Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale

5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale

1/41

Analiza biocompatibilitatiicelule biomateriale

implantabile

Dr. Elena Iulia Oprita


2/41

Laborator de testare abiocompatibilitatii biomaterialelor


3/41

Notiuni introductive

Biomaterial - termen folosit pentru materialenaturale sau sintetice, folosite in scopulreproducerii functiei tesuturilor.

- Este un substrat inert din punct de vedere

sistemic si farmacologic destinat sainteractioneze cu sistemele biologicepentru a directiona, intensifica sau inlocuifunctiile diferitelor tesuturi din organismuluman.


4/41

Biomaterialele pot fi clasificate avand in

vedere urmatoarele criterii: d.p.d.v al originii lor: naturale,

sintetice si hibride;

d.p.d.v al compozitiei chimice:

metalice, ceramice, polimerice sicompozite;

d.p.d.v al reactiilor de interfata:biotoxice, bioinerte, bioactive sibioresorbabile;


5/41

Biocompatibilitate - termenul estefolosit pentru a defini capacitatea unui

material de a determina un raspunscorespunzator al tesutului gazda incazul unei aplicatii specifice

- reprezinta capacitatea unuimaterial care este in contact cu tesutulviu de a nu cauza efecte toxice sidaunatoare.


6/41

Citotoxicitatecalitatea unui biomaterial de a fi

toxic pentru celule Clasificarea biomaterialelor

- necitotoxice

- usor citotoxice

- moderat citotoxice- sever citotoxice

Teste de citotoxicitate in vitro

- teste pe culturi celulare

Teste de citotoxicitate in vivo

- teste pe animale de laborator: soareci,sobolani, iepuri


7/41

Metoda culturilor celulare Biocompatibilitatea materialelor poate fi testat

ntr-un mod simplu analiznd dac ele suntsubstrate adecvate pentru creterea culturilor

celulare. Folosind culturile celulare pentru testarea

biocompatibilitii este posibil realizarea uneiselecii preliminare pentru a elimina materialele

care au efecte directe, duntoare. O serie de sisteme de culturi celulare sunt folosite

n mod frecvent pentru studierea citotoxicitii invitro.

Testarea biocompatibilitatii in vitro


8/41

Cultura primareste un izolat proasptde celule

care este cultivatin vitro.

Culturile de celule primare pot fi obinutedinfragmente de esuturi(os, cartilaj sau piele) sau

din suspensii de celule individuale obinuteprintratarea esuturilorcu enzime proteolitice(cartilaj sau tesut adipos).

Liniile celulare continuesunt derivate din culturilecelulare primare care s-au adaptat creteriiinvitro.


9/41

Metode de testare a citotoxicitatiiin vitro

Teste stabilite si standardizateEN ISO 109935Evaluarea biologica a dispozitivelor medicale.

Partea 5: Teste pentru citotoxicitatea in vitro

Metoda contactului direct

Metoda contactului indirect (extractului)


10/41

Metoda contactului direct

Linii celulare stabilizate80% confluenta

Probaacopera aproximativ

10% din stratul celularSe folosesc: materialul detestat (proba), un martor decultura si 2 martori (pozitiv sinegativ)

Se testeaza citotoxicitatea la24 si 48 ore.


11/41

- martorul de culturacultura de celule

simpla;- martorul pozitivorice material care utilizat

intr-un test de evaluare a citotoxicitatii

influenteaza in mod negativ viabilitatea si

morfologia celulara;

- martorul negativ- orice material care utilizat

intr-un test de evaluare a citotoxicitatii nu are

nici o influenta asupra celulelor


12/41

Scala de citotoxicitate (%)

80% - 100% - necitotoxic

50%80% - usor citotoxic

30%50% - moderat citotoxic

< 30% - sever citotoxic


13/41

Metoda contactului indirect(extractului)

Obtinerea extractuluimaterialul de

testat mentinut in mediul de cultura24h, 37C.

Se folosesc dilutii;

Se testeaza citotoxicitatea la 24, 48 si

72 ore.


14/41

- Blank mediul de extractie care nu contine

materialul de testat;

- martorul de culturacultura de celule

simpla;

- martorul pozitivorice material care utilizat

intr-un test de evaluare a citotoxicitatiiinfluenteaza in mod negativ viabilitatea si

morfologia celulara;

- martorul negativ- orice material care utilizatintr-un test de evaluare a citotoxicitatii nu are

nici o influenta asupra celulelor


15/41

Metode de testare a biocompatibilitatiiin vitro

Metode de testare a viabilitatii si proliferarii celulare

Metode de analiza a morfologiei si ultrastructurii celulare

Metode de determinare a sintezei de proteine


16/41

Metode calitativeTehnici de microscopie

Metode cantitative- Tehnici de dozare a proteinelor

- Reducerea sarurilor de tetrazoliu

- Cuantificarea sintezei de ADN


17/41

Metode de testare a viabilitatii siproliferarii celulare

Coloranti vitalifolositi pentru a identifica pe bazapermeabilitatii membranei celularecelulele vii, lezate sau moarte

Metode de testare a viabilitatii celulare

Colorarea celulelor vii/moarte in functie de colorantul folosit

- Albastru Tripan si Iodura de propidiu sunt colorantiexclusi de celulele viabile, coloreaza celulele moarte.

- Rosu Neutru si Crystal Violet

detecteaza lizacelulara, coloreaza celulele vii care adera la placile de cultura.


18/41

Crystal Violet detecteaza liza celulara, coloreaza celulele viicare adera la placile de cultura. Celulele lizate se desprindde suprafata placilor de cultura si nu sunt colorate

Eliberarea de catre celule in mediul de cultura a diferitelorenzime sau mediatori chimici poate fi afectata de

expunerea la diferite biomateriale, ex: enzima lactatdehidrogenaza (LDH) este un marker pentru toxicitateacelulara in testarea biocompatibilitatii.

LDH enzima citoplasmatica ce catalizeaza reactia deconversie a acidului lactic in acid piruvic. Prezenta enzimeiLDH in mediul d ecultura a celuleor este un indicator aldegradarii membranei celulare.


19/41

Metoda excluderii cu Albastru Tripan

Hemocitometru


20/41

Metode de testare a proliferarii celulare

Principalele metode de analiza a proliferarii celulare:

- reducerea sarurilor de tetrazoliu (metoda MTT)

- absorbtia Rosu neutru

- masurarea sintezei de ADN


21/41

Metoda MTT

Spectrofotometriareprezinta o tehnica de determinare aabsorbtiei radiatiilor luminoase cu o anumita lungime de unda, decatre o anumita substanta prezenta intr-o solutie.

Metoda spectrofotometrica bazata pe reducerea sarii de tetrazoliu(3-(4,5 dimetilthyazol-2-yl)-2,5-diphenyl tethrazolium bromide)(MTT) de culoare galbena la cristale de formazan de culoarealbastru-violet sub actiunea enzimelor mitocondriale (NADPH

reductaze) din celulele active metabolic. Cantitatea de formazangenerata este direct proportionala cu numarul de celule viabile.

Metoda este folosita pentru masurarea citotoxicitatii in vitroinduse de un biomaterial.

MTT este adaugat direct in mediul de cultura al celulelor si dupa operioada de incubare (3h), mediul este alcool izopropilic pentru

solubilizarea cristalelor de formazan. Probele rezultate sunt cititela un spectrofotometru, iar rezultatele obtinute vor fi prezentatesub forma unui grafic.


22/41

0

20

40

60

80

100

120

24h 48h

Viab

ilitatecelulara(%)

Timp (ore)

beta-TCP

0,5 mg

1 mg

5 mg

10 mg


23/41

Metode de analiza a morfologiei siultrastructurii celulare

Microscopie optica

Microscopie in contrast de faza

Microscopie electronica de transmisie (TEM)

Microscopie electronica de baleiaj (SEM) Microscopie de fluorescenta

Microscopie confocala


24/41

Microscopie optica

Coloratia Hematoxilina - EozinaMetoda coloraiei cu hematoxilin - eozin folosete succesiv uncolorant nuclear, bazic, hematoxilina i un colorant citoplasmatic,acid, eozina.Rezultatele acestei colorrii sunt:

nucleii apar colorai cu albastru violetcu hematoxilin (principaliiconstitueni chimici ai nucleului, ADN i ARN, posed radicalifosfat acizi ce reprezint locuri de ataare pentru colorantul bazichematoxilina);citoplasma se coloreaz n roz cu eozina(cele mai multe proteinecitoplasmatice se comport la pH-ul respectiv ca baze, expunnd

gruprile NH+3, care reprezint locul de ataare pentrucolorantul acideozina).


25/41

Fibroblaste dermale dupa 6 zile Fibroblaste dermale dupa 13 zile

de cultivare in suporturi compozite de cultivare in suporturi compoziteCOL/TCP COL/TCP


26/41

Metoda contactului directTestarea buretelui Colagen/Condroitin sulfat

Martor de cultura Controlul negativ

Control pozitiv Proba


27/41

Metoda contactului indirect (extractului)


28/41

Microscopie in contrast de faza

Avantajul major ale microscopiei in contrast de faz esteacela c celulele vii pot fi examinate n starea lor natural,fr ca, n prealabil, s fie omorte, marcate cu colorani ifixate n prob. Dinamica proceselor biologice aflate ndesfurare poate fi observat i nregistrat n condiiifoarte bune de claritate i contrast.

Osteoblaste umane cultivate 14zile pe particule macroporoase

Cultura primara osteoblaste desobolan dupa 3 zile de cultivare


29/41

Microscopie electronica de transmisie(TEM)

Filopodii celulare (osteoblat) carerealizeaza contacte stranse cu

suportul (burete COL/TCP)

Celul de tip osteoblastuman (O) cultivat 6 zilecu Biostite (buretecolagenS)


30/41

Microscopie electronica de baleiaj(SEM)

Imagini SEM aleosteoblastelor de

sobolan cultivate nsuport calciu-

fosfat/chitosan.

Infiltrarea celulei n

macroporul suportului

calciu-fosfat/chitosan;

Fixarea celular la baza

porului (sgei);

Celul n interiorul porului;Interacii celul - celul n

interiorul porului (sgei)

Spre deosebire de TEM, SEM furnizeaza imagini tridimensionale alesuprafetelor probelor cercetate


31/41

Microscopia de fluorescenta

In mod natural, componentele celulare manifestafluorescenta, insa prea slaba pentru a putea fi observatacorespunzator la microscop.

In general, preparatul este marcat (colorat) specific cucompusi fluorescenti (florocromi) care prezinta o afinitate

scazuta, nespecifica pentru moleculele biologice, dar elepot fi cuplate chimic cu anticorpi purificati specifici pentruorice macromolecula dorita.

Un complex fluorocrom anticorp cand este adaugat laculturile celulare se va lega la anticorpii selectati care apoi

lumineaza sub actiunea lungimii de unda excitate.


32/41

Testul Live/Dead

Celule stem mezenchimale cultivate in gel de colagen

Se bazeaza pe colorarea simultana a celulelor vii si moarte prin doiflurocromi: Etidiu si Calceina.Calceina coloreaza citoplasma celulelor vii in verde, iar ethidiu nucleulcelulelor moarte in rosu.


33/41

Analiza viabilitatii osteoblastelor umane cultivate in suportCOL-TCP prin marcare fluorescenta cu DAPI

DAPI - fluorocrom carecoloreaza in albastrunucleul celulelor vii.


34/41

Sinteza markerilor specifici celulari

Celule stem mezenchimale

umane injectate in bureteCOL/TCP pozitive pentruosteocalcin (marker specificpentru diferentiere osoasa).

Culturi de celule stem

mezenchimale exprimaVCAM-1 (markerspecific pentru celulestem mezenchimale)


35/41

Microscopie confocala

Metoda avansata pentru analiza interactiilor celulare cu biomaterialele

Ofera mai multe avantaje comparativ cu tehnicile histologice si SEMprin diminuarea timpului de analiza, probele nu necesita o pregatireaexcesiva ca in cazul celor doua

Poate fi folosita pentru a analiza morfologia celulelor si distributia ininteriorul unor suporturi implantabile, a studia adeziunile focale, aanaliza localizarea intracelulara a diferitelor componente celulare si acitoscheletului.


36/41

Citoscheletuleste un sistem de filamente

sau de fibre microscopice, ntlnit ncitoplasma celulelor eucariote, careorganizeaz celelalte componente alecelulei, menine forma celular i esteresponsabil cu locomoia celulei i cumicarea organitelor intracelulare.Citoscheletuleste compus din trei tipuriprincipale de filamente: filamente de actin,microtubuli i filamente intermediare.


37/41

Morfologia celulara siorganizareacitoscheletuluiosteoblastelordupa 18h de cultivare pe

suprafete de Al (A); Nb(B); Ti (C); V (D)


38/41

Celule vii (culoare verde) si celule moarte (nucleulrosu) cultivate in suportul compozit COL/TCP


39/41

Testarea biocompatibilitatii in vivo

Interfata biomaterial-mediul biologic/celule

este stratul caresepara doua faze

condensate (de obiceide dimensiunimoleculare).


40/41

Testarea in vivoa buretilor de COL/TCP


41/41

Testarea biocompatibilitatii in vivo

Urmareste:

Reactia inflamatorie Reactia imuna

Reactia mitogena

Formarea tumorilor

Reactia toxica

Documents

Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale