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第 3 章 氨基酸. (Amino Acid, AA, Aa, aa). —— 蛋白质的构件分子. 一、氨基酸. Protein Architecture. (一) 蛋白质水解. 蛋白质 —— 月示 —— 胨 —— 多肽 —— 肽 —— AA 1*10 4 5*10 3 2*10 3 1000 200 100 -500. - PowerPoint PPT Presentation
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(Amino Acid, AA, Aa, aa)
第 3 章 氨基酸
——蛋白质的构件分子Protein Architecture
一、氨基酸
(一) 蛋白质水解
蛋白质和多肽的肽键可被催化水解酸 /碱能将蛋白完全水解 酶水解一般是部分水解
得到各种 AA 的混合物
得到多肽片段和 AA 的混合物
氨基酸是蛋白质的基本结构单元
蛋白质——月示——胨——多肽——肽—— AA 1*104 5*103 2*103 1000 200 100 -500
(二) 氨基酸的结构(二) 氨基酸的结构
地球上天然形成的地球上天然形成的 AA300AA300 种以上。种以上。
构成蛋白质的构成蛋白质的 AAAA 只有只有 2020 余种余种,,且且都是都是 α-α- 氨基酸氨基酸。。
什么是氨基酸?
• ----C-C-C-C-COOH γ β α• ----C-C-C-C(NH2)-COOH α- 氨基酸 • ----C-C-C(NH2)-C-COOH β- 氨基酸
•----C-C(NH2)-C-C-COOH γ- 氨基酸
什么是 α- 氨基酸?
• 大多数 AA 在中性 pH 时呈兼性离子状态 :
•除甘氨酸外, 19 种 AA 都具有旋光性。
•除胱氨酸和酪氨酸外,其余AA 都能溶于水。
COO- NH3+
二、氨基酸的分类
(一)常见的蛋白质氨基酸
按R基的化学结构分类:1、脂肪族 aa
(1)中性 aa
( 2)含羟基或硫 aa
(3)酸性 aa及其酰胺
(4)碱性 aa
2、芳香族 aa
3、杂环 aa
按R基的极性性质分类:1、非极性R基 aa
2、不带电荷的极性R基 aa
3 、带正电荷的R基 aa
4 、带负电荷的R基 aa
(二)不常见的蛋白质氨基酸 由常见 aa 经修饰而来。
(三)非蛋白质氨基酸
•150 多种•多是蛋白质中 L型 α-AA 衍生物•有一些是β-, γ-, δ-AA•有些是 D-型 AA
鸟氨酸
瓜氨酸
三、氨基酸的酸碱性质
(一)兼性离子
H3N—CH—COOH
R+
( pH < pI )
H3N—CH—COO-
R+
( pH=pI )H2N—CH—COO-
R
( pH > pI )
(二)氨基酸的解离
(三)氨基酸的等电点
•当溶液为某一 pH 值时, AA 主要以兼性离子的形式存在,分子中所含的正负电荷数目相等,净电荷为 0 。这一 pH 值即为 AA的等电点( pI)。
•在 pI 时, AA 在电场中既不向正极也不向负极移动,即处于两性离子状态。
Ka1*Ka2=……
侧链不含离解基团的中性 AApI = (pK’1 + pK’2 )/2
甘氨酸滴定曲线
•对于侧链含有可解离基团的 AA• pI 取决于两性离子两边 pK’值的算术平均值•酸性 AA: pI = (pK’1 + pK’R-COO
- )/2
•碱性 AA: pI = (pK’2 + pK’R-NH2 )/2
四、氨基酸的化学反应
(一)α-氨基参加的反应
1.与亚硝酸反应
2.与酰化试剂反应
3. 烃基化反应
4.形成 Schiff’s碱反应5.脱氨基反应
NH2 OH
R CH COOH + HNO2 R CH COOH+H2O+N2
Van Slyke 法测氨基氮(体积)的基础。N2 中的 1/2 为氨基氮。
氨基酸定量和蛋白质水解程度的测定。
NO2
FO2N + H2N—CH—COOHR
NO2
O2N HN—CH—COOHR
+ HF
弱碱性
DNP- 氨基酸 (黄色)
DNFB
Sanger 法测定 N末端氨基酸基础
—N=C=S + N—CH—COOH
H
H R
PITC
—N—C—N—CH—COOHH H R
S PTC- 氨基酸
—N—C
H R
S
NC
CO PTH- 氨基酸
pH8.3
无水 HF
苯异硫氰酸酯 PITC
苯氨基硫甲酰衍生物
苯乙内硫脲衍生物
Edman 降解法基础
R’ COOH R’ COOR’ COOH R’ COO C=O + HC=O + H22N CH C=N CH N CH C=N CH H R H RH R H R
醛 氨基酸 Schiff’s 碱
-H20
+H20
在生物体内经 AA 氧化酶催化即脱去 α- 氨基而转变为酮酸。
(二) α- 羧基参加的反应
1. 成盐或成酯反应
2.成酰氯反应
3.脱羧基反应
4.叠氮反应
( 2 )成酯
NH2 干燥, HCl R CH COOH + C2H5OH 回流
R CH COOC2H5 + H2O
NH3·Cl保护羧基
( 1 )与 NaOH 等形成盐
HN- 保护基 R— CH-COOH + PCl5
HN- 保护基 R — CH-COOCl + POCl3 + HCl
保护氨基 活化羧基
NH2 脱羧酶 R—CH-COOH
R-CH2-NH2 +CO2
YNH O NH2NH2 R—CH—C—OCH3
YNH O HNO2 R—CH—C—NHNH2
YNH O R—CH—C—N -—N+ N + 2H2O
酰化氨基酸甲酯 肼
酰化氨基酰肼
酰化氨基酰叠氮
肽的人工合成
(三)α-羧基和α-氨基都参加的反应
1 、 与茚三酮反应
2、 成肽反应
弱酸 加热
(四) 侧链 R基参加的反应
1 、 Tyr
2 、碱性 AA2 、碱性 AA
3 、带硫 AA
O
NH2
OH
OH
I I
O
NH2
OH
OH
I
O
NH2
OH
OH
O2NNO2
O
NH2
OH
OH
NO2
Tyr 酚基在 3 和 5 位上易发生亲电取代反应,如碘化和硝化 黄色反应
N N
N N
O
NH2
OH
OH
HO 3S
HO 3S
PaulyPauly 反应
N N
NHN
N N
CH 2 CH CO O H
NH2HO 3S
HO 3S
His 侧链咪唑基与重氮苯磺酸生成棕红色化合物
PaulyPauly 反应
Arg 侧链胍基与环己二酮生成缩合物
Trp 侧链吲哚基能被N-溴代琥珀酰亚胺氧化——分光光度法测定 Trp 含量
Met 侧链上甲硫基:强亲核基团与烃化试剂成锍盐
保护巯基
与二硫硝基苯甲酸发生硫醇 - 二硫化物交换
pH8.0时 412nm最大光吸收— 分光光度法测定 -SH
2R-SH + 1/2O 2 R-S-S-R + H 2O
Cys 的巯基不稳定,易被氧化成二硫键巯基在有痕量的金属离子如:Cu2+ , Fe2+ , Co2+ 或 Mn2+ 时,易被氧化
Cys 中的二硫键可被氧化剂(过甲酸)以及还原剂(巯基化合物)打开。
H2N-CH-COOH
CH2
S
S
CH2
H2N-CH-COOH
6HCO O O H
H2N-CH-COOH
CH2
SO3H
H2N-CH-COOH
CH2
SH
2R-SH
+
+
6HCO O H
R-S-S-R
磺基丙氨酸
CH2SH
HOCH
HCOH
CH2SH
+ R-S-S-ROH
OH
S
S+ 2R-SH
五、 AA的光学活性和光谱性质
(一) AA 的光学活性和立体化学
(二)氨基酸的光谱性质
可见光区:无吸收远紫外和红外区:都吸收
近紫外区( 200—400nm): Tyr/Trp/Phe 原因: -C=C-C=C-C=C-C=C-
1 、紫外吸收光谱
Trp 280nmTyr 275nmPhe 257nm
蛋白质含量测定
280nm
2、核磁共振波谱
六、氨基酸混合物的分析分离
——利用 AA 成分分配系数的差异
(一)分配层析法的一般原理
{层析系统固定相 {流动相
附着在固相上的液体
固体
按两相所处状态分:
流动相
液体 气体
固定相
液体 液液层析 气液层析
固体 液固层析 气固层析
柱 固定相 装于柱内纸 固定相是液体, 吸附在滤纸上,将样品
点在纸上,用流动相展开薄层 将有适当粘度的固定相 涂在薄板上薄膜 与纸层析相似,
纸用其它高分子有机吸附剂代替
按操作形式分:
吸附 固体 吸附能力不同分配 液体 分配系数不同
离子交换 离子交换剂 亲和性不同凝胶 多孔凝胶, 通过速度不同
亲和 固定相只能与一种 组分结合,——分开其它无亲和力的组分
按层析原理分: 固定相 各组分对固定相
(二)分配柱层析
填充物为亲水性的不溶物质如纤维素、 淀粉、硅胶等,收集的组分用茚三酮 显色定量。
(三)纸层析(四)薄层层析
(五)离子交换层析
(六)气液层析
固定相 支持剂颗粒细,表面积大;采取高压,洗脱速度快。
(七)高效液相层析