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I nuovi sistemi automatizzati per la lettura degli ANA in
immunofluorescenza indiretta
Elio Tonutti
Laboratorio di Immunopatologia e AllergologiaAzienda Ospedaliero-Universitaria di Udine
Tolmezzo 12.12.2012
Am J Clin Pathol 2002Am J Clin Pathol 2002
Ann Rheum Dis 2010
4
+ - STOP
Pos > 1:160
-SLE ?
Anti-nucleosome
PM or SS ?
ANA - IIF
ENA profile
+
DNA ENA screen EIA
EIA o IIF
+
confirm
titre
IIFEIA
Flow-chart of Connective Tissue Disease
Sp-100
Pattern
Centromer Cytoplasmic/Nucleolar Nuclear dots Others
CENP-B AMA, ribosomial, Jo1, Polym/Dermat, Scleroder
EIA DB LIA ALB
RNP, Sm, SSA, SSB, Scl70, Jo-1, PCNA,
histone
5
CRITERIA FOR THE CLASSIFICATION OF CRITERIA FOR THE CLASSIFICATION OF
SYSTEMIC LUPUS ERYTHEMATOSUSSYSTEMIC LUPUS ERYTHEMATOSUS(ACR (ACR SubcommitteeSubcommittee) )
HochbergHochberg MC. MC. Arthritis Rheum Arthritis Rheum 1997; 40: 17251997; 40: 1725
1. 1. Malar rashMalar rash
2. 2. Discoid rashDiscoid rash
3. 3. PhotosensitivityPhotosensitivity
4. 4. Oral ulcersOral ulcers
5. 5. ArthritisArthritis
6. 6. SerositisSerositis
7. 7. Renal disorderRenal disorder
8. 8. Neurologic disorderNeurologic disorder
9. 9. Haematologic disorderHaematologic disorder
HaemoliticHaemolitic anemiaanemia
LymphopeniaLymphopeniaLeucopeniaLeucopenia
ThrombocitopeniaThrombocitopenia
10. 10. Immunologic disorderImmunologic disorder
dsDNA AbsdsDNA Abs
SmSmAbsAbs
SerologicSerologic test test for syphilisfor syphilis
aCL IgGaCL IgG
aCL IgMaCL IgM
LACLAC
11. 11. Antinuclear Antinuclear antibodyantibody
Le problematiche legate alla refertazione:
• Quali pattern refertare• Come refertare i pattern• Quando e se eseguire test di conferma (ANA reflex)• Quando inserire un commento interpretativo
J Autoimm 2010
Pattern Antigeni Patologie
associate
Test reflex
Membrana nucleare Lamina, Gp210 SLE, Sj, CBP,AH GP210
Omogeneo , nucleoli+ DNA,Istoni SLE, Drug SLE, AR j DNA, ENA?, Istoni, Nucleos
Omogeneo, nucleoli - DNA, Istoni SLE, Drug SLE DNA,ENA?, Istoni, Nucleos
Speckled coarse hnRNP, U1 RNP MCTD ENA
Speckled large granul. U1 RNP MCTD ENA
Fine speckled SSA,SSB,Mi2,Ku Sj,SLE,SSc/PM ENA,SSc/PM auto-Ab
SCL70-like pattern SCL70,PM/Scl Pm/Scl ENA SCL70, Pm/Scl auto-Ab
PCNA pleiomorphic PCNA SLA, MCTD PCNA
Centromerico CENP A,B,C,D SSc limited; Rayn. CENP
Multi dots (5-10) Sp100,PML PBC Sp100, PML
Few nuclear dots (2-6) P80 coilin (raro) Sj, SLE, Rayn. P80 coilin
Nucleolare: omog,
clumpy, speckled
Fibrill,
Pm/Scl,RNA pol
Scleroderma Fibrill, Pm/Scl,RNA pol
Centriolo diversi Mycoplasma, Sj ? ?
NuMa centrofilina Mycoplasma ?
Pattern Antigeni Patologie
associate
Test reflex
CENP-F MSA-3 cancer ?
Citoplasmatico diffuso Jo1, PL7, PL12, OJ,
EJ, Sc, ribosomi
Miosite, SLE,
alveolite, Rayn
Ribosomi, auto-Ab
Pm-associati
Citoplasmatico fin.
Speck.
Jo1 e auto-Ab
anti-sintetasi
Miosite,
dermatomiosite
Jo1 e auto-Ab anti-
sintetasi
Mitocondri-like M2 CBP M2
Lilsosomi -like ? ? ?
Smooth muscle actina Autoimmune
Hep
actina
Vimentina-like ? ? ?
Midbody MSA-2 SSc, Rayn ?
Sistemi per lo screening dei campioni negativi e Sistemi per lo screening dei campioni negativi e Sistemi per lo screening dei campioni negativi e Sistemi per lo screening dei campioni negativi e per consentire allper consentire allper consentire allper consentire all’’’’operatore di operatore di operatore di operatore di concentrare concentrare concentrare concentrare professionalitprofessionalitprofessionalitprofessionalitàààà e tempo sui veri campioni e tempo sui veri campioni e tempo sui veri campioni e tempo sui veri campioni positivipositivipositivipositivi, per i quali i sistemi possono fornire , per i quali i sistemi possono fornire , per i quali i sistemi possono fornire , per i quali i sistemi possono fornire unununun’’’’interpretazione di alcuni pattern interpretazione di alcuni pattern interpretazione di alcuni pattern interpretazione di alcuni pattern fluoroscopici fondamentalifluoroscopici fondamentalifluoroscopici fondamentalifluoroscopici fondamentali
• Microscopio a fluorescenza
– Lampada LED (10000 h di durata)
• Stazione motorizzata per individuare vetrini
e pozzetti
• Fotocamera o telecamera
• Software
• Sistema autofocusing
• Screening totalmente automatizzatoScreening totalmente automatizzatoScreening totalmente automatizzatoScreening totalmente automatizzato• Analisi Analisi Analisi Analisi HEp2:HEp2:HEp2:HEp2:
– completa: tempo varia dacompleta: tempo varia dacompleta: tempo varia dacompleta: tempo varia da1 1 1 1 minuto a 5 minuti a pozzettominuto a 5 minuti a pozzettominuto a 5 minuti a pozzettominuto a 5 minuti a pozzetto
– screening pos / negscreening pos / negscreening pos / negscreening pos / neg– analisi dei pattern (alcuni)analisi dei pattern (alcuni)analisi dei pattern (alcuni)analisi dei pattern (alcuni)
• Quantificazione dei risultatiQuantificazione dei risultatiQuantificazione dei risultatiQuantificazione dei risultati• Archiviazione di datiArchiviazione di datiArchiviazione di datiArchiviazione di dati----immagini immagini immagini immagini • Preparazione report per pazientePreparazione report per pazientePreparazione report per pazientePreparazione report per paziente• Visione Visione Visione Visione livelivelivelive dei pozzettidei pozzettidei pozzettidei pozzetti
• Il sistema analizza Il sistema analizza Il sistema analizza Il sistema analizza intensitintensitintensitintensitàààà e struttura della e struttura della e struttura della e struttura della fluorescenzafluorescenzafluorescenzafluorescenza di ogni campione, per poter fare la di ogni campione, per poter fare la di ogni campione, per poter fare la di ogni campione, per poter fare la discriminazione discriminazione discriminazione discriminazione POSITIVIPOSITIVIPOSITIVIPOSITIVI---- NEGATIVINEGATIVINEGATIVINEGATIVI
• Oltre alla normale procedura dei test in IFI, ogni Oltre alla normale procedura dei test in IFI, ogni Oltre alla normale procedura dei test in IFI, ogni Oltre alla normale procedura dei test in IFI, ogni pozzetto viene incubato con DAPI (4pozzetto viene incubato con DAPI (4pozzetto viene incubato con DAPI (4pozzetto viene incubato con DAPI (4’’’’6666----diamidinodiamidinodiamidinodiamidino----2222----phenylindol). Il DAPI permette il phenylindol). Il DAPI permette il phenylindol). Il DAPI permette il phenylindol). Il DAPI permette il riconoscimento dellriconoscimento dellriconoscimento dellriconoscimento dell’’’’elemento cellulare e la elemento cellulare e la elemento cellulare e la elemento cellulare e la messa a fuocomessa a fuocomessa a fuocomessa a fuoco
Esperienza col sistema Aklides
Sui campioni positivi localizza la fluorescenza: Sui campioni positivi localizza la fluorescenza: Sui campioni positivi localizza la fluorescenza: Sui campioni positivi localizza la fluorescenza: NUCLEARE o CITOPLASMATICA NUCLEARE o CITOPLASMATICA NUCLEARE o CITOPLASMATICA NUCLEARE o CITOPLASMATICA
con assegnazione della fluorescenza ad uno dei con assegnazione della fluorescenza ad uno dei con assegnazione della fluorescenza ad uno dei con assegnazione della fluorescenza ad uno dei 5 pattern basilari del software5 pattern basilari del software5 pattern basilari del software5 pattern basilari del software
omogeneo dots
centromericonucleolare
speckled
La segmentazione delle La segmentazione delle La segmentazione delle La segmentazione delle immaginiimmaginiimmaginiimmagini
• Le Le Le Le immaginiimmaginiimmaginiimmagini cellulari vengono considerate cellulari vengono considerate cellulari vengono considerate cellulari vengono considerate OGGETTI che vengono definiti utilizzando OGGETTI che vengono definiti utilizzando OGGETTI che vengono definiti utilizzando OGGETTI che vengono definiti utilizzando sistemi di identificazione:sistemi di identificazione:sistemi di identificazione:sistemi di identificazione:– Regionali (spazio fisico) Regionali (spazio fisico) Regionali (spazio fisico) Regionali (spazio fisico) – Topologici (proprietTopologici (proprietTopologici (proprietTopologici (proprietàààà di figure e forme)di figure e forme)di figure e forme)di figure e forme)– Di superficie Di superficie Di superficie Di superficie
Image Processing of AKLIDES ®
homogenous
nucleolar
speckeld
centromere
cytoplasm
DAPI FITC
dots
Pattern omogeneo
Pattern centromericoVALUTAZIONE ESEGUITA VALUTAZIONE ESEGUITA
A UDINEA UDINE
CAMPIONI ANALIZZATI: CAMPIONI ANALIZZATI: • 530 sieri in totale di cui
• 502 campioni consecutivi inviati per
ricerca ANA
• 28 campioni selezionati con pattern
IFI peculiari e/o specificità
autoanticorpale nota
CAMPIONI ANALIZZATICAMPIONI ANALIZZATI
•SSA
•SSB
•DNA
•SP100
•Cenp-B
•AMA-M2
•Gp210
•RNP
•Scl70
•Jo1
•PCNA
•PMscl
•Sm
•P-ribosomiale
Specificità
Anche più specificitàpresenti: fino a 4
68 sieri con
ANALISIANALISI
Microscopia tradizionale:
• tessuto: Hep-2 Alifax
•Valutazione al microscopio a fluorescenza di due operatori esperti:
•Titolo e pattern
Sistema automatizzato di lettura
• tessuto Hep-2 Alifax
• Valutazione automatizzata con lampada a led
• Titolo e pattern
ANALISI : sistema ANALISI : sistema
automatizzatoautomatizzato
Titolo:
Negativo, debolm. pos., 1+, 2+, 3+,
Pattern:
• speckled,
•omogeneo,
•nucleolare,
•centromerico
•dots
•citoplasmatico
•non definito
RISULTATI N = 530RISULTATI N = 530
Negativi POSITIVINon
determinati
Lettura Aklides 279 (53%) 245 (46%) 6 (1%)
Lettura microscopio
256 (48%) 270 (51%) 4 (1%)
Positivi 67 su 68 sieri con specificità definita
RISULTATI POSITIVI : RISULTATI POSITIVI :
titolotitolo
BASSO ALTO
Debol pos e 1+ 2+, 3+, 4+
Lettura Aklides N = 245
115 (47%) 130 (53%)
1:80 ≥≥≥≥ 1:160Non titolati
Lettura microscopio
N = 27082 (30%) 185 (69%) 3
PATTERN IFI omogeneo PATTERN IFI omogeneo
e specklede speckled
47
123
190
61
0
40
80
120
160
200
N CAMPIONI
OMOGENEO SPECKLED
microscopio
Aklides
microscopio
PATTERN IFI: altriPATTERN IFI: altri
0
2
4
6
8
10
12
14
N CAMPIONI
centromero
nucleolare
dotscitoplasm
at
membra..
matrice n
non defi...
PATTERN
microscopio
Aklides
Dots microscopio: misti + speckled e omogeneo = 20
N = 22
AGREEMENT (88.4%)
POS NEG
POS 231 20 (3.7%)
NEG 42 (7.9%) 237
MICROSCOPIO
AKLIDES
273 257 530
251
279
DEI 42 SIERI AKLIDES NEGATIVI/MICROSCOPIO POSITIVI:
• 29 speckled e/o omogeneo 1:80
• 8 speckled e/ o omogeneo o matrice nucleare 1:160
• 5 speckled o matrice nucleare 320
(1 siero SSA 52 kd positivo a basso titolo)
4,2% 3,1%
8% 2%
M. pos/A. neg M. neg/A. pos
Udine* 7.9% 3.7%
Berlin University** 4.2% 3.1%
Berlin private Lab** 8.0% 2.0%
M = lettura al microscopioA = lettura Aklides*Diluizione 1:80**Diluizione 1:160
Il gruppo di studio SIMeL di Autoimmunologia ha in corso uno studio comparativo tra 6 sistemi per l’interpretazione automatizzata del test ANA:
• 132 sieri validati in 6 laboratori utilizzando 6 diversi substrati Hep-2• I 132 sieri sono stati sucessivamente processati per gli ANA dai rispettivi “specialist” nei laboratori di Udine e Merano• Sono in corso le analisi dei risultati
A B C D E D
Falsi negativi 7/95 2/95 27/95 11/95 10/95 2/94
Sensibilità % 92.6 97.9 71.6 88.4 89.5 97.9
Falsi positivi 2/42 15/42 0/42 2/42 8/42 10/42
Specificità % 95.2 64.3 100 95.2 81.0 76.2
• automazione degli step interpretativiautomazione degli step interpretativiautomazione degli step interpretativiautomazione degli step interpretativi• oggettivitoggettivitoggettivitoggettivitàààà del sistemadel sistemadel sistemadel sistema• assenza di influenza della struttura assenza di influenza della struttura assenza di influenza della struttura assenza di influenza della struttura
intrinseca dellintrinseca dellintrinseca dellintrinseca dell’’’’occhio umanoocchio umanoocchio umanoocchio umano• abbattimento della soggettivitabbattimento della soggettivitabbattimento della soggettivitabbattimento della soggettivitàààà
interpretativa in fase di screeninginterpretativa in fase di screeninginterpretativa in fase di screeninginterpretativa in fase di screening
• STANDARDIZZAZIONESTANDARDIZZAZIONESTANDARDIZZAZIONESTANDARDIZZAZIONE
• I sistemi automatici per la lettura degli ANA sono in grado di discriminare i sieri ANA positivi da quelli ANA negativi
• Sono in grado di identificare i sieri ANA positivi e con autoanticorpi specifici
• I sistemi sono completamente automatizzati
•Sono in grado di archiviare tutte le immagini su scheda/paziente e di collegarsi al LIS.
•Possono processare oltre ai vetrini HEp-2 anche vetrini per ds-DNA, ANCA e 3 tessuti
• Come tutti i sistemi di acquisizione e di interpretazione di immagini interpretano l’immagine in rapporto alla qualità del substrato utilizzato
• Possono avere un ruolo rilevante nel fornire un “titolo” oggettivo di positività
CONCLUSIONI