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Análise de Proteínas
Prof. Eduardo Purgatto
Depto. de Alimentos e Nutrição Experimental
FCF – USP
Curso de Graduação
Disciplina de Bromatologia Básica
2005
ProteínasMacromoléculas compostas de vários AMINOÁCIDOS unidos por ligações covalentes denominadas LIGAÇÕES PEPTÍDICAS
ClassificaçãoComposição:
Conjugadas com compostos não-AASimples (apenas AAs)
Glicoproteínas,
Lipoproteínas, fosfoproteínas, etc.
ClassificaçãoEstrutura
Globulares (ex. albuminas, mioglobina)
Fibrosas (ex. colágeno)
Conjugadas (ex. Hemoglobina)
ClassificaçãoFunção biológica
- Elementos estruturais (colágeno) e sistemas contráteis;
- Armazenamento (ferritina);
- Veículos de transporte (hemoglobina);
- Hormônios;
- Enzimática (lipases);
- Nutricional (caseína);
- Agentes protetores (imunoglobulina);
Entre outras...
ClassificaçãoSolubilidade
Hidrofílicas Hidrofóbicas
Conalbumina Proteínas de membranas
Conteúdo em alimentos•Muito variável
•Alimentos de origem animal e leguminosas são ótimas fontes de proteínas
Análise de proteínas•Os princípios básicos incluem:
•Determinação de nitrogênio orgânico (Kjeldahl)
•Presença de ligações peptídicas (Biureto)
•Absorção no UV (devido a Trp e Tyr)
•Presença de grupos amino livres (Ninhidrina – Arg e Lys)
•Capacidade de ligação de corantes (Bradford)
•Presença de AAs aromáticos (Fluorescência - Phe e Trp)
Método de Kjeldahl
Johann Kjeldahl(1849-1900)
Desenvolveu em 1883 o processo básico para determinação de nitrogênio orgânico total. Os passos incluem:
•Digestão: H2 SO4 (conc.) a 350-400oC + catalisador
•Neutralização e Destilação
•Titulação
•Conversão do teor de N total para teor de proteína
Método de KjeldahlProteína
H2 SO4 (conc.) + K2 SO4
Δ
+ catalisador(NH4 )2 SO4
K2 SO4 : Aumenta o Ponto de Ebulição do H2 SO4 (de 337 para mais de 400oC)
Digestão mais eficiente
CuSO4 : Catalisador. Acelera o processo de oxidação da matéria orgânica
Método de KjeldahlNeutralização e Destilação
(NH4 )2 SO4 + 2NaOH 2NH3 + Na2 SO4 + 2H2 O
NH3 + H3 BO3 NH4 H2 BO3
Borato de amônio
Método de KjeldahlTitulação
NH4 H2 BO3 + HCl H3 BO3 + NH4 Cl
Método de KjeldahlAté que ponto o ácido é adicionado à amostra?
Até o PONTO DE VIRAGEM
Volumetria
Baseado na equivalência entre o conteúdo de N na amostra e o HCl usado na TITULAÇÃO
•Técnica analítica utilizada para determinar a concentração de um determinado reagente
•Também chamada de Análise Volumétrica
Bureta contém o Titulante
Frasco contém a amostra a ser Titulada + um indicador
Titulante = Solução padrão de um reagente de Concentração conhecida
Indicador = Substância que sofre mudança de cor quando é atingido o PONTO DE EQUIVALÊNCIA entre o Titulante e a Amostra
Volumetria
NaOH 0,1N
Amostra contém HCl
+ Fenolftaleína
Volumetria1o passo: Despejar lentamente o conteúdo da bureta sobre a amostra agitando esta última constantemente.
2o passo: Quando ocorrer a mudança de incolor para rosa claro, a titulação terá atingido o ponto de equivalência entre a base e o ácido
3o passo: Anotar o volume de Titulante gasto e calcular a concentração do Titulado.
Ntitulante x Vtitulante = Ntitulado x Vtitulado
0,1 x 10 ml = Ntitulado x 20 ml
Ntitulado = 0,05 N
1 Eq HCl _____________ 1 Eq Nitrogênio
1N (1Eq/1000 mL) _____ 14 g Nitrogênio
1N (1mL) ____________ 0,014g Nitrogênio
0,1N (1mL) ___________ 0,0014g Nitrogênio
Logo:
1mL (0,1N) __________ 0,0014g Nitrogênio
Vol. de HCl __________ Xg Nitrogênio
Método de Kjeldahl
A maioria dos alimentos (*) possui em média 16% de nitrogênio,
portanto:
16g N _______ 100g proteínas
1g N ________ Xg
Xg = 100/16 = 6,25
O teor de proteína bruta de um alimento é obtido pela multiplicação
do teor de N - total pelo fator de conversão (6,25).
Método de Kjeldahl
Método de KjeldahlO conteúdo de proteína para alimentos específicos pode utilizar fatores específicos:
% de N na proteína Fator
Ovo ou carne 16,0 6,25Leite 15,7 6,38Trigo 18,76 5,33Milho 17,70 5,65Aveia 18,66 5,36Soja 18,12 5,52Arroz 19,34 5,17
Método de KjeldahlVantagens
•Aplicável a todos os tipos de alimentos•Relativamente simples•Não é caro•Preciso. Trata-se de um método oficial para a determinação de proteínas•Vem sendo modificado para análise de microgramas de proteína (micro Kjeldhal)
Desvantagens•Mede Nitrogênio orgânico total, não apenas nitrogênio de proteínas•Demorado•É menos preciso que o método do biureto•Utiliza reagentes corrosivos.
Método de KjeldahlOutras possíveis fontes de N na amostra:
•Amino ácidos livres•Pequenos peptídeos•Ácidos nucléicos•Amino açúcares•Porfirinas•Algumas Vitaminas•Alcalóides•Uréia•Íons Amônio
DNA
Clorofila
Cianocobalamina (Vit. B12 )
Método de Kjeldahl
1.Digestão: H2 SO4 (conc.) a 350- 400oC + catalisador
2.Neutralização e Destilação
3.Titulação
4.Conversão do teor de N total para teor de proteína
Método de Kjeldahl
1.Digestão: H2 SO4 (conc.) a 350- 400oC + catalisador