ALTERAÇÃO DOS PERFIS PROTÉICOS PROVOCADA POR METIL JASMONATO (MEJA) EM FOLHAS DE Ricinus communis L.

Jucélia da Silva Araújo Giuli1, Cristiane M. C. Salles2, Olga Lima Tavares Machado3

UENF - Campos dos Goytacazes RJjucelia@uenf.br1, salles.cristiane@gmail.com2, olga@uenf.br3

RESUMO - As plantas percebem as agressões, e sua alta capacidade de adaptação torna possível sua sobrevivência. As plantas desenvolveram mecanismos de resposta para se defenderem e protegerem das várias formas de estresse ambiental. Os mecanismos de defesa de plantas em muitos casos baseiam-se na expressão de genes e alterações no conjunto de proteínas da célula. Análise do perfil de proteínas através de técnicas eletroforéticas é usada para estudar e entender mecanismos fisiológicos da planta em condições normais e sob estresse. Plantas tratadas com MeJa ou exposta a tipos de estresse que induzem a acumulação de jasmonatos, sintetizam polipeptídeos (JIPs). Concomitantemente estes tecidos reduzem ou interrompem a síntese de muitas proteínas constitutivas. A mamona foi escolhida como modelo para estudo por ser muito resistente e de fácil adaptação. Neste trabalho, verficaram-se alterações no perfil protéico das folhas de mamona após tratamentos com MeJa. Como já reportado para outras plantas, MeJa altera a expressão de genes em plantas de mamona, visto pelas alterações no perfil protéico, e promove eventos de senescência como a redução das subunidades da Rubisco. Os resultados encontrados mostram que metil jasmonato faz parte atuante na rota de sinalização do mecanismo de defesa da mamona.

INTRODUÇÃO Os vegetais sofrem constantes agressões por agentes bióticos e abióticos. Em geral, agentes

não-biológicos são radiação ultravioleta, salinidade, temperatura, umidade e outros produtos tóxicos presentes em rejeitos industriais e domésticos que alteram o ambiente (MARGIS-PINHEIRO et al., 1999). Agentes naturais como insetos, vírus, bactérias e fungos tentam criar nas plantas diferentes habitats como fonte de nutrientes (BARON e ZAMBRYSKI, 1995). Apesar da aparente passividade, as plantas percebem as agressões, e sua alta capacidade de adaptação torna possível que sobrevivam com freqüência, mesmo tendo muitas vezes seu desenvolvimento prejudicado. As plantas desenvolveram sofisticados mecanismos de resposta para se defenderem e protegerem das várias formas de estresse ambiental (HOLLEY et al., 2003). Os mecanismos de defesa de plantas em muitos casos baseiam-se na expressão de genes de defesa e alterações no conjunto de proteínas da célula. Análise do perfil de proteínas através de técnicas eletroforéticas tem sido muito usada para estudar e entender mecanismos fisiológicos e biológicos da planta em condições normais e sob os mais diversos tipos de estresse (SCHILTZ et al., 2004). Plantas tratadas com metil jasmonato ou exposta a tipos de

estresse que induzem a acumulação de jasmonatos, sintetizam altos níveis de polipeptídeos chamados JIPs. Concomitantemente estes tecidos reduzem ou interrompem a síntese de muitas proteínas presentes antes do tratamento por metil jasmonato (REINBOTHE et al., 1994). A mamona (Ricinus

communis) foi escolhida como modelo para estudo por ser muito resistente, se adaptando com facilidade a diversos tipos de solos e climas, por isso espera-se que ela seja adequada para a compreensão do mecanismo de defesa de plantas. Este trabalho teve por finalidade avaliar as alterações no perfil protéico das folhas de mamona após tratamentos com metil jasmonato e assim verificar o papel deste hormônio na rota de sinalização no mecanismo de defesa da mamona.

MATERIAIS E MÉTODOSAs sementes de R communis, cultivar IAC 80 foram adquiridas no Instituto Agronômico de

Campinas. As mesmas foram semeadas em potes plásticos contendo o substrato orgânico Plantmax® em casa de vegetação. No estágio trifoliar, as plantas foram levadas para o laboratório e expostas a MeJa. Após os tratamentos, as folhas cortadas foram pesadas e maceradas com auxilio de grau e pistilo na presença de nitrogênio líquido. O pó obtido foi ressuspenso em 5 volumes de tris-HCl 100 mM pH 8,0, EDTA 10 mM, PMSF 10 mM , benzamidina 4 mM, PVPP 5%, mantido por 1 hora e centrifugado a 15.000 x g por 30 min. a 4C. O sedimento foi descartado e o sobrenadante foi reservado para análises posteriores. Para 2D SDS-PAGE as proteínas foram extraídas segundo Tsugita et al. (1996). As eletroforeses unidimensionais foram feitas segundo Laemmli (1970) e as bidimensionais segundo O' Farrel (1975), Bjellqvist et al. (1982) e Görg et al. (1985 e 1988) empregando os aparelhos IPGphor e MULTIphor II (GE Healthcare) de acordo com instruções do fabricante. A análise de imunodetecção foi realizada segundo Towbin et al. (1979). A caracterização por espectrometria de massas.

RESULTADOS E DISCUSSÃOApós 24 horas não observamos indução aparente (Fig. 1A), somente são vistas as reduções

das bandas de 50 e 15 kDa. Para o tempo de 48 horas (Fig. 1B), além dessas mesmas reduções, observamos o aparecimento das bandas de 21, 24 e 32 kDa. Comportamento similar é observado após 72 h (Fig. 2A), mostrando-se mais acentuados após 144 h (Fig. 2B). As bandas protéicas com características similares e que apresentaram reduções ou induções foram retiradas do gel e hidrolisadas. As proteínas extraídas e os fragmentos triptícos foram levados ao espectrômetro de massas para serem seqüenciados, e as seqüências encontradas foram comparadas com outras seqüências encontradas em bancos de dados. Obteve-se a identificação de duas proteínas com massa

de 50 e 15 kDa como sendo Rubisco , cadeias pesada e leve (LSU e SSU). Os ensaios por “Western Blotting”, confirmaram as reduções e, fragmentos da LSU 25 e 30 kDa foram identificados (Figura 2C). Estas reduções da Rubisco, são sintomas típicos de plantas estressadas e demonstram eventos de senescência. Este fenômeno já foi reportado em outras plantas, como Oryza sativa, Hordeum vulgare

Brassica napus e Arabidopsis thaliana, quando submetidas ao mesmo tratamento (SEMBDNER e PARTHIER, 1993). A eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (2 DE) foi utilizada como uma ferramenta analítica para estudar as mudanças no proteoma das plantas. 2-DE revelou alterações consideráveis no perfil protéico das folhas tratadas com MeJa em relação as plantas não tratadas. Alguns “spots” protéicos mostram reduções, outros aumento e alguns aparecem nas plantas tratadas e não são vistos nos controles. Nas Figuras 3 e 4 destaca-se um “spot” com massa em torno de 50 kDa e ponto isoelétrico 6,1 que tem seus níveis reduzidos em 16% em 1 hora de tratamento e chega a 94% em 48 horas, o qual foi identificada com LSU e confirmada por ensaio de “Western Blotting” (Figuras 4G e 4H). Outra importante redução é de um “spot” com massa em torno de 15 kDa e pI 7,8 visto a partir de 14 horas e que apresenta características semelhantes com SSU. As proteínas superexpressadas podem fazer parte de algumas proteínas de defesa constitutiva, e as novas podem ser constituintes de grupos de proteínas induzidas por jasmonatos (JPIs) que podem ser, inibidores de proteinases, tioninas, proteínas ricas em prolina, enzimas envolvidas no metabolismo de fenilpropanóide e proteínas inativadoras de ribossomos -RIPs (Reinbothe et al., 1994), ou proteínas de reserva vegetativa (VSPs), proteínas induzidas que parecem ser de estresse, com a função de proteger e defender as plantas sob condições de estresse (ROSSATO et al., 2002).

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS MARGIS-PINHEIRO, M.; MARTIN, C.; DIDIERJAN, L.; BURKARD, G. (1999) -Differential expression of bean chitinase genes by virus infection, chemical treatment and UV irradiation. Plant Molecular Biology. 22: 659-668.BARON, C.; ZAMBRYSKI, P. C. (1995) The Plant Response in Pathogenesis, Symbiosis, and Wounding: Variations on a Common Theme? Annual Review of Genetics 29: 107-129HOLLEY, S. R.; YALAMANCHILI, R. D.; MOURA, D. S.; RYAN, C. A.; STRATMANN, J. W. (2003) - Convergence of Signaling Pathways Induced by Systemin, Oligosaccharide Elicitors, and Ultraviolet-B Radiation at the Level of Mitogen-Activated Protein Kinases in Lycopersicon peruvianum Suspension-Cultured Cells. Plant Physiology 132:1728-1738.

SCHILTZ, S.; GELLARDO, K.; HUART, M.; NEGRONI, L.; SOMMERER, N.; BURSTIN, J. (2004) - Proteome reference maps of vegetative tissues in pea. An investigation of nitrogen mobilization from leaves during seed filling. Plant Physiology. 135: 2241-2260.REINBOTHE, S.; MOLLENHAUER, B.; and REINBOTHE, C. (1994) - JlPs and RIPs: The Regulation of Plant Gene Expression by Jasmonates in Response to Environmental Cues and Pathogens. The Plant Cell. 6:1197-1209TSUGITA, A.; KAMO, M.; KAWAKAMI, T.; OHKI, Y. (1996) - Two-dimensional electrophoresis of plant proteins standardization of gel patterns. Electrophoresis. 17: 855-865.LAEMMLI, U. K. (1970) - Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacterophage T4. Nature. 277: 680-685.O’FARRELL, P. H. (1975) - High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. Journal of Biological.Chemistry 250: 407-421BJELLQVIST, B.; EK, K.; RIGHETTI, P.G.; GIANAZZA, E.; GÖRG, A.; WESTERMEIER, R.; POSTEL, W. (1982) - Isoeletric focusing in immobilized pH gradients: principle, methodology, and some applications. Journal of Biochemical and Biophysical. Methods 6: 317-339.GÖRG, A.; POSTEL, W.; GÜNTHER, S. (1988) - The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis. 9: 531-546. GÖRG, A.; POSTEL, W.; GÜNTHER, S.; WESER, J. (1985) - Improved horizontal two-dimensional electrophoresis with hybrid isoelectric focusing in immobilized pH gradients in the first dimension and laying-on-transfer to the second dimension. Electrophoresis. 6: 599-604.TOWBIN, H.; STAEHELIN, T.; GORDON J (1979) - Electrophoretic Transfer of Proteins from Polyacrylamide Gels to Nitrocellulose Sheets: Procedure and Some Applications. Proceedings of the National Academy of Sciences 76:4350-4354.SEMBDNER, G. and B. PARTHIER. (1993). The biochemistry and the physiological and and molecular actions of jasmonates. Annual Reviews of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 44: 569-589.ROSSATO, L.; MACDUFF, J. H.; LAINE, P.; Le DEUNFF, E.; OURRY, A. (2002) - Nitrogen storage and remobilization in Brassica napus L. during the growth cycle: effects of methyl jasmonate on nitrate uptake, senescence, growth, and VSP accumulation. Journal of Experimental Botany 53 (371): 1131-1141.

250

M controle tratada B M controle tratada A

105 160

75

50

35

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M controle tratada B M controle tratada A 250

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B

Figura 1: SDS-PAGE 15%, de proteínas extraídas de folhas de plantas controles e tratadas com metil jasmonato após 24 horas (A), 48 horas(B).

Figura 2. SDS-PAGE 15% de proteínas extraídas de folhas de plantas controles e tratadas com metil jasmonato após 72 horas (C) e 144 horas (D). (E) Imunodetecção após eletroforese em gel 15 %. C1 (controle); T1, T2, T3 e T4 (24, 48, 72 e 144 horas após tratamento

-

C D

E F

G H

BA 160 105 75 50 35 30 25

15

250 160 105 75 50 35 30 25

15

10

250 160 105 75 50 35 30 25

15

10

4 7 4 7

3 10 3 10

Figura 4: Eletroforese bidimensional dos extratos protéicos de folhas de mamona controle (A) e tratadas com MeJa (B) após14 horas, controle (C) e tratada (D) e após 24 horas, controle (E) e tratada (F) e após 48 horas. Imunodetecção após focalização isoelétrica na fixa de pH 4 a 7 e SDS-PAGE 12% das proteínas extraídas das plantas controles (G) e tratadas com MeJa (H), no tempo de 24 horas.