AlmaMaterStudiorum‐UniversitàdiBologna

SCUOLA DI SCIENZEDipartimento di Chimica Industriale “Toso Montanari”  

  

Corso di Laurea Magistrale in 

Chimica Industriale  

Classe LM‐71 ‐ Scienze e Tecnologie della Chimica Industriale  

SINTESI E STUDIO DELLA REATTIVITA’ DI DERIVATI DEGLI ACIDI TIOIDROSSAMICI, 

POTENZIALI INIBITORI DELLA S‐GLUCOSILTRANSFERASE (S‐UGT) 

Tesi di laurea sperimentale 

 

CANDIDATO Lorenzo Cassani 

 

RELATORE

Dott.ssa Mariafrancesca Fochi

 

 

 

Sessione II _________________________________________________________________________________________________________________

Anno Accademico 2016-2017 _______________________________________________________________________________________________________________ 

LatesidiseguitoriportataèrelativaallavorosvoltoduranteilperiododitirociniopressoillaboratorioICOAdell’universitàdiOrléans.Un ringraziamento particolare ai responsabili del laboratorio, il professore ArnaudTatibouetelaprofessoressaMarieSchulerchemihannoresopartecipedellorolavoroechemihannoseguitometicolosamentepassodopopasso.RingrazioimieicolleghidilaboratorioJustyna,Maria,Laura,Guillermee,inparticolare,Giulianoperl’avermiaiutatoeseguitoinlaboratorio.

ABSTRACT

Lo scopo di questo lavoro è stata la sintesi dei tioidrossimati, composti contenenti lafunzioneZ‐tioidrossimata.Questisonostatiottenutipartendodacinquediversealdeidiche,unavoltatrasformateinossime,sonostatefattereagireciascunaconilmetilN‐acetilcisteinato,esteredella(L)‐N‐acetilcisteina,adarelafunzioneZ‐tioidrossimata.Durantelasintesi,sullabasedilavorisvoltiprecedentementedalgruppodiricercapressocuihosvolto il tirocinio, si sono seguite dueproceduredifferenti: la prima cheutilizza laN‐clorosuccinimide, lasecondacheutilizza, invece,unasoluzionedi ipoclorito.Entrambehanno portato a delle buone rese anche se la seconda procedura è risultata essere lamigliore, soprattutto per quanto riguarda il tempo di reazione. Successivamente itioidrossimatisonostatisottopostiaprocessidisolfatazione‐eliminazione,eliminazione‐acidificazione al fine di ottenere i corrispondenti isotiocianati e acidi tioidrossamici.Poiché questi due processi si sono rivelati poco efficienti, si è cercato di migliorarliapportando diversemodifiche e ripetendoli di seguito più e più volte. Alcuni risultatiincoraggiantisonostatiottenutiancheselametodicamessaapuntononèrisultataessereapplicabileatuttiisubstratiimpiegati.

ThepurposeofthisworkwasthesynthesisofthiohydroximatescompoundscontainingtheZ‐thiohydroximatefunction.Theywereobtainedfromfivedifferentaldehydesthat,onceconverted into thecorrespondingoximes,werereactedwith themethylN‐acetylcysteinate, themethylesterof the(L)‐N‐acetylcysteine, to formtheZ‐thiohydroximatefunction.Throughoutthesynthesis,onthebasisoftheworksdevelopedpreviouslybytheresearchgroupinwhichIdidmyinternship,twodifferentprocedureswerefollowed:thefirstoneinvolvedtheuseofN‐chlorosuccinimide,whereasahypochloritesolutionwasusedinthesecondone.Boththemethodologiesemployed,allowedtoachievegoodyieldsthough thesecondmethodresulted tobepreferabledue to theshortedreaction time.Afterwards,thethiohydroximateswereemployedinsulfation‐eliminationorelimination‐acidificationreactionstoobtainthecorrespondingisothiocyanatesandthiohydroxamicacids.Duetothefactthatthisreactionswerenotsoefficient,somechangesweredonetoimproveitandthereactionswererepeatedseveraltimes.Someencouragingresultswereobtainedevenifthechangeswerenotapplicabletoallthesubstratesemployed.

INDICE

INTRODUZIONE1

GLUCOSINOLATI1

S‐GLUCOSILTRANSFERASE(S‐UGT)4

MIROSINASI6

OBBIETTIVODELPROGETTO8

RISULTATIEDISCUSSIONE10

FORMAZIONEDELLEOSSIME10

ESTERIFICAZIONEDELLA(L)‐N‐ACETILCISTEINA11

FORMAZIONEDELTIOIDROSSIMATO12

SOLFATAZIONEDEITIOIDROSSIMATI15

ISOTIOCIANATIDALLABETA‐ELIMINATIONSUITIOIDROSSIMATISOLFATATI20

ACIDITIOIDROSSAMICIDAITIOIDROSSIMATI22

CONCLUSIONIEPROSPETTIVE25

PARTESPERIMENTALE27

OSSIME27

METILN‐ACETILCISTEINATO32

TIOIDROSSIMATI33

TIOIDROSSIMATIO‐SOLFATATI38

ISOTIOCIANATI43

SALEDELL’ACIDOTIOIDROSSAMICO44

1

INTRODUZIONEGLUCOSINOLATII Glucosinolati (GLs) sono dei metaboliti tiosaccaridici secondari1 che si trovanoprincipalmenteintuttequellefamigliedipianteappartenentiall’ordinedelleBrassicales.Le famiglie più importanti sono le Brassicaceae, le Caricaceae, le Euphorbiaceae, leMoringaceae, le Phytolaccaceae, le Resedaceae e le Tropeaolaceae. Nel 2001 si sonoregistrati più di 120 GLs naturali anche se recentemente una seconda analisi hacompletatoilloronumeroa132.2Questisitrovanoinverdurequaliilcavolo,ibroccoli,ilcavolfiore,icavolettidiBruxellesesonoresponsabilidellorosaporeamaroeintenso.TuttiiGLsconosciutimanifestanounanotevoleomogeneitàstrutturalecostituitadaunafunzionetioidrossimataO‐solfatatadiconfigurazioneZlegatatramitelozolfoalcarbonioanomerico di una unità ‐D‐glucopiranosile e tramite il carbonio sp2 ad una catenalateraleRcherappresental’unicavariantestrutturale(Figura1).

Figura1.StrutturadeiGLs

1Fenwick,G.R.;Heaney,R.K.;Mullin,W.J.Crit.Rev.FoodSci.Nutr.1983,18,123‐201.2Fahey,J.W.;Zalcmann,A.T.;Talalay,P.Phytochemistry2001,56,5‐51.

2

Iprimiglucosinolatifuronoisolatinel1830dasemidisenapenera(Sinigrinao2‐propenilglucosinolato) e da semi di senape bianca (Sinalbina o 4‐idrossibenzil glucosinolato)(Figura2).

Figura2.StrutturediSinigrinaeSinalbinaLa prima struttura generale, incorretta, di questi composti fu proposta alla fine deldiciannovesimo secolo da Gadamer (1897) e prevedeva che la catena lateraleR fosselegata all’atomo di azoto mentre il gruppo solfato al carbonio sp2 della funzionetioidrossimata. Questa struttura fu ritenuta corretta fino al 1956, quando si rivelòincapacedidescriveredeterminateproprietàdellamolecola;quindinel1957EttlingereLundeen proposero una struttura nuova e corretta in cui il gruppo solfato è legatoall’atomodiazoto(Figura3).

Figura3.StrutturegeneralipropostenelcorsodeglianniLastereoisomeriaallegameC=NfustabilitaessereZviacristallografiaaraggiX.2EttlingereLundenfuronoiprimiadescriverelasintesichimicadiunglucosinolato.

3

Nellepianteiglucosinolatisonobiosintetizzatidagliamminoacidi.3

Figura4.BiosintesidiGLseazionedellaMirosinasi

3B.A.HalkierandJ.Gershenzon,Annu.Rev.PlantBiol.,2006,57,303‐333.

4

Uno dei passaggi critici di questa biosintesi è la formazione del legame S‐glicosidico,catalizzatodallaS‐glucosiltransferase(S‐UGT).LaMirosinasi invece idrolizza tale legame causando la scissione del glucosinolato. Daquestascissionesiformanocomposticheagisconodadifesanaturaledellapiantaperchétossici per batteri e insetti.4 Inoltre l’interesse in questi prodotti di scissione, benconosciutidadecenni,ècresciutarecentementegrazieallaloroazionechemiopreventivaversoilcancroemalattiecardiovascolarioneurologiche.5S‐GLUCOSILTRANSFERASE(S‐UGT)La S‐glucosiltransferase appartiene alla famiglia delle glicosiltransferasi (GTs), enzimiresponsabilidella formazionedi legamiglicosidiciechecatalizzano il trasferimentodiunozuccheroattivo(“donatore”)versounamolecolaaccettatrice(“accettore”).Questareazioneequivaleaunasostituzionenucleofila.

Figura5.AzionedelleGTsLo zucchero donatore può essere uno zucchero‐nucleotide mono o difosfato mentrel’accettorepuòessereanch’essounozucchero,ounlipideounamolecolapiùpiccola.6Leglicosiltransferasisonoclassificateinduefamiglie,AeBasecondadellalorostruttura.Ogni famigliaèpoidivisa induesottocategoriechesidifferenzianoasecondadel loromeccanismodiformazionedellegameglicosidico.Comegiàdetto,lareazionecatalizzatadalle GTs è una sostituzione nucleofila che può avvenire attraverso inversione oritenzionediconfigurazionedelcarbonioanomericodellozuccherodonatore.Selozuccherodonatoreèl’UDP‐‐glucosio,ilprodottodellareazionesarà,nelcasodiinversione,un‐glucoside,mentrenelcasodiritenzione,un‐glucoside.4F.S.Hanschen,E.Lamy,M.Schreiner,S.Rohn,Angew.Chem.,Int.Ed.,2014,53,11430‐11450.5A.T.Dinkova‐KostovaandR.V.Kostov,TrendsMol.Med.,2012,18,337‐347.6Coutinho,P.M.;Deleury,E.;Davies,G.J.;Henrissat,B.J.Mol.Biol.2003,328,307‐317.

5

Siriportailmeccanismodiinversionediconfigurazione.7

Figura 6. Meccanismo di formazione del legame glicosidico con inversione diconfigurazionealcarbonioanomerico.LaS‐glucosiltransferaseappartieneallafamigliaGT‐Beagiscesecondounmeccanismodiinversione di configurazione. Ha un ruolo fondamentale nella formazione deiglucosinolati perché permette la formazione del legame S‐glicosidico tra il carbonioanomerico dell’ UDP‐‐glucopiranosile (UDP‐Glc) e l’atomo di zolfo dell’acidotioidrossamico.

Figura7.

7Breton,C.;Fournel‐Gigleux,S.;Palcic,M.M.Curr.Opin.Struc.Biol.2012,22,540‐549

6

MIROSINASILaMirosinasiètraipochienzimicapacidiidrolizzareilegamitioglicosidiciel’unicoingradodiidrolizzareiglucosinolati.LaMirosinasieiGLssonoimmagazzinatiindiversepartidellapianta,specialmenteneisemi.Quandounapiantaèdanneggiataomasticataeingerita avviene quella che è chiamata “mustard oil bomb”, ossia l’enzima idrolizza ilglucosinolatoinunavarietàdicompostifondamentaliperladifesadellapiantaeperlasalute dell’uomo.8 L’enzima è stato isolato e caratterizzato da diverse fonti come ilcrescione,lasenapegiallaequellabianca;esistonodiversestrutturediquestoenzima,anchenellastessapianta.2

Figura8.StrutturadellaMirosinasiL’idrolisicausalascissionedelglucosinolatoinunamolecoladiglucosioeunamolecolaportante la funzione Z‐tioidrossimata O‐solfatata; quest’ultima subisce quello che èchiamato“Lossenlikerearrangement”dacuisigeneranogliisotiocianati.

8Bones,M.;Rossitier,J.T.,Phytochemistry,2006,67,1053‐1067.

7

Figura9.IdrolisidelGLsAndandoavariarelastrutturadiogniglucosinolatoolecondizionidireazioneèpossibileotteneresvariatemolecoletracuiinitrili,itiocianati,gliepitionitrili,gliossazolidintioni,oltreaipiùcomuniisotiocianati.9

Figura10.UnitàstrutturaliottenibiliperazionedellaMirosinasiTutte queste molecole agiscono come difesa della pianta e possiedono proprietàanticancerogene.4,5

9Agerbirk,N.;Olsen,C.E.,Phytochemistry,2012,77,16‐45

8

OBBIETTIVODELPROGETTOIlgruppodiricercapressocuihosvoltoilmiolavoroditesihalavoratosullasintesideitioidrossimati,composticontenentilafunzionalitàZ‐tioidrossimata.

Figura11.SchemageneralediunoZ‐tioidrossimatoI tioidrossimati sonodegliottimi inibitoridellaS‐glucosiltransferaseedi conseguenzarisultanofondamentalinellostudiodelmeccanismodiazionedell’enzima.L’obbiettivodellavoroquindièstatalasintesididiversitipiditioidrossimatiusaticomeinibitori e come punto di partenza per la sintesi di isotiocianati, via “Lossen likerearrangement”,ediaciditioidrossamici,viaeliminazioneepoiacidificazione.

Figura12.Obbiettivodellavoroditesi

9

I tioidrossimati che si trovano in natura sono i glucosinolati (GLs) che, come dettoprecedentemente, si trovano nelle piante e presentano una unità ‐D‐glucopiranosilelegataall’atomodizolfo.AdifferenzadeiGLschesonobiosintetizzatiapartiredagliamminoacidi,itioidrossimatidi cuimi sonooccupato sono stati tutti sintetizzati in laboratoriopartendoda cinquediverse aldeidi. Queste, attraverso opportuni passaggi, sono state convertite nellecorrispondentiossimeefattereagireconilmetilN‐acetilcisteinato,esteredella(L)‐N‐acetilcisteina,alfinediottenerelafunzionetioidrossimata.

Figura13.Schemaretrosinteticodelprogetto

10

RISULTATIEDISCUSSIONEFORMAZIONEDELLEOSSIMELeossime2a‐esonostateottenutedallecorrispondentialdeidi1a‐etramitereazioneconclorurodiidrossilammonioinsoluzionediacquaeMeOH.Afinereazioneilmetanoloèstatoallontanatoelafaseacquosaèstataestrattapiùvolteconetilacetato.Dall’analisi1H‐NMR del grezzo di reazione, si è osservato che la purificazionemediante colonnacromatograficanoneranecessaria.Lereseottenutesonostatemoltobuone(Tabella1).Tabella1.Sintesidelleossime2

Aldeide Resain2(%) E/Z1a

2a76

16/84

1b

2b93

53/47

1c

2c88

54/46

1d

2d90

/

1e

2e98

/

11

LeossimesonostateottenutecomemisceladeidueisomeriEeZedilrapportoE/Zèstato determinato dall’analisi 1H‐NMR ove possibile. L’isomero E presenta il segnalerelativoalprotoneimminicoappmmaggioripoichéinquestoisomeroquestoprotonerisultapiùdeschermatodall’ossigenodelgruppoossidrilicosull’azoto.ESTERIFICAZIONEDELLA(L)‐N‐ACETILCISTEINA

Schema1.EsterificazionedellacisteinaL’acetilcisteina 3 è un derivato acetilato dell’amminoacido cisteina; questa è statasottoposta a esterificazione al fine di ottenere il metil N‐acetil cisteinato 4 chesuccessivamenteèstatofattoreagireconleossimeperdareitioidrossimati.L’(L)‐N‐acetilcisteinaèstatasolubilizzatainMeOHanidro,cheagiscesiadasolventecheda reagente, e poi è stato aggiunto il tionil cloruro. La miscela di reazione è statamantenutasottoatmosferadiArgoneiltempodireazioneèstatoditreoredurantelequalisièmonitoratalaformazionedell’esteredesideratoviaTLC.Comeperleossime,ancheinquestocasoèstatafattal’analisi1H‐NMRdelgrezzodireazionechehamostratouna buona purezza del prodotto. Perciò la purificazione via colonna cromatografica èstataritenutanonnecessaria.Laresadellareazioneèstatadel54%.

12

FORMAZIONEDELTIOIDROSSIMATOPerottenerelafunzioneZ‐tioidrossimatasièseguitounprocedimento,precedentementesviluppatodallaboratorioperlasintesideiglucosinolati,10checonsisteinunasintesione‐potincuiprimasieffettualaclorurazionedell’ossima2conN‐clorosuccinimide(NCS)adarel’idrossimoilcloruro,poiquest’ultimoèfattoreagireconilmetilN‐acetilcisteinato4dacuisigenerailtioidrossimato.

Schema2.SintesidegliZ‐tioidrossimatiL’ossima2èsolubilizzatainDMFanidro;siaggiungeNCSa0°Cepoisilasciainagitazioneper7hatemperaturaambiente.LareazioneèmantenutasottoatmosferadiArgoneilpalloneavvoltodacartastagnolaperproteggerelamisceladireazionedallaluce.Dopole7h la miscela è raffreddata di nuovo a 0°C utilizzando un bagno di ghiaccio e vieneaggiuntol’estere4precedentementesintetizzatoeunabase,laNEt3,lentamente.Silasciainagitazionepertuttalanotte.Il giorno dopo si verifica la fine della reazione mediante TLC. Per confermare laformazionedelprodottovoluto,sièprocedutoall’analisi1H‐NMRdelgrezzodireazione.Dall’analisi risulta la presenza sia del prodotto che di impurezze, quindi si esegue lacolonnacromatografica.Lereseneicinquetioidrossimati5varianodal50all’80%.Nelloschema4siriportal’ipoteticomeccanismodellareazione.

10Rollin,P.;Tatibouet,A.C.R.Chim.2011,14,194‐210

13

Schema3.MeccanismodireazioneipotizzatoperlasintesidegliZ‐tioidrossimati Inizialmentel’ossimavienecloruratadallaNCSperformareilcorrispondenteidrossimoilclorurochesuccessivamentevienedeprotonatoedeliminaclorurogenerandol’ossidodinitrile,10ilqualereagendoconlafunzionetioliticapresentesulderivatocisteinicoportaal tioidrossimato. Entrambe le reazioni per ottenere l’idrossimoil cloruro e iltioidrossimato passano attraverso lo stesso intermedio nitrilico con perdita dellaconfigurazioneEoZdell’ossima/idrossimoilcloruro.Nonostantelereseottenutefosseroabbastanzabuone,itempidireazionetroppolunghi,l’alto numero di passaggi e l’eccessiva quantità di estere della cisteina4 richiesta dalprocessohannoportatoaprendereinconsiderazioneunaviadisintesialternativachepermettesseunusopiùmoderatodicisteinaesoprattuttotempidireazionepiùbrevi.Ilmetodoalternativoscelto,giàsviluppatoeutilizzatoinprecedenzadallaboratoriodiricerca nella sintesi dei glucosinolati, è un metodo semplice e comodo basato sullaformazione in situ dell’intermedio idrossimoil cloruro utilizzando una semplice edeconomicasoluzionediipoclorito.11

Schema4.SecondaprocedurasinteticapropostapergliZ‐tioidrossimati5

11SusanE.Cobb,KateF.Morgan,NigelP.Botting.TetrahedronLetters,2011,52,1605‐1607

14

Leossime2sonodisciolteindiclorometanoeintrodotteinunimbutoseparatoreacuisiaggiungelasoluzionediipoclorito.Lasoluzionebifasicavieneagitataperqualcheminutoesinotalosviluppodiuncolorebludellasoluzionedovutoallapresenzadell’intermedioC‐nitroso.12 La fase organica viene poi fatta gocciolare in una soluzione di un soloequivalente di metil cisteinato 4 in diclorometano a cui viene aggiunta per ultima elentamente la trietilammina, così da permettere la formazione dell’ossido di nitrile. Iltutto è poi lasciato in agitazione per 3h sotto atmosfera di Argon, monitorandol’avanzamento della reazione via TLC. A fine reazione si esegue l’analisi 1H‐NMR delgrezzodireazioneelapurificazionedelprodottoviacolonnacromatografica;leresefinalivannodal50all’80%.Confrontando i due processi, l’ultimo si è dimostratomigliore soprattutto per quantoriguardailtempodireazione.I tioidrossimati5 cosìpreparatisonostatisottopostiaprocessidisolfatazioneebeta‐eliminazione,beta‐eliminazioneeacidificazioneal finediottenere isotiocianatieaciditioidrossamici.

12Gil,V.;MacLeod,A.J.Tetrahedron1980,36,779‐783.

15

SOLFATAZIONEDEITIOIDROSSIMATI

Schema5.SolfatazionedeitioidrossimatiIl tioidrossimato 5 viene solfatato sull’ossigeno dell’ossidrile della funzionetioidrossimata (O‐sulfation) per reazione con il complesso zolfo triossido piridina(PyrSO3) seguito, senza alcuna purificazione intermedia, da uno scambio di cationepotassioutilizzandoKHCO3.13Diseguitosiriportailmeccanismodireazione.

Schema6.Meccanismodireazioneipotizzatoperlasolfatazione13Bourderioux,A.;Lefoix,M.;Gueyrard,D.;Tatibouet,A.;Cottaz,S.;Artz,S.;Burmeisterd,W.P.;Rollin,P.Org.Biomol.Chem.2005,3,1872‐1879

16

Loscopodella solfatazioneèquellodi rendere l’ossidrile sull’azotounmigliorgruppouscentecosìdapermettere,attraversolaBeta‐elimination,il“Lossenlikerearrangement”performaregliisotiocianati.10

Schema7.Processoperl’ottenimentodegliisotiocianatiL’interoprocessodisolfatazionesièdimostratoalquantocomplessopertuttiecinqueitioidrossimati di partenza, in particolare per5d derivante dalla benzaldeide e per5ederivantedallanaftaldeide.Il protocollo seguito per la solfatazione è lo stesso utilizzato per i glucosinolati: iltioidrossimato(1eq)èstatosolubilizzatoinacetonitrileepoifattoreagireconPyrSO3(5eq) per 1h a 50°C sotto atmosfera di Argon. Il tutto è poi stato posto in un bagno dighiaccio,sièaggiuntaunasoluzioneacquosadiKHCO3(5eq)einfinelamiscelaèstatalasciatainagitazioneatemperaturaambienteper30/40minuti.I primi tre tioidrossimati sottoposti a questo protocollo di reazione sono stati quelliderivantidall’eptanale1a,dallafenilacetaldeide1bedallafenilpropanale1c.Primadellapurificazioneèstataeffettuatal’analisi1H‐NMRdelgrezzodireazioneeintuttietreicasisiènotatalapresenzadeimedesimitresegnalicollocatinell’intervallotra8 e 9 ppm. Si è pensato che si riferissero al complessodi zolfo triossidopiridinanonreagitooalloionepiridiniorimastolegatoallafunzionesolfatataacausadelnonavvenutoscambio con il catione potassio o alla piridina formatasi dallo scambio del cationepotassio.Dopo questa prima analisi è stata fatta anche una TLC dove sono state osservate tremacchie.Ilgrezzoèstatopoipurificatoviacolonnacromatografica.Suitrecompostieluitidallacolonnasièeseguital’analisi1H‐NMR.Lospettrodelprodottosolfatato, il secondoadessereeluito,nonpresentaalcun segnale tragli8e i9ppmenemmenoquellorelativoalprotoneossidrilicodellafunzionetioidrossimataaprovadelfattochelasolfatazioneèavvenuta,comeconfermatoanchedallaspettrometriadimassa.Perquantoriguarda lealtredue frazionieluitedallacolonna, laprima(Rfmaggiore)èsimilealprodotto,mentrelaterza(Rfminore),mostrai3segnalitragli8ei9ppmealtrirelativiadaltreimpurezze.Lereseneiprodottidesideratinonsonostatealte,trail40eil60%.Sièipotizzatochelacausadiciòfosseuntempodireazionetroppobrevedanonpermettereallasolfatazione

17

digiungereacompletezzaocheilprodottosubissedegradazionedurantelareazionee/oquandoeluitoincolonna.Entrambeleipotesispiegherebberoilperchèdelcompostoilcuispettroèsimileaquellodelprodotto.Conglialtriduetioidrossimatisiècercatoquindidirisolvere ilproblemaandandoadapportaremodificheallaprocedurautilizzata.Partendo dal tioidrossimato 5d derivante benzaldeide, è stato cambiato il tempo direazioneda1ha18h(Tabella2,prova2).DallaTLCèrisultataunaquartamacchiaoltrealle tre già viste nei tre casi precedenti. Il confronto con la TLC della tioidrossima dipartenzahaportatoallaconclusionechequestasiadireagentenonreagito.Tuttequestemacchie rimangono anche dopo l’aggiunta della soluzione di KHCO3 prima dellapurificazione.Laresanelprodottodesiderato6dèstatadel34%.Tabella2.

Prova PyrSO3(eq)

KHCO3(eq)

Tempoa Resa(%)1) 2)

1 5 5 1h 30min 10

2 5 5 18h 30min 34

3 10 20 18h 30min 42

4 10 20b 8h 18h 11

5 5 5 3h 40min 7a:iltempo1siriferisceallareazionedisolfatazione,iltempo2allareazionediscambio.b:KHCO3aggiuntocomesolidoL’aumentodeltempodireazionehaportatoadunpeggioramento:iltioidrossimatononhamostratoelevatareattivitàedinoltreilprodotto6d,moltoprobabilmente,sidegradarestandotroppotemponellamisceladireazione.Vainoltrericordatochel’eluizioneincolonnapuòessereanch’essacausadidegradazione.Nonostante questo risultato, si è provato a spingere ancora di più la reazione disolfatazione aumentando a 10 il numero di equivalenti di PyrSO3 e a 20 il numero di

18

equivalenti di KHCO3 per forzare lo scambio di catione potassio (Tabella 2, prova 3)portandoadunaresaleggermentesuperiore(42%)anchesenonancorasoddisfacente.Lealtrevariazioninonhannoinveceportatoadalcunmiglioramento(Tabella2,prove4e5).Ancheperiltioidrossimato5ederivantedallanaftaldeidesonostatefattediverseprove(Tabella3).Tabella3.

Prova PyrSO3(eq)

KHCO3(eq)

Tempoa Resa(%)1) 2)

1 5 5.5 1h 30min 40

2 10 20 18h 30min 60

3 5 5b 3h30min 18h 54

4 5 5 4h30min 40min 27

a:iltempo1siriferisceallareazionedisolfatazione,iltempo2allareazionediscambio.b:KHCO3aggiuntocomesolidoDallatabellasinotacomeinquestocasolaresapiùsoddisfacenteèstataottenutaconlecondizionidescritteinprova2.

19

Alcunediquestemodifiche,comel’aumentodeltempodireazione,sonostateapplicatealtioidrossimato5cderivantedallafenilpropanaleesiènotatounmiglioramentodellaresacheèsalitaal68%.

Schema8.Perconcludere,nonostanteletanteprovefatte,nonsièancoracompresoqualisianolecondizionidi reazionemigliori per arrivare aunabuona resanelprodotto solfatato esoprattuttononèstatopossibiletrovareunacondizionechefossegeneraleedapplicabileatuttiisubstrati.Altrecondizioni(10equivalentidiPyrSO3e20diKHCO3,macontempidireazioneridotti)devonoessereancoratestate.

20

ISOTIOCIANATIDALLABETA‐ELIMINATIONSUITIOIDROSSIMATISOLFATATILaBeta‐eliminationnonèaltrochel’estrazione,permezzodiunabase,delprotonechesitrovainposizionealcarboniledelgruppocarbossilato.Unabasemedioforteèingradodistrapparequestoprotonecausandocosìunascissionedeltioidrossimatosolfatatoindue molecole più piccole. Di queste due, quella avente la funzione tioidrossimata O‐solfatata subisce il “Lossen like rearrangement”. Dal riarrangiamento si forma ilcorrispondenteisotiocianato.Errore.Ilsegnalibrononèdefinito.

Schema9.LareazionedieliminazioneèstatacondottasultioidrossimatoO‐solfatato6eelabaseutilizzata è stata il tert‐butilato di potassio, abbastanza forte da poter deprotonare ilprotoneinα.La base (1 eq) è stata aggiunta al tioidrossimato O‐solfatato sciolto in THF anidro,successivamente sono stati aggiunti etantiolo (1 eq) e NEt3 (3 eq). Il tutto è statomantenutoinagitazioneatemperaturaambienteesottoatmosferadiargon.

Schema10.

21

L’etantiolo agisce da nucleofilo attaccando il carbonio dell’isotiocianato; lo scopo èottenereunprodottofinalechesiapiùsemplicedaidentificareall’NMRedacuisipossarisalireallaformazioneeffettivadell’isotiocianato.

Schema11.La prima volta la miscela di reazione è stata lasciata in agitazione per 3h circa,monitorandol’avanzamentodellareazioneviaTLC.NellaprimaTLC,insiemealprodottosono state osservate anche tracce di tioidrossimato O‐solfatato. Nella seconda TLC,effettuatadopo1.5hdallaprima,ilreagentedipartenzaèancorapresente.Nonostantel’eliminazionenonsiastataottimale,sièpassatiallaseparazionemediantecolonnacromatografica.Dallospettro1H‐NMRdelprodottoisolatoèstatopossibileidentificareiprotoniaromaticidelnaftalenedaisegnalipresentitrai7.5egli8.25ppm,mentrenonsonostatiosservatiiprotonidelgruppotioammidicoedell’etile.Probabilmentelareazionediaddizionenucleofilanonèandataabuonfineequindisièisolatol’isotiocianatoconunaresadel39%.Nellasecondaprovasièaumentatoilnumerodiaggiunteediequivalentiditert‐butilatodipotassioedietantiolocosìdadareunamaggiorespintaallareazionedieliminazioneediaddizione;siètralasciatal’aggiuntadiNEt3.Sièiniziatocon1equivalentedibaseedopo30minutisièfattaunaTLCdacuièrisultato,oltrealprodotto,iltioidrossimatoO‐solfatatodipartenza.Sonostatiquindiaggiuntialtri3equivalentidibasee2dietantiolo;lamisceladireazioneèstatalasciatainagitazioneperlanotte.IlsuccessivocontrolloTLChamostratolapresenzadelreagentedipartenzaequindièstataeffettuataun’ultimaaggiuntadi3equivalentidibasee2dietantiolo.Dopo30minuti,lareazioneèstatafermataeilgrezzoèstatopurificatotramitecolonnacromatografica.Ancheinquestocasoèstatoperòisolatosolol’isotiocianatoconunaresadel13%.In conclusione, la sintesidegli isotiocianati è risultataper ilmomento insoddisfacenteperchènonostantelemodifichefatte,leresesonostatetroppobasse.Ulterioriproveandrannoeffettuateperverificarelafattibilitàdellasintesiproposta.

22

ACIDITIOIDROSSAMICIDAITIOIDROSSIMATILa reazione tra una base e il tioidrossimato promuove la Beta‐elimination da cui sigeneranoduemolecole.LamolecolaportantelafunzioneZ‐tioidrossimatanonsubisceil“Lossenlikerearrangement”,maanzigenerailsaledell’acidotioidrossamico.

Schema12.Come nella sintesi degli isotiocianati, anche qui la base utilizzata è il tert‐butilato dipotassio che reagendo con il tioidrossimatoporta alla formazionedel saledi potassiodell’acidotioidrossamico.

Schema13.Ilsaleformatovienepoiprotonatocosìdadarel’acidotioidrossamico.

Schema14.

23

Labaseèaggiuntadasubitoineccesso(3eq)altioidrossimato(1eq),solubilizzatoinTHF,cosìdaforzarelabeta‐elimination.Lamisceladireazioneèpoilasciatainagitazionesottoatmosferadiargoneatemperaturaambientepertuttalanotte;ilgiornodoposièeseguitaunaTLCchehamostratol’assenzadelprodottodipartenza.Lareazioneèstataquindilavorataedhafornitounsolidogiallomoltoumidocheèstatoliofilizzato:ilsolidoèstatosolubilizzatoinunopportunosolvente(nelnostrocasoacqua),lasoluzioneèstatacongelatainunbagnodiacetoneeghiaccioseccoequindipostasottoaltovuotoperunanotteinteracosìdapermetterelasublimazionedelsolvente.Successivamenteilsolidoseccoèstatopurificatoutilizzandounacolonnacromatograficaafaseinversa(RevelerisC‐18reversedphase).Adifferenzadellecomunicolonnecromatograficheabasedisilice,questotipodicolonnahacomefasestazionariasilicealchilataconcatenealchilicheC‐18.Lacolonnavieneeluitainmodoautomaticodallostrumentomostratoinfigura.

Ledimensionidellacolonnaedelleprovettevarianoasecondadellaquantitàdigrezzodireazionedapurificare.Perilsaledell’acidotioidrossamico,lafasemobileimpiegataèstatainizialmenteMeOH,successivamentemiscelediMeOHeH2O,aumentandoprogressivamente laquantitàdiH2Ofinoadarrivareal100%diH2O.Durante la separazione, tutte le impurezze sono state eluite per primementre il saledell’acidoèstatoeluitoperultimo.Lareazioneèstatainizialmentetestatasuiderivati5be5c(Schema15).L’analisi1H‐NMRe la spettroscopia di massa effettuate hanno confermato la loro formazione e la

24

cromatografiasufaseinversahafornitoiprodotticonunapurezzamoltoelevata.Leresepurtroppononsonostatesoddisfacenti.

Schema15.Ottenutiisali,l’acidificazioneadacidotioidrossamicoèstatafattasolosulsale7c.Peracidificareèstatausataunasoluzione0.5MdiHCl,acuièstatoaggiuntoDCMeil7c.Iltuttoèstatolasciatoinagitazioneper30minutiatemperaturaambienteeilgrezzoèstatopoipurificatoviacolonnacromatografica.Ilprodottoottenutodopolacromatografianonèperòrisultatoesserel’acidodesiderato,mailcorrispondenteisotiocianato.

Schema16.La soluzione di HCl utilizzata forse era troppo concentrata e può aver causato ladegradazione del prodotto, quindi si è deciso di ripetere la reazione riducendo laconcentrazionedellasoluzionediHCla0.2Meaumentandoiltempodireazionea1h,maancheinquestocasol’acidodesideratononèstatoisolato.

25

CONCLUSIONIEPROSPETTIVEIl fulcro del lavoro è stata la sintesi di cinquediversi tioidrossimati.Questi sono statiottenuti facendo reagire cinqueossime ciascuna con ilmetilN‐acetil cisteinato, formaesterificatadell’(L)‐N‐acetilcisteina.

I tioidrossimati sono stati poi utilizzati come punto di partenza per ottenere gliisotiocianati e gli acidi tioidrossamici attraversoprocessi di solfatazione‐eliminazione,eliminazione‐acidificazione.

26

La sintesi dei tioidrossimati è stata eseguita inizialmente utilizzando la N‐

clorosuccinimide.Lereseottenutesonostatebuone,mal’altonumerodipassaggi,l’eccessivaquantitàdimetilN‐acetil cisteinato richiestae, soprattutto, tempidireazione troppo lunghihannoportatoa cercareunaviadi sintesimigliore.Sièdeciso quindi di provare con una procedura, già impiegata dal laboratorio diricercanellasintesideiglucosinolati,cheutilizzalacandeggina.Taleprocedurasièrivelatapiùsemplice,hapermessodiridurredrasticamenteiltempodireazionecosìcomelaquantitàdimetilN‐acetilcisteinatoehaportatoadellebuonerese.

Perlasolfatazionedeitioidrossimati,sièseguitalastessaprocedurautilizzataperi glucosinolati, ma le rese sono risultate troppo basse. Si è deciso quindi diapportaremodifichealprocessoalfinediarrivareadunmiglioramentonellerese.Qualche miglioramento è stato raggiunto, anche se il processo è ancora daottimizzare.

La reazione di eliminazione per fornire isotiocianati eseguita su un solo

tioidrossimatoO‐solfatatoèrisultatainsoddisfacente.Dall’analisiNMRrisultalaformazionedelprodotto,maleresesonotroppobasse.Sonostatefattemodifichealprocessodisintesi,maquestehannoportatoaunpeggioramentopiuttostocheaunmiglioramentodellaresa.

Dallareazionedieliminazionesuitioidrossimatisisonoottenutiicorrispettivisali

conelevatapurezza,mapurtroppoleresenonsonostatesoddisfacenti.Ilprocessodisintesirichiedemodifiche.

L’acidificazionedeisalideitioidrossimatiadaciditioidrossamicinonhaportatoaiprodottidesiderati.Ancheinquestocasosisonoapportatemodifichealprocessocheperoranonhannoportatoalmiglioramentosperato.

Infuturosarànecessario

Migliorareulteriormenteilprocessodisolfatazionedeitioidrossimati;

Provarecondizionidifferentiperintrappolaregliisotiocianati;

Riguardareilprocessodisintesideisalideitioidrossimati;

Riguardarecompletamenteilmetododisintesidegliaciditioidrossamici.

27

PARTESPERIMENTALE

OSSIMEEptanalossima(2a)L’eptanale1a(1eq,5.00g,6ml,44mmol)èdiscioltainunamiscela1:1diH2O/MeOH(60ml).Aquestasoluzionevieneaggiuntoilclorurodiidrossilammonio(1.1eq,3.36g,48.4mmol).SuccessivamentesiversaunasoluzioneacquosadiNa2CO3(0.5eq,2.33g,22mmol,30ml)nellamisceladireazioneepoisilasciainagitazioneper3oreatemperaturaambiente.SiallontanailMeOHalrotavaporesiestraelafaseacquosaconEtOAc(3×45ml).Siraccoglietuttalafaseorganicachevienelavataconunasoluzioneacquosasaturadi NaCl (2 × 45 ml), anidrificata con MgSO4 e infine concentrata al rotavapor a darel’ossimasottoformadisolidocristallinoincoloreconunaresadel75%(4,27g).QuestasipresentacomemisceladeiduediastereoisomeriEeZconunrapportoE/Zdi16/84.

1HNMR(250MHz,Chloroform‐d)δ(ppm):9.05(s,1H,OH),7.42(t,J=6.1Hz,1H,H1E),6.72(t,J=5.4Hz,1H,H1Z),2.44–2.32(m,2H,CH22Z),2.20(q,J=6.8Hz,2H,CH22E),1.47(q,J=7.4,6.9Hz,2H,CH23Z),1.30(s,6H,CH24,5,6),0.88(t,J=6.1Hz,3H,CH37Z)HRMS(ESI⁺):m/zcalculatedforC7H16NO([M+H]⁺)=130,122490,found:130,122641HRMS(ESI¯):m/zcalculatedforC7H14NO([M]¯)=128,108102,found:128,108088

28

2‐fenilacetaldeideossima(2b)La2‐fenilacetaldeide1b(1eq,4g,33.3mmol)èdiscioltainunamiscela1:1diH2O/MeOH(44ml).Aquestasoluzionevieneaggiuntoilclorurodiidrossilammonio(1.1eq,2.54g,36.63mmol).SuccessivamentesiversaunasoluzioneacquosadiNa2CO3(0.5eq,1.76g,16.65 mmol, 22ml) nella miscela di reazione e si lascia in agitazione per 3 ore atemperaturaambiente.SiallontanaquindiilMeOHalrotavaporesiestraelafaseacquosaconEtOAc(3×34ml).Siraccoglietuttalafaseorganicachevienelavataconunasoluzioneacquosa satura di NaCl (2 × 34 ml), anidrificata con MgSO4 e infine concentrata alrotavapor a dare l’ossima sotto forma di solido giallo con una resa del 93% (4.21 g).QuestasipresentacomemisceladeiduediastereoisomeriEeZconunrapportoE/Zdi53/47.

1HNMR(400MHz,Chloroform‐d)δ(ppm):8.86(s,1H,OHE+Z),7.53(t,J=6.3Hz,1H,H1E),7.31(m,5H,HAr),7.22(m,5H,HAr),6.89(t,J=5.3Hz,1H,H1Z),3.74(d,J=5.3Hz,2H,H2Z),3.53(d,J=6.3Hz,2H,H2E).13CNMR(101MHz,Chloroform‐d)δ(ppm):150.81(C‐1Z),150.63(C‐1E),136.68(CqArEorZ),136.11(CqArZorE),128.86(CAr),128.83(CAr),128.78(CAr),128.77(CAr),126.91(CAr),126.70(CAr),35.95(C‐2E),31.75(C‐2Z).HRMS(ESI⁺):m/zcalculatedforC8H10NO([M+H]⁺)=136,075446,found:136,075690HRMS(ESI¯):m/zcalculatedforC8H8NO([M]¯)=134,061165,found:134,061137

29

3‐fenilpropanaleossima(2c)Il3‐fenilpropanale1c(1eq,4.01g,30mmol)èdiscioltainunamiscela1:1diH2O/MeOH(40ml).Aquestasoluzionevieneaggiuntoilclorurodiidrossilammonio(1.1eq,2.30g,33mmol).SuccessivamentesiversaunasoluzioneacquosadiNa2CO3(0.5eq,1.60g,15mmol,20ml)nellamisceladireazioneesilasciainagitazioneper3oreatemperaturaambiente.SiallontanailMeOHalrotavaporesiestraelafaseacquosaconEtOAc(3×30ml).Siraccoglietuttalafaseorganicachevienelavataconunasoluzioneacquosasaturadi NaCl (2 × 30 ml), anidrificata con MgSO4 e infine concentrata al rotavapor a darel’ossimasottoformadicristallibianchiconunaresadell’88%(3.94g).QuestasipresentacomemisceladeiduediastereoisomeriEeZconunrapportoE/Zdi54/46.

1HNMR(400MHz,Chloroform‐d)δ(ppm):8.88(s,1H,OHE+Z),7.44(t,J=5.9Hz,1H,H1E),7.27(m,5H,HAr),7.18(m,5H,HAr),6.74(t,J=5.2Hz,1H,H1Z),2.79(m,4H,H3Z+E),2.74–2.65(m,2H,H2Z),2.54–2.46(m,2H,H2E).13CNMR(101MHz,Chloroform‐d)δ(ppm):151.70(C‐1Z),151.39(C‐1E),140.71(CqArEorZ),140.54(CqArZorE),128.60(CAr),128.47(CAr),128.42(CAr),128.35(CAr),126.31(CAr),125.96(CAr),32.92(C‐3ZorE),31.99(C‐3EorZ),31.26(C‐2E),26.54(C‐2Z).HRMS(ESI⁺):m/zcalculatedforC9H12NO([M+H]⁺)=150,091155,found:150,091340HRMS(ESI¯):m/zcalculatedforC9H10NO([M]¯)=148,076587,found:148,076788

30

Benzaldeideossima(2d)Labenzaldeide1d (1eq,4.00g,3.83ml,37.7mmol)èdisciolta inunamiscela1:1diH2O/MeOH(50ml).Aquestasoluzionevieneaggiuntoilclorurodiidrossilammonio(1.1eq,2.91g,41.5mmol).SuccessivamentesiversaunasoluzioneacquosadiNa2CO3(0.5eq,2.00g,18.85mmol,25ml)nellamisceladireazioneesilasciainagitazioneper3oreatemperaturaambiente.SiallontanaquindiilMeOHalrotavaporesiestraelafaseacquosaconEtOAc(3×38ml).Siraccoglietuttalafaseorganicachevienelavataconunasoluzioneacquosa satura di NaCl (2 × 38 ml), anidrificata con MgSO4 e infine concentrata alrotavaporadarel’ossimasottoformadiliquidoincoloreconunaresadell’90%(4.11g).

1HNMR(250MHz,Chloroform‐d)δ(ppm):10.21(s,1H,OH),8.18(s,1H,H1),7.59–7.50(m,2H,HAr),7.33(m,3H,HAr).HRMS(ESI⁺):m/zcalculatedforC7H8NO([M+H]⁺)=122,060223,found:122,060040HRMS(ESI¯):m/zcalculatedforC7H6NO([M]¯)=120,045400,found:120,045487

31

2‐naftaldeideossima(2e)La2‐naftaldeide1e(1eq,4.01g,25.6mmol)èdiscioltainunamiscela1:1diH2O/MeOH(34ml).Aquestasoluzionevieneaggiuntoilclorurodiidrossilammonio(1.1eq,2.02g,28.2mmol).SuccessivamentesiversaunasoluzioneacquosadiNa2CO3(0.5eq,1.36g,12.80 mmol, 18 ml) nella miscela di reazione e poi lascia in agitazione per 3 ore atemperaturaambiente.SiallontanaquindiilMeOHalrotavaporesiestraelafaseacquosaconEtOAc(3×26ml).Siraccoglietuttalafaseorganicachevienelavataconunasoluzioneacquosa satura di NaCl (2 × 26 ml), anidrificata con MgSO4 e infine concentrata alrotavaporadarel’ossimasottoformadisolidobiancoconunaresadell’96%(4.22g).

1HNMR(250MHz,Chloroform‐d)δ(ppm):10.17(s,1H,OH),8.32(s,1H,H1),7.92–7.79(m,5H,HAr),7.55–7.46(m,2H,HAr).HRMS(ESI⁺):m/zcalculatedforC11H10NO([M+H]⁺)=172,075731found:172,075690HRMS(ESI¯):m/zcalculatedforC11H8NO([M]¯)=170,061073,found:170,061137

32

METILN‐ACETILCISTEINATO(4)

L’(L)‐N‐acetilcisteina3(1eq,3.1g,19mmol)èsolubilizzatain67mldiMeOHanidro.Siaggiungequindi lentamentegocciaagoccianellasoluzioneSOCl2 (1.16eq,22.1mmol,1.61ml).Questaèpoi lasciata inagitazioneper treorea temperatureambiente sottoatmosfera di Argon. Successivamente si allontana il solvente e il residuo risultante èdiscioltoinAcOEt(52ml).LafaseorganicavienelavataconunasoluzioneacquosasaturadiNaCl(3×26ml),anidrificataconMgSO4einfineconcentrataadareilprodottofinalesottoformadisolidobiancoopacoconunaresadel54%(1.86g).

1HNMR(250MHz,Chloroform‐d)δ(ppm):6.65‐6.34(m,1H,NH),4.88(dt,J=7.8,4.2Hz,1H,H2),3.78(s,3H,H4),3.07–2.92(m,2H,H3),2.06(s,3H,H1),1.34(t,J=9.0Hz,1H,SH)

33

TIOIDROSSIMATI metil(Z)‐N‐acetil‐S‐(1‐(idrossimmino)eptil)cisteinato(5a)Inunimbutoseparatoreèaggiuntaunasoluzionedieptanalossima2a(1.8eq,1.0g,7.7mmol)inDCManidro(38ml)eunasoluzioneacquosadiNaOCl14%(3eq,5.3ml,12.9mmol). La miscela bifasica è agitata per 10 minuti e poi la fase organica è versata,attraversounfiltrodiMgSO4,inunpalloneraffreddatoa0°CcontenenteunasoluzionedimetilN‐acetilcisteinato4(1eq,0.77g,4.3mmol)inDCManidro(70ml).Siaggiungepoilatrietilammina(3eq,1.81ml,12.9mmol)esilascialamisceladireazioneinagitazioneper3hsottoatmosferadiArgon.Passateletreore,siallontanailDCMalrotavaporeilgrezzodireazioneèpurificatomediantecolonnacromatografica(eteredipetrolio/etilacetato3/7).Ilprodottofinaleèottenutosottoformadisolidobiancoconunaresadel59%(0.77g).

S

NOH

O

O

HN

O

C13H24N2O4SMW = 304,41

124

5

6

7 3'2' 1'

6'

5'4'

3

5a

1HNMR(400MHz,Chloroform‐d)δ(ppm):9.02(s,1H,OH),6.51(d,J=7.2Hz,1H,NH),4.91(m,1H,H2'),3.79(s,3H,H6'),3.48(dd,J=13.5,4.7Hz,1H,H3'a),3.38(dd,J=13.5,4.7Hz,1H,H3'b),2.43–2.37(m,2H,H2),2.05(s,3H,H5'),1.56(m,2H,H3),1.32(m,6H,H4,5,6),0.89(m,3H,H7).13CNMR(101MHz,Chloroform‐d)δ:170.4(C=O),170.2(C=O),153.7(C‐1),52.9(C‐6’),52.3(C‐2’),33.1(C‐2),31.5,31.4(C‐3’),28.6,27.2(C‐3),23.0(C‐5’),22.5,14.0(C‐7).

34

metil(Z)‐N‐acetil‐S‐(1‐(idrossimmino)‐2‐feniletil)cisteinato(5b)Inunimbutoseparatoreèaggiuntaunasoluzionedi2‐fenilacetaldeideossima2b(1.8eq,1.0g,7.4mmol)inDCManidro(40ml)eunasoluzioneacquosadiNaOCl14%(3eq,5ml,12.3mmol).Lamiscelabifasicaèagitataper10minutiepoilafaseorganicaèversata,attraversounfiltrodiMgSO4,inunpalloneraffreddatoa0°CcontenenteunasoluzionedimetilN‐acetilcisteinato4(1eq,0.73g,4.1mmol)inDCManidro(75ml).Siaggiungepoilatrietilammina(3eq,1.73ml,12.3mmol)esilascialamisceladireazioneinagitazioneper3hsottoatmosferadiArgon.Passateletreore,siallontanailDCMalrotavaporeilgrezzodireazioneèpurificatomediantecolonnacromatografica(eteredipetrolio/etilacetato2/8).Ilprodottofinaleèottenutosottoformadisolidogialloconunaresadel78%(1.0g).

S

NOH

O

O

HN

O

C14H18N2O4SMW = 310,37

21

3'2'

6'

5'4'

1'

5b

1HNMR(400MHz,Chloroform‐d)δ (ppm):8.13(s,1H,OH),7.39–7.23(m,5H,HAr),6.18(d,J=6.8Hz,1H,NH),4.76(m,1H,H2'),3.87–3.71(m,2H,H2),3.72(s,3H,H6’),3.39(dd,J=13.3,4.7Hz,1H,H3'aorb),3.21(dd,J=13.3,5.0Hz,1H,H3'bora),1.98(s,3H,H5')13CNMR(101MHz,Chloroform‐d)δ:170.34(C=O),170.03(C=O),152.73(C‐1),135.71(CqAr), 128.80 (CAr), 128.44 (CAr), 127.18 (CAr), 52.89 (C‐6’), 52.20 (C‐2’), 39.34 (C‐2),31.52(C‐3’),23.02(C‐5’).

35

metil(Z)‐N‐acetil‐S‐(1‐(idrossimmino)‐3‐fenilpropil)cisteinato(5c)Inunimbutoseparatoreèaggiuntaunasoluzionedi3‐fenilpropanaleossima2c(1.8eq,1.01g,6.7mmol)inDCManidro(34ml)eunasoluzioneacquosadiNaOCl14%(3eq,4.6ml,11.1mmol).Lamiscelabifasicaèagitataper10minutiepoilafaseorganicaèversata,attraversounfiltrodiMgSO4,inunpalloneraffreddatoa0°CcontenenteunasoluzionedimetilN‐acetilcisteinato4(1eq,0.66g,3.7mmol)inDCManidro(68ml).Siaggiungepoilatrietilammina(3eq,1.56ml,11.1mmol)esilascialamisceladireazioneinagitazioneper3hsottoatmosferadiArgon.Passateletreore,siallontanailDCMalrotavaporeilgrezzodireazioneèpurificatomediantecolonnacromatografica(eteredipetrolio/etilacetato2/8).Ilprodottofinaleèottenutosottoformadisolidobiancoconunaresadel80%(0.97g).

S

NOH

O

O

HN

O

C15H20N2O4SMW = 324,40

3

21

3'2'

1'

6'

5'4'

5c

1HNMR(400MHz,Chloroform‐d)δ(ppm):8.68(s,1H,OH),7.35–7.16(m,5H,HAr),6.42(d,J=7.2Hz,1H,NH),4.90(m,1H,H2'),3.77(s,3H,H6'),3.51(dd,J=13.5,4.7Hz,1H,H3'aorb),3.37(dd,J=13.5,4.8Hz,1H,H3'bora),2.89(m,2H,H2),2.73–2.66(m,2H,H3),2.01(s,3H,H5').13CNMR(101MHz,Chloroform‐d)δ(ppm):170.41(C=O),170.23(C=O),152.63(C‐1),140.28(CqAr),128.57(CAr),128.39(CAr),126.40(CAr),52.97(C‐6’),52.29(C‐2’),35.12(C‐3),33.46(C‐2),31.71(C‐3’),23.01(C‐5’).

36

metil(Z)‐N‐acetil‐S‐((idrossimmino)(fenil)metil)cisteinato(5d)Inunimbutoseparatoreèaggiuntaunasoluzionedibenzaldeideossima2d(1.8eq,0.6g,5.0mmol)inDCManidro(25ml)eunasoluzioneacquosadiNaOCl14%(3eq,3.4ml,8.4mmol). La miscela bifasica è agitata per 10 minuti e poi la fase organica è versata,attraversounfiltrodiMgSO4,inunpalloneraffreddatoa0°CcontenenteunasoluzionedimetilN‐acetilcisteinato4(1eq,0.5g,2.8mmol)inDCManidro(50ml).Siaggiungepoilatrietilammina(3eq,1.16ml,8.4mmol)esilascialamisceladireazioneinagitazioneper3hsottoatmosferadiArgon.Passateletreore,siallontanailDCMalrotavaporeilgrezzodireazioneèpurificatomediantecolonnacromatografica(eteredipetrolio/etilacetato2/8).Ilprodottofinaleèottenutosottoformadiliquidogialloconunaresadel74%(0.62g).

1HNMR(400MHz,Chloroform‐d)δ(ppm):11.06(s,1H,OH),7.47–7.37(m,2H,HAr),7.30–7.20(m,3H,HAr),7.05(d,J=7.7Hz,1H,NH),4.58(m,1H,H2'),3.52(s,3H,H6'),3.11(dd,J=13.9,4.6Hz,1H,H3'a),3.05(dd,J=13.9,5.8Hz,1H,H3'b),1.82(s,3H,H5').13CNMR(101MHz,Chloroform‐d)δ:170.78(C=O),170.63(C=O),151.64(C‐1),133.57(CqAr), 129.58 (CAr), 128.49 (CAr), 128.46 (CAr), 52.58 (C‐6’), 52.47 (C‐2’), 33.38 (C‐3’),22.62(C‐5’).

37

metil(Z)‐N‐acetil‐S‐((idrossimmino)(naftalen‐2‐il)metil)cisteinato(5e)Inunimbutoseparatoreèaggiuntaunasoluzionedi2‐naftaldeideossima2e(1.8eq,1.0g,5.8mmol)inDCManidro(42ml)eunasoluzioneacquosadiNaOCl14%(3eq,4.0ml,9.7mmol).Lamiscelabifasicaèagitataper10minutiepoi la faseorganicaèversata,attraversounfiltrodiMgSO4,inunpalloneraffreddatoa0°CcontenenteunasoluzionedimetilN‐acetilcisteinato4(1eq,0.57g,3.2mmol)inDCManidro(59ml).Siaggiungepoilatrietilammina(3eq,1.41ml,9.64mmol)esilascialamisceladireazioneinagitazioneper3hsottoatmosferadiArgon.Passateletreore,siallontanailDCMalrotavaporeilgrezzodireazioneèpurificatomediantecolonnacromatografica(eteredipetrolio/etilacetato3/7).Ilprodottofinaleèottenutosottoformadisolidobiancoconunaresadel54%(0.61g).

1HNMR(400MHz,Chloroform‐d)δ(ppm):9.47(s,1H,OH),8.13(s,1H,HAr),7.87(m,3H,HAr),7.70(dd,J=8.6,1.7Hz,1H,HAr),7.58–7.47(m,2H,HAr),6.42(d,J=7.5Hz,1H,NH),4.83–4.75(m,1H,H2'),3.69(s,3H,H6'),3.50(dd,J=14.1,4.5Hz,1H,H3'a),3.25(dd,J=14.1,4.9Hz,1H,H3'b),1.92(s,3H,H5').13CNMR(101MHz,Chloroform‐d)δ:170.62(C=O),170.20(C=O),152.50(C‐1),133.91(Cq), 132.99 (Cq), 130.88 (Cq), 128.66 (CAr), 128.59 (CAr), 128.52 (CAr), 127.75 (CAr),127.23(CAr),126.73(CAr),125.04(CAr),52.85(C‐6’),52.64(C‐2’),34.01(C‐3’),22.95(C‐5’).

38

TIOIDROSSIMATIO‐SOLFATATIpotassio(Z)‐(1‐((2‐acetammide‐3‐metossi‐3‐ossopropil)tio)eptilidene)amminosolfato(6a)Il metil (Z)‐N‐acetil‐S‐(1‐(idrossimmino)eptil)cisteinato 5a (1 eq, 0.11 g, 0.36 mmol)viene disciolto in CH3CN (3.3ml) sotto atmosfera di Argon e poi fatto reagire con uneccessodiPyrSO3(5eq,0.28g,1.80mmol)mantenendoiltuttoinagitazionea50°C.Dopo1hlamisceladireazioneèstataraffreddataa0°CinunbagnodighiaccioesièaggiuntaunasoluzioneacquosadiKHCO3(5eq,0.18g,1.80mmol).Terminatal’aggiunta,siètoltoilbagnodighiaccio,sièlasciatalamiscelainagitazioneper30minuti.Ilsolventevienequindirimossoalrotavaporeilgrezzodireazionecosìottenutovienepurificatotramitecolonnacromatografica(metanolo/etilacetato1/9).Laresaèstatadel42%(0.064g).

1HNMR(250MHz,Acetone‐d6)δ(ppm): 7.90 (d,J=8.1Hz,1H,NH),4.75(m,1H,H2'),3.73(s,3H,H6'),3.46(dd,J=13.7,5.0Hz,1H,H3'aorb),3.31(dd,J=13.7,7.8Hz,1H,H3'bora),2.59(m,2H,H2),2.01(s,3H,H5'),1.60(m,2H,H3),1.44–1.24(m,6H,H4,5,6),0.94–0.81(m,3H,H7).HRMS(ESI¯):m/zcalculatedforC13H23N2O7S2([M]¯)=383.095979,found:383.095217

39

potassio(Z)‐(1‐((2‐acetammide‐3‐metossi‐3‐ossopropil)tio)‐2‐feniletilidene)amminosolfato(6b)Il metil (Z)‐N‐acetil‐S‐(1‐(idrossimmino)‐2‐feniletil)cisteinato 5b (1 eq, 0.10 g, 0.32mmol)vienediscioltoinCH3CN(3.2ml)sottoatmosferadiArgonepoifattoreagireconuneccessodiPyrSO3(5eq,0.25g,1.60mmol)mantenendoiltuttoinagitazionea50°C.Dopo1h lamisceladi reazioneè stata raffreddataa0°C inunbagnodi ghiaccioenelmentresièaggiuntaunasoluzioneacquosadiKHCO3(5eq,0.16g,1.60mmol).Terminatal’aggiunta,siètoltoilbagnodighiaccio,sièlasciatalamiscelainagitazioneper30minuti.Ilsolventevienequindirimossoalrotavaporeilgrezzodireazionecos’ottenutovienepurificatotramitecolonnacromatografica(metanolo/etilacetato1/9).Laresaèstatadel52%(0.072g).

1HNMR(250MHz,Acetone‐d6)δ:7.80(d,J=8.1Hz,1H,NH),7.41–7.18(m,5H,HAr),4.61(td,J=7.9,5.0Hz,1H,H2’),4.05(dd,2H,H1)3.65(s,3H,H6’),3.25(dd,J=13.7,5.1Hz,1H,H3’aorb),3.14–3.05(m,1H,H3’bora),1.97(s,3H,H5’).HRMS(ESI¯):m/zcalculatedfor([M]¯):389.04772,found:389.0491

40

potassio(Z)‐(1‐((2‐acetammide‐3‐metossi‐3‐ossopropil)tio)‐3‐fenilpropilidene)amminosolfato(6c)Ilmetil (Z)‐N‐acetil‐S‐(1‐(idrossimmino)‐3‐fenilpropil)cisteinato5c (1 eq, 0.11 g, 0.34mmol)vienediscioltoinCH3CN(3.1ml)sottoatmosferadiArgonepoifattoreagireconuneccessodiPyrSO3(5eq,0.27g,1.70mmol)mantenendoiltuttoinagitazionea50°C.Dopo1h lamisceladi reazioneè stata raffreddataa0°C inunbagnodi ghiaccioenelmentresièaggiuntaunasoluzioneacquosadiKHCO3(5eq,0.17g,1.70mmol).Terminatal’aggiunta,siètoltoilbagnodighiaccio,sièlasciatalamiscelainagitazioneper30minuti.Ilsolventevienequindirimossoalrotavaporeilgrezzodireazionecosìottenutovienepurificatotramitecolonnacromatografica(metanolo/etilacetato1/9).Laresaèstatadel53%(0.08g).

1HNMR(250MHz,Acetone‐d6)δ:7.86(d,J=8.1Hz,1H,NH),7.38–7.14(m,5H,HAr),4.76(td,J=7.9,4.8Hz,1H,H2’),3.69(s,3H,H6’),3.55–3.44(m,1H,H3’aorb),3.34(dd,J=13.6,7.8Hz,1H,H3’bora),2.99–2.77(m,4H,H2,3),1.99(s,3H,H5’).HRMS(ESI¯):m/zcalculatedforC15H19N2O7S2([M]¯)=403.064560,found:403.063917

41

potassio (Z)‐(((2‐acetammide‐3‐metossi‐3‐ossopropil)tio)(fenil)metilene)ammino solfato(6d)Ilmetil(Z)‐N‐acetil‐S‐((idrossimmino)(fenil)metil)cisteinato5d(1eq,0.11g,0.37mmol)viene disciolto in CH3CN (3.5ml) sotto atmosfera di Argon e poi fatto reagire con uneccessodiPyrSO3(5eq,0.29g,1.85mmol)mantenendoiltuttoinagitazionea50°C.Dopo18hlamisceladireazioneèstataraffreddataa0°Cinunbagnodighiaccioenelmentresiè aggiunta una soluzione acquosa di KHCO3 (5 eq, 0.18 g, 1.85 mmol). Terminatal’aggiunta,siètoltoilbagnodighiaccio,sièlasciatalamiscelainagitazioneper30minuti.Ilsolventevienequindirimossoalrotavaporeilgrezzodireazionecosìottenutovienepurificatotramitecolonnacromatografica(metanolo/etilacetato1/9).Laresaèstatadel34%(0.053g).

1HNMR(250MHz,Acetone‐d6)δ:7.75(d,J=8.2Hz,1H,NH),7.67–7.60(m,2H,HAr),7.51–7.41(m,3H,HAr),4.68–4.55(m,1H,H2’),3.63(d,J=1.7Hz,3H,H6’),3.22(dd,J=6.0,2.5Hz,2H,H3’),1.93(d,J=1.2Hz,3H,H5’).HRMS(ESI¯):m/zcalculatedforC13H15N2O7S2([M]¯)=375.033045,found:375.032616

42

potassio (Z)‐(((2‐acetammide‐3‐metossi‐3‐ossopropil)tio)(naftalen‐2‐il)metilene)amminosolfato(6e)Il metil (Z)‐N‐acetil‐S‐((idrossimmino)(naftalen‐2‐il)metil)cisteinato 5e (1 eq, 0.10 g,0.29mmol)vienediscioltoinCH3CN(3ml)sottoatmosferadiArgonepoifattoreagireconuneccessodiPyrSO3(5eq,0.23g,1.45mmol)mantenendoiltuttoinagitazionea50°C.Dopo1hlamisceladireazioneèstataraffreddataa0°CinunbagnodighiaccioenelmentresièaggiuntaunasoluzioneacquosadiKHCO3(5eq,0.14g,1.45mmol).Terminatal’aggiunta,siètoltoilbagnodighiaccio,sièlasciatalamiscelainagitazioneper30minuti.Ilsolventevienequindirimossoalrotavaporeilgrezzodireazionecosìottenutovienepurificatotramitecolonnacromatografica(metanolo/etilacetato2/8).Laresaèstatadel40%(0.055g).

1HNMR(250MHz,Acetone‐d6)δ:8.16(d,J=1.5Hz,1H,HAr),8.04–7.90(m,3H,HAr),7.71(dd,J=8.6,1.8Hz,1H,HAr),7.60–7.52(m,2H,HAr),4.68–4.55(m,1H,H2’),3.57(s,3H,H6’),3.35(dd,J=13.7,5.1Hz,1H,H3’aorb),3.19(dd,J=13.7,7.4Hz,1H,H2bora),1.94(s,3H,H5’).Il segnale del protone ammidico non è riportato perchè non chiaramente visibile inquantonascostodaiprotoniaromatici.Ilprodottoè stato caratterizzatosoloall’1H‐NMR, sononecessarieulteriori analisiperconfermarelastruttura.

43

ISOTIOCIANATI2‐isotiocianatonaftalene

Ilmetil (Z)‐N‐acetil‐S‐((idrossimmino)(naftalen‐2‐il)metil)cisteinato (1 eq,0.18g, 0.39mmol)èscioltoin2mldiTHFanidro.SonoquindiaggiuntiiltBuOK(1eq,0.044g,0.39mmol),l’etantiolo(1eq,0.39mmol,0.03ml)eperultimalaNEt3(3eq,1.17mmol,0.17ml).Lamisceladireazioneèlasciatainagitazioneper3hatemperaturaambiente,sottoatmosferadiArgon;ilgrezzodireazioneèstatopurificatotramitecolonnacromatografica(eteredipetrolio/etilacetato2/8).

1HNMR(250MHz,Chloroform‐d)δ(ppm):8.27–8.21(m,1H,HAr),7.96–7.86(m,3H,HAr),7.71–7.56(m,3H,HAr)Dall’analisi1H‐NMRrisultanosoloisegnalideiprotoniaromaticienonquellidell’etilederivante dall’etantiolo. Si è arrivati a concludere che quanto ottenuto non fosse ilprodottodellaaddizionenucleofila,mal’isotiocianato.La resa finale è stata quindi calcolata sull’isotiocianato ed è risultata essere del 39%(0.028g).

44

SALEDELL’ACIDOTIOIDROSSAMICOpotassio(Z)‐N‐idrossi‐2‐feniletanimmidetiolato(7b)IltBuOK(3eq,1.00g,8.7mmol)èaggiuntoadunasoluzionedimetil(Z)‐N‐acetil‐S‐(1‐(idrossimmino)‐2‐feniletil)cisteinato5b(1eq,0.9g,2.9mmol)inTHF(15ml).Lamisceladireazioneèlasciatainagitazioneper18hatemperaturaambienteesottoatmosferadiArgon.Sièpoiallontanatoilsolventealrotavaporeilgrezzodireazioneèstatopurificatomediante colonna cromatografica a fase inversa C‐18 (eluente metanolo/acqua)ottenendoilsaledeltioidrossimatocomesolidogialloconunaresadel20%(0.12g).

1HNMR(250MHz,Methanol‐d4)δ(ppm):7.41–7.11(m,5H,HAr),3.76(s,2H,H2).HRMS(ESI⁺):m/zcalculatedforC8H10NOS([M+H]⁺)=168,047801,found:168,047761HRMS(ESI¯):m/zcalculatedforC8H8NOS([M]¯)=166,033691,found:166,033208

45

potassio(Z)‐N‐idrossi‐3‐fenilpropanimmidetiolato(7c)IltBuOK(3eq,1.05g,9.3mmol)èaggiuntoadunasoluzionedimetil(Z)‐N‐acetil‐S‐(1‐(idrossimmino)‐3‐fenilpropil)cisteinato5c (1eq,1.05g,3.1mmol) inTHF(16ml).Lamiscela di reazione è lasciata in agitazione per 18h a temperatura ambiente e sottoatmosferadiArgon.Sièpoiallontanatoilsolventealrotavaporeilgrezzodireazioneèstato purificato mediante colonna cromatografica a fase inversa C‐18 (eluentemetanolo/acqua)ottenendoilsaledeltioidrossimatocomesolidogialloconunaresadel54%(0.37g).

1HNMR(400MHz,DeuteriumOxide)δ(ppm):7.35(m,5H,HAr),3.01(t,J=7.6Hz,2H,H2),2.73(t,J=7.6Hz,2H,H3).13CNMR(101MHz,DeuteriumOxide)δ171.17(C‐1),141.73(CqAr),128.65(CAr),128.54(CAr),126.12(CAr),41.77(C‐3),33.76(C‐2).HMRS(ESI⁺):m/zcalculatedforC9H12NOS([M+H]⁺)=182.063047,found:182.063411HRMS(ESI¯):m/zcalculatedforC9H10NO4S([M]¯)=228,033675,found:228,033602