ANA BEATRIZ SOTERO SIQUEIRA - UFPEA Deus, pelo dom da vida e por ser a minha força em todos os momentos. Aos meus pais Elinaldo Siqueira da Silva e Ana Lúcia Sotero Siqueira, por

ANA BEATRIZ SOTERO SIQUEIRA

Perfil Enzimático de Dermatófitos e Avaliação da Atividade

Antifúngica de Própolis e Lectinas

RECIFE-PE 2008

UFPE

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DOUTORADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS


Perfil Enzimático de Dermatófitos e Avaliação da Atividade Antifúngica de Própolis e Lectinas

RECIFE-PE 2008


Perfil Enzimático de Dermatófitos e Avaliação da Atividade Antifúngica de Própolis e Lectinas

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação

em Ciências Biológicas, nível Doutorado, como

parte dos requisitos para obtenção de grau de

Doutor em Ciências Biológicas, na área de

Microbiologia

Orientadora: Profa. Dra. Ana Lúcia Figueiredo Porto

RECIFE-PE 2008

Siqueira, Ana Beatriz Sotero Perfil enzimático de dermatófitos e avaliação da

atividade antifúngica de própolis e lectinas. / Ana Beatriz Sotero Siqueira. – Recife: A Autora, 2008.

177 fls. .: il.

Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) – UFPE. CCB

1. Dermatófitos 2. Atividade antifúngica 3. Própolis

4. Lectinas I.Título

582.28 CDU (2ª. Ed.) UFPE 579.5 CDD (22ª. Ed.) CCB – 2008 –076

AGRADECIMENTOS

À UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO, especialmente ao Curso de Pós-

Graduação em Ciências Biológicas, pela oportunidade oferecida para a realização do Curso de

Doutorado em Ciências Biológicas, área Microbiologia.

À minha eterna Orientadora Profa Dra. ANA LÚCIA FIGUEIREDO PORTO, que

admiro tanto pela dedicação profissional quanto pelo ser humano generoso e sábio que é.

Obrigada pela confiança, pelo estímulo e pelos ensinamentos que sempre me acompanharão.

À minha segunda eterna orientadora Profa Dra. LUSINETE ACIOLE DE QUEIROZ,

pela atenção, confiança, apoio, ensinamentos e antes e durante este trabalho. “Tic, tic , tic, tac...”

Aos professores do Curso de Doutorado em Ciências Biológicas, pelos ensinamentos

prestados durante as disciplinas.

À PhD. RITA DE CÁSSIA CARVALHO MAIA, querida amiga que tanto admiro,

atenciosa, generosa e que sempre se mostrou disposta a colaborar para meu crescimento

profissional.

À Profª. Dra. CRISTINA MARIA DE SOUZA-MOTTA, pela inesquecível e valiosa

contribuição durante o desenvolvimento deste trabalho.

As professoras Dra. REJANE PEREIRA NEVES e Dra. OLIANE MARIA CORREIA

MAGALHÃES, por estarem sempre disponíveis a transmitir ensinamentos, além da amizade e

respeito.

Ao Prof. PhD. ARMANDO MARSDEN, pela contribuição e companheirismo.

À todos os funcionários do Departamento de Micologia e do Laboratório de

Imunopatologia Keizo Asami, desta Universidade, pela ajuda sempre prestada.

Aos amigos do LAViTE/FIOCRUZ: RITA DE CÁSSIA CARVALHO MAIA,

BARTOLOMEU ACIOLE DOS SANTOS, RAFAEL DHALIA, CARLOS EDUARDO

CALZAVARA SILVA e GERUSA BARROS por me receberem de braços abertos dispostos a

ajudar, num momento importante da minha vida.

Ao meu querido amigo BRUNO SEVERO GOMES, por estar sempre ao meu lado,

dividindo comigo todos os momentos durante esses anos. Obrigada, Bruninho, pela ajuda

indispensável, compreensão, amizade sempre presente, por tudo! Esta conquista é nossa.

À minha querida amiga IDALINA CABUIM, pela colaboração, compreensão,

companheirismo e amizade da qual não esquecerei.

Aos amigos GILMARA ARAÚJO e FILIPE DUARTE, pelo incentivo, carinho e

presença constante.

Aos amigos do Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami, CAROLINA

ALBUQUERQUE e RÔMULO LINS pela amizade conquistada e agradável convívio durante

esses anos.

Aos amigos do Laboratório de Micologia Médica, pela amizade e ajuda sempre prestada.

À MINHA FAMÍLIA, pelo amor, paciência, compreensão, presença constante,

enfim...por tudo que faz por mim, impossível de esquecer e grande demais para ser resumido em

poucas palavras.

DEDICO

A Deus, pelo dom da vida e por ser a minha

força em todos os momentos.

Aos meus pais Elinaldo Siqueira da Silva e

Ana Lúcia Sotero Siqueira, por serem a essência

da minha formação pessoal, contribuindo

ativamente para a realização deste dia.

A minha irmã Maria Cecilia Sotero

Siqueira, sempre presente com seu apoio, estímulo

e amizade.

A toda minha grande família por ser um

exemplo de FAMÍLIA e porque é a base necessária

da minha vida

A todos os meus amigos, pelo

companheirismo e estímulo dados todos os dias.

É HOJE Composição: Didi e Maestrinho

A minha alegria atravessou o mar

E ancorou na passarela

Fez um desembarque fascinante

No maior show da terra

Será que eu serei o dono dessa festa

Um rei

No meio de uma gente tão modesta

Eu vim descendo a serra

Cheio de euforia para desfilar

O mundo inteiro espera

Hoje é dia do riso chorar

Levei o meu samba pra mãe de santo rezar

Contra o mal olhado eu carrego meu patuá

Eu levei!

Acredito ser o mais valente nessa luta do rochedo como mar

E como ar!

É hoje o dia da alegria

E a tristeza, nem pode pensar em chegar

Diga espelho meu!

Diga espelho meu

Se há na avenida alguém mais feliz que eu

Diga espelho meu

Se há na avenida alguém mais feliz que eu

LISTA DE FIGURAS

Figura Página

1A Coleta de exsudato resinoso verde por abelha Apis

mellifera..................................................................................

19

1B Coleta de exsudato resinoso vermelho por abelha Apis

mellifera...................................................................................

19

2 Representação esquemática de três tipos de lectinas de

plantas: merolectina, hololectina, quimerolectina...................

65

3 Lectinas com atividade antifúngica e especificidade de

ligação aos carboidratos..........................................................

69

4 Lectinas sem atividade antifúngica e especificidade de

ligação aos carboidratos..........................................................

70

LISTA DE TABELAS

Tabela Página

1 Componentes químicos gerais de amostras de

própolis..........................................................................................

46

2 Compostos químicos da própolis verde do Brasil......................... 57

3 Compostos químicos da própolis vermelha do Brasil................... 62

RESUMO

Dermatófitos são fungos filamentosos capazes de infectar pele, pêlos e unhas. São

classificados nos gêneros Microsporum, Trichophyton e Epidermophyton. Com o

objetivo de analisar o perfil enzimático desses fungos e avaliar atividade antifúngica de

própolis brasileiras (verde e vermelha), como também de lectinas de sementes de

leguminosas do Brasil (DViol, DRL, ConBr e LSL), foram utilizadas trinta amostras de

seis espécies de dermatófitos preservadas na Coleção de Culturas Micoteca - University

of Recife Mycolgy (URM), do Departamento de Micologia, da Universidade Federal de

Pernambuco, sendo cinco amostras de cada espécie: Microsporum canis, Microsporum

gypseum, Trichophyton tonsurans, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum e

Epidermophyton floccosum. Todas as amostras, preservadas ente 2 e 22 anos, foram confirmadas

taxonomicamente. Foi verificado que o período de estocagem não interferiu na capacidade

crescimento e esporulação dos dermatófitos (p-valor < 0.01) e que a estocagem induz ao

pleomorfismo de M. canis, independente do período. Atividade de proteases foi verificada em

57% das amostras. Todas foram capazes de crescer em meio de ágar-queratina e ágar-gelatina,

indicando atividade de queratinases e colagenases, respectivamente. Em nenhuma amostra foi

constatada atividade de fosfolipases mas em 90% foi observada atividade lipásica. O período de

estocagem não interferiu na atividade de proteases, queratinases, colagenases, fospolipases e

lipases. Para verificação da atividade antifúngica foi utilizado o método publicado no documento

M38-A pelo “Clinical and Laboratory Standards Institute”, utilizando como controle o

itraconazol e a terbinafina. A concentração inibitória mínima foi determinada por leitura visual e

por leitor de microplacas. A concentração fungicida mínima foi determinada pela ausência do

crescimento fúngico em meio de cultura Sabouraud líquido. O extrato alcoólico da própolis

verde apresentou atividade fungistática entre 8 e 1024µg/mL e o da própolis vermelha entre 8 e

512µg/mL, variando para cada espécie de dermatófito analisada. O extrato aquoso da própolis

verde e as soluções de lectinas não apresentaram atividade antifúngica. Foi constatado que as

lectinas utilizadas apresentaram discreto efeito estimulador sobre o crescimento dos dermatófitos

em cultivo, e que a lectina DViol também estimulou a esporulação das amostras de E. floccosum.

Dessa forma, foi demonstrado que não houve interferência para expressão enzimática desses

dermatófitos preservados na Coleção de Cultura Micoteca - URM. Foi verificado também que o

potencial antifúngico dos extratos alcoólicos das própolis verde e vermelha para essas espécies,

sugerem aplicações futuras como tratamento alternativo para dermatofitoses.

Palavras chave: dermatófitos, perfil enzimático, própolis verde brasileira, própolis vermelha

brasileira

ABSTRACT

Dermathophytes are a group of filamentous which infect skin, hair and nails. They are

classified in three genera Microsporum, Trichophyton and Epidermophyton. With the

purpose of evaluating the enzymatic profile of dermatophyte samples and the antifungal

activity of brazilian propolis (green and red) and of lectins from legumes seeds of

Brazil (DViol, DRL, ConBr e LSL), were used 30 samples from six different species of

dermatophytes stored for different periods of time at the Mycotheca Cultures Collection

- University of Recife Mycology (URM), from the Federal University of Pernambuco.

They included five samples as following: Microsporum canis, Microsporum gypseum,

Trichophyton tonsurans, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum and

Epidermophyton floccosum. It was observed that the storage period (2 to 22 years) did not affect

growth ability and sporulation among the dermatophytes (p value < 0.01) and storage in general,

induces M. canis pleomorphism, independently to the period of time. Protease activity was

observed in 57% of the samples. All of them were capable of growing in agar-keratin and agar-

gelatin, indicating keratinase and collagenase activity, respectively. None of the samples showed

phospholipase activity, but 90% of them showed lipase activity. The storage period did not

intervene on protease, keratinase, collagenase, phospholipase, and lipase production. In order to

evaluate the antifungal activity, the method was applied as suggested in the M38-A file, reported

by the “Clinical and Laboratory Standards Institute”, using itraconazole and terbinafine as

controls. The inhibitory concentration was determined by both, visual examination and by a

microplate reader. The minimal fungicide concentration was determined by the lack of fungal

growth in Sabouraud culture medium. The green propolis alcoholic extract showed a fungistatic

activity between 8 and 1024µg/mL, and the red propolis between 8 and 512µg/mL, varying

according to the dermatophyte species analyzed. The green propolis aquous extract and the

lectins solutions did not show any antifungal activity. It was observed that the lectins showed a

growth stimulatory effect on the dermatophytes studied. Moreover, the lectin DViol also

stimulated sporulation in E. floccosum samples. In the present study was demonstrated that there

was no interference to the enzymatic profile of the dermatophytes sample from the Mycotheca

Culture Collection - University of Recife Mycology (URM). It was also observed that

the antifungal potential of the alcoholic extracts of the green and red propolis to those

species, suggest their future application as an alternative treatment to dermatophytosis.

Keywords: dermatophytes, enzymatic profile, green brazilian propolis, red brazilian

propolis

SUMÁRIO

Página

AGRADECIMENTOS

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE TABELAS

RESUMO

ABSTRACT

1. INTRODUÇÃO....................................................................................................... 14

2. REVISÃO DA LITERATURA.............................................................................. 21

2.1. Dermatófitos............................................................................................................ 21

2.2. Preservação.............................................................................................................. 24

2.3. Enzimas................................................................................................................... 27

2.4. Drogas antifúngicas e teste de susceptibilidade antifúngica................................ 33

2.5. Própolis.................................................................................................................... 41

2.5.1. Características gerais............................................................................................ 41

2.5.2. Fonte botânica...................................................................................................... 43

2.5.3. Composição química............................................................................................ 44

2.5.4. Atividades biológicas........................................................................................... 49

2.5.5. Extratos alcoólico e aquoso.................................................................................. 52

2.5.6. Própolis verde....................................................................................................... 55

2.5.6.1. Fonte botânica................................................................................................... 55

2.5.6.2. Composição química......................................................................................... 55

2.5.6.3. Atividades biológicas........................................................................................ 58

2.5.6.4. Extratos alcoólico e aquoso............................................................................... 58

2.5.7. Própolis vermelha................................................................................................. 60

2.5.7.1. Fonte botânica................................................................................................... 60

2.5.7.2. Composição química......................................................................................... 61

2.5.7.3. Atividades biológicas........................................................................................ 61

2.6. Lectinas.................................................................................................................... 63

3. OBJETIVOS............................................................................................................. 71

3.1 Objetivo Geral........................................................................................................... 71

3.2 Objetivos Específicos................................................................................................ 71

4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................. 72

5. ARTIGOS................................................................................................................. 109

5.1. Taxonomic aspects and enzymatic profile of dermatophytes samples stored at the

Mycotheca Cultures Collection – University Of Recife Mycology

(URM)….......................................................................................................

110

5.2. Atividade antifúngica da própolis verde e da vermelha do Brasil em relação a

espécies de dermatófitos..................................................................................................

127

5.3. Susceptibilidade de espécies de Trichophyton a própolis verde e a vermelha do

Brasil................................................................................................................................

143

5.4 Efeito de lectinas de leguminosas do Brasil sobre o crescimento in vitro de

dermatófitos.....................................................................................................................

160

6. CONCLUSÕES.......................................................................................................... 177

SIQUEIRA, A.B.S. Perfil enzimático de dermatófitos e avaliação da atividade antifúngica...

14

1. INTRODUÇÃO

Os dermatófitos, agentes etiológicos de dermatofitoses, compreendem um grupo de

fungos filamentosos com propriedades queratinofílicas e queratinolíticas, e são

classificados em três gêneros: Microsporum, Trichophyton e Epidermophyton. São

capazes de infectar pele, pêlos e unhas, sendo diferenciados através de aspectos

macroscópicos, microscópicos e fisiológicos (WEITZMAN; SUMMERBELL 1995;

LARONE 1996; LACAZ et al., 2002). Entretanto, o pleomorfismo comum em dermatófitos

dificulta a manifestação desses aspectos tornando a identificação, por vezes, falha

(RIPPON, 1990; ELEWSKI, 1992; FISHER; COOK, 2001; SIDRIM; ROCHA, 2004;

LACAZ et al., 2002). Um dos parâmetros para classificação taxonômica foi proposto por

Emmons (1934), que estabeleceu como critério a morfologia de esporos e estruturas de

ornamentação, definindo dessa forma os três gêneros (WEITZMAN; SUMMERBELL 1995).

A partir do século XIX a Microbiologia destacou a importância de microrganismos nas

áreas da patologia humana e veterinária, assim como na indústria. O reconhecimento da

importância de fungos e bactérias levou ao aprimoramento de diferentes métodos para isolamento

e cultivo. A contínua obtenção de novas culturas e a necessidade da manutenção para fins de

estudos, conduziu à formação de vastas coleções de culturas de microrganismos em diversos

centros de pesquisas científicas e industriais (FIGUEIREDO, 2001).

A preservação de culturas puras é importante para estudos taxonômicos, identificação de

agentes etiológicos (LIMA; BORBA, 2001; GIRÃO et al., 2004; LIMA et al., 2004; BEZERRA et

al., 2006), atividades de ensino, testes de controle de qualidade de produtos e materiais, entre

outros (MELLO et al., 2003; CANHOS...). São importantes a conservação de aspectos

taxonômicos, fisiológicos, genéticos e a estabilidade metabólica de fungos preservados, pois os

mesmos podem ser utilizados como amostras de referência (MELLO et al., 2003; BAKER;

JEFFRIES, 2006; CANHOS...).

Fungos isolados, identificados e preservados de forma adequada, podem ser armazenados

por longos períodos (CANHOS...). Vários métodos de preservação de culturas de fungos têm sido

descritos, sendo que a escolha depende principalmente da disponibilidade da coleção de culturas e

da manutenção de características biológicas (SMITH; ONIONS, 1994; BUENO; GALLARDO,

1998; PANIZZO et al., 2005; NAKASONE et al...).

Os principais métodos empregados para manutenção de culturas de fungos incluem

repiques periódicos com cultivos a temperatura ambiente (SMITH; ONIONS, 1994; APARECIDO

et al., 2001; DESHMUKH, 2003; BORMAN et al., 2006; SOARES JUNIOR et al., 2007;


15

NAKASONE et al...) ou em baixas temperaturas (FIGUEIREDO, 2001; NAKASONE et al...), sob

óleo mineral (BORBA; RODRIGUES, 2000; FIGUEIREDO, 2001; LIMA et al., 2004; BORBA et

al., 2005; BEZERRA et al., 2006), em água destilada e esterilizada (método de Castellani, 1967)

(FIGUEIREDO, 2001; BORMAN et al., 2006), em solo (BAKERSPIEGEL, 1953; FERRETI-DE-

LIMA; MORAES-BORBA, 2001; BORMAN et al., 2006), em areia (FENG; HUA, 2005;

BORMAN et al., 2006), liofilização (FIGUEIREDO, 2001; NAKASONE et al...), congelamento

a -20 ou -80ºC (FIGUEIREDO, 2001; GINDRO; PEZET, 2001; BRILHANTE et al., 2004),

sílica-gel (FIGUEIREDO, 2001) e criopreservação em nitrogênio líquido (JONGS; DAVIS, 1979;

RYBNIKAR, 1995; RYAN et al., 2001; BORMAN et al., 2006).

A Micoteca do Departamento de Micologia, do Centro de Ciências Biológicas da

Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), registrada no Commonwealth Mycological Institute

sob a sigla URM (University of Recife Mycology), contem atualmente cerca de 8.000 culturas de

fungos filamentosos e leveduras, mantidas em duplicata, identificadas em nível de espécie e

preservadas pelos métodos de óleo mineral, liofilização e de Castellani (MICOTECA URM...).

Para preservação de dermatófitos, os métodos mais utilizados são os de óleo mineral

(SCHONBORN,1989; DESHMUKH, 2003; BRILHANTE et al., 2004) e/ou de Castellani

(DESHMUKH, 2003; BORMAN et.al., 2006; NAKASONE et al...). A indicação para utilização

do óleo mineral se faz para fungos filamentosos ou com dificuldade para esporulação. Além disso,

o método é recomendado para coleções localizadas nos trópicos, devido as intercorrências

causadas por ácaros. Em relação ao método de Castellani, o objetivo é evitar o pleomorfismo.

Ambos mantêm a viabilidade da cultura por períodos prolongados (FIGUEIREDO, 2001).

Além da natural variabilidade fenotípica de dermatófitos (REBELL; TAPLIN, 1979;

LACAZ et al., 2002), as amostras preservadas podem sofrer alterações, sendo que as mais

observadas são diminuição da esporulação e da pigmentação, como também notável produção de

micélio aéreo de textura algodonosa (BRILHANTE et al., 2004; BORMAN et al., 2006).

Esses fungos apresentam características taxonômicas, antigênicas e patógenas similares,

mas com diferenças nutricionais e enzimáticas (LACAZ et al., 2002).

Os dermatófitos produzem várias enzimas que estão significantemente envolvidas na

obtenção de nutrientes para crescimento do fungo, especialmente na fase micelial (WEITZMAN;

SUMMERBELL, 1995; KITAJMA, 2000).

Enzimas como proteases, queratinases, fosfolipases e lipases são importantes na

patogencidade e podem ser secretadas para o meio de cultura durante o crescimento no substrato

(KURNET; KASAFÍREK, 1988; PAPINI; MANCIANTI, 1995; TRABULSI et al., 1999;

ABDEL-RAHMAN, 2000). Por isso, uso de meio de cultura sólido permite detecção da atividade


16

enzimática e vem sendo utilizada por vários autores (HANKIN; ANAGNOSTAKIS, 1975;

PRICE; CAWSON, 1977; PRICE et al., 1982; WAWRZKIEWICK et al., 1991; AOKI et al.,

1994; CORDEIRO NETO, 1997; MUHSIN et al., 1997; FRIEDRICH et al.,1999; DOS SANTOS

et al., 2001; LACAZ et al., 2002; CARVALHO, 2003).

Urease foi a primeira enzima isolada e é utilizada para diferenciação entre Trichophyton

mentagrophytes e T. rubrum (LACAZ et al., 2002).

Proteases, principalmente queratinases, são bastante estudadas e estão envolvidas em

infecções por dermatófitos (WEITZMAN; SUMMERBELL, 1995; SIMPANYA; BAXTER, 1996;

MAIA et al., 2001; ABDEL-RAHMAN 2002). Entretanto outros autores não reconhecem a

participação dessas enzimas no processo de infecções fúngicas, pois alguns fungos não produtores

de tais enzimas foram isolados de dermatomicoses, enquanto outros que a produzem, não causam a

doença (ABDEL-GAWAD, 1997; LACAZ et al., 2002; MUHSIN; HADI, 2002).

Queratinases apresentam habilidade para digerir queratina pela quebra das ligações

dissulfeto. Essas enzimas já foram detectadas de várias espécies de dermatófitos que utilizam a

proteína como fonte de carbono e nitrogênio para crescimento (DESHMUKH; AGRAVAL, 1982;

WAWRZKIEWICZ et al., 1991; LOPEZ-MARTINEZ et al., 1994; AUBAID; MUHSIN, 1998;

MIGNON et al., 1998; VIANI et al., 2001; ABDEL-RAHMAN, 2002).

Colagenases são bastante utilizadas no debridamento químico do colágeno, pela

decomposição das fibras dessa proteína com exclusiva capacidade (VICTORIA...). Essas enzimas

já foram detectadas de espécies de dermatófitos pertencentes aos três gêneros (RIPPON;

GARBER, 1969; LOPEZ-MARTINEZ, 1994).

As lipases auxiliam os dermatófitos a superarem a ação de ácidos graxos fungistáticos

presentes na pele (PAPINI; MANCIANTI, 1995; TRABULSI et al., 1999) e as fosfolipases podem

causar danos à membrana da célula hospedeira pela degradação de fosfolipídeos que são

freqüentemente encontrados fazendo parte da membrana celular (LEHNINGER, 1993; HANEL et

al., 1995; IBRAHIM et al., 1995; STRYER, 2001). Essas enzimas também já foram constatadas

em de amostras de dermatófitos (DAS; BANERJEE, 1977; MAIA et al., 2001).

Durante os últimos anos, vem sendo citado o aumento de infecções fúngicas inclusive de

dermatofitoses, devido ao aumento de casos e da sobrevida de pessoas com doenças

imunossupressoras, tais como nos casos de transplante, câncer e HIV/AIDS (TSANG et al., 1996;

PORRO et al., 1997; SQUEO et al., 1998; GARCÍA et al., 2003; FERNÁNDEZ-TORRES et al.,

2002, FERNÁNDEZ-TORRES et al., 2003a; BERGOLD; GEORGIADIS 2004). Nesses casos, a

doença deixa de ser superficial e atinge camadas mais profundas da derme causando lesões

granulomatosas (ESTUDO...).


17

Geralmente, as micoses superficiais respondem bem aos antifúngicos de aplicação tópica,

entretanto a terapia local pode ser insuficiente em lesões extensas, profundas, em tinea unguium e

tinea capitis (FERNÁNDEZ-TORRES et al., 2001).

Em infecções mais brandas, o tratamento com antifúngico tópico tem como base o uso de

derivados imidazólicos, dos quais, clotrimazol, oxiconazol, miconazol, isoconazol, cetoconazol,

bifonazol, flutrimazol, erbeconazol são comumentes utilizados (FERNÁNDEZ-TORRES et al.,

2003a). Outros antifúngicos de uso tópico como terbinafina, ciclopirox, olamina,

amorolfina, butenafina também são bastante mencionados (FREEDBERG et al., 2003). Na prática

médica-clínica, para o tratamento de infecções crônicas ou severas, terbinafina, itraconazol e

fluconazol são mais utilizadas (FERNÁNDEZ-TORRES, et al., 2001, FERNÁNDEZ-TORRES et

al., 2003a).

Entretanto, essa micose pode ser resistente a terapia e a resposta ao tratamento pode não ser

adequada (BARCHIESI, et al., 2001; FAVRE et al., 2004). Além disso, sabe-se que o tratamento

prolongado pode gerar efeitos tóxicos ao organismo, visto que os antimicóticos também atuam

sobre outras células (GIORDANI et al., 2001), o que torna necessário o desenvolvimento de novas

estratégias terapêuticas (FOSTEL; LARTEY, 2000; TATSUMI et al., 2002; GARCÍA et al., 2003;

FERNÁNDEZ-TORRES et al., 2006).

Atenção especial tem se voltado para derivados naturais, com base no conhecimento da

produção de compostos antifúngicos pela natureza (WOJTASZEK, 1997; GURGEL et al., 2005).

Com o passar do tempo, produtos naturais como própolis estão sendo cada vez mais utilizados na

medicina (ACKERMANN, 1991; PARK et al., 1998a).

Própolis é um material resinoso de coloração e consistência variada, de composição

química complexa e elaborado por abelhas a partir da coleta de exsudatos de diversas partes das

plantas (BURDOCK, 1998; PARK et al., 1998a; BANKOVA et al., 2002; CASTALDO;

CAPASSO, 2002; BANKOVA, 2005a, BANKOVA, 2005b; FERNANDES JUNIOR et al., 2006).

É utilizada pelas abelhas para proteger a colméia de insetos e microrganismos invasores,

pelo emprego de uma fina camada que reveste tanto a entrada como o interior da colméia.

Também é utilizada para selar rachaduras, manter asséptico o ambiente interno da colméia,

preparar locais assépticos para a postura da abelha rainha e embalsamar invasores (BURDOCK,

1998; KUJUMGIEV et al., 1999; BANKOVA et al., 2000; SAWAYA et al., 2002; KOC et al.,

2005; FUNARI; FERRO, 2006).

A própolis verde do Brasil é nativa da região central do país mas pode ser encontrada em

outras regiões (KUMAZAWA et al., 2003). É elaborada por abelhas Apis mellifera a partir da

coleta de exsudatos de Baccharis dracunculifolia, comumente conhecida como alecrim-do-campo


18

ou vassourinha (PARK et al., PARK et al., 2002a, PARK et al., 2002c; ALENCAR et al., 2005a;

BANKOVA, 2005a, BANKOVA, 2005b) (Figura 1A).

A própolis vermelha foi recentemente encontrada em colméias localizadas no caule de

arbustos de manguezais como também ao longo da costa dos rios e mar dos estados da Paraíba,

Pernambuco, Alagoas, Sergipe e Bahia (Brasil). Foi observado que as Apis mellifera coletavam o

exsudato vermelho da superfície e dos buracos no tronco de Dalbergia ecastophyllum conhecida

como rabo-de-bugio, assumindo ser essa é a origem botânica da própolis vermelha (TRUSHEVA

et al., 2006; DAUGSCH et al. 2007) (Figura 1B).

Própolis apresenta diversas propriedades biológicas como antifúngica, antimicrobiana,

antiviral, antiinflamatória, antitumoral, cicatrizante, antioxidante, imunoestimulatória,

hepatoprotetora, entre outras (PARK et al., 1998a; PARK et al., 1998b; BANKOVA et al., 2000;

KOO et al., 2000; MARCUCCI et al., 2001; MURAD et al., 2002; KUMAZAWA et al., 2004;

CUSHNIE; LAMB, 2005; BANKOVA, 2005a; BANKOVA, 2005b). Por isso, vem sendo

utilizada pelo homem e a partir da década de 60 tornou-se objeto de intensos estudos

farmacológicos e químicos (BURDOCK, 1998; BANKOVA et al., 2000; CASTALDO;

CAPASSO, 2002; BANKOVA, 2005a; BANKOVA, 2005b).

A ação antifúngica e a antibacteriana estão entre as mais estudadas (MARCUCCI, 1995;

BURDOCK, 1998). A ação antifúngica da própolis já foi verificada em dermatófitos dos gêneros

Microsporum e Trichophyton (DOBROWOLSKI et al., 1991; SOARES; CURY, 2001; KOC et

al., 2005), em leveduras do gênero Candida (KUJUMGIEV et al., 1999; OTA et al., 2001;

SAWAYA et al., 2002; SANTOS et al., 2005), em Paracoccidioides brasiliensis (MURAD et al.,

2002) Cryptococcus neoformans (FERNANDES et al., 2007) e em outros fungos filamentosos

como espécies de Aspergillus, Penicillium e Cladosporium (ZHENG et al., 1996; AFOLAYAN;

MEYER, 1997). A combinação de drogas antifúngicas com própolis aumenta ainda mais a

atividade sobre os fungos (HEGAZI et al., 2000; SOARES; CURY, 2001).


19

Figura 1A. Coleta de exsudato resinoso verde por abelha Apis mellifera. Fonte:http://www.bioessens.com/images/propolis.jpg Figura 1B. Coleta de exsudato resinoso vermelho por abelha Apis mellifera. Foto gentilmente cedida pela Pharma Néctar®.

A

B


20

Além da própolis, lectinas são investigadas pela participação em diversas atividades

biológicas como antiproliferativa (WANG et al., 1995; WONG; NG, 2003), antitumoral (WANG

et al., 1996; ABDULLAEV; MEJIA, 1997; WANG et al., 2000; NGAI; NG, 2004),

imunomodulatória (WANG et al., 1996; SHE et al., 1998; WANG; NG, 2002; RUBINSTEIN et

al., 2004), estimulação de macrófagos, acumulação de leucócitos (RODRIGUEZ et al., 1992),

indução da produção de interferon gama por linfócitos humanos (BARRAL-NETTO et al.,

1992), liberação de histamina (GOMES et al., 1994), efeitos edematogênicos e migração celular

(BENTO et al., 1993), antifúngica (CIOPRAGA et al., 1999; YE et al., 2001; DAMICO et al.,

2003; TRINDADE et al., 2006), antibacteriana (AYOUBA et al., 1994), anti HIV (PEUMANS;

VAN DAME, 1995; OOI et al., 2000; YE et al., 2001; WONG; NG, 2003; BARRIENTOS;

GRONENBORN, 2005; WONG; NG, 2005), antiinseto (PEUMANS; VAN DAME, 1995),

armazenamento e transporte de carboidratos e proteínas, armazenamento de nitrogênio, defesa da

planta (PEUMANS; VAN DAME, 1995; RÜDIGER, 1997; NOMURA et al., 1998), entre outras.

Lectinas são proteínas ou glicoproteínas não pertencentes ao sistema imunológico, que se

ligam especificamente e reversivelmente a mono e oligossacarídeos livres ou na forma de

glicoconjugados (glicoproteína e glicolipídeo). Dessa forma, combinam-se com moléculas e

estruturas biológicas que contem esses açucares sem alterar a estrutura covalente das ligações

glicosídicas nos sítios de ligação (MOREIRA et al., 1996; MOREIRA et al., 1997; CAVADA et

al., 1998, LIS; SHARON 1998; DAMICO et al., 2003; CHEN et al., 2005; CHUMKHUNTHOD

et al., 2006; WONG et al., 2006). Promovem reações celulares como o reconhecimento celular e

comunicação entre as células (DE SOL et al., 2005). Algumas são metaloproteínas, necessitando

de Ca2+, Mn2+ e Mg2+ para completo funcionamento (CAVADA et al., 1998).

São encontradas em ampla variedade em espécies de animais, plantas, fungos, bactérias e

vírus (GRIFFIN, 1993; PEUMANS; VAN DAMME, 1995; WANG et al., 1996; LIS; SHARON,

1998; CAVADA et al., 1998; NGAI; NG, 2004; XIA; NG, 2005; CHUMKHUNTHOD et al.,

2006), entretanto estão presentes em maior quantidade em grãos de leguminosas e gramíneas

(MOREIRA et al., 1996; RAMOS et al., 1996; CAVADA et al., 1998; INA et al., 2005).

Canavalia brasiliensis, Dioclea violacea e D. rostrata são leguminosas de onde são

extraídas as lectinas ConBr, DVioL e DRL, respectivamente (CAVADA et al., 1996; BARBOSA

et al., 2001), as quais têm afinidade por glicose e manose (CAVADA et al.,. 1993; CAVADA et

al., 1996). Essas lectinas já demonstraram indução da produção de histamina em ratos (GOMES et

al., 1994), produção de óxido nítrico (ANDRADE et al., 1999), além do efeito protetor in vivo

contra infecção por Leishmania amazonensis em camundongos BALB/c (BARRAL-NETTO et


21

al., 1996), estimulação linfocitária em humanos (BARRAL-NETTO et al., 1992), estimulação da

produção de macrófagos e linfócitos em camundongos C3H/HeJ (RODRIGUEZ et al., 1992).

Lonchocarpus sericeus é uma leguminosa de onde é extraída a lectina LSL (NAPIMONGA

et al., 2007) com afinidade por N-acetilglicosamina, a qual já demonstrou atividade

antiinflamatória em casos de peritonite em ratos, notável diminuição de bactérias que

colonizavam essa região peritoneal (ALENCAR et al., 2005c) e inibição da migração de

neutrófilos em processos inflamatórios (NAPIMONGA et al., 2007).

Lectinas com propriedades antifúngicas já foram isoladas de sementes de leguminosa (YE

et al., 2001) de frutas (FREIRE et al., 2002; DAMICO et al., 2003; TRINDADE et al., 2006), de

fungos (VIARD et al., 1993; CHUMKHUNTHOD et al., 2006), de urtiga (BROCKAERT et al.,

1989), de batata (GOZIA et al., 1993), de germe de trigo (CIOPRAGA et al., 1999) e de erva

chinesa (YAN et al., 2005).

Entretanto, algumas lectinas de leguminosas não apresentam essa atividade (YE; NG,

2001; NG et al., 2002; WONG; NG, 2003; WONG et al., 2005; WONG et al., 2006) e outras

apresentaram efeito ativador da cinética do crescimento do fungo em cultivo (VIARD et al., 1993;

PÉREZ-SANTIAGO et al., 2000; HERNÁNDEZ et al., 2003).

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. DERMATÓFITOS

Dermatófitos são fungos que tem afinidade pela queratina da pele, pêlo e unha. Apresentam

ampla distribuição geográfica mas algumas espécies podem prevalecer em determinadas regiões, o

que está associado a variáveis como a adaptação do fungo ao ecossistema, migrações e/ou viagens,

condições sócio-econômicas e o grau de higiene das pessoas (SOYINKA, 1978; AZULAY, 1989;

AL-FOUZAN et al., 1993; OMIDYNIA et al., 1996; ASTE et al., 1997; ALI-SHTAYEH et al.,

1998; SIDRIM; ROCHA, 2004).

Esses fungos são agentes etiológicos de dermatofitoses que são comuns e endêmicas na

América Latina (WANK et al., 1991). A instalação da infecção por dermatófito inicia-se pela

inoculação de artrosporo depositado sobre a pele, favorecido por lesão cutânea ou escoriação pré-

existente (SIDRIM; ROCHA, 2004) e notável habilidade enzimática para degradar a queratina

(ABDEL-RAHMAN, 2000; SIMPANYA, 2000; MACÊDO et al., 2005).


22

As espécies prevalentes no nordeste do Brasil são Microsporum canis, M. gypseum,

Trichophyton mentagrophytes, T. tonsurans, T. rubrum e Epidermophyton floccosum, com

destaque para M.canis, T. tonsurans e T. rubrum (COSTA et al., 1991; SIDRIM; ROCHA, 2004).

Cerca de 23 a 70% dos casos de dermatofitoses podem ser promovidos por M. canis e T.

tonsurans, juntos (BRILHANTE et al., 2000; FERNANDES et al., 2001; ABDEL-RAHMAN,

2002; DIAS et al., 2003; BARROS, 2004).

A espécie T. rubrum é antropofílica e de distribuição mundial. É responsável por 70% dos

casos de dermatofitoses no mundo (APODACA; MCKERROW, 1990; SAMDANI et al., 1995;

COSTA et al., 2002; ESQUENAZI et al., 2004; SANTOS; HAMDAN, 2005) e por 50% no

nordeste brasileiro (BRILHANTE et al., 2000; DOS SANTOS et al., 2001; PONTES et al., 2002;

BARROS, 2004). É citada como agente etiológico predominante de dermatofitoses de pé,

tornozelo, regiões plantar e palmar no Reino Unido, como também de onicomicose nos Estados

Unidos, Europa (SAMDANI et al., 1995; VENKATESAN et al., 2007) e Brasil (LOPES et al.,

1994; AQUINO et al., 2007).

De acordo com Weitzman e Summerbell (1995) e Lacaz et al. (2002) a História da

Micologia Médica teve início em meados do século XIX a partir de colaborações de três

pesquisadores europeus: Robert Remak, Johann Schönlein e David Gruby. As primeiras

observações de estruturas microscópicas, foram de lesões de favo (tinea capitis), feitas por Robert

Remak em 1835, o qual não reconheceu as estruturas fúngicas e creditou esse reconhecimento a

Schönlein, que descreveu a natureza micótica em 1839. Posteriormente, Remak estabeleceu essa

micose como infecciosa, a partir do cultivo do agente etiológico em fatias de maçã, denominando

de Achorion schoenleinii. Valiosos achados sobre dermatomicologia também foram escritos por

David Gruby entre 1841 e 1844, através de comunicados enviados a French Academy of Science e

publicações nesse mesmo período. Independente dos achados de Remak e Schönlein, Gruby

descreveu o agente etiológico do favo, o parasitismo ectotrix (ao redor do pêlo), os aspectos

clínicos da lesão e estabeleceu a natureza contagiosa dessa doença. Em 1843 denominou o agente

etiológico de Microsporum devido ao pequeno tamanho dos esporos ao redor do pêlo e

posteriormente identificou como M. audouinii.

O gênero Trichophyton foi observado pela primeira vez por Gruby em 1844, a partir de

observações de estruturas fúngicas em amostras clínicas de pêlos e escamas epidérmicas do couro

cabeludo, entretanto esse gênero não foi nomeado. No ano seguinte, Malmsten consultando as

informações de Gruby para publicar sobre aspectos clínicos de lesão de couro cabeludo, observou

que as estruturas fúngicas por ele observadas, eram semelhantes às observadas por Gruby.


23

Malmsten denominou o agente etiológico de Trichophyton pela afinidade desse fungo por pêlos. A

espécie observada foi T. tonsurans (GEORG, 1956; WEITZMAN; SUMMERBELL, 1995).

O nome Epidermidophyton foi proposto por Langeron em 1879, para designar agente

etiológico de micose de pele. Em 1907, Raymond Sabouraud propôs o nome Epidermophyton pela

constatação de estruturas fúngicas em escamas epidérmicas (McGINNS et al., 1981). Esse fungo é

antropofílico e de um modo geral pode ser agente etiológico de tinea curis, tinea pedis e tinea

corporis (LACAZ et al., 2002; AQUINO et al., 2007).

Em 1910, Sabouraud publicou uma obra clássica, “Les Teignes”, propondo classificação

para dermatófitos a partir de achados microscópicos de parasitismo no pêlo e em escamas

epidérmicas, aspectos clínicos da lesão, métodos de cultivo e observações macroscópicas. Dessa

forma, os dermatótifos foram classificados em quatro gêneros: Achorion, Microsporum,

Trichophyton e Epidermophyton. A base do meio para cultivo (dextrose e ágar) desenvolvido na

época, é utilizada até hoje, embora a composição tenha sido modificada e em homenagem, é

denominado de ágar Sabouraud (WEITZMAN; SUMMERBELL, 1995; LACAZ et al., 2002).

Emmons (1934) propôs uma nova classificação para os dermatófitos, modificando a de

Sabouraud. Estabeleceu como critério a morfologia de esporos e estruturas de ornamentação, no

qual extinguiu o gênero Achorion, proposto por Sabouraud, inserindo-o no gênero Trichophyton.

Essa classificação é atualmente mantida e composta por três gêneros: Microsporum, Trichophyton

e Epidermophyton (LACAZ et al., 2002).

As principais características que distinguem os gêneros Microsporum, Trichophyton e

Epidermophyton são: presença de macroaleurias fusiformes; presença abundante de microaleurias

e presença de macroaleurias em forma de raquete, respectivamente (REBELL; TAPLIN, 1979;

LARONE, 1996; LACAZ et al., 1998; LACAZ et al., 2002).

Cole e Samson (1979) demonstraram que a ontogenia holotálica de esporor de

Microsporum e Trichophyton é a mesma. De Hoog et al. (1998) estudando a taxonomia de fungos

de interesse médico e a filogenia molecular, verificaram que os gêneros Microsporum e

Trichophyton são parafiléticos e o Epidermophyton é polifilético.

Apesar de ser um grupo extenso com características taxonômicas, antigênicas e patógenas

similares, apresentam diferenças nutricionais e enzimáticas (LACAZ et al., 2002). O pleomorfismo

comum em dermatófitos pode dificultar a manifestação de características taxonômicas, refletindo

em dificuldade para identificação (RIPPON, 1990; ELEWSKI, 1992; FISHER; COOK, 2001;

LACAZ et al., 2002; SIDRIM; ROCHA, 2004). Essa alteração genética pode acontecer quando há

repiques sucessivos do fungo para meio artificial ou quando é submetido à condição de


24

preservação, na qual há uma diminuição do metabolismo (KRAMER; MIX, 1957; DESHMUKH,

2003).

2.2. PRESERVAÇÃO

O contínuo isolamento de fungos e a necessidade da manutenção para estudos de

taxonomia, patologia ou industriais, conduzem à formação de vastas coleções de culturas de

fungos preservados de tal forma que permita principalmente a conservação de características

taxonômicas, genéticas e atividades biológicas (FIGUEIREDO, 2001; GIRÃO et al., 2004;

DIOGO et al., 2005).

Coleções de culturas de fungos são centros de excelência que atuam como unidades de

conservação e exploração principalmente de recursos taxonômicos, genéticos e metabólicos desses

organismos, cujo principal objetivo é adquirir fungos relevantes para estudos científicos e de

aplicações, oferecendo serviços fundamentais para a comunidade científica e tecnológica

(CANHOS...).

O principal objetivo da preservação de culturas é manter as mesmas em estado viável, sem

mudanças taxonômicas, fisiológicas e genéticas até que sejam requeridas para pesquisas. Para

garantir a completa viabilidade e estabilidade, são utilizados métodos que têm o princípio de

diminuir o metabolismo celular dos fungos (SMITH; ONIONS, 1994; NEUFELD; SARQUIS,

2003).

Os principais métodos empregados para manutenção de culturas de fungos incluem

repiques periódicos com cultivos a temperatura ambiente (SMITH; ONIONS, 1994; APARECIDO

et al., 2001; DESHMUKH, 2003; BORMAN et al., 2006; SOARES JUNIOR et al., 2007;

NAKASONE et al...) ou em baixas temperaturas (FIGUEIREDO, 2001; NAKASONE et al...), sob

óleo mineral (BORBA; RODRIGUES, 2000; FIGUEIREDO, 2001; LIMA et al., 2004; BORBA et

al., 2005; BEZERRA et al., 2006), em água destilada e esterilizada (método de Castellani, 1967)

(FIGUEIREDO, 2001; BORMAN et al., 2006), em solo (BAKERSPIEGEL, 1953; FERRETI-DE-

LIMA; MORAES-BORBA, 2001; BORMAN et al., 2006), em areia (FENG; HUA, 2005;

BORMAN et al., 2006), liofilização (FIGUEIREDO, 2001; NAKASONE et al...), congelamento a

-20 ou -80ºC (FIGUEIREDO, 2001; GINDRO; PEZET, 2001; BRILHANTE et al., 2004), sílica-

gel (FIGUEIREDO, 2001) e criopreservação em nitrogênio líquido (JONGS; DAVIS, 1979;

RYBNIKAR, 1995; RYAN et al., 2001; BORMAN et al., 2006).

De acordo com Figueiredo (2001) as primeiras coleções mundiais eram mantidas por

repicagens constantes. Além de ser um trabalho exaustivo, problemas como perda de viabilidade,


25

alterações fisiológicas de aspecto e pigmentação, decréscimo ou perda da capacidade de

esporulação e da patogenicidade apareciam constantemente. Assim, para preservação por longos

períodos, tornou-se necessário desenvolver outros métodos que mantivessem as culturas viáveis e

menos sujeitais a variações.

A Coleção de Culturas Micoteca - University of Recife Mycology (URM) do

Departamento de Micologia, do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de

Pernambuco, foi fundada em 1954 pelo Professor Augusto Chaves Batista, utilizando óleo mineral

como método de preservação (SHERF, 1943). Atualmente, o acervo contém aproximadamente

8.000 culturas de fungos, sendo cerca de 1.300 de leveduras e 6.700 de fungos filamentosos, todas

identificadas em nível de espécies e mantidas em duplicata em cada método de preservação. Todos

os fungos dessa Coleção são mantidos em óleo mineral e por liofilização (RAPER;

ALEXANDER, 1945). O método de Castellani é utilizado apenas para Zygomycetes e para as

espécies patógenas ao homem e vegetais (MICOTECA URM...).

Para preservação de dermatófitos, de modo geral, os métodos mais utilizados são os de óleo

mineral (SCHONBORN, 1989; DESHMUKH, 2003; BRILHANTE et al., 2004) e/ou o de

Castellani (DESHMUKH, 2003; BORMAN et al., 2006; NAKASONE et al...). A indicação para

utilização do óleo mineral se faz para fungos filamentosos ou com dificuldade para esporulação.

Além disso, o método é recomendado para coleções localizadas nos trópicos, devido à

intercorrências causadas por ácaros. O método de Castellani tem o objetivo de evitar o

pleomorfismo. Ambos mantêm a viabilidade da cultura por períodos prolongados (FIGUEIREDO,

2001).

De acordo com Fennel (1960), o método de óleo mineral foi inicialmente utilizado por

Lomiére e Chevrotier para aumentar a longevidade e reduzir a variabilidade de cultura de

Gonococcus, passando depois a ser aplicado também para fungos. A experiência demonstrou que

pelo emprego desse método, as repicagens da maioria das espécies pertencentes à Coelomycetes e

alguns basidiomicetos podem ser realizadas em intervalos de 12 a 24 meses, sem problemas.

Para preservação sob óleo mineral, é necessário que culturas fúngicas jovens desenvolvidas

pelo método clássico em tubos contendo meio de cultura solidificado e inclinado a 30º com a

horizontal, sejam submersas em uma camada de óleo mineral esterilizado. Previne-se desta forma

desidratação do meio de cultura, reduzindo a atividade metabólica e o crescimento, por reduzir a

tensão de oxigênio. A reativação é feita pela remoção de um fragmento da cultura e transferência

para meio líquido ou sólido (SMITH; ONIONS, 1994; FIGUEIREDO, 2001; NAKASONE et

al...).


26

Foi verificado que culturas submersas sob 1 cm de óleo mineral têm o consumo de

oxigênio reduzido cerca de 10% em poucas horas, e que a redução da atividade metabólica é

evidenciada pelo retardamento do crescimento e da esporulação. Camada de óleo superior a 1 cm

sobre a superfície de crescimento é indesejável, pois diminui o tempo de viabilidade das culturas.

Há evidências de que o óleo mineral em condições de total exaustão do oxigênio torna-se tóxico

para a maioria dos microrganismos (FIGUEIREDO, 2001).

Há relatos da aplicação desse método em centros de preservação de fungos como o New

York Botanical Garden (New York, U.S.A.), American Type Culture Collection (Maryland,

U.S.A.), Comunicable Disease Center (Georgia, U.S.A.), Lilly Research Laboratories (Indiana

U.S.A.), Harvard University (Massach. U.S.A.), Agricultural Research Service (Wash U.S.A.),

Commonwealth Mycological Institute (Kew, Inglaterra) (FIGUEIREDO, 2001).

Schonborn (1989) avaliaram amostras de dermatófitos preservados em óleo mineral e

verificaram viabilidade de 50% das culturas preservadas no período de 2 a 15 anos.

Smith e Onions (1994) citam a boa preservação de espécies de Aspergillus e Penicillium

por 40 anos, sob óleo mineral.

Borba e Rodrigues (2000) constataram viabilidade e perda de capacidade de esporulação

em 20 amostras de Coelomycetes, entre 34 analisadas após 50 anos de preservação sob óleo

mineral. Mas, o grau de variações está mais relacionado a espécie do fungo do que com a

preservação.

Deshmukh (2003) constataram a manutenção de características taxonômicas de

Microsporum e Trichophyton preservados em óleo mineral por sete anos e em água destilada e

esterilizada entre sete a dez anos.

Brilhante et al. (2004) constataram pleomorfismo com desenvolvimento de hifas estéreis

em amostras de M. canis estocadas sob óleo mineral por nove meses.

Borman et al. (2006) constataram que M. canis, T. rubrum e T. tonsurans preservados em

água destilada esterilizada por um período de 2 meses a 21 anos, apresentaram aspectos de

pleomorfismo (micélio algodosono, redução da pigmentação e da esporulação) a partir do quinto

ano de preservação em mais de 20% do grupo analisado, com formação de micélio estéril e

dificuldade de esporulação. Dermatófitos criopreservados por até 2 anos, mantiveram

características taxonômicas típicas (BAKER; JEFFRIES et al., 2006).

Lima et al. (2004) detectaram que amostras preservadas sob óleo mineral de Blastomyces

dermatitidis e Paracoccidioides brasiliensis, apresentaram-se incapazes de completar o

dimorfismo após reativação. Borba et al. (2005) constataram alterações morfológicas em amostras

de P. brasiliensis estocadas sob óleo mineral.


27

Braz (2007) demonstrou preservação de características morfológicas e capacidade de

produção enzimática de 31 amostras de Acremonium sp. preservadas sob óleo mineral na Coleção

de Culturas da Micoteca-URM, entre 2 e 43 anos.

A variedade dos métodos recomendados e descritos na literatura reflete a falta de um

método que seja abrangente e satisfatório para todos os fungos (FIGUEIREDO, 2001), pois a

estocagem pode promover alterações morfológicas, macroscópicas e/ou de componentes da célula

fúngica (BAKER; JEFFRIES, 2006; BORMAN et al., 2006; SOARES JÚNIOR et al., 2007).

2.3. ENZIMAS

Os dermatófitos produzem uma variedade de enzimas extracelulares como proteases,

queratinases, colagenases e lipases capazes de quebrar moléculas maiores existentes na pele e

anexos em moléculas menores para utilização (SKOREPOVÁ; HAUCK, 1987; PAPINI;

MANCIANTI, 1995; MUHSIN; SALIH, 2000; TAKASUKA, 2000; MAIA et al, 2001; ABDEL-

RAHMAN, 2002). A atividade enzimática pode variar de acordo com a espécie de dermatófito

(MUHSIN; SALIH, 2000) e as diferentes expressões enzimáticas podem estar relacionadas com o

aspecto ecológico (antropofílico, zoofílico e geofílico) uma vez que a adaptação paulatina do solo

para o homem e outros animais, envolveu também adequação nutricional (PHILPOT, 1977;

SIMPANYA; BAXTER, 1996, MUHSIN; SALIH, 2000).

Samdani et al. (1995) demonstraram variações da atividade proteolítica entre T.

mentagrophytes (zoofílico) e T. rubrum (antropofílico) isolados de tinea pedis e tinea unguium,

apresentando maior atividade as amostras de T. mentagrophytes.

Simpanya e Baxter (1996) constataram que amostras de M. canis e M. cookei apresentaram

diferentes expressões enzimáticas de proteases, sendo que as da primeira espécie apresentaram

atividade bem maior do que as da segunda. Para esses autores, essa diferença reflete o contraste

ecológico dessas duas espécies, visto que a primeira é zoofílica e a outra é geofílica. Entretanto,

Bruguera et al. (1997) não verificaram diferenças enzimáticas significativas para proteases, lipases

e fosfolipases entre amostras de M. canis e M. gypseum.

A variação interespecífica de proteases e lipases também foi constatada em amostras de M.

gypseum, T. mentagrophytes e E. floccosum. As duas primeiras espécies que são zoofílicas,

apresentaram elevada atividade de proteases e lipases, enquanto que na última foi observada baixa

atividade de proteases e não houve atividade lipásica (MUHSIN; SALIH 2000).

Amostras da mesma espécie também podem apresentar variações quanto a atividade

enzimática. Essa constatação foi observada entre amostras de T. tonsurans para queratinases,


28

colagenases e elastases (ABDEL-RAHMAN, 2000), de M. canis para proteases (MAIA et al.,

2001) e de T. rubrum para proteases, queratinases, fosfolipases, lipases e desoxiribonucleases

(DOS SANTOS et al., 2001).

Esse incrível sistema enzimático está direcionado principalmente para a degradação de

queratina, que é proteína estrutural localizada na pele e anexos. Essa escleroproteína contém

cadeias polipeptídicas α queratina (cadeias α) e β queratina (cadeias folhas β) que estão

fortemente unidas por ligações covalentes dissulfeto, mantendo a forma tridimensional da

molécula. Além dessas ligações, interações hidrofóbicas e ligações de hidrogênio estabilizam a

estrutura filamentosa da proteína (COULOMBE; OMARY, 2002). Por essa razão, é extremamente

resistente a degradação por enzimas proteolíticas como tripsina, pepsina e papaína. A alta

resistência a maioria dos microrganismos deve-se, principalmente as ligações dissulfeto, entretanto

os dermatófitos possuem um sistema enzimático capaz de quebrar essas ligações (SOUZA

JUNIOR et al., 1999).

Queratinases pertencem ao grupo das proteases que hidrolisam as ligações peptídicas nas

proteínas (SAID; PIETRO, 2002). Possui alta especificidade por queratina mas também podem

degradar substratos solúveis como caseína, soroalbumina bovina e gelatina, e insolúveis como

elastina, colágeno, lã, cabelo, unha, entre outros (FRIEDRICH; KER, 2003). Tem grande

capacidade para agir em substratos compactos como queratina, quando comparadas com outras

enzimas proteolíticas sendo assim distinguidas de outras proteases (ONIFADE et al., 1998).

Queratinases já foram detectadas de amostras de Microsporum (TAKIUCHI et al., 1984;

MIGNON et al., 1998), de Trichophyton (DESHMUKH; AGRAVAL, 1982; AUBAID; MUHSIN,

1997; ABDEL-RAHMAN, 2000) e de Epidermophyton floccosum (HOPSU-HAVU; TUNNELA,

1977; LOPEZ-MARTINEZ, 1994), os quais utilizam a proteína como fonte de carbono e

nitrogênio para crescimento (WAWRZKIEWICZ et al.,1991; VIANI et al., 2001; MACÊDO et al.,

2005).

O colágeno é uma proteína insolúvel estrutural encontrada na pele, ossos, ligamentos,

cartilagens e outras partes do organismo. Cada molécula de colágeno é formada pelo

entrelaçamento, em tríplice hélice, de três cadeias polipeptídicas chamadas cadeias alfa. É rica em

lisina, prolina, hidroxilisina e hidroxiprolina. Essa estrutura protéica justifica as propriedades

físicas e biológicas do colágeno: rigidez, solidez e estabilidade. Devido a estrutura tridimensional,

é bastante resistente a degradação por enzimas proteolíticas (VARGAS et al., 1997). Existem

cinco tipos de colágeno, sendo que os tipos I e V estão presentes na pele (STRYER, 2001;

CAMPBELL, 2003). A gelatina é uma proteína derivada da hidrólise parcial do colágeno, cujas

ligações moleculares são hidrolisadas, permitindo o seu rearranjo (PEREIRA, et al., 2006).


29

Colagenases são enzimas proteolíticas capazes de degradar o colágeno, cuja proteína

apresenta alta especificidade por essa enzima. As colagenases de microrganismos possuem

capacidade para hidrolisar o colágeno nativo e desnaturado (gelatina). As proteases, de um modo

geral, não hidrolisam a tripla hélice do colágeno por não degradar essa estrutura (HONDA, 1998;

GOSHEV et al., 2005). Enquanto as colagenases degradam moléculas de colágeno nativo, as

gelatinases degradam principalmente o colágeno desnaturado e o colágeno tipo IV, que está

presente na membrana basal (STRYER, 2001; PEREIRA et al., 2006).

Pesquisas relacionadas com a habilidade de fungos em produzir enzimas extracelulares

como proteases, queratinases e lipases, permitem estabelecer relação com a patogenicidade

(MAGO, 1990).

Vários autores reconhecem o papel importante de proteases sintetisadas por dermatófitos

no processo de infecção do tecido do hospedeiro e desenvolvimento fúngico (MINOCHA et al.,

1972; SKOREPOVÁ; HAUCK, 1987; KURNET; KASAFÍREK, 1988; GRZYWNOWICZ et al.,

1989; SAMDANI et al., 1995; SIMPANYA; BAXTER, 1996; MAIA et al., 2001; ABDEL-

RAHMAN 2002). Além da invasão mecânica promovida pelo micélio no tecido do hospedeiro, a

habilidade que os dermatófitos têm de invadir e subseqüentemente se disseminar no estrato córneo

é governado em parte, por enzimas proteolíticas que contribuem de forma imprescindível

(SAMDANI et al., 1995; ABDEL-RAHMAN, 2000; MAIA et al., 2001).

De acordo Rippon e Garber (1969) a ação de proteases está envolvida na patogenia causada

por dermatófitos, intensificando a reação inflamatória pela indução da quimiotaxia de leucócitos

polimorfonuclear.

Minocha et al. (1972) verificaram a atividade proteolítica de T. rubrum, T. mentagrophytes

e E. floccosum na patogenia de lesões de pele. Para T. rubrum e E. floccosum o eritema intenso

não tem correlação com a atividade proteolítica e quanto mais curta é a duração da lesão, maior é a

atividade das enzimas relacionadas, pois isolados fúngicos de lesões cutâneas extensas,

apresentaram baixa atividade enzimática. Para T. mentagrophytes, quanto maior a atividade

enzimática, maior é a intensidade do eritema e menor é a duração da infecção. Concluíram que

essas enzimas são importantes para a penetração do fungo no tecido queratinizado e que

promovem vasodilatação, melhorando a permeabilidade capilar com intensificação da resposta

inflamatória, mas que a participação na patogenia varia, dependendo da espécie.

Meevootisom e Niederpruem (1979) verificaram que proteases extracelulares e micelial são

produzidas por T. rubrum e devem ter participação na invasão de tecidos do hospedeiro,

contribuindo para hipersensibilidade. Skorepová e Hauck (1987) verificaram que 57,5% de

amostras de T. rubrum isoladas de lesões pustulosas, apresentaram atividade proteolítica.


30

Alguns fungos de interesse médico produzem proteases que podem atuar como fator de

virulência, devido ao envolvimento com a propagação do fungo no hospedeiro, causando

conseqüente invasão através da degradação de proteínas da pele, anexos ou mucosa (KWON-

CHUNG; BENNETT,1992).

Weitzman e Summerbell (1995) em trabalho de revisão sobre dermatófitos, reafirmaram o

envolvimento de enzimas nas infecções por fungos de interesse médico, em especial por

dermatófitos.

Okafor e Ada (2000) avaliaram a atividade queratinolítica de T. rubrum, T.

mentagrophytes, T. tonsurans, M. audouinii e M. gypseum utilizando cabelo humano como

substrato. Todas cresceram sobre o cabelo, mas apenas M. gypseum e T. mentagrophytes foram

capazes de causar danos estruturais e formar órgãos de perfuração. Macêdo et al. (2005)

constataram a capacidade de perfuração de pêlo in vitro em 94,3% das amostras de E. floccosum

analisadas, sugerindo que essa espécie possa ser agente etiológico de tinea capitis.

Abdel-Rahman (2000) avaliando a expressão de proteases extracelular de T. tonsurans

isolados de tinea capitis, infere que a ação dessas enzimas é importante para a infecção uma vez

que, a presença de estruturas fúngicas, apenas, sobre o tecido queratinizado do hospedeiro, não é

suficiente para desenvolvimento de dermatofitoses.

Atividades de colagenases já foram verificadas em amostras de T. schoenleinii (RIPPON;

GARBER, 1969) e de T. tonsurans (ABDEL-RAHMAN, 2000).

Abdel-Rahman (2002) correlacionou a atividade extracelular de colagenases e elastases de

amostras de T. tonsurans isolados de tinea capitis com a manifestação clínica da doença.

Constatou que quanto maior é a atividade enzimática, mais severa é a infecção e mais curto é o

período da doença. Por outro lado, quanto menor é a atividade dessas enzimas, maior é o período

de infecção e mais branda é a inflamação. É reforçada a participação virulenta e patogênica de

proteases para infecção e disseminação de fungos no estrato córneo. A correlação entre enzimas e

patogenicidade é explicada pela função antigênica enzimática: estimulam a resposta inflamatória e

devido a isso estimulam o organismo reação do hospedeiro infectado.

Macêdo et al. (2005) caracterizaram quanto a fatores de patogenicidade, amostras de E.

floccosum recém isoladas e preservadas na Coleção de Culturas Micoteca - URM e verificaram

que todas apresentavam atividade de proteases pela formação de halo ao redor da colônia.

Viani et al. (2007) avaliaram a atividade de proteases extracelular de M. canis isolados de

gatos com e sem lesão e constataram que a atividade de queratinases e elastases era elevada

(p<0.05) quando comparada aos animais sem lesão.


31

Mas segundo Kurnet e Kasafírek (1988), é incerta a função precisa de proteases e

queratinases na virulência e patogenia de dermatófitos.

Para Lacaz et al. (2002) a ação dessas enzimas proteolíticas não é responsável por

infecções fúngicas. É citado que alguns fungos não produtores de tais enzimas foram isolados de

dermatomicoses, enquanto outros que a produzem, não causam a doença.

Chaves et al. (2003) trabalhando com espécies de Candida de isolados clínicos de

pacientes com AIDS e com espécie de Candida estocadas na Coleção de Cultura Micoteca - URM,

não detectaram atividade proteásica em meio sólido, em nenhum dos isolados.

Produção de proteases foi verificada em amostras de Chrysosporium tropicum, C.

keratinophilum (ABDEL-GAWAD, 1997) e Curvularia spp. (MUHSIN; SALIH, 2000).

Muhsin e Hadi (2002) constataram produção de queratinases e degradação de pêlos por

62% das amostras de Chrysosporium pannicola. Esses mesmos autores verificaram que amostras

de Aspergillus flavus apresentaram atividade dessa enzima em meio de cultura adicionado de pena

de galinha.

Braz (2007) verificou atividade proteásica em 23 amostras de Acremonium preservadas na

Coleção de Culturas Micoteca - URM e constatou essa atividade na caseína do leite em 10% das

amostras analisadas e na gelatina em 8%.

Atividade de queratinases também já foi constatada em amostras de Penicillium,

Alternaria, Scopulariopsis (RIPPON, 1990; MARCHISIO et al., 1991; KWON-CHUNG;

BENETTT, 1992; AGUT et al., 1995; GUGNANI, 2003) Bacillus e Actinomicetos (ASAHI et al.,

1985; SIESENOP; BOHM, 1995; GRADISAR et al., 2000).

Sabe-se que a pele é a primeira linha de defesa contra infecções por microrganismos

patógenos ao homem (TRUSWELL, 1987; ANDERSON et al., 1988) e que existem ácidos

graxos com ação fungistática que dificultam a infecção por dermatófitos, sendo esse um dos

mecanismos de defesa natural do organismo (NOBRE; VIEGAS, 1972; ZAROR et al., 1987;

MORIELLO; DE BOER, 1991; OGAWA et al., 1998; FERREIRA-NOZAWA, 2003). Tinea

capitis, por exemplo, é reconhecida como uma dermatofitose quase que exclusiva da infância

(LACAZ et al., 2002; HERNÁNDEZ et al., 2004), regredindo espontaneamente na puberdade

devido à produção, sob influência hormonal, de ácidos graxos com propriedade fungistática

(AZULAY, 1989; OGAWA et al., 1998). Além das proteases, as lipases extracelulares também

são citadas pela participação durante a infecção (OGAWA et al., 1998). Acredita-se que as lipases

auxiliam esses fungos a superar a ação dos ácidos graxos fungistático presentes na pele,

colaborando para a virulência nesse grupo de fungos (PAPINI; MANCIANTI, 1995, TRABULSI

et al., 1999).


32

Nobre e Viegas et al. (1972) determinando atividade lipolítica de amostras de dermatófitos

recém isolados (M. canis, M gypseum, E. floccosum e T. mentagrophytes) e preservados (T.

tonsurans, T. rubrum, T. schoenleinii, T. violaceum e T. megnini), constataram que essa atividade

foi mais evidente em amostras recém isoladas (75 a 100%). Dentre as amostras deste grupo à

atividade foi maior nas de M. canis, E. floccosum e T. mentagrophytes. Todas as amostras

preservadas apresentaram atividade menor quando comparadas com as do outro grupo.

Papini e Mancianti (1995) não constataram atividade lipásica em M. canis, por outro lado,

essa atividade foi verificada nas espécies T. rubrum (DAS; BANERJEE, 1977; DOS SANTOS et

al., 2001), M. gypseum e T. mentagrophytes (MUHSIN; SALIH, 2000).

Costa et al. (1967) foram os primeiros a demonstrarem atividade fosfolipásica utilizando a

lecitina da gema de ovo. Fosfolipases são enzimas que degradam os fosfolipídeos, freqüentemente

encontrados fazendo parte da membrana celular de animais, plantas e microrganismos. Parecem

auxiliar a invasão de células hospedeiras por dermatófitos (DAS; BANERJEE, 1977).

Há relatos sobre a associação entre fosfolipases e fungos patogênicos (HANEL et al.,

1995). A produção dessa enzima por Candida albicans está relacionada com a virulência e

patogenicidade, pois tal enzima pode causar danos à membrana da célula do hospedeiro pela

degradação de fosfolipídeos e lisofosfolipídeos (HANEL et al., 1995; IBRAHIM et al., 1995). A

elevada produção de fosfolipases foi correlacionada com maior capacidade de aderência de C.

albicans, desenvolvimento da doença e elevada taxa de mortalidade em estudos com animais

(MAYSER et al., 1996). Chaves et al. (2003) constataram atividade fosfolipásica nessa espécie,

em 13 amostras preservadas e em quatro recém isoladas de pacientes com AIDS.

Dos Santos et al. (2001) mencionam a falta da atividade de fosfolipases em T. rubrum,

sugerindo a não utilização desse critério como marcador para diferenciação de biotipos. Entretanto

esse parâmetro foi utilizado por Maia et al (2001) para caracterização fenotípica de recém isolados

de M. canis.

Atividade fosfolipásica não foi verificada em amostras de E. floccosum recém isoladas e

preservadas (MACÊDO et al., 2005) como também em amostras preservadas de Acremonium

(BRAZ, 2007).

Hankin e Anagnostakis (1975) detectaram a produção de exoenzimas em meios sólidos e

determinaram as atividades pela hidrólise do substrato, através da formação de halo. A atividade

de proteases é normalmente detectada qualitativamente utilizando como substratos ágar acrescido

de caseína, hemoglobina, gelatina ou outras proteínas. A região de hidrólise, observada em torno

da colônia indica atividade enzimática (AUNSTRUP, 1974).


33

Muhsin et al. (1997) constataram a atividade lipásica de dermatófitos e leveduras em meio

sólido.

É possível a determinação quantitativa da atividade fosfolipásica em grande número de

amostras de fungos, em meio de cultura sólido contendo lecitina de soja ou gema de ovo como

fonte fosfolipídica (PRICE; CAWSON, 1977).

O uso de meio sólido permite rápida detecção da atividade enzimática (HANKIN;

ANAGNOSTAKIS, 1975), pois durante o crescimento no substrato protéico, os dermatófitos

secretam enzimas para o meio de cultura (KURNET; KASAFIREK, 1988). Essa forma de verificar

a atividade enzimática vem sendo utilizada por outros autores (PRICE; CAWSON, 1977; PRICE

et al., 1982; WAWRZKIEWICK et al., 1991; AOKI et al., 1994; CORDEIRO NETO, 1997;

MUHSIN et al., 1997; FRIEDRICH et al.,1999; DOS SANTOS et al., 2001; LACAZ et al., 2002;

CARVALHO, 2003).

O desenvolvimento de colônias de dermatófitos em meios contendo um único substrato

como fonte nutritiva, demonstra capacidade de sintetizar enzimas para degradar o substrato e

utilizá-lo para o desenvolvimento fúngico (ONIFADE ET AL, 1998; OGAWA ET AL. 1998).

2.4. DROGAS ANTIFÚNGICAS E TESTE DE SUSCEPTIBILIDADE ANTIFÚNGICA

Várias drogas são citadas para o tratamento de dermatofitoses, o qual pode ser de aplicação

tópica e/ou oral (CARAZO et al., 1999; QUINDÓS, 2002; SECCO...). O tratamento tópico é

indicado nos casos de lesões pequenas e localizadas (LLAMBRICH; LECHA, 2002; KARACA;

KOÇ, 2004) cujas drogas mais utilizados pertencem a classe dos derivados imidazólicos

(clotrimazol, oxiconazol, miconazol, isoconazol, cetoconazol, bifonazol, flutrimazol, erbeconazol)

(FERNÁNDEZ-TORRES et al., 2003a). Outros antifúngicos de uso tópico como terbinafina,

ciclopirox, olamina, amorolfina, butenafina também são bastante mencionados (FREEDBERG et

al., 2003).

Entretanto, sabe-se que a escolha da forma ideal depende, dentre outros aspectos, da

localização e extensão da lesão como também da espécie envolvida (FERNANDEZ-TORRES et

al., 2001; FERNANDEZ-TORRES et al., 2002). Às vezes é necessária a administração da droga

por via oral, principalmente em casos de tinea unguium e tinea capitis (FERNANDEZ-TORRES et

al., 2001; PUJOL et al., 2002; FAVRE et al., 2003; FERNANDEZ-TORRES et al., 2003a;

SANTOS et al., 2006). O tratamento por via oral é realizado em casos de lesões extensas ou

disseminadas, utilizando-se principalmente os derivados imidazólicos (fluconazol, itraconazol,

cetoconazol) e alilaminas (terbinafina) (FEEDBERG et al., 2003).


34

Entre essas, itraconazol e terbinafina são bastante mencionadas principalmente por inibirem

o crescimento do fungo em baixas concentrações (FERNÁNDEZ-TORRES et al., 2001; FAVRE

et al., 2003; BARROS et al., 2006) e apresentarem atividade fungicida (HAZEN, 1998;

FERNÁNDEZ-TORRES et al., 2002; FERNANDEZ-TORRES et al., 2003a; SANTOS;

HAMDAN, 2005). Favre et al. (2003) citam que entre os antifúngicos de uso sistêmico, terbinafina

é bastante eficaz por apresentar atividades fungistática e fungicida em baixas concentrações, como

por exemplo, em 0.06µg/mL e 0.07µg/mL, respectivamente. Fluconazol é citada como a menos

indicada, pois a inibição de 90% do crescimento fúngico é obtida em elevadas concentrações,

como por exemplo, em 64µg/mL para T. mentagrophytes e T. rubrum (SANTOS et al., 2006) e

32µg/mL para outras espécies (FERNÁNDEZ-TORRES et al., 2001; PEREA et al., 2001; FAVRE

et al., 2003; BARROS et al., 2006; SANTOS et al., 2006).

Itraconazol e terbinafina inibem o crescimento fúngico alterando síntese de ergosterol em

nível de membrana celular. Itraconazol é um triazol com três átomos de nitrogênio no anel azólico

(JAIN; SHEGAL, 2001) que inibe a formação de blocos de ergosterol por interferir na demetilação

do lanosterol (DE BACKER et al., 1998). Há inibição da enzima esterol-14-α-desmetilase, que é

um sistema enzimático microssomal dependente do citocromo P450, que prejudica a síntese do

ergosterol na membrana citoplasmática e leva ao acúmulo de 14-α-metilesteróis. Esses

metilesteróis não possuem as mesmas propriedades físicas do ergosterol e levam à formação da

membrana com propriedades alteradas, que não desempenha as funções básicas necessárias ao

desenvolvimento do fungo (JAIN; SHEGAL, 2001; LACAZ et al., 2002; BERGOLD;

GEORGIADIS, 2004). Pode ser fungistático ou fungicida, dependendo da concentração da droga

(OLIVEIRA et al., 2002).

Terbinafina é uma alilamina que inibe a ação da enzima esqualeno epoxidase, impedindo a

formação do ergosterol no início da síntese. Há acúmulo de esqualeno intracelular que é tóxico

para a célula, resultando em rápida atividade fungicida. A elevada concentração de esqualeno

interfere na síntese da estrutura celular do fungo e na função da membrana celular, levando à

ruptura da parede e morte celular (LEYDEN, 1998; DONCKER, 1999; LACAZ et al., 2002;

BERGOLD; GEORGIADIS, 2004).

Devido à variedade de antifúngicos utilizados para tratamento de dermatofitoses, torna-se

evidente a necessidade de um método padronizado para determinação da susceptibilidade

antifúngica, entretanto, ainda não está estabelecido (JESSUP et al., 2000; BARROS et al., 2006;

SANTOS et al., 2006). A utilização de vários métodos pode conferir resultados diferentes

(NORRIS et al., 1999; JESSUP et al., 2000; FERNÁNDEZ-TORRES et al., 2002) e a importância


35

da padronização reflete em terapêutica eficaz, a qual é dependente da correta escolha da droga que

apresente atividade em relação ao fungo em questão (JESSUP et al., 2000; BARROS et al., 2006).

Foi proposto em 1998 e aprovado em 2002, pelo “National Committee for Clinical

Laboratory Standards” (NCCLS), atual “Clinical and Laboratory Standards Institute” (CLSI), o

documento M38-A com o protocolo padronizado para avaliação in vitro da atividade antifúngica

de fungos filamentosos que causam infecções invasivas, incluindo espécies de Aspergillus e

Fusarium, Pseudallescheria boydii (Scedosporium apiospermum), Rhizopus arrhizus e Sporothrix

schenckii. O documento inclui a seleção de agentes antifúngicos, preparação de soluções padrão e

diluições de antifúngicos utilizadas para realização, implementação e interpretação dos testes.

Além disso, essa padronização está relacionada com meio de cultura utilizado para crescimento e

estimulação da esporulação do fungo (batata-dextose-ágar), meio de cultura utilizado para teste de

susceptibilidade (RPMI-1640), determinação da concentração inibitória mínima, padronização do

inóculo, período (24 a 50h) e temperatura de incubação (35ºC), leitura e interpretação dos

resultados.

Por causa da falta de padronização para dermatófitos, vários autores citam modificações do

documento M38-A e algumas espécies já foram testadas (FERNÁNDEZ-TORRES et al., 2001;

PEREA et al., 2001; FERNÁNDEZ-TORRES et al., 2002; FERNÁNDEZ-TORRES et al., 2003b;

GHANNOUM et al., 2004; SANTOS; HAMDAN, 2005; BARROS et al., 2006; FERNÁNDEZ-

TORRES et al., 2006).

Algumas modificações referem-se às estruturas fúngicas utilizadas no inóculo (esporos e

fragmentos de hifas), tamanho do inóculo (103 a 104 estruturas fúngicas/mL), período de incubação

(4 a 10 dias), temperatura de incubação (28 a 35ºC), interpretação de resultados (7 a 10 dias),

determinação da concentração inibitória mínima (CIM) que será aquela capaz de inibir de 50 a

100% do crescimento fúngico (NORRIS et al., 1999; JESSUP et al, 2000; FERNÁNDEZ-

TORRES et al., 2001; FERNÁNDEZ-TORRES et al., 2002; FERNÁNDEZ-TORRES et al.,

2003b; GHANNOUM et al., 2004; KARACA; KOÇ, 2004; SANTOS; HAMDAN, 2005;

BARROS et al., 2006; FERNÁNDEZ-TORRES et al., 2006).

Outros métodos têm sido mencionados com algumas alterações, como o proposto pelo

“Antifungal Susceptibility Subcommittee of the European Committee on Antimicrobial

Susceptibility Testing” (AFST-EUCAST, 2002) que é aplicado para leveduras e fungos

filamentosos que não sejam dermatófitos. Algumas modificações sugeridas por BARROS et al.

(2006), incluem crescimento em meio de cultura batata-dextrose-ágar (BDA) suplementado de 2%

de farinha de arroz, adição de 2% de glicose ao RPMI-1640 e temperatura de incubação de 28ºC.

Esses autores compararam o protocolo M38-A (CLSI) com o proposto pelo AFST-EUCAST


36

(Discussion Document E.Dis. 7.1 ESCAMID) modificado, em 50 amostras de T. mentagrophytes e

50 de T. rubrum e não observaram diferenças significativas nos resultados.

Pujol et al. (2002) citam procedimento colorimétrico para a avaliação da susceptibilidade

antifúngica de dermatófitos. É utilizado Alamar Blue como indicador que altera a coloração de

azul para vermelho na presença de metabólitos resultantes do crescimento fúngico. Dessa forma,

também é facilitada a leitura da concentração inibitória mínima e podem ser empregadas técnicas

de macro e microdiluição. As drogas antifúngicas são obtidas comercialmente e a diluição em série

é preparada com o indicador que também funciona como diluente. Comparando a concentração

inibitória mínima obtida pelo CLSI e por esse método colorimétrico, foi relatada semelhança de

resultados de 87,7% para itraconazol, 81,6% para anfotericina B, 69,4% para cetoconazol e 67,3%

para fluconazol.

Karaca e Koç (2004) propuseram o método de disco-difusão por ser simples, eficaz e de

baixo custo. A leitura de resultados seguiu a recomendada pelo documento M2-A8 (CLSI, 2003)

para testes de sensibilidades aos antimicrobianos por disco-difusão, através da medição do

diâmetro do halo de inibição do crescimento formado ao redor de cada disco impregnado com a

droga. A comparação em relação ao método proposto pelo CLSI resultou em semelhança e

consistência de resultados. Entretanto, Rex et al. (1993), Hanzen (2000) e Rex et al. (2001) citam

que alguns azólicos não se difundem de forma eficiente no ágar tornando difícil a padronização

desta técnica.

Posteriormente, Fernández-Torres et al. (2006) constataram que pelo método de disco-

difusão em meio composto por RPMI-1640 adicionado de ágar, itraconazol mostrou menor

capacidade de inibição de crescimento para as espécies M. canis, M. gypseum, T. mentagrophytes e

T. rubrum, por apresentar menor halo de inibição.

A concentração inibitória mínima (CIM) é a menor concentração da droga que inibe o

crescimento de microrganismo, mas não indica erradicação. A concentração fungicida mínima

(CFM) é a menor concentração da droga capaz de eliminar o microrganismo. Devido as diferentes

formas de ação, como anteriormente mencionado, terbinafina apresenta CIM e CFM menor do que

itraconazol. Terbinafina é capaz de erradicar o fungo em concentrações baixas podendo apresentar

na mesma concentração atividade fungistática e fungicida (CIM = CFM). Já para itraconazol a

concentração fungicida mínima apresenta-se maior ou igual a concentração inibitória mínima

(CFM≥CIM) (LEYDEN, 1998).

Há controvérsia em relação a determinação da CIM para os azólicos. Alguns autores citam

que deve ser considerada CIM a que inibir pelo menos 50% do crescimento do fungo (PUJOL et

al., 1996; FERNÁNDEZ-TORRES et al., 2001; PEREA et al., 2001; PUJOL et al., 2002;


37

KARACA; KOÇ, 2004). Outros citam que tem que ser capaz de inibir pelo menos 80% do

crescimento (HAZEN, 1998; JESSUP et al., 2000; GHANNOUM et al., 2004; SANTOS;

HAMDAN, 2005; BARROS et al., 2006), embora a inibição total seja a mais eficiente (HAZEN,

1998; FERNÁNDEZ-TORRES et al., 2002; FERNÁNDEZ-TORRES et al., 2003a; FAVRE et al.,

2003, GHANNOUM et al., 2004).

De acordo com alguns autores, a concentração inibitória mínima de itraconazol para os

dermatófitos, é a que inibir 80% do crescimento desse grupo de fungos (NORRIS et al., 1999;

JESSUP et al., 2000; JAIN; SHEGAL, 2001; GHANNOUM et al., 2004; SANTOS; HAMDAN,

2005; BARROS et al., 2006; SANTOS et al. 2006). Com base nisso, a CIM é baixa quando

comparada a CFM que é relativamente alta. O coeficiente CIM/CFM apresenta-se alto o que indica

que itraconazol é mais fungistático do que fungicida (HAZEN, 1998; JAIN; SHEGAL, 2001;

GARCÍA-PATOS; APARICIO...; SECCO...).

Ghannoum et al. (2006) promoveram uma avaliação interlaboratorial, seguindo protocolo

M38-A (CLSI, 2002) modificado, para verificar a atividade antifúngica de itraconazol, terbinafina,

ciclopirox, griseofulvina, posaconazol e voriconazol em relação a T. mentagrophytes e T. rubrum.

Constataram que a determinação da concentração que inibe 50% do crescimento foi bastante

variável entre os laboratórios, para a mesma droga e a mesma amostra testada. Já para inibição de

80%, não houve variação significativa.

Santos et al. (2006) utilizaram a inibição de 80% do crescimento com critério de atividade

antifúngica de itraconazol para T. mentagrophytes e T. rubrum, obtendo resultados eficazes.

Vários autores concordam que a concentração inibitória mínima para terbinafina é a que

inibir totalmente o crescimento do fungo (HAZEN, 1998; FERNÁNDEZ-TORRES et al., 2001;

FERNÁNDEZ-TORRES et al., 2002; FERNÁNDEZ-TORRES et al., 2003b; SANTOS;

HAMDAN, 2005; SANTOS et al., 2006; BARROS et al., 2006).

Fernández-Torres et al. (2001) avaliaram a atividade antifúngica de 10 drogas em relação a

508 amostras de dermatófitos, segundo documento M38-A, adotado pelo CLSI (2002). Foram

constatadas concentrações inibitórias mínimas semelhantes entre itraconazol e terbinafina, tais

como 0.22µg/mL e 0.21µg/mL, respectivamente. Todos os antifúngicos mostraram-se eficazes,

com exceção do fluconazol por inibir 80% do crescimento fúngico em elevada concentração.

Ghannoum et al. (2004) verificaram a susceptibilidade antifúngica de M. canis, T.

mentagrophytes, T. tonsurans, T. rubrum e E. floccosum para fluconazol, itraconazol, posaconazol,

voriconazol, terbinafina e griseofulvina. Itraconazol, terbinafina, voriconazol e posaconazol,

destacaram-se por apresentarem concentrações inibitórias mínimas semelhantes e baixas. Foi

verificado que a inibição do crescimento de metade das amostras (CIM50) foi obtida nas


38

concentrações de 0.06 e 0.03 µg/mL para itraconazol e terbinafina, respectivamente. A inibição do

crescimento de 90% das amostras (CIM90) foi obtida nas concentrações de 0.125 e 0.03µg/mL,

para as mesmas drogas.

Cetinkaya et al. (2005) avaliaram a atividade antifúngica de itraconazol, terbinafina,

cetoconazol e fluconazol em amostras recém isoladas das mesmas espécies acima citadas. A faixa

de concentração inibitória mínima foi de 0.08 a 0.4µg/mL para itraconazol, 0.04 a 0.2µg/mL para

terbinafina, 0.09 a 1.1µg/mL para cetoconazol e 16.2 a 24µg/mL para fluconazol. Os autores

enfatizam a eficácia antifúngica de itraconazol e terbinafina em concentrações menores quando

comparadas com as outras drogas.

Barros et al. (2006) considerando CIM para itraconazol e terbinafina a que inibir 80% e

100% do crescimento fúngico, respectivamente, constataram elevada atividade inibitória dessas

drogas pela capacidade de inibição de 90% das amostras (CIM90) de Trichophyton sp. nas

concentrações de 0,25 µg/ml e 0,015µg/ml, respectivamente.

A determinação do período de incubação é de extrema importância para determinar CIM e

CFM. Dependendo do período de incubação, certas drogas como a griseofulvina, podem

apresentar ação fungistática ou fungicida. Geralmente, as drogas fungistáticas como itraconazol

estão mais sujeitas as interferências do que as fungicidas como terbinafina, e podem apresentar

ação fungicida devido ao efeito “postantibiotic” (HAZEN 2000), no qual não é observado

crescimento fúngico mesmo após a retirada da droga, devido a diminuição do metabolismo

fúngico (LICATA, et al., 1997). As drogas de ação fungicida, podem apresentar-se fungistáticas

quando o período de incubação for prolongado, entretanto isso é visto como artefato devido a

presença de estruturas fúngicas resistentes (HAZEN 2000).

Dessa forma, o período de incubação para teste de susceptibilidade antifúngica para

dermatófitos, varia de 4 dias (NORRIS et al., 1999; FAVRE et al., 2003; GHANNOUM et al,

2004) a 10 dias (KARACA; KOÇ, 2004; SANTOS; HAMDAN, 2005) sendo o sétimo dia, o

adequado para leitura dos resultados (FERNÁNDEZ-TORRES et al., 2002; FERNÁNDEZ-

TORRES et al., 2003a; KARACA; KOÇ, 2004; SANTOS; HAMDAN, 2005; BARROS et al.,

2006; FERNÁNDEZ-TORRES et al., 2006).

Segundo o CLSI (2002), a preparação do inóculo é importante para eficácia do teste. O

ideal é a utilização de culturas desenvolvidas em meio sólido, visto que a obtenção de esporos é

mais fácil. A utilização de emaranhado de hifas obtido de cultura em meio líquido não é

recomendada porque dificulta o contato e a atuação da droga nas hifas centrais. Dessa forma, pode

haver falsa resistência e capacidade de crescimento do fungo, pois a presença de células restantes e

com metabolismo, ainda que lento, permite o crescimento (HAZEN, 2000).


39

Um dos aspectos que dificulta a padronização do teste de sensibilidade antifúngica para

dermatófitos, é a pouca esporulação, dependendo da espécie, e a conseqüente dificuldade para a

padronização do inóculo (GHANNOUM et al., 2004). Hazen (2000) cita que para esse grupo de

fungos, as estruturas que compõem o inóculo podem ser fragmentos de hifas, até mesmo porque

essas estruturas são formas infectantes para dermatofitoses e por isso é válido utilizá-las para

avaliação antifúngica.

Perea et al. (2001) constataram susceptibilidade antifúngica de várias espécies de

dermatófitos utilizando como inóculo a mistura de fragmentos de hifas e esporos.

Fernandez-torres et al. (2003b) comparando a susceptibilidade de fragmentos de hifas,

macroaleurias de parede espessa como as de Microsporim canis, M. cookei, M. gypseum, M.

racemosum e de parede delgada como as de Ttrichophyton ajelloi, constataram que a espessura da

parede celular dos esporos interfere na atuação da droga, pois é necessário maior concentração da

droga para inibir o crescimento fúngico.

Para dermatófitos, quando há pouca esporulação, o que predomina é a utilização de esporos

com fragmentos de hifas (NORRIS et al., 1999; JESSUP et al., 2000; FERNÁNDEZ-TORRES et

al., 2001; PETRIKKOU et al., 2001; FERNÁNDEZ-TORRES et al., 2002; FAVRE et al., 2003;

FERNÁNDEZ-TORRES et al., 2003b; KARAKA; KOÇ, 2004; FERNÁNDEZ-TORRES et al.,

2006). Entretanto para as espécies de Trichophyton, que esporulam com mais facilidade, sugere-se

a utilização de esporos (GHANNOUM et al., 2004; SANTOS; HAMDAN 2005; GHANNOUM et

al., 2006; SANTOS et al., 2006).

Além das estruturas, o tamanho do inóculo interfere na determinação da concentração

mínima inibitória (GHANNOUM et al., 2004).

Fernández-Torres et al. (2001) avaliaram a atividade antifúngica de 10 drogas em relação a

508 amostras de dermatófitos, segundo procedimento adotado pelo CLSI (2002), documento M38-

A, com inóculo que variou entre 104 e 106 UFC/ml. Foi constatado que o tamanho do inóculo

exerceu influência para determinação da concentração inibitória mínima, exceto para itraconazol e

terbinafina, que apresentaram CIM semelhantes, 0.22µg/mL e 0.21µg/mL, respectivamente.

Entretanto, Fernández-Torres et al. (2002) constataram diferenças significativas na

determinação da concentração inibitória mínima de itraconazol e terbinafina, em relação à

dermatófitos, utilizando inóculo de 104 UFC/mL, indicando que mesmo no inóculo padronizado, a

resposta às drogas pode ser diferente. As concentrações inibitórias obtidas foram 0.4µg/mL para

itraconazol e 0.04µg/mL para terbinafina. Resultados semelhantes, nas mesmas condições de

inóculo, foram citados por Santos e Hamdan (2005) para itraconazol e terbinafina, sendo as

concentrações de 0.5µg/mL e 0.03µg/mL, respectivamente.


40

Santos e Hamdan (2005) constataram que diferentes meios de cultura (RPMI 1640,

McVeigh & Morton e ágar Sabouraud) e períodos de incubação (7 e 10dias) também influenciam

na determinação das concentrações inibitórias mínimas e fungicidas, para T. rubrum. A

concentração inibitória mínima obtida em diferentes meios de cultura no mesmo período de

incubação para a mesma amostra de fungo, foi significantemente diferente para azóis e

griseofulvina. Da mesma forma, diferentes períodos de incubação resultaram em concentrações

inibitórias diferentes para cada meio de cultura, quando azóis e griseofulvina são testados, não

havendo alteração para terbinafina. O meio de cultura RPMI 1640 foi o mais adequado, pois os

outros apresentaram discrepância dos resultados.

A variação da temperatura de incubação, entre 28 e 35ºC, parece ser o fator que menos

interfere no teste de sensibilidade antifúngica para dermatófitos (JESSUP et al., 2000;

FERNÁNDEZ-TORRES et al., 2001; FERNÁNDEZ-TORRES et al., 2002; FAVRE et al., 2003;

FERNÁNDEZ-TORRES et al., 2003a; KARACA; KOÇ, 2004; GHANNOUM et al., 2004;

SANTOS; HAMDAN, 2005; BARROS et al., 2006; FERNÁNDEZ-TORRES et al., 2006).

Norris et al. (1999) avaliaram crescimento a 30ºC e 35ºC, de T. rubrum, T. mentagrophytes

e T. tonsurans em placas de microdiluição utilizadas para avaliação de susceptibilidade antifúngica

e verificaram que a temperatura não influenciou no crescimento desses fungos.

Fernández-Torres et al. (2002) não observaram interferência significativa no teste de

susceptibilidade in vitro para dermatófitos realizado nas temperaturas de 28ºC e 37ºC. Por isso

sugeriram que a realização a 28ºC é satisfatória. De forma semelhante, Santos e Hamdan (2005)

citaram que a temperatura de incubação (28º e 35ºC) das placas de microdiluição não interferiu nos

resultados.

Devido ao aumento de casos de dermatofitoses, principalmente, em pessoas

imunocomprometidas (TSANG et al., 1996; PORRO et al., 1997; WALSH; GROLL, 1999;

GIORDANI et al., 2001; FERNÁNDEZ-TORRES et al., 2002; BERGOLD; GEORGIADIS, 2004;

VENKATESAN et al 2007), torna-se evidente a necessidade da padrozinação do método de

susceptibilidade antifúngica para esses fungos, pois a avaliação in vitro de drogas antifúngicas está

relacionada com a contribuição para efetiva terapia principalmente em pacientes com

dermatofitoses crônicas (CETINKAYA et al., 2005).

As dermatofitoses podem ser resistentes à terapia e a resposta ao tratamento pode não ser

adequada (BARCHIESI et al., 2001, FAVRE et al., 2004). A absorção das drogas de uso tópico

através da pele é insignificante e por causa disso é improvável o aparecimento de efeitos tóxicos

ao organismo. Mas quando há rompimento dessa barreira cutânea como em queimaduras e lesões

cutâneas extensas com exposição da derme, poderá haver irritações no local da aplicação


41

(FREEDBERG et al., 2003). Entretanto, sabe-se que o tratamento prolongado com uso de drogas

sistêmicas pode gerar efeitos tóxicos como náuseas, vômitos, anemia hemolítica, sonolência,

erupções cutâneas, efeitos antiandrogênicos como diminuição da libido, ginecomastia e

hepatotoxicidade, esta última ocorre entre 1-5% dos casos com raros casos fatais (GIORDANI et

al., 2001; FREEDBERG et al., 2003). Por isso, torna-se necessário o desenvolvimento de novas

estratégias terapêuticas (FOSTEL; LARTEY, 2000; TATSUMI et al., 2002; GARCÍA et al., 2003;

FERNÁNDEZ-TORRES et al., 2006).


produção de compostos antifúngicos pela natureza (WOJTASZEK, 1997; GURGEL et al., 2005).

Com o passar do tempo, produtos naturais como própolis, estão sendo cada vez mais utilizados na

medicina (PARK et al., 1998a).

2.5. PRÓPOLIS 2.5.1. Características Gerais

Própolis é um material resinoso, de consistência viscosa a dura e composição química

complexa, elaborado por abelhas a partir da coleta de exsudatos de diversas partes das plantas

como brotos, botões florais, folhas novas e casca (BURDOCK, 1998; PARK et al., 2000;

BANKOVA et al., 2000; CASTALDO; CAPASSO 2002; PARK et al., 2004; BANKOVA, 2005a;

FERNANDES JÚNIOR et al., 2006). A transformação desse material coletado pelas abelhas em

própolis, ocorre na colméia após mastigação e adição de enzimas salivares que são produzidas

durante a coleta da matéria-prima, como também pela adição de cera (PARK et al.,1997;

BURDOCK, 1998; PINTO et al., 2001; CASTALDO; CAPASSO, 2002; PIETTA et al., 2002;

FUNARI; FERRO, 2006; HEGAZI...).

As abelhas da espécie Apis mellifera, responsáveis pela elaboração da própolis, foram

introduzidas no Brasil em 1893 pelo padre português Antônio Carneiro. Em 1956 houve

introdução de abelhas africanas para melhoria da produção de mel, entretanto um escape acidental

de abelhas rainha promoveu africanização das abelhas, devido à reprodução entre abelhas

européias e africanas. Por causa disso, hoje em dia, as abelhas presentes no Brasil são

reconhecidas como abelhas africanizadas (PEREIRA et al., 2002).

A coloração da própolis depende da procedência, podendo variar entre marrom claro e

escuro, marrom avermelhado, esverdeado, amarelado e avermelhado (BURDOCK, 1998;

SALATINO et al., 2005; DAUGSCH et al., 2007). Possui odor característico de resina aromática


42

que pode variar de uma amostra para outra. O ponto de fusão varia entre 60 e 70 ºC podendo

atingir em alguns casos, até 100 ºC (MARCUCCI, 1995). É uma substância rígida, mas quebradiça

quando fria e que se torna dúctil e maleável quando aquecida (BURDOCK, 1998; SALATINO et

al., 2005).

A própolis é utilizada pelas abelhas para proteger a colméia de insetos e microrganismos

invasores, pelo emprego de uma fina camada que reveste tanto a entrada como o interior da

colméia. Também é utilizada para selar rachaduras, manter asséptico o ambiente interno da

colméia, preparar locais assépticos para a postura da abelha rainha e embalsamar invasores

(BURDOCK, 1998; KUJUMGIEV et al., 1999; BANKOVA et al., 2000; SAWAYA et al., 2002;

KOC et al., 2005; SALATINO et al., 2005; FUNARI; FERRO, 2006). O nome deriva do grego,

sendo que pro significa “a favor, em defesa de” e polis “cidade” (MARCUCCI, 1995;

BURDOCK, 1998; SALATINO et al., 2005).

Antes de Cristo, a própolis já era bastante utilizada no Egito para mumificação e também

pelos sacerdotes dotados de conhecimentos médicos e químicos. Praticamente todas as civilizações

antigas conheceram e utilizaram os produtos das abelhas como valiosos recursos na medicina

(PEREIRA et al., 2002). A história da medicina das civilizações Chinesa, Tibetana, Egípcia e

Greco-Romana contém registros com centenas de receitas para curar ou prevenir enfermidades

cujos ingredientes principais são mel, própolis e às vezes as abelhas (PARK et al., 2002b; PARK

et al...). Persas, romanos, gregos e incas também utilizavam para o tratamento de infecções, reduzir

inchaços, aliviar cólica e como cicatrizante. Na II Guerra Mundial, a própolis foi bastante utilizada

em hospitais como antimicrobiano e para alívio de queimaduras (HEGAZI...). Na Europa foi

utilizada como antibacteriano, antieczematoso, antiacne, no tratamento de abscessos gengivais

hemorrágicos, candidíase bucal e halitose. Também se fez presente nos receituários chineses como

medicamento ativo contra moléstias coronarianas e hipertensão (NOTHENBERG, 1997). A partir

da década de 60 tornou-se objeto de intensos estudos farmacológicos e bioquímicos na Europa,

Bulgária, Czechoslovakia e Polônia (BANKOVA, 2005a; SALATINO et al., 2005), sendo que em

1969 o extrato etanólico da própolis passou a ser industrializado farmaceuticamente (HEGAZI...).

No Japão, o uso da própolis foi impulsionado em 1985 após a realização do XXX Congresso

Internacional de Apicultura, sendo hoje, o principal comprador da própolis brasileira, pois

consome 90% da própolis exportada pelo Brasil, devido principalmente as propriedades biológicas

(AGUIAR et al., 2003; SALATINO et al., 2005; MARCUCCI et al., 2007; NASCIMENTO et al.,

2007).

O primeiro “paper review” foi escrito por Ghisalberti em 1979, indicando que era tempo de

colher mais informações sobre a própolis do que recomendá-la na prática médica, uma vez que a


43

composição química era muito desconhecida. Vinte anos após, aumentou a quantidade de

informações sobre a composição química e propriedades biológicas, entretanto a aplicação não

obteve tanto avanço (BANKOVA et al., 2000). Uma das causas é a capacidade de panacéia (várias

atividades biológicas), que atrapalha a aceitação e aplicação, uma vez que pode gerar desconfiança

devido à atribuição de várias atividades biológicas simultâneas (PEREIRA, 2002).

Atualmente existem diversos produtos contendo própolis que são comercializados pelas

industrias farmacêuticas e alimentícias em todo mundo, principalmente no Japão. São apresentados

sob várias formas, tais como balas, chocolates, doces, xampus, cremes para pele, soluções anti-

sépticas, pastas de dente entre outras (PARK et al., 1998a).

2.5.2 Fonte Botânica

Em regiões de clima temperado como Europa, América do Norte, oeste da Ásia e norte da

África, as fontes de própolis são poucas, sendo a principal, o botão do álamo Populus sp.

(MARKHAM et al., 1996; WOLLENWEBER; BUCHMANN, 1997; PARK et al., 2000). As

árvores do gênero Populus podem ser encontradas ao longo dos rios ou em regiões pantanosas.

São dotadas de raízes longas que podem causar fraturas na terra pela busca de água e por causa

disso não devem ser plantadas perto de residências ou de sistemas de canalização.

Em regiões de clima tropical o álamo não é nativo, mas existe uma grande diversidade

vegetal para retirada da resina, o que dificulta a correlação com a composição química da própolis.

Entretanto, o melhor indicador da origem botânica própolis é a análise da sua composição química

comparada com a provável fonte vegetal (PARK et al., 2002a). Por apresentar diversas

propriedades biológicas, existe grande interesse da determinação da composição química da

própolis da América do Sul (AGUIAR et al., 2003).

No Brasil, existem diversas espécies vegetais para a retirada de resina. No entanto, poucas

foram identificadas até agora, sendo o alecrim, assa-peixe, aroeira e eucalipto alguns exemplos de

onde as abelhas buscam a matéria-prima para a produção da própolis (PARK et al., 2000). A

principal fonte botânica da própolis verde brasileira é a resina extraída de Baccharis

dracunculifolia (PARK et al., 2002a; KUMAZWA et al., 2003; ALENCAR et al., 2005a),

comumente conhecida como alecrim-do-campo ou vassourinha. É nativa da região central do

Brasil mas pode ser encontrada em qualquer outra região do país (KUMAZWA et al., 2003).

Baccharis dracunculifolia além de ser amplamente encontrada no sul e sudeste do Brasil,

também é encontrada no Uruguai, Argentina, Paraguai e Bolívia, entretanto não predomina

(SALATINO et al., 2005). Ao oeste de Uberlândia (Minas Gerais, Brasil), foram encontradas


44

Brachiarea decumbens e Eucalyptus urophilla como fontes botânicas da própolis dessa região

(NASCIMENTO; BENZZAN, 2001).

A principal fonte botânica da própolis vermelha do Brasil é Dalbergia ecastophyllum,

conhecido como rabo-de-bugio, localizados nos estados da região nordeste do país, tais como

Paraíba, Pernambuco, Alagoas, Sergipe e Bahia (DAUGSCH et al., 2007).

Park et al. (2002a) classificaram própolis brasileira a partir de características físico-

químicas e identificaram fontes botânicas da própolis de cinco estados do sul do Brasil, um do

sudeste e seis do nordeste. Esses autores concluíram que própolis dessas regiões tem como fonte

botânica a resina extraída do álamo, de Baccharis dracunculifolia e de Hyptis divaricata,

respectivamente, com aspectos físicos e colorações diferentes.

Marcucci et al. (2007) verificaram que quando a fonte vegetal predominante da região vai

terminando, começam a aparecer novas fontes de resinas o que justifica a presença do álamo na

região sul do Brasil e o surgimento de própolis com composição química proveniente de várias

fontes botânicas.

A fonte botânica da própolis de Cuba é a resina floral de Clusia rosea (CUESTA-RUBIO

et al., 2002). De forma semelhante, a própolis da Venezuela apresenta como fonte botânica

exsudatos resinosos de botões florais de Clusia minor e C. major (TOMÁS-BARBERÁN et al.,

1993). Essas própolis apresentam como principais componentes benzofenonas poliisoprenilados,

oriundos das resinas florais, tornando essa própolis diferente das do Brasil e Europa (TOMÁS-

BARBERÁN et al., 1993; CUESTA-RUBIO et al., 2002).

2.5.3. Composição Química

A composição química varia quali e quantitativamente dependendo do tipo de flora que

esteja próxima a colméia, sendo, portanto, um reflexo da fonte botânica (BURDOCK, 1998;

PARK et al., 2002a; BANKOVA, 2005b; NASCIMENTO et al., 2007). A variabilidade genética

das abelhas (KOO; PARK, 1997), fatores associados à época do ano em que a própolis é produzida

(PARK et al., 1997), técnicas de extração e metodologias utilizadas podem influenciar na

composição (PARK et al., 1998a; KUMAZAWA et al., 2004; BANKOVA et al., 2005a; SOUSA

et al., 2007). Inclusive, numa mesma localidade, a composição pode variar sazonalmente

(SFORCIN et al., 2000).

Em regiões de clima temperado, é observada menor variação de composição química.

Nesse caso, as abelhas coletam a própolis apenas no verão (cerca de quatro meses) e por isso as

variações sazonais na composição da própolis são insignificantes. No Brasil, entretanto, a coleta de


45

própolis ocorre durante todo o ano, existindo deste modo, uma variação sazonal na sua

composição (BANKOVA et al., 2000).

Amostras de própolis das regiões sudeste (São Paulo, Minas Gerais e Rio de Janeiro) e sul

(Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul) do Brasil apresentam diferentes composições

químicas. Foi verificado que as amostras da região sul contem flavonóides em maior concentração

do que as da outra região, já que o clima se assemelha ao de zonas temperadas da Europa (PARK

et al., 2002a; MARCUCCI et al., 2007).

PARK et al. (1998a) demonstraram que própolis de várias regiões do Brasil (Minas Gerais,

São Paulo, Goiás, Mato Grosso do Sul, Paraná e Rio Grande do Sul) apresentam presença variada

de flavonóides como quercetina, canferol, apigenina, isorhamnetina, pinocembrina, sakuranetina,

isosakuranetina, crisina, acacetina, galangina e canferide e, em maiores concentrações,

sakuranetina e acacetina.

Os primeiros componentes identificados na própolis foram a vanilina, ácido ciâmico e

álcool cinâmico (DIETRICH; KUSTENMACHER, 1911) seguidos de flavonóides e terpenos

(PROPAVK, 1975). Já foram identificadas mais de 300 substâncias e algumas delas estão citadas

na Tabela 1.


46

COMPOSTOS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Flavonóides

crisina, tectocrisina, canferol, canferide,

pinocembrina, pinobanskina, quercetina,

galangina, acacetina, apigenina, galangina,

quercetina, tectocrisina, isosakuretina,

pinostrobina, isoramnetina, sakuranetina

Walker e Crane, 1987; Greenaway et al., 1991;

Marcucci, 1995; Boudourova-Krasteva et al 1997;

Martos et al 1997; Banskota et al. 1998; Bankova et al.,

2000, Fontana et al., 2000; Castro, 2001; Marcucci et al.,

2001; Park et al., 2002a; Pereira et al., 2002; Funari e

Ferro, 2006.

Ácidos fenólicos

ácido caféico, ácido ferúlico, ácido

cinâmico, artepelin C, ácido cumárico,

derivados prenilados do ácido p-cumárico

dupranina e derivados

Walker e Crane, 1987; Greenaway et al., 1991; Aga et

al., 1994; Marcucci, 1995; Tatefuji et al., 1996;

Boudourova-Krasteva et al., 1997; Matsuno et al., 1997;

Banskota et al., 1998; Tazawa et al., 1998; Bankova et

al., 2000; Fontana et al., 2000; Castro 2001; Marcucci et

al., 2001; Park et al., 2002a; Pereira et al., 2002; Funari

e Ferro, 2006; Sousa et al., 2007.

Aldeídos aromáticos

vanilina, isovanilina, gálico, salicílico,

hidroxicinâmico, isoferúlico, benzaldeído,

aldeído capróico, p-hidroxibenzaldeído


Marcucci, 1995; Markham et al., 1996; Christov et al.,

1998; Tazawa et al., 1998; Bankova et al., 2000;

Fontana et al., 2000; Pereira et al., 2002.

Álcoois

Triterpenos, fenetílico, prenílico,

isobutenol, benzílico

Christov et al., 1998; Marcucci et al., 1998; Bankova et

al., 2000.

Lignanas;

sesamina, ascantina, sesartenina,

dihidrobenzofuran

Valcic et al., 1998; Bankova et al., 1998; Walker e

Crane, 1987; Greenaway et al., 1991; Marcucci, 1995;

Bankova et al., 1996; Banskota et al., 1998; Christov et

al., 1999; Fontana et al., 2000; Bankova et al., 2000;

Pereira et al., 2002.

Aminoácidos

alanina, arginina, asparagina, ácido

aspártico, cistina, cisteína, glicina,

histidina, triptófano, isoleucina, serina,

lisina, metionina, ornitina, fenilalanina


Marcucci, 1995; Fontana et al., 2000; Bankova et al.,

2000; Pereira et al., 2002.

continua na página seguinte

Tabela 1. Componentes químicos gerais de amostras de própolis.


47

Ácidos graxos

araquídico, behênico, cerótico, lignocérico,

palmítico, oleico, láurico, mirístico,




Terpenos

ácido diterpenos, farnesol, geraniol,

cimeno, limoneno, estireno, naftaleno, β-

bisabolol, derivados de clerodane,

derivados do labdane, β- amirin,

sesquiterpenóides, ledol, spatulenol

Matsuno 1995; Walker e Crane, 1987; Greenaway et

al., 1991; Marcucci, 1995; Bankova et al. 1996;

Matsuno et al. 1997; Banskota et al. 1998; Bankova et

al., 2000; Fontana et al., 2000; Bankova et al., 2000;

Pereira et al., 2002.

Acúcares

ribofuranose, frutose, glucitol, glicose,

talose, sacarose, xilitol, xilose, galactose,

manose, ácido galacturônico, lactose,

maltose, melibiose, eritritol, inositol


Marcucci, 1995; Bankova et al. 1998; Bankova et al.,

2000; Fontana et al., 2000; Pereira et al., 2002.

Compostos voláteis

Sesquiterpenos, monoterpenos Bankova et al. 1995; Borcic et al. 1996; Bankova et al

1998; Bankova et al., 2000.

Cetonas

Acetofenonas e derivados Walker e Crane, 1987; Greenaway et al., 1991;

Marcucci, 1995; Banskota et al. 1998; Bankova et al.,

2000; Fontana et al., 2000; Bankova et al., 2000; Pereira

et al., 2002.

Vitaminas

A, B1, B2, B6, C e E Walker e Crane, 1987; Greenaway et al., 1991;



Minerais

alumínio, vanádio, ferro, cálcio, silício,

manganês, estrôncio, sódio, potássio,

magnésio, bário, estrôncio, cádmio,

chumbo, cobre, manganês, ferro, cálcio,

vanádio, silício, alumínio, níquel, zinco




Continuação da Tabela 1.


48

Entretanto, flavonóides e ácidos fenólicos são os compostos mais importantes, pois são os

maiores responsáveis por várias atividades biológicas, estando dessa forma, interligados

(MARCUCCI et al., 2001; HAVSTEEN, 2002; FERNANDES JÚNIOR et al., 2006; PACKER;

LUZ, 2007).

Flavonóides são pigmentos de plantas responsáveis pela coloração de flores e frutos, sendo

bastante utilizados para classificação taxonômica. Controlam o crescimento da planta e

representam uma barreira química de defesa contra bactérias, fungos, vírus, insetos e animais

herbívoros, principalmente por inibição enzimática que pode ser por competição ou alostérica.

Entretanto, atuam também de forma harmônica com plantas e insetos, atraindo-os e orientando-os

até o néctar, contribuindo enormemente para a polinização. A toxicidade às células humanas é

muito baixa, por isso são componentes presentes em preparações de uso medicinal, como por

exemplo na própolis (HAVSTEEN, 2002). Já foram atribuídas aos flavonóides propriedades

antiinflamatória, antimicrobiana (HAVSTEEN, 1983) antialérgica, antioxidante e antitumoral

(HARBORNE; WILLIAMS, 2000).

Os ácidos fenólicos derivam do ácido benzóico e são responsáveis por diversas atividades

da própolis, principalmente antitumoral. Ácido caféico e ácido gálico são tipos de ácidos fenólicos

que inibem seletivamente o vírus HIV, pois se ligam irreversivelmente a proteína gp120 presente

no vírus, proteína esta essencial para a capacidade de infecção pelo mesmo (VLIETINCK et

al.,1998).

Devido a biodiversidade da flora no Brasil, diferentes compostos químicos podem estar

relacionados as mesmas propriedades biológicas. A diminuição em alguns componentes

biologicamente ativos como os fenólicos são acompanhados pelo aumento de outros, por exemplo,

ácidos diterpênicos. Como a própolis da região sul do Brasil é rica em flavonóides e a da região

sudeste é rica em ácidos fenólicos (SALATINO et al., 2005), pode-se esperar que algumas

atividades biológicas relacionadas a estes compostos, sejam similares em diferentes estações do

ano (BANKOVA et al., 1998). Isto foi comprovado por Sforcin et al. (2000) que demonstraram

não existir diferença estatisticamente significante na atividade antimicrobiana da própolis coletada

de São Paulo durante as quatro estações do ano, em relação a Staphylococcus aureus e Escherichia

coli. A subespécie da abelha também tem influência na composição quantitativa da própolis,

porém o critério de escolha da fonte botânica pelas abelhas permanece incerto (BANKOVA et al.,

1998).

Sabe-se que a própolis européia é constituída principalmente por substâncias resinosas

provenientes de Populus nigra (BANKOVA et al., 2000) por isso, contem fenólicos típicos:


49

flavonóides agliconas, flavonas e flavononas, ácidos fenólicos e seus ésteres ácidos aromáticos e

seus ésteres (BANKOVA et al., 2000; BANKOVA et al., 2002).

A própolis do Brasil, em geral, é composta por 50% de resina e bálsamo vegetal, 30% de

cera, 10% de óleos essenciais e aromáticos, 5% de pólen e 5% de outras substâncias variadas,

incluindo restos orgânicos, sendo considerada uma das misturas mais heterogêneas (BURDOCK,

1998; PARK et al., 2002a; PIETTA et al., 2002). Os constituintes principais são os compostos

fenólicos representados pelos flavonóides, ácidos fenólicos e seus ésteres, que são amplamente

distribuídas no reino vegetal, sendo encontradas em diversas partes da planta como em frutas,

sementes, hastes e flores (CUSHNIE; LAMB, 2005). Flavonóides agliconas (canferol, quercetina,

ramnazina) já foram constatados, embora a origem vegetal seja diferente da Europa (MARCUCCI

et al., 2007).

2.5.4. Atividades Biológicas

Além da aplicação industrial, a própolis destaca-se pelas propriedades biológicas como

atividade antimicrobiana (BIANCHINI; BEDENDO, 1998; BANKOVA et al., 2000; SFORCIN et

al., 2000;; MARCUCCI et al 2001; BANKOVA, 2005a, FERNANDES JÚNIOR et al., 2006;

BARROS et al., 2007) antifúngica (BANKOVA et al., 2000; MURAD et al., 2002, CUSHNIE;

LAMB, 2005) antiviral, como para os vírus influenza e os da herpes (BURDOCK, 1998;

BANKOVA et al., 2000; BARROS et al., 2007), anti-HIV (PARK et al., 2000) antiinflamatória

(BANKOVA et al., 2000; REIS et al., 2000; BARROS et al., 2007), antitripranossomal

(PRYTZYK et al., 2003), antioxidante (BANKOVA et al., 2000; KUMAZAWA et al., 2004;

SIMÕES et al., 2004), imunomodulatória (BANKOVA et al., 2000; CHEN et al., 2004; SFORCIN

et al., 2005; BARROS et al., 2007), antitumoral (PARK et al., 1998a, 1998b; KOO et al., 1999;

BANKOVA et al., 2000; KOO et al., 2000; BAZO et al., 2002; AKAO et al., 2003; CHEN et al.,

2004; ISHIKAWA et al., 2004), antiulcerativa (REIS et al., 2000; ALENCAR et al., 2005a;

BARROS et al., 2007; SOUSA et al., 2007), como coadjuvante no tratamento de periodontite

crônica (AMARAL et al., 2006), sequestrante de radicais livres (CHEN et al., 2004),

hepatoprotetora (BANKOVA et al., 2000; BANKOVA, 2005a; BARROS et al., 2007), cicatrizante

e anestésica (PARK et al., 1998a; PARK et al., 2000; PARK et al., 2002b), entre outras.

Os flavonóides, juntamente com ácidos fenólicos e seus ésteres, aldeídos fenólicos e

cetonas são considerados os mais importantes compostos antimicrobianos da própolis

(FERNANDES JÚNIOR et al., 2006). A atividade antibiótica dos flavonóides é decorrente,


50

principalmente, da inibição de atividade de proteases (HAVSTEEN 2002) e fosfolipases

extracelulares (D´AURIA et al., 2003).

A atividade antimicrobiana da própolis européia é similar à própolis brasileira (POPOVA

et al., 2004), entretanto, a ação sobre o microrganismo alvo pode variar (MENEZES, 2005).

Mesmo com variação na concentração de flavonóides, própolis de várias regiões do Brasil

(Minas Gerais, São Paulo, Goiás, Mato Grosso do Sul, Paraná e Rio Grande do Sul) demonstraram

atividade antimicrobiana para Streptococcus mutans, a qual foi verificada pela presença de halo

inibitório (0,5 a 1,5mm) ao redor do disco impregnado com extrato alcoólico dessa própolis

(PARK et al., 1998a).

Park et al. (2001) verificaram atividade antimicrobiana semelhante para amostras de

própolis de regiões subtropicais do Brasil (Santa Cruz), do Uruguai e da Argentina (Buenos Aires

e Tucumán), em relação a Staphylococcus aureus. Todas as própolis apresentaram atividades

inibitórias semelhantes (halo de 2mm), exceto a própolis do Uruguai, que inibiu de forma

moderada (halo de 1mm). Além disso, constataram que a resina do álamo Populus sp. presente

nessas regiões, inibiu fortemente (halo de 4mm) o crescimento dessa bactéria.

Popova et al. (2005) verificaram que a atividade antimicrobiana da própolis da Turquia,

com elevada concentração de ácidos fenólicos e flavonóides, é maior do que para própolis com

baixa concentração dessas substâncias. Apesar das diferentes composições químicas, a atividade

antimicrobiana sempre está presente, independente da origem geográfica, da fonte botânica e do

clima da região (BANKOVA, 2005b), uma vez que as abelhas utilizam a própolis como anti-

séptico (MENEZES, 2005).

A maioria dos flavonóides com atividade de proteção a planta contra ataques de

microrganismos são isoflavonóides, flavonas e flavononas (HARBORNE; WILLIAMS 2000). O

efeito antifúngico de sakuranetina (ATKINSON; BLAKEMAN, 1982) e isoflavonóides de

leguminosas (ervilhas, feijão, soja, grão-de-bico) foi verificado pela inibição da germinação de

conídios de Botrytis cinerea na superfície das folhas (HARBONE; WILLIAMS 2000).

Em aplicações agrícolas, foi avaliado o uso da própolis como agente de controle da

germinação de esporos do fungo da ferrugem do cafeeiro (Hemileia vastatrix). A partir da

concentração de 2mL de própolis por litro de água, o controle de germinação de esporos

apresentou-se superior a 99%. Essa dosagem de própolis mostra a viabilidade em uso agrícola

como fungicida natural para fins de cafeicultura e também agricultura orgânica (PEREIRA et al.,

2001).

Devido a habilidade em inibir a germinação de esporos de fungos fitopatógenos, tem se

proposto o uso de flavonóides como agente antifúngico para fungos patógenos ao homem


51

(HARBORNE; WILLIAMS, 2000; CUSHNIE; LAMB, 2005). Já foi verificada a atividade

antifúngica de flavonóides em relação a Candida albicans (VALSARAJ et al., 1997; WACHTER

et al., 1999) e Aspergillus flavus (ZHENG et al., 1996).

De um modo geral, as ações antibacteriana e antifúngica da própolis estão entre as mais

avaliadas (MARCUCCI, 1995; BURDOCK et al., 1998), sendo a antimicrobiana mais

popularmente conhecida e a mais comprovada cientificamente (MENEZES, 2005). Marcucci et al.

(2001) constataram atividades antibacteriana (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,

Streptococcus faecalis, Escherichia coli) e antitripanossomal da própolis do Paraná.

A ação antifúngica (fungistática e fungicida) é atribuída aos ácidos fenólicos (ácido

cinâmico, ácido felúrico e ácido caféico), terpenos e a flavonóides como crisina, ermanina,

galangina, canferol, pinobanskina e pinocembrina, sendo a atividade fungicida atribuída

principalmente a esse último (PARK et al...). Essas substâncias são encontradas nas própolis verde

(BANKOVA et al., 2000; PARK et al., 2002a; SALATINO et al., 2005; MARCUCCI et al., 2007)

e na vermelha, ambas do Brasil (DAUGSCH et al., 2007; SILVA et al., 2007).

A ação anifúngica da própolis já foi verificada em relação a dermatófitos como M. canis,

M.gypseum (DOBROWOLSKI et al., 1991), Trichophyton mentagrophytes e T.rubrum

(DOBROWOLSKI et al., 1991; SOARES; CURY, 2001; KOC et al., 2005); a leveduras como

Candida albicans (KUJUMGIEV et al., 1999; SAWAYA et al., 2002; SANTOS et al., 2005), C.

tropicalis, C. krusei, C. guilliermondii (OTA et al., 2001; SAWAYA et al., 2002) C. lusitaneae, C.

stellatoidea e C. parapsilosis (SAWAYA et al., 2002), Paracoccidioides brasiliensis (MURAD et

al., 2002) e Cryptococcus neoformans (FERNANDES et al., 2007), como também em relação a

outros fungos filamentosos como Aspergillus flavus (ZHENG et al., 1996); A. tamarii, A. flavus,

Cladosporium sphaerospermum, Penicillium digitatum e P. italicum (AFOLAYAN; MEYER,

1997) A combinação de drogas antimicóticas com a própolis aumenta ainda mais a atividade sobre

os fungos (HEGAZI et al., 2000).

A atividade antifúngica da própolis em relação a dermatófitos e espécies de Candida tem

sido atribuída, em parte, aos flavonóides (CAFARCHIA et al., 1999).

Flavonóides prenilados, flavonas e flavononas apresentaram atividade antifúngica para C.

albicans (VALSARAJ et al., 1997; WACHTER et al., 1999) e A. flavus (CUSHNIE; LAMB,

2005). Galangina, um flavonóide comum presente na própolis, tem apresentado atividade

antifúngica para A. tamarii, A. flavus, Cladosporium sphaerospermum, Penicillium digitatum and

P. italicum (CAFARCHIA et al., 1999).

Kujumgiev et al. (1999) observaram que amostras de própolis de diferentes regiões

geográficas (Brasil, Bulgária, Egito e Mongólia) apresentaram atividade antibiótica para Candida


52

albicans, Staphylococus aureus e Escherichia coli, como também antiviral para vírus da influenza

aviária. Para amostras de própolis de região temperada, os flavonóides e ésteres de ácidos

fenólicos foram os responsáveis por essas atividades. Própolis de região tropical apresentaram

traços dessas substâncias mas apresentaram atividades semelhantes, indicando que a atividade

biológica é resultante de uma mistura de componentes e não de um em particular

Da mesma forma, própolis do Brasil e da Bulgária estimularam a atividade fungicida de

macrófagos peritoneais em camundongos, em relação a Paracoccidioides brasiliensis

demonstrando melhor resposta no mecanismo de resistência a esse fungo (MURAD et al., 2002).

Silici et al. (2005) verificaram atividade antifúngica da própolis de apiários da Turquia,

coletadas por abelhas Apis mellifera caucasica em relação a C. albicans, C. glabrata,

Trichosporon spp. e Rhodotorula sp., nas concentrações de 0.03 a 3.75µg/mL.

Oliveira et al. (2006) constataram o efeito fungistático da própolis da região de Maringá na

concentração de 5x10-2 mg/ml sobre espécies de Candida e de Trichosporon assim como, sobre

Geotrichum candidum isodalas de onicomicoses, de acordo com o protocolo de referência M27-A,

segundo CLSI (2002). O efeito fungicida foi obtido na concentração de 20x10-2mg/ml, embora a

susceptibilidade das leveduras tenha sido diferente entre as espécies. A predominância de

flavonóides determinou a propriedade antifúngica e o pH=5,6 do extrato, revelou a proximidade

com o pH da pele indicando a possibilidade tópica de utilização, pois quanto mais distante é esse

valor, maior o grau de agressão à pele. A partir desses dados, foi sugerido o uso da própolis como

uma opção para o tratamento de onicomicoses, pois além de ser um produto natural, é de baixo

custo e não é tóxico.

2.5.5. Extratos Alcoólico e Aquoso

Várias pesquisas têm demonstrado as atividades biológicas da própolis, entretanto a

maioria delas está relacionada ao extrato alcoólico (MARKHAM et al., 1996; MORENO et al.,

1999; KOO et al., 2000; MARCUCCI et al., 2001; SILICI et al., 2005; AMARAL et al., 2006;

FERNANDES JÚNIOR et al., 2006). Foi demonstrado que mais compostos ativos são extraídos da

própolis nativa se o extrato for preparado em álcool etílico em concentrações acima de 50% e por

isso o efeito antibiótico é maior. Quando a água é utilizada como solvente, foi verificado que as

atividades antifúngicas e antibacterianas são mais fracas comparando com extrato etanólico.

(SAWAYA et al., 2002).

O efeito bactericida do extrato etanólico da própolis é promovido pela presença de

ingredientes ativos, principalmente de flavonóides, que em combinação com antimicrobianos


53

podem permitir a redução da dose clínica de determinados antibacterianos. Isso reflete na

diminuição da incidência de efeitos colaterais e potencializa a antibioticoterapia no tratamento de

infecções quando a resistência bacteriana torna-se fator determinante (MIRZOEVA et al., 1997).

O extrato alcoólico da própolis de diferentes localidades da Argentina apresentou atividade

antibacteriana na concentração inibitória mínima de 7.8µg/mL para Streptococcus pyogenes e

outras bactérias resistentes a antibióticos (MORENO et al., 1999).

Park et al. (2000) verificaram atividade antimicrobiana de extratos alcoólicos de amostras

de própolis de São Paulo, Paraná, Bahia e Pernambuco em relação as espécies Staphylococcus

aureus e Streptococcus mutans, pela formação de halo transparente ao redor da colônia indicando

inibição de crescimento.

Prytzyk et al. (2003) constataram atividade antifúngica dos extratos etanólicos de diferentes

amostras de própolis de duas regiões da Bulgária (sudeste e oeste) na concentração de 0.5mg/mL,

em relação a C. albicans. O diâmetro do halo de inibição do crescimento desse fungo foi igual a 13

e a 13,7 mm para as própolis das regiões sudeste e oeste, respectivamente. Esses autores

consideraram que a susceptibilidade antifúngica é negativa quando o diâmetro do halo é menor do

que 10mm.

Trichoderma viride, Aspergillus niger e Penicillium chrysogenum não apresentaram

susceptibilidade ao extrato aquoso da própolis da Alemanha, utilizada em concentrações de até

10% m/v. Por outro lado, os dois fungos filamentosos foram sensíveis aos extratos etanólicos

provenientes de outras localidades (Colômbia, Etiópia, Alemanha, Itália, Polônia, Rússia e África

do Sul) em concentrações de 0.5 a 2.5% m/v. Entre os 16 extratos alcoólicos avaliados, T. viride só

não apresentou sensibilidade em cinco (um da Etiópia, um da Colômbia, três da África do Sul).

Entre seis espécies de bactérias avaliadas (Bacillus subtilis, B. megaterium, B. brevis,

Pseudomonas syringae e Escherichia coli), a atividade antibacteriana do extrato aquoso dessa

própolis foi obtida na máxima concentração utilizada (10% m/v) para quatro primeiras espécies e

não foi obtida na última (GAREDEW et al., 2004).

Koc et al. (2005) constataram a atividade antifúngica do extrato etanólico da própolis da

Turquia (“poplar type”) em relação a Trichophyton rubrum e T. mentagrophytes segundo

protocolo M38-A (CLSI, 2002). Foi obtida inibição de 50% e 90% das amostras analisadas nas

concentrações de 0.1µg/mL e 0.2 µg/mL, respectivamente. Além disso, o uso da própolis como

anti-séptico para dermatófitos representa excelente alternativa no caso de tratamento de tinea pedis

(SOARES; CURY, 2001).

De acordo com o documento M27-A (CLSI, 2002) foi atribuída atividade antifúngica ao

extrato etanólico da própolis da Turquia para C. albicans, C. glabrata, Trichosporon spp.


54

Rhodotorula sp. cuja CIM ≤0.06µg/mL foi a mesma para todas as amostras. A concentração

inibitória mínima para itraconazol foi ≤0.35µg/mL, para todas as amostras, indicando que a

própolis foi tão efetiva quanto o itraconazol (SILICI; KOÇ, 2006).

Quiroga et al. (2006) verificaram a susceptibilidade de espécies de Aspergillus, Fusarium,

Saccharomyces e Rhodotorula mantidas nas coleções de culturas do Instituto de Estudios

Vegetales Dr. A.R. Sampietro e da Universidad Nacional de Tucumán, na Argentina, em relação a

amostras de própolis da região noroeste da Argentina. Os resultados mostraram que esses fungos

foram tão sensíveis a própolis quanto ao cetoconazol e clotrimazol, principalmente pela presença

de pinocembrina e galangina presente no extrato alcoólico. Esses mesmos autores verificaram a

capacidade citotóxica das amostras de própolis nas plantas e constataram a baixa citotoxicidade,

sugerindo a partir desses dados o uso desse produto natural para controle de pragas de plantas.

Alguns trabalhos têm mencionado ausência ou pouca toxicidade da própolis (BURDOCK,

1998; MORENO et al., 2005) inclusive da própolis do Brasil (REIS et al., 2000; RIBEIRO et al.,

2004). Estes resultados já eram esperados, visto que os principais constituintes da própolis

possuem toxicidade relativamente baixa (ADELMANN, 2005).

Entretanto há relatos de dermatite de contato em apicultores espanhóis (CALLEJO et al.,

2001), em pessoas na Rússia e em outras regiões do mundo (MARCUCCI, 1995; BURDOCK,

1998).

Ribeiro et al. (2004) não constataram efeitos tóxicos da própolis sobre o peso corporal e

sobre os metabolismos protéico, lipídico, mineral e de carboidratos de coelhos.

Reis et al. (2000) observaram atividade antiinflamatória do extrato etanólico de amostras de

própolis de regiões de São Paulo, com atividade semelhante a de medicamentos sintéticos

relacionados e a ausência de efeito tóxico.

Experimentos com ratos demonstraram que uma alta dosagem de própolis (700 mg/Kg) não

foi capaz de causar efeitos indesejáveis nesses animais (DOBROWOLSKI et al., 1991). O mesmo

resultado foi observado por pesquisadores russos, os quais demonstraram que a dosagem de 350

mg/Kg administrada em camundongos, não foi capaz de causar efeitos tóxicos. A dose letal

(DL50) para camundongos só foi observada com a ingestão de uma quantidade superior a 7.340

mg/Kg. No entanto, os efeitos indesejáveis podem ser evitados com utilização de dosagens

controladas (RIBEIRO et al., 2004).

Dessa forma, pesquisas científicas vêm corroborando para acentuar o potencial terapêutico

da própolis (MENEZES, 2005).


55

2.5.6. Própolis Verde

2.5.6.1. Fonte Botânica

Baccharis dracunculifolia é a principal fonte botânica da própolis verde produzida em

Minas Gerais e São Paulo por abelhas Apis mellifera (PARK et al., 2000; PARK et al., 2002a).

Alencar et al. (2005a) constataram 96% de similaridade entre as própolis dessas regiões quanto à

fonte botânica. Entretanto a composição química pode variar mesmo quando se têm abelhas da

mesma espécie e o mesmo vegetal como principal fonte botânica. Além de fatores climáticos já

mencionados, qualquer interferência agrícola acentuada na região, pode interferir.

Sousa et al. (2007) verificaram que a produção da própolis pode ocorrer em qualquer lugar

desde que seja oferecida matéria-prima, mas a produção da própolis verde ocorre apenas em

regiões onde a mata nativa característica de cerrado é predominante. Caso contrário, a própolis não

pode ser classificada como própolis verde, pois além de Baccharis dracunculifolia podem existir

outras fontes que influenciem na composição química.

Isso foi observado em cinco regiões de São Paulo e uma de Minas Gerais, as quais tinham

Apis mellifera e Baccharis dracunculifolia como produtor e fonte botânica, respectivamente. A

própolis verde só foi produzida em duas regiões (Capetinga-MG e no distrito de Chave da

Taquara-SP), devido a presença predominante da respectiva fonte botânica. Nas outras regiões,

havia além do alecrim, culturas de cana-de-açúcar, café e eucalipto, que modificaram a

composição química da própolis verde (SOUSA et al., 2007).

2.5.6.2. Composição Química

A própolis verde brasileira apresenta alta concentração de compostos fenólicos com

predomínio de ácidos fenólicos (NASCIMENTO; BEZZAN, 2001; PINTO et al., 2001; PARK et

al., 2002a; BANKOVA, 2005a; SOUSA et al., 2007), sendo o ácido cinâmico o mais abundante,

principalmente os que contem o grupo prenil, como por exemplo, o artepelin C (PARK et al.,

2002a; SALATINO et al., 2005; SOUSA et al., 2007) (Tabela 2). Além desses, também são

citados terpenos (ácidos diterpênicos) e ácidos aromáticos (ALENCAR et al., 2005a).

Flavonóides diferentes da própolis européia já foram constatados na própolis verde do

Brasil, tais como canferide (BOUDOROVA-KRAVSTEVA et al., 1997; PARK et al., 2002a;


56

MARCUCCI et al., 2007), pinobanskina (PARK et al., 2002a; MARCUCCI et al., 2007) crisina,

galangina (MARCUCCI et al., 2007) canferol e isosakuranetina (PARK et al., 2002a).

Mesmo não sendo abundante como na própolis européia, os flavonóides junto com os

ácidos fenólicos, compreendem as classes mais importantes (PINTO et al., 2001; SALATINO et

al., 2005; NASCIMENTO et al., 2007) pois a elas são atribuídas grande parte da bioatividade

contra vários microrganismos patógenos e insetos invasores da colméia (BANSKOTA et al., 1998;

BURDOCK, 1998; HARBORNE; WILLIAMS, 2000) como também as atividades antimicrobiana,

antioxidante, antiviral, antitumoral, antiinflamatória (PINTO et al., 2001; FUNARI; FERRO,

2006).

Além dessas substâncias, também já foram encontrados terpenos (ácidos sesqui, di e

triterpênicos) (SALATINO et al., 2005), acetofenonas (KUMAZAWA et al., 2003; PARK et al.,

2004), lignanas, álcool triterpênico e hidrocarbonos (BANKOVA et al., 2000).

Própolis das regiões de Minas Gerais e São Paulo são ricas em ácidos, entre eles: ácido

caféico, ácido cafeoilquínico, ácido p-cumárico, artepelin C e derivados prenilados (MARCUCCI

et al., 2007).

Dependendo do tipo de solvente empregado na extração ou mesmo das condições

utilizadas no processo, haverá maior ou menor eficiência de extração das substâncias fenólicas

(PINTO et al., 2001). Entretanto, não há dúvidas que em outros ecossistemas, a própolis apresente

diferente composição química, a depender da fonte botânica (BANKOVA et al., 2000;

BANKOVA, 2005b).


57

COMPOSTO REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA

Flavonóides

canferol, canferide, pinobanskina,

pinocembrina, acacetina, crisina, galangina,

isossacuranetina, sacuretina

Park et al., 1998a; Park et al., 2002; Funari e Ferro,

2006; Marcucci et al., 2007.

Ácidos fenólicos

ácido cafeico, ácido cafeoilquínico, derivados

prenilados do ácido p-cumárico, ácido

cinâmico, artepelin C, ácido felúrico

Bankova et al., 2000; Marcucci et al., 2001; Pinto et

al., 2001; Alencar et al., 2005a; Funari e Ferro,

2006; Sousa et al., 2007.

Cetonas

Acetofenonas Bankova et al., 2000; Pinto et al., 2001;

Kumazwa et al., 2003; Park et al., 2004.

Aldeídos aromáticos (vanilina e isovanilina)

e lignanas

Bankova et al., 2000.

Álcoois

Triterpenos Bankova et al., 2000; Pinto et al., 2001.

Terpenos

ácidos sesqui e diterpênicos

Bankova et al., 2000; Pinto et al., 2001; Salatino et

al., 2005.

Compostos voláteis (sesquiterpenos) ácidos

graxos, aminoácidos

Bankova et al., 2000.

Oligoelementos

alumíno, vanádio, ferro, cálcio, silício,

manganês, estrôncio,

Bankova et al., 2000; Pinto et al., 2001.

Vitamina B1, B2, B6, E, C e Hidrocarbonos Bankova et al., 2000.

Tabela 2. Compostos químicos da própolis verde do Brasil.


58

2.5.6.3. Atividades Biológicas

Já foram constatadas várias atividades biológicas relacionadas a própolis verde brasileira,

como antibacteriana (PARK et al., 1998a; BANKOVA et al., 2000, KOO et al., 2000; MATSUI,

et.al., 2004; AMARAL et al., 2006), antiulcerativa (BARROS, 2007), antifúngica (OTA et al.,

2001; SAWAYA et al., 2002; SANTOS et al., 2005), anti-HIV (PARK et al., 2000); antioxidante

(PARK et al., 1998a; REIS et al., 2000; MATSUI et al., 2004) antiinflamatória (KOO et al., 2000;

REIS et al., 2000), anestésica (KOO et al., 2000), hepatoprotetora (MISHIMA et al., 2005;

BANKOVA et al., 2000) citotóxica e antitumoral (BANKOVA et al., 2000; KUMAZWA et al.,

2003; KOO et al., 2000; MISHIMA et al., 2005; PHARMANECTAR...). As atividades

antibacteriana e citotóxica são atribuídas principalmente aos prenilados derivados do ácido p-

cumárico, ao ácido diterpênico e as lignanas, e a antitumoal ao artepelin C e flavonóides

(BANKOVA et al., 2000; KUMAZAWA et al., 2003). Além disso, a atividade biológica dos

flavonóides também está relacionada à capacidade de proteção celular contra radicais livres

(RUSSO et al., 2002). Atividades imunomodulatória e antihepatotóxica são atribuídas ao ácido

cafeiolquínico (BANKOVA et al., 2000).

Há comprovações da eficácia antifúngica da própolis verde de Minas Gerais por inibição de

candidíase oral (SANTOS et al., 2005) e antibacteriana por regressão de 95% de leões de

gengivites (AMARAL et al., 2006), como também da própolis de São Paulo (in vitro e in vivo) em

relação a Candida albicans, C. tropicalis, C. krusei e C. guilliermondi, C. glabrata, C.

parapsilosis e C. lusitaneae (OTA et al., 2001; SAWAYA et al., 2002).

2.5.6.4. Extratos Alcoólico e Aquoso

O extrato etanólico da própolis verde brasileira é rico em ácidos fenólicos, principalmente

o artepelin C e contém maior concentração de flavonóides quando comparando com o extrato

aquoso. O primeiro composto proporciona o sinergismo das ações que incluem antitumoral,

citotóxica, antibacteriana, antifúngica e antiinflamatória. A atividade antibacteriana, nesse caso,

está relacionada a bactérias gram positivas como Staphylococcus aureus e Streptococcus sp. e

gram negativas, como Escherichia coli e a antifúngica, para Candida sp. Já ao artepelin C é

atribuída a atividade antitumoral, citotóxica e antibacteriana, neste último caso, em relação a

Helicobacter pylori, principal agente causador da gastrite (PHARMANECTAR...).


59

O extrato alcoólico da própolis verde do Brasil contém derivados prenilados do ácido p-

cumárico, ácido cinâmico, artepelin C e ácido felúrico como os principais ácidos fenólicos e,

pinobanskina, pinocembrina, canferol, isosacuretina, quercetina, galangina e canferide como os

principais flavonóides. Entre esses, chamam a atenção à elevada concentração de derivados

prenilados do ácido p-cumárico e de canferide (PARK et al., 2002a).

O extrato aquoso da própolis verde brasileira contém como principais constituintes o ácido

cafeiolquínico e derivados (ácido 3,4-di-cafeiolquínico e ácido 3,5-di-O-cafeiolquínico) como

também o ácido cinâmico e derivados (ácido p-cumárico, artepelin C, drupanina e bacarina)

(NAKAJIMA et al., 2007).

Pinto et al. (2001) avaliaram o efeito do extrato alcoólico da própolis verde de Minas

Gerais sobre bactérias patogênicas isoladas do leite de vacas com mastite, da raça Holandesa, de

uma propriedade da zona da mata de Minas Gerais. A própolis utilizada era proveniente de uma

propriedade rural localizada no Município de Itapecerica (MG), de cor verde e odor balsâmico,

cedida pelo proprietário. Os resultados in vitro demonstraram que o extrato alcoólico inibiu o

crescimento de bactérias gram positivas (Staphylococcus aureus, Staphylococcus sp. coagulase

negativo e Streptococcus agalactiae) na concentração de 100mg/mL pela técnica do antibiograma

em discos de papel de filtro. O extrato aquoso não inibiu nenhuma amostra bacteriana, assim como

o veículo alcoólico puro utilizado como controle. De forma semelhante, Park e Ikegaki (1998c) já

haviam constatado que o extrato aquoso da própolis de São Paulo não exibiu atividade

antibacteriana sobre bactérias gram-positivas e que quando o solvente utilizado possuía uma

porcentagem de água superior a 50%, menor era a atividade antibacteriana do respectivo extrato.

Os autores concluíram que os componentes ativos da própolis responsáveis pela antibacteriana na

própolis não são solubilizados pela água por ser solvente de alta polaridade.

Mello et al. (2006) constataram, segundo procedimento do CLSI, que o extrato etanólico da

própolis verde brasileira industrializada pela Pharma Néctar® inibiu a formação do tubo de

germinação de uma amostra de Candida albicans (ATCC 18804). A ausência do tubo de

germinação, observado por microscopia de luz, foi constatado na concentração de 0,33µg/mL. Por

microscopia eletrônica, foi possível observar hiperplasia e alterações de superfície celular como

destacamento da parece celular na concentração de 0.43µg/mL, indicando que essa própolis atua

em nível de parede celular promovendo aumento da permeabilidade celular e conseqüente ruptura

da membrana com perda de material celular.

Extratos etanólicos da própolis verde brasileira de Minas Gerais demonstraram atividade

antimicrobiana em relação a Staphylococcus aureus, mas extrato aquoso não apresentou essa


60

atividade (PARK et al., 1998a). Além disso, também foi observada atividade antioxidante para o

extrato alcoólico (MATSUI et al., 2004).

O ácido cafeoilquínico e seus derivados possuem forte ação antioxidante, sequestrante de

radicais livres, inibição do crescimento de células cancerígenas na leucemia mielóide, indução

daapoptose dessas células e favorecimento da diferenciação celular de granulócitos (BANKOVA

et al., 2000; MISHIMA et al., 2005), ação protetora hepática e das células pancreáticas e

citotóxica, acelerando a redução dos tumores. Foi verificado aumento da eficácia da radioterapia

em cobaias após pré-tratamento com própolis, além de ser observado menor ocorrência de efeitos

adversos em conjunto à estimulação das células sanguíneas (PHARMANECTAR...).

Em geral, a maioria dos compostos da própolis nativa é lipofílica e os mesmos são mais

facilmente extraídos por etanol, por isso, o extrato alcoólico é alvo de várias pesquisas. Isso não

ocorre com o extrato aquoso, embora seja mais facilmente absorvido do que o extrato alcoólico e

apresente componentes importantes como ácido cafeoilquínico. Como a maioria dos compostos da

própolis verde brasileira é hidrofílica, a extração aquosa é mais eficiente nessa própolis do que nas

originárias de outras regiões (MATSUI et al., 2004). Mas, sabe-se que o extrato etanólico

apresenta de um modo geral, maior rendimento de compostos fenólicos e promove mais atividades

biológicas como antimicrobiana, antioxidante (ADELMANN, 2005), antiinflamatória (KOO et al.,

2000; REIS et al., 2000), anestésica e citotóxica (KOO et al., 2000).

2.5.7. Própolis Vermelha

2.5.7.1. Fonte Botânica

Recentemente foi encontrada no Brasil a própolis vermelha em colméias localizadas no

caule de arbustos de manguezais, como também ao longo da costa dos rios e mar dos estados da

Paraíba, Pernambuco, Alagoas, Sergipe e Bahia (Brasil). Foi observado que as abelhas coletavam

o exsudato vermelho da superfície dos buracos feitos por insetos no tronco de Dalbergia

ecastophyllum, conhecida como rabo-de-bugio, sendo essa a origem botânica dessa própolis

(DAUGSCH et al., 2007; SILVA et al., 2007).


61

2.5.7.2. Composição Química

Silva et al. (2007) relataram que a composição química da própolis vermelha do Brasil

também é variável dependendo da biodiversidade da fonte botânica, mas é notável a

predominância de flavonóides. Trusheva et al. (2006) constataram a presença de elemicina,

eugenol, álcool triterpênico (α-amyrin, β-amyrin, cicloartenol, lupeol) e isoflavonóides

(isosativan, medicarpin) na própolis vermelha de Cuba.

Para a própolis vermelha da região nordeste do Brasil, há relatos da composição química

do extrato alcoólico, com predomínio de flavonóides, entre os quais podem ser citados:

liquiritigenina, daidzeína, dalbergina, isoliquiritigenina, formononetina e biochanina A (DAUGSH

et al., 2007). Foram encontrados outros flavonóides presentes na fonte botânica e na própolis, tais

como rutina, pinobanskina, quercetina, luteolina, pinocembrina, entre outros (KANAZAWA et al.,

2003) (Tabela 3).

Silva et al. (2007) encontraram ácido felúrico, quercetina, crisina e medicarpin em amostras

de própolis vermelha de Alagoas.

2.5.7.3. Atividades Biológicas

Em Cuba, atividades biológicas da própolis vermelha são relatadas há mais de 17 anos,

entre as quais podem ser mencionadas: sequestrante de radicais livres e hepatoprotetora

(GONZALEZ et al., 1994; PASCUAL et al., 1994; GONZALEZ et al., 1995).

Aos flavonóides presentes na própolis vermelha são atribuídas atividades terapêuticas

como antitumoral, hepatoprotetora e antimicrobiana. Foi descoberto que isoliquritigenina inibe o

crescimento de câncer prostático (KANAZAWA et al., 2003) e que liquiritigenina e

isoliquirigenina inibem a xantina oxidase. A inibição da xantina oxidase foi sugerida para uso no

tratamento de hepatites e tumores cerebrais, porque aumenta o nível de xantina oxidase sérica

(KONG et al., 2000).

As amostras de própolis vermelha da região nordeste do Brasil apresentaram atividade

antimicrobiana para Staphylococcus aureus (ATCC 25923), em concentrações próximas a

2.5µg/mL, que variaram a depender da prevalência de D. ecastophyllum nas regiões (DAUGSCH,

et al., 2007).


62

COMPOSTO REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA

Flavonóides

pinocembrina, pinobanskina Daugsch et al., 2007.

isovatin, medicarpin

(isofalvonoides)

Silva et al., 2007.

rutina, luteolina,

formononetina

Dugsch et al., 2007.

Quercetina Daugsch et al., 2007; Silva et al., 2007.

Crisina Silva et al., 2007.

Liquititigenina Donnelly et al., 1973; Kong et al., 2000; Daugsch et al., 2007.

daidzeína, fomononetina,

diocanina A (isoflavonoides)

Donnelly et al., 1973; Daugsch et al., 2007.

Dalbergina Donnelly et al., 1973; Daugsch et al., 2007.

Isoloquitigenina Kong et al., 2000; Kanazawa et al., 2003; Daugsch et al., 2007.

Ácido fenólico

ácido felúrico Silva et al., 2007.

Tabela 3. Compostos químicos da própolis vermelha do Brasil.


63

2.6. LECTINAS

Lectinas são proteínas ou glicoproteínas que se ligam especificamente e reversivelmente a

mono e oligossacarídeos livres ou na forma de glicoconjugados (glicoproteína e glicolipídeo).

Dessa forma, combinam-se com moléculas e estruturas biológicas que contem esses açucares sem

alterar a estrutura covalente das ligações glicosídicas nos sítios de ligação (MOREIRA et al., 1996;

MOREIRA et al., 1997; CAVADA et al., 1998, LIS; SHARON, 1998; DAMICO et al., 2003;

CHEN et al., 2005; CHUMKHUNTHOD et al., 2006; WONG et al., 2006). Algumas são

metaloproteínas, necessitando de Ca2+, Mn2+ e Mg2+ para completo funcionamento (CAVADA et

al., 1998).

A palavra tem origem do latim legere (selecionar) e leva em consideração a capacidade

hemaglutinante seletiva das lectinas para um tipo particular de grupo sangüíneo humano.

Entretanto, desde que o termo deixou de ser restrito a isso, o significado original foi esquecido.

Para substituir, usa-se o termo aglutinina que é usado como sinônimo de lectina e mais adequado,

pois aglutina eritrócitos e outras células (PEUMANS; VAN DAMME, 1995).

São encontradas amplamente em animais, plantas, fungos, bactérias e vírus (GRIFFIN,

1993; PEUMANS; VAN DAMME, 1995; WANG et al., 1996; CAVADA et al., 1998; LIS;

SHARON, 1998; NGAI; NG 2004; XIA; NG, 2005; CHUMKHUNTHOD et al., 2006) entretanto

essas substâncias estão presentes em maior quantidade em grãos de leguminosas e gramíneas

(BARONDES, 1981; GRIFFIN, 1993; MOREIRA et al., 1996; RAMOS et al., 1996; CAVADA et

al., 1998; CAVADA et al., 2000; YE et al., 2001; YE; NG, 2001; LORIS, 2002; NG et al., 2002;

SHARON; LIS, 2004; ALENCAR et al., 2005b). As sementes de leguminosas como as de feijão e

ervilha são fontes ricas de lectinas as quais tem sido amplamente caracterizada em relação a

propriedades química, fisicoquímica, estrutural e biológica (GOZIA et al., 1993; MOREIRA et al.,

1993; CAVADA et al., 1996; MOREIRA et al., 1996; GRANGEIRO et al., 1997; NAPIMOGA et

al., 2007). As partes das plantas mais susceptíveis ao ataque de predadores, como por exemplo as

sementes, são as que contem lectinas em maior concentração. Com exceção de quitinases,

glucanases e glicosidades, as lectinas são as únicas proteínas capazes de reconhecer e ligar-se a

glicoconjugados presentes na superfície de bactérias e fungos ou expostos no trato intestinal de

insetos e mamíferos. Além disso, sabe-se da capacidade de estabilidade da lectina em condições

desfavoráveis, a qual se mantém viável em ampla faixa de pH, elevada temperatura e na presença

de proteases de animais e insetos. Isso leva a crer na função de defesa dessa classe de proteína

(PEUMANS; VAN DAMME, 1995, YE; NG, 2001).


64

As lectinas de plantas podem sem agrupadas de acordo com a especificidade de ligação

com o açúcar e com as características estruturais. De acordo com a especificidade por

carboidratos, podem ligar-se a D-manose/D-glicose, D-manose, N-acetilglicosamina, N-

acetilgalactosamina, galactose e ácido siálico (PEUMANS; VAN DAMME, 1995; MOREIRA et

al., 1996; NGAI; NG, 2004; WONG; NG, 2005; WONG et al., 2006). De acordo com as

características estruturais, os três maiores grupos são merolectinas, hololectinas e quimerolectinas.

Merolectinas são proteínas que consistem exclusivamente de único domínio de ligação a

carboidrato. Devido ao caráter monovalente, as merolectinas são incapazes de precipitar

glicoconjugados ou aglutinar células (PEUMANS; VAN DAMME, 1995). Exemplo desse grupo

são as haveínas, proteína do látex de seringueira (Hevea brasiliensis), que se liga à quitina. (VAN

PARIJS et al., 1992). Hololectinas são compostas exclusivamente de domínios de carboidratos

ligantes, mas com dois ou mais sítios de ligação, podendo ser idênticos ou parecidos. Por serem di

ou multivalente, podem aglutinar células e/ou precipitar glicoconjugados, comportando-se como

aglutininas e compreende a maioria das lectinas de plantas, pois se comportam como

hemaglutininas. Quimerolectinas são compostas de um ou mais domínios de carboidratos ligantes

e um domínio não relacionado com uma atividade catalítica bem definida e que age independente

dos domínios de carboidratos ligantes. Dependendo do número de sítios de ligação a carboidratos,

as quimerolectinas comportam-se como merolectinas ou hololectinas. Representantes deste grupo

são as proteínas inativadoras de ribossomos (RIP tipo 2), como por exemplo a ricina (toxina da

mamona), que possui dois domínios de ligação para carboidratos comportando-se como

hololectina e um domínio para a inativação do ribossomo (PEUMANS; VAN DAMME, 1995)

(Figura 2). Essa classificação foi ampliada com o conceito de superlectinas, as quais possuem dois

ou mais domínios ligantes a carboidratos, domínios esses com especificidade para açúcares

diferentes (não-relacionados). Posteriormente foi elaborado o termo multilectinas, que são aquelas

que possuem dois ou mais domínios ligantes a carboidratos, idênticos, mas que podem se ligar a

açúcares diferentes (MONTEIRO-MOREIRA, 2002).


65

Durante muito tempo, as lectinas são analisadas pela participação em diversas atividades

biológicas como antiproliferativa (WANG et al., 1995; WONG; NG, 2003), antitumoral (WANG

et al., 1996; ABDULLAEV; MEJIA, 1997; WANG et al., 2000; NGAI; NG, 2004),

imunomodulatória (WANG et al., 1996; SHE et al., 1998; WANG et al., 2002; RUBINSTEIN et

al., 2004), estimulação de macrófagos, acumulação de leucócitos (RODRIGUEZ et al., 1992),

indução da produção de interferon δ por linfócitos humanos (BARRAL-NETTO et al., 1992),

liberação de histamina (GOMES et al., 1994), efeitos edematogênicos e migração celular (BENTO

et al., 1993), antifúngica (CIOPRAGA et al., 1999; YE et al., 2001; DAMICO et al., 2003;

TRINDADE et al., 2006), antibacteriana (SEQUEIRA; GRAHAM, 1977; AYOUBA et al., 1994),

anti-HIV (PEUMANS; VAN DAMME, 1995; OOI et al., 2000; WANG; NG, 2001; YE et al.,

2001; WONG; NG, 2003; BARRIENTOS; GRONENBORN, 2005; WONG; NG, 2005),

antiinseto (PEUMANS; VAN DAMME, 1995), armazenamento e transporte de carboidratos e

proteínas, armazenamento de nitrogênio, defesa da planta (PEUMANS; VAN DAMME, 1995;

RÜDIGER, 1997; NOMURA et al., 1998), entre outras.

Lectinas com propriedades antifúngicas já foram isoladas de sementes de leguminosa como

feijão Phaseolus vulgaris (YE et al., 2001); de frutas como pitomba Talisia esculenta (FREIRE et

al., 2002), jaca Artocarpus integrifolia, fruta-pão A. incisa (TRINDADE et al 2006) e graviola

Annona muricata (DAMICO et al., 2003); de fungos como Kluyveromyces bulgaricus (VIARD et

Figura 2. Representação esquemática de três tipos de lectinas de plantas: merolectina, hololectina, quimerolectina (Peumans e van Dame, 1995).

MEROLECTINA HOLOLECTINA QUIMEROLECTINA

quitinase – classe I

RIP – tipo II

domínio de ligação ao carboidrato

domínio catalítico

domínio de inativação ribossômica


66

al., 1993) e Schizophyllum commune (CHUMKHUNTHOD et al., 2006); de urtiga Urtica dioica

(BROCKAERT et al., 1989), de batata (GOZIA et al., 1993), de germe de trigo (CIOPRAGA et

al., 1999) e de erva chinesa como Astragalus mongholicus (YAN et al., 2005). Essas lectinas são

denominadas, respectivamente: lectinas de Phaseolus vulgaris, TEL, “jackin”, “frutackin”, AML,

Kb-CWL I, SCL, UDA, lectina de batata, WGA, AMML.

A atividade antifúngica de lectinas já foi constatada em concentrações que variaram entre

100µg/mL a 10.58mg/mL, para diferentes espécies de fungos. Há relatos da atividade antifúngica

de lectinas em relação a leveduras como Sacchromyces cerevisiae (VIARD et al., 1993; FREIRE

et al., 2002; TRINDADE et al., 2006), Candida albicans, C. glabrata, Kluyveromyces bulgaricus,

K. lactis, Pichia pastoris, Rhodotorula mucilaginosa, Sacchromyces bayanus, S. uvarurn,

Schizosacchamyces bulgaricus, Schizosacchamyces octosporus (VIARD et al., 1993),

Trichoderma viridae, T. hamatum (BROCKAERT et al., 1989) e em relação a fungos filamentosos

como Aspergillus niger (CHUMKHUNTHOD et al., 2006), Fusarium oxysporum (CIOPRAGA et

al., 1999; YE et al., 2001; FREIRE et al., 2002; DAMICO et al., 2003; YAN et al., 2005), F.

moniliforme (TRINDADE et al., 2006), F. graminearum (CIOPRAGA et al., 1999), F. solani

(DAMICO et al., 2003), Colletorichum sp. (YAN et al., 2005), C. lindemuthianum (BROCKAERT

et al., 1989; FREIRE et al., 2002), C. musae (DAMICO et al., 2003), Phoma betae, Phycomyces

blakesleeanus, Phytophthora erythroseptica, Septoria nodorum (BROCKAERT et al., 1989),

Botrytis cinerea (BROCKAERT et al., 1989; YAN et al., 2005), Coprinus comatus, Rhizoctonia

solani (YE et al., 2001), Drechslera turcia (YAN et al., 2005).

A atividade antifúngica de lectinas pode variar, dependendo da espécie analisada. Yan et al.

(2005) não constataram atividade antifúngica da lectina AMML, com afinidade de ligação para

galactose e derivados, em relação a Rhizoctonia solani e Mycospharella arachidicola na

concentração de até 200µg/mL. Chumkhunthod et al. (2006) também não observaram essa

atividade para lectina SCL com afinidade de ligação para N-acetilgalactosamina, em relação a S.

cerevisiae, Candida albicans, Penicillium diditatum na concentração de até 1mg/ml. Entretanto

esses autores constataram atividade antifúngica dessas mesmas lectinas para outras espécies de

fungos, como mencionado anteriormente. Os exemplos de lectinas, a respectiva especificidade por

carboidratos e a atuação sobre algumas espécies de fungos estão sumarizados na Figura 3.

A inibição do crescimento de fungos pela ação de lectinas, parece ser resultante da inibição

da germinação de esporos como também do crescimento do micélio (GRIFFIN, 1993). O exato

mecanismo de atuação ainda não foi elucidado, mas parece haver alteração na síntese da parede

celular fúngica devido a modificação na síntese de quitina, por deficiência da deposição na parede

celular. Lectinas que se ligam à quitina demonstram importante efeito antifúngico, entretanto, a


67

ocorrência ou não dessa alteração é dependente da combinação do fungo com a lectina (GRIFFIN,

1993; PEUMANS; VAN DAMME, 1995).

A parede celular dos fungos é altamente versátil, sendo continuamente expandida durante o

crescimento e extensivamente remodelada durante o desenvolvimento. Quimicamente, a parede

contém entre 80 e 90% de polissacarídeos, sendo o restante constituído de proteínas e lipídeos. Em

algumas espécies são encontrados quantidades apreciáveis de pigmentos (melanina), polifosfatos e

íons inorgânicos. Fisicamente, a parede celular é formada por microfibrilas entrelaçadas, embebida

numa matriz amorfa. Quitina e celulose são os principais componentes microfibrilantes da maioria

dos fungos filamentosos, enquanto que nas leveduras a parede contém principalmente glucanas

não celulósicas. Proteínas e vários polissacarídeos (glucanas, mananas, galactanas e

heteropolissacarídeos) são as principais substâncias cimentantes. Os monossacarídeos mais

freqüentemente encontrados na parede celular dos fungos são: D-glicose, N-acetil-D-glicosamina,

D-manose, D-galactose, D-galactosamina, L-fucose, D-glicosamina, xilose e ácido D-glicurônico.

Desses, glicose, N-acetil-D-glicosamina e manose são encontrados na maioria dos fungos.

Ocasionalmente ramnose, ribose e arabinose podem ser observadas (KITAJMA, 2000).

Entretanto, algumas lectinas de leguminosas não apresentam essa atividade para Fusarium

oxysporum, Botrytis cinerea, Mycosphaerella arachidicola e Coprinus comatus (YE; NG, 2001;

NG et al., 2002; WONG; NG, 2003, 2005; WONG et al., 2006) (Figura 4). Outras, podem

apresentar discreto efeito ativador da cinética do crescimento do fungo em cultivo (VIARD et al.,

1993; PÉREZ-SANTIAGO et al., 2000; HERNÁNDEZ et al., 2003).

Viard et al. (1993) observaram efeito estimulatório da lectina Kb-CWL I com

especificidade de ligação a galactose, sobre Candida albicans e C. tropicalis nas concentrações

entre 0.04 e 0.08mg/mL, havendo aceleração para formação do tubo germinativo como também

indução da formação de micélio.

Pérez-Santiago et al. (2000) verificaram a capacidade de inibição e estimulação do

crescimento de Ustilago maydis (basidiomyceto) por lectinas com especificidade para ligação a N-

acetilgalactosamina, N-acetilglicosamina e galactose, na concentração de 100µg/mL. A única

lectina que inibiu a germinação de esporos e o desenvolvimento do fungo foi a CCL, extraída de

Zea mays (milho), com especificidade de ligação por galactose. As lectinas DBA e PLA extraídas

de Dolichos biflorus e Phaseolus lunatus (feijão lima, comum no México e Argentina)

respectivamente, com especificidades por N-acetilgalactosamina, e a lectina WGA com

especificidade pode N-acetilglicosamina, obtida de Triticum vulgaris (trigo), inibiram a

germinação desse fungo mas não houve inibição do desenvolvimento do micélio nem alterações


68

morfológicas. A lectina ConA, obtida de Canavalia ensiformis (feijão-de-porco) e capaz de ligar-

se a glicose e manose, estimulou a germinação dos esporos e o crescimento fúngico.

Hernández et al. (2003) constataram que a ConA tem efeito ativador sobre basidiósporos de

Ustilago maydis após nove horas de incubação, apresentando acentuada capacidade de agregação,

ramificações múltiplas e germinação. Além disso, foram observadas várias alterações

morfológicas como, por exemplo, espessamento da parede celular e deformações no basidiósporo.

Does et al. (1999) avaliaram a atividade antifúngica de UDA e demonstraram que a

inibição do crescimento Botrytis cinerea, Trichoderma viride e Colletotrichum lindemuthianum é

temporária, detectável após seis horas de incubação com a lectina 67µg/mL. Após esse período,

não houve inibição do crescimento fúngico, mesmo na máxima concentração de lectina

(300µg/mL). Esses autores sugerem que o fungo desenvolve algum mecanismo de adaptação.

Canavalia brasiliensis, Dioclea violacea e D. rostrata são leguminosas das quais são

extraídas as lectinas ConBr, DVioL e DRL, respectivamente (CAVADA et al., 1996; BARBOSA

et al., 2001), as quais têm afinidade por glicose e manose (CAVADA et al. 1993, CAVADA et al.,

1996). Essas lectinas já demonstraram indução da produção de histamina em ratos (GOMES et al.,

1994), produção de óxido nítrico (ANDRADE et al., 1999), além do efeito protetor in vivo contra

infecção por Leishmania amazonensis em camundongos BALB/c (BARRAL-NETTO et al.,

1996), estimulação linfocitária em humanos (BARRAL-NETTO et al., 1992), estimulação da

produção de macrófagos e linfócitos em camundongos C3H/HeJ (RODRIGUEZ et al., 1992).

Lonchocarpus sericeus é uma leguminosa da qual é extraída a lectina LSL (NAPIMOGA et

al., 2007) com afinidade por N-acetilglicosamina. Já demonstrou atividade antiinflamatória em

casos de peritonite em ratos, notável diminuição de bactérias que colonizavam essa região

peritoneal (ALENCAR et al., 2005b) e inibição da migração de neutrófilos em processos

inflamatórios (NAPIMOGA et al., 2007).


69

Origem da

lectina Nome da lectina

Carboidrato de ligação Fungo susceptível Referência bibliográfica

Phaseolus vulgaris (feijão vermelho)

lectina de Phaseolus vulgaris

glicoproteínas: lactoferrina, ovoalbumina e tiroglobulina

Fusarium oxysporum Coprinus comatus Rhizoctonia solani

Ye et al., 2001

semente de Talisia esculenta (pitomba)

TEL glicose, manose, N-acetilglicosamina

Sacchromyces cerevisiae Fusarium oxysporum Colletotrichum lindemuthianum

Freire et al., 2002

Artocarpus integrifolia (jaca) A. incisa (fruta-pão)

jackin

frutackin

N- acetilglicosamina S. cerevisiae Fusarium moniliforme

Trindade et al., 2006

Semente de Annona muricata (graviola)

AML glicose, manose Fusarium oxysporum Fusarium solani Colletotrichum musae

Damico et al., 2003

Kluyveromyces bulgaricus (levedura)

Kb-CWL I Galactose Sacchromyces cerevisiae S. bayanus, S. uvarurn Candida albicans, Candida glabrata Rhodotorula mucilaginosa Pichia pastoris Kluyveromyces lactis K.bulgaricus Schizosacchamyces bulgaricus Sch. Octosporus

Viard et al., 1993

Schizophyllum commune (basidiomiceto)

SCL N-acetilgalactosamina Aspergillus niger Chumkhunthod et al., 2006

Urtica dioica (urtiga)

UDA N- acetilglicosamina Trichoderma viride T. hamatum Colletorichum lindemuthianum Botrytis cincerea Phoma betae Phycomyces blakesleeanus Septoria nodorum Phytophytora erythroseptica

Brockaert et al., 1989

Germe de trigo WGA

N- acetilglicosamina Fusarium oxysporum F. graminearum

Ciopraga et al., 1999

Astragalus mongholicus (erva chinesa)

AMML Galactose Colletorichum sp. Drechslera turcia F.oxysporum, Botrytis cincerea

Yan et al., 2005

Figura 3. Lectinas com atividade antifúngica e especificidade de ligação aos carboidratos.


70

Origem da lectina Carboidrato de ligação Fungo analisado Referência bibliográfica

Pisum sativum var. macrocarpon (ervilha)

glicose, manose Fusarium oxysporum Rhizoctonia solani Botrytis cinerea Mycosphaerella arachidicola

Ye; Ng, 2001

Castanea mollisima (castanha chinesa)

glicose, manose Coprinus comatus, Mycosphaerella arachidicola Botrytis cinerea

Ng et al., 2002

Vigna sesquipedalis (feijao da terra)

ácido poligalacturônico Fusarium oxysporum Rhizoctonia solan Coprinus comatus

Wong; Ng, 2003

Canavalia gladiata

glicose, manose, ramnose Botrytis cinerea Mycosphaerella arachidicol Fusarium oxysporum

Wong; Ng, 2005

Feijão malhado Galactose Botrytis cinerea Mycosphaerella arachidicola Fusarium oxysporum

Wong et al., 2006

Figura 4. Lectinas sem atividade antifúngica e especificidade de ligação aos carboidratos.


71

3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Caracterizar amostras Microsporum canis, Microsporum gypseum, Trichophyton

tonsurans, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum e Epidermophyton floccosum,

preservadas na Coleção de Culturas Micoteca – University of Recife Mycology (URM) quanto ao

perfil enzimático e avaliar a atividade antifúngica própolis e lectinas.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Confirmar as características clássicas de amostras de dermatófitos através de aspectos

macroscópicos, microscópicos e fisiológicos;

Detectar a atividade de proteases, queratinases, colagenases, fosfolipases e lipases;

Correlacionar aspectos taxonômicos e perfil enzimático de amostras dermatófitos preservadas;

Avaliar in vitro a atividade antifúngica do extrato alcoólico e aquoso da própolis verde e do

extrato alcoólico da própolis vermelha em relação a espécies de dermatófitos;

Avaliar in vitro a atividade antifúngica de lectinas de leguminosas em relação a espécies de

dermatófitos


72

4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABDEL-GAWAD KM. Mycological and some physiological studies of keratinophilic and other moulds associated with sheep wool. Microbiological Research. v.152, n.2, p.181-188, jul. 1997. ABDEL-RAHMAN, S.M. Polymorphic exocellular protease expression in clinical isolates of Trichophyton tonsurans. Mycopathologia, v. 150, n. 3, p. 117–120, jun. 2000. ABDEL-RAHMAN, S.M. Trichophyton tonsurans exocellular protease expression: correlation with clinical presentation in tinea capitis. Clinical and Experimental Dermatology, v. 27, n. 4, p. 268-271, jun. 2002. ABDULLAEV, F.I.; MEJIA, E.G. Antitumor effect of plant lectins. Natural Toxins, v. 5, n. 4, p. 157-163. 1997. ACKERMANN, T. Fast Chromatographic study of propolis crudes. Food Chemistry, v. 42, n. 2, p. 135-138. 1991. ADELMANN, J. Própolis: variabilidade composicional, correlação com a flora e bioatividade antimicrobiana / antioxidante. 2005. 186f: il. color, tb. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Universidade Federal do Paraná, Curitiba, 2005. AFOLAYAN, A.J.; MEYER, J. J. The antimicrobial activity of 3,5,7- trihydroxyflavone isolated from the shoots of Helichrysum aureonitens. Journal of Ethnopharmacology, v. 57, n. 3, p. 177–181, ago. 1997. AFST-EUCAST: Reference Method for Determination of Minimal Inhibitory Concentration (MIC) by Broth Dilution of Fermentative Yeasts. Discussion document E. Dis. 7.1 ESCAMID. Subcommittee of Antifungal Susceptibility Testing of the European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Taufkirchen. 2002. AGA, H.; SHIBUYA, T.; SUGIMOTO, T.; KURIMOTO, M.; NAKAJIMA, S.H. Isolation and identification of antimicrobial compounds in Brazilian propolis. Bioscience, biotechnology, and Biochemistry, v. 58, n.5, p. 945-946. 1994 AGUIAR, C.L.; ALENCAR, S.M.; PAREDES-GUZMÁN, J.F.; KOO, M.H.; PARK, Y.K. Caracterização físico-química das própolis originárias da região de Mata Atlântica do Estado de Alagoas. Mensagem Doce, n.72, jul. 2003.


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109

5. ARTIGOS 5.1. Taxonomic aspects and enzymatic profile of dermatophytes samples stored at the Mycotheca

Cultures Collection – University of Recife Mycology (URM).

5.2. Atividade antifúngica da própolis verde e da vermelha do Brasil em relação a espécies de

dermatófitos.

5.3. Susceptibilidade de espécies de Trichophyton a própolis verde e a vermelha do Brasil.

5.4. Efeito de lectinas de leguminosas do Brasil sobre o crescimento in vitro de dermatófitos.


110

TAXONOMIC ASPECTS AND ENZYMATIC PROFILE OF DERMATOPHYTES SAMPLES

STORED AT THE MYCOTHECA CULTURES COLLECTION – UNIVERSITY OF RECIFE

MYCOLOGY (URM)

Artigo submetido para:

MYCOPATHOLOGIA

Qualis A

Fator de impacto 0,915 (Journal of Citation Report - 2006)


111

TAXONOMIC ASPECTS AND ENZYMATIC PROFILE OF DERMATOPHYTES SAMPLES

STORED AT THE MYCOTHECA CULTURES COLLECTION – UNIVERSITY OF RECIFE

MYCOLOGY (URM)

Ana Beatriz Sotero Siqueira*1,2, Idalina Inês F. N. Cambuim1, Rita de Cássia Maia3, Viviana

Giampaoli4, Cristina Souza-Motta1, Lusinete Aciole de Queiroz1, Ana Porto2

1Department of Mycology, Federal University of Pernambuco, Recife-Brazil 2 Keizo Asami Immunopathology Laboratory, Federal University of Pernambuco, Recife-Brazil 3 Aggeu Magalhães Research Center – CPqAM / FIOCRUZ, Recife-Brazil 4 Statistics Department, University of São Paulo, Brazil

*Email for correspondence: [email protected]


112

ABSTRACT

Dermatophytes, the etiologic agents of dermatophytosis, are keratinophilic fungi classified in three

genera Microsporum, Trichophyton and Epidermophyton. These fungi are able to produce

a variety of enzymes, which are secreted to the extracellular medium in order to facilitate

substrate degradation. With the purpose of evaluating taxonomic characteristics and the

enzymatic profile of dermatophyte samples stored for different periods of time at the

Mycotheca Culture Collection - University of Recife Mycology (URM), from the Federal

University of Pernambuco, 30 samples from six different species of dermatophytes were

used, being five from each of the following: Microsporum canis, Microsporum gypseum,

Trichophyton tonsurans, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum and

Epidermophyton floccosum. Every sample, preserved from 2 to 22 years, was taxonomically

confirmed. It was observed that the storage period did not affect growth ability and sporulation

among the dermatophytes (p value < 0.01) and storage in general, induces M. canis pleomorphism,

albeit the period of time. Protease activity was observed in 57% of the samples. All of them were

capable of growing in agar-keratin and agar-gelatin, indicating keratinase and collagenase activity,

respectively. None of the samples showed phospholipase activity, but 90% of them showed lipase

activity. The storage period did not intervene on protease, keratinase, collagenase, phospholipase,

and lipase production. Considering this, the fungal preservation at the Mycotheca Culture

Collection - URM, has been shown efficient since the storage time period did not interfere in

confirming taxonomic data and enzyme expression of the different genera.

Key words: enzymatic profile, stored dermatophytes, taxonomic characteristics


113

INTRODUCTION

The dermatophytes are a group of closely related fungal species that have the capacity to

invade keratinized tissue of humans and others animals and produce dermatophytosis. The

organisms belong to three genera including Microsporum, Trichophyton and Epidermophyton. The

identification is based mainly on its morphological and physiological aspects [1, 2], even though

the pleomorphism, common in dermatophytes, difficult the manifestation of these aspects making

the identification, sometimes, flawed. These fungi show similar taxonomic, pathogenic and

antigenic characteristics, but with nutritional and enzymatic differences [3].

These fungi produce a variety of enzymes for the degradation of proteins, including

hydrolytic enzymes like protease, ketarinase, phospholipase and lipase, which are important in the

pathogenicity and can be secreted to the culture medium. Enzymatic detection has been used on

taxonomic studies for species differentiation as well in isolates from the same species allowing the

evidence of variability in epidemiological studies [4, 5, 6, 7].

The preservation of fungi which are pathogenic to man and animals is important for

research and biotechnology, thus, determining the correct preservation method for each fungal

species and periodical monitoring to check their identity has become a requirement [8, 9].

Conservation of morphological, physiological, genetic and metabolic stability is crucial for many

purposes and is vital for isolates used as medical reference strains, for chemotaxonomic studies, or

in the commercial production of biochemicals [10].

Numerous methods for the storage of fungal cultures have been evaluated, and many have

been found to be suitable for high quality storage of at least certain fungal strains. Methods to date

include storage in sterile water, saline, grain or soil at room temperature, storage under mineral or

paraffin oil, freezing at -20 or -80 Cº, freeze-drying, cryopreservation in liquid nitrogen, and

subculturing in sterile distilled water, under mineral oil, drying on silica gel, soil storage or by

freeze-drying [11, 12].

The Mycotheca of the Department of Mycology from the Center for Biological Sciences, of

the Federal University of Pernambuco, registered on the Commonwealth Mycological Institute

under URM (University of Recife Mycology) comprises to date, around 8.000 filamentous and

yeast fungal cultures, kept in duplicate, identified at the species level and preserved by freeze-

drying, mineral oil and distilled sterile water

This work main goal is to evaluate the taxonomic characteristics and enzymatic profile of

the dermatophyte samples stored for different periods of time at the Mycotheca Cultures

Collection – URM, Department of Mycology, Federal University of Pernambuco, Brazil.


114

MATERIAL E METHODS

Fungal Samples

A total of 30 dermatophytes cultures were tested, including 5 strains of each of the

following species: Microsporum canis, M. gypseum, Trichophyton mentagrophytes, T. tonsurans,

T. rubrum and Epidermophyton floccosum. These fungi were obtained from the culture collection

and were preserved in mineral oil [13]. Most of them were clinical isolates, while some were

isolated from soil. They were subsequently maintained at the Mycotheca Cultures Collection –

URM (Table 1).

Taxonomic Characteristics Evaluation

Methods for evaluation of purification and taxonomic aspects of fungi were used as

described by some authors [3, 14]. The isolated colonies were cultured on Sabouraud Dextrose

Agar medium (SDA) and Dermatophyte Test Medium (DTM) on Petri dishes incubated at 30ºC

for 15 days. The microscopic characteristics were observed in accordance with Ridell technique on

SDA, DTM and Potato-Dextrose-Agar medium (PDA) [3].

In order to differentiate T. mentagrophytes from T. rubrum species, the urease activity test

was employed [3, 15]. Colony fragments from T. mentagrophytes and T. rubrum were plated onto

the urea agar medium by Christensen and observed until the seventh day in order to verify de color

switch from yellow to a fucsia pink color, indicating the presence of the enzyme.

Fungal stock cultures were kept on SDA slants at 4 ºC for the enzymes assays.

Evaluation of the Enzymatic Profile

Methods to detect the enzymatic activity of protease, keratinase, collagenase,

phospholipase and lipase were carried out in Petri dishes. After the medium was autoclaved and

cooled to approximately 50ºC, it was distributed on Petri dishes. Fragments of 5 mm were

removed from young colonies grown on Petri dishes containing SDA and each fragment was

placed on the center of the Petri dish containing the specific solid media. After the inoculation, the

isolates were maintained for 20 days at 30ºC.

Protease assay was carried out as described by Kantarcioglu and Yücel [16]. The substrate

skimmed milk medium was prepared and consisted of two phases: 1st phase - skimmed milk,

10g% in distilled water; 2nd phase - agar 2g% in distilled water. When transparent halo around of

the colony was present, acidified solution of mercury chlorate was added to ascertain whether the

halo occurred by acidic or alkaline metabolic products from milk, or if there was a true proteolysis

indicating that casein was really degraded. To detect the enzymatic activity the activity zone (ZA)

was calculated represented by the colony diameter, divided by the diameter of the colony plus the

diameter of transparent halo. The ZA value represents the enzymatic activity when: ZA is between


115

0,9 and 1,0 = very low enzymatic activity (+); between 0,89 and 0,80 = low enzymatic activity (+

+); between 0,79 and 0,70 = high enzymatic activity (+ + +) and < 0,69 = very high enzymatic

activity (+ + + +).

Keratinase and collagenase assays were performed [17], when using keratin and gelatin as

substrates, respectively. Preparation of soluble keratin was obtained by heating chicken feathers in

DMSO (dimethyl sulphoxide) at 100ºC for 2 hours, being precipitated thereafter with acetone.

Soluble keratin at 0,012% was added to the agar medium, containing agar 2% in distilled water.

The test medium to verify the collagenase activity contained gelatin, 1% and agar, 2% in distilled

water. The ability of utilizing keratin or gelatin substrates as the only sources of carbon and

nitrogen, and growth on solid medium containing these substances, indicate keratinase and

collagenase activity, respectively.

To detection of phospholipase activity, two methods were used. For the first method [18],

fragments of cultures were inoculated in the center of Petri dishes containing the phospholipase

medium, which consisted of 0,2% soy lecithin, peptone, 1%, glucose, 2% sodium chloride, 5,73 %,

calcium chloride 0,05% and agar 2%, in distilled water. The second method [19] differs from the

first by using two egg yolks, replacing the “egg yolk” of Difco Laboratories. The formation of an

opaque halo around the colonies indicated phospholipase activity, which was measured. This was

accomplished by calculating the activity zone (Pz), represented by the colony diameter, divided by

the diameter of the colony plus the zone of precipitation. When the Pz was equal to 1.0, the

samples were considered negative and when the Pz was less than 1.0, the phospholipase activity

was considered as positive.

The lipase assay was evaluated as previously described [6]. The lipase medium consisted of

peptone, 1%, sodium chloride, 0,5%, calcium chloride, 0,01% and agar, 2%, in distilled water.

Tween 20 was autoclaved separately and was used as a substrate at a final concentration of 1%.

Formation of a precipitate halo around the colonies indicated lipase production, which was

measured.

Statistical Analysis

In order to evaluate the relationship between dermatophytes samples growth and keratinase

and collagenase production, the Kruskal-Wallis [20] was used.

To analyze the influence of the storage time associated to enzymatic activity, the Gamma

family generalized models were applied [21].


116

RESULTS

Taxonomic Characteristics

All dermatophytes samples preserved from 2 to 22 years were analyzed taxonomically,

considering their macroscopic and microscopic characteristics. Regarding texture, the samples

showed typical characteristics to each species, with two M. gypseum (3060 e 3645) samples and all

M. canis samples showing cotton-like colony texture. The two M. gypseum samples had been

preserved for 18 and 12 years respectively, and the M. canis samples had been preserved from 2 to

9 years.

Regarding the surface, 60% of the M. canis (4678, 4225, 4962), M. gypseum (6034, 3645,

4279) and 80% of the T. mentagrophytes (4156, 3239, 2875, 2875) samples were lobated, and had

been stored for a period of 2 to 21 years. The T. tonsurans, T. rubrum and E. floccosum samples

showed discrete surface appearance differences, with the first two been preserved for 2 to 5 years

and the last for 3 to 17 years.

When observing microscopic characteristics, the DTM and PDA media, were considered

the most suitable to induce sporulation. Only one sample of M. canis sporulated in SDA medium

and all of them sporulated on DTM and PDA media. One sample of M. gypseum (3060) was

subjected to microcultivation in SDA and DTM media for over a month and sporulation was not

observed, which was accomplished only in PDA medium. None of the E. floccosum samples

sporulated in SDA medium, but all of them in DTM and PDA media. The sporulation period

varied between 7 and 30 days, depending on the species being cultivated and the culture medium

used, with an average of 14 to 21 days, with one E. flocossum sample sporulating on the 30 day

(Table 2).

Some of the M. canis (4962) and M. gypseum (4964, 3645, 4279) samples were found

piriform and claviform microconidia. In one T. mentagrophytes (2875) sample was observed

predominantly piriform and claviform microconidia. In order to differentiate that species from T.

rubrum, was used the urease test, which turned positive in the fifth day. The other T.

mentagrophytes samples also produced these samples between the third and fifth days, whereas T.

rubrum samples did not produce it until the seventh day.

Considering the sample storage time, it was observed that the fungus growth and

sporulation abilities in culture medium was determined by the species (p value < 0.01) and was not

observed a relationship between the species and storage period (p value < 0.05).

Enzymatic Profile Evaluation

Among 30 dermatophytes samples were observed protease activity in 57% of them. All

samples were capable of growing in a culture medium containing agar-keratin and agar-gelatin.


117

Phospholipase activity was not observed in any if the samples, while lipase activity was observed

in 90% of the samples.

A high protease activity was observed in three M. canis (4156, 4678, 4158), two M.

gypseum (3060, 4279), two T. mentagrophytes (4156, 4422), one T. tonsurans (4945) and four E.

floccosum (3345, 4151, 4799, 4798) samples. A weak activity was observed in one M. canis

(4962), one M. gypseum (6034), two T. mentagrophytes (3239, 2875) and one T. rubrum (4725)

sample. All other samples did not show any protease activity.

The keratinase production was observed in all samples with the average of the colony

diameter of 6,59; 6,53; 5,29; 4,86; 4,68; 3,60 centimeters for M. gypseum, M canis, T. rubrum, T.

mentagrophytes, T. tonsurans and E. floccosum, respectively (Kruskal-Wallis test 15.7159, p-value

= 0.0016).

Collagenase production was also observed in all samples with the average of the colony

diameter of 7,73; 6,50; 5,63; 5,45; 4,63; 2,89 centimeters for M. canis, M. gypseum, T. rubrum, T.

mentagrophytes, T. tonsurans and E. floccosum, respectively (Kruskal-Wallis test 20.3303, p-value

< 2.2e-16).

The precipitation indicating lipase activity reached diameters between 3,1x 10-3 and 1,55

cm. The samples that showed higher precipitates were two M. canis (4678, 4158), two M. gypseum

(4964, 3645), three T. mentagrophytes (4156, 4422, 2875), two T. tonsurans (4965, 4945), two T.

rubrum (4724, 4728) and three E. floccosum (3345, 4799, 3195) samples. Such activity was not

observed in one M. gypseum (4279), T. mentagrophytes (2785) and T. tonsurans (4968) sample.

The precipitate diameter averages were 5.318, 4.70, 4.60, 3.79, 3.52, 3.142 centimeters observed

in M. canis, T. rubrum, T. mentagrophytes, M. gypseum, T. tonsurans, E. floccosum, respectively

(Kruskal-Wallis test 4.8344, p-value = 0.456). The presence of lipase and protease activity was

observed to be inversely proportional, especially for M. gypseum and T. rubrum species.

When analyzing the enzymatic activity, was observed that the storage period did not

influenced the production of protease (p-value >0.8), keratinase (p-value >0.9), collagenase (p-

value >0.7), phospholipase (p-value >0.7) and lipase (p-value >0.7). Although, it has been shown

that the fungal species influenced the activity of those enzymes (p-value <0.01).

The results obtained in this section can be observed on Table 3.

DISCUSSION

Texture variations and surface aspect observed in the dermatophytes samples analyzed are

typical of pleomorphism and are in agreement with the description others authors [1, 2]. Those

genetic alterations can happen with multiple fungal passages on culture medium or when the


118

fungus is subjected to a preservation condition with a metabolism reduction, showing very few to

none pigmentation [11].

The species that varied the most regarding the macroscopic findings were M. canis, M.

gypseum and T. mentagrophytes. It has been shown that some preserved dermatophyte species,

especially M. canis and T. mentagrophytes, has shown taxonomic variations quite unlike the

parental strains [11, 12].

Pleomorphic colonies observed in SDA medium could have bare mycelial areas, which,

eventually, would cover the whole colony and impair sporulation [2, 11]. Although the storage

period has not caused loss of the sporulation ability, it was observed that it became more difficult

to sporulate in SDA medium, which is usually used for maintenance [1, 22, 23]. The PDA medium

is well known and recognized to induce sporulation in dermatophytes [2, 24, 25].

Microconidia were observed in M. canis and M.gypseum samples similarly to the

Trichophyton sp samples what already have been mentioned by other authors [14, 23]. The

ontogeny of the holothallic conidia of Microsporum and Trichophyton is essentially the same [26].

Their only difference is the macroconidial cell-wall thickness and presence of echinulations in

Microsporum species, which are absent in Trichophyton species [1, 14].

According to the results obtained, it was observed that the preservation seems to alter

macroscopic aspects expression typical of each species, but the storage period did not influence

such finding. Moreover, the storage procedure can induce taxonomic changes and/or alterations in

fungal cell components [12].

The M. canis samples preserved less than 10 years and two M. gypseum samples preserved

over 10 years, showed pleomorphic characteristics. Confirming that the storage period did not

influence the maintenance of the macroscopic aspects in this genus, showing different outcomes to

the preservation process. Similar observations have been described by others authors [12, 27].

The Trichophyton samples preserved for up to 5 years conserved the typical macroscopic

characteristics. In T. mentagrophytes, samples preserved for over 10 years, were pleomorphic,

nevertheless, not much can be established about the other species since they had been preserved

for up to 4 years. In this particular case, it was observed that the T. mentagrophytes samples had

been influenced by the storage time. This has been discussed in a similar fashion by other authors

[11, 12].

The urease production by T. rubrum samples and the lack of production by T.

mentagrophytes samples, as described in the present work, allow stating that these characteristics

are specie-related. The ability to hydrolyze urea is considered the biochemical evidence most


119

widely used to differentiate T. mentagrophytes from T. rubrum, with the first being able to

hydrolyze urea [1, 3, 14].

The lack of association between species and storage period, demonstrated in the present

work, shows that the time influenced equally all samples and none in a special manner.

The use of solid medium allows the detection of an enzymatic activity since dermatophytes

secrete enzymes into the culture medium during growth what improves the substrate assimilation

[6, 28, 29].

The results obtained in this work show that dermatophytes are able to synthesize different

types of enzymes and that the variability in enzymatic activity was observed among different

species, as well as among samples of the same species [4, 7, 30].

The different enzymatic profile could be associated with the ecologic aspect

(anthropophilic, zoophilic and geophilic) of each species. The gradual adaptation of the soil to the

man and other animals involved nutritional adjustment along with the ability to break and utilize

bigger molecules from the skin and annexes in smaller molecules to digest [5, 30].

The findings obtained in this work, regarding the protease activity, are in agreement with

other authors, who also reported this activity in a majority of M. canis e M. gypseum samples [ 7,

31]. It was observed a variation on protease activity among Tricophyton species and an increased

activity of this enzyme in T. mentagrophytes. Similar results have been reported [4, 6, 30]. The

expression of this enzyme’s activity in a T. tonsurans and a T. rubrum sample could be explained

through the anthropophilic behavior of these specie, since they are well adapted to human

parasitism and therefore, could have lost or attenuated their synthesis capability [32, 33].

The development of colonies from all dermatophytes samples in agar-keratin and agar-

gelatin media, demonstrates the presence of keratinases and collagenases, respectively. The

presence of one substrate as a sole nutrient source, demonstrates de ability of those samples to

synthesize enzymes to degrade the substrate and utilize it to the fungal development [34]. These

findings are in agreement with other authors, who detected keratinase and collagenase activity in

dermatophyte samples [6, 33]. However, Abdel-Rahman [4] did not detect the keratinase activity

in a Trichophyton sp. sample among 12 samples studied. The higher keratinase and collagenase

activity was observed among Microsporum samples, and the ecologic aspects aforementioned also

corroborate this finding.

The lack in the phospholipase detection in dermatophytes is in agreement with Dos Santos

et al. [6] who suggest that this criterion should not be taken into consideration as a biotype

differentiation marker. Nevertheless, this parameter was utilized by Maia et al. [7] to characterize

phenotypically new M. canisi isolates.


120

The lipase activity was observed in the majority of dermatophyte samples studied and

similar results have been reported [35]. Other authors mentioned the finding of lipase activity in

dermatophytes specimens such as M. gypseum, T. mentagrophytes [30] and T. rubrum [6].

The data reported in this work shows an inverse correlation between proteases and lipases

activity that can be associated with a compensatory balance between the hyper-activation of one

enzyme and lower activity of the other. It has been established that the skin is the first line of

defense against infections caused by pathogenic microorganisms and also that there are fatty

acids with fungal-static action [36, 37] that complicate infections by dermatophytes,

characterizing a natural defense mechanism of the organism. Tinea capitis, as an example, is well

known as a dermatophytosis occurring almost exclusively in infants, spontaneously decreasing in

puberty due to the production, under hormonal control, of fatty acids with fungal-static properties

[34, 37, 38]. Consequently, those fungi that depend on the enzymatic activity to establish the

inflammatory process, especially extracellular protease and lipase [34, 36] are likely to

compensate the higher activity of one enzyme by the lowering of another.

It was observed that the dermatophyte preservation in the Mycotheca Culture Collection -

URM was efficient, since the period of storage did not influenced data collecting to confirm

taxonomic characteristics of the different species, neither to the expression of enzyme activities.

The utilization of these parameters, to evaluate fungal preservation efficiency, have been

mentioned by other authors [12, 27, 39].

Based on the results obtained, it was concluded that different fungi species vary their

responses to one or more parameters, but that a group of characteristics is common to a specific

group.

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124

Table 1. Dermatophyte species preserved in mineral oil and storaged at the Mycotheca

Cultures Collection - University of Recife Mycology (URM).

Specie Registration Nº Storage year Storage period Substrate (URM) (year)

Microsporum canis M. canis M. canis M. canis M. canis M. gypseum M. gypseum M. gypseum M. gypseum M. gypseum Trichophyton mentagrophytes T. mentagrophytes T. mentagrophytes T. mentagrophytes T. mentagrophytes T. tonsurans T. tonsurans T. tonsurans T. tonsurans T. tonsurans T. rubrum T. rubrum T. rubrum T. rubrum T. rubrum Epidermophyton floccosum E. floccosum E. floccosum E. floccosum E. floccosum

4962 4225 4154 4678 4158 4964 3060 6034 3645 4279 4156 3239 2785 4422 2875 4965 4963 4968 4945 4946 4725 4724 4727 4728 4569 3345 4151 4799 4798 3195

2005 1999 1999 2003 1998 2005 1989 2005 1995 2000 1999 1992 1985 2002 1986 2005 2005 2005 2004 2004 2003 2003 2003 2003 2004 1993 1999 2004 2004 1990

2 8 8 4 9 2

18 2

12 7 8

15 22 5

21 2 2 2 3 3 4 4 4 4 3

14 8 3 3

17

ES ES ES ES ES ES UN ES ES BR BR ES SO ES UN ES ES ES ES ES ES ES ES ES US ES ES ES ES ES

ES: Epidermal scales; UN: Unkown; BR: Beaches of Recife; SO: Soil; US: ungueal scales


125

SDA: Sabouraud Dextrose Agar medium

DTM: Dermatophyte Test Medium

PDA: Potato Dextrose Ágar médium

- : spore absence

Table 2. Sporulation period in different culture media from dermatophytes

samples stored in mineral oil at the Mycotheca Cultures Collection -

University of Recife Mycology (URM).


4962 4225 4154 4678 4158 4964 3060 6034 3645 4279 4156 3239 2785 4422 2875 4965 4963 4968 4945 4946 4725 4724 4727 4728 4569 3345 4151 4799 4798 3195

Specie Registration Nº Sporulation (days) (URM) SDA DTM PDA

21 - - - -

14 -

14 14 14 14 - -

14 21 14 14 14 14 21 7 7

14 14 7 - - - - -

21 21 21 21 21 14 - 7 7 7

14 21 14 14 21 21 21 21 21 21 14 14 14 14 14 14 21 30 14 14

21 21 21 21 21 14 21 14 14 14 14 21 14 14 21 14 14 14 14 21 14 14 14 14 14 14 21 30 14 14


126

Table 3. Enzymatic profile of dermatophytes samples stored in mineral oil at the Micotheca

Cultures Collection - University of Recife Mycology (URM) between 2 and 22 years.

Dermatophyte (URM)

Protease Keratinase Collagenase Phospholipase Lipase (ZA) (φ colony) (φ colony) (φ halo) (φ precipitated)

Enzyme

Microsporum canis 4962 4225 4154 4678 4158 Microsporum gypseum 4964 3060 6034 3645 4279 Trichophyton mentagrophytes 4156 3239 2785 4422 2875 Trichophyton tonsurans 4965 4963 4968 4945 4946 Trichophyton rubrum 4725 4724 4727 4728 4569 Epidermophyton floccosum 3345 4151 4799 4798 3195

+ + -

+ + + + + + + + + + + +

-

+ + + + + +

- + + + +

+ + + + + +

- + + + +

+ + - - -

+ + + + -

+ + - - - -

+ + + + + + + + + + + + + + + +

-

7,35 7,65 6,85 6,65 4,14

6,25 5,15 6,45 7,35 7,75

5,53 4,75 6,20 3,75 4,05

3,85 5,11 3,85 5,95 4,65

4,44 4,40 6,74 5,75 5,15

4,75 4,15 2,75 3,23 3,11

7,75 7,95 7,12 7,25 7,12

7,15 4,65 6,55 7,25 6,90

6,25 4,48 7,95 3,35 5,22

5,94 5,25 3,85 5,45 4,15

5,94 515 4,47 6,35 6,25

2,75 3,40 2,25 3,41 2,65

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

9,3 x 10-3 8 x 10-3

6,8 x 10-3 1,55 1,02

1,45 5,1 x 10-3 7,5 x 10-3

1,09 -

1,40 6,5 x 10-3

- 1,50 1,77

1,30 3,1 x 10-3

- 1,15

3,7 x 10-3

8,3 x 10-3 1,44

6 x 10-3 1,14

6,7 x 10-3

1,30 7,1 x 10-3

1,05 4,7 x 10-3

1,10

ZA: activity zone, φ: diameter in centimeters, - : absence of enzymatic activity, + +: weak proteasic activity, + + + +: very strong proteasic activity


127

ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DA PRÓPOLIS VERDE E DA VERMELHA DO BRASIL EM

RELAÇÃO A ESPÉCIES DE DERMATÓFITOS

Artigo a ser submetido para:

JOURNAL OF ETHNOPHARMACOLOGY

Qualis A



128

ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DA PRÓPOLIS VERDE E DA VERMELHA DO BRASIL EM

RELAÇÃO A ESPÉCIES DE DERMATÓFITOS

Ana Beatriz Sotero Siqueira*a,b, Bruno Severo Gomesa,b, Rita Maiac, Sheila Abreud, Cristina

Souza-Mottaa, Lusinete Aciole de Queiroza, Ana Lucia F. Portob,e.

aDepartamento de Micologia, Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Recife-Brasil bLaboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA), UFPE, Recife-Brasil cCentro de Pesquisas Aggeu Magalhães – CPqAM / FIOCRUZ, Recife-Brasil dPharma Nectar®, Belo Horizonte-Brasil eDepartamento de Morfologia e Fisiologia Animal, Universidade Federal Rural de Pernambuco

(UFRPE) / LIKA-UFPE, Recife-Brasil

*Email para correspondência: [email protected]


129

Resumo

Relevância Etnofarmacológica: Própolis é um material elaborado por abelhas a partir de exsudatos

resinosos de plantas. Algumas amostras de própolis do Brasil já apresentaram atividade

antifúngica.

Objetivo: Verificar a antifúngica da própolis verde e da vermelha do Brasil em relação a amostras

de Microsporum canis, M. gypseum e Epidermophyton floccosum.

Material e Métodos: Foi analisada a atividade antifúngica in vitro do extrato alcoólico e aquoso da

própolis verde e do extrato alcoólico da própolis vermelha em relação a espécies de

demrmatpofitos, sendo utilizado como controle itraconazol e terbinafina.. A concentração

inibitória mínima foi determinada de acordo com o método de adotado pelo “Clinical and

Laboratory Standards Institute”. A concentração fungicida mpinima foi determinada pela ausência

de crescimento em meio de cultura Sabouraud líquido.

Resultados: As espécies pertencentes ao gênero Microsporum foram susceptíveis a atividade

fungistática do extrato alcoólico da própolis verde e da vermelha nas concentrações entre 64-

1024µg/ml e 16-512µg/ml, respectivamente. As amostras de E. floccosum foram susceptíveis a

atividade fungistática desses mesmos extratos entre 8-512µg/ml e 16-256µg/ml, respectivamente.

A atividade fungicida do extrato alcoólico da própolis verde e da vermelha foi constatada entre

256-1024µg/ml e 128-1024µg/ml, respectivamente, para as amostras de dermatófitos utilizadas. O

extrato aquoso da própolis verde não apresentou atividade antifúngica.

Conclusões: Os dados obtidos demonstram que as amostras de M. canis e E. floccosum foram mais

susceptíveis aos extratos alcoólicos das própolis utilizadas do que as de M. gypseum e que o

potencial antifúngico dos extratos alcoólicos das própolis verde e vermelha para essas espécies,

sugerem aplicações futuras como tratamento alternativo para dermatofitoses causadas por essas

espécies.

Palavras chaves: Antifúngico; Dermatófito; Própolis verde; Própolis vermelha


130

1. Introdução

Os dermatófitos, agentes etiológicos de dermatofitoses, são fungos com propriedades

queratinofílicas e queratinolíticas, capazes de infectar pele, pêlos e unhas. Microsporum

canis, M. gypseum e Epidermophyton floccosum são exemplos de espécies zoofílica, geofílica e

antropofílica, respectivamente. Esses fungos apresentam distribuição geográfica cosmopolita,

entretanto podem ser observadas variações na prevalência da espécie de região para região, tendo

esse fato importância epidemiológica e terapêutica (Weitzman e Summerbell, 1995; Aquino et al.,

2007).

Os casos de infecções causadas por dermatófitos têm aumentado consideravelmente (Porro

et al., 1997) e medicamentos de uso tópico e oral têm sido empiricamente administrados (Roberts

et al., 1994). Entretanto, alguns fungos são significativamente diferentes a susceptibilidade a essas

drogas (Jessup et al., 2000).

As dermatofitoses podem ser resistentes à terapia e a resposta ao tratamento pode não ser

adequada (Favre et al., 2003), por isso, torna-se necessário o desenvolvimento de novas estratégias

terapêuticas (García et al., 2003).


produção de compostos antifúngicos pela natureza (Gurgel et al., 2005). Com o passar do tempo,

produtos naturais como própolis, estão sendo cada vez mais utilizados na medicina (Park et al.,

1998).

Própolis é um material resinoso elaborado por abelhas a partir da coleta de exsudatos

resinosos de diversas partes das plantas como brotos, botões florais, folhas novas e casca

(Burdock, 1998; Park et al., 2004; Bankova, 2005). Mais de 300 substancias já foram identificadas

em diferentes amostras de própolis, tais como flavonóides, ácidos fenólicos, ácidos aromáticos e

ácidos diterpênicos, que são os principais componentes responsáveis pelas atividades biológicas

das própolis (Bankova e Marcucci, 2000; Park et al., 2004).

Própolis possui propriedades antibacteriana, antifúngica, antiviral, antiinflamatória,

antiulcerativa, antitumoral, antioxidante, anestésica local, hepatoprotetora, imunoestimulatória,

cicatrizante, entre outras (Banskota et al., 1998; Park et al., 1998; Suzuki et al., 2002; Koc et al.,

2005).

Alguns autores têm relatado a atividade antifúngica da própolis da Turquia em relação a

Trichophyton rubrum e T. mentagrophytes (Koc et al., 2005). Própolis do Brasil, provenientes de

São Paulo, Paraná e Ceará (Kujumgiev et al., 1999; Ota et al., 2001; Sawaya et al., 2002; Oliveira

et al., 2006) e da Bulgária, Mongólia e Egito (Kujumgiev et al., 1999) apresentaram atividade

antifúngica em relação a espécies de Candida. A susceptibilidade de Paracoccidioides brasiliensis


131

para própolis do Brasil (Botucatu) e da Bulgária (Murad et al., 2002) como também de

Cryptococcus neoformans em relação à própolis verde brasileira (Fernandes et al., 2007), já foi

verificada.

A própolis verde do Brasil é rica em derivados prenilados do ácido cinâmico e é elaborada

por abelhas Apis mellifera a partir da coleta da matéria-prima de Baccharis dracunculifolia

(Bankova e Marcucci, 2000). Já foi verificada atividade in vitro em relação a bactérias gram

positivas e gram negativas e in vivo por redução de 95% de casos de gengivites (Amaral et al.,

2006) e inibição de candidíase oral (Santos et al., 2005).

A própolis vermelha brasileira apresenta elevada concentração de flavonóides e é

encontrada em colméias ao longo do mar e costa dos rios, como também em arbustos de

manguezais da região Nordeste do Brasil. O material coletado pelas abelhas Apis mellifera é

proveniente de exsudato vermelho da superfície de Dalbergia ecastophyllum, sendo essa a fonte

botânica dessa própolis. Já foi demonstrada atividade antimicrobiana in vitro da própolis vermelha,

em relação a Staphylococcus aureus (Daugsch et al., 2007).

Este trabalho teve como objetivo avaliar in vitro as atividades fungistática e fungicida do

extrato aquoso da própolis verde e dos extratos alcoólicos da própolis verde e da vermelha, ambas

do Brasil, em relação a amostras de Microsporum canis, M. gypseum e Epidermophyton

floccosum.

2. Material e Métodos

2.1. Amostras fúngicas

Quinze amostras de dermatófitos foram analisadas, sendo cinco de Microsporum canis,

cinco de M. gypseum e cinco de Epidermophyton floccosum. Esses fungos foram obtidos da

Coleção de Culturas Micoteca-University of Recife Mycology (URM) e estavam preservados sob

óleo mineral (Sherf, 1943). A maioria das amostras foi isolada de escamas epidérmicas (Tabela

1). A amostra Trichophyton mentagrophytes (INCQS 40004, ATCC 9533) foi utilizada como

controle.

2.2. Procedimentos para avaliação da atividade antifúngica

O procedimento adotado foi realizado de acordo com a padronização publicada no

documento M38-A (2002) pelo “Clinical and Laboratory Standards Institute” (CLSI, 2002) e

adequado para dermatófitos segundo Fernández-Torres et al. (2002) e Barros et al. (2006).

2.2.1. Meio de cultura

O meio de cultura utilizado para o procedimento foi o RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, USA)

com L-glutamina e sem bicarbonato de sódio, tamponado a pH 7.0 com ácido


132

morfolinepropanesulfônico (MOPS) a 0.165 M (Sigma-Aldrich, USA). O meio foi esterilizado por

filtração em membrana com porosidade de 0,22µm (Millipore).

2.2.2. Antifúngicos

As drogas utilizadas para efeito comparativo foram itraconazol (Jansen-Cilag, São Paulo,

Brasil) e terbinafina (Novartis, São Paulo, Brasil) as quais foram dissolvidas em dimetilsulfóxido

(DMSO) (Gibco, Minas Gerais, Brasil). Foram utilizadas 10 concentrações entre 0.03 e 16µg/ml.

2.2.3. Própolis

Foram utilizados extratos alcoólico e aquoso da própolis verde e extrato alcoólico da

própolis vermelha, fornecidos secos pela Pharma Néctar®, Belo Horizonte, Brasil. A própolis

verde foi obtida de Minas Gerais e a própolis vermelha da Paraíba, estados do Brasi. Após a

solubilização dos extratos nos referidos solventes, água e álcool etílico a 70% (Sawaya et al.,

2002), foram preparadas concentrações de 2 a 1024µg/ml e de 4 a 2048µg/ml, respectivamente

para os extratos alcoólico e aquoso.

2.2.4. Preparação do inóculo

As amostras de Microsporum e E. floccosum foram semeadas em meio de Batata-Dextrose-

Ágar contido em tubos de ensaio os quais foram mantidos a temperatura ambiente (28+ 2ºC) até a

esporulação de cada amostra. Posterirmente foram acrescentados 5ml de água destilada

esterilizada nos tubos de ensaio e com auxílio de pipeta Pasteur foi promovido desprendimento de

esporos e fragmentos de hifas. Após 20 minutos em repouso, o sobrenadante foi aspirado para

outro tubo de ensaio esterilizado e agitado em vortex por 15 segundos. A densidade das

suspensões foi ajustada em espectrofotômetro a 530nm, para obter entre 65-70% de transmitância.

Posteriormente, as suspensões foram diluídas (1:50) em RPMI 1640 para obter a concentração de 2

vezes maior do que a necessária.

2.2.5. Procedimento do teste

Em placas esterilizadas de microtitulação com tampa (TPP, Suíça), contendo 96 poços com

formato de U (fundo chato) foram depositados 100µl das drogas nas fileiras de 1 a 10, sendo que

cada concentração foi depositada em uma fileira. Nos poços das fileiras 11 e 12 foram depositados

100µl do meio RPMI 1640, os quais foram os controles de crescimento e o de esterilização do

meio, respectivamente. Essas placas foram armazenadas a -20ºC até o momento do uso.

No momento adequado, foi depositado em cada poço 100µl do inóculo padronizado como

citado anteriormente (item 2.2.4) e as placas de microtitulação foram incubadas a temperatura

ambiente (28+ 2ºC) por sete dias para interpretação dos resultados.

A determinação da concentração inibitória mínima dos extratos das própolis e dos

antifúngicos foi realizada por observação visual de cada poço que apresentava redução de


133

crescimento fúngico. Levando em consideração o crescimento total (100%) no poço controle, o

percentual de redução de crescimento foi atribuído aos demais poços. A inibição do crescimento

também foi verificada por leitura das placas de microtitulação pelo programa Microplate Manager,

modelo BenchMark Plus (Bio-Rad Laboratories Inc.) a 530nm.

Para itraconazol e terbinafina a concentração inibitória mínima (CIM) foi a que promoveu

inibição de 80% e 100% do crescimento fúngico, respectivamente (Santos e Hamdan, 2005). Para

as própolis a CIM considerada foi a que inibiu 100% do crescimento fúngico.

Para determinação da concentração fungicida mínima, cada conteúdo dos poços que

apresentava redução de 80% e 100% do crescimento fúngico, foi transferido da placa de

microtitulação para tubos de ensaio contendo 5ml de Sabouraud líquido. Os tubos foram mantidos

a temperatura ambiente (28 + 2ºC) por sete dias para verificação de desenvolvimento fúngico. A

concentração fungicida mínima correspondeu a menor concentração fungistática que não permitiu

o crescimento do fungo (Favre et al., 2003).

2. 3. Análise de dados

Todo experimento foi realizado em duplicata. Foram determinadas as concentrações

inibitória e fungicida mínima (CIM e CFM) de cada antifúngico e dos extratos das própolis, as

médias geométricas das concentrações inibitória e fungicida mínima (CIMMG e CFMMG) em

relação a espécie, a determinação da concentração capaz de inibir metade e todas as amostras

analisadas (CIM50 e CIM100, respectivamente).

3. Resultados

Os resultados referentes a atividade antifúngica estão nas Tabelas 2 e 3. A média dos

resultados referentes a inibição do crescimento das amostras de dermatófitos estão nos Gráficos 1

e 2. As amostras de dermatófitos analisadas não foram susceptíveis ao extrato aquoso da própolis

verde.

O extrato alcoólico da própolis verde apresentou atividade fungistática entre 64-1024µg/ml

para M. canis, 256-1024 µg/ml para M. gypseum e 8-512 µg/ml para E. floccosum. A atividade

fungicida do extrato alcoólico da própolis verde foi constatada em três amostras de M. canis

(URM 4225, URM 4154 e URM 4678), cuja CFM=256µg/ml para a primeira e de 1024µg/ml para

as demais. Entre as amostras de M. gypseum, duas (URM 4279 e URM 3645) foram susceptíveis a

atividade fungicida do extrato alcoólico da própolis verde, cuja CFM=1024µg/ml. Todas as

amostras de E. floccosum foram susceptíveis a atividade fungicida do extrato alcoólico da própolis

verde na maior concentração analisada (1024µg/ml).

A atividade fungistática do extrato alcoólico da própolis vermelha foi verificada nas

concentrações de 16-128µg/ml para M. canis, 64-512µg/ml para M. gypseum e 16-256µg/ml para


134

E. floccosum. A atividade fungicida foi verificada entre 128-256µg/ml, 128-1024 e 128-512µg/ml,

respectivamente para as mesmas espécies acima citadas.

4. Discussão

A atividade antifúngica de itraconazol e terbinafina verificada neste trabalho tem sido

mencionada de forma similar por outros autores (Favre et al., 2003; Barros et al., 2006).

As concentrações inibitórias que não foram determinadas, como citados na Tabela 2,

demonstram sensibilidade da maioria das amostras analisadas de M. canis, M. gypseum e E.

floccosum para uma mesma concentração de própolis.

A susceptibilidade das espécies de dermatófitos aos extratos alcoólicos das própolis

utilizadas, pode ser explicada pela composição química das própolis. Já foi demonstrado que mais

compostos ativos são extraídos da própolis nativa se o extrato for preparado com álcool etílico e

em concentrações acima de 50%. Quando a água é utilizada como solvente, é citado que a

atividade antifúngica e a antibacteriana, por exemplo, são mais fracas quando comparada com o

extrato alcoólico (Sawaya et al., 2002).

O extrato alcoólico da própolis verde brasileira é rico em ácidos fenólicos e flavonóides,

havendo predomínio de ácidos fenólicos dos quais o ácido cinâmico é o mais abundante,

principalmente os que contem o grupo prenil, como por exemplo, o artepelin C (Park et al., 2002;

Sousa et al., 2007). Além desses, também são citados terpenos, ácidos aromáticos e flavonóides

tais como canferide, pinobanskina, pinocembrina, crisina, galangina, canferol e isosakuranetina,

entre outros (Park et al., 2002; Marcucci, 2006).

A maior susceptibilidade ao extrato alcoólico da própolis vermelha, verificada neste

trabalho, também está relacionada com a composição química dessa própolis, pois há predomínio

de flavonóides em vez de ácidos fenólicos. Entre os flavonóides, podem ser citados:

liquiritigenina, daidzeína, dalbergina, isoliquiritigenina, formononetina e biochanina A, rutina,

pinobanskina, quercetina, luteolina, pinocembrina, entre outros (Trusheva et al., 2007).

De um modo geral, a atividade antifúngica da própolis é atribuída ao ácido cinâmico, ácido

felúrico, ácido caféico, terpenos e principalmente aos flavonóides, tais como crisina, ermanina,

galangina, canferol, pinobanskina e pinocembrina, sendo a atividade fungicida atribuída

principalmente a esse último (Burdok et al., 1998).

A atividade antifúngica da própolis verde constatada neste trabalho já havia sido verificada

em relação a Candida albicans (Santos et al., 2005) e a Cryptoccoccus neoformans (Fernandes et

al., 2007). Para o extrato alcoólico da própolis vermelha já foi verificada atividade antibacteriana,

em relação a Staphylococcus aureus (Daugsch et al. 2007).


135

As elevadas concentrações inibitórias mínimas obtidas neste trabalho e a não obtenção da

média geométrica da concentração fungicida do extrato alcoólico da própolis verde para M. canis e

M. gypseum, refletem a composição química da própolis do Brasil, que é diferente da própolis

européia, onde predomina flavonóides (Bankova et al., 2000). Koc et al. (2005) verificaram

susceptibilidade de dermatófitos em relação à própolis da Turquia em baixas concentrações

(0.025-0.8µg/ml). Por outro lado, amostras de Candida sp. avaliadas por outros autores foram

susceptíveis ao extrato alcoólico da própolis verde de São Paulo nas concentrações entre 3-

12mg/ml (Ota et al., 2001) e 6-12mg/ml (Sawaya et al., 2002). Entretanto, é citado que quanto

maior é a concentração de flavonóides no extrato de própolis, maior é a atividade antifúngica (Koc

et al., 2005).

A menor sensibilidade de M. gypseum aos antifúngicos e ao extrato alcoólico das própolis

utilizadas, pode está associada com a capacidade de esporulação e a quantidade de esporos

produzidos. De acordo com Fernández-Torres et al. (2003) a parede celular do esporo do

dermatófito é mais espessa do que da hifa, havendo necessidade de maior concentração do

antifúngico para inibição do crescimento. Devido a facilidade da produção de esporos por

amostras dessa espécie, esse fato pode ter ocorrido.

Soares e Cury (2001) sugerem a associação de antifúngicos com própolis como uma

excelente alternativa para o tratamento de dermatofitoses causadas por T. rubrum, T.

mentagrophytes e E. floccosum. A susceptibilidade das amostras de Microsporum e E. floccosum,

utilizadas neste trabalho, a atividade antifúngica do extrato alcoólico da própolis verde e da

vermelha, pode reforçar essa possibilidade.

5. Conclusões

Os dados obtidos demonstram que as amostras de M. canis e E. floccosum foram mais

sensíveis a atividade antifúngica do extrato alcoólico das própolis verde e da vermelha do que as

de M. gypseum. O potencial antifúngico da própolis vermelha para essas espécies sugerem

aplicações futuras como tratamento alternativo para dermatofitoses causadas por M. canis, M.

gypseum ou E. floccosum.

Agradecimentos

Agradecemos a concessão de bolsa pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de

Nível Superior (CAPES) como também pelo suporte financeiro e infra-estrutura da Universidade

Federal de Pernambuco (UFPE), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

(CNPq) e Rede de Coleções de Culturas de Microrganismos do Norte e Nordeste do Brasil

(RENNEBRA).


136

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139

Espécie Nº registro Ano de estoque Período de estoque Substrato

(URM) (ano)

Microsporum canis

M. canis

M. canis

M. canis

M. canis

M. gypseum

M. gypseum

M. gypseum

M. gypseum

M. gypseum

Epidermophyton floccosum

E. floccosum

E. floccosum

E. floccosum

E. floccosum

4962

4225

4154

4678

4158

4964

3060

6034

3645

4279

3345

4151

4799

4798

3195

2005

1999

1999

2003

1998

2005

1989

2005

1995

2000

1993

1999

2004

2004

1990

2

8

8

4

9

2

18

2

12

7

14

8

3

3

17

EE

EE

EE

EE

EE

EE

DE

EE

EE

PR

EE

EE

EE

EE

EE

EE: escamas epidérmicas; DE: desconhecido; PR: praias de Recife

Tabela 1. Amostras de Microsporum canis, M. gypseum e Epidermophyton floccosum

preservadas sob óleo mineral e estocados entre 2 e 18 anos, na Coleção de Culturas

Micoteca - University of Recife Mycology (URM).


140

Tabela 2. Determinação da concentração mínima inibitória de itraconazol, terbinafina e extratos

alcoólicos das própolis verde e vermelha do Brasil, em relação a amostras de Microsporum canis, M.

gypseum e Epidermophyton floccosum preservadas na Coleção de Culturas Micoteca - University of

Recife Mycology (URM).

* Média dos resultados

CIMs: concentrações inibitórias mínimas

CIM50 e CIM100: concentração mínima capaz de inibir 50% e 100% das amostras de Microsporum, canis, M.

gypseum e Epidermophyton floccosum, respectivamente

CIMMG: média geométrica da concentração inibitória mínima de todas as amostras de cada espécie

ND : não determinado

Espécie de dermatófito

(número de amostras testadas)

Microsporum canis (5)

M. gypseum (5)

Epidermophyton floccosum (5)

Antifúngico

(inibição do crescimento)

Itraconazol (80%)

Terbinafina (100%)

Própolis verde (100%)

Própolis vermelha (100%)

Itraconazol (80%)

Terbinafina (100%)



Itraconazol (80%)

Terbinafina (100%)



*CIMs

(µg/mL)

0.125 – 1

0.06 – 0.125

256 – 1024

64 – 128

0.25 – 16

0.25 – 16

1024

128 – 512

0.03

0.03 – 0.125

256 – 512

32 – 256

*CIM50

(µg/mL)

0.125

0.06

256

ND

0.5

0.25

ND

128

ND

0.03

ND

128

*CIM100

(µg/mL)

1

0.125

1024

128

16

16

1024

512

ND

0.06

ND

ND

*CIMMG

(µg/mL)

0.21

0.03

588.13

111.43

1.74

0.57

1024

222.86

0.03

0.04

445.72

147.03


141


CFMs: concentrações fungicidas mínima

CFM50 e CFM100: concentração mínima capaz de inibir 50% e 100% das amostras de Microsporum canis, M.

gypseum e E. floccosum, respectivamente

CFMMG: média geométrica da concentração fungicida mínima de todas as amostras de cada espécie



(número de amostras testadas)

Microsporum canis (5)

M. gypseum (5)

Epidermophyton floccosum (5)

Antifúngico

(inibição de crescimento)

Itraconazol

Terbinafina

Própolis verde

Própolis vermelha

Itraconazol

Terbinafina

Própolis verde

Própolis vermelha

Itraconazol

Terbinafina

Própolis verde

Própolis vermelha

*CFMs

(µg/mL)

0.25 – 2

0.125 – 0.5

256 – 1024

128 – 256

0.5 – 16

0.03 – 16

1024

128 - 1024

0.03 – 0.25

0.03 – 0.25

1024

128 – 512

*CFM50

(µg/mL)

0.25

0.125

256

ND

1

0.25

1024

256

0.06

0.125

ND

256

*CFM100

(µg/mL)

2

0.5

ND

256

16

16

ND

1024

0.125

ND

ND

ND

*CFMMG

(µg/mL)

0.66

0.19

ND

147.03

2

0.43

ND

337.79

0.07

0.16

1024

294.06

Tabela 3. Determinação da concentração mínima fungicida de itraconazol, terbinafina e extratos

alcoólicos das própolis verde e vermelha do Brasil, em relação a amostras de Microsporum canis e

M. gypseum e Epidermophyton floccosum preservadas na Coleção de Culturas Micoteca - University

of Recife Mycology (URM).


142

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024

Microsporum canisM. gypseumEpidermophyton floccosum

Concentração (µg/mL) do extrato alcoólico da própolis verde

Gráfico 1. Média da inibição do crescimento de amostras de Microsporum canis, M. gypseum e

Epidermophyton floccosum preservadas na Coleção de Culturas Micoteca - University of Recife

Mycology (URM), em diferentes concentrações do extrato alcoólico da própolis verde.

D.O

. 530

nm

Concentração (µg/mL) do extrato alcoólico da própolis vermelha

Gráfico 2. Média da inibição do crescimento de amostras de Microsporum canis, M. gypseum e

Epidermophyton floccosum preservadas na Coleção de Culturas Micoteca - University of Recife

Mycology (URM), em diferentes concentrações do extrato alcoólico da própolis vermelha.

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024

Microsporum canisM. gypseumEpidermophyton floccosumD

.O. 5

30nm


143

SUSCEPTIBILIDADE DE ESPÉCIES DE Trichophyton A PRÓPOLIS VERDE E A

VERMELHA DO BRASIL


LETTERS IN APPLIED MICROBIOLOGY

Qualis A



144

SUSCEPTIBILIDADE DE ESPÉCIES DE Trichophyton A PRÓPOLIS VERDE E A

VERMELHA DO BRASIL

Ana Beatriz Sotero Siqueira*1,2, Bruno Severo Gomes1,2, Gilmara Araújo1, Sheila Abreu3, Rita

Maia4, Cristina Souza-Motta1, Lusinete Aciole de Queiroz1, Ana Lucia F. Porto2,5

1Departmento de Micologia, Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Recife-Brasil 2 Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA), UFPE, Recife-Brasil 3 Pharma Néctar®, Belo Horizonte-Brasil 4 Centro de Pesquisa Aggeu Magalhães – CPqAM / FIOCRUZ, Recife-Brazil 5 Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal, Universidade Federal Rural de Pernambuco

(UFRPE), Recife – PE, Brasil



145

RESUMO

Objetivos: A atividade antifúngica de extratos da própolis verde e da vermelha do Brasil foi

constatada in vitro em relação a diferentes espécies de Trichophyton.

Material e Resultados: Foi analisada atividade antifúngica in vitro dos extratos aquoso e alcoólico

da própolis verde e do extrato alcoólico da própolis vermelha do Brasil, em relação a amostras de

Trichophyton rubrum, T. tonsurans e T. mentagrohytes, sendo utilizado como controle itraconazol

e terbinafina. A concentração inibitória mínima foi determinada de acordo com o método de

microdiluição adotado pelo “Clinical and Laboratory Standards Institute”. A concentração

fungicida mínima foi determinada pela ausência de crescimento em meio de cultura Sabouraud

líquido. Os dados obtidos demonstraram que a atividade antifúngica do extrato alcoólico da

própolis verde foi verificada nas concentração de 64 a 1024µg ml-1, enquanto que para o extrato

alcoólico da própolis vermelha foi de 8 a 1024µg ml-1.

Conclusão: A atividade antifúngica do extrato alcoólico da própolis vermelha foi mais eficiente do

que o da verde em todas as amostras de Trichophyton analisadas.

Significância e Impacto do estudo: O potencial antifúngico dos extratos alcoólicos das própolis

verde e da vermelha para essas espécies, sugere aplicações futuras como tratamento alternativo

para dermatofitoses causadas por T. rubrum, T. tonsurans e T. mentagrophytes.

Palavras chaves: antifúngico, dermatófito, própolis verde brasileira, própolis vermelha brasileira


146

INTRODUÇÃO

Os dermatófitos são fungos filamentosos pertencentes aos gêneros Trichophyton,

Microsporum e Epidermophyton capazes de infectar pele, pêlos e unhas. Os casos de infecções

causadas por esses fungos têm aumentado consideravelmente sendo que os agentes etiológicos

mais comuns desse tipo de micose superficial são as espécies pertencentes ao gênero Trichophyton

(Weitzman e Summerbell 1995; Lacaz et al., 2002).

Além dos fungos apresentarem diferentes susceptibilidades às drogas, a resposta ao

tratamento pode não ser eficaz devido a resistência ao medicamento (Favre et al. 2004).

No desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para tratamento de micoses, aquelas

direcionadas para os derivados naturais vêm se destacando principalmente pela capacidade de

produção de compostos antifúngicos pela natureza (Gurgel et al. 2005; Fernandes Júnior et al.

2006) e entre essas, a própolis está sendo cada vez mais utilizada na medicina (Kujumgiev et al.

1999; Santos et al. 2005).

Própolis é um material resinoso elaborado por abelhas a partir da coleta de exsudato

resinoso de diversas partes das plantas como brotos, botões florais, folhas novas e casca (Castaldo

e Capasso 2002; Park, et al. 2004). Já foram identificadas mais de 300 substancias em diferentes

amostras de própolis, tais como flavonóides, ácidos fenólicos, ácidos aromáticos e ácidos

diterpênicos que são os principais componentes responsáveis pelas atividades biológicas da

própolis (Bankova 2005).

A própolis possui propriedades antibacteriana, antifúngica, antiviral, antiinflamatória,

antiulcerativa, antitumoral, antioxidante, anestésica local, hepatoprotetora, imunoestimulatória,

cicatrizante, entre outras (Park et al. 1998; Castaldo e Capasso 2002; Suzuki et al. 2002; Fernandes

Júnior et al. 2006).

A atividade antifúngica da própolis de várias regiões do mundo tem sido recentemente

mencionada. Já foi constatada a atividade antifúngica da própolis da Turquia em relação aos

dermatófitos Trichophyton rubrum e T. mentagrophytes (Koc et al. 2005). A própolis do Brasil,

como as provenientes de São Paulo, Paraná e Ceará, e de outras regiões do mundo como as da

Bulgária, Mongólia e Egito apresentaram atividade antifúngica em relação a espécies de Candida

(Kujumgiev et al. 1999; Ota et al. 2001; Sawaya et al. 2002; Oliveira et al. 2006). Já foi constatada

a susceptibilidade de Paracoccidioides brasiliensis para própolis de Botucatu (Brasil) e da

Bulgária (Murad et al. 2002) como também de Cryptococcus neoformans em relação a própolis

verde brasileira (Fernandes et al. 2007).

A própolis verde do Brasil é nativa da região central do país, é elaborada por abelhas Apis

mellifera a partir da coleta de exsudatos de Baccharis dracunculifolia e é rica em derivados


147

prenilados do ácido cinâmico (Park et al. 2004). Dessa própolis já foi verificada atividade in vitro

em relação a bactérias gram positivas e gram negativas e in vivo por redução de 95% de casos de

gengivites por bactérias (Amaral et al. 2006) além de inibição de candidíase oral (Santos et al.

2005).

A própolis vermelha brasileira é encontrada em colméias ao longo do mar e da costa dos

rios, como também em arbustos de manguezais da região Nordeste do Brasil e contém maior

concentração de flavonóides do que a própolis verde. O material coletado por Apis mellifera é

proveniente de exsudato vermelho da superfície de Dalbergia ecastophyllum, sendo essa a fonte

botânica dessa própolis (Trusheva et al. 2006; Daugsch et al. 2007). Já foi demonstrada atividade

antimicrobiana in vitro dessa própolis em relação a Staphylococcus aureus (Daugsch et al. 2007).

Este trabalho teve como objetivo avaliar in vitro a atividade antifúngica do extrato aquoso

da própolis verde e dos extratos alcoólicos das própolis verde e vermelha do Brasil, em relação a

amostras de Trichophyton mentagrophytes, T. tonsurans e T. rubrum.

MATERIAL E MÉTODOS

Amostras fúngicas

Quinze amostras de dermatófitos foram analisadas, sendo cinco de Trichophyton rubrum,

cinco de T. tonsurans e cinco de T. mentagrophytes. Esses fungos foram obtidos da Coleção de

Culturas Micoteca-University of Recife Mycology (URM) e estavam preservados sob óleo mineral

(Sherf 1943). A maioria das amostras foi isolada de escamas epidérmicas (Tabela 1). A amostra

Trichophyton mentagrophytes (INCQS 40004, ATCC 9533) foi utilizada como controle.


148

Procedimentos para avaliação da atividade antifúngica

Foi utilizado o método descrito no documento M38-A (2002) pelo “Clinical and

Laboratory Standards Institute” (CLSI, 2002) e adequado para dermatófitos segundo Fernández-

Torres et al. (2002) e Barros et al. (2006).

EE: escamas epidérmicas; DE: desconhecido; PR: praias do Recife; SO: solo; EU:

escamas ungueais

Tabela 1. Espécies de dermatófitos preservados sob óleo mineral na Coleção

de Culturas Micoteca - University of Recife Mycology (URM).

Espécie No. registro Ano de Período Substrato (URM) estoque de estoque (ano)

Trichophyton rubrum

T. rubrum

T. rubrum

T. rubrum

T. rubrum

T. tonsurans

T. tonsurans

T. tonsurans

T. tonsurans

T. tonsurans

T. mentagrophytes

T. mentagrophytes

T. mentagrophytes

T. mentagrophytes

T. mentagrophytes

4725

4724

4727

4728

4569

4965

4963

4968

4945

4946

4156

3239

2785

4422

2875

2003

2003

2003

2003

2004

2005

2005

2005

2004

2004

1999

1992

1985

2002

1986

4

4

4

4

3

2

2

2

3

3

8

15

22

5

21

EE

EE

EE

EE

EU

EE

EE

EE

EE

EE

PR

EE

SO

EE

DE


149

Meio de cultura

O meio de cultura utilizado para este procedimento foi o RPMI 1640 (Sigma-Aldrich,

USA) com L-glutamina e sem bicarbonato de sódio, tamponado a pH 7.0 com ácido

morfolinepropanesulfônico (MOPS) a 0.165 M (Sigma-Aldrich, USA). O meio foi esterilizado por

filtração em membrana com porosidade de 0,22µm (Millipore).

Antifúngicos

Foram preparadas concentrações entre 0.03 e 16µg ml-1 de itraconazol (Jansen-Cilag,

Brasil) e terbinafina (Novartis, Brasil) após solubilização em dimetilsulfóxido (DMSO) (Gibco,

Minas Gerais, Brasil), as quais foram utilizadas para efeito comparativo.

Própolis

Foram utilizados extratos alcoólico e aquoso da própolis verde e extrato alcoólico da

própolis vermelha, fornecidos liofilizados pela Pharma Néctar®, Belo Horizonte, Brasil. A

própolis verde é obtida de Minas Gerais e a própolis vermelha da Paraíba, estados do Brasil. Após

a solubilização dos extratos nos referidos solventes, água e álcool etílico a 70% (v/v) (Sawaya et

al. 2002), foram preparadas concentrações entre 0.03 a 1024µg ml-1 e 0.03 a 2048µg ml-1,

respectivamente para os extratos alcoólico e aquoso.

Preparação do inóculo

As amostras de Trichophyton foram semeadas em meio Batata-Dextrose-Ágar contido em

tubos de ensaio os quais foram mantidos a temperatura ambiente (28+ 2ºC) até a esporulação de

cada amostra. Posteriormente foram acrescentados 5ml de água destilada esterilizada nos tubos de

ensaio e com auxílio de pipeta Pasteur foi promovido desprendimento de esporos e fragmentos de

hifas. Após 20 minutos em repouso, o sobrenadante foi aspirado para outro tubo de ensaio

esterilizado e agitado em vortex por 15 segundos. A densidade das suspensões foi ajustada em

espectrofotômetro a 530nm, para obter entre 65-70% de transmitância. Posteriormente, as

suspensões foram diluídas (1:50) em RPMI 1640 para obter a concentração de 2 vezes maior do

que a necessária.

Procedimento do teste

Em placas esterilizadas de microtitulação com tampa (TPP, Suíça), contendo 96 poços com

formato de U (fundo chato) foram depositados 100µl das drogas nas fileiras de 1 a 10, sendo que

cada concentração foi depositada em uma fileira. Nos poços das fileiras 11 e 12 foram depositados

100µl do meio RPMI 1640, os quais foram os controles de crescimento e o de esterilização do

meio, respectivamente. Essas placas foram armazenadas a -20ºC até o momento do uso.


150

No momento adequado, foi depositado em cada poço 100µl do inóculo padronizado como

citado anteriormente (item 2.2.4) e as placas de microtitulação foram incubadas a temperatura

ambiente (28+ 2ºC) por sete dias para interpretação dos resultados.

A determinação da concentração inibitória mínima dos extratos das própolis e dos

antifúngicos foi realizada por observação visual de cada poço que apresentava redução de

crescimento fúngico. Levando em consideração o crescimento total (100%) no poço controle, o

percentual de redução de crescimento foi atribuído aos demais poços. A inibição do crescimento

também foi verificada por leitura das placas de microtitulação pelo programa Microplate Manager,

modelo BenchMark Plus (Bio-Rad Laboratories Inc.) a 530nm.

Para itraconazol e terbinafina a concentração inibitória mínima (CIM) foi a que promoveu

inibição de 80% e 100% do crescimento fúngico, respectivamente (Santos e Hamdan, 2005). Para

as própolis a CIM considerada foi a que inibiu 100% do crescimento fúngico.

Para determinação da concentração fungicida mínima, cada conteúdo dos poços que

apresentava redução de 80% e 100% do crescimento fúngico, foi transferido da placa de

microtitulação para tubos de ensaio contendo 5ml de Sabouraud líquido. Os tubos foram mantidos

a temperatura ambiente (28 + 2ºC) por sete dias para verificação de desenvolvimento fúngico. A

concentração fungicida mínima correspondeu a menor concentração fungistática que não permitiu

o crescimento do fungo (Favre et al., 2003).

Análise de dados

Todo experimento foi realizado em duplicata. Foram determinadas as concentrações

inibitória e fungicida mínima (CIM e CFM) de cada antifúngico e própolis, as médias geométricas

das concentrações inibitória e fungicida mínima (CIMMG e CFMMG) em relação a cada espécie,

a determinação da concentração capaz de inibir metade e todas as amostras analisadas (CIM50 e

CIM100, respectivamente).

RESULTADOS

Estão nas Tabelas 2 e 3 os resultados referentes a atividade antifúngica determinados por

observação visual. Está nos Gráfico 1 e 2 a média dos resultados referentes à inibição do

crescimento das amostras de dermatófitos. As amostras de dermatófitos analisadas não foram

susceptíveis ao extrato aquoso da própolis verde.

O extrato alcoólico da própolis verde apresentou atividade fungistática entre 64-512 µg ml-

1 para T. rubrum e entre 128-1024 µg ml-1 para T. tonsurans e T. mentagrophytes. A atividade

fungicida do extrato alcoólico da própolis verde apresentou CFM=1024 µg ml-1 para T. rubrum e

T. tonsurans e CFM=512 µg ml-1 para T. mentagrophytes.


151

A atividade fungistática do extrato alcoólico da própolis vermelha foi verificada nas

concentrações de 8-128 µg ml-1 para T. rubrum, 32-128 µg ml-1 para T. ronsurans e 16-128 µg ml-

1 para T. mentagrophytes. A atividade fungicida foi verificada entre 128-256 µg ml-1, 128-1024 e

256-512 µg ml-1, respectivamente para as mesmas espécies acima citadas.


CIMs: concentrações inibitórias mínimas

CIM50 e CIM100: concentração mínima capaz de inibir 50% e 100% das amostras de Trichophyton

rubrum, T. tonsurans e T. mentagrophytes, respectivamente

CIMMG: média geométrica da concentração inibitória mínima de todas as amostras de cada espécie



(No. de amostras testadas)

Trichophyton rubrum (5)

T. tonsurans (5)

T. mentagrophytes (5)

Antifúngico

(inibição do crescimento)

Itraconazol (80%)

Terbinafina (100%)



Itraconazol (80%)

Terbinafina (100%)



Itraconazol (80%)

Terbinafina (100%)



*CIMs

(µg ml-1)

0.03

0.03

256 – 512

64 – 128

0.03 - 0.125

0.03

512 – 1024

128

0.03 – 0.125

0.06 – 0.125

512 – 1024

128

*CIM50

(µg ml-1)

ND

ND

ND

64

ND

ND

512

ND

0.06

0.125

512

ND

*CIM100

(µg ml-1)

0.03

0.03

512

128

0.125

0.03

1024

128

0.125

1

1024

128

*CIMMG

(µg ml-1)

0.03

0.03

445.72

97

0.03

0.03

776.04

128

0.08

0.16

776.04

128

Tabela 2. Determinação da concentração inibitória mínima de itraconazol, terbinafina e extratos

alcoólicos das própolis verde e vermelha do Brasil, em relação a amostras de Trichophyton rubrum,

T. tonsurans e T. mentagrophytes preservadas na Coleção de Culturas Micoteca - University of



152


(No. de amostras testadas)

Trichophyton rubrum (5)

T. tonsurans (5)

T. mentagrophytes (5)

Antifúngico

(inibição de crescimento)

Itraconazol

Terbinafina

Própolis verde

Própolis vermelha

Itraconazol

Terbinafina

Própolis verde

Própolis vermelha

Itraconazol

Terbinafina

Própolis verde

Própolis vermelha

*CFMs

(µg ml-1)

0.25 – 0.5

0.03 – 0.125

1024

128 – 256

0.25 – 1

0.03 – 0.25

1024

128 - 1024

0.25 – 2

0.06 – 2

512 – 1024

256 – 512

*CFM50

(µg ml-1)

0.25

0.06

ND

128

0.5

0.03

ND

512

0.25

0.125

ND

256

*CFM100

(µg ml-1)

0.5

0.125

1024

256

0.25

0.25

1024

1024

2

0.25

1024

512

*CFMMG

(µg ml-1)

0.38

0.07

1024

194.01

0.66

0.06

1024

512

0.5

0.28

891.44

337.79


CFMs: concentrações fungicidas mínima

CFM50 e CFM100: concentração mínima capaz de inibir 50% e 100% das amostras de Trichophyton

rubrum, T. tonsurans e T. mentagrophytes, respectivamente

CFMMG: média geométrica da concentração fungicida mínima de todas as amostras de cada espécie


Tabela 3. Determinação da concentração mínima fungicida de itraconazol, terbinafina e extratos

alcoólicos das própolis verde e vermelha do Brasil, em relação a amostras de Trichophyton rubrum,

T. tonsurans e T. mentagrophytes preservadas na Coleção de Culturas Micoteca - University of



153

Concentração (µg ml-1) do extrato alcoólico da própolis vermelha

Gráfico 2. Média da inibição do crescimento de amostras de Trichophyton rubrum, T.

tonsurans e T. mentagrophytes preservadas na Coleção de Culturas Micoteca – University

of Recife Mycology (URM), em diferentes concentrações do extrato alcoólico da própolis

vermelha.

D.O

. 530

nm

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024

Trichophyton rubrumT. tonsuransT. mentagrophytes

Concentração (µg ml-1) do extrato alcoólico da própolis verde

Gráfico 1. Média da inibição do crescimento de amostras de Trichophyton rubrum, T.

tonsurans e T. mentagrophytes preservadas na Coleção de Culturas Micoteca – University

of Recife Mycology (URM), em diferentes concentrações do extrato alcoólico da própolis

verde.

D.O

. 530

nm

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024

Trichophyton rubrumT. tonsuransT. mentagrophytes


154

DISCUSSÃO

A atividade antifúngica de itraconazol e terbinafina obtida em baixas concentrações,

verificada neste trabalho, tem sido mencionada de forma similar por outros autores (Fernández-

Torres et al. 2001; Favre et al. 2004; Barros et al. 2006).

As concentrações inibitórias que não foram determinadas, como citado na Tabela 2,

demonstram sensibilidade da maioria das amostras analisadas para uma mesma concentração de

própolis.

A atividade antifúngica da própolis verde e da vermelha do Brasil em relação a espécies de

Trichophyton, verificada neste trabalho, já havia sido constatada de forma semelhante com outras

própolis provenientes de São Paulo e do Paraná em relação a Trichophyton mentagrophytes e

T.rubrum (Soares e Cury 2001) e com própolis da Turquia, em relação a essas mesmas espécies

(Koc et al. 2005).

Sabe-se que pinocembrina, crisina (flavonóides) e ácido cinâmico (ácido fenólico) são os

principais responsáveis pela atividade antifúngica da própolis (Burdock 1998; Cushnie e Lamb

2005) e que a extração em álcool etílico promove a obtenção de mais compostos ativos da própolis

nativa. Dessa forma, a atividade fungistática e fungicida do extrato alcoólico da própolis verde e

da vermelha, constatada neste trabalho pode ser explicada pela composição química das própolis.

O extrato alcoólico da própolis verde do Brasil é rico em ácidos fenólicos, principalmente em

artepelin C, e apresenta maior concentração de flavonóides do que o extrato aquoso. Os ácidos

fenólicos e flavonóides do extrato alcoólico da própolis verde promovem, de um modo geral, o

sinergismo das atividades biológicas, incluindo a antifúngica, já o artepelin C em especial, é citado

principalmente pela atividade antitumoral (Banskota et al. 2000; Mello et al. 2006). Nakajima et

al. (2007) identificaram como os principais constituintes do extrato aquoso da própolis verde do

Brasil o ácido cafeiolquínico e derivados, e o ácido cinâmico e derivados (ácido p-cumárico,

artepelin C, bacarina), os quais já tinham sido identificados no extrato alcoólico. Entretanto como

o extrato alcoólico apresenta maior rendimento de compostos fenólicos, as atividades biológicas

são mais evidenciadas. Quando a água é utilizada como solvente, é citado que as atividades

antifúngicas e também as antibacterianas são mais fracas comparando com o extrato alcoólico

(Sawaya et al. 2002).

Outros autores mencionam a atividade antifúngica do extrato alcoólico da própolis verde

do Brasil em relação a espécies de Candida (Ota et al. 2001; Sawaya et al. 2002) e a atividade

antibacteriana do extrato alcoólico da própolis vermelha do Brasil em relação a Staphylococcus

aureus (Daugsch et al. 2007).


155

As atividades fungistática e fungicida da própolis vermelha obtidas em concentrações

menores do que a própolis verde, verificada neste trabalho, pode está relacionada com a

composição química dessa própolis, pois há predomínio de flavonóides (pinocembrina e

pinobanskina), em vez de ácidos fenólicos (Kanazawa et al. 2003; Trusheva et al. 2006).

Provavelmente a maior concentração de flavonóides no extrato alcoólico da própolis vermelha

utilizada neste trabalho, tenha refletido a maior atividade antifúngica. Outros autores também

correlacionam a composição química da própolis com atividade antimicrobiana (Katircioglu e

Mercan 2006) e antifúngica (Havsteen 2002; Fernandes Júnior et al. 2006; Quiroga et al. 2006).

Os resultados referentes a maior susceptibilidade de T. rubrum a atividade fungistática dos

extratos alcoólicos das própolis utilizadas, estão de acordo com os de Soares e Cury (2001). Esses

autores constataram susceptibilidade de dermatófitos à atividade fungistática do extrato alcoólico

da própolis do Brasil fornecida pela Uniflora Apicultores Associados LTDA® nas concentrações

de 125µg ml-1 para T.rubrum e de 250µg ml-1 para T. mentagrophytes. Koc et al. 2005 também

constataram maior susceptibilidade das amostras de T. rubrum ao extrato alcoólico da própolis da

Turquia, na concentração de 0.025- 0.4µg ml-1, enquanto que para as amostras de T.

mentagrophytes foi de 0.1-0.8µg ml-1. Entretanto, as elevadas concentrações inibitórias mínimas

obtidas neste trabalho, refletem a composição química da própolis do Brasil, que é diferente da

própolis européia, o que é comprovado por outros autores que determinaram susceptibilidade de

amostras de Candida sp. aos extratos alcoólicos de própolis brasileiras provenientes do estado de

São Paulo, nas concentrações entre 3-12mg ml-1 (Ota et al. 2001) e 6-12mg ml-1 (Sawaya et al.

2002).

A semelhante susceptibilidade de T. tonsurans e T. mentagrophytes à atividade fungistática

dos extratos alcoólicos das própolis verde e vermelha utilizadas, demonstra a eficiente atividade

antifúngica pela inibição do crescimento de espécies diferentes de dermatófitos. Resultados

semelhantes foram citados por Koc et al. (2005) que verificaram atividade fungistática do extrato

alcoólico da própolis da Turquia na concentração de 0.076µg ml-1 para T. rubrum e 0.1µg ml-1

para T. mentagrophytes.

A atividade fungistática do extrato alcoólico das própolis verde e da vermelha em relação

às amostras de Trichophyton utilizadas demonstra a possibilidade da utilização dessa própolis em

associação com antifúngicos sintéticos, como alternativa para o tratamento de dermatofitoses por

espécies desse gênero. Esses resultados são corroborados por Soares e Cury (2001) que sugerem a

associação de antifúngicos com própolis como uma excelente alternativa para o tratamento de

dermatofitoses por T. rubrum, T. mentagrophytes e E. floccosum. De forma semelhante Stepanović

et al. (2003) constataram o sinergismo entre o extrato alcoólico da própolis da Sérvia e


156

antifúngicos, pela potencialização dessas drogas para inibição do crescimento de amostras de C.

albicans.

CONCLUSÕES

De acordo com os resultados obtidos é possível concluir que o extrato alcoólico da própolis

vermelha apresentou atividade antifúngica mais eficiente do que o da verde. As amostras de T.

rubrum foram mais sensíveis a atividade antifúngica do extrato alcoólico da própolis verde e da

vermelha e as amostras de T. tonsurans e T. mentagrophytes foram susceptíveis ao extrato

alcoólico da própolis verde em concentrações inibitórias mínimas semelhantes. O potencial

antifúngico da própolis verde e da vermelha para essas espécies, sugere aplicações futuras como

tratamento alternativo para dermatofitoses causadas por T. rubrum, T. tonsurans e T.

mentagrophytes

Agradecimentos

Agradecemos a concessão de bolsa pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de

Nível Superior (CAPES) como também pelo suporte financeiro e infra-estrutura da Universidade

Federal de Pernambuco (UFPE), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

(CNPq) e Rede de Coleções de Culturas de Microrganismos do Norte e Nordeste do Brasil

(RENNEBRA).

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160

EFEITO DE LECTINAS DE LEGUMINOSAS DO BRASIL SOBRE O CRESCIMENTO IN

VITRO DE DERMATÓFITOS


CELLULAR AND MOLECULAR LIFE SCIENCES

Qualis A

Fator de impacto 4,655 (Journal of Citation Report – 2006)


161

EFEITO DE LECTINAS DE LEGUMINOSAS DO BRASIL SOBRE O CRESCIMENTO IN

VITRO DE DERMATÓFITOS

Ana Beatriz Sotero Siqueira*1,2, Bruno Severo Gomes1,2, Rita Maia3, Cristina Souza-Motta1,

Benildo Souza Cavada5, Lusinete Aciole de Queiroz1, Ana Lucia F. Porto2,4

1Departmento de Micologia, Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Recife-Brasil 2 Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA), UFPE, Recife-Brasil 3 Centro de Pesquisa Aggeu Magalhães – CPqAM / FIOCRUZ, Recife-Brasil 4 Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal, Universidade Federal Rural de Pernambuco

(UFRPE), Recife – PE, Brasil 5 Laboratório de Moléculas Biologicamente Ativas, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza –

CE, Brasil



162

RESUMO

Foi verificado o efeito das lectinas DViol, DRL, ConBr e LSL obtidas de sementes de leguminosas

sobre o crescimento de dermatófitos obtidos da Coleção de Culturas Micoteca – University of

Recife Mycology. O procedimento foi realizado em placas de microtitulação e os resultados

interpretados por leitura visual e pelo leitor de microplacas a 530nm. Foram utilizadas

concentrações de lectinas de 0.5 a 256µg/mL e o inóculo padronizado entre 65-70% de

transmitância. Foi verificado que as lectinas não apresentaram atividade antifúngica mas todas

apresentaram efeito estimulador sobre o crescimento desses fungos. Apenas a lectina DViol

estimulou a produção de esporos de Epidermophyton floccosum.

Palavras chaves: lectinas, leguminosa, Dviol, dermatófitos, Epidermophyton floccosum


163

INTRODUÇÃO

Lectinas são proteínas ou glicoproteínas que se ligam especificamente e reversivelmente a

mono e oligossacarídeos livres ou na forma de glicoconjugados (glicoproteína e glicolipídeo).

Dessa forma, combinam-se com moléculas e estruturas biológicas que contem esses açucares sem

alterar a estrutura covalente das ligações glicosídicas nos sítios de ligação [1, 2, 3].

São encontradas amplamente em animais, plantas, fungos, bactérias e vírus [2, 4, 5, 6]

entretanto essas substâncias estão presentes em maior quantidade em grãos de leguminosas e

gramíneas [1, 7, 8, 9]. As sementes de leguminosas como as de feijão e ervilha são fontes ricas de

lectinas as quais tem sido amplamente caracterizada em relação a propriedades química,

fisicoquímica, estrutural e biológica [1, 10, 11, 12]. As partes das plantas mais susceptíveis ao

ataque de predadores, como por exemplo, as sementes, são as que contem lectinas em maior

concentração. Com exceção de quitinases, glucanases e glicosidades, as lectinas são as únicas

proteínas capazes de reconhecer e ligar-se a glicoconjugados presentes na superfície de bactérias e

fungos ou expostos no trato intestinal de insetos e mamíferos [4, 8].

Dioclea violacea, D. rostrata e Canavalia brasiliensis são leguminosas das quais são

extraídas as lectinas DViol, DRL, ConBr respectivamente, as quais têm afinidade por glicose e

manose [11, 14, 15]. Essas lectinas já demonstraram indução da produção de histamina em ratos

[16], efeito protetor in vivo contra infecção por Leishmania amazonensis em camundongos

BALB/c [17], estimulação linfocitária em humanos [18], estimulação da produção de macrófagos

e linfócitos em camundongos C3H/HeJ [19].

Lonchocarpus sericeus é uma leguminosa da qual é extraída a lectina LSL com afinidade

por N-acetilglicosamina [12]. Já demonstrou atividade antiinflamatória em casos de peritonite em

ratos, notável diminuição de bactérias que colonizavam essa região peritoneal [9] e inibição da

migração de neutrófilos em processos inflamatórios [12].

Alguns trabalhos relatam a atividade antifúngica de lectinas de sementes de leguminosas

tais como Phaseolus vulgaris [8]; de frutas como Talisia esculenta [20], Artocarpus integrifolia,

A. incisa [21] e Annona muricata [22]; de fungos como Kluyveromyces bulgaricus [23] e

Schizophyllum commune [24]; de Urtica dioica [25]; de batata [26]; de germe de trigo [27] e de

Astragalus mongholicus [28]. Essas lectinas são denominadas, respectivamente: lectinas de

Phaseolus vulgaris, TEL, “jackin”, “frutackin”, AML, Kb-CWL I, SCL, UDA, lectina de batata,

WGA, AMML.

A susceptibilidade a atividade antifúngica de lectinas já foi constatada em leveduras como

Sacchromyces cerevisiae [20, 21, 23], S. bayanus, S. uvarurn, Candida albicans, Candida

glabrata, Rhodotorula mucilaginosa, Pichia pastoris, Kluyveromyces bulgaricus, K. lactis,


164

Schizosacchamyces bulgaricus, Schizosacchamyces octosporus [23] e em fungos filamentosos

como Coprinus comatus, Rhizoctonia solani [8], Fusarium oxysporum [8, 22, 27, 28],

Colletorichum lindemuthianum [20], F. moniliforme [21], Colletorichum musae, F. solani [22],

Aspergillus niger [24], Phoma betae, Phycomyces blakesleeanus, Septoria nodorum, Phytophthora

erythroseptica [25], F. graminearum [27], Colletorichum sp., Drechslera turcia [28], Botrytis

cincerea [25, 28], Trichoderma viride, T. hamatum [25].

Entretanto, outras lectinas não apresentam atividade antifúngica [13, 29, 30, 31, 32] e

algumas demonstram efeito ativador da cinética do crescimento do fungo [23, 33, 34].

Os dermatófitos são fungos filamentosos pertencentes aos gêneros Trichophyton,

Microsporum e Epidermophyton, possuem propriedades queratinofílicas e queratinolíticas e são

capazes de infectar pele, pêlos e unhas [35]. São rotineiramente identificados através de aspectos

macroscópicos, microscópicos e fisiológicos entretanto, o pleomorfismo que é comum em

dermatófitos pode dificultar a manifestação desses aspectos [36, 37].

Este trabalho teve como objetivo verificar o efeito de lectinas de sementes de leguminosas

sobre o crescimento de amostras de dermatófitos.

MATERIAL E METODOS

Fungos

Foram utilizadas 30 de seis espécies de dermatófitos, sendo cinco amostra de cada espécie:

Microsporum canis, Microsporum gypseum, Trichophyton tonsurans, Trichophyton

mentagrophytes, Trichophyton rubrum e Epidermophyton floccosum. Tais fungos obtidos da

Coleção de Culturas da Micoteca University of Recife Mycology - URM, da Universidade Federal

de Pernambuco e estavam preservados sob óleo mineral [38]. A maioria das amostras foi isolada

de dermatofitoses enquanto que as demais foram isoladas do solo e de praias da cidade do Recife

(Tabela 1).

Meio de cultura

O meio de cultura utilizado para a avaliação do efeito das lectinas sobre o crescimento dos

dermatófitos foi o RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, USA) com L-glutamina e sem bicarbonato de

sódio, tamponado a pH 7.0 com ácido morfolinepropanesulfônico (MOPS) a 0.165 M (Sigma-

Aldrich, USA). Esse meio de cultura foi esterilizado por filtração em membrana com porosidade

de 0,22µm (Millipore).

Lectinas

Foram utilizadas quatro lectinas extraídas de leguminosas. As lectinas foram DViol, DRL,

ConBr e LSL, extraídas respectivamente de Dioclea violacea, Dioclea rostrata, Conavalia

brasiliensis e Lonchocarpus sericeus. A primeira lectina foi obtida de sementes de leguminosas do


165

estado do Rio Grande do Sul (Brasil) e as demais do estado do Ceará (Brasil). Essas lectinas

foram purificadas [1, 11, 39, 40] e gentilmente fornecidas pelo Laboratório de Moléculas

Biologicamente Ativas da Universidade Federal do Ceará. Após solubilização em água destilada e

esterilizada, foram preparadas dez concentrações entre 0.5 e 256µg/mL, seguido de diluições

seriadas para atingir a concentração final de 10 vezes maior do que a concentração utilizada no

procedimento. Posteriormente, foram diluídas (1:5) em RPMI 1640 para obter a concentração de

duas vezes maior do que a necessária.

Preparação do inóculo

As amostras de dermatófitos foram semeadas em meio de Batata-Dextrose-Ágar contido

em tubos de ensaio os quais foram mantidos a temperatura ambiente (28+ 2ºC) até a esporulação

de cada amostra. Posterirmente foram acrescentados 5ml de água destilada esterilizada nos tubos

de ensaio e com auxílio de pipeta Pasteur foi promovido desprendimento de esporos e fragmentos

de hifas. Após 20 minutos em repouso, o sobrenadante foi aspirado para outro tubo de ensaio

esterilizado e agitado em vortex por 15 segundos. A densidade das suspensões foi ajustada em

espectrofotômetro a 530nm, para obter entre 65-70% de transmitância. Posteriormente, as

suspensões foram diluídas (1:50) em RPMI 1640 para obter a concentração de 2 vezes maior do

que a necessária.

Avaliação do efeito de lectinas sobre o crescimento de dermatófitos

O procedimento foi realizado em placas esterilizadas de microtitulação com tampa (TPP,

Suíça), contendo 96 poços com formato de U (fundo chato) nas quais foram depositados 100µL

das lectinas nas fileiras de 1 a 10, sendo que cada concentração foi depositada em uma fileira. Nos

poços das fileiras 11 e 12 foram depositados 100µL do meio RPMI 1640, os quais foram o

controle de crescimento e o de esterilização do meio, respectivamente. Essas placas foram

armazenadas a -20ºC até o momento do uso. No momento adequado, 100µL do inóculo

padronizado foi depositado nos poços das fileiras 1 a 11.

Após inoculação, as placas de microtitulação foram incubadas a temperatura ambiente (28+

2ºC) por sete dias para interpretação dos resultados [41]. A avaliação macroscópica do crescimento

das amostras nos poços das placas de microtitulação foi realizada por observação visual de cada

poço, comparando com o crescimento no poço controle. Além disso, essas placas foram

submetidos ao leitor de microplacas, programa Microplate Manager, modelo BenchMark Plus

(Bio-Rad Laboratories Inc.) a 530nm.

Para avaliação microscópica, foram retirados fragmentos das colônias desenvolvidas nas

placas de microtitulação e corados com azul de Aman. As amostras que apresentaram

características microscópicas típicas da espécie foram semeadas em meio Sabouraud-Dextrose-


166

Ágar contido em placas de Petri, para observação de características macroscópicas, as quais foram

identificadas segundo os autores [36, 37].

Análise dos dados

Todo experimento foi realizado em duplicata. De cada concentração, foi determinada a

média do crescimento fúngico.

RESULTADOS

Nenhuma das lectina testadas apresentou atividade antifúngica para as amostras de

dermatófitos analisadas. Entretanto de acordo com os resultados obtidos no sétimo dia de

incubação, tanto pela avaliação visual quanto pelo leitor de microplacas, foi constatado que todas

as amostras de dermatófitos utilizadas apresentaram aumento do crescimento diretamente

proporcional ao aumento da concentração das lectinas utilizadas (Figuras 1A, 1B, 2A e 2B).

Foi realizada observação microscópica de fragmentos das colônias dos dermatófitos

desenvolvidos nas placas de microtitulação e foi observado que apenas as amostras de E.

floccosum no sétimo dia de incubação, produziram em grande quantidade esporos característicos

na presença da lectina DViol (256µg/mL). Foram observadas macroaleurias claviformes, isoladas,

sem ornamentações na parede celular, sem ou com septos (Figura 3A). Não foram observados

clamidósporos nem microaleurias. Não houve produção de esporos de E. floccosum na ausência

dessa lectina nem quando essa espécie foi submetida à incubação em concentrações menores de

DViol (Figura 3B). Para as demais amostras de Microsporum e Trichophyton na presença das

lectinas utilizadas (DViol, DRL, ConBr e LSL) em todas as concentrações testadas, não houve

produção de esporos.

A avaliação macroscópica das culturas de E. floccosum em meio de ágar Sabouraud, após

incubação com a lectina DViol, revelou características da espécie analisada, tais como superfície

de coloração branca (Seguy, 1936 - Pl XLVI 680 albus), textura cotonosa, margem regular,

aspecto plano (URM 4799, URM 4798, URM 4151) ou com sulcos radiais (URM 3195, URM

3345) (Figura 4A). O reverso apresentou-se plano com pigmentação variando entre amarelo

(Seguy, 1936 - PlXV 214 orange), amarelo mostarda (Seguy - PlXV 215 orange) e amarelo-

amarronzado (Seguy - PlXV 215 orange, PlXXIII 337 vert). As colônias com pigmentação

amarela foram URM 3195 e URM 4799, a amarelo-mostarda foi URM 4798 e as amarronzadas

foram URM 4151 e URM 3345 (Figura 4B).

DISCUSSÃO

Lectinas de sementes de leguminosas sem atividade antifúngica e com especificidade de

ligação à glicose e manose também já foram relatadas por outros autores, tais como a lectina de


167

ervilha Pisum sativum var. macrocarpon [13], de castanha chinesa Castanea mollisima [29] e de

feijão Canavalia gladiata [32].

Entretanto, há relatos de outras lectinas que podem se ligar à glicose, manose e N-

acetilglicosamina com atividade antifúngica. Entre essas, a lectina TEL já promoveu inibição de

57% do crescimento de Sacchromyces cerevisiae, Fusarium moniliforme e Colletotrichum

lindemuthianum na concentração de 280µg/mL [20] e a lectina AML (glicose/manose) que

promoveu inibição de 41% do crescimento de F. solani, F. oxysporum e Colletotrichum musae na

concentração de 100µg/mL [22]. Trindade et al. [21] verificaram a atividade antifúngica das

lectinas “jackin” e “frutackin” (N-acetilglicosamina) a 2.25mg/mL para S. cerevisiae e Fusarium

moniliforme.

O estímulo do crescimento dos dermatófitos utilizados neste trabalho pelas lectinas DViol,

DRL, ConBr e LSL é corroborado por Viard et al. [23], que também observaram o efeito

estimulador da lectina Kb-CWL I, obtida de Kluveromyces bulgaris e com afinidade de ligação à

galactose, sobre o crescimento in vitro de Candida albicans e C. tropicalis.

De acordo com os resultados obtidos neste trabalho, referente ao período de esporulação

nos meios de SDA, DTM e BDA, foi verificado que E. floccosum é um fungo que esporula

lentamente, mas em contato com a lectina DViol, esse período diminuiu e produção de esporos foi

estimulada. De forma semelhante, outros autores [33, 34] verificaram que a lectina Concanavalina

A (ConA), com a afinidade de ligação por glicose e manose, estimulou a germinação de esporos de

Ustilago maydis. Hernández et al. [34] constataram algumas alterações morfológicas decorrentes

da atuação da ConA sobre basidioporos de Ustilago maydis, tais como espessamento da parede

celular e deformação desses esporos. Entretanto, nenhuma alteração microscópica foi verificada

nas amostras de E. floccosum utilizadas neste trabalho.

A obtenção de grande quantidade de esporos de E. floccosum resultante da estimulação

pela lectina DViol a 250µg/mL, está de acordo com os resultados obtidos por Pérez-Santiago et al.

[33]. Esses autores verificaram que a lectina Con A (glicose/manose) aumentou cerca de 30% a

esporulação de Ustilago maydis a 100µg/mL

A análise da composição química da parece celular dos dermatófitos indica que entre os

carboidratos, há predomínio de glicose, manose, glicomanose e N-acetilglicosamina [43]. Shah e

Knight [44] constataram diferenças significativas na elevada concentração de glicose na parede

celular de E. floccosum. Talvez esse carboidrato tenha favorecido o efeito da lectina DViol

utilizada neste trabalho sobre essa espécie de dermatófito.

De acordo com os resultados obtidos foi concluído que as lectinas DViol, DRL, ConBr e LSL

não apresentaram atividade antifúngica nas concentrações testadas, mas todas estimularam o


168

crescimento das amostras de dermatófitos em todas as concentrações utilizadas. Apenas a lectina

DViol estimulou a esporulação das amostras de E. floccosum.

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172

EE: escamas epidérmicas; DE: desconhecido; PR: praias de Recife; SO: solo; EU: escamas ungueais

Espécie Nº registro Ano de estoque Período de estoque Substrato (URM) (ano)


4962 4225 4154 4678 4158 4964 3060 6034 3645 4279 4156 3239 2785 4422 2875 4965 4963 4968 4945 4946 4725 4724 4727 4728 4569 3345 4151 4799 4798 3195

2005 1999 1999 2003 1998 2005 1989 2005 1995 2000 1999 1992 1985 2002 1986 2005 2005 2005 2004 2004 2003 2003 2003 2003 2004 1993 1999 2004 2004 1990

2 8 8 4 9 2

18 2

12 7 8

15 22 5

21 2 2 2 3 3 4 4 4 4 5

14 8 3 3

17

EE EE EE EE EE EE DE EE EE AP AP EE SO EE DE EE EE EE EE EE EE EE EE EE EU EE EE EE EE EE

Tabela 1. Espécies de dermatófitos preservados sob óleo mineral na Coleção de

Cultura Micoteca - University of Recife Mycology (URM).


173

Figura 1. Crescimento de amostras de dermatófitos obtidas da Coleção de Culturas Micoteca – University of Recife Mycology em diferentes concentrações da lectina Dviol (A) e DRL (B).

Microsporum canis M. gypseum

Trichophyton rubrum

T. mentagrophytes

T. tonsurans Epidermophyton floccosum

Concentração (µg/mL) da lectina DViol

D.O

530

nm

A

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0 0.5 1 2 4 8 16 32 64 128 256

B

D.O

530

nm

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 0.5 1 2 4 8 16 32 64 128 256

Concentração (µg/mL) da lectina DRL


174

Figura 2. Crescimento de amostras de dermatófitos obtidas da Coleção de Culturas Micoteca – University of Recife Mycology em diferentes concentraçãoes da lectina ConBr (A) e LSL (B).

Microsporum canis M. gypseum

Trichophyton rubrum

T. mentagrophytes

T. tonsurans Epidermophyton floccosum

Concentração (µg/mL) da lectina ConBr A

D.O

530

nm

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 0.5 1 2 4 8 16 32 64 128 256

Concentração (µg/mL) da lectina LSL B

D.O

530

nm

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 0.5 1 2 4 8 16 32 64 128 256


175

Figura 3. (A) Estruturas microscópicas de Epidermophyton floccosum após incubação por sete dias a temperatura ambiente com a lectina DViol a 256µg/mL: macroaleurias claviformes, isoladas, sem ornamentações na parede celular, com ou sem septos (seta). (B) Filamentos micelianos septados e hialinos de E. floccosum na ausência da lectina DViol

B

A


176

Figura 4A. Aspectos macroscópicos do verso da cultura de Epidermophyton floccosum em meio de cultura ágar Sabouraud: coloração branca, superfície plana (A’ – URM 4798) e com sulcos radiais (B’ – URM 3345).

A’ B’

Figura 4B. Aspectos macroscópicos do reveso da cultura de Epidermophyton floccosum em meio de cultura ágar Sabouraud: pigmentação amarela (A’ – URM 3195), amarela-mostarda (B’ – URM 4798) e amarela-amarronzada (C’ – URM 3345).

A’ B’ C’


177

6. CONCLUSÕES

Os resultados obtidos permitem concluir que:

1. As amostras analisadas de Microsporum canis, M. gypseum e Trichophyton

mentagrophytes apresentaram aspectos macroscópicos de pleomorfismo;

2. As amostras analisadas de T. tonsurans, T. rubrum e Epidermophyton floccosum

apresentaram aspectos taxonômicos característicos das espécies;

3. O período de estocagem não impediu a expressão de aspectos taxonômicos para a

identificação das amostras de dermatófitos utilizadas;

4. O método de preservação utilizado pela Coleção de Culturas Micoteca-URM (UFPE)

mostrou-se eficiente;

5. As amostras de dermatófitos analisadas apresentaram perfil enzimático característico das

espécies avaliadas;

6. Os extratos alcoólicos das própolis verde e vermelha apresentaram atividade antifúngica

em relação aos dermatófitos avaliados;

7. As amostras de M. canis e T. rubrum foram mais susceptíveis a atividade antifúngica do

extrato alcoólico da própolis verde e da vermelha;

8. As amostras de T. tonsurans e T. mentagrophytes foram susceptíveis ao extrato alcoólico

da própolis verde em concentrações inibitórias mínimas semelhantes;

9. O potencial antifúngico do extrato alcoólico da própolis vermelha foi maior do que o da

verde;

10. As lectinas DViol, DRL, ConBr e LSL não apresentaram atividade antifúngica nas

concentrações testadas;

11. Todas as lectinas estimularam o crescimento das amostras de dermatófitos em todas as

concentrações utilizadas;

12. Apenas a lectina DViol estimulou a esporulação das amostras de E. floccosum.

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ANA BEATRIZ SOTERO SIQUEIRA - UFPEA Deus, pelo dom da vida e por ser a minha força em todos os momentos. Aos meus pais Elinaldo Siqueira da Silva e Ana Lúcia Sotero Siqueira, por