Lokakarya Fungsional Non Peneliti 1997

OPTIMASI ANALISIS VITAMIN A, D DAN E DALAMDAGING AYAM DENGAN KROMATOGRAFI CAIR

PRESTASI TINGGI

Jernih Rosida

Balai Penelitian Ternak Ciawi, P .O . Box 221, Bogor 16002

PENDAHULUAN

Vitamin merupakan komponen penting yang diperlukan oleh manusiauntuk tumbuh optimal . Kekurangan vitamin dapat mengakibatkan terganggu-nya penglihatan, mineralisasi tulang dan reproduksi . Begitu pula sebaliknyaapabila dikonsumsi secara berlebihan dapat menyebabkan gangguan kulit dandan hiperkalsemia . Vitamin dibedakan menurut kelarutannya di dalam lemakatau pelarut lemak yaitu vitamin A (C20H300), vitamin D2 (C28H440), vitamin D 3(C27H440), vitamin E (C29H500) dan vitamin yang larut dalam air yaitu vitaminB, (C12H 17 N40S), vitamin B2 (C 17H1805N4 ), vitamin B 6 (C 7 H1003N), vitamin B 12(C63H88O14NPCo) dan vitamin C (C6H806) .

Ternak unggas dan babi membutuhkan kedua jenis vitamin tersebuttetapi ruminan hanya memerlukan vitamin yang larut dalam lemak ataupelarut lemak karena mikroba rumen dapat mensintesa vitamin yang larutdalam air. Sedangkan manusia mutlak memerlukan kedua jenis vitamintersebut sebab keduanya tidak dapat disintesis oleh tubuh .

Daging merupakan sumber protein, lemak, mineral dan vitamin yanglarut dalam pelarut lemak bagi manusia . Penentuan vitamin tersebut mulaidilakukan secara individual . Vitamin A dilakukan secara spektrofotometriberdasarkan reaksi CARR - PIERCE, vitamin D berdasarkan reaksi antimon(Ill) chlorida dan vitamin E dengan kalorimetri EMMERSE-ENGELberdasarkan reaksi ion ferro menjadi ferri . Sedangkan teknik KromatografiCair Prestasi Tinggi (HPLC) dapat memisahkan vitamin yang larut dalamlemak secara serentak dan waktu analisis yang singkat .

Pada penentuan dengan HPLC selain jenis kolom pemisahan vitaminyang larut dalam lemak dipengaruhi oleh konsentrasi dan kecepatan alir fasagerak. Makalah ini melaporkan hasil analisis vitamin A, D dan E pada kolomC8 dan C18, serta penentuan konsentrasi dan kecepatan aiir fasa gerak yangoptimal .

Bahan

Daging unggas (ayam) yang diperoleh dari kandang percobaan BalaiPenelitian Ternak Ciawi . Standar vitamin A, D2, D3 dan E dad Sigma

BAHAN DAN METODE

187

Lokakarya Fungsional Non Penelid 1997

chemical . Kloroform, dietileter, etanol absolut, kalium hidroksida dari MERCKpelarut metanol khusus HPLC, vitamin C, disodium-hidrogenfosfat, asam sitratdari AJAX chemical .

Alat digunakan penguap hampa udara (BUCHI ROTAVAPOR),pengering dingin (DYNAVAC), pemanas listrik yang dilengkapi denganpengaduk magnit (HEIDOLP), pengocok ultra sonik (SANOPON), blender danpenyaring FGWP 0,22 .Lm dari MILLIPORE .

HPLC Hewlett Packard model 1084 B yang digunakan dilengkapidengan injektor automatik, detektor variabel ultra violet, 2 wadah fasa gerakdan integrator pengolah. Rever data kolom yang digunakan C18 Reversephase LICHROSORB dengan ukuran (10 4m, 25 cm x 4,6 nm i .d .) dan C8Reverse phase LICHROSORB dengan ukuran (10 µm, 25 cm x 4,6 nm i .d .)dan C8 dengan ukuran (10 µm, 25 cm x 46 mm) .

PERSIAPAN CONTOH DAN EKSTRAKSI VITAMIN

Contoh daging diiris-iris dan dikeringkan dengan kering beku selama 3hari lalu digiling halus berukuran 1 mm mengunakan blender dan disimpanpada suhu 4°C sampai siap dianalisis . Vitamin yang larut dalam lemak bersifatpeka terhadap cahaya, maka selama analisis cahaya Iangsung dihindarkandengan menggunakan wadah yang dilapisi kertas karbon atau aluminium .

Contoh tersebut ditimbang 3 - 5 gr lalu diekstrak 3 kali dengan 30 mlcampuran chloroform : etanol (2 : 1) dengan blender selama masing-masing 3menit. Larutan disaring dengan corong Buchner menggunakan kertas saringWhatman 41, kemudian hasil saringan diuapkan dengan vakum . Residu dicuciatau dilarutkan dengan 50 ml etanol absolut dan dipindahkan ke dalamerlenmeyer bertutup teflon . Larutan residu dalam etanol ditambahkan 1,5 mlkalium hidroksida 15% (w/v) dan 0,5 gr vitamin C sambil dialiri gas N2 laluditutup dengan cepat. Campuran tersebut dikocok di dalam ultra sonik selama30 menit, kemudian didiamkan semalam pada suhu kamar lalu dikocokkembali selama 30 menit dengan ultra sonik .

Campuran tersebut diekstrak dengan 2 x 75 ml dietileter, lalu lapisaneter dicuci 2 kali dengan 40 ml larutan dapar fosfat pH 7,4 dan akhirnyadengan air suling hingga bebas basa (uji kertas pH) . Lapisan eter dipisahkandan diuapkan dengan vakum dan residunya dilarutkan kembali dengan 3 mlmetanol HPLC grade . Larutan disaring dengan kertas saring FGWP 0,22 µm .

Larutan contoh 10 µl disuntikkan pada HPLC dan dielusi dengan larutanmetanol 90% dan 95% . Begitu pula kecepatan alir fasa gerak yaitu 1,5 ml dan2,0 ml/menit pada 2 jenis kolom C18 dan C8 .

1 88

Penentuan perlakuan optimal untuk analisis HPLC dilihat pada wakturetensi yang cepat dan dapat memisahkan setiap komponen vitamin . Datawaktu retensi analisis vitamin A, D2, D3 dan E disajikan dalam Tabel 1 . Padakonsentrasi metanol 90% waktu retensi yang diperlukan untuk vitamin A, D2,D3 dan E lebih lama dibandingkan konsentrasi metanol 95% . Begitupula padakolom C18 dengan konsentrasi metanol 90% tampak lebih lama . Dengankecepatan alir 1,5 mI/menit waktu retensi yang diperlukan lebih lamadibandingkan dengan kecepatan alir 2 ml/menit .

Tabel 1 . Waktu retensi yang diperlukan pada berbagai kecepatan alir, kadarmetanol dan jenis kolom

A : Kadar metanol 90%

Lokakarya Fungsional Non Peneliti 1997

HASIL DAN PEMBAHASAN

T.D . = tidak dilanjutkan

B : Kadar metanol 95%

Jenis kolom mempengaruhi kecepatan waktu retensi . Baik padakecepatan alir 1,5/menit atau 2 mI/menit dan konsentrasi metanol 90% atau,kolom C8 memiliki waktu retensi yang lebih lambat dari kolom C18 . Olehkarena itu setelah mendapatkan puncak vitamin A pada kolom C18konsentrasi metanol 90% tidak dilanjutkan kembali . Walaupun pemisahanpada kolom C8 menghasilkan waktu retensi yang cepat, puncak vitamin D2dan D3 tidak terpisahkan . Vitamin D2 dan D3 keduanya mempunyai strukturmolekul yang hampir sama . Pada kolom C18 vitamin D2 muncul lebih awal

1 89

JenisVitamin

Jenis kolomC8 C18

1,5 mI/menit 2,0 ml/menit1,5 ml/menit 2,0 ml/menit

A 4,44 3,42 7,41 5,78D 2 6,95 5,48 T.D . T.D .D 3 6,95 5,48 T .D . T.D .E 8,87 7,89 T .D . T.D .

JenisVitamin

JenisC8 C18

1,5 ml/menit 2,0 ml/menit1,5 mI/menit 2,0 ml/menit

A 2,87 2,25 4,41 3,28D 2 5,45 2,95 7,83 5,96D 3 5,45 2,95 8,34 6,39E 7,05 3,27 9,50 7,37

dari vitamin D3 karena adanya ikatan rangkap pada C22 - C23 dan gugusanmethyl pada C24 . Sedangkan pemisahan kedua jenis vitamin tersebut kurangsempurna karena faktor pemisahan (resolution factor) lebih kecil dari 1 .

Adapun pemisahan vitamin A, D2, D3 telah dilaporkan oleh Landen(1981) dengan menggunakan kolom ODS (Zorbax), fasa gerak asetonitril danmetilklorida (7 : 3) dan kecepatan alir 1 mI/menit. Waktu yang diperlukanuntuk vitamin tersebut 14 menit . Sedangkan pada kolom C18 konsentrasimetanol 95% dan kecepatan alir 2 ml/menit waktu yang diperlukan untukvitamin tersebut 7,5 menit . Oleh karena itu untuk analisis contoh dagingdilakukan dengan kolom C18, konsentrasi metanol 95% dan kecepatan alir 2ml/menit .

Begitupula data ketelitian dan dapat ulang (recovery) dari standarvitamin yang larut dalam lemak dapat dilihat pada Tabel 2 . Hasil recoveryuntuk vitamin A tampak lebih tinggi yaitu 112 t 16%. Sedangkan untukvitamin D2 menunjukan lebih rendah yaitu 92 ± 14%, demikian juga untukvitamin D3 85 ± 15 %. Adapun recovery untuk vitamin E tampak memuaskanyaitu 104 ± 13 %.

Tabel 2 . Hasil recovery campuran standar vitamin A, D2, D3 dan E

1 90

Lokakarya Fungsionai Non Peneliti 1997

X Recover (%) :

A 112,36 + 16,74%; D 2 92,60±14,28% ;D3 85,16±15,32% ;E 104,61 ± 13,99%

Hasil analisis vitamin A, D2, D3 dan E dari contoh tersebut dapat dilihatpada Tabel 3 . Dari hasil rata-rata tampak vitamin A lebih besar dari vitamin

Jenis Vitamin Vitamin yangdianalisa (mg)

Vitamin yangdidapat (mg)

Recovery (%)

A 15,32 21,83 142,52D 2 6,13 6,66 108,65D 3 1,78 1,67 94,86E 31,87 27,92 87,63A 9,52 10,82 113,70D 2 1,68 1,64 97,62D 3 1,77 1,79 101,13E 4,73 5,84 123,47A 4,10 3,88 94,67D 2 1,69 1,22 72,19D 3 3,44 2,45 71,22E 2,27 2,12 93,39A 18,76 18,49 98,56D 2 0,99 0,91 91,92D 3 2,56 1,88 73,44E 4,37 4,98 113,96

Lokakarya Fungsional Non Peneli8 1997

D2 dan D3 . Sedangkan vitamin E tidak terdeteksi . Keadaan ini diakibatkankarena kandungan vitamin dalam daging terlalu kecil . Untuk melihat konsis-tensi analisis HPLC dilakukan perhitungan standar deviasi . Pada vitamin Adidapat standar deviasi yang lebih tinggi dari vitamin D2 dan D3 . Tetapikoefesien keragaman untuk vitamin A lebih kecil dari vitamin D2 dan D3 . Halini mungkin disebabkan kadar vitamin D jauh lebih kecil dari vitamin A,sehingga perbedaan analisis yang kecil menyebabkan keragaman yang besar .Selain itu pengulangan contoh n = 3 juga mungkin mempengaruhi nilaikeragaman . Walaupun nilai keragaman analisis vitamin lebih besar dari 10%,analisis HPLC tetap merupakan analisis cepat dan sensitif .

Tabel 3 . :Hasil analisis vitamin A, D2, D3 dan E dalam daging ayam

KESIMPULAN

Dari uraian di atas dapat disimpulkan bahwa vitamin yang larut dalamlemak dapat dipisahkan dengan HPLC, kolom C18, konsentrasi metanol 95%dan kecepatan alir 2 mI/menit secara serentak .

DAFTAR BACAAN

Antalick, J .D . 1981 . Determination of vitamin A, D and E by HPLC . AnalAbstracts, 40,3F15 .

Bieri, J.G ., Tolliver T.J ., Catignani G .L. 1980. Simultaneous determinationofalpha-tocopherol and retinol in plasma or red cells by HPLC . AnalAbstracts, 40,1 D208 .

Capuano, A., Daghette A . 1981 . Direct HPLC determination of vitamin A, Eand B6 (retinol, alpha-tocopherol and pyri doxibne respectively) presentin dietetic oils .Anal Ab stract 40, 2F72 .

Deluca, H .F. 1978. The fat soluble Hand Book of lipid research Vol 2 plenum .New York .

1 91

Ulangan Vitamin (mg/100 gr)Contoh A D2 D3 E

1 1,65 0,48 0,52 tidakterdeteksiII 1,39 0,4 0,34 tidak terdeteksiIII 1,32 0,35 0,38 tidak terdeteksiX mg/1 00gr 1,45 0,41 0,41

Std deviasi ±0,17 ±0,07 ±0,09

Keragaman (%) 11,9 16,88 23,07

Lokakarya Fungsional Non Peneliti 1997

Gertz, C. dan Hermanu K. 1982, Determination of tocopherols andTocotrienol in food . Anal abstract 43, 5F13 .

Muniz, J.F., Wehr G .T ., Wehr H .M. 1983. Reversed phase liquid chromatography Determination of vitamin D2 and D3 in milk . AnalAbstracts,44,1 F36 .

Okano, T., Takeuchi A ., Kobayashi T. 1982. Simplified assay of vitamin D2 infortified dried milk by two stage HPLC.Anal Abstracts 43,5F28 .

Pask-Hughes, R .A ., Calan D.H. 1982. Determination of vitamin D3 in Codliver oil by HPLC . J.Chrom 246, 95 -104 .

Paul A.A ., Sautgahe D .A.T . 1978 . The composition of foods her mayesty'sStationaery office London 4 th .

Zonta, F . dan Stancher B. 1982. HPLC of fat soluble vitamin separa tion andindentification of vitamin D2 D3 and their iso mers in food samples inthe presence of vitamin A .E and carotene . J . Chrom 246, 105 - 112 .

1 92