L D ( P i l e t , 1 9 7 2 )

S o n g e t a l .


10/14


A - D N A

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0

o X - r a y ( A r n o t t , 1 9 7 2 )o X - r a y ( P r e m i l a t , 1 9 8 3 )* X - r a y ( A r n o t t , 1 9 6 9 )A X - r a y ( F u l e r , 1 9 6 5 )* S t a t i c N M R ( N a l l , 1 9 8 1 )E S t a t i c N M R ( S h i n d o , 1 9 8 5 )* M A S N M R ( T a n g , 1 9 8 9 )v I R L D ( P i l e t , 1 9 7 2 )* M A S N M R ( O u r s )

9 0

a P HFIGURE 1 3 E s t i m a t e d p h o s p h a t e g r o u p o r i e n t a t i o n s i n A - D N A f i b e r s , o b t a i n e d b y v a r i o u s m e t h o d s . A l l m et h o ds h a v e a n error m a r g i n o f 1 0 - 2 0 .

m o r e t h a n e n o u g h n e t r o p s i n p r e s e n t t o m a i n t a i n B-DNA.I n d e e d , t h e x-ray d i f f r a c t i o n d i s p l a y e d a t y p i c a l B f o r mp a t t e r n ( F i g . 2 a ) .

N a D N AT h e OD F f o r N a D N A i n t h e a b s e n c e o f n e t r o p s i n i s m uchmore c o m p l e x ( F i g . 7 ) . T h r e e s t r o n g p e a k s a p p e a r . T h em a j o r f e a t u r e i s a b r o a d r i d g e a t a CSA o r i e n t a t i o n o f ( a p H ,I P H ) ( 6 3 0 , 7 1 0 ) . We a s s i g n t h i s p e a k t o t h e A f o r m o fD N A , w i t h t h e s u p p o r t o f t h e x - r a y d i f f r a c t i o n p a t t e r n ( F i g .2 b ) . T h e l o c a t i o n o f t h i s p e a k agrees a g a i n w i t h p r e v i o u sd e t e r m i n a t i o n s ( T a n g e t a l . , 1 9 8 9 ) . U n d e r t h e c o n d i t i o n su s e d , h o w e v e r , n o t a l l o f t h e DNA i s i n t h e A f o r m . T h e twos u b s i d i a r y p e a k s c o r r e s p o n d t o a s i g n i f i c a n t f r a c t i o n o fDNA m o l e c u l e s i n d i f f e r e n t c o n f o r m a t i o n s . E x p e r i m e n t s o nd i f f e r e n t s a m p l e s g a v e r e s u l t s w i t h v a r y i n g p r o p o r t i o n s o ft h e s e t h r e e p e a k s . U n d e r no c o n d i t i o n s , h o w e v e r , was a pureA - f o r m OD F o b s e r v e d . We d i s c u s s t h e two a d d i t i o n a l p e a k si n t h e OD F f o r NaDNA b e l o w .

L i D N AT h e OD F f o r LiDNA i s shown i n F i g . 8 . T h i s d i s p l a y s twop e a k s , w h i c h c o i n c i d e w i t h t h e s u b s i d i a r y f e a t u r e s o b s e r v e d

i n t h e N a D N A O D F . T h e m a i n p e a k i s a t t h e o r i e n t a t i o n a lc o o r d i n a t e s ( a P H , , B P H ) ( 0 , 6 5 0 ) , w h i l e t h e m i n o r p e a k i sa t ( a P H , J 3 P H ) ( 0 , 2 5 0 ) . T h e m a j o r p e a k i s i n a p o s i t i o nc l o s e , b u t n o t i d e n t i c a l t o , t h e p e a k f o r N a D N A - n e t r o p s i na s s i g n e d t o B-DNA.

One p o s s i b l e i n t e r p r e t a t i o n o f t h e LiDNA OD F i s t h a t t h eDNA i s p r e d o m i n a n t l y i n t h e B f o r m , w i t h a n e x t r a com-p o n e n t , p o s s i b l y t h e C f o r m . On e a r g u m e n t a g a i n s t t h i si n t e r p r e t a t i o n i s t h a t t h e m a i n OD F p e a k i n LiDNA i s n o t a te x a c t l y t h e s a m e p o s i t i o n a s t h a t e x p e c t e d o f B- DNA. T h i sd i s c r e p a n c y was o b s e r v e d i n a w i d e range o f s a m p l e s . I na d d i t i o n , t h e x - r a y d i f f r a c t i o n p a t t e r n o f Li DN A d o e s n o to b v i o u s l y s h o w t h e s u p e r p o s i t i o n o f two f o r m s . I n s t e a d , at y p i c a l C - f o r m p a t t e r n i s d i s p l a y e d . I t was e s t a b l i s h e d e a r -l i e r t h a t w e t - s p u n Li D N A p r e p a r e d a t l o w L i C l c o n t e n to c c ur s i n t h e C f o r m ( R u p p r e c h t a n d F o r s l i n d , 1 9 7 0 ) .

A n o t h e r p o s s i b l e i n t e r p r e t a t i o n o f t h e Li DN A OD F i s t h a tt h e DNA i s i n a n e s s e n t i a l l y pure C f o r m , b u t t h e C f o r mi t s e l f i n c o r p o r a t e s p h o s p h o d i e s t e r l i n k a g e s w i t h two d i f f e r -e n t o r i e n t a t i o n s . I t s h o u l d b e r e c a l l e d t h a t Z-DNA, whichf o r m s i n c e r t a i n n u c l e o t i d e sequences u n d e r h i g h e r s a l tc o n c e n t r a t i o n s , a l s o d i s p l a y s two d i s t i n c t p h o s p h o d i e s t e ro r i e n t a t i o n s .

T h e s e two i n t e r p r e t a t i o n s may b e d i s t i n g u i s h e d b y p e r -f o r m i n g 3 1 p _ 3 1 p s p i n d i f f u s i o n e x p e r i m e n t s , w h i c h ar ep l a n n e d .

P H

0

1 0

2 0

3 04 05 0

6 07 0

8 09 0

VIJAA s o8B 0

0

I I I ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ I I I

1 5 4 8 B i o p h y s i c a l J o u m a l


11/14

3 1 P - N M R o f D N A F i b e r s

L i - a n d Mg-DNA ( m a j o r p e a k ) t i o n s t h a t LiDNA a n d M g D N A never a d o p t t h e A f o r m( S c h u l t z e t a l . , 1 9 9 4 ; R u p p r e c h t e t a l . , 1 9 9 4 ) .

b L i - and M g- D N A ( m i n o r p e a k )

FIGURE 1 4 V i e w o f t h e p r e d o m i n a n t p h o s p h a t e o r i e n t a t i o n s i n LiDNAa n d Mg DNA , d e d u c e d f r o m F i g s . 8 a n d 9 . ( a ) M a j o r OD F p e a k ; ( b ) m i n o rOD F p e a k .

M g D N AT h e OD F f o r MgDNA ( F i g . 9 ) i s very s i m i l a r t o t h a t o fLiDNA ( F i g . 8 ) . T h e s p e c t r a l b r o a d e n i n g i n MgDNA d o e sn o t seem t o b e a s s o c i a t e d w i t h much o f a c h a n g e i n t h ep h o s p h a t e g r o u p o r i e n t a t i o n s . T h e two p e a k s i n t h e OD F ar ei n t h e s a m e p o s i t i o n as f o r L i D N A . H o w e v e r , t h e m i n o rp e a k appears t o b e s m a l l e r t h a n i n L i D N A . X - r a y d i f f r a c t i o ns h o w s a t y p i c a l C - t y p e p a t t e r n ( F i g . 2 d ) .I t i s i n t e r e s t i n g t o n o t e t h a t t h e m i n o r component o f t h eODF i n N a D N A ( F i g . 7 ) h a s p r e c i s e l y t h e s a m e f o r m as t h eOD F f o r LiDNA ( F i g . 8 ) . T h e N a D N A r e s u l t may t h e r e f o r eb e a t t r i b u t e d e i t h e r t o a c o e x i s t e n c e o f a l l 3 f o r m s ( A , B , a n dC ) , or o f two f o r m s ( A a n d C ) , w i t h t h e C f o r m d i s p l a y i n gtwo c o n f o r m a t i o n s . On t h e o t h e r h a n d , t h e OD F p l o t s o fLiDNA a n d MgDNA d o n o t s h o w t h e e x i s t e n c e o f a nA - f o r m p e a k . T h i s i s i n a c c o r d a n c e w i t h p r e v i o u s o b s e r v a -

P h o s p h a t e group o r i e n t a t i o n sB y a s s u m i n g t h a t t h e o r i e n t a t i o n s o f t h e 3 1 p s h i e l d i n g t e n s o rp r i n c i p a l axes h a v e t h e s a m e r e l a t i o n s h i p t o t h e p h o s p h o d i -e s t e r l i n k a g e a s i n b a r i u m d i e t h y l p h o s p h a t e , i t i s p o s s i b l e t od e d u c e t h e o r i e n t a t i o n o f t h e P04 g r o u p w i t h r e s p e c t t o t h eh e l i x i n t h e d i f f e r e n t c o n f o r m a t i o n a l f o r m s o f DNA. T h ea c c u r a c y o f t h i s e s t i m a t i o n i s e x p e c t e d t o b e +0 0 .T h e d e d u c e d p h o s p h o d i e s t e r o r i e n t a t i o n s f o r t h e m a j o rc o m p o n e n t s i n N a D N A a n d N a D N A - n e t r o p s i n a r e s h o w n i nF i g . 1 0 , a a n d b . I n t h e s e d i a g r a m s , t h e 0 3 - P - 0 4 p l a n e ,w h e r e 03 a n d 04 a r e t h e n o n - b o n d e d o x y g e n s , i s d e p i c t e d a sa w e d g e . T h e a s s u m e d p r i n c i p a l a x i s s y s t e m o f t h e 3 1 ps h i e l d i n g t e n s o r s i s a l s o s h o w n o n t h e p l o t s a s x , y , z .A s d i s c u s s e d a b o v e , we a t t r i b u t e t h e p r e f e r e n t i a l o r i e n t a -t i o n s i n F i g . 1 0 , a a n d b t o t h e A a n d B f o r m o f D N A ,r e s p e c t i v e l y . T h e p h o s p h a t e g r o u p o r i e n t a t i o n s i n t h e s e s y s -t e m s a r e v e r y d i f f e r e n t . I t s h o u l d b e n o t e d t h a t t h e l a r g e raPH a n g l e i n A - D N A c o n t r a c t s t h e d i s t a n c e s p a n n e d b y t h ee s t e r o x y g e n s a l o n g t h e h e l i x . T h i s i s i n a c c o r d a n c e w i t h t h ef a c t t h a t t h e r e s i d u e t r a n s l a t i o n i s 2 . 5 6 A f o r A - D N A , b u t3 . 3 8 A f o r B - D N A ( S a e n g e r , 1 9 8 4 ) .T h e e x p e r i m e n t a l N a D N A - n e t r o p s i n OD F wa s c o m p a r e dw i t h p h o s p h a t e g r o u p o r i e n t a t i o n s i n c r y s t a l l i n e o l i g o n u c l e -o t i d e - n e t r o p s i n c o m p l e x e s . F i g . 11 s h o w s a s c a t t e r p l o t o f3 1 p CSA o r i e n t a t i o n s o b t a i n e d f r o m t h e c r y s t a l s t r u c t u r e s o fs i x o l i g o n u c l e o t i d e s c o m p l e x e d w i t h n e t r o p s i n ( C o l l e t a l . ,1 9 8 9 ; K o p k a e t a l . , 1 9 8 5 b ; T a b e r n e r o e t a l . , 1 9 9 3 ; B a l e n d i -ran e t a l . , 1 9 9 5 ; G o o d s e l l e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h e q u a l i t a t i v ea g r e e m e n t w i t h F i g . 6 b i s g r a t i f y i n g .T h e p h o s p h a t e group o r i e n t a t i o n s o b t a i n e d b y a v a r i e t y o fd i f f e r e n t m e t h o d s a r e c o m p a r e d g r a p h i c a l l y f o r B - D N A i nF i g . 1 2 , a n d f o r A - D N A i n F i g . 1 3 . T h e s e p l o t s s h o w t h eE u l e r a n g l e s r e l a t i n g a l o c a l a x i s s y s t e m P a t t a c h e d t o t h ep h o s p h a t e group t o a f r a m e H w i t h t h e z a x i s a l o n g t h e h e l i x .T h e l o c a l a x i s s y s t e m P i s a t t a c h e d t o t h e P 0 4 g r o u p , ass h o w n i n F i g s . 1 0 a n d 1 4 . T h i s i s t h e s a m e o r i e n t a t i o n ast h a t a s s u m e d f o r t h e 3 1 p CSA t e n s o r i n t h e NMR e x p e r i -m e n t s .

T h e a g r e e m e n t i s r a t h e r g o o d f o r B - D N A a n d very g o o df o r A-DNA. F o r B - D N A , t h e NMR r e s u l t s t e n d t o w a r d aE u l e r a n g l e aPH w h i c h i s - 2 0 - 3 0 s m a l l e r t h a n t h a t d e -r i v e d f r o m o t h e r m e t h o d s . I t i s p o s s i b l e t h a t t h i s r e f l e c t s as m a l l r o t a t i o n o f t h e CS A p r i n c i p a l a x i s s y s t e m i n B - D N Aw i t h r e s p e c t t o B D E P . A n o t h e r c o n t r i b u t i n g f a c t o r i s t h et e n d e n c y f o r t h e N M R - d e r i v e d OD F t o b e " a t t r a c t e d " t o t h eaPH =0 a x i s , b y m e r g i n g w i t h i t s m i r r o r i m a g e i n t h e aPH= 0 a x i s , a s d i s c u s s e d b y S c h m i d t - R o h r a n d S p i e s s ( 1 9 9 4 ) .On t h e o t h e r h a n d , t h e a n g l e s e s t i m a t e d f r o m x-ray s t r u c -t u r e s o f o l i g o n u c l e o t i d e s c o m p l e x e d w i t h n e t r o p s i n ( F i g . 11a ) d o s e e m t o c l u s t e r a r o u n d t h e N M R - d e t e r m i n e d o r i e n t a -t i o n , w h i c h a d d s s u p p o r t t o t h e v a l i d i t y o f t h e NMR r e s u l t s .I t s h o u l d b e r e c a l l e d t h a t x-ray f i b e r d i f f r a c t i o n p r o v i d e s no

a1 5 4 9o n g e t a l .


12/14


C-DNA

0A

0

0 1 0 2 0 3 0 40 5 0 6 0 70 8 0 90

PHFIGURE 1 5 E s ti m a te d p h o s p h a t e g r o u p o r i e n t a t i o n s i n C - D N A f i b e r s , o b t a i n e d b y v a r i o u s m e t h o d s . A l l m e t h o d s h a v e an error m a r g i n o f 1 0 - 2 0 .

d i r e c t i n f o r m a t i o n as t o t h e PG4 g r o u p o r i e n t a t i o n s - t h e s eh a v e t o b e d e d u c e d b y m o d e l b u i l d i n g a n d r e f i n e m e n t w i t ht h e c o n s t r a i n t s o f t h e b a s e p a i r g e o m e t r y . I n f r a r e d d i c h r o i s m ,o n t h e o t h e r h a n d , d o e s o b s e r v e t h e p h o s p h a t e g r o u p s d i -r e c t l y , b u t , l i k e N M R , r e q u i r e s a s s u m p t i o n s as t o t h e o r i e n -t a t i o n s o f t h e t r a n s i t i o n moment s w i t h r e s p e c t t o t h e l o c a lm o l e c u l e s group.

T h e e s t i m a t e d p h o s p h a t e g r o u p o r i e n t a t i o n s f o r t h e m a j o ra n d m i n o r p e a k s o f LiDNA a n d MgDNA a r e s h o w n i n F i g .1 4 . T h e m a j o r o r i e n t a t i o n a l component i s s i m i l a r t o t h a t o fB-DNA, b u t w i t h t h e 0 3 - P - 0 4 p l a n e s r o t a t e d s l i g h t l y a b o u tt h e i r b i s e c t o r s o as t o b e c o m e more p e r p e n d i c u l a r t o t h eh e l i x a x i s . T h e m i n o r o r i e n t a t i o n a l component i s r o t a t e d i nt h e o p p o s i t e d i r e c t i o n , s o as t o p r o d u c e 0 3 - P - 0 4 p l a n e s t h a tare a l m o s t p a r a l l e l t o t h e h el i x a x i s . T h i s r o t a t i o n l e a d s t ot h e c o n t r a c t i o n o f t h e d i s t a n c e s p a n n e d b y t h e e s t e r o x y g e n sa l o n g t h e h e l i x . T h i s i s c o n s i s t e n t w i t h t h e s h o r t e r p i t c h o fC - D N A c o m p a r e d t o B-DNA.I n o r d e r t o e l u c i d a t e C- D N A s t r u c t u r e , i t w i l l b e neces-s a r y t o e s t a b l i s h w h e t h e r t h e LiDNA a n d M g D N A s a m p l e sc o n t a i n a m i x t u r e o f DNA c o n f o r m a t i o n s , or w h e t h e r C -DNA i t s e l f s u p p o r t s two d i f f e r e n t p h o s p h a t e g r o u p o r i e n t a -t i o n s .

F o r C-DNA, t h e r e h a v e b ee n f e w p r e v i o u s s t r u c t u r a ls t u d i e s . Th e o n l y i n d e p e n d e n t d e t e r m i n a t i o n o f P04 groupo r i e n t a t i o n s i s b y i n f r a r e d l i n e a r d i c h r o i s m o f t h e P 0 2v i b r a t i o n s ( P o h l e e t a l . , 1 9 8 4 ) . T h a t r e s u l t i s q u i t e d i f f e r e n t

( s e e F i g . 1 5 a n d T a b l e 1 ) . T h e p r e s e n t NMR r e s u l t a l s od i s a g r e e s s h a r p l y w i t h t h e e s t i m a t e f r o m m o d e l b u i l d i n gb a s e d o n x-ray d i f f r a c t i o n c o n s t r a i n t s ( M a r v i n e t a l . , 1 9 6 1 ;A r n o t t a n d S e l s i n g , 1 9 7 5 ) , w h i c h agrees r o u g h l y w i t h t h e I Rd a t a . T h e IRLD a n d x-ray d i f f r a c t i o n - b a s e d m o d e l o r i e n t a -t i o n s r e s e m b l e much m o r e c l o s e l y t h e PG4 o r i e n t a t i o n s i nA-DNA. H o w e v e r , i t s h o u l d b e r e c a l l e d t h a t t h e a n a l y s i s o ft h e IRLD a n d x-ray d i f f r a c t i o n r e s u l t s a s s u m e d a u n i f o r mDNA s t r u c t u r e .

A t t h e moment, t h e d i s c r e p a n c y b e t w e e n t h e s e e s t i m a t e si s n o t u n d e r s t o o d . We c o n s i d e r o u r e s t i m a t e o f P 0 4 o r i e n -t a t i o n s t o b e u n e q u i v o c a l a n d c l e a r l y i n c o n s i s t e n t w i t h p r e -v i o u s m o d e l s , w e l l o u t s i d e t h e b o u n d s o f t h e e x p e r i m e n t a le r r o r . T h e d i s c r e p a n c y i s t o o l a r g e t o b e p l a u s i b l y e x p l a i n e db y a s h i f t i n t h e 3 1 p CS A p r i n c i p a l a x e s .A summary o f p h o s p h o d i e s t e r g r o u p o r i e n t a t i o n s i n C -

DNA s a m p l e s , e s t i m a t e d b y d i f f e r e n t m e t h o d s , i s shown i nT a b l e 1 .I n c o n c l u s i o n , r o t o r s y n c h r o n i z e d 2D- M AS a n d 2 D -PASS m e t h o d s may b e u s e d t o c h a r a c t e r i z e t h e o r i e n t a t i o no f t h e p h o s p h o d i e s t e r b a c k b o n e i n A - , B - a n d C-DNA. TheN a D N A - n e t r o p s i n c o m p l e x d i s p l a y s a s i n g l e p h o s p h a t e o r i -e n t a t i o n a t t r i b u t e d t o t h e pure B f o r m . The Li DN A a n dMgDNA s a m p l e s d i s p l a y two p h o s p h a t e group o r i e n t a t i o n s ,w h i c h c o u l d b e i n t e r p r e t e d e i t h e r as a m i x t u r e o f a s l i g h t l yd i s t o r t e d B f o r m a n d a C f o r m , or as a pure C f o r m a l o n e ,i f t h a t f o r m i t s e l f s u p p o r t s two p h o s p h a t e c o n f o r m a t i o n s .

0

1 0

2 0

3 0

4 0P H

o X - r a y ( M a r v i n , 1 9 6 1 )O X - r a y ( A r n o t t , 1 9 7 5 )* I R L D ( P o h l e , 1 9 8 4 )A I R L D ( B r a h m s , 1 9 7 3 )* M A S N M R , m a j o r p e a k ( O u r s )* M A S N M R , m i n o r p e a k ( O u r s )

5 0

6 0 47 0

8 09 0



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S o n g e t a l . 3 1 P - N M R o f D N A F i b e r s 1 5 5 1TABLE I Th e E u l e r a n g l e s o f t h e p h o s p h o d i e s t e r g r o u p s i n A - , B - , a n d C-DNA f i b e r s , o b t a i n e d f r o m d i f f e r e n t methods

A - D N A B- D N A C-DNAM e t h o d ap H 3 P H aPH (PH a P H IPH R e f .

M A S N M R * 6 5 7 2 0 5 3 o 0 { 6 5 T h i s a r t i c l e l 2 5

6 2 6 5 5 5 5 T a n g e t a l . , 1 9 8 9 , 1 9 9 0S t a t i c NMR 5 8 7 1 3 0 5 5 S h i n d o e t a l . , 1 9 8 5

7 3 6 4 N a l l e t a l . , 1 9 8 1X - r a y # -79 7 7 - 4 1 7 7 -36 7 3 A m o t t a n d S e l s i n g , 1 9 7 5 ;

A m o t t a n d H u k i n s ,1 9 7 2

- 7 1 6 4 -35 7 2 A r n o t t e t a l . , 1 9 6 95 2 6 5 2 3 5 7 P r e m i l a t a n d A l b i s e r , 1 9 8 3

- 6 1 6 1 2 0 4 2 C h a n d r a s e k a r a n e t a l . ,1 9 8 9 ; 1 9 9 6-5 7 6 5 -17 4 4 M a r v i n e t a l . , 1 9 6 1 ; F u l l e re t a l . , 1 9 6 5

I R L D 3 1 5 5 3 5 5 0 P o h l e e t a l . , 1 9 8 45 1 6 5 2 4 5 6 3 2 4 8 P i l e t a n d B r a h m s , 1 9 7 2 ;

B r a h m s e t a l . , 1 9 7 3T h e E u l e r a n g l e s r e f e r t o t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n a l o c a l s y s t e m P a t t a c h e d t o t h e p h o s p h o d i e s t e r g r o u p , a n d a h e l i x a x i s s y s t e m H w i t h z a x i s a l o n g t h eh e l i x l o n g a x i s . T h e o r i e n t a t i o n o f P w i t h r e s p e c t t o t h e p h o s p h o d i e s t e r g r o u p s i s s h o w n i n F i g . 1 0 . T h i s c o i n c i d e s w i t h t h e e x p e c t e d p r i n c i p a l a x i so r i e n t a t i o n o f t h e 3 1 p CSA t e n s o r s i n NMR m e a s u r e m e n t s .* T h e a n g l e s f o r t h e P < H t r a n s f o r m a t i o n a r e d e t e r m i n e d d i r e c t l y .# T h e a n g l e s a r e d e t e r m i n e d f r o m t h e e s t i m a t e d P 0 4 g r o u p c o o r d i n a t e s b y a t t a c h i n g a n a x i s s y s t e m P a s i l l u s t r a t e d i n F i g . 1 0 . E s t i m a t e d f r o m t h e o r i e n t a t i o n o f t h e t r a n s i t i o n m o m e n t s o f t h e a n t i s y m m e t r i c a n d s y mm et r i c s t r e t c h i n g v i b r a t i o n s o f P 0 2 a t 1 2 3 0 c m - ' a n d 1 0 9 0 c m - ' ,r e s p e c t i v e l y , r e l a t i v e t o t h e DNA h e l i x a x i s .T h e N a D N A s a m p l e e q u i l i b r a t e d a t 75% r e l a t i v e h u m i d i t yi s p r e d o m i n a n t l y i n t h e A f o r m , b u t t h e r e a r e c o n s i d e r a b l em i n o r c o m p o n e n t s w i t h a s i m i l a r d i s t r i b u t i o n o f p h o s p h a t eo r i e n t a t i o n s t o t h a t f o u n d i n L i D N A . T h e o r i e n t a t i o n s o f t h e3 1 p c h e m i c a l s h i f t t e n s o r s w i t h r e s p e c t t o t h e DNA h e l i xa x i s i n A - a n d B - D N A a r e i n g o o d a g r e e m e n t w i t h t h o s eo b t a i n e d f r o m o t h e r m e t h o d s . T h e o r i e n t a t i o n o f t h e p h o s -p h a t e l i n k a g e i n C - D N A i s i n c o n f l i c t w i t h p r e v i o u s r e s u l t sd e d u c e d f r o m i n f r a r e d l i n e a r d i c h r o i s m a n d x - r a y f i b e rd i f f r a c t i o n . C u r r e n t c o n c e p t s o f C-DNA s t r u c t u r e may h a v et o b e r e v i s e d .We t h a n k T . K a r l s s o n a n d 0 . G . J o h a n n e s s e n f o r i m p l e m e n t a t i o n o f t h es p i n n i n g - s p e e d c o n t r o l l e r a n d s u s t a i n e d h e l p . We t h a n k G . S . H a r b i s o n , B .N o r d e n , L . K a d a l a y i l , a n d H . F r i t z s c h e f o r d i s c u s s i o n s a n d c o m m e n t s .T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y t h e S w e d i s h N a t u r a l S c i e n c e R e s e a r c h C o u n -c i l a n d t h e S w e d i s h M e d i c a l R e s e a r c h C o u n c i l .

REFERENCESA l a m , T . M . , a n d G . P . D r o b n y . 1 9 9 1 . S o l i d - s t a t e NMR s t u d i e s o f DNAs t r u c t u r e a n d d y n a m i c s . C h e m . R e v . 9 1 : 1 5 4 5 - 1 5 9 0 .A r n o t t , S . 1 9 8 0 . T w e n t y y e a r s h a r d l a b o r a s a f i b e r d i f f r a c t i o n i s t . F i b e rD i f f r . M e t h o d s , A CS S y m p . S e r . 1 4 1 : 1 - 3 0 .A m o t t , S . , S . D . D o v e r , a n d A . J . W o n a c o t t . 1 9 6 9 . L e a s t - s q u a r e s r e f i n e -m e n t o f t h e c r y s t a l a n d m o l e c u l a r s t r u c t u r e s o f DNA a n d R N A f r o m

x - r a y d a t a s t a n d a r d b o n d l e n g t h s a n d a n g l e s . A c t a C r y s t a l l o g r . B . 2 5 :2 1 9 2 - 2 2 0 6 .A r n o t t , S . , a n d D . W. L . H u k i n s . 1 9 7 2 . O p t i m i z e d p a r a m e t e r s f o r A - D N Aa n d B-DNA. B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 4 7 : 1 5 0 4 - 1 5 0 9 .A r n o t t , S . , a n d D . W. L . H u k i n s . 1 9 7 3 . R e f i n e m e n t o f t h e s t r u c t u r e o fB- D N A a n d i m p l i c a t i o n s f o r t h e a n a l y s i s o f X - r a y d i f f r a c t i o n d a t a f r o mf i b e r s o f b i o p o l y m e r s . J . M o l . B i o . 8 1 : 9 3 - 1 0 5 .A r n o t t , S . , a n d E . S e l s i n g . 1 9 7 5 . T h e c o n f o r m a t i o n o f C - D N A . J . M o l . B i o .9 8 : 2 6 5 - 2 6 9 .B a l e n d i r a n , K . , S . T . R a o , C . Y . S e k h a r u d u , G . Z o n , a n d M . S u n d a r a l -i n g a m . 1 9 9 5 . X - r a y s t r u c t u r e s o f t h e B -DNA d o d e c a m e r d(CGCGTTA-ACGCG) w i t h a n i n v e r t e d c e n t r a l t e t r a n u c l e o t i d e a n d i t s n e t r o p s i nc o m p l e x . A c t a C r y s t a l l o g r . D . 5 1 : 1 9 0 - 1 9 8 .B l i i m i c h , B . , C . B o f f e l , G . S . H a r b i s o n , Y . Y a n g , a n d H . W. S p i e s s . 1 9 8 7 .

T w o - d i m e n s i o n a l M A S NMR: ne w p r o s p e c t s f o r t h e i n v e s t i g a t i o n o fp a r t i a l l y o r i e n t e d p o l y m e r s . B e r . B u n s e n g e s . P h y s . C h e m . 9 1 :1 1 0 0 - 1 1 0 3 .B r a h m s , J . , J . P i l e t , T . T . P . L . L a n , a n d L . R . H i l l . 1 9 7 3 . D i r e c t e v i d e n c eo f t h e C - l i k e f o r m o f s o d i u m d e o x y r i b o n u c l e a t e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i .U . S . A . 7 0 : 3 3 5 2 - 3 3 5 5 .B r a n d e s , R . , R . R . V o l d , D . R . K e a r n s , a n d A . R u p p r e c h t . 1 9 8 8 a . S t a t i cd i s o r d e r a n d l i b r a t i o n a l m o t i o n s o f t h e p u r i n e b a s e s i n f i l m s o f o r i e n t e dL i - D N A . J . M o i . B i o L 2 0 2 : 3 2 1 - 3 3 2 .B r a n d e s , R . , R . R . V o l d , D . R . K e a r n s , a n d A . R u p p r e c h t . 1 9 8 8 b . A2 H - N M R s t u d y o f t h e A - D N A c o n f o r m a t i o n i n f i l m s o f o r i e n t e d N a -DNA: e v i d e n c e o f a d i s o r d e r e d B- D N A c o n t r i b u t i o n . B i o p o l y m e r s .2 7 : 1 1 5 9 - 1 1 7 0 .C h a n d r a s e k a r a n , R . , a n d S . A r n o t t . 1 9 9 6 . T h e s t r u c t u r e o f B - D N A i no r i e n t e d f i b e r s . J . B i o m o L S t r u c t . D y n . 1 3 : 1 0 1 5 - 1 0 2 7 .C h a n d r a s e k a r a n , R . , M . W a n g , R . G . H e , L . C . P u i g j a n e r , M . A . B y l e r ,R . P . M i l l a n e , a n d S . A r n o t t . 1 9 8 9 . A r e -e xa m i n a t i o n o f t h e c r y s t a l


14/14

1 5 5 2 B i o p h y s i c a l J o u r n a l V o l u m e 7 3 S e p t e m b e r 1 9 9 7s t r u c t u r e o f A - D N A u s i n g f i b e r d i f f r a c t i o n d a t a . J . B i o m o l . S t r u c t . D y n .6 : 1 1 8 9 - 1 2 0 2 .

C o l l , M . , J . A y m a m i , G . A . v a n d e r M a r e l , J . H . v a n B o o m , A . R i c h , a n dA . H . - J . W a n g . 1 9 8 9 . M o l e c u l a r s t r u c t u r e o f t h e n e t r o p s i n - ( d C G C -GATATCGCG) c o m p l e x : DNA c o n f o r m a t i o n i n a n a l t e r n a t i n g A Ts e g m e n t . B i o c h e m i s t r y . 2 8 : 3 1 0 - 3 2 0 .

E r n s t , R . R . , G . B o d e n h a u s e n , a n d A . W o k a u n , A . 1 9 8 7 . P r i n c i p l e s O fN u c l e a r M a g n e t i c R e s o n a n c e i n O n e a n d Two D i m e n s i o n s . C l a r e n d o nP r e s s , O x f o r d .

F a l k , M . 1 9 6 6 . A g r a v i m e t r i c s t u d y o f h y d r a t i o n o f p o l y n u c l e o t i d e s . C a n .J . C h e m . 4 4 : 1 1 0 7 - 1 1 1 1 .F l a n a g a n , M . E . , S . B . R o l l i n s , a n d R . M . W i l l i a m s . 1 9 9 5 . N e t r o p s i n a n ds p e r m i n e c o n j u g a t e s o f a w a t e r - s o l u b l e q u i n o c a r c i n a n a l o g : a n a l y s i s o fs e q u e n c e - s p e c i f i c DNA i n t e r a c t i o n s . C h e m . B i o l . 2 : 1 4 7 - 1 5 6 .F r i t z s c h e , H . 1 9 9 4 . I n f r a r e d l i n e a r d i c h r o i s m s t u d i e s o f D N A - d r u g

c o m p l e x e s : q u a n t i t a t i v e d e t e r m i n a t i o n o f t h e d r u g - i n d u c e d r e s t r i c t i o n o ft h e B-A t r a n s i t i o n . N u c l e i c A c i d s R e s . 2 2 : 7 8 7 - 7 9 1 .F r i t z s c h e , H . , R . B r a n d e s , A . R u p p r e c h t , Z . S o n g , T . W e i d l i c h , a n d D . R .K e a r n s . 1 9 9 2 . T h e f o r m a t i o n o f A - D N A i n N a D N A f i l m s i s s u p p r e s s e db y n e t r o p s i n . N u c l e i c A c i d s R e s . 2 0 : 1 2 2 3 - 1 2 2 8 .F r i t z s c h e , H . , M . R i c h t e r , a n d A . R u p p r e c h t . 1 9 8 4 b . R e s t r i c t i o n o f c o n f o r -

m a t i o n a l t r a n s i t i o n s o f DNA i n f i l m s i n d u c e d b y i n t e r c a l a t i n g a n dn o n - i n t e r c a l a t i n g a n t i b i o t i c s . S t u d . B i o p h y s . 1 0 4 : 9 1 - 9 5 .F r i t z s c h e , H . , A . R u p p r ec h t , a n d M . R i c h t e r . 1 9 8 4 a . I n f r a r e d l i n e a r d i c h r o -

i s m o f o r i e n t e d D N A - l i g a n d c o m p l e x e s p r e p a r e d w i t h t h e w e t - s p i n n i n gm e t h o d . N u c l e i c A c i d s R e s . 1 2 : 9 1 6 5 - 9 1 7 7 .F u j i w a r a , T . , a n d H . S h i n do . 1 9 8 5 . P h o s p h o r u s - 3 1 n u c l e a r m a g n e t i c r e s -

o n a n c e o f h i g h l y o r i e n t e d DNA f i b e r s . 2 . M o l e c u l a r m o t i o n s i n h y d r a t e dDNA. B i o c h e m i s t r y . 2 4 : 8 9 6 - 9 0 2 .F u l l e r , W . , M . H . F . W i l k i n s , H . R . W i l s o n , a n d L . D . H a m i l t o n . 1 9 6 5 . T h em o l e c u l a r c o n f i g u r a t i o n o f d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d . I V . X - r a y d i f f r a c t i o ns t u d y o f t h e A f o r m . J . M o l . B i o l . 1 2 : 6 0 - 8 0 .G a b r i e l s e , W . , H . F . J . M. v a n W e l l , a n d W. S . V e e m a n . 1 9 9 6 . D e t e r m i -n a t i o n o f t h e 1 3 C m a g n e t i c s h i e l d i n g t e n s o r i n p a r t i a l l y o r i e n t e d p o l y m e rs y s t e m s . S o l i d S t a t e N u c l . M a g n . R e s o n . 6 : 2 3 1 - 2 4 0 .G o o d s e l l , D . S . , M . L . K o p k a , a n d R . E . D i c k e r s o n . 1 9 9 5 . R e f i n e m e n t o fn e t r o p s i n b o u n d t o DNA: b i a s a n d f e e d b a c k i n e l e c t r o n d e n s i t y mapi n t e r p r e t a t i o n . B i o c h e m i s t r y . 3 4 : 4 9 8 3 - 4 9 9 3 .H a r b i s o n , G . S . , a n d H . W. S p i e s s . 1 9 8 6 . T w o - d i m e n s i o n a l m a g i c - a n g l e -

s p i n n i n g NMR o f p a r t i a l l y o r d e r e d s y s t e m s . C h e m . P h y s . L e t t . 1 2 4 :1 2 8 - 1 3 4 .H a r b i s o n , G . S . , V . - D . V o g t , a n d H . W. S p i e s s . 1 9 8 7 . S t r u c t u r e a n d o r d e ri n p a r t i a l l y o r i e n t e d s o l i d s : c h a r a c t e r i z a t i o n b y 2 D - m a g i c - a n g l e - s p i n n i n gN MR . J . C h e m . P h y s . 8 6 : 1 2 0 6 - 1 2 1 8 .H e i n e m a n n , U . , C . A l i n g s , a n d M. H a h n . 1 9 9 4 . C r y s t a l l o g r a p h i c s t u d i e s o fDNA h e l i x s t r u c t u r e . B i o p h y s . C h e m . 5 0 : 1 5 7 - 1 6 7 .H e r z f e l d , J . , R . G . G r i f f i n , a n d R . A . H a b e r k o r n . 1 9 7 8 . P h o s p h o r u s - 3 1c h e m i c a l - s h i f t t e n s o r s i n b a r i u m d i e t h y l p h o s p h a t e a n d u r e a - p h o s p h o r i ca c i d : m o d e l c o m p o u n d s f o r p h o s p h o l i p i d h e a d - g r o u p s t u d i e s . B i o c h e m -i s t r y . 1 4 : 2 7 1 1 - 2 7 1 8 .J u a n g , C . L . , P . T a n g , a n d G . S . H a r b i s o n . 1 9 9 5 . S o l i d - s t a t e NMR o f DNA.N u c l . M a g n . R e s . 2 6 1 : 2 5 6 - 2 7 0 .K o p k a , M . L . , C . Y o o n , D . G o o d s e l l , P . P j u r a , a n d R . E . D i c k e r s o n . 1 9 8 5 a .T h e m o l e c u l a r o r i g i n o f D N A - d r u g s p e c i f i c i t y i n n e t r o p s i n a n d d i s t a -

m y c i n . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 8 2 : 1 3 7 6 - 1 3 8 0 .K o p k a , M. L . , C . Y o o n , D . G o o d s e l l , P . P j u r a , a n d R . E . D i c k e r s o n . 1 9 8 5 b .B i n d i n g o f a n t i t u m o r d r u g t o DNA. N e t r o p s i n a n d C - G - C - G - A - A - T - T -B r C - G - C - G . J . M o l . B i o l . 1 8 3 : 5 5 3 - 5 6 3 .L a n g r i d g e , R . , H . R . W i l s o n , C . W. H o o p e r , M . H . F . W i l k i n s , a n d L . D .H a m i l t o n . 1 9 6 0 . T h e m o l e c u l a r c o n f i g u r a t i o n o f d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d .I . X - r a y d i f f r a c t i o n s t u d y o f a c r y s t a l l i n e f o r m o f t h e l i t h i u m s a l t . J . M o l .B i o l . 2 : 1 9 - 3 7 .M a r i c q , M . M . , a n d J . S . W a u g h . 1 9 7 9 . NMR i n r o t a t i n g s o l i d s . J . C h e m .P h y s . 7 0 : 3 3 0 0 - 3 3 1 6 .M a r v i n , D . A . , M . S p e n c e r , M . H . F . W i l k i n s , a n d L . D . H a m i l t o n . 1 9 6 1 .T h e m o l e c u l a r c o n f i g u r a t i o n o f d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d . I I I . X - r a y d i f -f r a c t i o n s t u d y o f t h e C f o r m o f t h e l i t h i u m s a l t . J . M o l . B i o l . 3 : 5 4 7 - 5 6 5 .N a l l , B . T . , W. P . R o t h w e l l , J . S . W a u g h , a n d A . R u p p r e c h t . 1 9 8 1 .S t r u c t u r a l s t u d i e s o f A - f o r m s o d i u m DNA: p h o s p h o r o u s - 3 1 n u c l e a r

m a g n et i c r es o n a n ce o f o r i e n t e d f i b e r s . B i o c h e m i s t r y . 2 0 : 1 8 8 1 - 1 8 8 7 .

P a t e l , D . J . , a n d L . S h a p i r o . 1 9 8 5 . M o l e c u l a r r e c o g n i t i o n i n n o n c o v a l e n ta n t i t u m o r a g e n t - d n a c o m p l e x e s : NMR s t u d i e s o f t h e b a s e a n d s e q u en c ed e p e n d e n t r e c o g n i t i o n o f t h e DNA m i n o r g r o o v e b y n e t r o p s i n . B i o c h e -m i e . 6 7 : 8 8 7 - 9 1 5 .P i l e t , J . , a n d J . B r a h m s . 1 9 7 2 . D e p e n d e n c e o f B-A c o n f o r m a t i o n a l c h a n g ei n DNA o n b a s e c o m p o s i t i o n . N a t u r e New B i o . 2 3 6 : 9 9 - 1 0 0 .P o h l e , W . , a n d H . F r i t z s c h e . 1 9 8 4 . R e s t r i c t i o n o f DNA c o n f o r m a t i o n a lf l e x i b i l i t y i n d u c e d b y a n t i b i o t i c s a n d a m i n o c o m p o u n ds . S t u d . B i o p h y s .1 0 4 : 3 0 3 - 3 0 8 .P o h l e , W . , V . B . Z h u r k i n , a n d H . F r i t z s c h e . 1 9 8 4 . T h e D N A p h o s p h a t eo r i e n t a t i o n . I n f r a r e d d a t a a n d e n e r g e t i c a l l y f a v o r a b l e s t r u c t u r e s . B i o p o l y -

m e r s . 2 3 : 2 6 0 3 - 2 6 2 2 .P r e m i l a t , S . , a n d G . A l b i s e r . 1 9 8 3 . C o n f o r m a t i o n s o f A - D N A a n d B- D N Ai n a g r e e m e n t w i t h f i b e r X - r a y a n d i n f r a r e d d i c h r o i s m . N u c l e i c A c i d s R e s .1 1 : 1 8 9 7 - 1 9 0 8 .R h e e , Y . , C . W a n g , B . L . G a f f n e y , a n d R . A . J o n e s . 1 9 9 3 . N i t r o g e n - 1 5 -l a b e l e d o l i g o d e o x y n u c l e o t i d e s . 6 . U s e o f N - 1 5 NMR t o p r o b e b i n di n g o fn e t r o p s i n a n d d i s t a m y c i n t o ( d [ C G C G A A T T C G C G ] ) 2 . J . A m . C h e m .S o c . 1 1 5 : 8 7 4 2 - 8 7 4 6 .R u p p r e c h t , A . 1 9 6 6 . P r e p a r a t i o n o f o r i e n t e d DNA b y w e t s p i n n i n g . A c t aC h e m . S c a n d . 2 0 : 4 9 4 - 5 0 4 .R u p p r e c h t , A . 1 9 7 0 . A w e t s p i n n i n g a p p a r a t u s a n d a u x i l i a r y e q u i p m e n ts u i

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