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1
Analyses des corrélations entre les concentrations d’IL-18 et de TLR4 soluble et la charge en bactéries parodontopathogènes chez les patients atteints de
parodontite chronique
Mémoire
Guillaume Tremblay
Maîtrise en sciences dentaires – Parodontie Maître ès sciences (M. Sc.)
Québec, Canada
© Guillaume Tremblay, 2014
2
III
Résumé
La parodontite est une infection polymicrobienne qui entraîne une inflammation du
parodonte et provoque une destruction irréversible des tissus de soutien de la dent. Le but
de cette étude était d’évaluer les concentrations des cytokines IL-18, IL-1β, IL-10, TNFα
ainsi que celles des récepteurs Toll de type 2 (Toll-like receptor 2, TLR2) et 4 (TLR4)
solubles dans le fluide créviculaire gingivale (FCG) et la salive d’une cohorte de patients
atteints de parodontite. Ces concentrations ont été corrélées avec les paramètres cliniques
de la parodontite et la quantité des bactéries Porphyromonas gingivalis, Treponema
denticola et Fusobacterium nucleatum retrouvées chez les participants à l’étude. Les
résultats obtenus ont révélé que les taux d’IL-18, d’IL-1β et de TLR4 dans le FCG sont plus
élevés chez les sujets atteints de parodontite par rapport à ceux exempts de la maladie et
que la sévérité de la maladie parodontale est associée à des concentrations élevées d’IL-1β
et de TLR4 chez les sujets malades.
IV
V
Table des matières
Résumé ................................................................................................................................ III Table des matières ............................................................................................................... V
Liste des tableaux ............................................................................................................... IX Liste des figures .................................................................................................................. XI
Liste des abréviations ..................................................................................................... XIII Remerciements .................................................................................................................. XV
Chapitre 1 .......................................................................................................................... 1 Introduction ....................................................................................................................... 1
1.1 Les maladies parodontales ........................................................................................ 1 1.1.2 Les constituants du parodonte ............................................................................ 1 1.1.3 Les maladies gingivales ..................................................................................... 1 1.1.4 Les parodontites ................................................................................................. 2
1.2 Le diagnostic de la parodontite ................................................................................. 3 1.2.1 L’étendue et la sévérité de la parodontite .......................................................... 4 1.2.2 La prévalence de la maladie parodontale ........................................................... 4 1.2.3 L’étiologie de la maladie parodontale ............................................................... 5
1.3 Les bactéries parodontopathogènes .......................................................................... 5 1.3.1 Porphyromonas gingivalis ................................................................................. 6 1.3.2 Treponema denticola ......................................................................................... 8 1.3.3 Fusobacterium nucleatum ................................................................................. 9
1.4 La réponse immune et l’inflammation parodontale ................................................ 10 1.4.1 La reconnaissance des motifs associés aux pathogènes ................................... 11
1.5 Les cytokines .......................................................................................................... 11 1.5.1 L’interleukine 1 beta (IL-1β) ........................................................................... 12 1.5.2 Le facteur de nécrose tumorale alpha (TNFα) ................................................. 13 1.5.3 L’interleukine 18 (IL-18) ................................................................................. 14 1.5.4 L’interleukine 10 (IL-10) ................................................................................. 15
1.6 Les récepteurs de type Toll (Toll-like receptors, TLRs) ........................................ 16 1.7 Le fluide créviculaire gingival (FCG) .................................................................... 18 1.8 La salive .................................................................................................................. 19 1.9 Problématique ......................................................................................................... 20 1.10 Hypothèse de recherche ........................................................................................ 21 1.11 Objectifs du projet de recherche ........................................................................... 21 1.12 Pertinence du projet .............................................................................................. 22
Chapitre 2 ........................................................................................................................ 23 Méthodologie ................................................................................................................... 23
2.1 Description de l’étude ............................................................................................. 23 2.2 Aspect légal et considérations éthiques .................................................................. 23 2.3 Population à l’étude et recrutement des sujets ........................................................ 24 2.4 Critères d’inclusion - Groupe malade ..................................................................... 24
VI
2.5 Critères d’inclusion - Groupe contrôle ................................................................... 24 2.6 Critères d’exclusion ................................................................................................ 25 2.7 Examen parodontal ................................................................................................. 25
2.7.1 Examen parodontal partiel pour fin de dépistage (PSR) ................................. 25 2.7.2 Examen parodontal complet ............................................................................ 26
2.8 Prélèvements des échantillons biologiques ............................................................ 27 2.8.1 Prélèvement de salive ...................................................................................... 27 2.8.2 Prélèvement du FCG ....................................................................................... 28 2.8.3 Prélèvement de la plaque dentaire ................................................................... 28
2.9 Préparation des prélèvements en vue des analyses ................................................ 30 2.9.1 Espèces bactériennes de référence et conditions de culture ............................ 30
Analyse des échantillons biologiques ............................................................................ 31 2.10 Quantification de P. gingivalis, T. denticola et F. nucleatum par la réaction en chaîne de la polymérase (PCR) .................................................................................... 31
2.10.1 Procédure d’amplification par PCR quantitative .......................................... 31 2.10.2 Dosage des cytokines IL-18, IL-1β, IL-10, TNFα, dans la salive et le FCG par ELISA ................................................................................................................ 32 2.10.3 Dosage des TLRs (TLR2 et TLR4) dans la salive et le FCG ........................ 34
2.11 Méthodes statistiques et plan de l’analyse des données ....................................... 34 2.12 Analyses statistiques ............................................................................................ 35
Chapitre 3 ........................................................................................................................ 37
Résultats .......................................................................................................................... 37 3.1 Caractéristiques de la population à l’étude ............................................................ 37 3.2 Analyses des paramètres cliniques ......................................................................... 37
3.3 Quantification des bactéries dans la plaque dentaire et la salive par qPCR ........... 38 3.4 Quantification des espèces P. gingivalis, T. denticola et F. nucleatum dans les échantillons de plaque dentaire .................................................................................... 40
3.4.1 Chez les sujets sains ........................................................................................ 41 3.4.2 Chez les patients atteints de parodontite ......................................................... 42
3.5 Comparaison des charges bactériennes chez les groupes sain et malade ............... 42 3.6 Dosage des médiateurs de l’inflammation IL-18, IL-1β, IL-10 et TNFα dans le FCG et la salive des sujets sains et des sujets atteints de parodontite .......................... 44
3.6.1 Concentrations des médiateurs de l’inflammation chez le groupe sain .......... 44 3.6.2 Concentrations des médiateurs de l’inflammation chez le groupe malade ..... 44
3.7 Concentrations des récepteurs TLR2 et TLR4 dans le FCG et la salive ................ 45 3.8 Analyses statistiques comparatives des concentrations des médiateurs de l’inflammation et du récepteur TLR4 chez les deux groupes à l’étude ....................... 45 3.9 Analyses de corrélations entre la charge bactérienne et la concentration des médiateurs de l’inflammation dans le FCG et la salive des sujets sains ...................... 47 3.10 Corrélations entre les charges bactériennes et les paramètres cliniques parodontaux des sujets malades ................................................................................... 47 3.11 Corrélations entre les concentrations des médiateurs de l’inflammation et les paramètres cliniques parodontaux des sujets malades ................................................. 48
VII
3.12 Analyse de l’effet du tabagisme sur les paramètres cliniques parodontaux, microbiologiques et inflammatoires chez les sujets fumeurs et non-fumeurs du groupe malade ........................................................................................................................... 50
Chapitre 4 ........................................................................................................................ 53 Discussion ........................................................................................................................ 53
4.1 Analyses microbiologiques ..................................................................................... 54 4.2 Corrélations entre les bactéries et les paramètres cliniques chez les sujets malades ...................................................................................................................................... 58 4.3 Corrélations entre les médiateurs détectés dans le FCG et la salive et les paramètres cliniques mesurés chez les sujets malades ................................................. 59
Conclusion ........................................................................................................................... 63
Bibliographie ....................................................................................................................... 65
Annexes ............................................................................................................................... 77
VIII
IX
Liste des tableaux
Tableau 1. Classification de l’état de santé de la Société Américaine des Anesthésistes (ASA) .................................................................................................................. 26 Tableau 2. Description des indices et notations de l’examen PSR ...................................... 27 Tableau 3. Séquences des amorces spécifiques utilisées pour la détection des bactéries parodontopathogènes dans les échantillons de plaque dentaire ......................... 31 Tableau 4. Caractéristiques démographiques des sujets à l’étude ........................................ 38 Tableau 5. Données d’amplification d’une culture pure de P. gingivalis ............................. 41 Tableau 6. Concentrations de bactéries détectées par qPCR chez les sujets sains et les sujets malades (UFC/ml). ............................................................................................. 43 Tableau 7. Comparaison des charges bactériennes chez les groupes sain et malade par les tests MANOVA et Fisher. .................................................................................. 43 Tableau 8. Comparaison des concentrations des médiateurs de l’inflammation présents dans le FCG et la salive chez les groupes à l’étude ............................................ 46 Tableau 9. Comparaison des concentrations des médiateurs de l’inflammation dans le FCG chez les groupes sain et malade. ................................................................ 46 Tableau 10. Comparaison des moyennes des concentrations des médiateurs de l’inflammation dans la salive des groupes sain et malade. ............................... 47 Tableau 11. Corrélations entre les charges bactériennes et les concentrations des médiateurs dans le FCG du groupe sain. .......................................................... 48 Tableau 12. Corrélations entre les charges bactériennes et les concentrations des médiateurs de la salive du groupe sain. ............................................................ 48 Tableau 13. Corrélations entre les charges bactériennes et les paramètres cliniques parodontaux des sujets malades. ...................................................................... 49 Tableau 14. Corrélations entre les concentrations des médiateurs de l’inflammation du FCG et les paramètres cliniques parodontaux des sujets malades. ................... 49 Tableau 15. Corrélations entre les concentrations des médiateurs de l’inflammation de la salive et les paramètres cliniques parodontaux des sujets malades. ................. 50 Tableau 16. Comparaison des paramètres cliniques parodontaux des patients fumeurs et non-fumeurs du groupe malade. ....................................................................... 51 Tableau 17. Comparaison des paramètres microbiologiques et inflammatoires chez les sujets fumeurs et non-fumeurs du groupe malade. ........................................... 51
X
XI
Liste des figures
Figure 1. Différence entre un parodonte sain et un parodonte atteint par la maladie parodontale ............................................................................................................. 3 Figure 2. Composition bactérienne du biofilm parodontal ..................................................... 6 Figure 3. Décompte bactérien chez des sujets sains comparé à celui des sujets atteints de parodontite chronique ............................................................................................. 7 Figure 4. Production de FCG et de ses composantes lorsque la maladie parodontale est active ..................................................................................................................... 18 Figure 5. Photographie d'un prélèvement du FCG par capillarité . ...................................... 29 Figure 6. Photographie d'un prélèvement de la plaque dentaire ........................................... 29 Figure 7. Cycles d’amplification de P. gingivalis ................................................................ 33 Figure 8. Cycles d’amplification de F. nucleatum et T. denticola ........................................ 33 Figure 9. Courbe standard obtenue par l’amplification des dilutions d’une culture pure de P. gingivalis ........................................................................................................... 40 Figure 10. Nombre de bactéries détectées par qPCR chez les sujets sains et malades. ........ 42
XII
XIII
Liste des abréviations
A. actinomycetemcomitans (A.a) Aggregatibacter actinomycetemcomitans ADN Acide désoxyribonucléique ANOVA Analyse de la variance ANCOVA Analyse de variance univariée BSA: Albumine bovine sérique C. rectus (C.r) Campylobacter rectus °C Degré Celsius Ct Seuil de cycle dl Degré de liberté ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay F. nucleatum (F.n) Fusobacterium nucleatum FCG Fluide créviculaire gingival IL Interleukine JEC Jonction énamo-cémentaire LPS Lipopolysaccharides MANOVA Analyse de variance multivariée min Minutes ml Millilitre mm Millimètre mM Millimolaire MMPs Métalloprotéinases matricielles PAMPs Motifs moléculaires associés aux pathogènes PBS Tampon phosphate salin PCR Réaction en chaîne de la polymérase P. gingivalis (P.g) Porphyromonas gingivalis pg/ml Picogramme par millilitre P. intermedia (P.i) Prevotella intermedia P. micros (P.m) Peptostreptococcus micros PMNs Neutrophiles polymorphonucléaires PRRs Récepteurs de reconnaissance de motifs moléculaires PSR Indice de dépistage et notation en parodontie qPCR PCR quantitative en temps réel R2 Coefficient de corrélation Subsp Sous-espèces SQ Quantité de départ T. denticola (T.d) Treponema denticola T. forsythia (T.f) Tannerella forsythia TLR Récepteur Toll TNFα Facteur de nécrose tumorale alpha UFC Unité formant une colonie Valeur r Valeur de la corrélation de Pearson X2 Khi-deux ou Khi-carré
XIV
XV
Remerciements
Qu’il me soit permis d’exprimer mes remerciements,
À ma directrice de recherche, docteure Fatiha Chandad, pour son accueil dans son
laboratoire et son regard critique lors de l’élaboration de ma maîtrise,
Aux docteurs Sylvie Louise Avon et Daniel Grenier, pour avoir accordé leur temps et leur
savoir à l’évaluation de ce projet et de ce mémoire,
Au docteur Marc Fecteau pour m’avoir transmis sa passion pour la dentisterie et
l’implantologie,
Au docteur René-Guy Landry pour m’avoir transmis sa passion pour la parodontie et
également pour les nombreuses leçons de vie qu’il m’a inculquées,
Au docteur André Martel, de me permettre de cheminer à ses côtés autant au niveau
professionnel que personnel,
À Huguette et Maurice, pour avoir été des modèles de vie,
À ma copine, Catherine, pour sa présence, sa patience et sa compréhension dans le
cheminement de mon rêve,
À mes parents, Martine et René, pour avoir toujours été présents et à l’écoute au fil des
années. Votre compréhension et votre appui m’ont permis d’apprécier les bons moments et
de traverser les plus difficiles.
XVI
1
Chapitre 1
Introduction
1.1 Les maladies parodontales
Les maladies parodontales sont le résultat d’un processus inflammatoire qui affecte les
tissus de soutien des dents. Elles se divisent en deux groupes : les maladies gingivales et les
parodontites. Le déclenchement et la progression d’une maladie parodontale entraînent la
modification des constituants de l’appareil d’attache de la dent nommé le parodonte.
1.1.2 Les constituants du parodonte
Le parodonte représente l’ensemble des tissus de soutien de la dent. Il est constitué de la
gencive, de l’os alvéolaire, du ligament parodontal et du cément. Au niveau d’un parodonte
sain, la gencive s’attache à la dent près de la jonction énamo-cémentaire via l’épithélium de
jonction. La jonction énamo-cémentaire représente la séparation entre la portion coronaire
de la dent et la racine recouverte par une mince couche de cément. Le cément est un tissu
conjonctif avasculaire qui sert principalement à fixer les fibres du ligament parodontal. Ces
fibres font ainsi la liaison entre le cément de la dent et l’os alvéolaire et permettent
l’ancrage des dents dans les os du maxillaire et de la mandibule [1].
1.1.3 Les maladies gingivales
Les maladies gingivales sont généralement le résultat d'un processus inflammatoire qui
affecte uniquement la gencive. La maladie gingivale la plus fréquemment rencontrée est la
gingivite. Elle est définie par une inflammation qui se limite à la gencive adjacente aux
dents. Au cours de cette maladie, il ne se produit aucune modification au niveau de la
position de l’épithélium de jonction et du niveau osseux. Globalement, chez la population
américaine, 50% des individus âgés de 30 ans et plus sont atteints de gingivite [2].
Il existe deux types de maladies gingivales : celles induites seulement par la plaque dentaire
(gingivites) et celles non induites par la plaque dentaire. La plaque dentaire, appelée aussi
biofilm gingival, induit le plus fréquemment la gingivite. Toutefois, d’autres facteurs
systémiques spécifiques comme une modification du système hormonal, la malnutrition
2
ainsi que la prise de certains médicaments peuvent favoriser ou modifier la réponse
immuno-inflammatoire engendrée par les bactéries de la plaque [3]. Il est à noter que
certaines maladies gingivales non induites par la plaque dentaire peuvent être d’origine
microbienne mais associées à des infections à Neisseria gonorrhoeae, Treponema
pallidum, certains streptocoques, certains virus ou des champignons [3]. D’autres maladies
gingivales peuvent être associées à des désordres mucocutanés et à certaines réactions
d’hypersensibilités [3]. La gingivite est une condition réversible car l’élimination de la
plaque bactérienne permet le rétablissement de la santé gingivale si celle-ci est induite par
la plaque bactérienne [3,4]. D’une manière générale, l’épithélium de jonction constitue une
barrière de défense très efficace contre l’accumulation du biofilm supra-gingival [1].
Lorsque la flore de la plaque bactérienne de la gingivite, majoritairement aérobie à Gram
positif, est remplacée par une plaque à prédominance de bactéries anaérobies à Gram
négatif, l’inflammation touchant particulièrement la gencive peut progresser et affecter tout
le parodonte [5].
1.1.4 Les parodontites
À l’examen clinique et radiologique, la parodontite se distingue de la gingivite par une
destruction progressive de l’ensemble des composantes du parodonte. En effet, la
persistance et l’évolution de la plaque bactérienne vers une flore anaérobie stricte, au
niveau de l’espace gingivo-dentaire, peuvent entraîner une modification de l’état
inflammatoire. Ce dernier peut modifier les tissus de support de la dent et ainsi conduire à
la perte de la dent [5]. Les individus atteints d’une gingivite ne développeront pas
systématiquement une parodontite. Cependant, il n’a jamais été démontré qu’une
parodontite pouvait se développer en absence d’inflammation gingivale [6].
La plus récente classification des maladies parodontales inclut la parodontite chronique, la
parodontite agressive, la parodontite secondaire aux désordres systémiques, la parodontite
nécrotique, les abcès parodontaux et les lésions endo-parodontales [7]. Le diagnostic précis
de la condition dépend des informations recueillies au cours de l’histoire médicale du
patient ainsi que de l’examen clinique et radiologique.
Histologiquement, l'un des premiers changements causés par la parodontite est la migration
apicale de l'épithélium de jonction le long de la surface de la racine de la dent [8]. La
3
modification de la structure de l’épithélium de jonction et de sa position est définitivement
la première étape de la progression de la maladie. Elle est suivie par une destruction
progressive du ligament parodontal et de l’os alvéolaire. Ces modifications des constituants
du parodonte entraînent la formation d’un long épithélium de jonction et d’une poche
parodontale [1] (Figure 1).
Figure 1. Schéma représentant la différence entre un parodonte sain et un parodonte atteint par la maladie parodontale. (Illustration adaptée de Watts (1998) [8] représentant l’épithélium d’une poche parodontale migrant vers l’apex de la dent à la suite de la destruction de l’os alvéolaire et du ligament parodontal [7,8].)
1.2 Le diagnostic de la parodontite
Pour établir un diagnostic de parodontite, plusieurs paramètres doivent être évalués. La
classification des maladies parodontales a été révisée et un consensus a été établi lors de
l’International Workshop for a Classification of Periodontal Diseases de 1999 [7]. La
maladie est classifiée selon le type de parodontite, son étendue et sa sévérité. Lors d'un
examen parodontal complet, la profondeur des poches parodontales au sondage et la mesure
des récessions gingivales sont notées à partir de six sites autour de chaque dent. La
combinaison des profondeurs des poches parodontales et des récessions gingivales par site
permet de calculer la perte d’attache. Le calcul de la perte d’attache lors du sondage permet
Dentine
Jonction énamo-cémentaire
Os alvéolaire
Épithélium de jonction (sain)
Émail
Ligament parodontal
Épithélium de la poche parodontale (enflammée)
4
de quantifier la destruction parodontale en périphérie des dents. De plus, la présence de
saignement lors du sondage évoque une phase active de la maladie. Ces mesures et leurs
localisations permettent de définir le type de parodontite : chronique ou agressive. Lors du
consensus de 1999, le terme parodontite « de l’adulte » a été remplacé par celui de
parodontite « chronique ». Le terme « chronique » a été choisi car il a été jugé non
spécifique à l’âge, donc moins restrictif puisque la maladie peut être présente à tout âge [9].
De plus, la parodontite chronique non traitée évolue lentement au cours du temps d’où le
qualificatif « chronique » attribué à cette forme de pathologie.
1.2.1 L’étendue et la sévérité de la parodontite
Le nombre de sites atteints par la maladie permet de déterminer l’étendue de celle-ci alors
que l’ampleur de la perte d’attache clinique au niveau des dents indique sa sévérité.
Concernant la classification de l’étendue, la maladie est dite « localisée » lorsque moins de
30% des sites sont atteints. L’étendue est dite « généralisée » lorsque plus de 30% des sites
sont affectés [7]. Cette décision reste néanmoins arbitraire car il n'existe pas de règles
strictes et rapides pouvant déterminer l’étendue réelle de la maladie parodontale d'un
patient. La sévérité quant à elle, est classée par rapport à l’importance de la perte d’attache
autour de la racine de la dent. La perte d’attache clinique est la distance entre la jonction
énamo-cémentaire (JEC) et la base du sulcus ou de la poche parodontale mesurée à l’aide
d’une sonde parodontale. La sévérité de la maladie peut donc être « légère » quand la perte
d’attache est de 1 à 2 mm, « modérée » quand la perte est de 3 à 4 mm et « sévère » quand
la perte atteint 5 mm et plus [7].
1.2.2 La prévalence de la maladie parodontale
La maladie parodontale représente actuellement la maladie buccale la plus rencontrée chez
la population adulte. Aux États-Unis, la prévalence globale de la maladie parodontale chez
les adultes de 30 ans et plus est de 47,2% [10]. Selon l’Organisation Mondiale de la Santé [3],
5 à 15% de la population mondiale, soit 600 à 900 millions d’humains, souffrent de la
forme sévère de la maladie parodontale. Cette maladie constitue aussi un problème
important pour la santé générale de l’individu car elle est considérée comme un facteur de
risque pour plusieurs désordres systémiques tels que les maladies cardio-vasculaires, les
infections respiratoires, le diabète et les accouchements prématurés [11].
5
1.2.3 L’étiologie de la maladie parodontale
La maladie parodontale est aujourd’hui décrite comme une condition multifactorielle,
épisodique, irréversible et cumulative. Elle est déclenchée par des bactéries spécifiques
appelées parodontopathogènes et elle est influencée par des facteurs génétiques et
environnementaux [3,12]. Le passage de la gingivite à la parodontite résulterait d’un
déséquilibre entre l’agression des bactéries de la plaque dentaire, de plus en plus
pathogènes, et du système de défense de l’hôte. La parodontite progresse selon des phases
cycliques d'exacerbation, de rémission et de latence. Il s’agit également d’un phénomène
étroitement lié à l'efficacité de la réponse immunitaire de l'hôte [13]. Étant donné la
complexité de cette maladie, la microbiologie et les réponses immunitaires et
inflammatoires de l’hôte sont des éléments clés pour la compréhension de la pathogenèse
des maladies parodontales.
1.3 Les bactéries parodontopathogènes
Actuellement, il existe plus de 700 espèces bactériennes dans la cavité buccale humaine
dont plus de 400 se retrouvent au sein des poches parodontales des sujets atteints de
parodontite [14]. Parmi ces multiples espèces, environ 10 à 20 sont associées à la destruction
tissulaire observée au cours de la parodontite [15]. Il est également bien admis que les
bactéries soient essentielles mais insuffisantes pour causer la maladie parodontale [16]. Les
microorganismes les plus fréquemment associés aux infections parodontales sont appelés
les bactéries parodontopathogènes et incluent les espèces bactériennes suivantes :
Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Aggregatibacter
actinomycetemcomitans, Tannerella forsythia, Prevotella intermedia, Campylobacter
rectus, Peptostreptococcus micros et Fusobacterium nucleatum. Les bactéries les plus
étudiées dans ce contexte sont celles du complexe rouge décrit par Socransky et Haffajee
[10] soit P. gingivalis, T. forsythia et T. denticola (Figure 2).
Les bactéries parodontopathogènes possèdent plusieurs facteurs de virulence qui jouent un
rôle primordial dans la dégradation des constituants du parodonte et la stimulation des
cellules de l’hôte qui mène à la sécrétion de médiateurs de l’inflammation [19]. Dans les
formes sévères de la parodontite, la présence de P. gingivalis au sein de la flore
microbienne sous-gingivale est une composante importante dans le déclenchement et la
6
progression du processus de colonisation et de destruction de l’épithélium buccal [20]. Les
sujets malades présentent une augmentation significative de la charge bactérienne de 18 des
40 espèces connues, incluant T. forsythia, T. denticola et P. gingivalis [21] (Figure 3).
Figure 2. Composition bactérienne du biofilm parodontal. Figure représentant la relation entre les espèces bactériennes des complexes microbiens (Tirée de Socransky et Haffajee [17,18]). Le schéma montre l’arrangement requis des complexes bactériens pour que les bactéries anaérobies du complexe rouge puissent proliférer et survivre dans la poche parodontale. Sans la colonisation par les espèces des complexes inférieurs (bleu, jaune, mauve et vert), l’adhésion des bactéries parodontopathogènes ne peut permettre cette organisation.
1.3.1 Porphyromonas gingivalis
P. gingivalis est une bactérie anaérobie stricte à Gram négatif qui possède plusieurs facteurs
de virulence lui permettant de coloniser l'espace sous-gingival et d’envahir les tissus
environnants. Cette espèce bactérienne peut perturber le système de défense de l'hôte,
détruire les tissus parodontaux ou encore promouvoir la réponse immunodestructrice de
l'hôte [22]. Son association avec la parodontite sévère et son rôle d’agent étiologique
principal sont fortement appuyés dans la littérature [10]. En effet, selon l’étude de
Griffen et al. [23], cette bactérie parodontopathogène est détectée chez 79% des patients
7
atteints de parodontite. Cette étude a également démontré que P. gingivalis pouvait être
détecté chez environ 25% des sujets sains. La détection de cette bactérie est 11,2 fois plus
élevée chez les patients souffrant de parodontite que chez les sujets sains [23]. Ces données
démontrent que la simple présence de bactéries parodontopathogènes ne conduit pas
nécessairement à la maladie parodontale et que ces bactéries doivent atteindre une
concentration critique pour induire la destruction irréversible du parodonte [24]. La présence
de P. gingivalis a été positivement associée aux poches parodontales de profondeur ≥ à 7
mm, appuyant ainsi son rôle dans la progression de la maladie parodontale [25].
Figure 3. Décompte bactérien chez des sujets sains comparé à celui des sujets atteints de parodontite chronique (Tirée de Teles et al., 2010 [21]). Le graphique montre la quantité moyenne (x105) de 40 espèces bactériennes provenant de 28 échantillons de plaque sous-gingivale prélevés chez des sujets au parodonte sain et 28 échantillons de plaque sous-gingivale provenant de patients atteints de parodontite chronique. L’aire sous la courbe en rouge indique l’augmentation du nombre de bactéries en cas de maladie, spécialement pour P. gingivalis et les bactéries du complexe rouge de Socransky et al. [17].
a g i v e n s p e c i e s b y c h a n g i n g t h e c o n c e n t r a t i o n o f e a c hD N A p r o b e . S i g n a l s w e r e c o n v e r t e d t o a b s o l u t e c o u n t sb y c o m p a r i s o n t o s t a n d a r d s o n t h e s a m e m e m b r a n e ;f a i l u r e t o d e t e c t a s i g n a l w a s r e c o r d e d a s z e r o . A t o t a lo f 9 3 1 s u b g i n g i v a l s a m p l e s w e r e e v a l u a t e d .
D a t a A n a l y s i sC l i n i c a l d a t a w e r e a v a i l a b l e f r o m s i x s i t e s p e r t o o t h f o rv i s i b l e p l a q u e , g i n g i v a l r e d n e s s , B O P , s u p p u r a t i o n ,r e c e s s i o n , a n d P D . G C F v o l u m e w a s m e a s u r e d a te a c h m e s i o - b u c c a l s i t e . T h e l e v e l s o f e a c h i n fl a m m a -t o r y m e d i a t o r w e r e m e a s u r e d f o r u p t o 2 8 G C F s a m -p l e s p e r s u b j e c t a n d w e r e e x p r e s s e d a s p g / s i t e o r n g /s i t e . M i c r o b i o l o g i c d a t a a v a i l a b l e f o r e a c h s u b j e c tw e r e t h e c o u n t s o f e a c h o f t h e 4 0 t e s t s p e c i e s f o r u pt o 2 8 s u b g i n g i v a l p l a q u e s a m p l e s p e r s u b j e c t . T h ed a t a f o r e a c h s p e c i e s w e r e e x p r e s s e d a s c o u n t s· 1 0 5 a n d a s t h e p e r c e n t a g e o f t h e t o t a l D N A p r o b ec o u n t a t e a c h s i t e . T h e p e r c e n t a g e o f D N A p r o b ec o u n t d a t a f o r s p e c i fi c s u b g i n g i v a l s p e c i e s w e r eg r o u p e d i n t o t h e m i c r o b i a l c o m p l e x e s d e s c r i b e d b y
S o c r a n s k y e t a l . 1 2 F o r o v e r a l l a n a l y s e s , t h e d a t a f o re a c h c l i n i c a l , m i c r o b i o l o g i c , a n d i m m u n o l o g i c p a -r a m e t e r w e r e a v e r a g e d w i t h i n a s u b j e c t a n d t h e na v e r a g e d a c r o s s s u b j e c t s i n e a c h c l i n i c a l g r o u ps e p a r a t e l y . T h e d i s t r i b u t i o n o f t h e v a l u e s f o r e a c h v a r i -a b l e i n e a c h g r o u p w a s t e s t e d u s i n g t h e D ’ A g o s t i n o -P e a r s o n n o r m a l i t y t e s t ; d e p e n d i n g o n t h e r e s u l t , t h es i g n i fi c a n c e o f d i f f e r e n c e s b e t w e e n h e a l t h y s u b j e c t sa n d s u b j e c t s w i t h c h r o n i c p e r i o d o n t i t i s f o r e a c h c l i n -i c a l , m i c r o b i o l o g i c , a n d i m m u n o l o g i c p a r a m e t e rw a s d e t e r m i n e d u s i n g t h e u n p a i r e d t t e s t o r t h eM a n n - W h i t n e y t e s t . T h e s i g n i fi c a n c e o f t h e s t a t i s t i -c a l d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e g r o u p s f o r t h e p e r c e n t -a g e o f m a l e s a n d t h e p e r c e n t a g e o f s m o k e r s w a st e s t e d u s i n g t h e F i s h e r e x a c t t e s t .
F o r c e r t a i n a n a l y s e s , t h e d a t a w e r e s e p a r a t e d a c -c o r d i n g t o P D c a t e g o r i e s < 4 m m , 4 t o 6 m m , a n d> 6 m m , a v e r a g e d w i t h i n a s u b j e c t w i t h i n e a c h c a t e -g o r y , a n d t h e n a v e r a g e d a c r o s s s u b j e c t s . T h e s i g n i fi -c a n c e o f d i f f e r e n c e s a m o n g t h e t h r e e P D c a t e g o r i e sw i t h i n t h e p e r i o d o n t i t i s g r o u p w a s d e t e r m i n e d u s i n g
F i g u r e 1 .M e a n c o u n t s ( · 1 0 5 ) o f t h e 4 0 t e s t s p e c i e s f r o m u p t o 2 8 s u b g i n g i v a l b i o fi l m s a m p l e s f r o m e a c h p e r i o d o n t a l l y h e a l t h y s u b j e c t a n d s u b j e c t w i t h c h r o n i cp e r i o d o n t i t i s . M e a n c o u n t s o f e a c h s p e c i e s w e r e c o m p u t e d b y a v e r a g i n g t h e d a t a f o r e a c h s u b j e c t a n d t h e n a v e r a g i n g a c r o s s s u b j e c t s i n e a c h g r o u ps e p a r a t e l y . T h e s i g n i fi c a n c e o f t h e d i f f e r e n c e f o r e a c h s p e c i e s b e t w e e n c l i n i c a l g r o u p s w a s d e t e r m i n e d u s i n g t h e M a n n - W h i t n e y t e s t a n d a d j u s t e df o r 4 0 c o m p a r i s o n s . 1 3 T h e s p e c i e s w e r e o r d e r e d a n d g r o u p e d a c c o r d i n g t o t h e c o m p l e x e s d e s c r i b e d b y S o c r a n s k y e t a l . 1 2 * P < 0 . 0 5 ; † P < 0 . 0 1 ;‡ P < 0 . 0 0 1 .
B i o m a r k e r s i n G i n g i v a l C r e v i c u l a r F l u i d V o l u m e 8 1 • N u m b e r 1
9 2
8
L’interaction de la bactérie avec le système immunitaire de l’hôte est primordiale lors du
développement de la maladie et particulièrement au cours de la parodontite chronique.
P. gingivalis possède la capacité de synthétiser diverses protéases pouvant dégrader les
peptides environnants et ainsi assurer la croissance de la bactérie [26]. En réponse à cette
agression bactérienne, une puissante réaction pro-inflammatoire est déclenchée par les
cellules de l’immunité qui libèrent différents médiateurs de l’inflammation incluant des
cytokines et des métalloprotéinases matricielles (MMPs) au sein du parodonte [26]. Bien que
P. gingivalis soit un facteur étiologique important des parodontites, l’intégrité des tissus
parodontaux résulte essentiellement de la réponse du système immunitaire de l'hôte face à
l'agression bactérienne [26]. La grande majorité des études portant sur l’interaction entre les
bactéries de la plaque et les cellules de l’hôte ont été réalisées en utilisant P.
gingivalis [119,120,121,122]. Il s’agit de toute évidence d’un pathogène important pour l’étude
de la maladie parodontale en raison de la multitude de facteurs de virulence qu’il
possède [27, 28].
1.3.2 Treponema denticola
T. denticola est une bactérie anaérobie stricte à Gram négatif de la famille des spirochètes.
Ce microorganisme, en forme de spirale, hautement mobile, a été largement caractérisé en
termes de pathogénicité et d'implication dans le développement de la maladie
parodontale [29]. En plus d’être associée à la parodontite chronique, cette bactérie est
associée à la gingivite ulcéro-nécrotique, à la parodontite agressive et à la parodontite
réfractaire [30]. T. denticola est un colonisateur tardif de la plaque sous-gingivale et possède
une forte tendance à se développer dans les poches parodontales profondes [31].
Cette bactérie parodontopathogène possède plusieurs facteurs de virulence associés à sa
capacité d’adhérence, sa motilité et aux différents facteurs cytotoxiques qu’il produit [29,30].
Certains mécanismes de virulence, tels que l'induction et la dégradation des cytokines, sont
similaires à ceux des autres parodontopathogènes alors que d'autres mécanismes, tels que
l'inhibition de la migration des fibroblastes et des neutrophiles polymorphonucléaires
(PMNs) sont uniques à cette bactérie [30]. Les facteurs de virulence spécifiques de T.
denticola semblent jouer un rôle d’importance dans l’association de cette bactérie avec la
parodontite chronique [30]. Sa capacité d’interagir en synergie avec d'autres agents
9
pathogènes parodontaux favorise le dérèglement de la défense immunitaire et contribue à la
destruction tissulaire de l'hôte [123].
Les interactions in vivo des espèces bactériennes, membres du complexe rouge, sont encore
mal caractérisées, mais certaines études ont déjà montré que la présence de P. gingivalis
pourrait être nécessaire pour que T. denticola puisse coloniser la plaque sous-gingivale [29].
Un essai clinique a également démontré que les niveaux de P. gingivalis et de T. denticola
retrouvés dans la plaque sous-gingivale pourraient prédire la destruction parodontale [32]. La
revue de Ellen et Galimanas [33] sur la relation entre la présence de T. denticola et l’état
parodontal démontre l’intérêt d’approfondir les études sur ce pathogène et de développer
des traitements ciblant son élimination.
1.3.3 Fusobacterium nucleatum
F. nucleatum est une bactérie anaérobie stricte à Gram négatif non motile. Cette espèce
prédominante au sein du biofilm sous-gingival peut être retrouvée autant chez un individu
sain que chez individu atteint de la maladie parodontale [34]. Cependant, cette bactérie est
plus couramment retrouvée et étudiée dans la plaque bactérienne associée à la maladie
parodontale. F. nucleatum est classé dans le complexe orange de la classification de
Socransky et al. en raison de son abondance et de sa capacité d’agrégation avec d'autres
espèces dans la cavité buccale [17]. Cette bactérie parodontopathogène est l'une des
premières espèces à Gram négatif à s'établir au sein du biofilm bactérien jouant ainsi un
rôle central dans les interactions physiques entre les diverses espèces à Gram positif et
négatif [34]. En effet, F. nucleatum favorise l’établissement d’une synergie mutuelle entre
les pathogènes parodontaux permettant le développement et l’évolution de la plaque
dentaire [35]. Ainsi, la plaque formée peut contribuer au recrutement d’autres pathogènes et
par la suite, favoriser le déclenchement et la progression de la maladie parodontale [36]. En
raison de sa capacité d'adhérence, il a été démontré que F. nucleatum pouvait s’associer à
des virus et faciliter l’envahissement des cellules de l’hôte [34]. Cette bactérie
parodontopathogène possède également la capacité de moduler le système de défense de
l’hôte contribuant ainsi au renforcement de la virulence des autres pathogènes [36].
10
1.4 La réponse immune et l’inflammation parodontale
La réponse immuno-inflammatoire produite au niveau des tissus parodontaux est induite
principalement par les bactéries pathogènes de la plaque dentaire [12]. Les bactéries
colonisant le biofilm dentaire possèdent différents potentiels pathogéniques qui peuvent
stimuler une réponse inflammatoire et contribuer à la destruction des constituants du
parodonte [37]. Grâce à leur capacité de coloniser l’espace gingivo-dentaire et d’échapper
aux mécanismes de défense de l’hôte, les bactéries peuvent se multiplier et produire des
substances qui contribueront à l’établissement d’une réaction inflammatoire destructrice au
sein des tissus du parodonte [38]. La réponse immunitaire de l’individu face à l’agression
bactérienne joue un rôle primordial dans la sévérité et l’étendue de la destruction tissulaire.
La première ligne de défense activée durant le déclenchement par l’agression bactérienne
est la réponse immunitaire innée. La première phase de cette réponse consiste en une
migration de PMNs et de monocytes/macrophages qui infiltrent les tissus parodontaux [12].
La présence de ces cellules de l’immunité permet de limiter la croissance bactérienne ainsi
que son infiltration au sein de l’appareil d’attache de la dent. La multiplication des bactéries
parodontopathogènes et l’action de leurs facteurs de virulence peuvent entraîner la
perturbation de la fonction primaire des PMNs. De plus, plusieurs mécanismes permettent à
certaines bactéries d’envahir les tissus et d’éviter le contact avec les PMNs et les autres
acteurs du système immunitaire [15].
Les macrophages jouent également un rôle essentiel dans la pathogenèse de la maladie
parodontale [16,39]. L’activation des macrophages se produit lorsque le principal facteur de
virulence des bactéries à Gram négatif, le lipopolysaccharide (LPS), est reconnu par un
récepteur spécifique présent sur la membrane du macrophage [16]. Plusieurs facteurs de
virulence peuvent être libérés par les parodontopathogènes et activer la transformation des
monocytes en macrophages [40,41]. Une fois activés, ces derniers exercent une action
bactéricide en phagocytant les microorganismes pathogènes [41]. L’activation des
macrophages favorise également la réponse inflammatoire et la sécrétion d’une grande
concentration de médiateurs de l’inflammation incluant les cytokines, les chémokines, les
prostaglandines et les métalloprotéinases matricielles (MMPs). Tous ces facteurs cités
participent à la réponse inflammatoire. Les MMPs peuvent être produites également par les
11
cellules épithéliales ainsi que par les fibroblastes [6,42]. Lorsque l’équilibre des systèmes de
régulation de la réponse inflammatoire est rompu, les MMPs peuvent cependant favoriser la
dégradation des fibres de collagène et perturber ainsi l'anatomie normale des tissus
parodontaux [43,44]. En effet, plus les concentrations des différents médiateurs de
l’inflammation augmentent, plus la réponse inflammatoire s’amplifie et risque de
progresser au sein des tissus entraînant la destruction de l'appareil d’attache des dents [45,46].
1.4.1 La reconnaissance des motifs associés aux pathogènes
La réponse immune innée assure les défenses primaires de l’hôte en reconnaissant les
microorganismes qui pénètrent les couches superficielles des muqueuses [38]. En général, la
réponse innée est stimulée via des récepteurs présents chez les cellules de l’hôte et appelés
« les récepteurs de motifs de reconnaissance » ou encore les PRRs pour « pattern
recognition receptors » [47]. Les PRRs reconnaissent les microorganismes grâce à des
structures présentes sur ces derniers et appelées «motifs moléculaires associés aux
pathogènes » ou PAMPs (pathogen associated molecular patterns). Les PAMPs sont donc
des molécules ou structures présentes chez les microorganismes (bactéries ou virus) mais
elles sont absentes chez les cellules de l’hôte [48]. De ce fait, les PAMPs sont
potentiellement impliqués dans plusieurs types de pathologies affectant le système
immunitaire dont la maladie parodontale [38,47,49].
L’activation de la réponse immunitaire innée est un prérequis pour permettre le
déclenchement de l’immunité adaptative conduisant à une immunité humorale spécifique
et/ou à des réponses immunitaires cellulaires impliquant des lymphocytes [38,47]. Lorsque
l’agent déclencheur du système de défense de l’hôte persiste au site de l’infection, il
contribue à l’installation d’un état d’inflammation chronique. Cette réponse locale entraîne
la production de différentes cytokines et médiateurs de l’inflammation pouvant entraîner la
destruction des constituants de l’appareil d’attache de la dent [50,51].
1.5 Les cytokines
Les progrès récents de la recherche scientifique dans le domaine des infections
parodontales ont permis de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans cette
pathologie [21]. La littérature rapporte le rôle joué par une multitude de médiateurs dans les
12
processus inflammatoires associés à la parodontite. Ces médiateurs sont généralement des
protéines solubles présentes dès le déclenchement de la réponse immune innée et
permettent la communication entre les cellules [28]. Elles sont produites par différentes
populations cellulaires, notamment les PMNs, les macrophages, les monocytes, les
lymphocytes, les fibroblastes, les cellules épithéliales et les cellules dendritiques [39,52]. Leur
production semble jouer un rôle central dans la progression de l’inflammation vers la
destruction des tissus parodontaux [39,53].
Lors d’une sécrétion inappropriée, les cytokines peuvent entraîner des dommages dans la
fonction et le renouvellement des cellules parodontales et dans l’activation des ostéoclastes
via des médiateurs et des enzymes destructrices [28]. L'induction de médiateurs primaires
tels que les interleukines (IL) et les facteurs de nécrose tumorale (TNF) stimule la
production de médiateurs secondaires. Cette stimulation conduit à une amplification de la
réponse inflammatoire ainsi qu’à l'induction d'enzymes dégradant les tissus conjonctifs
environnants [53]. L’étendue de la destruction des tissus parodontaux est déterminée par
l’équilibre entre les cytokines proinflammatoires et anti-inflammatoires ainsi que la
régulation de leurs récepteurs [53]. Lorsque cet équilibre est rompu en faveur des cytokines
proinflammatoires, la réponse physiologique devient une réponse pathologique et une perte
de l’attache de la dent se produit [53,54]. Les interactions entre les diverses cytokines
constituent un réseau très complexe. Le défi des dernières années consistait à caractériser la
globalité de la réponse des cytokines, les conséquences qu’elles entraînent sur la réponse de
l’hôte et la contribution précise de ces médiateurs à la maladie parodontale [39,55].
1.5.1 L’interleukine 1beta (IL-1ββ)
Les interleukines sont un groupe de cytokines possédant des fonctions importantes au
niveau du système immunitaire. Elles sont impliquées dans la réponse inflammatoire lors
d’infections aiguës ou chroniques [56,57]. L’IL-1 est une cytokine proinflammatoire qui
régule directement plusieurs gènes exprimés au cours de l'inflammation [56]. La forme
prédominante de l'IL-1 dans les tissus parodontaux est l'IL-1β et elle est principalement
produite par les macrophages [56,58].
Au cours des années 90, de multiples études ont mis en évidence l’implication de l’IL-1β
dans la pathogenèse de la maladie parodontale [6,59,60]. Différentes cellules de l’hôte libèrent
13
des quantités d’IL-1β en présence de LPS des bactéries à Gram négatif [61]. La sécrétion de
ce médiateur affecte les cellules du parodonte incluant les fibroblastes gingivaux, les
fibroblastes du ligament parodontal et les ostéoblastes, [62] en stimulant leur capacité de
prolifération et/ou de production de différents médiateurs de l’inflammation. Le LPS
stimule également la résorption osseuse en augmentant la différenciation des ostéoclastes et
de leurs précurseurs [62]. De plus, l’IL-1β peut induire l'expression d’autres médiateurs
pouvant amplifier la réponse inflammatoire [62].
De fortes concentrations d’IL-1β dans le fluide créviculaire gingival (FCG) et les tissus
parodontaux ont été détectées chez des sujets atteints de parodontite comparativement à des
sujets sains ou encore atteints de gingivite [62]. Cependant, les relations entre les taux
d'IL-1β dans le FCG ou dans la salive et la maladie parodontale ne sont pas pleinement
élucidées [67].
1.5.2 Le facteur de nécrose tumorale alpha (TNFαα)
La destruction des tissus parodontaux est également associée à une production excessive de
TNFα [53]. Cette cytokine proinflammatoire est impliquée dans l’inflammation et
spécialement dans la réaction de la phase aiguë. Une production de TNFα dans les tissus
entraîne une vasodilatation des vaisseaux sanguins et le développement des signes de
l’inflammation dont l’érythème, la chaleur et l’œdème. Sa libération est stimulée par
plusieurs médiateurs dont l’IL-1 et les endotoxines bactériennes [53]. Cette cytokine est
produite par plusieurs types cellulaires comme les cellules endothéliales et les leucocytes et
contribue à différents processus pathologiques associés au déclenchement d’une réponse
inflammatoire. Le TNFα augmente l’expression des molécules d’adhésion et stimule la
production de chimiokines nécessaires pour le recrutement des leucocytes de la circulation
sanguine. Le TNFα induit aussi l’expression d’autres médiateurs qui amplifient et
maintiennent la réponse inflammatoire tels que les prostaglandines et les MMPs. De plus, le
TNFα agit en synergie avec l’IL-1 pour augmenter la résorption osseuse [53].
Le TNFα a été fortement associé au processus inflammatoire se produisant au cours de la
maladie parodontale [53]. En plus d’être un puissant déclencheur de l’apoptose cellulaire, le
TNFα est un stimulateur de la résorption osseuse, mais il est moins puissant que l’IL-1β [6].
Les concentrations de TNFα dans les tissus parodontaux peuvent être cinq fois moins
14
élevées que les concentrations d’IL-1β [63]. Cependant, les effets de l’IL-1β et du TNFα
semblent être synergiques dans leur capacité d’induire une résorption de l’os alvéolaire [29].
De multiples études ont analysé les concentrations de l’IL-1β et de TNFα afin de mieux
comprendre l’association entre la maladie parodontale et les désordres systémiques comme
l'athérosclérose, les maladies coronariennes, l'infarctus du myocarde et la crise
cardiaque [6,42] . La littérature rapporte aussi que le TNFα pourrait jouer un rôle dans la
résistance à la réponse immunitaire de certains pathogènes cependant ce rôle se doit d’être
clarifié davantage [53].
Plusieurs études ont clairement établi une relation de cause à effet entre les cytokines
inflammatoires et la pathogenèse de différentes maladies en utilisant des antagonistes
d’IL-1 et de TNFα incluant l’antagoniste du récepteur de l’IL-1 (IL-1ra), des récepteurs
solubles d’IL-1 ou de TNFα [53,124,125,126,127] . De plus, la perte des fibroblastes au cours de
l’infection parodontale est, en partie, causée par le TNFα. En résumé, la grande partie des
dommages rencontrés durant la destruction des tissus parodontaux est attribuée au TNFα et
à l’IL-1β. Ces dommages représentent bien une réponse exagérée de l’hôte vis-à-vis des
parodontopathogènes causée probablement par une production excessive de TNFα et de
l’IL-1 [53].
1.5.3 L’interleukine 18 (IL-18)
L'IL-18 est une cytokine produite principalement par les monocytes/macrophages, les
cellules épithéliales, les ostéoblastes, les lymphocytes B et T ainsi que par les cellules
dendritiques [64]. En plus d’avoir la possibilité d’interagir avec l’IL-1β, l’IL-18 engendre
des effets proinflammatoires similaires à ceux de l’IL-1β [64].
De plus en plus de travaux proposent le rôle de l'IL-18 dans la réponse
proinflammatoire [26,50]. En effet, il a été rapporté que cette cytokine est un facteur
important dans le maintien de l’inflammation dans diverses maladies inflammatoires
chroniques de la peau et dans l’arthrite rhumatoïde [65]. Rouabhia et al. [66] ont démontré que
les cellules épithéliales buccales avaient la capacité d’exprimer et de sécréter l’IL-18 à la
suite d’une stimulation par la levure Candida albicans. Une étude a établi une corrélation
très significative entre le taux d'IL-18 présent dans le FCG et la profondeur de la poche
15
parodontale [65]. Il a également été rapporté que le niveau d’IL-18 détecté dans le FCG des
patients atteints de parodontite était plus élevé que celui de l’IL-1β et qu’il était
substantiellement plus élevé que celui de l'IL-12 [65,67,68]. De plus, l’IL-18 induirait une
augmentation de la production des autres médiateurs de l’inflammation, une activation des
PMNs [69] et une modulation de la production d’IL-1β [70].
Cependant, la littérature rapporte également des données opposées à celles citées ci-dessus.
Les travaux de Türkoglu et al. [71] réalisés en 2009 rapportent qu’il n’existe pas de
différence significative des taux d’IL-18 entre les sujets sains et les sujets atteints de
parodontite. De plus, la preuve directe de l’implication de l'IL-18 dans la pathogenèse de la
maladie parodontale demeure non élucidée et nécessite d’autres travaux.
1.5.4 L’interleukine 10 (IL-10)
L’IL-10 est considérée comme une cytokine anti-inflammatoire et joue un rôle central dans
la phase de résolution de l'inflammation [72,73]. Cette cytokine possède des fonctions
indispensables à la régulation de l'homéostasie du système immunitaire et des divers
épithélia. Elle contrôle et supprime l'expression des cytokines proinflammatoires au cours
de la phase de récupération des infections [73]. Les dommages causés par l'inflammation au
niveau tissulaire peuvent être limités par cette cytokine et ainsi contribuer au renforcement
de la défense de l’hôte. L’augmentation de l'expression de l'IL-10 a été associée à de
nombreuses infections bactériennes et virales chroniques [73]. Cette cytokine pourrait avoir
un rôle important dans la pathogenèse des maladies inflammatoires chroniques telle que la
maladie parodontale [74]. Gemmell et al. [75] ont rapporté que, chez les patients atteints de
parodontite, l'activation de la réponse immunitaire par P. gingivalis entraîne une sécrétion
importante d’IL-10. L’étude de Cullinan et al. [74] suggère que cette cytokine contribue à la
progression de la maladie parodontale. De plus, l’IL-10 aurait la capacité de moduler la
production et l'expression de cytokines proinflammatoires telles que l’IL-1β et le TNFα,
avec des conséquences fonctionnelles importantes sur l'activation et le maintien de la
réponse immunitaire [56]. Dans des échantillons de FCG provenant de patients atteints de
parodontite, l’IL-10 a été détectée dans 43% des sites et ce, peu importe l’état d’activité de
la maladie ou la profondeur des poches parodontales [56].
16
Gamonal et al. [56] rapportent dans leur revue de littérature que seulement la moitié des
études réalisées jusqu’à présent a détecté une augmentation des concentrations de l’IL-10
dans le FCG alors que l’autre moitié rapporte des résultats opposés, soit une diminution du
taux de cette cytokine [62]. En résumé, l’ensemble des résultats disponibles actuellement
concernant l’IL-10 montre des productions variables de cette cytokine au niveau du FCG
des sujets atteints de parodontite. Le profil d'expression de l'IL-10 dans des conditions
saines et malades n'a pas encore été clairement élucidé et la relation de l’IL-10 avec la
progression de la maladie demeure à clarifier.
1.6 Les récepteurs de type Toll (Toll-like receptors, TLRs)
Les TLRs sont une grande famille de récepteurs spécifiques qui contrôlent de multiples
aspects de la réponse immunitaire [76]. La famille des récepteurs de type Toll comprend de
10 à 12 formes différentes [48]. Ces récepteurs sont caractérisés par un domaine
intracytoplasmique d’environ 150 acides aminés, très similaires à ceux des membres de la
famille du récepteur de l’IL-1 [76]. Les TLRs sont la classe la plus étudiée des PRRs et sont
considérés comme les détecteurs primaires de pathogènes qui reconnaissent spécifiquement
les PAMPs [48]. Cette reconnaissance des microorganismes par les TLRs contribue à
orienter les réponses immunitaires [38]. La stimulation des récepteurs Toll par les produits
bactériens conduit à l'activation des diverses voies de signalisation et à l’induction de
l’expression de gènes codant pour des produits antimicrobiens et des cytokines
inflammatoires [48].
Dans le contexte de la maladie parodontale, les deux types de récepteurs Toll les plus
étudiés sont les TLR2 et TLR4. En effets, plusieurs études ont rapporté des interactions
entre les TLRs et les LPS de P. gingivalis [77,78]. Les LPS sont reconnus par le TLR4 alors
que les peptidoglycanes des bactéries à Gram positif sont reconnus par le TLR2 [48]. Cette
reconnaissance entraîne la production de cytokines proinflammatoires, telles que l’IL-1β et
le TNFα, qui induisent, à leur tour, une résorption de l’os alvéolaire, de même que la
production de MMPs, si la cascade inflammatoire n’est pas contrôlée [76,79]. De plus,
certaines bactéries parodontopathogènes dont P. gingivalis, ont la capacité de modifier la
structure biochimique de leur LPS en réponse aux conditions environnementales modulant
ainsi son interaction avec le système immunitaire de l’hôte [80]. Les TLR2 et TLR4 sont
17
exprimés à des niveaux élevés chez les cellules qui répondent aux LPS des bactéries, tels
les monocytes et les macrophages, et l’activation de ces derniers conduit à la production de
molécules de co-stimulation et de cytokines inflammatoires grâce aux TLR2 et TLR4 [54].
Dans la littérature actuelle, diverses hypothèses et résultats divergents sont rapportés
concernant le rôle des TLRs dans la pathogenèse des infections parodontales, mais peu de
conclusions définitives semblent être tirées. Par exemple, Darveau et al. [80] ont établi que
l’activation des cellules immunitaires par les LPS de P. gingivalis utilise une voie de TLR2
ou TLR4. Pour quantifier ces récepteurs, la majorité des études réalisées utilise soit des
prélèvements de tissus de gencive, des échantillons de salive ou encore de sérum.
Lappin et al. [81] ont, pour leur part, utilisé la salive pour déterminer la quantité de TLR2 et
de TLR4 chez 20 sujets sains et 20 sujets atteints de parodontite. Les résultats de cette
étude suggèrent que TLR2 et TLR4 sont présents à des concentrations de 20 à 50 fois plus
élevées dans la salive des patients atteints de parodontite comparativement à des sujets
sains. Buduneli et al. [82] ont évalué la présence de TLR2 et de TLR4 dans la salive et le
plasma de patients atteints de parodontite chronique. Les taux de TLR2 salivaires étaient
comparables dans les groupes malade et sain alors que les taux de TLR4 salivaires et de
TLR2 et TLR4 plasmatiques étaient significativement plus élevés chez le groupe atteint de
parodontite chronique [82]. D’autre part, les résultats de Mori et al. [83] suggèrent que TLR2
et TLR4 étaient détectés dans les tissus gingivaux en plus d’être spécifiquement associés à
la parodontite sévère.
Des données récentes stipulent que les TLRs, en plus d’avoir un rôle bénéfique dans la
défense de l’hôte via TLR2 et TLR4, pourraient également contribuer au développement
d’un certain nombre de maladies induites par un processus inflammatoire chronique comme
la parodontite [81]. Il semble que lorsque les tissus parodontaux sont enflammés,
l’expression de TLR2 et TLR4 soit augmentée chez les sujets malades comparativement à
celle des sujets sains [84]. Ces données soulèvent la pertinence de développer les
connaissances sur les voies de signalisation activées via les TLRs car elles représentent des
cibles potentiellement prometteuses pour des nouvelles thérapies visant les maladies à
composante immunitaire [76]. Des études supplémentaires sont donc requises pour
déterminer si les quantités de TLRs dans la salive et le FCG peuvent être utilisées comme
marqueurs spécifiques de l’activité de la maladie parodontale [81].
18
1.7 Le fluide créviculaire gingival (FCG)
Le FCG est un exsudat inflammatoire sécrété par l’épithélium sulculaire qui se retrouve au
niveau de la crevasse gingivale saine ou inflammée [85]. La fonction primaire de l'excrétion
du FCG est d’isoler l’espace gingivo-dentaire des substances nuisibles pouvant se retrouver
dans la cavité buccale [86]. La quantité de FCG produite est directement liée à la
perméabilité vasculaire et à l’inflammation se retrouvant dans les tissus périphériques de la
dent [87]. Le FCG contient des substances dérivées du sérum, des leucocytes, des bactéries,
des cellules épithéliales, des cellules des tissus conjonctifs et de multiples médiateurs de
l’inflammation (Figure 4) [86]. Toutes ces composantes reflètent l’évolution de la maladie
parodontale et peuvent être potentiellement utilisées comme indicateurs de l’état de la santé
parodontale [86]. La composition du FCG dépend de l'interaction entre le biofilm bactérien
adhérant à la surface des dents et les cellules des tissus parodontaux [88].
Figure 4. Production de FCG et de ses composantes lorsque la maladie parodontale est active (Adaptée de l’illustration de Uitto et al. [86]).
Ce fluide est souvent prélevé et utilisé pour analyser et quantifier les médiateurs de
l’inflammation libérés au cours de la parodontite [88]. Facilement collecté, de manière non-
invasive, au niveau de la crevasse gingivale, le FCG pourrait permettre d’établir certaines
corrélations entre la flore bactérienne sous-gingivale et les substances biologiques libérées
19
lors de la défense de l’hôte [89]. L'analyse des constituants spécifiques du FCG fournit un
indicateur quantitatif pour l'évaluation du métabolisme cellulaire local, reflétant le statut
parodontal d’un individu [88]. Par conséquent, les niveaux de certains médiateurs de
l’inflammation tels que l’IL-1 et le TNFα, pourraient constituer des marqueurs de choix
pour établir l’activité de la maladie parodontale et la qualité de la réponse immunitaire de
l’hôte au niveau d’un site précis [88].
Les résultats de l’analyse microbiologique menée par Teles et al. [21] ont démontré des
corrélations positives entre les pourcentages des espèces bactériennes des complexes rouge
et orange, et les niveaux des marqueurs inflammatoires retrouvés dans le FCG. Les
relations précises entre les différents médiateurs de l’inflammation et leurs concentrations
retrouvées dans le FCG restent à élucider. Certaines études ont démontré des corrélations
positives entre certains médiateurs et le statut clinique de la maladie alors que d’autres
n’ont pas pu démontrer ces corrélations [88].
La réaction inflammatoire, induite par les bactéries parodontales au niveau de la poche
parodontale, entraîne la production d’une quantité variable de médiateurs de
l’inflammation [88]. Cette variabilité se manifeste d’un site à un autre dans la bouche et entre
les individus atteints de parodontite [6]. En général, lorsque la pathogénicité de la plaque
bactérienne augmente, les niveaux des médiateurs de l’inflammation produits et retrouvés
au sein du FCG augmenteront également. Les concentrations des divers médiateurs
inflammatoires peuvent alors être suffisantes pour saturer le système de défense de l’hôte et
déclencher une réponse inflammatoire destructrice. Lorsque le seuil de l’équilibre entre la
défense de l’hôte et la progression de la maladie est rompu, une dégradation progressive
des tissus parodontaux survient [88].
1.8 La salive
La salive se compose d’un mélange de plusieurs liquides de la cavité buccale. Elle est
composée de sécrétion des glandes salivaires mineures et majeures, du liquide créviculaire
gingival, de bactéries, de produits bactériens, de débris alimentaires et même de virus [90].
Elle constitue un outil de diagnostic qui reflète une image relative de la microflore buccale
car les bactéries provenant des diverses surfaces de la cavité buccale y sont présentes [91].
Le prélèvement de la salive est facile, rapide, non invasif et peut être analysé pour obtenir
20
de l’information sur la santé parodontale [91]. La prévalence des principales bactéries
parodontopathogènes dans la salive semble varier grandement entre les individus en raison
de la santé parodontale. Plus la détérioration parodontale progresse, plus les quantités de
bactéries pathogènes augmentent dans la salive [92].
La présence de P. gingivalis dans la salive est significativement associée aux poches
parodontales de profondeur ≥ 6 mm [91]. Dans une étude menée sur 40 sujets, au moins une
des six bactéries parodontopathogènes suivantes; T. forsythia, T. denticola, P. gingivalis, C.
rectus, A. actinomycetemcomitans et P. intermedia, a été retrouvé dans 88,2% des
échantillons de salive des sujets. Le pathogène P. gingivalis a, pour sa part, été détecté chez
44% des sujets atteints de parodontite modérée et chez 40% des sujets atteints de
parodontite sévère. Globalement, les cultures positives ont démontré des colonies
bactériennes variant entre 2 x 105 à 6 x 107 UFC/ml de salive [92].
La revue de la littérature de Kaufman et al. [90] suggère qu’un certain nombre de marqueurs
retrouvés dans la salive semble prometteur pour détecter la présence de la maladie et
évaluer l’efficacité des traitements. Plusieurs marqueurs ont été étudiés incluant des
protéines (enzymes et immunoglobulines), des hormones et des produits bactériens [90].
Certains médiateurs tels que l’IL-1β et la MMP-8 ont déjà été retrouvés en quantités
significativement plus élevées dans les échantillons de salive de sujets atteints de maladies
parodontales que ceux des sujets sains [90]. La salive pourrait ainsi présenter un profil
général de tous les sites atteints par la maladie et permettre d’obtenir une évaluation globale
de l’état parodontal [93]. L’analyse de la salive comme outil diagnostic de la maladie
parodontale semble prometteuse. Cette approche simple et économique facilite grandement
la détection et l’évaluation des maladies parodontales [94].
1.9 Problématique
Actuellement, la maladie parodontale affecte des millions de personnes dans le monde.
Seulement aux États-Unis, il a été établi que près de 65 millions de personnes souffraient
de parodontite [10]. Une seconde étude a noté que ce chiffre sous-estimait la réalité et que
près de 50% de la population américaine âgée de 30 ans et plus souffrent de parodontite [95].
Malgré ces chiffres importants, plusieurs aspects associés à la pathogénicité des membres
du biofilm parodontopathogène et la réponse de l’hôte demeurent inconnus. Les bactéries
21
parodontopathogènes stimulent la sécrétion de cytokines proinflammatoires et de différents
médiateurs qui contribuent à la destruction des tissus de soutien de la dent. La chronicité de
cette pathologie est causée par la persistance d’une charge bactérienne pathogène au niveau
du sillon gingival et d’une sécrétion importante de médiateurs de l’inflammation. Ces deux
facteurs étiologiques, bactériens et immunologiques, sont à l’origine du déclenchement et
l’amplification de la réponse immunodestructrice de l’hôte. Un grand nombre d’études a été
réalisé sur le rôle de différents médiateurs de l’inflammation et la sévérité de la maladie
parodontale. Cependant, l’IL-18 et les récepteurs de type Toll n’ont été que très peu
étudiés. Jusqu’à présent, seules deux études [68,71] rapportant des données contradictoires sur
les taux de ces composantes sont retrouvées dans la littérature. D’autres travaux sont donc
requis afin de mieux comprendre le rôle de ces composantes dans la pathogenèse de la
maladie parodontale.
1.10 Hypothèse de recherche
Dans le cadre de ce mémoire de maîtrise, nous proposons l’hypothèse que les patients
atteints de parodontite possèdent des taux élevés de médiateurs de l’inflammation et de
récepteurs Toll (TLR2 et TLR4) dans leur FCG et leur salive par rapport à ceux des sujets
sains. De plus, ces taux sont en corrélation positive avec la quantité de certaines bactéries
parodontopathogènes dans la plaque dentaire sous-gingivale des individus et avec les
paramètres cliniques de la parodontite (profondeur moyenne des poches parodontales et
moyenne des pertes d’attache).
1.11 Objectifs du projet de recherche
Pour tester l’hypothèse énoncée ci-dessus, nous proposons de réaliser les objectifs
suivants :
Objectif 1 : Quantifier la charge en P. gingivalis, T. denticola et F. nucleatum dans la
plaque sous-gingivale d’un groupe de patients atteints de parodontite et d’un groupe de
sujets sains par la technique de PCR quantitative en temps réel.
Objectif 2 : Quantifier les taux d’IL-18, d’IL-1β, d’IL-10, de TNFα, de TLR2 et de
TLR4 solubles dans le FCG et dans la salive d’un groupe de patients atteints de parodontite
et de sujets sains.
22
Objectif 3 : Analyser les corrélations entre les paramètres cliniques, les taux de
cytokines, de TLRs et la charge bactérienne en P. gingivalis, T. denticola et F. nucleatum
chez les patients atteints de parodontite et des sujets sains.
1.12 Pertinence du projet
Les mesures cliniques de la maladie parodontale, basées sur la profondeur des poches
parodontales et la perte d’attache clinique, sont des données primordiales pour le diagnostic
et le contrôle de l’évolution de la maladie. Il est cependant impossible de déterminer l’état
de la maladie à un moment précis et de prédire son développement ou bien sa résolution.
Les paramètres biochimiques présents lors de l’inflammation et de la destruction du
parodonte ont sans doute un potentiel de fournir des informations sur les signes et le
développement de la maladie parodontale. La découverte d’indicateurs précoces de la
maladie, détectés dans divers échantillons biologiques de l’hôte, pourrait améliorer le
diagnostic et le traitement de la maladie parodontale. En effet, définir un marqueur présent
dans l'inflammation et la destruction tissulaire parodontale ayant une haute spécificité et
sensibilité parodontale, pourrait conduire à l’élaboration d’un nouvel outil diagnostique. Ce
dernier pourrait grandement guider les professionnels dentaires dans leur suivi de l’état de
santé parodontale de leurs patients. Nos résultats d’analyse des taux salivaire et créviculaire
des cytokines (IL-18, IL-1β, IL-10, TNFα) et des récepteurs TLR2 et TLR4, combinés à la
quantification de la charge bactérienne en P. gingivalis, T. denticola et de F. nucleatum
pourraient nous guider vers un indicateur potentiel de l’évolution de l’état de santé du
parodonte.
23
Chapitre 2
Méthodologie
2.1 Description de l’étude
L’étude réalisée dans le cadre du projet de maîtrise est une étude pilote sur un échantillon
de vingt patients atteints de parodontite et de vingt sujets au parodonte sain. Les données
épidémiologiques, parodontales, immunologiques et microbiologiques obtenues au moyen
d’un questionnaire, d’un examen parodontal, d’un prélèvement de plaque dentaire, de FCG
et de salive ont été répertoriées dans une base de données afin d’entreprendre les analyses.
La variable d’intérêt principale était la présence et la sévérité de la maladie parodontale
chez les sujets malades et les sujets sains. Ce projet a été préalablement approuvé par le
comité d’éthique de la recherche sur les humains de l’Université Laval.
2.2 Aspect légal et considérations éthiques
Une demande de participation à l’étude a été faite auprès de tous les sujets ayant répondu
aux divers critères de sélection établis. Une explication précise des objectifs de l’étude a été
donnée aux participants potentiels et une signature d’un consentement libre et éclairé
(Annexe 1) a été obtenue.
Ce projet de recherche a été approuvé par le Comité d’éthique de la recherche de
l’Université Laval pour sa conformité sur le plan déontologique. Le projet a été ajouté au
projet existant du Dr. Fatiha Chandad portant le numéro d’approbation 2010-023 / 23-04-
2010. Ce numéro a été renouvelé à l’été 2011 au comité d’éthique de recherche de
l’Université Laval et a permis la collecte des prélèvements jusqu’au mois de mai 2012.
Dans le but d’assurer la confidentialité des données, toutes les informations recueillies lors
de la collecte des données ont été compilées à l’aide d’un numéro d’identification et en
aucun cas, les noms des participants n’ont été divulgués, mentionnés ou écrits. Les dossiers
des sujets à l’étude ont été conservés à la clinique de parodontie de la Faculté de médecine
dentaire de l’Université Laval. Les échantillons prélevés lors de l’examen parodontal ont
été identifiés par un chiffre et conservés à -80°C jusqu’à leur analyse.
24
2.3 Population à l’étude et recrutement des sujets
Cette étude consistait à évaluer quarante sujets. Vingt patients adultes souffrant de
parodontite chronique généralisée, modérée ou sévère, représentaient le groupe malade.
Tous les participants à cette étude ont été recrutés à la clinique de parodontie de la Faculté
de médecine dentaire de l’Université Laval (Québec) entre janvier 2011 et février 2012. Un
groupe contrôle, constitué de vingt sujets adultes, présentant une santé parodontale
optimale, représentait le groupe sain. Les sujets du groupe contrôle étaient principalement
des étudiants et des membres du personnel, choisis au hasard, de la Faculté de médecine
dentaire de l’Université Laval.
2.4 Critères d’inclusion - Groupe malade
Les patients (es) devaient répondre aux critères d’inclusion suivants :
1) fréquenter la clinique de parodontie de l’Université Laval,
2) être âgés de 18 ans et plus,
3) avoir au moins vingt dents en bouche,
4) ne souffrir d’aucune maladie systémique,
5) ne prendre aucune médication pouvant affecter le parodonte,
6) avoir reçu un diagnostic de parodontite chronique généralisée, modérée à sévère suite à
leur examen parodontal complet et,
7) n’avoir reçu aucun traitement de parodontie durant les cinq dernières années précédant
le recrutement à l’étude.
2.5 Critères d’inclusion - Groupe contrôle
Les sujets du groupe contrôle devaient répondre aux critères d’inclusion suivants :
1) être âgés de 18 ans et plus,
2) avoir au moins vingt dents en bouche,
3) ne souffrir d’aucune maladie systémique,
4) ne prendre aucune médication pouvant affecter le parodonte
5) à l’examen parodontal partiel, les sujets ne devaient avoir aucun sondage > 3 mm et
aucune perte d’attache > 2 mm.
25
2.6 Critères d’exclusion
Lors de la sélection des patients, ont été exclus de l’étude, les patients :
1) les patients atteints d’une parodontite agressive,
2) les patients ayant été sous une antibiothérapie durant les trois mois précédant le
recrutement à l’étude ou nécessitant une antibiothérapie prophylactique,
3) les patients souffrant de maladies systémiques entraînant des problèmes parodontaux
(ex : diabète, VIH),
4) les patients ayant une déficience au niveau de la fonction des polymorphonuclaires telle
que la neutropénie cyclique, l’agranulocytose, le syndrome de Chediak-Higashi et la
gingivite ulcéro-nécrotique aiguë.
5) les patientes en période de gestation ou de lactation ne pouvaient pas participer à l’étude,
6) les patients immunosupprimés et ceux traités avec des médicaments ayant des
répercussions parodontales (antiépileptiques, bloqueur des canaux calciques,
immunosuppresseurs).
8) tous les patients dont l’état de santé était classé ASA III et + selon la classification de
l’état de santé de la Société Américaine des Anesthésistes (American Society of
Anesthesiologists) (Tableau 1), à la suite de l’administration du questionnaire médical,
ne pouvaient pas participer à l’étude.
2.7 Examen parodontal
Tous les sujets éligibles à l’étude devaient répondre à un questionnaire médical (Annexe 2)
et avoir un examen parodontal partiel. Toutes les mesures des examens parodontaux ont été
prises par un seul résident dentiste (Dr Guillaume Tremblay) sous la supervision des
cliniciens parodontistes de la Faculté de médecine dentaire (Université Laval). Les mesures
ont été effectuées avec une sonde parodontale graduée PCP127 (Hu-Friedy®, Chicago,
Etats-Unis).
2.7.1 Examen parodontal partiel pour fin de dépistage (PSR)
L’examen parodontal partiel a été fait à l’aide de l’indice de dépistage et notation en
parodontie PSR (de l’anglais Periodontal Screening and Recording) (Tableau 2). Cet
examen permet un dépistage parodontal simple, reproductible et efficace pour dresser un
26
portrait global de la santé parodontale [97]. Les sujets du groupe contrôle ont obtenu des
notations de « 0 » ou « 1 » dans tous les sextants, indiquant l’absence d’une perte d’attache
et donc l’absence de parodontite. Pour les sujets du groupe à l’étude, ils ont tous obtenu une
notation de « 4 » dans au moins un sextant. Un examen parodontal complet (Annexe 3) a
dû être effectué chez ces sujets afin d’établir le diagnostic de la maladie et la sévérité.
Tableau 1. Classification de l’état de santé selon la Société Américaine des Anesthésistes (ASA). Cette classification est utilisée en médecine et en médecine dentaire pour exposer l’état de la santé d’un patient. (Tableau adapté de Owen et al. en 1978 [96]).
Classification ASA
Note État de santé du patient
1 Patient normal, sans désordre systémique apparent
2 Patient souffrant d’un désordre systémique léger à modéré, bien contrôlé médicalement ou ayant un ou plusieurs facteurs de risque (grossesse, tabagisme)
3 Patient souffrant d’un désordre systémique relativement sévère limitant légèrement ses activités quotidiennes
4 Patient souffrant d’un désordre systémique sévère limitant considérablement ses activités quotidiennes et mettant constamment sa vie en danger
5 Patient moribond dont l’espérance de vie ne dépasse pas 24 heures 6 Patient déclaré en état de mort cérébrale dont on prélève les organes pour greffe
2.7.2 Examen parodontal complet
Les sujets dont l’examen parodontal de dépistage avait révélé une notation anormale (note
PSR ≥ 2), ont été soumis à un examen parodontal complet. Chaque dent a été sondée à six
endroits autour de la dent (mésio-buccal, buccal, disto-buccal, disto-lingual, lingual et
mésio-lingual). Les mesures ont été notées pour chacun des sites sur une charte
parodontale. Les récessions gingivales ont été évaluées à partir de la distance entre la
gencive marginale et la JEC. La perte d’attache est calculée en additionnant les mesures des
profondeurs des poches parodontales à celles des récessions. Les critères évalués au cours
de l’examen parodontal complet sont les suivants : nombre de dents absentes, la profondeur
des poches parodontales et la mesure des récessions gingivales (pour calculer la perte
d’attache). À la suite de l’examen parodontal complet, les patients ayant reçu un diagnostic
27
de parodontite chronique généralisée modérée à sévère, tout en répondant aux critères
d’inclusion, ont été inclus dans cette étude.
Tableau 2. Description des indices et notations de l’examen PSR. Cet examen de diagnostic est effectué dans le but de déceler la présence d’une maladie parodontale. Chaque note est attribuée par sextant, si une note excède la notation « 2 », un examen parodontal complet doit être fait et des traitements seront nécessaires (Adapté de Landry et al. [97])
Indice de dépistage et notation en parodontie (PSR) Note Signification
0 Aucun saignement, aucune poche parodontale de profondeur > 3,5 mm
1 Saignement au sondage (gingivite), aucune présence de tartre, aucune poche de profondeur > 3,5 mm
2 Saignement, présence tartre supra ou sous-gingival, aucune poche de profondeur > 3,5 mm
3 Saignement, présence de tartre supra ou sous-gingival, poche parodontale de profondeur de 4 à 5,5 mm
4 Saignement, présence de tartre, poche parodontale de profondeur de 6 mm et +
2.8 Prélèvements des échantillons biologiques
Comme l’examen de dépistage n’avait décelé aucune anomalie au niveau du parodonte
chez les sujets du groupe contrôle, l’examen parodontal complet et l’enregistrement des
diverses données cliniques sur une charte parodontale ont été effectués seulement pour le
groupe malade. Des prélèvements d’échantillons de salive, de FCG ainsi que de plaque
dentaire ont été réalisés dans cet ordre de citation pour les deux groupes à l’étude. Il faut
noter que pour chaque patient du groupe malade, tous les échantillons ont été prélevés
avant de débuter les traitements parodontaux spécifiques à chaque patient.
2.8.1 Prélèvement de salive
Tous les participants à l’étude ont fourni environ 5 ml de salive non stimulée. Cette
dernière a été recueillie dans un tube de polypropylène stérile de 50 ml. Pour effectuer le
prélèvement, les sujets étaient au repos, en position assise, la tête légèrement penchée et les
lèvres légèrement entrouvertes pour laisser écouler la salive. La salive a été immédiatement
congelée et entreposées à -80°C pour les analyses ultérieures. Au moment de la réalisation
28
des analyses, la salive a été décongelée et clarifiée par une étape de centrifugation à 400 x g
pendant 12 minutes. Les surnageants ont été utilisés pour les analyses de détection des
médiateurs de l’inflammation.
2.8.2 Prélèvement du FCG
Il a été rapporté que le prélèvement de FCG est une méthode fiable pour évaluer les
marqueurs de l’inflammation et pour évaluer la susceptibilité d’un individu à la maladie
parodontale [18,19]. Six sites de la bouche des sujets malades ont été identifiés sur la base de
la profondeur des poches parodontales au sondage et sur le degré d’inflammation clinique.
Indépendamment de la dent et de sa localisation en bouche, les six sites choisis étaient les
sites les plus atteints par la maladie en termes de destruction et d’inflammation. Les
échantillons de FCG pour le groupe malade ont été recueillis au niveau des poches
parodontales les plus profondes (≥ 6 mm) à l’aide d’une bandelette de papier buvard
(Whatman®) d’une dimension de 2 mm x 8 mm (Figure 5).
Chez les sujets sains, la bandelette a été installée au niveau du sulcus. Afin de standardiser
la sélection, les dents choisies chez tous les sujets sains ont été les dents numéro 16, 24, 36
et 44. Ces dents font parties des dents de l’indice de Ramfjord [98] utilisé pour évaluer
rapidement l’état parodontal global de la dentition.
Lors de la collecte du FCG, les sites ont été isolés de toute contamination par la salive avec
des rouleaux de coton stériles. La majorité de la plaque dentaire supra-gingivale se trouvant
au niveau du sulcus a été éliminée à l’aide d’un coton 2x2 stérile. La bande a ensuite été
insérée dans le sulcus pour une durée de 40 à 50 secondes. Une fois la bandelette retirée,
elle fut rapidement placée dans un tube stérile de 1,5 ml (Sarstedt, Montréal, Qc, CA)
contenant 250 µl de tampon PBS (10 mM, pH 7,2), additionné d’inhibiteurs de protéases
(Roche Applied Science®, Laval, Qc, Canada). Le tube a été congelée à -80°C pour les
analyses ultérieures.
2.8.3 Prélèvement de la plaque dentaire
Il a été montré que le prélèvement de la plaque dentaire, à l’aide d’un simple mouvement
de curette Gracey standard (Hu-Friedy®), dans une poche parodontale, était efficace pour
obtenir un échantillon contenant plus de 1x108 bactéries cultivables [15,16]. Entre 61 à 91%
29
des bactéries totales présentes dans la poche parodontale peuvent se retrouver dans la
plaque collectée à l’aide d’une curette, comparativement aux pointes de papier qui récoltent
entre 7 à 41% des bactéries réellement présentes [99]. Les échantillons de plaque dentaire ont
été obtenus à partir des sites opposés utilisés pour le prélèvement du FCG. La plaque sous-
gingivale chez les patients atteints de parodontite a été prélevée à l’aide d’une curette en
effectuant un seul mouvement ayant comme point de départ la base de la poche parodontale
(Figure 6). Chez les sujets sains, la plaque dentaire présente au niveau du sulcus a été
prélevée de manière similaire.
Figure 5. Photographie d’un prélèvement du FCG par capillarité. Une bandelette (Whatman®) absorbe le FCG chez un sujet du groupe sain (Photographie de ©Guillaume Tremblay).
Figure 6. Photographie d’un prélèvement de la plaque dentaire. Prélèvement chez un sujet sain à l’aide d’un simple mouvement d’une curette Gracey standard (Hu-Friedy®) (Photographie de ©Guillaume Tremblay).
30
Une fois la plaque dentaire recueillie, la curette a été secouée dans un tube de 1,5 ml à fond
conique stérile (Sarstedt), contenant 500 µl de tampon phosphate salin (PBS, 10 mM, pH
7,2) et additionné d’inhibiteurs de protéases (Complete protease inhibitor cocktail; Roche
Diagnostics®, Mississauga, ON, Canada). Une curette stérile a été utilisée pour chaque site.
Tous les prélèvements de plaque dentaire et de FCG ont été identifiés par un numéro pour
ensuite être conservés dans un congélateur à -80°C.
2.9 Préparation des prélèvements en vue des analyses
Pour la plaque dentaire, les prélèvements furent dégelés puis dispersés à l’aide d’un
appareil à ultrasons dans un bain de glace pendant 15 min. Tous les échantillons ont ensuite
été soumis à un traitement de dénaturation dans un bain marie à 100ºC pendant 10 min. Les
tubes contenant les bandelettes de FCG furent dégelés puis les bandelettes ont été éluées
par agitation rotative pendant une nuit à 4°C.
2.9.1 Espèces bactériennes de référence et conditions de culture
Les espèces bactériennes de référence utilisées dans cette étude étaient P. gingivalis ATCC
33277, T. denticola ATCC 35405 et F. nucleatum sous espèce nucleatum ATCC 25586. À
l’exception de T. denticola, les bactéries ont été cultivées dans un milieu Todd-Hewitt broth
(THB, BD Biosciences, Mississauga, ON, Canada) enrichi d’hémine (10 µg/ml) et de
vitamine K1 (1 µg/ml). L’espèce T. denticola a été cultivée dans un milieu spécifique pour
les spirochètes buccaux, selon le protocole décrit par Dawson et Ellen [100] et contenant du
BHI (Brain Heart Infusion, Sigma, St-Louis, MO, États-Unis) additionné d’acides gras
volatiles (acide isobutyrique, DL-2-méthylbutyrique, acide isovalérique, acide valérique
(0.001% [vol/vol])), d’acides aminées (L-cystéine hydrochloride et L-asparagine) et de 2%
de sérum de cheval inactivé à la chaleur. Les cultures bactériennes ont été incubées en
anaérobiose à 37ºC dans une atmosphère composée à 10% CO2, 10% H2 et 80% N2. Des
échantillons de cultures bactériennes ont été standardisés en termes de nombres de bactéries
par ml et ont été utilisés comme contrôles positifs pour chacune des amplifications par PCR
des bactéries cibles.
31
Analyse des échantillons biologiques 2.10 Quantification de P. gingivalis, T. denticola et F. nucleatum par la réaction en chaîne de la polymérase (PCR)
La réaction en chaîne de la polymérase (PCR) est une technique d’amplification sensible,
efficace et hautement reproductible. À partir d’un prélèvement complexe et peu abondant
d’un fragment spécifique d’acide désoxyribonucléique (ADN), il est possible d’obtenir un
grand nombre de copies de ce même fragment. Pour la réaction d’amplification de
fragments spécifiques de P. gingivalis, T. denticola et F. nucleatum, nous avons utilisé la
technique de PCR quantitative (qPCR) en temps réel et des amorces spécifiques à ces
bactéries cibles telles que décrites par Ashimoto et al. [101] (Tableau 3).
2.10.1 Procédure d’amplification par PCR quantitative
Des cultures pures de chacune des espèces à l’étude ont été préparées auparavant dans des
milieux de culture appropriés et ont servi de contrôle positif d’amplification et de standards
de référence pour la quantification des bactéries ciblées. Les bactéries de référence ont été
centrifugées à 8000 x g pendant 20 min, lavées 2 fois dans du tampon PBS et suspendues
dans le même tampon à une densité optique DO660 nm de 0,1.
Tableau 3. Séquences des amorces spécifiques utilisées pour la détection des bactéries parodontopathogènes dans les échantillons de plaque dentaire [101].
Résumé des amorces spécifiques utilisées
Espèces bactériennes Amorces spécifiques
P. gingivalis Pg-1 : 5'-TGT-AGA-TGA-CTG-ATG-GTG-AAA-ACC-3'
Pg-2 : 5'-ACG-TCA-TCC-CCA-CCT-TCC-TC-3'
T. denticola Td-1: 5'-TAA-TAC-CGA-ATG-TGC-TCA-TTT-ACA-3'
Td-2: 5'-TCA-AAG-AAG-CAT-TCC-CTC-TTC-TTC-TTA-3'
F. nucleatum Fn-400-1: 5'-AGA-GTT-TGA-TCC-TGG-CTC-AGA-3'
Fn-400-2: 5'-GTC-ATC-GTG-CAC-AGA-GAA-TTG-CTG-3'
Les échantillons de plaque dentaire ainsi que les contrôles positifs ont été portés à
ébullition pendant 10 min et conservés sur de la glace jusqu’à l’utilisation dans l’expérience
d’amplification par PCR. Les tests d’amplification par PCR ont été réalisés sans
32
purification d’ADN c.-à-d. 2 µl de chaque échantillon ont été directement ajoutés à 23 µl de
tampon mixte de la réaction d’amplification par PCR. Le système iQ ™ SYBR ® Green
supermix (Bio-Rad Laboratories©, Hercules, CA, États-Unis) a été utilisé dans toutes les
expériences d’amplification par PCR. L’instrument d’amplification était l’appareil Bio-Rad
CFX 96 Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories©, Hercules, CA, États-Unis). Brièvement,
chaque réaction d’amplification contenait un volume final de 25 µl du mélange réactionnel
de qPCR et lequel contenait 12,5 µl de 2 × iQ ™ SYBR ® Green Supermix (cat. no. 170-
8882, Bio-Rad Laboratories©), 1 µl de 0,4 µM d’amorce sens et 1 µl de 0,4 µM d'amorce
inverse, 2 µl d’échantillon à tester et 8,5 µl d'eau déminéralisée stérile. Tous les tests
d’amplification comprenaient un témoin négatif, dans lequel l'eau déminéralisée a été
substituée à l'échantillon bactérien. Le mélange iQ ™ SYBR ® Green Supermix est
composé de 0,4 mM de chaque dNTP, 50 U/ml de iTaq DNA polymerase, 6 mM MgCl2,
SYBR ® Green I, et 20 nM de fluorescéine. Les produits fluorescents ont été détectés après
une étape finale d'extension de chaque cycle. Tous les échantillons ont été testés en
duplicata.
La réaction d’amplification de P. gingivalis a été réalisée selon le protocole
suivant (Figure 7). Les conditions d’amplification de 35 cycles ont été débutées par une
phase de dénaturation à 95°C durant 3 min, suivie par une étape de dénaturation à 95°C
durant 10 secondes, une phase d’hybridation à 60°C durant 30 secondes puis une phase
d'élongation (ou polymérisation) à 72°C durant 30 secondes. L’analyse de la courbe de
fusion (Melting curve) a été produite à des intervalles de 0,2 secondes entre 65 à 95°C
suivis de l’incrémentation 0,5°C pendant 5 secondes.
Pour les bactéries F. nucleatum et T. denticola (Figure 8), les étapes d’amplification étaient
les mêmes que celles décrites pour P. gingivalis mais les températures, les temps et le
nombre de cycles variaient légèrement.
2.10.2 Dosage des cytokines IL-18, IL-1β, IL-10, TNFα, dans la salive et le FCG par ELISA
La technique ELISA permet de doser une substance ou une protéine spécifique dans un
échantillon biologique. Cette méthode utilise généralement deux anticorps. Le premier se
lie à l’antigène recherché, alors que le deuxième, couplé à une enzyme, reconnaît le
33
complexe antigène-anticorps. Le rôle de l’enzyme est de quantifier la présence du
complexe antigène-anticorps, soit par conséquent l’antigène qui est recherché.
Étape Température et temps 1 - 2 95.0°C pour 3 minutes - 95.0°C pour 10 secondes
3 60.0°C pour 30 secondes 4 - 5 72.0°C pour 30 secondes + Lecture de la plaque - 35 cycles
6 95.0°C pour 10 secondes 7 Courbe de fusion, 65 à 95°C suivie de l’incrémentation 0.5°C pour 5 secondes
Figure 7. Cycles d’amplification de P. gingivalis (Tirée du logiciel Bio-Rad Laboratories©).
Étape Température et temps 1 - 2 98.0°C pour 2 minutes - 98.0°C pour 10 secondes
3 60.0°C pour 10 secondes 4 - 5 72.0°C pour 30 secondes + Lecture de la plaque - 39 cycles
6 Courbe de fusion, 75 à 95°C suivie de l’incrémentation 0.2°C, 10 secondes Figure 8. Cycles d’amplification de F. nucleatum et T. denticola (Tirée du logiciel Bio-Rad Laboratories©).
34
Les concentrations des marqueurs présents dans la salive et le FCG ont été mesurées en
utilisant des trousses de détection de BioLegend ELISA Max™ (BioLegend©, San Diego,
CA, États-Unis) en suivant le protocole établi par le manufacturier. Brièvement, l’anticorps
monoclonal spécifique de la cytokine a été fixé dans le fond de puits d’une plaque de 96
puits. Une solution de blocage a été ajoutée pour éliminer les liaisons non spécifiques à
l’antigène. Après des lavages, les puits ont été incubés durant 90 minutes avec la salive ou
le FCG à la température ambiante. Après un second lavage, un anticorps secondaire de
détection marqué à la biotine a été ajouté. À la suite d’une incubation de 60 minutes et
d’un lavage, une enzyme, la peroxydase couplée à la streptavidine, et une solution de
révélation ont été ajoutés pour détecter la liaison antigène-anticorps. Les réactions ont été
arrêtées à l’aide d’une solution d'arrêt et l'absorbance a été mesurée à 450 nm en utilisant
un lecteur de microplaque. Des protéines recombinantes de chacune des molécules ciblées
avaient servi à établir des courbes standards. Tous les tests ont été réalisés en duplicata et
les résultats ont été exprimés en moyenne ± l’écart-type.
2.10.3 Dosage des TLRs (TLR2 et TLR4) dans la salive et le FCG
Les concentrations, salivaire et créviculaire, en récepteurs solubles TLR2 et TLR4 ont été
déterminées en utilisant des trousses de détection commerciales de la compagnie Creative
Biomart© (NY, États-Unis) et en suivant le protocole décrit par le manufacturier. Les
protéines recombinantes de chacune des molécules ciblées étaient fournies dans les trousses
pour l’établissement des courbes standards. Les trousses respectives utilisées sont la
Human TLR2 ELISA (CKERS-TLR2-891H) et la Human TLR4 ELISA (CKERS-TLR4-
897H).
2.11 Méthodes statistiques et plan de l’analyse des données
Les données démographiques et cliniques notées lors de l’examen des sujets sont
présentées en utilisant les moyennes et les valeurs standardisées. Toutes les expériences ont
été effectuées en duplicata et les résultats obtenus représentent les moyennes. Pour les
analyses statistiques de notre recherche, nous avons eu recours au Service de statistiques du
Département de mathématiques et statistiques de la Faculté des sciences et de génie de
l’Université Laval.
35
2.12 Analyses statistiques
La comparaison des sujets sains et malades au niveau du sexe a été réalisée par la méthode
du khi-deux (X2) de Pearson. Cette méthode statistique étudie la présence d’un lien entre
deux variables catégoriques. L’âge moyen de ces deux mêmes groupes a également été
comparé en utilisant le test de Student. Cette dernière méthode prend en compte l’âge
comme une variable continue. Les liens entre les concentrations de bactéries, de médiateurs
de l’inflammation dans le FCG ou dans la salive ainsi que les paramètres cliniques ont été
étudiés par l’analyse des corrélations de Pearson (valeur r). Les comparaisons des
concentrations des bactéries, des médiateurs dans le FCG et dans la salive, entre les sujets
du groupe sain et malade, ont été réalisées en utilisant la méthode d’analyse de variance
multivariée (MANOVA) à l’aide de la statistique lambda de Wilks. À la suite d l’obtention
d’un résultat significatif à cette analyse statistique, des tests univariés sont effectués sur
chacune des variables à l’aide du test de Student afin de détecter précisément la variable
statistiquement significative. Chez le groupe malade, les comparaisons des variables
biochimiques et cliniques chez les fumeurs et les non-fumeurs ont également été effectuées
par des analyses MANOVA et des tests de Student au besoin. L’analyse MANOVA permet
de déterminer si les facteurs qualitatifs entraînent des changements importants sur les
variables quantitatives. Dans une analyse MANOVA, le test de Fisher (valeur F) a
également été utilisé. Cette méthode détermine s’il existe des différences dans les
moyennes sur plusieurs variables entre les différents groupes. Le test a également été utilisé
pour les analyses de la variance univariée en corrigeant pour une covariable (ANCOVA) ou
sans correction pour une covariable (ANOVA). Ce test permet de déterminer s’il existe des
différences dans les moyennes sur plusieurs variables entre différents groupes.
L’interprétation des résultats a été effectuée au seuil de signification alpha = 10%, compte
tenu de la taille restreinte de l’échantillonnage et du caractère exploratoire de l’étude. Ainsi,
pour vérifier séparément la force des diverses associations, une probabilité d’erreur
(valeur p) inférieure à 0,10 (p ≤ 0,10) est déclarée statistiquement significative. Les
analyses statistiques ont permis d’obtenir les corrélations entre les paramètres cliniques, les
taux d’IL-18, IL-1β, IL-10, TNFα, TLR2 et TLR4 du FCG et de la salive ainsi que la
charge bactérienne en P. gingivalis, T. denticola et F. nucleatum chez les patients atteints
de parodontite et chez des sujets sains.
37
Chapitre 3
Résultats
3.1 Caractéristiques de la population à l’étude
Cette étude a évalué quarante sujets divisés en deux groupes : un groupe sain et un groupe
malade. Le groupe malade est constitué de vingt patients adultes atteints de parodontite
chronique généralisée modérée ou sévère. Le groupe sain comprend vingt sujets adultes
présentant une santé parodontale optimale. Tous les participants à l’étude ont été recrutés à
la clinique de parodontie de la Faculté de médecine dentaire de l’Université Laval selon des
critères décrits dans la section Méthodologie.
Le groupe malade est composé de 12 femmes et 8 hommes dont l’âge moyen est de
49,2 ans (27 à 68 ans). Le groupe sain comprend 11 femmes et 9 hommes dont l’âge moyen
est de 34,9 ans (19 à 57 ans) (Tableau 4). L’âge moyen chez le groupe sain est d’environ 14
ans plus jeune que celui du groupe malade. La répartition des sexes dans les deux groupes
est relativement similaire (p = 0,7491) avec une légère prédominance de femmes. Aucun
des sujets du groupe sain n’était fumeur au moment du recrutement. Chez le groupe
malade, sept sujets étaient fumeurs au moment de l’inclusion dans l’étude. Les sujets ayant
cessé de fumer six mois avant le début de l’étude ont été considérés non-fumeurs alors que
ceux ayant cessé de fumer moins de 6 mois avant leur recrutement à l’étude ont été
considérés fumeurs (Tableau 4).
3.2 Analyses des paramètres cliniques
Tous les sujets du groupe sain présentaient un PSR de 0 ou 1, c’est-à-dire un état
parodontal en santé. Plus précisément, tous les sujets présentaient des profondeurs de
sulcus variant de 2 à 3 mm et une absence de tartre sous-gingival. Pour le groupe atteint de
parodontite chronique généralisée modérée à sévère, tous les sujets présentaient des poches
parodontales de profondeur ≥ à 6 mm au niveau des six sites sélectionnés pour le
prélèvement de la plaque dentaire et du FCG. Les données concernant la localisation du site
de prélèvement de plaque et de FCG, la profondeur de la poche parodontale et la perte
d’attache clinique ont été notées pour chaque participant à l’étude. De plus, les moyennes
38
des profondeurs des poches parodontales et des pertes d’attache clinique ont été calculées
pour chaque sujet.
Tableau 4. Caractéristiques démographiques des sujets à l’étude.
Caractéristiques des sujets Groupe Contrôle N=20
Groupe Malade N=20
Variables démographiques
Âge (en années)
Sexe (homme/femme)
Tabagisme (non-fumeurs/fumeurs)
34,9 (19 à 57 ans)
9/11
0/20
49,2* (27 à 68 ans)
8/12
7/20
Paramètres cliniques
Moyenne PPP (mm)
Moyennes PAC (mm)
- (2 à 3)
0.0
8,25 (6 à 14)
8,55 (6 à 13)
* p < 0,1, significativement plus élevé que chez le groupe sain PPP : profondeur de la poche parodontale PAC : perte d’attache clinique
L’analyse des données mesurées cliniquement révèle que la moyenne des profondeurs de
poches parodontales (PPP) du groupe malade est de 8,25 mm (allant de 6 à 14 mm). La
marge d’erreur des mesures effectuées durant le sondage parodontal est de plus ou moins
1 mm correspondant à la graduation de la sonde parodontale. De plus, en mesurant les
récessions gingivales, nous pouvions calculer la perte d’attache clinique aux sites évalués.
La moyenne des pertes d’attache pour le groupe malade est de 8,55 mm (allant de 6 à
13 mm) (Tableau 4). Cette moyenne démontre qu’en plus des poches parodontales
profondes, la majorité des sujets avaient en plus des récessions gingivales qui excédaient la
JEC vers la racine.
3.3 Quantification des bactéries dans la plaque dentaire et la salive par qPCR Avant de procéder à la quantification des bactéries dans les échantillons de plaque dentaire
prélevés chez les sujets à l’étude, plusieurs mises au point ont été effectuées. Pour
déterminer la positivité d’une réaction d’amplification et quantifier les bactéries présentes
dans un échantillon par qPCR en temps réel, on a dû déterminer le nombre de cycles à
39
partir duquel le produit PCR est détectable. Le moment d’apparition de ce signal seuil
appelé «Seuil de cycle» ou Ct (Cycle threshold) est dépendant de la quantité de la matrice
initialement présente dans l’échantillon amplifié. Le Ct représente le nombre de cycles de
PCR où la quantité d’ADN de la bactérie recherchée permet aux sondes fluorescentes de
dépasser le seuil de la fluorescence établi par le programme CFX Manager™ software
(Bio-Rad Laboratories©). La valeur de Ct est mesurée au moment de la phase
exponentielle, au début de la réaction d’amplification, lorsque les réactifs ne sont pas
limités. Le Ct calculé est inversement proportionnel au logarithme décimal du nombre de
copies initiales de l’ADN recherché. Le résultat d’une PCR en temps réel est représenté
graphiquement sous une forme de courbes sigmoïdes. Une valeur de Ct entre 8 et 35 est
considérée valable. Si la valeur de Ct est inférieure à 8, ceci indique que la réaction contient
trop d’ADN ciblé et une valeur de Ct supérieure à 35 montre que la réaction n’en contient
pas assez.
Une valeur SQ (starting quantity) est calculée par le programme CFX Manager™ software
(Bio-Rad Laboratories©) et est exprimé en unité arbitraire (UA). Cette valeur, identifiée
pour chaque échantillon, a été utilisée pour produire les corrélations entre les différentes
variables à l’étude. La valeur de SQ est obtenue en comparant la valeur de Ct des
échantillons à celle des Ct de la courbe standard. Le résultat de l’analyse est la quantité
d’acides nucléiques représentant le nombre de copies du spécimen recherché par quantité
totale de l’échantillon. La quantification en temps réel est donc basée sur la relation entre la
quantité initiale de l’échantillon et la valeur de Ct obtenue lors de l’amplification. De plus,
l’analyse de la courbe de fusion permet d’identifier les différents produits de la réaction
qPCR. Dans notre étude, des courbes standard pour chacune des bactéries cibles (P.
gingivalis, T. denticola, F. nucleatum) ont été établies en utilisant la moyenne des Ct
obtenues et les différentes concentrations de cultures pures des bactéries cibles allant de 100
à 108 UFC/ml. Ces courbes ont montré une relation linéaire entre la valeur de Ct et les log
d’UFC présentes dans l’échantillon de culture pure de la bactérie (Figure 9). Le Tableau 5
représente un exemple de valeurs des Ct et SQ obtenus pour l’espèce P. gingivalis.
L’évaluation des courbes standards, représentées par le coefficient de corrélation (R2) est
importante pour évaluer la qualité du test de qPCR effectué. Les données des courbes
40
standard pour T. denticola, F. nucleatum sont similaires (résultats non présentés) avec des
valeurs de coefficients de corrélations respectives de R2 = 0,988 et R2 = 0,99.
Figure 9. Courbe standard obtenue par l’amplification des dilutions d’une culture pure de P. gingivalis (Tirée du logiciel Bio-Rad Laboratories©, Hercules, CA, États-Unis). Le coefficient de corrélation entre les Ct et la quantité de bactéries est R2 = 0,976. L’amplification de chaque dilution a été effectuée en duplicata.
3.4 Quantification des espèces P. gingivalis, T. denticola et F. nucleatum dans les échantillons de plaque dentaire
Les échantillons de plaque dentaire sous-gingivale provenant de 20 sujets sains et de 20
sujets atteints de parodontite ont été analysés par qPCR et les concentrations de bactéries
parodontopathogènes ciblées ont été déterminées par référence aux courbes standards des
cultures pures utilisées. Les premières analyses révèlent une prévalence de P. gingivalis de
90% et de 100% respectivement chez les sujets sains et les patients malades. F. nucleatum
est détectée chez tous les membres des deux groupes à l’étude. Cependant, T. denticola n’a
été détectée que chez les sujets malades (prévalence de 100%) alors qu’aucun sujet sain n’a
révélé la présence de cette bactérie. Les résultats de quantification des bactéries ciblées
obtenus par qPCR sont résumés dans le tableau 6 et la figure 10. La compilation des
données révèle que les sujets atteints de parodontite ont une plus grande charge bactérienne
que les sujets sains (Figure 10).
41
3.4.1 Chez les sujets sains
Pour P. gingivalis, les concentrations de bactéries détectées chez les sujets sains varient de
2,53 x 101 à 1,27 x 103 UFC/ml (Tableau 6). Les résultats nuls obtenus pour T. denticola
peuvent s’expliquer soit par l’absence totale de cette espèce bactérienne chez les sujets
sains ou bien par la présence d’une charge dont la valeur est en dessous du seuil de
détection de la technique de qPCR utilisée. Pour l’espèce F. nucleatum, des concentrations
relativement importantes ont été détectées et s’échelonnent de 6,33 x 102 UFC/ml à
2,68 x 105 UFC/ml (Tableau 6).
Tableau 5. Données d’amplification d’une culture pure de P. gingivalis ATCC 33277. Le tableau inclut les données du contrôle négatif (0 UFC/ml) et du contrôle positif (2,4 x 109 CFU/ml). La culture pure a été diluée en série par un facteur de 10.
Valeurs de Ct et SQ de la courbe de dilutions d’une culture pure de P. gingivalis ATCC 33277
Nom Cycle threshold (Ct) Starting Quantity (SQ)
Contrôle Positif 2,5 x 109 UFC/ml 1,77 2,93 x 1010
Contrôle Négatif (0 UFC /ml) 32,55 4,56 x 101
Standard 1
Dilution 1/10 10,02 1 x 108
Standard 2 Dilution 1/100 14,03 1 x 107
Standard 3 Dilution 1/1x103 17,47 1 x 106
Standard 4 Dilution 1/1x104 22,12 1 x 105
Standard 5 Dilution 1/1x105 25,4 1 x 104
Standard 6 Dilution 1/1x106 25,55 1 x 103
Standard 7 Dilution 1/1x107 31,53 1 x 102
42
3.4.2 Chez les patients atteints de parodontite
Chez les sujets du groupe malade, la charge bactérienne en P. gingivalis varie de 1,19 x 102
à 2,74 x 109 UFC/ml (Tableau 6). Contrairement à ce qui a été obtenu chez les sujets sains,
T. denticola est présente en grandes quantités chez les sujets malades. Les concentrations
de T. denticola obtenues varient de 2,90 x 101 à 2,23 x 109 UFC/ml (Tableau 6). Pour
l’espèce F. nucleatum, les concentrations bactériennes détectées varient entre 5,03 x 102 et
4,75 x 106 UFC/ml (Tableau 6).
Figure 10. Nombre de bactéries détectées par qPCR chez les sujets sains et malades. La figure démontre la différence entre le nombre de trois bactéries détectées chez les sujets sains (bleu) et malades (rouge) (Tirée de l’analyse de détection par qPCR).
3.5 Comparaison des charges bactériennes chez les groupes sain et malade Dans une première étape, des analyses MANOVA et des tests de Fisher (valeur F) ont été
utilisés pour comparer les concentrations des bactéries chez le groupe sain et le groupe
malade. Les résultats des analyses indiquent qu’il existe une différence significative pour
au moins une bactérie entre le groupe sain et le groupe malade (F = 8,16, dl = 3,36,
p = 0,0003) (Tableau 7). Ces résultats sont une étape initiale mais décisive pour la poursuite
des analyses statistiques plus approfondies.
43
Tableau 6. Concentrations de bactéries détectées par qPCR chez les sujets sains et les sujets malades (UFC/ml).
Bactéries
Moyenne des concentrations bactériennes (UFC/ml) Sujets sains Sujets malades
Valeurs de p Moyenne Intervalle Moyenne Intervalle
P. gingivalis 2,52 x 102 2,53 101
à 1,27 x 103
4,89 x 108 1,19 x 102
à 2,74 x 109
0,0683
T. denticola 0 - 2,87 x 108 2,90 x 101
à
2,23 x 109 0,0764
F. nucleatum 7,57 x 104 6,33 x 102
à 2,68 x 105
1,55 x 106 5,03 x 102
à
4,75 x 106 0,0003
Tableau 7. Comparaison des charges bactériennes chez les groupes sain et malade par les tests MANOVA et Fisher.
Probabilité de présence d’une différence entre les groupes sain et
malade en termes de charges bactériennes
MANOVA et tests de Fisher
Valeur F dl Valeur de p
8,16 3,36 0,0003* * La valeur p = 0,0003 indique l’existence d’une différence statistiquement significative pour au moins une espèce bactérienne entre les groupes sain et malade.
Afin de disséquer les différences existantes entre les moyennes des concentrations détectées
des trois espèces bactériennes chez les sujets des deux groupes, le test de Student a été
utilisé. Les résultats d’analyses montrent qu’il existe une différence statistiquement
significative entre les concentrations des bactéries P. gingivalis, T. denticola et
F. nucleatum retrouvées chez les sujets du groupe sain et celles détectées chez les sujets du
groupe malade. La valeur de p est inférieure à 0,1 pour P. gingivalis (p = 0,0683),
T. denticola (p = 0,0764) ainsi que pour F. nucleatum (p = 0,0003) (Tableau 6). Pour les
trois espèces cibles, les moyennes des charges bactériennes sont significativement plus
élevées chez les sujets malades que chez les sujets sains.
44
3.6 Dosage des médiateurs de l’inflammation IL-18, IL-1β, IL-10 et TNFα dans le FCG et la salive des sujets sains et des sujets atteints de parodontite
L’analyse des concentrations des médiateurs de l’inflammation IL-18, IL-1β, IL-10 et
TNFα dans le FCG et la salive des sujets sains et des sujets atteints de parodontite a été
effectuée par ELISA. Les résultats obtenus sont rapportés dans les tableaux 9 et 10. Puisque
les résultats des dosages d’IL-10 et TNFα étaient en dessous du seuil de sensibilité du test
ELISA chez tous les sujets sains et pour la majorité des sujets malades, les données pour
ces deux médiateurs ne sont pas incluses dans le tableau. Les concentrations sont
rapportées en pg/ml et la moyenne des duplicatas a été utilisée. La concentration minimale
détectable pour les médiateurs était 0,1 pg/ml pour le FCG et la salive.
3.6.1 Concentrations des médiateurs de l’inflammation chez le groupe sain
Chez les sujets sains, les médiateurs IL-10 et TNFα n’ont pas été détectés dans les
échantillons de FCG car la concentration détectée était inférieure au seuil de détection du
test (0,1 pg/ml). Les concentrations détectées d’IL-18 et d’IL-1β, variaient respectivement
de 1,1 à 67,7 pg/ml et de 0,5 à 13,5 pg/ml (Tableau 9).
Au niveau de la salive des sujets sains, de très faibles concentrations d’IL-10 et de TNFα
ont été détectées. Les quantités d’IL-10 varient de 0,1 à 0,4 pg/ml alors que celles du
TNFα, pour plus de la moitié des sujets sont inférieures au seuil de détection. La seconde
moitié des sujets sains qui étaient positifs pour le TNFα présentent des concentrations très
faibles allant de 0,1 et 0,3 pg/ml et un seul sujet atteint révèle une concentration de 1,9
pg/ml. À l’opposé, les concentrations d’IL-18 et l’IL-1β dans la salive des sujets sains, sont
plus importantes et varient respectivement de 1 à 93,2 pg/ml et de 0,2 à 37,2 pg/ml
(Tableau 10).
3.6.2 Concentrations des médiateurs de l’inflammation chez le groupe malade
Comme pour les sujets sains, les médiateurs IL-10 et TNFα dans le FCG n’ont pas été
détectés chez plus de la moitié des sujets atteints de parodontite, les valeurs obtenues étant
inférieures au seuil de détection du test utilisé (0,1 pg/ml). La moitié des échantillons du
45
groupe malade positifs pour l’IL-10 ont révélé des concentrations variant de 0,1 à 0,6
pg/ml. Pour le TNFα, un seul échantillon a révélé une concentration au-dessus du seuil de
détection soit 2 pg/ml (résultats non présentés). Concernant l’IL-18 et l’IL-1β, les
concentrations détectées dans le FCG varient de 5,9 à 418,9 pg/ml pour l’IL-18 et de 7,7 à
351 pg/ml pour l’IL-1β (Tableau 9).
Les mêmes médiateurs de l’inflammation ont été évalués dans les échantillons de salive du
groupe malade. Les concentrations détectées d’IL-10 et de TNFα sont très faibles et varient
respectivement de 0 à 3,3 pg/ml et de 0,1 à 1,2 pg/ml. Un seul sujet révèle une
concentration de 7,2 pg/ml pour le TNFα (résultats non présentés). Les concentrations
détectées d’IL-18 variaient entre 3,4 et 679,7 pg/ml alors que celles de l’IL-1β variaient de
3,3 à 317,4 pg/ml (Tableau 10). En raison des faibles concentrations et de la faible
prévalence du TNFα et de l’IL-10 détectées chez les deux groupes, ces médiateurs sont
exclus des analyses statistiques.
3.7 Concentrations des récepteurs TLR2 et TLR4 dans le FCG et la salive Tous les échantillons de salive et de FCG des groupes sain et malade testés n’ont révélé
aucune valeur positive pour le récepteur TLR2 soluble. Ces résultats peuvent être expliqués
soit par l’absence de ce récepteur dans les échantillons analysés soit par sa présence à des
niveaux inférieurs au seuil de détection de la trousse ELISA utilisée (0,312 ng/ml).
Quant au récepteur TLR4 soluble, les concentrations de ce récepteur ont été dosées en
duplicata dans les échantillons de FCG et de salive des deux groupes à l’étude. La limite de
détection de la trousse ELISA était de 0,04 ng/ml. Chez le groupe sain, TLR4 a été détecté
dans le FCG à des concentrations de 1,2 à 8,3 ng/ml (Tableau 9) et à des concentrations
relativement plus élevées dans la salive variant de 3,1 à 11,5 ng/ml chez le même groupe
(Tableau 10). Chez les sujets malades, les concentrations de TLR4 varient entre 3,3 et 15
ng/ml dans le FCG (Tableau 9) et de 1 à 12,8 ng/ml dans la salive (Tableau 10).
3.8 Analyses statistiques comparatives des concentrations des médiateurs de l’inflammation et du récepteur TLR4 chez les deux groupes à l’étude
Dans une première étape, les différences entre les concentrations des médiateurs de
l’inflammation IL-18, IL-1β et du récepteur TLR4 chez les groupes sain et malade ont été
analysées à l’aide de la statistique lambda de Wilks. Les résultats obtenus montrent des
46
valeurs de p < 0,1 indiquant ainsi l’existence d’une différence significative pour au moins
un médiateur de l’inflammation entre le groupe sain et le groupe malade autant au niveau
du FCG (p = 0,0158) que de la salive (p = 0,0436) (Tableau 8).
Tableau 8. Comparaison des concentrations des médiateurs de l’inflammation présents dans le FCG et la salive chez les groupes à l’étude.
Probabilité de différence entre les concentrations des médiateurs détectés dans le FCG et la salive chez les groupes sain et malade
Test MANOVA et test de Fisher, hypothèse : aucun effet du groupe
Valeur F dl Valeur de p
FCG 3,52 5,24 0,0158*
Salive 2,73 5,24 0,0436*
Les valeurs de p = 0,0158 pour le FCG et de p = 0,0436 pour la salive indiquent l’existence de différences statistiquement significatives pour au moins un médiateur entre les sujets des groupes sain et malade.
L’analyse comparative, à l’aide du test de Student, des moyennes des concentrations de
chacun des médiateurs du groupe sain et du groupe malade, autant dans le FCG que dans la
salive, révèle des valeurs de p < 0,1 (Tableau 9 et 10) et des différences statistiquement
significatives. Les sujets atteints de parodontite ont des concentrations plus élevées d’IL-
18, d’IL-1β et de TLR4 que les sujets sains.
Tableau 9. Comparaison des concentrations des médiateurs de l’inflammation dans le FCG chez les groupes sain et malade.
Moyennes des concentrations des médiateurs dans le FCG chez les groupes sain et malade
Médiateur Groupe Moyenne Minimum Maximum Valeur de p
IL-18 (pg/ml)
Malade 87,84 5,90 418,90 0,0868 Sain 22,21 1,10 67,30 IL-1β
(pg/ml) Malade 133,20 7,70 351,00 0,0003 Sain 4,74 0,50 13,50
TLR4 (ng/ml)
Malade 8,02 3,29 14,98 0,0025 Sain 5,08 1,22 8,32
47
Tableau 10. Comparaison des moyennes des concentrations des médiateurs de l’inflammation dans la salive des groupes sain et malade.
Moyennes des concentrations des médiateurs dans la salive chez les groupes sain et malade
Médiateur Groupe Moyenne Minimum Maximum Valeur de p
IL-18 (pg/ml)
Malade 135,60 3,40 679,70 0,0550 Sain 30,58 1,00 93,20 IL-1β
(pg/ml) Malade 77,70 3,30 317,40 0,0332 Sain 7,60 0,20 37,20
TLR4 (ng/ml)
Malade 4,89 1,025 12,77 0,1088 Sain 6,28 3,12 11,54
3.9 Analyses de corrélations entre la charge bactérienne et la concentration des médiateurs de l’inflammation dans le FCG et la salive des sujets sains
Des analyses de corrélations entre les charges bactériennes et les concentrations des
médiateurs de l’inflammation ont été réalisées en calculant le coefficient de corrélation «r»
de Pearson. Ces analyses n’ont pas révélé de corrélation (ni positive ni négative) entre les
charges bactériennes et les concentrations des médiateurs détectées dans le FCG chez les
sujets sains (Tableau 11). Au niveau de la salive, la probabilité est inférieure à 0,1 pour
l’IL-18 et la bactérie F. nucleatum (r = 0,61868, p = 0,0565). Pour les médiateurs IL-1β,
TNFα et le récepteur TLR4, il ne semble y avoir aucun lien entre les concentrations des
bactéries et celles des médiateurs dans la salive chez les sujets sains (Tableau 12).
3.10 Corrélations entre les charges bactériennes et les paramètres cliniques parodontaux des sujets malades
Les calculs des coefficients de corrélation entre les charges bactériennes et les paramètres
cliniques mesurés chez les sujets atteints de parodontite n’ont révélé aucune corrélation
entre les quantités des trois espèces bactériennes cibles et les mesures des profondeurs de
poches ou celles de la perte d’attache clinique (Tableau 13). Les coefficients de corrélations
ne montrent pas des corrélations statistiquement significatives à ce niveau.
48
Tableau 11. Corrélations entre les charges bactériennes et les concentrations des médiateurs dans le FCG du groupe sain.
Corrélations entre les charges bactériennes et les concentrations de médiateurs du FCG des sujets sains
Médiateur P. gingivalis F. nucleatum Valeur de r* Valeur de p* Valeur de r Valeur de p
IL-18 -0,139 0,7003 0,49780 0,1431
IL-1β -0,198 0,5819 0,14094 0,6977
TLR4 0,113 0,6346 -0,28069 0,2306
* Les valeurs de r et p sont nécessaires pour déterminer la présence ou l’absence de corrélations potentielles entre les variables.
Tableau 12. Corrélations entre les charges bactériennes et les concentrations des médiateurs de la salive du groupe sain.
Corrélations entre les charges bactériennes et les concentrations de médiateurs de la salive des sujets sains
Médiateur P. gingivalis F. nucleatum Valeur de r Valeur de p Valeur de r Valeur de p
IL-18 0,187 0,6049 0,61868* 0,0565*
IL-1β -0,075 0,8366 -0,21438 0,5520
TLR4 -0,005 0,9827 -0,00523 0,9825
* Les valeurs de r et p sont nécessaires pour déterminer la présence ou l’absence de corrélations potentielles entre les variables.
3.11 Corrélations entre les concentrations des médiateurs de l’inflammation et les paramètres cliniques parodontaux des sujets malades
Les mesures de la profondeur des poches parodontales et de la perte d’attache des sujets du
groupe malade ont également été analysées pour la présence ou l’absence d’une corrélation
avec les concentrations des médiateurs détectées dans le FCG et la salive. Au niveau du
FCG, les analyses révèlent des corrélations statistiquement significatives entre les
moyennes des profondeurs de poches parodontales et les concentrations d’IL-1β
(r = 0,4873, p = 0,0293). Cette valeur de «p» signifie que plus les profondeurs des poches
sont grandes plus les concentrations d’IL-1β sont élevées. Une corrélation positive entre les
49
moyennes des pertes d’attache et les concentrations de TLR4 est également observée
(r = 0,3938, p = 0,0858) (Tableau 14).
Tableau 13. Corrélations entre les charges bactériennes et les paramètres cliniques parodontaux des sujets malades.
Corrélations entre les charges bactériennes et les paramètres cliniques parodontaux des sujets malades
Mesures en mm P. gingivalis T. denticola F. nucleatum
Valeur de r
Valeur de p
Valeur de r
Valeur de p
Valeur de r
Valeur de p
Profondeur des poches -0,19 0,43 0,0596 0,8028 0,17593 0,4581
Perte d’attache clinique -0,23 0,33 0,11164 0,6394 0,20484 0,3863
Pour la salive, les analyses montrent l’existence d’une corrélation entre la concentration
d’IL-1β et la profondeur des poches (p < 0,1) et également avec la perte d’attache clinique
(Tableau 15). Une corrélation similaire est également observée entre la concentration de
TLR4 et la profondeur des poches parodontales (r = 0,3789, p = 0,0995) (Tableau 15).
Tableau 14. Corrélations entre les concentrations des médiateurs de l’inflammation du FCG et les paramètres cliniques parodontaux des sujets malades.
Corrélations entre les concentrations des médiateurs de l’inflammation du FCG et les paramètres cliniques parodontaux des sujets malades
Mesures en mm IL-18 IL-1β TLR4
Valeur de r
Valeur de p
Valeur de r
Valeur de p
Valeur de r
Valeur de p
Profondeur des poches
0,34 0,15 0,49 0,0293 0,3208 0,1679
Perte d’attache clinique
0,29 0,22 0,36 0,1149 0,3938 0,0858
50
Tableau 15. Corrélations entre les concentrations des médiateurs de l’inflammation de la salive et les paramètres cliniques parodontaux des sujets malades.
Corrélations entre les concentrations des médiateurs de l’inflammation de la salive et les paramètres cliniques parodontaux des sujets malades
Mesures en mm IL-18 IL-1β TLR4
Valeur de r
Valeur de p
Valeur de r
Valeur de p
Valeur de r
Valeur de p
Profondeur des poches
-0,04 0,86 0,41 0,0698 0,38 0,0995
Perte d’attache clinique
-0,05 0,84 0,43 0,0603 0,29 0,2085
3.12 Analyse de l’effet du tabagisme sur les paramètres cliniques parodontaux, microbiologiques et inflammatoires chez les sujets fumeurs et non-fumeurs du groupe malade
Des analyses de l’effet de la consommation du tabac sur les paramètres cliniques
parodontaux, sur les concentrations de bactéries et de médiateurs de l’inflammation du
FCG et de la salive, ont été effectuées en comparant les différentes variables des sujets
fumeurs et non-fumeurs cliniques, microbiologiques et inflammatoires. Le groupe des
sujets sains ne comprenait aucun participant fumeur alors que le groupe des patients atteints
de parodontite comprenait 7 sujets fumeurs et 13 non-fumeurs.
Des analyses statistiques des paramètres cliniques parodontaux (profondeur de poche
parodontale, perte d’attache clinique) révèlent que, dans le groupe malade, la moyenne des
profondeurs de poches parodontales chez les fumeurs (moyenne PPP = 7,09 mm) est
légèrement plus faible que celle des sujets non-fumeurs (moyenne PPP = 8,87 mm)
(Tableau 16). De manière similaire, la moyenne des mesures de pertes d’attache chez les
fumeurs est plus faible (moyenne PAC = 7,12 mm) que celle des non-fumeurs (moyenne
PAC = 9,32 mm) (Tableau 16). Ces différences semblent statistiquement significatives chez
le groupe malade (p < 0,1) (Tableau 16).
L’effet du tabagisme sur les concentrations de bactéries et de médiateurs de l’inflammation
détectées chez les sujets malades a également été analysé. Dans une première étape, le test
de lambda de Wilks a montré que les concentrations moyennes des bactéries étaient
similaires chez les fumeurs et les non-fumeurs (p = 0,7333). De plus, les moyennes des
51
concentrations de médiateurs de l’inflammation détectés étaient comparables chez les
fumeurs et les non-fumeurs autant dans le FCG (p = 0,4643) que dans la salive (p = 0,6807)
(Tableau 17). Ainsi, aucun test univarié n’a été fait car aucun test multivarié n’était
significatif.
Tableau 16. Comparaison des paramètres cliniques parodontaux des patients fumeurs et non-fumeurs du groupe malade.
Comparaison des paramètres cliniques parodontaux des patients fumeurs et non-fumeurs du groupe malade
Mesures en mm Tabagisme Moyenne Écart type Minimum Maximum Valeur
de p Profondeur des
poches Non-fumeur 8,87 1,19 7,50 10,83 0,0035 Fumeur 7,09 1,00 6,00 8,83
Perte d’attache clinique
Non-fumeur 9,32 1,73 6,83 12,33 0,0059 Fumeur 7,12 0,90 6,17 8,50 Les valeurs de p < 0,1 autant pour la profondeur des poches (p = 0,0035) que pour la perte d’attache (p = 0,0059) indiquent qu’il y a une différence statistiquement significative entre ces deux sous-groupes. Tableau 17. Comparaison des paramètres microbiologiques et inflammatoires chez les sujets fumeurs et non-fumeurs du groupe malade.
Probabilités de l’existence de différence entre les fumeurs et les non-fumeurs du groupe malade au niveau des charges bactériennes et des médiateurs de
l’inflammation dans le FCG et la salive Test MANOVA et tests de Fisher, Hypothèse : aucun effet du tabagisme
Valeur F dl Valeur de p Concentrations des bactéries
(P. g, T. d et F. n) 0,43 3,16 0,7333*
Médiateurs - FCG 0,98 5,14 0,4643* Médiateurs - Salive 0,63 5,14 0,6807*
* Les valeurs de p supérieures à la valeur seuil de 0,1 indiquent qu’il n’existe pas de différences statistiquement significatives entre les fumeurs et les non-fumeurs en termes de charges bactériennes et de médiateurs inflammatoires.
53
Chapitre 4
Discussion
Cette étude avait pour but de vérifier les hypothèses que 1) les patients atteints de
parodontite possèdent des concentrations élevés de médiateurs de l’inflammation et de
récepteurs Toll (TLR2 et TLR4) dans le FCG et la salive par rapport à celles des sujets
sains; et 2) que ces concentrations sont en corrélation positive avec la quantité de bactéries
parodontopathogènes et avec les paramètres cliniques parodontaux chez ces mêmes
patients.
Afin de vérifier ces hypothèses, nous avons analysé des paramètres cliniques parodontaux,
microbiologiques et inflammatoires dans le FCG et la salive d’une cohorte de vingt sujets
ayant un parodonte sain et vingt sujets atteints de parodontite. Les analyses des paramètres
cliniques parodontaux ciblaient les profondeurs de poches parodontales et les récessions
gingivales. Les analyses microbiologiques ciblaient la détection des espèces bactériennes
P. gingivalis, T. denticola et F. nucleatum de la plaque sous-gingivale et les analyses
inflammatoires consistaient à doser des cytokines (IL-1β, IL-10, IL-18 et TNFα) et des
récepteurs solubles de la famille des Toll (TLR2 et TLR4) dans le FCG et la salive.
Le groupe sain comptait 11 femmes et 9 hommes alors que le groupe malade était composé
de 12 femmes et 8 hommes. Les sujets du groupe contrôle sont en moyenne de 14 années
plus jeunes que les sujets du groupe malade. Cet écart était prévisible puisque la
parodontite chronique affecte en général les individus plus âgés de la population et sa
prévalence augmente avec l’âge. L’étude de Papapanou [102] parue en 2012 a analysé la
prévalence de la maladie parodontale chez les adultes aux États-Unis à l’aide des résultats
obtenus en 2009-2010 par le NHANES (National Health and Nutrition Examination
Survey). L’examen parodontal de la totalité de la bouche des sujets permet à ces données
d’être les plus représentatifs de toutes les études épidémiologiques existantes. La
prévalence globale de la maladie parodontale chez les adultes de 30 ans et plus est de
47,2% [10]. De manière générale, la prévalence de la parodontite modérée augmente avec
l'âge chez les adultes variant de 24,4% chez les adultes âgés de 30 à 34 ans à 70,1% chez
les adultes de 65 ans et plus. Cependant, la prévalence de la parodontite sévère demeure
54
relativement constante à moins de 15% et ce, peu importe le groupe d’âge [10] ciblé. La
consommation de tabac n’était pas un critère d’exclusion du recrutement à l’étude puisque
la prévalence des patients atteints de parodontite et fumeurs est très élevée parmi la
population malade qui fréquente la clinique de parodontie de la Faculté de médecine
dentaire (Université Laval). Ainsi, 35% des sujets du groupe malade étaient fumeurs et
s’approchent des données statistiques affirmant que le tiers de la population utilise le
tabac [103]. Il est connu que le tabagisme est un facteur de risque significatif dans le
développement de la maladie parodontale [103]. Cet usage supprime les réponses
inflammatoire et immunitaire, ce qui peut contribuer à augmenter la susceptibilité à la
maladie parodontale chez les fumeurs. Ainsi, il est important d’identifier l’effet potentiel du
tabagisme sur les variables étudiées au cours de cette étude.
4.1 Analyses microbiologiques
Au cours de cette étude, nous avons évalué la présence et la quantité de trois bactéries
parodontopathogènes (P. gingivalis, T. denticola et F. nucleatum), fortement associées à
l’étiopathogenèse de la parodontite [15], chez le groupe sain et le groupe atteint de
parodontite, en utilisant la technique de qPCR. Les espèces P. gingivalis et F. nucleatum
ont été détectées autant chez les sujets sains que malades, alors que l’espèce T. denticola
n’a été détectée que chez le groupe malade. Les résultats de cette étude montrent que les
sujets atteints de parodontite chronique abritent des quantités significativement plus élevées
des trois bactéries parodontopathogènes étudiées que les sujets sains. Ces données
confirment celles déjà rapportées dans de multiples précédentes études [17,18,104]. Braga et
al. [105] rapportent des résultats similaires à ceux de la présente étude en détectant P.
gingivalis autant chez des sujets sains que chez des sujets atteints de parodontite chronique
généralisée sévère et les quantités bactériennes étaient plus importantes chez le groupe
malade.
La composante inflammatoire est actuellement reconnue comme un facteur étiologique de
la parodontite aussi important que la composante bactérienne. Durant la dernière décennie,
de multiples études ont disséqué la réponse immuno-inflammatoire développée au cours
des parodontites. Plusieurs facteurs cellulaires, moléculaires et génétiques ont été analysés
chez des cohortes de patients atteints de différentes formes de parodontite [54]. Plusieurs
55
médiateurs de l’inflammation incluant des cytokines, des chémokines et des facteurs de
croissance ont été étudiés en relation avec l’état de santé ou de maladie parodontale.
Cependant, l’IL-18 et les récepteurs Toll n’ont été que très peu étudiés dans ce contexte. La
présente étude s’est penchée spécifiquement sur ces deux composantes associées à
l’immuno-inflammation. Deux sources de facteurs inflammatoires ont été utilisées, soit le
FCG et la salive. Les concentrations des médiateurs de l’inflammation
IL-1β, IL-10, IL-18 et TNFα et les récepteurs TLR2 et TLR4 de la famille des Toll, ont été
analysés. Les deux cytokines IL-10 et TNFα ont montré des niveaux et des prévalences très
faibles autant dans le FCG que dans la salive chez les deux groupes à l’étude. Ces deux
médiateurs ont été exclus des analyses statistiques subséquentes. Ces faibles concentrations
de ces cytokines sont en accord avec les données de plusieurs études récentes, utilisant des
technologies très sensibles et rapportant des valeurs très faibles ou en dessous des limites
de détection des outils utilisés [106,107].
Cependant, il faut noter que la littérature rapporte également plusieurs études avec des
niveaux très variés de ces cytokines qui atteignent parfois plusieurs nanogrammes [108,109].
Parmi ces études, certains auteurs ont associé le TNFα et l’IL-10 au développement de la
parodontite en suivant les variations des concentrations de ces médiateurs entre les sujets
sains et malades durant les diverses phases de traitement de la parodontite. Cependant
aucun consensus ne peut être établi à ce sujet [62]. Ces divergences entre les études peuvent
être attribuées à l’histoire de la santé systémique des sujets recrutés, aux origines
géographiques et potentiellement aux méthodes et outils d’analyses utilisés. De plus, les
niveaux élevés de TNFα et d’IL-10 où les ARNm ont été quantifiés se basaient sur des
analyses d’échantillons sanguins ou de biopsies gingivales [62].
La littérature est très riche en travaux sur le rôle des cytokines dans l’étiologie et la
pathogenèse des maladies parodontales. Cependant, très peu d’études existent sur le rôle de
l’IL-18 dans le contexte de cette pathologie. Récemment, Pradeep et al. [110] rapportaient un
rôle potentiel de l’IL-18 dans la stimulation de la sécrétion de MMPs (MMP-9) et d’IL-1β,
deux médiateurs possédant des effets proinflammatoires et impliqués dans le processus de
dégradation tissulaire [70]. Cette potentielle relation entre l’IL-18,
l’IL-1β et la maladie parodontale a retenu notre intérêt dans la présente étude. Les dosages
de ces deux médiateurs ont révélé une différence statistiquement significative entre les deux
56
groupes à l’étude en termes de concentrations de ces deux cytokines autant dans le FCG
que dans la salive. Les concentrations de ces deux cytokines sont plus élevées chez les
sujets atteints de parodontite chronique. Ces résultats sont similaires à ceux rapportés par
d’autres études [62,65,68]. En effet, les concentrations d’IL-18 rapportées dans l’étude de
Johnson et Serio [65] étaient plus élevées dans les poches parodontales avec une profondeur
supérieure à 6 mm comparativement à celles mesurées dans des échantillons de FCG
provenant de sulcus de sites sains. De plus, les taux d’IL-18 identifiés dans l’étude de
Figueredo et al. [68] étaient également plus élevés chez les patients atteints de parodontite
chronique par rapport aux concentrations détectées chez des patients atteints de gingivite.
L’inflammation et l’immunité innée sont deux processus qui se chevauchent au cours d’une
réponse à une agression bactérienne. Depuis la découverte des motifs associés aux
pathogènes (PAMPs), les récepteurs TLRs à ces signaux ont reçu une attention
grandissante. Dans le contexte des maladies parodontales, très peu d’études se sont
penchées sur le dosage de ces récepteurs in vivo. Dans le cadre de cette étude, nous avons
dosé les niveaux de TLR2 et TLR4 solubles dans la salive et le FCG de sujets sains de
patients atteints de parodontite [111]. Aucune trace de TLR2 n’a été détectée chez les sujets
des deux groupes à l’étude malgré la grande sensibilité de la trousse de détection utilisée.
Ces données sont en accord avec celles rapportées par Prakasam et Srinivasan [111] qui
rapportent également que TLR2 n’est pas détecté chez les sujets malades, cependant son
taux augmente chez les patients au cours du traitement de la maladie par détartrage et
surfaçage radiculaire.
Concernant le récepteur TLR4, les analyses n’ont pas révélé de différences entre les
concentrations de ce récepteur dans la salive chez les deux groupes sain et malade.
Cependant, une différence statistiquement significative est observée entre les deux groupes
sain et malade au niveau des concentrations de TLR4 dans le FCG (Tableau 9). Ces
résultats sont en opposition, du moins pour la salive, de ceux rapportés par
Buduneli et al [112]. Cette étude avait cependant exclu tous les sujets fumeurs pour éliminer
toutes les interactions possibles entre le tabagisme et les concentrations de TLR. Notre
étude ne pouvait éliminer les sujets fumeurs en raison du nombre déjà restreint des sujets de
la cohorte. L’effet du tabagisme sur la sécrétion des TLRs dans le FCG n’a pas été
clairement analysé mais l’étude de Fatemi et al. [113] sur des biopsies de tissu gingival a
57
suggéré que le tabagisme chez les sujets atteints de parodontite pourrait augmenter
d'environ 6,5 fois l’expression de l’ARNm de TLR4 dans la gencive [113]. Le peu d’études
rapportées dans la littérature ne permettent pas à ce jour de confirmer l’existence d’une
relation entre le tabagisme et l’expression des TLR2 et TLR4. Des données controversées
ont été également rapportées au sujet d’une diminution de l'expression des TLR2 par les
macrophages soumis à la présence de composés dérivés du tabac [114].
Le FCG semble donner un portrait plus précis des concentrations des médiateurs de
l’inflammation de la parodontite que celles retrouvées dans la salive si on se réfère à la
différence statistiquement significative détectée au niveau des concentrations de TLR4 dans
le FCG. La salive semble représenter un milieu plus dilué en raison des nombreuses
composantes qui la constitue. Le type et l’origine du prélèvement pourraient donner une
idée plus spécifique de l’inflammation gingivale et des marqueurs présents.
Les analyses de corrélations entre les quantités de bactéries détectées et les concentrations
de médiateurs de l’inflammation du FCG chez les sujets sains ont révélé une corrélation
négative entre les taux d’IL-18 et les quantités de T. denticola (r = 0,64846, p = 0,0425) et
une corrélation positive entre cette même cytokine et les quantités de F. nucleatum
(r = 0,61868, p = 0,0565) (Tableau 12). On pourrait en déduire que la présence d’une
grande concentration de T. denticola causerait une diminution de la concentration d’IL-18,
probablement causée par les activités protéolytiques de ce cette bactérie. Cependant,
l’inverse pourrait se produite en présence de l’espèce F. nucleatum dont l’augmentation de
la concentration induirait une augmentation de la sécrétion d’IL-18 par les cellules du
parodonte.
Chez les sujets sains, la présence des bactéries P. gingivalis et F. nucleatum semble induire
l’augmentation des concentrations de la cytokine IL-18 alors que la présence de la bactérie
T. denticola semble correspondre à une diminution des concentrations d’IL-18. Pour les
médiateurs IL-1β et TLR4, aucune corrélation ne semble exister entre la charge bactérienne
et la concentration de ces dernières composantes dans la salive des sujets sains. Bien que
les sujets sains ne présentent pas de signe d’inflammation parodontale, la faible présence
d’une bactérie parodontopathogène semble pouvoir faire varier les concentrations de
certains médiateurs de l’inflammation même si aucun paramètre clinique ne permet
58
d’identifier un état inflammatoire. On peut supposer que dans ces conditions, on est en
présence d’un état d’équilibre hôte-microorganisme compatible avec un état de santé. Les
faibles concentrations tant au niveau des bactéries que des médiateurs retrouvés chez les
sujets sains, ne sont pas suffisantes pour entraîner une modification du système immunitaire
et l’établissement d’une condition inflammatoire.
Curieusement, le même processus de corrélation chez les sujets atteints de parodontite n’a
pas permis d’établir un lien entre les bactéries P. gingivalis, T. denticola et F. nucleatum et
les médiateurs de l’inflammation étudiés tant dans le FCG que dans la salive. On peut
supposer que l’augmentation de la charge bactérienne en bactéries parodontopathogènes
chez les sujets malades entraîne certes des augmentations au niveau des médiateurs, mais
aucune association claire entre une bactérie et un médiateur ne semble être spécifique à la
maladie. Notre hypothèse de départ favorisant une corrélation positive entre les trois
bactéries parodontopathogènes et les concentrations d’IL-18, IL-1β, IL-10, TNFα et TLR4
ne peut être affirmée.
4.2 Corrélations entre les bactéries et les paramètres cliniques chez les sujets malades
Au cours de cette étude, nous avons tenté d’analyser le lien entre la sévérité de la maladie
d’un point de vue clinique et les concentrations des bactéries retrouvées dans la plaque
dentaire sous-gingivale. Nos analyses ne révèlent pas de lien entre les concentrations des
bactéries P. gingivalis, T. denticola et F. nucleatum et la profondeur des poches
parodontales ou du niveau de perte d’attache. L’hypothèse de départ proposant une
corrélation positive entre les quantités de P. gingivalis, T. denticola et F. nucleatum et les
paramètres cliniques chez les sujets atteints de parodontite chronique se doit d’être rejetée.
Dans la littérature, il est vrai que P. gingivalis est positivement associé aux poches
parodontales ≥ 7 mm et que T. denticola possède une forte tendance à se développer dans
les poches parodontales profondes ≥ 6 mm mais notre étude n’a pu le
démontrer [24,25,30,31,115]. Toutefois, l’étude de Simonson et al. [116] a démontré que les
quantités de T. denticola présentes dans des échantillons de plaque sous-gingivale de sujets
atteints de parodontite sévère étaient deux fois plus élevées que les quantités retrouvées
chez un groupe sain ou souffrant de parodontite modérée. Il a été conclu que les agents
59
pathogènes étudiés sont liés à la parodontite chronique et leur fréquence est plus élevée
dans les poches parodontales profondes [116]. Par ailleurs, la présence simultanée de ces
bactéries dans des sites profonds suggère une relation synergique entre ces espèces
virulentes, favorisant de cette manière, la progression de la maladie parodontale [117].
Dans notre étude, tous les sujets souffraient de parodontite chronique sévère ce qui
explique probablement qu’à l’intérieur même du groupe, aucune association avec les
paramètres cliniques n’a pu être observée. On peut supposer qu’en raison de la moyenne
très sévère de la profondeur des poches parodontales (8,25 mm) et de la perte d’attache
(8,55 mm) chez le groupe malade, nos statistiques ne peuvent déceler de lien car presque
tous les sujets avaient une mesure moyenne des poches parodontales ≥ 7 mm. De plus, le
faible nombre d’échantillons à l’intérieur du groupe atteint de parodontite peut ne pas
permettre d’illustrer le lien entre les bactéries parodontopathogènes et la sévérité de la
maladie.
4.3 Corrélations entre les médiateurs détectés dans le FCG et la salive et les paramètres observés chez les sujets malades
Nous avons effectué des analyses de corrélation entre les mesures des paramètres cliniques
mesurés chez le groupe malade et les médiateurs de l’inflammation mesurés dans le FCG et
la salive. Les résultats d’analyses révèlent l’existence d’une possible corrélation positive
entre les profondeurs de poches parodontales et les concentrations d’IL-1β (p = 0,0293)
(Tableau 14) ainsi qu’avec les pertes d’attache et les quantités de
TLR4 (p = 0,0858) (Tableau 14). Ces données suggèrent que plus les poches parodontales
sont profondes, plus les concentrations d’IL-1β dans le FCG sont importantes. Ce résultat
est en accord avec ceux rapportés par Engebretson et al. [61] où il a été démontré l’existence
d’une forte corrélation entre les concentrations d’IL-1β du FCG et la profondeur des poches
parodontales. Cette étude démontrait également une association positive entre les
concentrations d’IL-1β et la perte d’attache [61]. La littérature rapporte plusieurs études sur
l’association entre les taux d’IL-1β élevés du FCG et la sévérité de la maladie parodontale
et que ces concentrations diminuent au cours du traitement [62].
Une corrélation positive a également été observée entre la perte d’attache et les
concentrations de TLR4. Il semble que plus la perte d’attache clinique est sévère, plus les
60
quantités de TLR4 dans le FCG semblent élevées. Même si la profondeur des poches des
sujets du groupe malade est en relation directe avec la perte d’attache, les statistiques n’ont
pas été en mesure d’identifier des relations significatives pour les deux paramètres
cliniques conjointement pour les médiateurs IL-1β et TLR4. D’autre part, aucune
corrélation entre les paramètres cliniques et les médiateurs IL-18, Il-10 et TNFα analysés
dans le FCG n’a été révélée dans cette étude. Concernant l’IL-10, nos résultats appuient
ceux rapportés par Gamonal et al. [56] qui, malgré une détection de la cytokine chez 43%
des sujets atteints de parodontite, n’a pas observé de variations des concentrations de la
cytokine IL-10 en fonction de l’activité de la maladie ou la profondeur des poches
parodontales [56].
Les échantillons de salive du groupe atteint de parodontite ont permis de déterminer des
associations statistiquement significatives entre les concentrations d’IL-1β et la profondeur
des poches parodontales (p = 0,0698) ainsi qu’avec la perte d’attache (p = 0,0603)
(Tableau 15). Plus la profondeur des poches parodontales augmente, plus les
concentrations d’IL-1β détectées dans la salive semblent augmenter. De plus, il semble
exister un lien entre l’augmentation de la profondeur des poches parodontales et les
concentrations de TLR4 (p = 0,0995) dans la salive mais aucun lien n’a été établi avec la
perte d’attache (Tableau 15). La présence du TLR4 dans la salive des sujets malades de
notre étude corrobore les résultats de Buduneni et al. [112] proposant que les individus
souffrant de parodontite chronique possèdent des taux plus élevés de TLR4 dans leur
salive. Comme pour les résultats obtenus dans le FCG, aucune relation entre les paramètres
cliniques et les médiateurs IL-18, Il-10 et TNFα mesurés dans la salive n’a été observée.
L’étude de Teles et al. [118] a comparé les niveaux de plusieurs cytokines dont l’IL-10, et le
TNFα et a conclu que les concentrations de ces médiateurs dans la salive ne permettent pas
de distinguer un état sain d’un état malade. En résumé, l’étude de Teles et al. [118] n’a pas
montré d’association entre les niveaux de cytokines salivaires et les paramètres cliniques de
la maladie parodontale. Selon cette même étude, la dilution des composantes du FCG dans
la salive semble masquer les différences entre les concentrations des médiateurs pouvant
exister au niveau des sites atteints par la maladie [118]. Les résultats de notre étude semblent
indiquer l’existence d’un lien entre les paramètres cliniques (donc la sévérité de la maladie)
et l’augmentation des concentrations d’IL-1β et de TLR4 retrouvées dans le FCG et la
61
salive. Selon Teles et al. [21], il serait logique de retrouver ces médiateurs autant dans le
FCG que dans la salive car plusieurs éléments de preuve indiquent que la source principale
des cytokines dans la salive proviendrait du FCG. Ainsi, l’hypothèse de départ proposant
l’existence d’une corrélation entre les concentrations des médiateurs de l’inflammation
étudiés et les paramètres cliniques chez les sujets atteints de parodontite chronique semble
positive.
63
Conclusion En résumé, notre étude a permis de confirmer que la charge bactérienne en P. gingivalis,
T. denticola et F. nucleatum est plus élevée chez les patients atteints de parodontite que
chez les sujets sains. Notre étude a également montré que les taux d’IL-18, d’IL-1β et de
TLR4 dans le FCG sont plus élevés que ceux retrouvés chez les sujets sains. Finalement, la
sévérité clinique de la maladie est associée à des taux élevés de d’IL-1β et de TLR4 dans le
FCG et la salive.
L’ensemble de ces résultats appuie le rôle de l’IL-1β, l’IL-18 et du TLR4 dans la
pathogenèse de la maladie parodontale. Des études fondamentales et cliniques avec une
taille d’échantillon plus grande pourraient être réalisées afin de déterminer précisément le
rôle de l’IL-18 et de TLR4 dans l’étiologie de la maladie parodontale chronique.
65
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127. DINARELLO C.A. Anti-cytokine therapeutics and infections. Vaccine (2003). Vol 21
suppl. 2, p. 24-34.
77
Annexes
Annexe 1. Formulaire de consentement éclairé...................................................................78 Annexe 2. Questionnaire médical........................................................................................82 Annexe 3. Examen parodontal maxillaire et mandibulaire..................................................84
78
Annexe 1
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initiales _____
Titre de la recherche : Comparaison des bactéries des patients atteints de maladie de gencive à celles des individus sains
Formulaire de consentement
Chercheur principal : Dr Fatiha Chandad Cette recherche est dirigée par la professeure Fatiha Chandad de la Faculté de médecine dentaire à l’Université Laval.
Avant d’accepter de participer à ce projet de recherche, veuillez prendre le temps de lire et de comprendre les renseignements qui suivent. Ce document vous explique le but de ce projet de recherche, ses procédures, avantages, risques et inconvénients. Nous vous invitons à poser toutes les questions que vous jugerez utiles à la personne qui vous présente ce document.
Nature de l’étude
Cette recherche a pour but d’étudier les différentes bactéries qu’on retrouve chez les patients malades et de les comparer aux bactéries qu’on retrouve chez les sujets sains. Cette étude permettra au clinicien de pouvoir distinguer un état sain d’un état malade sur la base des bactéries qu’on retrouve dans la plaque dentaire. La recherche qui sera réalisée est une étude exploratoire financée par les Instituts de recherche en santé du Canada. Déroulement de la participation
Votre participation à cette recherche consiste à :
1. Répondre à un questionnaire d’une durée approximative de 10 minutes, qui sera complété avec vous par un dentiste.
2. Avoir un examen de la bouche par un dentiste de la Faculté de médecine dentaire de l’Université
Laval. Le dentiste vous informera de l’état de santé de votre gencive et des tissus mous de votre bouche. Un deuxième examen dentaire vous est offert et sera effectué dans une période de deux ans. Cet examen permettra de mettre en évidence les modifications éventuelles au niveau des bactéries retrouvées dans votre bouche. Les frais de dentiste sont défrayés par l'étude.
3. Accepter qu’on fasse un prélèvement d’un maximum de six (6) échantillons de plaque dentaire qui se
trouve dans l’espace entre la dent et la gencive. Ce prélèvement est fait par le dentiste avec une curette dentaire. Ces échantillons sont testés au laboratoire pour préciser l’activité de la maladie des gencives.
4. Accepter qu’on fasse un prélèvement d’un maximum de six (6) échantillons de liquide qui se trouve
dans l’espace entre la dent et la gencive (i.e. liquide créviculaire). Ce prélèvement est fait par le dentiste avec une bandelette de papier buvard, si bien qu’aucun inconfort ou douleur ne sont ressentis. Ces échantillons sont testés au laboratoire pour préciser l’activité de la maladie des gencives.
Avantages, risques ou inconvénients possibles liés à votre participation
Votre participation pourra nous aider à mieux comprendre cette dérive d’état de santé vers un état malade, et permettra de développer des méthodes pour la surveillance et la prévention de ce changement dans la flore bactérienne qu’abrite la cavité buccale humaine. Les résultats obtenus par cette étude pourront aussi éclairer notre compréhension des autres facteurs de risque de développer une maladie de gencive.
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initiales _____
Le prélèvement de plaque dentaire sous-gingivale peut causer un léger inconfort uniquement dans les sites présentant une inflammation importante avec saignement. Si l’inconfort vous dérange, nous ne prélèverons pas de plaque à ce site. Le prélèvement du liquide qui se trouve dans l’espace entre la dent et la gencive ne cause aucun inconfort puisqu’il est fait à l’aide d’une bandelette de papier et dure 30 secondes. Participation volontaire et droit de retrait
Vous êtes libre de participer à ce projet de recherche. Vous pouvez aussi mettre fin à votre participation sans conséquence négative ou préjudice et sans avoir à justifier votre décision. Si vous décidez de mettre fin à votre participation, il est important d’en prévenir le chercheur dont les coordonnées sont incluses dans ce document. Tous les renseignements personnels vous concernant seront alors détruits.
Confidentialité et gestion des données
Les mesures suivantes seront appliquées pour assurer la confidentialité des renseignements fournis par les participants:
• les noms des participants ne paraîtront dans aucun rapport;
• les divers documents de la recherche seront codifiés et seul le chercheur aura accès à la liste des noms et des codes;
• les résultats individuels des participants ne seront jamais communiqués;
• les matériaux de la recherche, incluant les données relatives à l’examen de la cavité buccale, seront conservés dans une base de données sur l’ordinateur du laboratoire situé au local 1716 de la Faculté de médecine dentaire. Cet ordinateur, protégé par un mot de passe, sert uniquement pour la conservation des bases de données du laboratoire et seul le chercheur et le professionnel de recherche y ont accès. Les échantillons biologiques (plaque dentaire et liquide de gencive) prélevés, seront conservés dans un congélateur à –80°C situé à la Faculté de médecine dentaire au Local 1732. L’accès aux laboratoires de recherche est limité aux seuls membres du Groupe de recherche en écologie buccale (GREB). Toutes les données et les échantillons seront conservés pendant deux ans après la fin du projet de recherche, soit en mars 2013, après quoi ils seront détruits;
• la recherche fera l'objet de publications dans des revues scientifiques, et aucun participant ne pourra y être identifié ou reconnu;
Un court résumé des résultats de la recherche sera expédié aux participants qui en feront la demande en indiquant l’adresse où ils aimeraient recevoir le document, juste après l’espace prévu pour leur signature. Dans un souci de protection, le ministère de la Santé et des Services sociaux demande à tous les comités d’éthique désignés d’exiger que le chercheur conserve, pendant au moins un an après la fin du projet, la liste des participants de la recherche ainsi que leurs coordonnées, de manière à ce que, en cas de nécessité, ceux-ci puissent être rejoints rapidement »; Renseignements supplémentaires Si vous avez des questions sur la recherche ou sur les implications de votre participation, veuillez communiquer avec Dr Fatiha Chandad au numéro de téléphone suivant : (418)-656-2131, poste 8599 ou à l’adresse de courriel suivante : [email protected] Remerciements Votre collaboration est précieuse pour nous permettre de réaliser cette étude et nous vous remercions d’y participer.
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initiales _____
Signatures Je soussigné(e) ____________________________, consens librement à participer à la recherche intitulée : «Comparaison des bactéries des patients atteints de maladie de gencive à celles des individus sains ». J’ai pris connaissance du formulaire et j’ai compris le but, la nature, les avantages, les risques et les inconvénients du projet de recherche. Je suis satisfait(e) des explications, précisions et réponses que le chercheur m’a fournies, le cas échéant, quant à ma participation à ce projet.
_________________________________ ___________________
Signature du participant, de la participante Date
Un court résumé des résultats de la recherche sera expédié aux participants qui en feront la demande en indiquant l’adresse où ils aimeraient recevoir le document. Les résultats ne seront pas disponibles avant le 30 avril 2011. Si cette adresse changeait d’ici cette date, vous êtes invité(e) à informer la chercheure de la nouvelle adresse où vous souhaitez recevoir ce document.
L’adresse à laquelle je souhaite recevoir un court résumé des résultats de la recherche est la suivante :
_____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ J’ai expliqué le but, la nature, les avantages, les risques et les inconvénients du projet de recherche au participant. J’ai répondu au meilleur de ma connaissance aux questions posées et j’ai vérifié la compréhension du participant. ____________________________________ __________________ Signature du chercheur Date
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initiales _____
Plaintes ou critiques
Toute plainte ou critique sur ce projet de recherche pourra être adressée au Bureau de l'Ombudsman de l'Université Laval à l’adresse suivante: Bureau de l'Ombudsman de l'Université Laval Pavillon Alphonse-Desjardins, bureau 3320 2325, rue de l’Université Université Laval Québec (Québec) G1V 0A6 Renseignements - Secrétariat : (418) 656-3081 Ligne sans frais : 1-866-323-2271 Télécopieur : (418) 656-3846 Courriel : [email protected]
Copie du participant
82
Annexe 2
Faculté de médecine dentaireProgrammes de formation complémentaire
QUESTIONNAIRE MÉDICALCONFIDENTIEL
FMD-251 (07-05)
Nom et prénom :
1. Instructions :* Répondre à toutes les questions* Ce questionnaire est confidentiel et sera conservé dans votre dossier* Lors de visites subséquentes, tout changement devra être rapporté
2. Nom de votre médecin de famille :3. Êtes-vous en bonne santé présentement ?4. Êtes-vous sous les soins d’un médecin présentement ?5. Si oui, pour quelle condition ?6. Date de votre dernier examen médical :7. Avez-vous déjà été hospitalisé ?8. Pour quelle raison ? Date :9. Prenez-vous présentement des médicaments ou en avez-vous pris au cours des six (6) derniers mois ?10. Avez-vous déjà fait une réaction allergique aux produits suivants :
* Aliments* Pénicilline, sulfamide ou autres antibiotiques* Aspirine* Iode* Codéine* Anesthésie locale* Autres
11. Devez-vous prendre des antibiotiques avant une procédure dentaire ?12. Avez-vous déjà eu des complications suite à une procédure médicale ou dentaire ?13. Si oui, quelle complication ?14. Fumez-vous ?15. Avez-vous présentement ou avez-vous déjà eu un des problèmes suivants ?
* perte d’appétit* fatigue excessive* tendance à faire des contusions (bleus sur la peau)* guérison difficile des plaies/coupures* tolérance réduite à l’exercice* envie fréquente d’uriner/soif excessive* douleur à la poitrine* insomnie* perte de poids* toux persistante* enflure des chevilles* difficulté à respirer (souffle court)* angine/infarctus (crise cardiaque)* maladie cardiaque (souffle, stimulateur, prolapsus mitral, etc.)* fièvre rhumatismale* prothèse valvulaire cardiaque* problèmes de saignement* épilepsie* accident cérébro-vasculaire* paralysie* problèmes aux yeux (glaucome, etc.)* problèmes aux oreilles (surdité, otite, etc.)* maux de tête sévères* dépression* haute/basse pression* étourdissement* évanouissement (perte de conscience)* asthme/fièvre des foins* allergies* problèmes de sinus/rhumes fréquents* maladie immunitaire
No dossier :
OUI NON
83
84
Annexe 3
Faculté de médecine dentaireProgrammes de formation spécialisée en parodontie
EXAMEN PARODONTALMAXILLAIRE
FMD-252 (07-05)
Nom et prénom : No dossier :
MOBILITÉ1
23
TARTRESO
SU
PUS
SAIGNEMENT
FURCATION
T K
PERTE D’ATTACHE
RÉCESSION
POCHES
1
2
3
POCHES
3
2
1
RÉCESSION
PERTE D’ATTACHE
SAIGNEMENT
PUS
TARTRESO
SU
18 17 16 15 14 13 12 11 21 22 23 24 25 26 27 28
18 17 16 15 14 13 12 11 21 22 23 24 25 26 27 28
Sextant(03, 04, 05) Problème Procédure
Date : 1 2 3
Résident/e : 1 2 3
B
L
85
Faculté de médecine dentaireProgrammes de formation spécialisée en parodontie
EXAMEN PARODONTALMANDIBULAIRE
FMD-253 (07-05)
Nom et prénom : No dossier :
TARTRESO
SU
PUS
SAIGNEMENT
T K
PERTE D’ATTACHE
RÉCESSION
POCHES
1
2
3
POCHES
3
2
1
RÉCESSION
PERTE D’ATTACHE
48 47 46 45 44 43 42 41 31 32 33 34 35 36 37 38
48 47 46 45 44 43 42 41 31 32 33 34 35 36 37 38
Sextant(08, 07, 06) Problème Procédure
Date : 1 2 3
Résident/e : 1 2 3
L
B
T K
FURCATION
SAIGNEMENT
PUS
TARTRESO
SU
MOBILITÉ
1
2
3
