Analytische Ultrazentrifugation (AUZ) Alexandra Beusch, Beatrice Lafargue Methodenseminar, Januar 2007

Analytische Ultrazentrifugation(AUZ)

Alexandra Beusch, Beatrice Lafargue

Methodenseminar, Januar 2007

• Aufbau der Analytischen Ultrazentrifuge

• Sedimentationslauf

(Sedimentationsgeschwindigkeitslauf)

• Gleichgewichtslauf

(Sedimentationsgleichgewichtslauf)

Gliederung

Fragestellung

• Homogenität der Probe

(Sedimentationslauf)

• Sedimentationskoeffizient

(Sedimentationslauf)

• Molekulargewicht (Gleichgewichtslauf)

Analytische Ultrazentrifuge (AUZ)

AUZ: 160 000€; Rotor: 18 000€; Zelle ca. 2 500€

max. 50 000 rpm

Probe: 450 µl

Optische Systeme

Probenkonzentration /-verteilung kann während des Laufes verfolgt werden Absorptionsoptik

Interferenzoptik

Wellenlänge frei wählbar (190-800 nm)

Probe muss Chromophor sein

OD()= 0.5-1.5

Probe muss kein Chromophor sein

Unterschiedliche Brechungsindizes (Probe und Lösungsmittel)

Geringere Empfindlichkeit -> höhere Proteinkonzentration (mind. 1mg/ml)

Schlierenoptik

+

++

Laser 675 nm

Analytische Ultrazentrifuge (AUZ)

Schlitten Absorption

Aufhängung Rotor

Linsensystem Interferenz

Aufhängung Optik

Radiometer

Strahlengang

Sedimentation

Wirkende Kräfte

Experiment

Auswertung

Van Holde Weischet Analyse

Sedimentation

Wie setzt sich der Sedimentationskoeffizient

zusammen?

Sedimentationskoeffizient

Fz = Zentrifugalkraft

mp = Partikelmasse r = radialer Abstand Partikel zu Rotationsachseω = Winkelgeschwindigkeit

Wirkende Kräfte:

pz mrF 2

• Fz ist dem Schwerefeld proportional

• Fz nimmt im Verlauf der Sedimentation zu

Wirkende Kräfte



Fb = Auftriebskraft

Wirkende Kräfte:

pz mrF 2

LmpLmpLm VmVm 2

~

Lmb mrF 2

• Fb wirkt Fz entgegen

• abhängig von Lösungsmittel

Wirkende Kräfte

mp = Partikelmasse r = radialer Abstand Partikel/Rotationsachseω = Winkelgeschwindigkeit mLm = Masse des verdrängten Lsg.mittelsVp = Teilchenvolumen ρLm = Lösemitteldichte

= partielles spezif. Volumen des Teilchens2

~V



Fb = Auftriebskraft

Ff = Reibungskraft

Wirkende Kräfte:

pz mrF 2

LmpLmpLm VmVm 2

~

Lmb mrF 2

vfFf

D

Tf

• Ff wirkt Fz entgegen

• f ist abhängig von Form, Größe und Hydratation des Partikels

• Zwischen den drei Kräften stellt sich ein Gleichgewicht ein (< 1 ms)

Wirkende Kräfte


= partielles spezif. Volumen des Teilchens v = Geschwindigkeit des Teilchensf = Reibungskoeffizient k = Boltzmann KonstanteT = Temperatur D = Diffusionskoeffizient

2

~V



Fb = Auftriebskraft

Ff = Reibungskraft

Wirkende Kräfte:

pz mrF 2

LmpLmpLm VmVm 2

~

Lmb mrF 2

0 fbz FFFufFf

Wirkende Kräfte

D

Tf



2

~V

Einheit: = 1 S [Svedberg]



Fb = Auftriebskraft

Ff = Reibungskraft

Wirkende Kräfte:

pz mrF 2

LmpLmpLm VmVm 2

~

Lmb mrF 2

ufFf s

r

u

f

Vm Lmp

22

~1

s1310

Wirkende Kräfte

D

Tf



2

~V

Sedimentation

Welche Informationen liefert das Sedimentationsexperiment ?

Sedimentationsexperiment mögliche Erkenntnisse

• Bestimmung des/der Sedimentationskoeffizienten s

• Aussage über Zusammensetzung bzw. Reinheit der Probe (homogen, heterogen)

• Aussage über die partielle Konzentration der einzelnen Komponenten

Sedimentationsexperiment Vorab: Überlegungen

? In welchem Puffer soll Protein/Partikel gelöst sein ?

z.B.: TRIS absorbiert bei 205 nm sehr stark, Phosphatpuffer nicht

? Bei welchen Wellenlängen möchte ich messen ?

z.B.: 280 nm → aromatische AS, 205 nm → Peptidrückgrad

? Bei welcher Geschwindigkeit soll gemessen werden ?

abhängig von MW; so hoch wie möglich, um die Diffusion an der Sedimentationsfront zu minimieren, ABER: es werden für eine gute Auswertung mind. 15-20 Scans für benötigt; im Zweifel mehrere Läufe bei unterschiedl. Geschwindigkeiten

? Wie viele Scans in welchem zeitlichen Abstand?

so viele Scans wie möglich über die komplette Probenzelle in kurzem zeitlichen Abstand

Sedimentationsexperiment Vorbereitungen

Doppelsektorzelle

Reference = Lösungsmittel, 420 µl

Sample = Probe in Lösungsmittel, 400 µl

- unterschiedliche Befüllung wichtig für Messung der Menisken

- sektorförmige Messzelle vermeidet Konvektionen

Zelle zusammenbauen, befüllen und in Rotor einsetzen

Rotor in Zentrifuge einsetzen, Optik einschrauben

Zentrifuge starten und Vakuum ziehen lassen

mind. 30 min bei geringer Geschwindigkeit (ca. 3000 rpm) einlaufen lassen, um konstante Temperatur zu erreichen

Experiment starten

Dauer: ca. 3 – 4 h

Sedimentationslauf Rohdaten

rm = Radius Meniskus rbnd= boundary (Wendestelle der Sedimentationsfront) rb = Radius Boden

Probe

Lösemittel

radiale Verdünnung durch sektorförmige Messzelle

Auswertung Programm: Ultrascan

Auswertungssoftware: Ultrascan (by Borries Demeler and The University of Texas)

1. Editieren des Rohdatensatzes

(Anzeige der Menisken und des Plateaus)




(Anzeige der Menisken und des Plateaus; Möglichkeit, einzelne Scans zu eliminieren, um Randeffekte („boundary“) auszuschließen)




(Anzeige der Menisken und des Plateaus; Möglichkeit, einzelne Scans zu eliminieren, um Randeffekte („boundary“) auszuschließen)

2. Auswertung der bearbeiten Daten mit der Enhanced Van Holde-Weischet Analyse (vHWA)

Auswertung vHWA

Noch mal ein bisschen Theorie:

Die Van Holde Weischet Analyse (vHWA)

Auswertung Warum vHWA?

• korrigiert für Diffusionseffekte

• Möglichkeit der besseren Auswertung von heterogenen Proben und Proben mit zwei oder mehr gut voneinander getrennten Komponenten

• Auswertung von Datenpunkten in Zell-Bodennähe und von Scans ohne stabiles Plateau möglich

Warum van Holde Weischet?

Auswertung vHWA

Verbreiterung der Sedimentationsfront (Boundary

Spreading) : Diffusion vs. Heterogentiät

• Partikel unterliegt im Zentrifugalfeld ungerichteter und gerichteter Diffusion

• Ungerichtet: BROWNsche Molekularbewegung

• Gerichtet/wechselseitig: Konzentrationsgefälle an der Sedimentationsfront

• führt zu einer Verbreiterung der Sedimentationsfront = Vortäuschung breiter S-Verteilung; allerdings überwiegt mit vorschreitender Zeit die Sedimentation die Diffusion

Auswertung vHWA

Boundary Spreading: Diffusion vs. Heterogenität

Probe mit nur einer einzigen sedimentierenden Komponente

Auswertung vHWA


Probe mit mehreren Komponenten

Auswertung vHWA


Auswertung vHWA

Berechnung der apperenten Sedimentationskoeffizienten

Auswertung vHWA

Extrapolationsplot

Auswertung vHWA

Distributionsplot

Auswertung vHWA: Originaldaten

Gleichgewichtslauf

am Beispiel eines Einkomponentensystems

Gleichgewichtslauf

Konzentrationsreihe

Probenmeniskus

Lösungsmittelmeniskus 3x identische Probe100µl

3x identischer Puffer120 µl

Gleichgewichtslauf

6 000 rpm

8 000 rpm

10 000 rpm

0 h

Diffusion Sedimentation

Im Gleichgewicht kein netto-Stofftransport

Gleichgewicht ist abhängig von…

Diffusion Sedimentation

• Molekulargewicht

• Pufferviskosität

• Länge der Flüssigkeitssäule

• Temperatur

• WinkelgeschwindigkeitMeniskus: darf kein Protein enthalten,

Aber auch keine vollständige Sedimentation!

Gleichgewichtslauf

MP =Molekulargewicht Protein = partielles spezif. Volumen des Teilchens R = allg. Gaskonstante = [8.31 J/(K*mol)] ρLM = LösemitteldichteT = Temperatur ω = Winkelgeschwindigkeitr = Abstand Partikel-Rotationsachse c = Konzentration

PV~

)(

)(ln

)~

1(

222 rd

cd

V

TRM

LMP

P

Gleichgewichtslauf- lineare Auswertung

Ergebnis: 147 - 377 kDa

MP = Molekulargewicht Protein = partielles spezif. Volumen des Teilchens R = allg. Gaskonstante = [8.31 J/(K*mol)] ρLM = LösemitteldichteT = Temperatur ω = Winkelgeschwindigkeitr = Abstand Partikel-Rotationsachse c = Konzentration

PV~

2

2

)~

1(ln

2

rTR

VMc LMPP

Gleichgewichtslauf- Global Fit

BTR

rrVMA LMP

erc

2

)()~

1()ln( 20

22

)(

MP = Molekulargewicht Protein = partielles spezif. Volumen des Teilchens R = allg. Gaskonstante = [8.31 J/(K*mol)] ρLM = LösemitteldichteT = Temperatur ω = Winkelgeschwindigkeitr = Abstand Partikel-Rotationsachse c(r) = Konzentration am Punkt rA = Amplitude B = Baseline

PV~

)(

)(ln

)~

1(

222 rd

cd

V

TRM

LMP

P

= Parameter können „freigegeben“ werden



******************************************************************************************* Global Equilibrium Analysis *******************************************************************************************

Data Report for Project "SampleFit"Fitted Model: 1-Component, Ideal

Parameters for this model:

Molecular Weight for component 1: 5.085e+05 dalton (fitted)Partial Specific Volume for component 1 (at 20ºC): 7.200e-01 ccm/g (fixed)

Global Fitting Statistics:

Variance: 3.0158e-05Standard Deviation: 5.4916e-03Number of floated Parameters: 13Number of Datasets: 6Number of Datapoints: 1225Number of Degrees of Freedom: 1212Number of Runs: 243 (61.277 %, corrected)Expected Number of Runs: 198 (corrected)Run Variance: 9.837e+01 (corrected)

According to these statistical tests, this model is a good candidate for the experimental data.This fit is recommended for Monte Carlo Analysis.

Detailed Information for fitted Scans:

• Gleichgewichtslauf:

stationärer Zustand => Molekulargewicht mit hoher

Genauigkeit

• Sedimentationslauf:

Informationen über Sedimentationskoeffizient,

Reinheit und Zusammensetzung der Probe

Zusammenfassung

Vorteile

• Hydrodynamische Methode:

Proteine in Lösung; kein Kontakt mit Trägermaterialien

• Gemische können analysiert werden

• Kein/kaum Probenverlust

• Absolutmethode: keine Kalibrierung– Masse– Größe – Dichte

Literatur

www.beckmancoulter.comwww.nanolytics.de

Software

http://www.ultrascan.uthscsa.edu/

http://www.beckmancoulter.com/

http://www.nanolytics.de/



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