1

Almen cellebiologi 2007

Membrantransport

Kap. 12, s. 389-420

Forelæsning 1

Stine Falsig Pedersensfpedersen@aki.ku.dk

35321546/room 527

2

De næste tre forelæsninger:

1. - Membranen og membran-transport proteiner generelt - Pumper og andre carrier proteiner

2. - Ion-kanaler og membranpotentialet

3. - Ionkanalers roller i nervesystemet – fysiologi og patofysiologi

3

De næste tre forelæsninger:

1. - Membranen og membran-transport proteiner generelt - Pumper og andre carrier proteiner

2. - Ion-kanaler og membranpotentialet

3. - Ionkanalers roller i nervesystemet – fysiologi og patofysiologi

4

Ca 50% af plasma-membranens vægt udgøres af membran-proteiner

Engelman 2005 Nature 438: 578-580

5

Membranproteiners funktioner

Transport Struktur: adhesion, cytoskelet Signalering: receptorer, enzymer

Plasma-membranens proteiner medierer funktioner, som lipid-dobbeltlaget ikke kan varetage

Hvad skal der til, for at et molekyle kan transporteres over en membran?

6

Lipid-dobbeltlaget er en semi-permeabel membran

• Mest permeabelt for små, hydrofobe (non-polære) molekyler

• Meget permeabelt for små (vand), men ikke for store (aminosyrer, glucose) uladede polære molekyler

• Impermeabelt for ioner

Alberts Fig. 11-1

Der er altså brug for transport-mekanismer til alt det, der ikke kan

passere ved simpel diffusion!

7

Hvorfor interessere sig for membrantransport?!

Boron and Boulpaep (2002)Medical Physiology

8

Hver membran i cellen har et specifikt sæt af transportproteiner

Hvert organel har netop de transportører, der er relevante for dens specifikke behov

F.eks. : optag af næringsstoffer over plasmamembranen, optag af H+ i lysosomerne, og optag af pyruvat og efflux af ATP fra mitochondrierne.

9

Membran-transport proteiner er enten carriers eller kanaler

Carrier proteiner: Binder ion/molekyle, og undergår konformations-ændringer, der resulterer i translokation over cellemembranen

Kanal proteiner:Vandig pore gennem plasmamembranen, hvorigennem bestemte ion/molekyle transporteres, når poren er åben (uregulerede kanaler kaldes også porer)

Hvad er hurtigst: carrier- eller kanal-medieret transport?

Carrier Kanal

10

Drivkraften for transport er den elektrokemiske gradient

Bidrag fra concentrationsgradienten: ΔGconcentration: RT · ln Cxi/Cxo

Bidrag fra ladningen og membranpotentialet: ΔGladning : z · F · Vm,

R= gaskonstanten, T= temperaturen i K, Cx= koncentration af x, F = Faradays konstant, og Vm= membranpotentialet

Den elektrokemiske gradient = drivkraften for transport bliver derfor:

Δμx : ΔGconcentration + ΔGladning = RT· ln Cxi/Cxo + z · F ·Vm

∼

11

Transport over membranen er passiv eller aktiv

Kanaler kan kun mediere passiv transport – derfor er der også brug for carriersCarriers kan både mediere aktiv og passiv transport

Passiv transport:transport med en favorabel drivkraft, dvs nedad den elektrokemiske gradient (den samlede drivkraft hidrørende fra koncentrations- og ladningsforskel) for det transporterede molekyleAktiv transport:transporten opad den elektrokemiske gradient – kræver derfor energi-tilførsel

12

Passiv og aktiv transport – hvem gør hvad?

Passiv transport

∼

Sekundært aktiv Primært aktivPassiv

Aktiv transport kan være: Primært aktiv: drevet af ATP hydrolyse eller lysSekundært aktiv: drevet af transport af en anden ion/molecule nedad Δμ

13

Pumper – også kaldet ATPaser

14

Aktiv transport kan drives på tre måder

1. Transport af molekyle opad dets elektrokemiske gradient, koblet til transport af et andet molekyle nedad dets elektrokemiske gradient (sekundært aktiv transport)

2. Transport opad elektrokemisk gradient, drevet af ATP-hydrolyse

3. Transport opad elektrokemisk gradient, drevet af lys-energiprimært aktiv transport

1 2 3

Bemærk at en pumpe er et carrier-, og ikke et kanal-protein!

15

Primært aktiv transport I: Lys driver H+ transport via bacteriorhodopsin

H+ pumpe fra Halobacterium halobium. Hver bakteriorhodopsin protein indeholder et retinal molekyle, som, når det rammes af lys, undergår en konformationsændring og afgiver en H+, som passerer gennem proteinet ud til extracellulær siden. Cyklus afsluttes med at retinal regenereres ved at optage en ny H+ fra cytosolen.

16

Primært aktiv transport II: ATP-hydrolyse driver Na+,K+ ATPasen (Na+,K+ pumpen)

3 Na+ ioner ud for hver 2 K+ ind, dvs, transporten er elektrogen.

ATP-hydrolyse er drivkraft via autofosforylering: P-type ATPase

Ca. 30% af en celles energiforbrug går til Na+,K+ ATPasen

17

Na+,K+ ATPasens transportcyklus

3 Na+ binding intracellulært stimulerer ATP-hydrolyse og autofosforylering →konformationsændring → 3 Na+ transporteres ud → 2 K+ bindes extracellulært → fosfat frigøres → konformationsændring → 2 K+ frigives inde i cellen → en ny cyklus kan starte

Bemærk at selvom en pumpe

transporterer Na+ i den ene retning og

K+ i den anden retning kaldes den

stadig en pumpe, og ikke en antiporter!

18

Na+,K+ ATPasen er essentiel for normal cellefunktion:

• Opretholder lav [Na+]i og høj [K+]i (opbygger iongradienter, der driver sekundært aktiv transport)

• Opretholder steady state cellevolumen

• Bidrager til membranpotentialet

19

Na+,K+ pumpen opretholder en lav Na+ koncentration i eukaryote celler. De fleste sekundært aktive transportsystemer er derfor koblet til transport af Na+ ind i cellen.

Na+: 15 mM

K+: 140 mM

Cl-: 15 mM

Na+: 140 mM

K+: 5 mM

Cl-: 110 mM

− −−

−

−

−

−

−

−

−−

−−

−−−

−−

−

−

−

−

−

−

−−−−

Na+,K+ ATPasen skaber bl.a. grundlaget for sekundært aktiv transport

~

3 Na+ 2 K+

20

COMPONENT INTRACELLULAR

CONCENTRATION (mM) EXTRACELLULAR

CONCENTRATION (mM)

Cations

Na+ 5-15 145 K+ 140 5 Mg2+ 0.5 1-2 Ca2+ 10-4 1-2 H+ 7 × 10-5 (10-7.2 M or pH 7.2) 4 × 10-5 (10-7.4 M or pH 7.4)

Anions* Cl- 5-15 110

Den frie Ca2+ koncentration inde i cellen [Ca2+]i holdes også meget lav i steady state, for at Ca2+ kan fungere som second messenger

Na+,K+ pumpen

Ca2+ pumpen

Ca2+ pumper spiller en vigtig rolle i kontrol af [Ca2+]i…..

21

En anden P-type ATPase pumper Ca2+ ud af cytoplasma og ind i SR

Ca2+-pumpen i det sarcoplasmatiske reticulum (SR) kaldes SERCA. Den stimuleres når [Ca2+] i cytoplasma er høj. SERCA fjerner Ca2+ fra cytosolenved at pumpe det ind i SR, så muskelen bliver klar til at svare på et nyt signal.SERCA har 10 transmembrane α-helices. Dens 3D struktur er løst ved røntgenkrystallografi.

22

Andre carrier proteiner end pumper

23

Carrier-medieret transport kan være uniport, symport, eller antiport

Uniport: ét molekyle transporteresSymport (cotransport): de transporterede molekyler flyttes i samme retningAntiport (exchange): de transporterede molekyler flyttes i hver sin retning

24

Uniport – eksempel: glucosetransportørerne GLUT

Glucose transportører af GLUT familien

• GLUT1 findes i plasmamembranen hos så godt som alle celler. Forskellige isoformer findes feks i lever- (GLUT2) og muskel- (GLUT4) celler

• Transporterer glucose nedad dets koncentrationsgradient, dvs ind hvis blod glucose er høj, ud hvis cytoplasma glucose er høj (altså PASSIV transport)

25

Carrier-medieret transport kan være uniport, symport, eller antiport

Uniport: ét molekyle transporteresSymport (cotransport): de transporterede molekyler flyttes i samme retningAntiport (exchange): de transporterede molekyler flyttes i hver sin retning

26

Cotransportører (symporters)

Cotransportør proteiner• Transport af et el. flere molekyler opad en elektrokemisk gradient, drevet af

transport samme vej af et molekyle(r) nedad en elektrokemisk gradient: altsåSEKUNDÆRT AKTIV transport

• Oftest drevet af den indadrettede Na+-gradient

27

Cotransportører – eksempel: SGLT

Na+-glucose cotransportøren, SGLT

• Findes feks i den apikale membran i epithelceller i tarmen og i nyrens proximaletubuli

• Transporterer glucose ind i cellen opad glucoses koncentrationsgradient, drevet af indadrettet Na+ transport, dvs nedad Na+’s koncentrationsgradient

28

Glucose

Tarm-lumen

Men hvad så når glucosen skal videre ud i kroppen?

Na+

Glucose

Na+

Glucose

Blod-side

Glucose

En glucose-uniportertransporterer glucoseud af cellen nedad glucoses (elektro)-kemiske gradient

Glucose

Glucose

Na+

Hvad er dette?

29

Epitheler har tight junctions

Epitheler har tight junctions, som dels holder epithelet sammen til et mere eller mindre tæt lag, og dels muliggør assymmetrisk fordeling af membranproteiner i den enkelte celle.

30

Tight junctions er vigtige for transcellulær transport

Tight junctions imellem epithelcellerne muliggør asymmetrisk fordeling af transportproteinerne

Der er altså forskellige sæt transportproteiner på cellens apikale og basolaterale side - dette muliggør transcellulær transport

Glucosegradienten over epitheletopretholdes også af tight junctions, fordi de begrænser diffusion imellem cellerne

31

Glucose-transport over tarm-epithelcellen er et eksempel på transcellulær transport

Transportproteinernes forskellige fordeling i cellen muliggør transcellulær transport

Na+,K+ ATPasen producerer en indadrettet Na+ gradient

Glucoseoptag ind i tarm-epithelcellen drives af kobling til Na+ optag

Fra epithelcellen til blodsiden er glucosetransporten passiv

Glucosegradienten og den assymmetriske fordeling af transportproteinerne opretholdes af tight junctions

Tarm-lumen Blod-side

32

Hele regnskabet......

For hver gang SGLT kører kommer 1 glucose og 1 Na+ ind. Na+,K+ ATPasen skal altså køre en gang for hver 3 gange SGLT kører. De 2 K+ der kom ind via ATPasen recycles via basolaterale K+ kanaler. 3 Cl- følger passivt med paracellulært.

33

Carrier-medieret transport kan være uniport, symport, eller antiport

Uniport: ét molekyle transporteresSymport (cotransport): de transporterede molekyler flyttes i samme retningAntiport (exchange): de transporterede molekyler flyttes i hver sin retning

34

Exchangers (antiportere)

Exchanger proteiner

• Transport af et el. flere molekyler opad en elektrokemisk gradient, drevet af transport modsat vej af et molekyle(r) nedad en elektrokemisk gradient: altsåSEKUNDÆRT AKTIV transport

• Oftest drevet af den indadrettede Na+-gradient

• Oftest elektroneutrale (cation-cation eller anion-anion)

35

Eksempel: Na+/H+ exchangeren NHE1

NHE1 transporterer H+ ud af cellen ved hjælp af den indadrettede Na+ gradient – den er altså sekundært aktiv

Na+

H+

~3 Na+ 2 K+

Struktur-model af Na+/H+

exchanger-proteinet

NHE1 er bl.a. vigtig i opretholdelse af cellens volumen og pH

36

Na+/H+ exchangeren er en vigtig regulator af intracellulær pH

Opretholdelse af cellulær pH er afgørende for normal cellefunktionCellulær forsuring aktiverer transportører, der medierer H+ udsmidning, f.eks. NHE1

Hæmmer NHE

Cellen kan ikke regulere pHCellen regulerer pH

Cellen forsuresexperimentelt

Ca. hvad er intra- og extracellulært pH i pattedyrsceller?

37

Opretholdelse af osmotisk balance er essentiel for cellen

Osmose: bevægelse af vand nedad dets koncentrationsgradient, dvs fra et område med højere vandkoncentration (= lavere koncentration af opløste stoffer) til et område med lavere vandkoncentration (= højere koncentration af opløste stoffer)Cellemembranen er meget mere permeabel for vand end for ioner

38

Optag af vand over cellemembranen drevet af osmose kan få cellen til at svulme og springe

Fordi celler er meget permeable for vand, vil de svulme hvis koncentrationen af opløste stoffer er lavere udenfor end i cellenDisse opløste stoffer kaldes osmolytter, og er både salte, og organiske stoffer, og makromolekyler (DNA, proteiner)

39

Intracellulær vandbalance

Fordi celler indeholder (mest negativt) ladede makromolekyler, der ikke kan komme ud af cellen, men som vil tiltrække modsat ladede opløste ioner, vil celler altid indeholde flere osmolytter end deres omgivende miljøCeller vil altså uundgåeligt optage vand, svulme og sprænges, hvis ikke noget modvirkede dette

40

Forskellige organismer har udviklet forskellige strategier for at undgå denne form for osmotisk svulmning

Dyreceller pumper ioner udved hjælp af Na+,K+ ATPasen(som jo smider 3 Na+ ud, for

hver 2 K+, den tager op)

Planteceller har stive vægge

Protozoer pumper vand ud

41

Optag af vand over cellemembranen drevet af osmose kan få cellen til at svulme og springe

Så hvad sker der mon hvis man smider en rød blodcelle

ned i noget vand?

42

Osmotisk svulmning og skrumpning af røde blodceller

Hvis osmolyt-koncentration er lavere udenfor end indeni cellen (hypoton opløsning), vil cellen svulme fordi vand går ind i cellen nedad sin koncentrationsgradient

Hvis osmolyt-koncentration er højere udenfor end indeni cellen (hyperton opløsning), vil cellen skrumpe fordi vand går udad cellen nedad sin koncentrationsgradient

43

Osmotisk svulming efter ændringer i intra- eller extracellulær osmolytkoncentration modvirkes også af membrantransport proteiner

Svulmet

H2O

K+

Cl-

K+

Cl-Aminosyrer

Normal

H2OH+

Na+

Na+ K+ 2Cl-

Skrumpet

44

Planter, svampe, og bakterier bruger H+ gradienter istedet for Na+ gradienter til at drive sekundært aktiv transport

Disse H+ gradienter opretholdes af H+ pumper, der kan være lysdrevne(bakteriorhodopsin) eller ATP-hydrolyse-drevne som Na+,K+ ATPasenEn anden type H+ pumper (V-type H+ ATPaser), som findes i dyreceller, pumper H+ ind i feks lysosomer, hvis funktion kræver at deres lumen er surt

45

Opsummering - I

1. Lipid-bilag er semipermeable: vand og små non-polære molekyler passerer ved diffusion, ioner og store polære uladede molekyler gør ikke

2. Stoffer, der ikke kan passere ved diffusion transporteres af membranproteiner

3. Drivkraften for transport over cellemembranen er den elektrokemiske gradient

4. Transport nedad elektrokemisk gradient = passiv transport kan ske via carriers eller kanaler Transport opdad en elektrokemisk gradient = aktiv transport kan kun ske via carriers

5. Aktiv transport kan være primært aktiv = direkte ATP-hydrolyse koblet, eller sekundært aktiv = drevet af en transport af et andet molekyle nedad dets elektrokemiske gradient

46

Opsummering - II

6. Na+,K+ATPasen er en P-type primært aktiv transportør, som er afgørende for cellers funktion

7. Sekundært aktiv transport sker via cotransportører (symporters) eller exchangere (antiporters)

8. Celler har flere osmolytter end det omgivende miljø (Gibbs-Donnanligevægten), og dyreceller pumper derfor (v.h.a. Na+,K+ATPasen) konstant ioner ud for ikke at svulme

9. Membrantransportsystemer spiller vigtige fysiologiske roller i f.eks. kontrol af cellulært [Ca2+], pH, og volumen, og i transcellulær transport