Upload
djordje
View
484
Download
4
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Amino kiseline i peptidi, struktura, funkcija, nomenklatura, podela, stereohemija aminokiselina
Citation preview
1
1
~ 2. AMINOKISELINE I PROTEINI ~
• πρωτεῖος gr.- prvi, najvažniji, koji zauzima prvo mesto• peptidi – polimeri aminokiselina, koje su međusobno povezane peptidnim
(amidnim) vezama
• redosled aminokiselina nosi u sebi genetsku informaciju koja se odražava kroz njihove specifične funkcije
NH2NH
NHNH
O
R O
O RR
NHNH
NHOH
O
O
R O
OR
RR
Naziv “protein” potiče od grčke reči proteios (prvi, najvažniji), što ukazuje na njihov fundamentalni značaj za strukturu i funkciju živih bića. Po strukturi, proteini su peptidi, tj. polimeri α-aminokiselina međusobno povezanih amidnim, tzv. peptidnim vezama. Redosled povezivanja AK (sekvenca) genetski je uslovljen i karakterističan za dati protein, i manifestuje se kroz specifičnu f-ju tog proteina.
2
2
2.1. AMINOKISELINE
• proteine izgrađuju α-aminokiseline• opšta struktura:
Karboksilna grupa
α-ugljenik
Bočni niz
α-amino-grupa NH3+
CH C
O
O-
R
NH2
CH C
OH
O
R
amonio-grupa
karboksilato-grupa
Svi organizmi koriste identičnu paletu od 20–22 osnovne (standardne, uobičajene) AK za izgradnju proteina. Uprkos ograničenom broju AK, postoji ogroman broj polipeptida i proteina sa širokim spektrom funkcija, koji nastaju njihovim različitim kombinovanjem.
Standardne aminokiseline predstavljaju derivate karboksilnih kiselina sa NH2vezanom za α-C (pozicija 2 po IUPAC-u). Za α-C su dodatno vezani atom vodonika i bočni niz R koji je karakterističan za svaku AK, i koji joj određuje fizička i hemijska svojstva i biološku funkciju.
U ćeliji, pri fiziološkim uslovima, i -NH2 i –COOH su jonizovane. Naime, sredina u ćeliji je približno neutralna; pošto je pKa (-NH3
+) grupe oko 9, ona će se nalaziti u protonovanoj formi (kao aminijum-jon), a pošto je pKa (-COOH) oko 3, ona će biti deprotonovana (kao karboksilatni jon).
3
3
2.1.1. Stereohemija aminokiselina
• α-ugljenikov atom je asimetričan (4 različite grupe): H-, R-, NH2-, -COOH
• aminokiseline se javljaju kao enantiomeri – molekuli koji se odnose kao predmet i njegov lik u ogledalu
• označavanje konfiguracije na α-ugljeniku – analogno D-/L-gliceraldehidu COOH
C
CH3
HNH2S
L-Alanin(S)-Alanin
COOH
C
CH3
H NH2R
D-Alanin(R)-Alanin
CHO
CH2OH
H OH
CHO
CH2OH
OH H
L-GliceraldehidD-Gliceraldehid
S• sistematsko označavanje stereoizomera: Cahn-Ingold-Prelog-ovo pravilo
Kod svih AK sem glicina na α-C nalaze se 4 različite grupe, odn. α-C je asimetrični (hiralni) centar. Samim tim, tih 19 AK mogu se javiti u dve enantiomerne forme. Po konvenciji, enantiomeri AK označavaju se kao D i L, po analogiji sa D- i L-gliceraldehidom. AK predstavljamo Fišerovom projekcijom, tako da je α-COOH gore a bočni niz dole, pri čemu su oba orijentisana od posmatrača (ispod ravni papira), dok su H i NH2 iznad ravni. Enantiomer kod koga je je NH2 grupa sa leve strane označava se sa L, i obrnuto.
Alternativno, konfiguracija hiralnog centra može se označiti sistematski, korišćenjem CIP pravila. Ovaj sistem se ređe koristi jer, dok sve hiralne proteinogene AK imaju identičnu L/D konfiguraciju (L), nemaju sve identičnu R/S konfiguraciju (cistein je R).
4
4
• Gly jedini nema hiralni centar
COOH
NH2
CH3
C2H5
H
H
COOH
NH2
CH3
C2H5
H
H
COOH
NH2
CH3
C2H5
H
H
COOH
NH2
CH3
C2H5
H
H
L-Izoleucin D-IzoleucinL-Aloizoleucin D-Aloizoleucin
COOH
NH2
OH
CH3
H
H
COOH
NH2
OH
CH3
H
H
COOH
NH2
OH
CH3
H
H
COOH
NH2
OH
CH3
H
H
L-Alotreonin D-AlotreoninL-Treonin D-Treonin
• neke od AK (Ile, Thr) imaju dodatne hiralne centre → 2n stereoizomera
NH2–CH2–COOH
enantiomeridiastereoizomeri
diastereoizomeri
Kao što je pomenuto, glicin nema nijedan hiralni centar jer na α-C ima dva identična supstituenta (H). S druge strane, dve AK – izoleucin i treonin – poseduju dodatni hiralni centar na β-C-atomu, te se javljaju u vidu 4 stereoizomera (2 enantiomerna para).
5
5
Hiralnost života• klasična hemijska sinteza:
ahiralni prekursor → racemska smešabiosinteza:
ahiralni prekursor → čist stereoizomer
COOH
C
R
HNH2
L-aminokiseline• hiralni biomolekuli dominantno se javljaju u jednoj konfiguraciji (homohiralnost)
• drugi enantiomer je često neaktivan ili toksičan
• proteinogene AK uvek imaju L-konfiguraciju
(D-izomeri neuobičajeni; nađeni u bakterijskom ćelijskom zidu, nekim antibioticima...)
• monosaharidi predominantno imaju D-konfiguraciju
CHO
CHOH
CHOH
CHOH
C
CH 2OH
H OH
D-heksoze
L-Asp–L-Phe–MeL-Asp–D-Phe–Me
Aspartamsladakgorak
N
NH
O
O
O
OTalidomidR - antiemetikS - teratogen
Kao što je već pomenuto, prvi molekuli AK nastali su abiotički, iz neorganskih prekursora. Prilikom klasične hemijske sinteze u ahiralnim uslovima, iz ahiralnih prekursora uvek će nastati racemska smeša (2 enantiomera u odnosu 1:1). Međutim, uočeno je da se u biološkim sistemima uvek jedan enantiomer javlja u velikom višku. Tako, sve proteinogene AK imaju L-konfiguraciju, dok većina monosaharida ima D-konfiguraciju. Ovo ne znači da se u prirodi drugi izomer uopšte ne javlja – D-aminokiseline su pronađene u ćelijskom zidu bakterija, u nekim antibioticima itd.
Uzrok homohiralnosti biomolekula još uvek je nepoznat. Jedna od mogućnosti je da su AK nastale u svemiru, na kometama, i polarizovano zračenje Sunca selektivno je uništavalo D-enantiomer. Pošto su samo L-izomeri AK bili prisutni u dovoljnim količinama, živi svet se razvio tako da samo njega iskorišćava. Formirani enzimi su, zahvaljujući svojoj hiralnosti, nastavili da proizvode samo jedan stereoizomer.
Budući da su enzimi, receptori i drugi sistemi u organizmu hiralni, oni tipično prihvataju samo jedan stereoizomer biomolekula, dok su ostali neaktivni, pokazuju drugačiju aktivnost, ili su čak toksični. Jedan primer je aspartam, veštački zaslađivač koji je zapravo metil-estar dipeptida; dok je izomer sa L-Phe sladak, izomer sa D-Phe ima gorak ukus. Drastičniji primer je talidomid, sedativ koji se koristio 1950-ih i 1960-ih, a koji se javlja u 2 enantiomerne forme. R-izomer pokazuje željeno dejstvo, zbog čega se talidomid prepisivao trudnicama protiv jutarnje mučnine. Međutim, uvek prisutni S-izomer pokazuje teratogeno dejstvo (izaziva poremećaje u razvoju ploda); kao posledica, preko 10 000 dece rođeno je sa deformitetima kao što je fokomelija.
6
6
2.1.2. Proteinogene aminokiseline• 22 proteinogene aminokiseline (20 genetski kodiranih)
COOH
NH2
GlicinGly (G)
COOH
NH2
AlaninAla (A)
COOH
NH2
COOH
NH2
COOH
NH2
ValinVal (V)
LeucinLeu (L)
IzoleucinIle (I)
COOH
NH2
OH
SerinSer (S)
TreoninThr (T)
COOH
NH2
OH
COOH
NH2
FenilalaninPhe (F)
TirozinTyr (Y)
COOH
NH2OH
COOHNH NH
NH2
NH2
ArgininArg (R)
COOH
O
NH2
NH2
AsparaginAsn (N)
Asparaginska k.Asp (D)
COOH
O NH2
OH
CisteinCys (C)
COOH
NH2
SH
Glutaminska k.Glu (E)
GlutaminGln (Q)
COOHO
NH2
NH2
COOHO
NH2
OHCOOH
NH2
NH
N
HistidinHis (H)
MetioninMet (M)
COOH
NH2
SCOOHN
H
ProlinPro (P)
TriptofanTrp (W)
COOH
NH2NH
LizinLys (K)
COOH
NH2
NH2
SelenocisteinSec (U)
COOH
NH2
SeH
PirolizinPyl (O)
NH2
NHN
O
COOH
Na slajdu je prikazano 20 uobičajenih proteinogenih AK, koje su direktno kodirane u DNK. Dodatno, date su i dve manje uobičajene proteinogene AK – selenocistein i pirolizin – koje su na neuobičajen način kodirane u DNK i RNK. Kao što se vidi, AK su strukturno veoma raznovrsne – neki od bočnih nizova su hidrofobni, neki hidrofilni ili čak naelektrisani.
AK je najlakše pamtiti prema svojstvima bočnog niza (2.1.2.2.).
7
7
“asparDic acid”D Asp Asparaginska k.
Y Tyr Tirozin (tYrosine)najjednostavnija na TT Thr Treonin
W Trp Triptofan V
U S O P F M K L I H Q E G C N
R A
uobičajena na S
sledeća uobičajena na Pfonetski
posle L ide K...najjednostavnija na L
posle D (za Asp) ide Enajjednostavnija na G
najjednostavnija na A
Val Valin
Sec SelenocisteinSer SerinPyl PirOlizinPro ProlinPhe FenilalaninMet MetioninLys LizinLeu LeucinIle IzoleucinHis HistidinGln GlutaminGlu Glutaminska k.Gly GlicinCys CisteinAsn AsparagiN
Arg ARgininAla Alanin
XJZB
Xaabilo koja aminokiselinaXleLeucin / izoleucinGlxGlutamin / glutaminska k.Asx Asparagin / asparaginska k.
Za svaku AK date su standardne troslovne i jednoslovne skraćenice, koje se koriste prilikom pisanja peptidnih sekvenci (IUPAC pravilo 3AA-21).
8
8
2.1.2.1. Esencijalne i neesencijalne AK
Neesencijalne• nisu neophodne u ishrani• mogu nastati transaminacijom iz α-ketokiselina...
Esencijalne• neophodne u ishrani• čovek ne poseduje enzimske sisteme potrebne za sintezu
Gly, AlaAsp, AsnGlu, GlnProSerCys*Tyr*
* nastaju iz esencijalnih aminokiselina Met odn. Phe
Leu, Ile, Val HisLysMetPhe, TrpThr
Sve proteinogene AK neophodne su za izgradnju proteina i normalno funkcionisanje organizma. Mnoge od njih ljudski organizam u stanju je da sintetiše iz drugih jedinjenja (kao što su α-ketokiseline), te ih nije neophodno uzimati hranom. S druge strane, za sintezu nekih AK – esencijalnih AK – čovek ne poseduje odgovarajuće enzime, te ih je neophodno uneti ishranom. U slučaju deficita esencijalnih AK, dolazi do poremećaja - nervoze, zamora, ošamućenosti, imunodeficijencije... Treba napomenuti da podela AK na esencijalne i neesencijalne nije stroga – pojedinci koji ne sintetišu određenu AK u dovoljnim količinama mogu zahtevati dodatni unos, neke od AK mogu se sintetisati, ali samo iz esencijalnih AK.
Proteini u kojima su prisutne esencijalne AK u optimalnom odnosu nazivaju se kompletnim. Ovde spada većina proteina životinjskog porekla (iz mesa, ribe, mleka, jaja), dok biljni proteini uglavnom imaju ograničen sadržaj neke od esencijalnih AK (npr. Met, Trp, Lys). Međutim, uravnoteženom ishranom lako se postiže unos dovoljnih količina svih esencijalnih AK, čak i kod vegetarijanaca.
9
9
• struktura bočnog niza određuje svojstva svake AK• polarnost/hidrofobnost• sposobnost građenja H-veza• jonizabilnost (naelektrisanje) • fleksibilnost, voluminoznost
• ima esencijalnu ulogu u određivanju strukture i f-ja proteina
• prema strukturi bočnog niza:
2.1.2.2. Podela aminokiselina
Asp, Asn, Glu, GlnKisele AK i amidi
Lys, Arg, HisBazne AK
Cys, MetAK sa sumporom
Ser, ThrHidroksi-AK
Phe, Tyr, TrpAromatične AK
ProCiklične AK
Gly, Ala, Val, Leu, IleAlifatične AK
Specifična svojstva svake AK određena su prirodom njenog bočnog niza, naročito njenom polarnošću i hidropatijom (hidrofoban/hidrofilan), jonizabilnošću (mogućnošću formiranja +/-šarže), sposobnošću građenja H-veza, kao i stereohemijskim faktorima (voluminoznost, fleksibilnost).
Prema strukturi bočnog niza (R), odn. funkcionalnim grupama, AK se dele na one sa alifatičnim bočnim nizom (Gly, Ala, Val, Leu, Ile), alicikličnim (Pro), aromatičnim (Phe, Tyr, Trp), alkoholnom hidroksilnom grupom (Ser, Thr), sumpornim grupama (Cys, Met), baznim grupama (Lys, Arg, His), aminodikarboksilne kiseline (Asp, Glu) i njihove amide (Asn, Gln).
10
10
Asp, GluPolarne negativno naelektrisane AK
Lys, Arg, HisPolarne pozitivno naelektrisane AK
Ser, Thr, Cys, Asn, GlnPolarne nenaelektrisane AK
Phe, Tyr, TrpAromatične AK
Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, MetNepolarne alifatične AK
• prema svojstvima (polarnosti i naelektrisanju) bočnog niza:
hidrofobne hidrofilne
Phe Met Ile Leu Val Cys Trp Ala Thr Gly Ser Pro Tyr His Gln Asn Glu Lys Asp ArgIle Phe Val Leu Met Trp Ala Gly Cys Tyr Pro Thr Ser His Glu Asn Gln Asp Lys Arg
Alternativno, prema svojstvima (polarnost, naelektrisanje) R, AK se dele na one sa nepolarnim bočnim nizom – alifatičnim (Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met) i aromatičnim (Phe, Tyr, Trp), sa polarnim nenaelektrisanim bočnim nizom (Ser, Thr, Cys, Asn i Gln) i polarnim naelektrisanim bočnim nizom – pozitivnim (Lys, Arg, His) i negativnim (Asp, Glu). Generalno, polarnije AK teže da se koncentrišu na površini proteina (u kontaktu sa vodom), a hidrofobnije – u unutrašnjosti.
Tačno definisanje hidropatije (hidrofilnosti/hidrofobnosti) AK je teško, i postoje različite skale (na slajdu prikazane dve). Kao što se vidi, redosled pojedinih AK varira između različitih skala. Za sada još uvek nije moguće sa sigurnošću predvideti da li će se dati AK ostatak u proteinu nalaziti na vodi izloženoj površini ili u hidrofobnoj unutrašnjosti.
11
11
• AK sa nepolarnim bočnim nizom
COOH
NH2
GlicinGly (G)
COOH
NH2
AlaninAla (A)
COOH
NH2
ValinVal (V)
COOH
NH2
LeucinLeu (L)
COOH
NH2
IzoleucinIle (I)
COOHNH
ProlinPro (P)
• ciklične AK
• alifatični nizovi su nepolarni i hidrofobni• hidrofobnost raste sa porastom broja C atoma u bočnom nizu• teže da se koncentrišu u unutrašnjosti proteina (Gly i Ala mogu i spolja)• izgradnja hidrofobnih džepova• Gly - fleksibilan
• jedina ciklična AK (sa sekundarnom amino-grupom – iminokiselina / pirolidinkarboksilna kiselina)• hidrofoban, ali se može naći i spolja• rigidna konformacija, narušava strukturu α-heliksa i β-nizova, često – na mestima petlji i zavoja
U AK sa nepolarnim alifatičnim bočnim nizom spadaju glicin i 4 AK kod kojih je R alkil-grupa (metil- kod Ala, izopropil- kod Val, izobutil- kod Leu i s-butil kod Ile). Alifatični bočni nizovi nepolarni su i hidrofobni; hidrofobnost raste sa porastom broja C-atoma u lancu. Ala, Val, Leu i Ile imaju značajnu ulogu u formiranju i održavanju 3D strukture proteina, zahvaljujući težnji da se bočni nizovi u vodenoj sredini grupišu unutar proteinske globule, daleko od vode. Dodatno, zajedno sa aromatičnim aminokiselinama, učestvuju u izgradnji hidrofobnih džepova u aktivnom centru nekih enzima, koji imaju funkciju vezivanja nepolarnih supstrata ili obezbeđuju “anhidrovanu” sredinu neophodnu za neke reakcije. Gly, zahvaljujući najmanjim dimenzijama molekula, lako rotira i uvodi fleksibilnost u polipeptidni lanac.
Prolin se razlikuje od ostalih 20 AK po tome što mu je bočni niz (C3) vezan za α-NH2, formirajući cikličnu strukturu sa sekundarnom amino-grupom (pirolidinski prsten). Za razliku od ostalih AK, kod kojih je moguća rotacija oko Cα-N veza, ciklična struktura prolina je rigidna, i ograničava strukturu (konformaciju) polipeptidnog lanca. Može dovesti do naglih promena smera lanca – petlji i zavoja. Pro je hidrofobna AK, mada manje nego Val, Leu i Ile, te se može naći i na površini proteina.
12
12
• aromatične AKCOOH
NH2
FenilalaninPhe (F)
TirozinTyr (Y)
COOH
NH2OH
TriptofanTrp (W)
COOH
NH2NH
• AK sa sumporom
CisteinCys (C)
COOH
NH2
SH
MetioninMet (M)
COOH
NH2
S
• Phe: fenil-grupa, Tyr: p-hidroksifenil-, Trp: 1H-indol-3-il-• hidrofobnost raste u nizu Tyr < Phe < Trp (neke skale: Tyr < Trp < Phe)• Tyr – slabo kisela fenolna OH, pKa = 10,10
• Cys jonizabilan (pKa = 8,14) i relativno polaran ali retko na površini, Met hidrofoban• Cys se može reverzibilno oksidovati do cistina (nastali disulfidni mostovi imaju strukturnu ulogu)• Cys može imati funkcionalnu ulogu
COOH
N H 2
S H
COOH
N H 2
S H
COOH
N H 2
S
COOH
N H 2
S
-2H+ - 2e
2H+ + 2e
Aromatične AK u bočnom nizu sadrže aromatične prstenove – fenil- (Phe), p-hidroksifenil- (Tyr) odn. indolil- (Trp). Aromatični prstenovi su po prirodi hidrofobni; prisustvo polarnih grupa (OH kod Tyr, N kod Trp) povećava mogućnost interakcije sa polarnim rastvaračem i hidrofilnost. Tirozin poseduje flabo kiselu fenolnu OH grupu, koja pri normalnim fiziološkim uslovima ostaje nedisosovana (pKa=10). OH grupa kod nekih proteina podleže fosforilaciji (vezivanju ostatka fosforne kiseline).
Dve AK – Cys i Met – u svom bočnom nizu poseduju atom S. U slučaju Met, S je u vidu tioetarske grupe, što ga čini hidrofobnom AK. Tiolna (sulfanil-, sulfhidrilna, merkapto-) grupa cisteina je relativno polarna, i može graditi slabe vodonične veze, a predstavlja i slabu kiselinu (pKa=8, u proteinima 5-10) koja može disosovati gradeći tiolatni jon. Uprkos polarnosti, Cys se retko nalazi na površini proteina. Naime, SH grupe lako se oksiduju pri fiziološkim uslovima, uz povezivanje dva Cys disulfidnim mostom (-SS-) i građenje cistina. Disulfidni mostovi (disulfidne veze) omogućavaju unakrsno povezivanje različitih polipeptidnih lanaca ili različitih delova istog lanca, čime se stabilizuje 3D struktura (naročito bitno kod ekstracelularnih proteina koji moraju da funkcionišu u agresivnoj sredini, npr. u digestivnom sistemu). Pored toga, kod intracelulanih proteina Cys može imati i funkcionalnu ulogu, odn. nalaziti se u aktivnom centru enzima (zahvaljujući nukleofilnosti -S– jona), a bitan je deo i mnogih peptida i proteina koji učestvuju u redoks reakcijama ili koriste metalne kofaktore (glutation, Fe-S klasteri...). Toksičnost teških metala velikim delom je posledica njihove težnje da se vezuju za -S– cisteina, čime narušavaju funkciju enzima.
13
13
• hidroksi-AK
• u bočnom nizu: alkoholna OH• polarne, grade vodonične veze• mogu biti fosforilovane ili glikozilovane → regulacija, markiranje...
COOH
NH2
OH
SerinSer (S)
TreoninThr (T)
COOH
NH2
OH
• bazne AK
COOHNH NH
NH2
NH2
ArgininArg (R)
COOH
NH2
NH
N
HistidinHis (H)
LizinLys (K)
COOH
NH2
NH2
• sadrže u bočnom nizu N sa slobodnim el. parom, koji može vezati H+
• pKa bočnog niza: Arg (guanidino-grupa) 12,10, Lys (ε-NH2) 10,67, His (imidazol) 6,04• pri fiziološkim uslovima pozitivno naelektrisane• imidazol – lako prima/otpušta H+; ligand kod metaloproteina
Dve AK – Ser i Thr – u svom bočnom nizu sadrže alkoholnu OH grupu koja je polarna i sposobna za građenje vodoničnih veza, te su ove AK hidrofilne. Hidroksilna grupe Ser i Thr manje su kisele od fenolne OH grupe Tyr, i ne disosuju pri fiziološkim uslovima. Uprkos tome, zahvaljujući nukleofilnosti, one mogu učestvovati u različitim reakcijama te se mogu naći u aktivnom centru enzima (npr. serinske proteaze i esteraze). OH grupa Ser i Thr se u ćeliji često modifikuje (fosforiluje, glikoziluje), što ima ulogu u regulaciji aktivnosti enzima (aktivacija/inhibicija), markiranju proteina itd.
Arg, Lys i His poseduju hidrofilne bočne nizove koji sadrže N sa slobodnim elektronskim parom, tj. bazni N. Pri fiziološkim uslovima, ovi bočni nizovi vezuju H+. U slučaju His, bočni niz sadrži imidazolov prsten, čiji je pKa blizak neutralnom pH; zahvaljujući tome, on lako prima i otpušta H+, te kod nekih enzima (uklj. serinske proteaze i esteraze) može učestvovati u kiselo-baznoj katalizi. Dodatno, on može kompleksirati različite metalne jone, te se javlja kao ligand kod metaloproteina (pored ostalog, i u Hb i Mb). Lys u položaju ε sadrži dodatnu NH2 grupu, i pri fiziološkim uslovima pozitivno je naelektrisan. Arginin je najbaznija od 20 AK, jer sadrži guanidino-grupu (guanidin je jaka organska baza), i pri fiziološkim uslovima potpuno je protonovan (tj. nosi pozitivnu šaržu).
14
14
• kisele AK i njihovi amidi
• dikarboksilne kiseline, pri fiziološkom pH otpuštaju H+ → negativno naelektrisanje• pKa bočnog niza 3,71 za Asp, 4,15 za Glu
COOH
O
NH2
NH2
AsparaginAsn (N)
Asparaginska k.Asp (D)
COOH
O NH2
OH
GlutaminGln (Q)
COOHO
NH2
NH2
Glutaminska kiselinaGlu (E)
COOHO
NH2
OH
Na kraju, dve AK – Asp i Glu – u bočnom nizu sadrže dodatne karboksilne grupe sa pKa≈4, koje su pri fiziološkim uslovima deprotonovane (tj. prisutan je aspartat/glutamat) i negativno naelektrisane. Karboksilatne grupe mogu se nalaziti u aktivnom centru nekih enzima (npr. serinske proteaze i esteraze), ili služiti za vezivanje metalnih jona. U organizmu su pored slobodnih kiselina prisutni i njihovi amidi – Asn i Gln, koji su nenaelektrisani ali i dalje veoma polarni i sposobni za građenje vodoničnih veza, te se često nalaze na površini proteina.
15
15
• neke od AK nakon biosinteze proteina mogu podleći modifikacijama (hidroksilacija, fosforilovanje, karboksilacija, acilovanje, alkilovanje...)
2.1.2.3. Posttranslaciona modifikacija AK
COOHNH
OH
4-HidroksiprolinHyp
• komponente kolagena• uloga u stabilizaciji heliksa• hidroksilacijom u prisustvu vitamina C
5-HidroksilizinHyl
COOH
NH2
NH2
OH
Cistin
COOH
NH2
SSHOOC
NH2
• nastaje oksidacijom cisteina• povezuje 2 lanca / 2 dela istog lanca, i stabilizuje 3D strukturu proteina
COOH
NH2
OP
O
O-
O-
O-Fosfoserin O-Fosfotirozin
COOH
NH2OP
O
O-
O-
γ-Karboksiglutaminska k.
COOHO
NH2
OH
O OH
• fosforilacija često ima ulogu u aktivaciji / deaktivaciji enzima
• u proteinima vezanim za koagulaciju krvi
Uz osnovnih 20/22 AK koje su kodirane u DNK, u strukturu proteina ulaze i brojne AK nastale modifikacijom nakon translacije (sinteze polipeptidnog niza). Ove reakcije uključuju hidroksilaciju, fosforilovanje, karboksilaciju, acilovanje (formil-, acetil-, ostaci masnih kiselina), alkilovanje (metil-, prenil-), građenje amida na C terminusu, glikozilaciju itd. Na slajdu su dati neki od primera modifikovanih AK.
Hyp i Hyl nastaju hidroksilacijom Pro i Lys u prisustvu askorbinske kiseline (vitamina C). Nalaze se u proteinu kolagenu, i imaju značajnu ulogu u stabilizaciji strukture. U nedostatku vitamina C formira se manje stabilan kolagen, i dolazi do slabljenja vezivnog tkiva, odn. skorbuta. Cistin, koji nastaje oksidativnim povezivanjem 2 Cys, već je pomenut. Ima funkciju u stabilizaciji 3D strukture proteina. O-fosfoserin i O-fosfotirozin nastaju fosforilacijom Ser i Tyr uz utrošak ATP, i imaju ulogu u regulaciji enzimske aktivnosti (neki enzimi se fosforilacijom aktiviraju/deaktiviraju). γ-karboksiglutamat nalazi se u nekoliko faktora koagulacije krvi. Vitamin K je neophodan za sintezu ove AK; u slučaju deficita, može doći do hemoragije.
16
16
2.1.3. Neproteinogene AK
H2N CNH2
NCH3
CH2 COO-
kreatin H3N CH2 CH2 SO3-
+
taurin
+
β-cijanoalanin
CH2 C≡NCOO-CHH3N
H3N CH COO-
CH2 O CO
CH N N-+
azaserin
O NC O
H3N
H
+
cikloserin
NO2
CH2OHC HC OHH
NHC
O
CHCl2
hloramfenikolL-
lekovi
H3N CH COO-CH2 CH2 SH
homocistein
NH3
CH2
CH2
CH2
CHH3N COO-+
+
ornitin
NH CO
NH2
CH2
CH2
CH2
CHH3N COO-+
citrulin
intermedijeri
CH2-OOC CH2
CH2
NH3+
γ-aminobuterna kiselinaGABA N
NCH2
CH2H3NH+
histamin
HO
HO
CH2
CH2H3N+
Dopamin
O
I
I
HO
I
I
CH2
CHH3N COO-+
tiroksin
neurotransmiteri i hormoni
Uz navedene AK koje izgrađuju proteine, postoji i niz biološki značajnih neproteinogenih AK i njihovih derivata. GABA i dopamin nastaju dekarboksilacijom Glu i Tyr, i imaju ulogu neurotransmitera u mozgu sisara. Histamin, nastao dekarboksilacijom histidina, jedan je od značajnih medijatora inflamacije (→ antihistaminici), i reguliše kontrakciju krvnih sudova i lučenje želudačne kiseline. Tiroksin, nastao jodovanjem (zato je organizmu neophodan jod) i dimerizacijom Tyr u štitnoj žlezdi, i adrenalin/epinefrin, nastao iz tirozina u nadbubrežnoj žlezdi, hormoni su koji regulišu metabolizam.
Kreatin, u vidu kreatin-fosfata, pomaže u skladištenju i transferu energije, naročito u mišićima. Ponekad se koristi kao dijetetski suplement pri bodibildingu, jer (po nekim autorima) poboljšava performanse anaerobnog treninga i stimuliše razvoj mišića. Taurin, amino-sulfonska kiselina koja nastaje iz cisteina, ulazi u sastav žučnih soli, emulgatora u digestivnom traktu. Dodaje se i u energetske napitke, jer poboljšava performanse mišića, mada novija istraživanja ukazuju da količina prisutna u napicima nije dovoljna za ispoljavanje bilo kakvog pozitivnog efekta. Citrulin i ornitin učestvuju u ciklusu uree, kojim organizam koristi za izbacivanje suvišnog azota.
Neki AK derivati našli su primenu u medicini. Hloramfenikol je u drugoj polovini XX veka korišćen kao antibiotik širokog spektra, mada je zbog neželjenih efekata danas uglavnom napušten. Cikloserin se koristi u tretmanu tuberkuloze, a azaserin je potencijalni antikancer lek.
17
17
2.1.4. Kiselobazna svojstva aminokiselina
• sve AK sadrže dve grupe koje mogu jonizovati: α-COOH i α-NH2
• za slabu kiselinu, konstanta disocijacije (kiselinska konstanta) iznosi:
odn, u formi Henderson-Hasselbach-ove jednačine:
• pri pH = pKa, [HA] = [A-]• pri pH < pKa, preovlađuje protonovani oblik• pri pH > pKa, preovlađuje deprotonovani oblik
R-COOH R-COO– + H+→←
R-NH3+ R-NH2 + H+→←
pKa ≈ 3,5–4,0 (u AK: 1,7-2,4)
pKa ≈ 9,0–10,8
+ -
+ -
-+
-+
-
[H ][A ][HA]
[H ][A ][HA]
[A ][H ]+[HA]
[A ][H ] = - +[HA]
[A ]+[HA]
a
a
a
a
a
K
log K log
log K log log
log log K log
pH pK log
=
=
=
−
=
+ -[H ][A ][HA]aK =
-[A ]+[HA]apH pK log=
Na fizička i hemijska svojstva i biološku aktivnost AK i proteina u celini značajno utiče naelektrisanje svih jonizabilnih funkcionalnih grupa. Sve AK sadrže 2 grupe koje mogu jonizovati: α-COOH i α-NH2. Za svaku slabu kiselinu, moguće je definisati kiselinsku konstantu odn. pKa vrednost (negativni logaritam Ka). Iz Henderson-Hazelbahove jednačine vidimo da je pri pH=pKa koncentracija protonovanog i deprotonovanog oblika kiseline jednaka. Kada je pH<pKa (tj. u kiselijoj sredini), dominira protonovani oblik, a pri pH>pKa, deprotonovani.
18
18
R-COOH R-COO– + H+→←
R-NH3+ R-NH2 + H+→←
pKa ≈ 3,5-4,0
pKa ≈ 9,0-10,8
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
RCOO–RCOOH
RNH3+ RNH2
• ni pri jednoj pH vrednosti ne postoji nejonski oblik AK
• oblik koji ima ukupno naelektrisanje 0 je cviterjon (zwitterion)
• pH pri kome je ukupno naelektrisanje 0 je izoelektrična tačka, pH(I)
COOH
NH3+
R COO-
NH3+
R COO-
NH2
R
Da vidimo kako se ponašaju α-COOH i α-NH2 grupe AK koja nema jonizabilne bočne grupe. pKa(α-COOH) je oko 2; pri pH<2, ona je protonovana i nenaelektrisana (-COOH), iznad pH 2 je deprotonovana (-COO─). pKa(α-NH3
+) grupe je oko 9, te je ona pri pH<9 protonovana i pozitivna (-NH3
+), iznad pH 9 je nenaelektrisana (-NH2). Kao što se može videti, u celom pH opsegu bar jedna grupa je jonizovana, tj. ni pri jednoj pH vrednosti ne postoji nejonski oblik AK. Oblik koji ima ukupno naelektrisanje 0 (mada unutar molekula i dalje postoje šarže) je cviterjon (zwitterion), a pH pri kome je ukupno naelektrisanje 0 naziva se izoelektrična tačka, i označava sa pI, IET ili (po IUPAC-u) pH(I).
19
19
Određivanje pH(I)A) računski: iz pKa grupa koje dobijaju naelektrisanje pri sniženju i povišenju pH u odn. na pH(I) (tj. u odnosu na oblik sa ukupnim naelektrisanjem 0)
COOH
NH3+
COO-
NH3+
COO-
NH2
+a a 3pK (α - COOH) + pK (α - NH ) 2,33+ 9,71pH(I) = = = 6,02
2 2
z = 0 z = -1z = +1
Poznavanje izoelektrične tačke aminokiselina, peptida i proteina veoma je važno za prečišćavanje i izolaciju proteina postupcima kao što je taloženje i elektroforeza, zbog čega je neophodno znati odrediti ovu vrednost. pH(I) se najčešće određuje računski ili eksperimentalno (volumetrijski, pH-metrijski).
Kod računskog određivanja, uzima se srednja vrednost pKa grupa koje prve jonizuju pri povišenju i sniženju pH u odnosu na pH(I), odn. u odnosu na oblik sa ukupnim naelektrisanjem 0. U slučaju AK koje nemaju jonizabilne grupe u bočnom nizu, situacija je jednostavna – koriste se pKa vrednosti za α-COOH i α-NH3
+.
20
20
pH(I)
pKa(α-COOH)
pKa(α-NH3+)
COOH
NH3+
COO-
NH3+
COO-
NH2
0,5 eq
B) iz titracione krive:
1 eq
1,5 eq
2 eq
Alternativno, pH(I) se može odrediti eksperimentalno, titracijom rastvorom baze. Ukoliko krećemo od potpuno protonovanog oblika (pri niskom pH), vidimo da pH pri dodatku NaOH postepeno raste. Dolazi do postepene deprotonacije kiselije grupe (α-COOH). Kada je utrošeno 0,5 ekvivalenata NaOH, koncentracija protonovanog i deprotonovanog oblika je jednaka, a pH odgovara pKa(α-COOH). Kada je utrošen 1 eq NaOH, COOH grupa je potpuno deprotonovana, i dalji dodatak NaOH titruje NH3
+ grupu. Opet, pri 1,5 eq možemo očitati pKa(α-NH3+), a pri 2 eq i NH3
+ je potpuno deprotonovana.
Sa krive vidimo da oblik sa z=0 imamo pri 1 eq; pH vrednost koja odgovara ovoj tački je pH(I).
21
21
• polifunkcionalne AK (sa baznim/kiselim bočnim nizom)
LizinpKa(ε-NH3
+)=10,80
COOH
NH3+
NH3+
NH3+
- H+
TirozinpKa(PhOH)=10,07
COOH
NH2OH
O-
- H+
Asparaginska k.pKa(β-COOH)=3,83
COOH
O NH2
OH
- H+
O
O-
CisteinpKa(RSH)=8,33
COOH
NH2
SH
- H+
S-
Glutaminska k.pKa(γ-COOH)=4,25
COOHO
NH2
OH
- H+
O
O-
ArgininpKa(GndH+)=13,20
COOHNH2
+NH
NH2
NH3+
NH NH
NH2
- H+
NH2 NH
NH2+
HistidinpKa(ImH+)=6,04
COOH
NH2
NH
NH
+
- H+
NH
N
NH+
NH
Prikazana situacija odnosi se na AK koje imaju samo α-COOH i α-NH2 grupu. Međutim, postoje i AK koje poseduju dodatne jonizabilne grupe – arginin, histidin i leucin sadrže bazne grupe koje se mogu protonovati i nositi pozitivnu šaržu, a cistein, tirozin, glutaminska kiselina i asparaginska kiselina sadrže kisele grupe koje podležu deprotonaciji.
22
22
• AK sa kiselim bočnim nizom: Asp
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
α-COO-α-COOH
RNH3+ RNH2
COOH
NH3+
HOOC
pKa(α-COOH) = 1,95pKa(β-COOH) = 3,71pKa(α-NH3
+) = 9,66
β-COO-β-COOH
COO-
NH3+
HOOC
COO-
NH3+
O-OC
COO-
NH2
O-OC
z = +1 z = 0 z = -1 z = -2
a apK (α - COOH) + pK (β - COOH) 1,95 + 3,71pH(I) = = = 2,832 2
• pH(I) << 7 ⇒ pri fiziološkim uslovima Asp je negativno naelektrisana
U ovom slučaju, za računanje izoelektrične tačke koriste se pKa vrednost grupe koja se prva protonuje kada se pH spusti ispod pH(I), i grupe koja se prva deprotonuje pri pH>pH(I). Kao što se vidi, kod AK sa dodatnim kiselim grupama, pH(I) je pomerena ka kiseloj sredini. Pri fiziološkim uslovima, ovakve AK biće negativno naelektrisane.
23
23
COOHNH3
+
HOOC
COO-
NH3+
HOOC
COO-
NH3+
O-OC
COO-
NH2
O-OC
z = +1 z = 0 z = -1 z = -2
Titraciona kriva analogna je krivoj za AK bez jonizabilnih bočnih nizova; razlika je u pojavi dodatnih prevoja.
24
24
• AK sa baznim bočnim nizom: His
COOH
NH3+
NHNH+
pKa(α-COOH) = 1,70pKa(α-NH3
+) = 9,09pKa(ImH+) = 6,04
COO-
NH3+
NHNH+
COO-
NH3+
NHN
COO-
NH2
NHN
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
α-COO-α-COOH
RImH+ RIm
z = +2 z = +1 z = 0 z = -1
+ +a a 3pK (ImH ) + pK (α - NH ) 6,04 + 9,09pH(I) = = = 7,56
2 2
• pH(I) blizu 7 ⇒ pri fiziološkim uslovima His je pribl. neutralan, i lako razmenjuje H+
RNH3+ RNH2
25
25
COOHNH3
+
NHNH+
COO-
NH3+
NHNH+
COO-
NH3+
NHN
COO-
NH2
NHN
z = +2 z = +1 z = 0 z = -1
pH(I)
pKa (ImH+)
pKa (α-NH3+)
pKa (α-COOH)
26
26
• AK sa baznim bočnim nizom: Lys
COOH
NH3+
NH3+
pKa(α-COOH) = 2,15pKa(α-NH3
+) = 9,16pKa(ε-NH3
+) = 10,67
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
α-COO-α-COOH
z = +2 z = +1 z = 0 z = -1
+ +a 3 a 3pK (α - NH ) + pK (ε - NH ) 9,16 +10,67pH(I) = = = 9,92
2 2
• pH(I) > 7 ⇒ pri fiziološkim uslovima Lys je pozitivno naelektrisan
RNH3+ RNH2
COO-
NH3+
NH3+
COO-
NH2
NH3+
COO-
NH2
NH2
RNH3+ RNH2
27
27
2.1.5. UV spektri aminokiselina
• sve AK bezbojne (ne apsorbuju u VIS području)• u UV području apsorbuju AK sa aromatičnim prstenom (Phe, Tyr, Trp)• apsorpciju pokazuje i cistin (omogućava detekciju disulfidnih mostova)
λmax (Phe) = 257, 206, 188 nm
λmax (Tyr) = 274, 222, 193 nm
λmax (Trp) = 280, 219 nm
λmax (Cys-Cys) = 250 nm
λmax (His) = 211 nm
Phe
Tyr
Trp
protein
Zbog odsustva proširene delokalizacije, nijedna AK ne apsorbuje svetlost u vidljivom području, odn. sve AK su bezbojne. Većina i u UV području pokazuje apsorpciju samo pri niskim λ. Izuzetak su aromatične AK, koje zahvaljujući prisustvu delokalizovanih π-elektrona apsorbuju svetlost u UV području (Tyr i Trp imaju maksimum na 280 nm, dok Phe pokazuje slabu apsorpciju na 260 nm). Zbog toga, većina proteina apsorbuje na 280 nm, što se može iskoristiti za grubo određivanje njihove koncentracije. Dodatno, apsorpciju pokazuje i cistin, što se može iskoristiti za detekciju disulfidnih mostova.
28
28
2.1.6. Metaboličke reakcije aminokiselina• transaminacija
R1 COOH
NH2
R1 COOH
O
R2 COOH
NH2
R2 COOH
O
aminokiselina1
ketokiselina2
ketokiselina1
aminokiselina2
• dekarboksilacija
R COOH
NH2
aminokiselina
R
NH2
amin
CO2
biogeni amini His → histamin (medijator inflamacije)Ser → etanolamin (komponenta lipida)Glu → GABA (neurotransmiter)5-OH-Trp → serotonin (neurotransmiter)L-DOPA → dopamin (neurotransmiter)Phe → fenetilamin (neurotransmiter)Lys → kadaverinOrn → putrescin...
• deaminacija
R COOH
NH2
-2H
aminokiselina
R COOH
NH
iminokiselina
NH3
OH2
R COOH
O
ketokiselina
Jedna od najvažnijih metaboličkih reakcija aminokiselina je transaminacija, odn. transfer amino-grupe sa jednog molekula na drugi. Pritom, α-aminokiselina reaguje sa α-keto-kiselinom (2-okso-kiselinom), i nastaje novi par aminokiselina-ketokiselina. Reakcije ovog tipa značajne su za biosintezu i degradaciju aminokiselina, i metabolizam azota uopšte. Konverzija aminokiselina u ketokiseline (koje su u metabolizmu značajni međuproizvodi) može se postići i oksidativnom deaminacijom – oksidacijom do iminokiselina, koje zatim podležu hidrolizi.
Mnoge α-aminokiseline podležu gubitku karboksilne grupe – dekarboksilaciji – pri čemu nastaju tzv. biogeni amini, koji često imaju značajnu ulogu u organizmu. Tako γ-aminobuterna kiselina (iz glutaminske kiseline), serotonin (iz 5-hidroksitriptofana), dopamin (iz L-3,4-dihidroksifenilalanina) i još neki amini deluju kao neurotransmiteri (učestvuju u prenošenju nervnog impulda), histamin (koji nastaje iz histidina) učestvuje u razvoju inflamatornih procesa (upala, alergija)... Kadaverin i putrescin i (koji nastaju iz lizina i neproteinogene aminokiseline ornitina) odgovorni su za karakteristični miris truleži.
*Napomena: pošto biohemijski procesi tipično predstavljaju čitav niz ili mrežu reakcija, uobičajeni način pisanja reakcija (A + B → C + D) je nepraktičan, i retko se koristi. Umesto toga, mnogo je češće u upotrebi sistem zakrivljenih strelica, kojima se prikazuju vrste koje ulaze u reakciju ili iz nje izlaze. Tipično se glavni učesnici (prekursor i produkt) povezuju pravom strelicom, a pomoćna jedinjenja krivim. Još neke konvencije pri pisanju biohemijskih reakcija:
•reakcije se često ostavljaju neizjednačenim po pitanju naelektrisanja; naelektrisanja se generalno ignorišu (npr. piše se ATP, veoma retko ATP4–)•mnoge čestice pišu se u najjednostavnijoj formi, umesto u realno prisutnoj: H+ umesto H3O+, ATP umesto Mg2+·ATP4– itd.•zbog glomaznih struktura i sistematskih imena jedinjenja, uobičajeno je korišćenje trivijalnih imena i skraćenica, npr. Glc → Glc6P → Fru6P → Fru1,6BP → G3P + DHAP.
29
29
2.1.7. Hemijske reakcije aminokiselina2.1.7.1. Reakcije karboksilne grupe
R COOH
NH2
aminokiselina NH3
OH2R CONH2
NH2
amid
R COOH
NH2
aminokiselina
OH2R CONH-R1
NH2
amidNH2R1
R COOH
NH2
aminokiselina
OH2R COOR1
NH2
estarOHR1
R1 COOH
NH2
aminokiselina1
R2 COOH
NH2+ R1 CO
NH2
R2 COOH
NH
aminokiselina2 amid (peptid)
Hemijske reakcije aminokiselina obuhvataju reakcije karboksilne grupe, amino-grupe i bočnih nizova.
Kao i sve karboksilne kiseline, i aminokiseline mogu da grade derivate sa amonijakom i aminima (amide) i alkoholima (estre). Biološki najznačajnija je reakcija građenja amida između –COOH grupe jedne aminokiseline i –NH2 grupe druge. Nastala amidna veza, tzv. peptidna veza, omogućava formiranje makromolekula – proteina.
30
30
2.1.7.2. Reakcije amino grupe
R COOH
NH2
aminokiselina
OH2 R COOH
N
R1Šifova baza
(imin)R1
O
aldehid
R COOH
NH2
aminokiselina
OH2 R COOH
NH
R1
ON-acil-aminokiselina
R1
O
Clacil-hlorid
• ninhidrinska reakcijaO
O
N C-
O
O
O
O
N
O
O-
ljubičasti proizvod
R COOH
NH2O
O
OH
OH
ninhidrin
RCHOCO2
O
O
OH
H
hidrindantin
NH3
O
O
OH
OH
Amino-grupa može da reaguje sa karbonilnom grupom, dajući jedinjenja tipa imina. Ova reakcija značajna je kod procesa koji uključuju PALP (koenzim izveden iz vitamina B6) i kod kovalentnog umrežavanja kolagena. S druge strane, toksični efekti aldehida i alkohola (koji se u organizmu prevode u aldehide) može se pripisati njihovoj reakciji sa amino-grupama biomolekula.
Ninhidrinska reakcija često se koristi za dokazivanje aminokiselina, peptida i proteina. Ninhidrin je oksidans, i dovodi do oksidativne deaminacije α-NH2, pri čemu sam prelazi u hidrindantin. Hidrindantin reaguje sa još jednim molekulom ninhidrina i nastalim NH3 gradeći intenzivno plavoljubičast proizvod. Sem za detekciju, reakcija se koristi i za kvantifikaciju proteina, merenjem apsorbancije na 570 nm i očitavanjem sa kalibracione krive. Ninhidrin se inače koristi i u forenzici, za detekciju otisaka prsta.
31
31
2.1.7.3. Specifične reakcije
• Cys – građenje disulfidnih mostova
COO-
NH3+
SH
S
O-OC
N+
S
O-
O
COO-
N+O
-
OS
-
COO-
N+O
-
O
S
O-OC
N+
S
O-
O
COO-
NH3+
• 5,5’-ditiobis(2-nitrobenzoeva kiselina), DTNB, Elmanov reagens
COO-
NH3+
SHO
-OC
NH3+
SCOO
-
NH3+
S2- 2H
2H
• Lys – građenje iminaCOO
-
NH3+
NH3+
COO-
NH3+
NROR
Pored reakcija na α-COOH i α-NH2, postoji i niz reakcija specifičnih za određene bočne nizove. Niz ovih reakcija biće obrađen na vežbama; ovde će samo biti prikazano nekoliko primera. Već je pomenuta oksidacija cisteina u cistin; reakcija je reverzibilna, i redukcija se prilikom određivanja strukture proteina koristi za razdvajanje lanaca i odmotavanje proteina. Reakcija sa Elmanovim reagensom - 5,5’-ditiobis(2-nitrobenzoevom kiselinom), pri kojoj nastaje žuto obojeni NTB2– proizvod, koristi se za spektrofotometrijsku kvantifikaciju tiolnih grupa.
32
32
2.1.8. Tehnike razdvajanja aminokiselina• jonoizmenjivačka hromatografija
katjonski izmenjivači
anjonski izmenjivači
S
O
O
O-
CH2N
COO-
COO-
O
COO-
jako kiselapolistirenska smola
slabo kisela karboksimetil-celuloza (CMC)
slabo kisela/helirajućapolistirenska smola
N+
CH3
CH3
CH3
jako baznapolistirenska smola
O NH+
slabo baznadiaminoetilceluloza
SO3- SO3
-
H+ H+SO3
- SO3-
Lys2+ Glu+SO3
- SO3-
Lys2+
Glu+
Na+
Na+
SO3- SO3
-
Lys2+
Na+Na+
Na+Na+
Na+
Da bi se ispitala svojstva nekog određenog proteina, peptida ili aminokiseline, neophodno je prethodno ga razdvojiti od svih ostalih komponenti biološkog materijala (hiljade drugih biomolekula). Prečišćavanje se može zasnivati na raznim fizičkim ili hemijskim svojstvima, uključujući veličinu molekula, naelektrisanje, rastvorljivost, selektivno vezivanje (afinitet)... Uobičajena metoda razdvajanja AK je jonoizmenjivačka hromatografija. Postoji niz različitih stacionarnih faza, koje karakteriše prisustvo kiselih ili baznih grupa koje se pri uslovima analize jonizuju, i sposobne su za vezivanje suprotno naelektrisanih jona aminokiselina.
U slučaju da se koristi katjonski izmenjivač (sa negativno naelektrisanim grupama), koristi se mobilna faza dovoljno niskog pH da AK budu u protonovanoj, pozitivno naelektrisanoj formi. AK nanesene na kolonu će se zbog toga vezivati za stacionarnu fazu (jonoizmenjivač). AK se zatim eluiraju postepenom (gradijentnom) promenom koncentracije soli (npr. NaCl) u mobilnoj fazi ili promenom pH. U slučaju eluiranja rastvorom soli (Na+ istiskuje R-NH3
+), prvo se odvajaju AK koje nose najmanje pozitivno naelektrisanje i najslabije su vezane – prvo će eluirati kisele AK, pa neutralne, pa bazne. U slučaju gradijenta pH (od niskih ka visokim vrednostima), situacija je slična – prvo eluiraju AK koje i u jako kiseloj sredini imaju malo pozitivno naelektrisanje, dok bazne AK eluiraju tek pri visokim vrednostima pH, potrebnim za njihovo deprotonovanje.
33
33pH
AspThr
Ser Glu
Pro
Gly Ala
U praksi, za analizu AK koriste se aminokiselinski analizatori, koji predstavljaju specijalno adaptirane HPLC sisteme. Uzorci se automatski nanose na visokoefikasnu katjon-izmenjivačku kolonu u protonovanoj formi (nisko pH). Komponente se eluiraju korišćenjem pufera kao mobilne faze, pri čemu se korišćenjem binarne pumpe obezbeđuje kontrolisana gradijentna promena (porast) pH. Pošto su AK bezbojne, u cilju detekcije efluentu sa kolone kontinualno se dodaje ninhidrin, koji sa njima daje intenzivnu plavoljubičastu boju koja se detektuje spektrofotometrijski. Rezultat analize je hromatogram, u kome je retenciono vreme (vreme eluiranja) karakteristično za svaku AK (i povezano sa njenim naelektrisanjem), a površina pika srazmerna njenoj koncentraciji.
AK se alternativno mogu određivati i klasičnom reverzno-faznom HPLC tehnikom, ali ih je u tom slučaju neophodno derivatizovati odn. hemijskim putem prevesti u formu koja se ne jonizuje (jonska jedinjenja tipično se ne zadržavaju na RP stacionarnoj fazi) i koja se može detektovati UV/VIS tehnikom. Primer reagensa za derivatizaciju AK je o-ftalaldehid.
34
34
2.2. PEPTIDI
• peptidi : oligo- i polimeri AK međusobno vezanih peptidnim vezama• α-COOH jedne AK povezuje se sa α-NH2 druge
CH C OHNH2
R1
O
CH C OHNH
R2
O
H
CH C OHNH
R2
O
CH CNH2
R1
O
H2O
ΔG0` ≈ 21 kJ/mol
peptidna veza
peptidna (amidna) grupa
Najvažnija biološka funkcija AK je da predstavljaju gradivne jedinice peptida i proteina. Peptidi su oligomeri i polimeri AK, međusobno povezanih amidnim, tzv. peptidnim vezama. Prilikom formiranja peptidne veze, dolazi do kondenzacije α-COOH grupe jedne AK i α-NH2 grupe sledeće, uz gubitak molekula vode. Reakcija je, u principu, termodinamički nepovoljna i ne odigrava se spontano. Za razliku od COOH i NH2 grupa slobodnih AK, peptidna grupa je pri fiziološkim uslovima nenaelektrisana.
35
35
NH2N
R1 H
HR2O
H
N
O R3H
H
N
O HR4
H
N
O R5H
H O
N
HR6
H O
OH
• pp lanac: pp kičma + varijabilni bočni niz
• konvencija pisanja: od N-terminusa ka C-terminusu
O
NHNH
O
NH2
SH
O
OH
NH2-Cys-Phe-Ala-COOHCys-Phe-AlaCFAcisteinil-fenilalanil-alanin
• nastavak -in (-an kod Trp) → -il• kod Cys: cisteinil• kiseline: α-/β-asparagil, α-/γ-glutamil• amidi: asparaginil, glutaminil
peptidi:• oligopeptidi (2-10 AK)• polipeptidi (10-50/100)• proteini (50/100-)
Povezivanjem većeg broja AK ostataka nastaje polipeptidni niz, koga čine polipeptidna kičma (sačinjena od N-atoma, α-C i karbonilnog C) za koju su vezani bočni nizovi (R). Po konvenciji, oligo- i polipeptidni nizovi uvek se pišu od N-terminusa (slobodne NH2 grupe) ka C-terminusu (slobodnoj COOH). Peptidi se imenuju navođenjem naziva svih AK ostataka koji ih izgrađuju. Imena AK ostataka dobijaju se zamenom nastavka –in/an nastavkom –il (glicin→glicil, lizin→lizil). U slučaju cisteina, IUPAC nalaže upotrebu naziva cisteinil, da bi se izbeglo mešanje sa ostatkom cisteinske kiseline (→cisteil). Kod dvobaznih AK i njihovih amida potrebno je obratitipažnju: ostatak Asp je asparagil (ili aspartil), a ostatak Asn – asparaginil. Kod dvobaznih kiselina je, u slučaju neklasičnog povezivanja, neophodno naglasiti i koja COOH učestvuje u građenju peptidne veze. Na primer, tripeptid glutation je γ-glutamil-cisteinil-glicin, jer se peptidna veza uspostavlja između γ-COOH grupe Glu i α-NH2 grupe Cys. Prilikom pisanja peptida i proteina, uobičajeno je korišćenje troslovnih ili jednoslovnih skraćenica.
Prema dužini lanca, peptidi se dele na oligopeptide, sa 2 do 10-20 AK ostataka (dalje se razlikuju di-, tri-, tetrapeptidi itd.), polipeptide (10-50 do 50-100 AK ostataka), i proteine (preko 50-100 AK ostataka). Ne postoji prirodna, strogo definisana granica između polipeptida i proteina. Razlika je prvenstveno u 3D strukturi – peptidi kraćeg lanca najčešće nemaju stabilnu 3D strukturu, dok se proteini uvijaju u tzv. nativnu konformaciju.
Proteini mogu da sadrže veoma veliki broj AK ostataka; najveći poznati protein, titin iz mišića, čini čak 27-33 000 AK. Čak i relativno mali proteini imaju veliku molekulsku masu (uz prosečnu Mr(AK) od 110 Da, Mr proteina od 100 aminokiselina iznosi 11 000 Da). Zbog toga se Mrproteina tipično izražava u kilodaltonima (kDa).
36
36
2.2.1. Struktura i stereohemija peptidne grupe
• C-N veza: parcijalni karakter dvostruke veze• otežana rotacija → cis- i trans- konformacija• sp2 → koplanarni atomi: Cα, C=O, N-H, Cα• smanjena baznost
N
O
H
N+
O-
H
N
O
Hδ+
δ–
Rendgenostrukturna analiza pokazala je da je C–N veza peptidne grupe kraća nego što bi se očekivalo za normalnu jednostruku C–N vezu, ali duža od C=N. Sledi da peptidna veza ima parcijalni karakter dvostruke veze, i može se predstaviti kao rezonantni hibrid dve strukture date na slajdu. Ovo ima više značajnih posledica, od kojih su najznačajnije vezane za stereohemiju peptidne grupe. Delokalizacija elektrona i parcijalni karakter dvostruke veze onemogućavaju slobodnu rotaciju oko C–N veze, dok sp2 hibridizacija C i N atoma ima za posledicu koplanarnost atoma peptidne veze (α-C, C=O, N-H i sledeći α-C leže u istoj ravni). Broj mogućih konformacija peptidne grupe je zbog sprečene rotacije sveden na dve – cis i trans. U cis-konformaciji, dva α-C (iz susednih AK ostataka) su sa iste strane peptidne veze, te se javljaju sterne smetnje između bočnih nizova vezanih za te C-atome. Zbog toga je trans-konformacija povoljnija, i skoro sve peptidne veze u proteinima imaju trans-konformaciju (kod prolina je, zbog specifičnosti bočnog niza, česta i cis). Planarnost peptidne grupe značajno ograničava broj mogućih konformacija celog polipeptidnog niza (v. 2.3.5.3.).
37
37
2.2.2. Fiziološki aktivni peptidi
• Sintetišu se:
1. translacijom mRNK na ribozomima (→ samo proteinogene AK + modifikovane)
2. proteolitičkim cepanjem dužih pp lanaca (→ samo proteinogene AK + modifikovane)
3. na specifičnim enzimima - sintetazama neribozomalnih peptida
(→ i neuobičajene AK, D-AK, neuobičajeno povezivanje...)
2.2.2.1. Peptidni hormoni• = peptidi koji se luče u krvotok i imaju regulatornu f-ju
• {sinteza na ribozomu}→ pre-prohormon —{ER}→ prohormon —{pakovanje u vezikule}→ —{hidroliza}→ hormon —{lučenje}→
• sadrže od 3 AK ostatka (tiroliberin) do 84 (parathormon)
└─SS─┘CYPQNCPRG
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN
|S2|
\S2\
└-S2-┘
S
Ala Trp γ,δ-(OH)2 Leu
Hyp Cys Thr Ala
U daljem tekstu, biće obrađeno nekoliko primera fiziološki aktivnih peptida. Ovi peptidi mogu u ćeliji nastati na nekoliko načina:1) Translacijom mRNK na ribozomima, identično biosintezi proteina. Ovakvi peptidi sadrže samo proteinogene aminokiseline (20 uobičajenih L-AK) i AK nastale njihovom posttranslacionom modifikacijom. Ovde spadaju peptidni hormoni i signalni molekuli, kao i neki antibiotici.2) Cepanjem dužih polipeptidnih lanaca odgovarajućim proteolitičkim enzimima. Budući da polipeptidi-prekursori takođe nastaju translacijom, i ova grupa sadrži samo proteinogene i modifikovane AK. Ovde spadaju otpadni proizvodi aktiviranja proenzima (zimogena), sazrevanja kolagena, prelaska fibrinogena u fibrin...3) Na specifičnim enzimima – sintetazama neribozomalnih peptida. Zahvaljujući tome, oni nisu ograničeni genetski kodiranim AK, nego mogu da sadrže i neuobičajene AK i D-AK, a između njih može postojati i neuobičajeno povezivanje (ciklične strukture, razgranate strukture, peptidna veza koja nije uspostavljena između αCOOH i αNH2). U ovu grupu spadaju glutation (→), kao i razni peptidi jednoćelijskih organizama, biljaka i gljiva (uklj. antibiotike i toksine).
Prva grupa bioaktivnih peptida o kojoj će biti reči su peptidni hormoni. Hormoni uopšte predstavljaju jedinjenja koja luče žlezde u jednom delu organizma, a koja izazivaju odgovor u udaljenim delovima. Peptidni hormoni sintetišu se translacijom (odn. kodirani su u DNK). U prvoj fazi, sintetiše se pre-prohormon, koji se u endoplazmatskom retikulumu modifikuje (uklanja se N-terminalna sekvenca, ponekad dolazi i do glikozilacije) dajući prohormon, koji se pakuje u vezikule. Prohormon se po potrebi (kao odgovor na spoljašnji signal) izlučuje iz ćelije egzocitozom. Prethodno dolazi do finalnog uklanjanja nepotrebnih delova sekvence (koji su imali funkciju stabilizacije pri umotavanju) endopeptidazama. Peptidni hormoni značajno se razlikuju po dužini niza – dok najkraći (tiroliberin) imaju samo 3 AK ostatka, paratiroidni hormon (parathormon) sadrži 84 AK ostatka i ima Mr od skoro 10 kDa.
38
38
Insulin• prvi otkriveni peptidni hormon• ekstrahovan i primenjen 1921-22. (Banting, Macleod) → Nobelova nagrada• prvi kristalisani peptid 1926. (Abel)• prvi sekvencionisan peptid 1955. (Sanger et al.) → Nobelova nagrada• prvi hemijski sintetisan peptid 1964. (Du et al., Katsoyoanis et al.)• tercijarna struktura 1969. (Hodgkin) → Nobelova nagrada
• nastaje u β-ćelijama Langerhansovih ostrvaca
• aktivacija: pre-proinsulin (114 AK) → otkidanje terminalnog peptida →proinsulin (84 AK) → insulin (51 AK)
NH2–
SH–COOH
SHSH SH
pre-proinsulin(114 AK)
proinsulin(84 AK)
NH2–
–COOHSS
SS
insulin(51 AK, 5808 Da)
NH2–
–COOHSS
SS
NH2–
–COOH
Prvi otkriveni peptidni hormon bio je insulin. Zbog njegovog značaja za medicinu, intenzivno je istraživan, što je rezultovalo i nizom Nobelovih nagrada.
Insulin sintetišu β-ćelije Langerhansovih ostrvaca pankreasa u vidu pre-proinsulina, polipeptida od 114 AK ostataka. U endoplazmatskom retikulumu dolazi do otkidanja N-terminalne sekvence, umotavanja i oksidacije Cys uz formiranje disulfidnih mostova, pri čemu se stvara proinsulin (84 AK). Isecanjem centralnog dela lanca nastaje zreli insulin, koji sadrži 51 AK i ima Mr od 5808 Da.
39
39
• 2 lanca: A (21 AK) i B (30 AK)
• 2 interlančana disulfidna mosta (A7-B7, A20-B19), 1 intralančani (A6-A11)
• signalizira dostupnost Glc →
• stimuliše ulazak glukoze iz krvi u ćelije (ugl. mišićne i masnog tkiva), sintezu glikogena, masnih kiselina i TAG,
• inhibira glukoneogenezu, proteolizu, lipolizu
B
A
Glc
mk
CO2glikogen
TAGmk
insulin
glukagonGlc
glikogen
pyr
*
Molekul zrelog insulina sastoji se od dva polipeptidna lanca, A (21 AK) i B (30 AK). Lanci su povezani preko dva interlančana disulfidna mosta. Dodatno, u molekulu postoji jedan intralančani disulfidni most, koji povezuje delove lanca A.
U organizmu, insulin signalizira dostupnost glukoze (npr. nakon unetog obroka). On stimuliše ulazak glukoze iz krvi u ćelije, ugl. mišćnog tkiva (gde dalje stimuliše njeno deponovanje u vidu glikogena) i masnog tkiva (gde stimuliše sintezu i deponovanje masnih kiselina i triacilglicerola). Dodatno, on inhibira procese mobilizacije energetskih zaliha – glukoneogenezu, proteolizu i lipolizu.
U slučaju poremećaja u sintezi insulina, dolazi do poremećaja u metabolizmu glukoze i uopšte energetskom metabolizmu – dijabetesa.
40
40
• jedan lanac (29 AK, 3485 Da), bez disulfidnih mostova
• nastaje u α Langerhansovim ćelijama pankreasaiz proglukagona (9 kDa)
• antagonist insulinu – signalizira hipoglikemiju →stimuliše konverziju glikogena iz jetre u glukozu (glikogenolizu), lipolizu, glukoneogenezu
Glukagon
*
Glc
mk
CO2glikogen
TAGmk
insulin
glukagonGlc
glikogen
pyr
Drugi peptidni hormon koji učestvuje u regulaciji nivoa glukoze u krvi i energetskog metabolizma je glukagon. Ovaj hormon sintetišu α-ćelije Langerhansovih ostrvaca pankreasa, takođe u vidu prohormona – proglukagona. Za razliku od insulina, u pitanju je jednolančani polipeptid bez disulfidnih mostova.
Antagonist je insulinu, i signalizira hipoglikemiju, odn. smanjen nivo glukoze u krvi. Stimuliše mobilizaciju energetskih rezervi – glikogenolizu i lipolizu – kao i sintezu glukoze iz nešećernih prekursora (glukoneogenezu).
41
41
Hormoni zadnjeg režnja hipofize
• hipofiza – endokrina žlezda u osnovi mozga, ispod hipotalamusa
• prednji režanj: hormoni koji stimulišu lučenje drugih hormona
• zadnji režanj: oksitocin, vazopresin
Oksitocin• nonapeptid• 1007 Da• Cys povezani S-S mostom• uloga u reprodukciji – stimuliše:
• vezivanje za partnera...• seksualno uzbuđenje• kontrakcije pri porođaju • laktaciju • majčinski nagon
• antagonist: progesteron
CYIQNCPLG-NH2└─SS─┘
U grupu peptidnih hormona spadaju i hormoni koje luči hipofiza. Hipofiza je endokrina žlezda koja se nalazi u osnovi mozga, ispod hipotalamusa (koji je kontroliše), i zadužena je za lučenje niza hormona koji regulišu homeostazu. Sastoji se od prednjeg režnja (adenohipofize), koja luči hormone koji stimulišu lučenje drugih hormona, i zadnjeg režnja (neurohipofize) koja luči oksitocin i vazopresin (o kojima će dalje biti reči).
Oksitocin je po strukturi nonapeptid mase oko 1 kDa, sa jednim intralančanim disulfidnim mostom. Ima niz funkcija, od kojih su najvažnije vezane za reprodukciju. Odgovoran je za uspostavljanje čvrste veze između partnera (zbog čega se naziva “hormonom ljubavi”), seksualno uzbuđenje, majčinski nagon, kontrakcije pri porođaju (zbog čega se koristi za stimulaciju trudova) i laktaciju. Povezuje se i sa uspostavljanjem društvenih veza, razvijanjem poverenja, empatijom i darežljivošću, a nesposobnost lučenja ovog hormona sa sociopatijom, psihopatijom, narcisizmom...
42
42
Vazopresin, antidiuretski hormon (ADH)• nonapeptid
• Cys povezani S-S mostom
• reguliše resorpciju vode iz bubrežnih tubula → retencija vode → hipertenzija
• vazokonstriktor → hipertenzija → primena kod hipovolemijskog šoka
• povezan sa procesom pamćenja?
• održava vezu između partnera, stimuliše agresivnost mužjaka prema drugim mužjacima
• strukturno sličan oksitocinu:
└─SS─┘CYFQNCPRG
C–Y–I–Q–N–C–P–L–G–NH2└──S──S──┘
C–Y–F–Q–N–C–P–R–G–NH2└──S──S──┘
Drugi hormon zadnjeg režnja hipofize je vazopresin ili antidiuretski hormon. To je takođe nonapeptid sa intralančanim disulfidnim mostom, koji se od oksitocina razlikuje samo u dva AK ostatka. Ovaj hormon prvenstveno reguliše retenciju vode u organizmu, putem regulacije resopcije vode u bubrezima. Pošto deluje i kao vazokonstriktor, u visokim koncentracijama povećava krvni pritisak. Dok ovaj efekat kod zdravih osoba nije izražen, u medicini se koristi kod hipovolemijskog šoka (npr. usled gastrointestinalnog krvarenja, porođaja...). Pored ovoga, vazopresin ima dejstvo i na centralni nervni sistem. Implicirana je uloga u procesu pamćenja (kontroverzno), a utiče i na društveno ponašanje – povezuje se sa održavanjem veze između partnera i agresivnošću mužjaka prema drugim mužjacima.
43
43
• mali peptidni molekuli koji deluju kao neurotransmiteri • poznato oko 100
• enkefalini: met-enkefalin (YGGPM), leu-enkefalin (YGGPL)• endorfini (endogeni morfini)
2.2.2.2. Neuropeptidi
2.2.2.3. Peptidni antibiotici
1) peptidi: bacitracin, tirocidin, gramicidin...
Tirocidin AD-Phe–Pro–Phe–D-Phe–Asn–Gln–Tyr–Val–Orn–Leu
Gramicidin S1D-Phe–Pro–Val–Orn–Leu–D-Phe–Pro–Val–Orn–Leu
Neuropeptidi su mali peptidni molekuli koji deluju kao neurotransmiteri, odn. omogućavaju komunikaciju između neurona (prenos signala sa presinaptičkog na postsinaptički neuron). Za razliku od peptidnih hormona, dejstvo je lokalizovano samo na okolne ćelije (postsinaptičke neurone). Za razliku od niskomolekulskih neurotransmitera (acetilholin, noradrenalin...), dejstvo je duže i raznovrsnije. Poznato je oko 100 različitih neuropeptida kod sisara.
Prvi primer, enkefalin, predstavlja pentapeptid koji se javlja u dve forme, kao met-enkefalin (sekvence YGGPM) i leu-enkefalin (YGGPL). Ima ulogu u regulaciji nocicepcije (percepcije bola) – ima opioidno delovanje (smanjuje bol, popravlja raspoloženje).
Endorfine (endogeni morfini) proizvode hipofiza i hipotalamus. Luče se prilikom stresa – fizičke aktivnosti, uzbuđenja, bola, ljubavi... Kao i enkefalini, izazivaju analgeziju i dobro raspoloženje.
Peptidni antibiotici su peptidi prirodnog porekla koji imaju funkciju zaštite organizma od mikroorganizama (bakterija, gljivica), a koji se često koriste u humanoj medicini. U pitanju su neribozomalni peptidi, koji nastaju na specijalizovanoj neribozomalnoj peptid sintetazi (NRPS) kao templatu. Zbog toga, u njihovim strukturama uobičajene su nestandardne aminokiseline, D-aminokiseline, i nestandardni načini povezivanja (naročito – formiranje cikličnih struktura).
Prvu grupu čine antibiotici čisto peptidne strukture, linearne ili ciklične. Primeri su bacitracin (izolovan iz Bacillus subtilis), tirocidin (Bacillus brevis) i gramicidin (iz Bacillus brevis). Deluju tako što narušavaju lipidni dvosloj ćelijske membrane i/ili ćelijski zid bakterija.
Tirocidin A je ciklični dekapeptid. Predstavlja prvi komercijalno dostupan antibiotik. Zbog toksičnosti (utiče na crvena krvna zrnca i reproduktivni sistem), te je nepogodan za unutrašnju upotrebu. Gramicidini su linearni pentadekapeptidi (A, B, C) ili ciklični dekapeptidi (gramicidin S). Ugrađuju se u ćelijsku membranu bakterija gradeći kanal kroz koga mogu da prođu joni. Zbog toksičnosti (izazivaju hemolizu) koriste se samo eksterno.
44
44
2) glikopeptidni antibiotici: vankomicin, teikoplanin, bleomicin
3) β-laktamski antibiotici: penicilini (iz Penicillium sp. i Aspergillus sp.) icefalosporini
• sadrže β-laktamski prsten
Penicilini: benzilpenicilini, fenoksimetilpenicilini, ampicilin
Cefalosporini: cefalosporin C, cefaleksin, cefritaksin
tiazolidinskiprsten
β-laktamski prsten
S
N
NHR
O
OCOOH
β-laktamski prstendihidrotiazinski prsten
N
NHR
O
O
S
R1
COOH
Glikopeptidni antibiotici su ciklični peptidi za koje su vezani ugljenohidratni molekuli. Inhibiraju izgradnju ćelijskog zida bakterija, čineći ih neotpornim na uslove okoline. Zbog toksičnost, koriste se samo u posebnim situacijama – kod kritično bolesnih pacijenata, pacijenata preosetljivih na β-laktamske antibiotike, i u slučaju penicilin-rezistentnih infekcija. Predstavnici su vankomicin (1449 Da, iz Streptomyces orientalis, inhibira izgradnju ćelijskog zida Gram-pozitivnih bakterija, nefrotoksičan), teikoplanin i bleomicin.
β-laktamske antibiotike karakteriše prisustvo β-laktamskog (četvoročlanog) prstena. U najpoznatije predstavnike spadaju penicilini i cefalosporini.
45
45
• rezistencija: β-laktamaza koja razara antibiotike
• klavulanska kiselina – inhibitor β-laktamaze
• imipenem – β-laktamski antibiotik veoma širokog dejstva
O
NO
COOH
HOH
O
NO
COOH
HOH
S
NH
NH
klavulanskakiselina
imipenem
Gram-pozitivna
Gram-negativna
• inhibiraju izgradnju ćelijskog zida
Deluju tako što inhibiraju izgradnju (tačnije, umrežavanje) peptidoglikanskog sloja ćelijskog zida bakterija (Gram-pozitivnih, a noviji deluju i na Gram-negativne). Kao posledica toga, bakterija postaje manje otporna na uslove spoljašnje sredine; dodatno, normalna deoba je sprečena a pri pokušaju deobe bakterija potpuno gubi ćelijski zid.
Neke bakterije razvile su rezistenciju putem sinteze enzima β-laktamaze, koji raskida β-laktamski prsten antibiotika i time ih inaktivira. U ovakvim slučajevima, uz antibiotik se daju inhibitori β-laktamaze, kao što je klavulanska kiselina.
Jedan od pripadnika grupe β-laktamskih antibiotika je i imipenem. Imipenem predstavlja antibiotik veoma širokog dejstva, efikasan i protiv Gram-pozitivnih i protiv Gram-negativnih bakterija. Samo mali broj bakterija pokazuje rezistenciju prema ovom jedinjenju.
46
46
4) makrolidni antibiotici: • makrociklični (≥7 atoma) laktoni
• inhibiraju sintezu proteina kod bakterija vezivanjem za ribozome ili DNK
• Aktinomicin D – iz Streptomyces, sadrži fenoksazon-dikarboksilnu kiselinu amidno vezanu za pentapeptid, deluje i kao citostatik (inhibira transkripciju)
N
O O
NH2
ThrOOThr
D Val
Pro
O
Sar
Me Val Me Val
O
SarPro
D Val
47
47
• životinjski otrovi (pčela, škorpija, paukova, zmija) su tipično peptidi
• peptidi otrova kobre (LD50 = 750 μg/kg) – kardiotoksini (oštećuju srčani mišić), neurotoksini (izazivaju paralizu), hemotoksini
2.2.2.4. Peptidni toksini
• bakterijski toksini: botulinum toksin (Botox) iz Clostridium botulinum -neurotoksin, LD50 ≈ 1 ng/kg
α-amanitin (Amanita phalloides)hepato- i nefrotoksičan
γ,δ-(OH)2 Ile 6-OH-Trp Gly
Asn
Hyp
Cys
S=O
Gly
Ile
faloidin (Amanita phalloides)
S
Ala Trp γ,δ-(OH)2 Leu
Hyp Cys Thr Ala
• amanita toksini (iz Amanita pečurki) – amatoksini i falotoksini
48
48
2.2.2.5. Glutation
• tripeptid: γ-glutamil-cisteinil-glicin
O
NH
SH
NH COOHHOOC
O
NH2
peptidna veza između α-NH2 Cys i –COOH iz bočnog niza Glu!
• redukovani oblik – GSH,
• oksidovani oblik – GSSG
• glavni antioksidans u ćelijama, štiti ih od toksičnih oblika kiseonika
• visoka C u eritrocitima – redukuje metHb u Hb
• GSH + GSH reduktaza učestvuju u formiranju disulfidnih veza kod peptida i proteina
• GSH – nosač u transportu AK (donor γ-glutamil grupe)
• učestvuje u brojnim detoksifikacijama, metaboličkim putevima...
Redoks ciklus GSH
2 GSH GSSG
H2O2 2 H2O
NADPH + H+NADP+
GSH reduktaza
GSH peroksidaza