PANNON AGRÁRTUDOMÁNYI EGYETEMGEORGIKON MEZŐGAZDASÁGTUDOMÁNYI KAR

Növénytani és Növényélettani TanszékTanszékvezető: Dr. Szabó István egyetemi tanár

Allaga József Szántóné Palánki Edit

Növényélettani gyakorlatok

KESZTHELY1997

2

Lektorálta: Dr. habil. Borbély György

biológiai tudományok kandidátusa

KLTE Természettudományi Kar

Dr. Tóth Benedek

mezőgazdasági tudományok kandidátusa

PATE Georgikon Mezőgazdaságtudományi Kar

A jegyzet az „Alapítvány a Magyar Felsőoktatásért és Kutatásért” támogatásával jött

létre.

3

TARTALOMJEGYZÉKELŐSZÓ................................................................................................................................................................. 6

LABORATÓRIUMI RENDSZABÁLYOK......................................................................................................... 7

1. PLAZMOLÍZIS VIZSGÁLATOK............................................................................................................... 9

1/A ÉLŐ ÉS ELHALT SZÖVETEK PERMEABILITÁSÁNAK VIZSGÁLATA; A KONKÁV, A KONVEX ÉS ADEPLAZMOLÍZIS TANULMÁNYOZÁSA................................................................................................................... 141/B SAPKA- ÉS TONOPLASZTPLAZMOLÍZIS VIZSGÁLATA KÁLIUMSZULFOCIANIDDAL ...................................... 151/C CA++-IONOK JELENTŐSÉGE A PLAZMOLÍZISKOR FELLÉPŐ HATÁRHÁRTYA-SÉRÜLÉSEKNÉL....................... 15

2. TRAUBE-FÉLE SEJT TANULMÁNYOZÁSA........................................................................................17

3. CITOPLAZMA-VISZKOZITÁS VIZSGÁLATA ....................................................................................18

4. NÖVÉNYI SZÖVETEK VÍZPOTENCIÁLJA (ψψψψ) ÉS ANNAK MÉRÉSE............................................ 20

4/A VÍZPOTENCIÁL MEGHATÁROZÁSÁRA ALKALMAS MÓDSZEREK ................................................................ 224/B BURGONYAGUMÓ VÍZPOTENCIÁLJÁNAK MEGHATÁROZÁSA MÉRETVÁLTOZÁS ALAPJÁN ......................... 244/C BURGONYAGUMÓ VÍZPOTENCIÁLJÁNAK MEGHATÁROZÁSA REFRAKTOMÉTERES MÉRÉSSEL ................... 26

5. NÖVÉNYI SZÖVETEK OZMOTIKUS POTENCIÁLJÁNAK (ψψψψππππ) MÉRÉSE .................................... 28

5/A OZMOTIKUS POTENCIÁL MÉRÉSÉRE ALKALMAS MÓDSZEREK.................................................................. 285/B NÖVÉNYI SZÖVETEK OZMOTIKUS POTENCIÁLJÁNAK (ψπ) MEGHATÁROZÁSA KRIOSZKÓPIÁVAL .............. 29

6. KÜLÖNBÖZŐ TÍPUSÚ NÖVÉNYEK VÍZTARTÓ KÉPESSÉGÉNEK ÖSSZEHASONLÍTÁSA .... 34

7. A KUKORICA AKTUÁLIS TELÍTETTSÉGI HIÁNYÁNAK ÉS IGÉNYBEVÉTELÉNEKMEGÁLLAPÍTÁSA............................................................................................................................................ 36

8. PROLIN-PRÓBA A VÍZHIÁNY KIMUTATÁSÁRA ............................................................................. 38

9. A SZTÓMÁK VISELKEDÉSE KÜLÖNBÖZŐ pH-ÉRTÉKŰ PUFFER OLDATOKBAN................. 40

10. SZTÓMÁK VIZSGÁLATA KOLLÓDIUMOS LEVONATON ......................................................... 42

11. VÍZKULTÚRÁS KÍSÉRLETEK ........................................................................................................... 43

11/A A VÍZKULTÚRÁS KÍSÉRLETEK ÁLTALÁNOS SZEMPONTJAI ........................................................................ 4311/B HIÁNYTÜNETEK VIZSGÁLATA FIATAL EGYSZIKŰ ÉS KÉTSZIKŰ NÖVÉNYEKNÉL ........................................ 4511/C HIÁNYTÜNETEK HATÁROZÓ KULCSA ...................................................................................................... 47

12. FOTOSZINTETIKUS PIGMENTEK VIZSGÁLATA ........................................................................ 50

12/A KLOROPLASZTISZ SZÍNANYAGAINAK SZÉTVÁLASZTÁSA MEGOSZLÁSI PAPÍR-KROMATOGRÁFIÁVAL ........ 5112/B A LEVELEK KLOROFILL ÉS KAROTINOID TARTALMÁNAK MEGHATÁROZÁSA SPEKTROFOTOMÉTERREL, ANYERS PIGMENTKIVONAT ABSZORPCIÓS SPEKTRUMÁNAK FELVÉTELE ................................................................ 53

13. FOTOSZINTÉZISES O2-TERMELÉS JODOMETRIÁS MEGHATÁROZÁSA (WINKLER-MÓDSZER) ......................................................................................................................................................... 57

14. A FOTOSZINTÉZIS SORÁN KÉPZŐDÖTT KEMÉNYÍTŐ KIMUTATÁSA SACHS-FÉLEJÓDPRÓBÁVAL................................................................................................................................................. 60

4

15. A FOTOSZINTÉZIS SORÁN KÉPZŐDÖTT SZACHARÓZ MENNYISÉGI MEGHATÁROZÁSA62

16. LÉGZÉSVIZSGÁLAT FRENYÓ-FÉLE "IDŐTITRÁLÁSSAL", A 2,4-D HATÁSA A LÉGZÉSRE63

17. KATALÁZ ENZIM AKTIVITÁSÁNAK VIZSGÁLATA ................................................................... 65

17/A A KATALÁZ AKTIVITÁSÁNAK MÉRÉSE TITRÁLÁSSAL ............................................................................... 6617/B A KATALÁZ ENZIM AKTIVITÁSÁNAK MÉRÉSE FRENYÓ-MÓDSZERREL (HASZNÁLATI UTASÍTÁS AFRENYÓ-FÉLE KATALÁZ-MÉRŐ ESZKÖZHÖZ) ...................................................................................................... 67

18. A POLIFENOLOXIDÁZ ÉS A PEROXIDÁZ ENZIMEK AKTIVITÁSÁNAK EGYÜTTESMÉRÉSE .............................................................................................................................................................. 70

19. DEHIDROGENÁZ ENZIMEK KIMUTATÁSA TTC SEGÍTSÉGÉVEL (VETŐMAGVAKÉLETKÉPESSÉGÉNEK VIZSGÁLATA) ........................................................................................................ 73

20. A KEMÉNYÍTŐ ENZIMES LEBONTÁSÁNAK VIZSGÁLATA...................................................... 76

21. A POLARITÁS TANULMÁNYOZÁSA NÖVÉNYEKEN.................................................................. 80

22. NÖVEKEDÉSSZABÁLYOZÓ ANYAGOK HASZNÁLATA GYÖKEREZTETÉSIMÓDSZEREKNÉL............................................................................................................................................. 82

22/A A GYÖKEREZTETÉS FŐBB SZEMPONTJAI.................................................................................................. 8222/B AZ α-NAFTIL-ECETSAV HATÁSA A DUGVÁNYOK GYÖKÉRKÉPZÉSÉRE...................................................... 86

23. A GIBBERELLIN HATÁSA A HOSSZANTI NÖVEKEDÉSRE....................................................... 88

24. A CCC NÖVEKEDÉSGÁTLÓ HATÁSA............................................................................................. 89

25. SALÁTA HIPOKOTIL-TESZT A GIBBERELLINEK KIMUTATÁSÁRA..................................... 91

26. AZ ETILÉN KIMUTATÁSA BORSÓEPIKOTIL-TESZT SEGÍTSÉGÉVEL ................................. 92

27. A CSÍRANÖVÉNYEK SZABAD AMINOSAVAINAK KIMUTATÁSA KÖRPAPÍR-KROMATOGRÁFIÁVAL ................................................................................................................................. 93

28. A NÖVÉNYI KIVONATOK FEHÉRJETARTALMÁNAK MEGHATÁROZÁSA......................... 97

28/A A FEHÉRJE MENNYISÉGÉNEK MEGHATÁROZÁSA BIURET-REAKCIÓVAL................................................... 9728/B A FEHÉRJE MENNYISÉGÉNEK MEGHATÁROZÁSA LOWRY-MÓDSZERREL.................................................. 9928/C A FEHÉRJE MENNYISÉGÉNEK MEGHATÁROZÁSA BRADFORD-MÓDSZERREL.......................................... 102

29. FEHÉRJÉK VIZSGÁLATA POLIAKRILAMID GÉLELEKTROFORÉZISSEL ........................105

29/A A POLIAKRILAMID GÉLELEKTROFORÉZIS (PAGE) JELLEMZŐI............................................................... 10529/B BURGONYAFAJTÁK AZONOSÍTÁSA POLIAKRILAMID GÉLELEKTROFORÉZISSEL A RAKTÁROZOTT FEHÉRJÉKÉS AZ ÉSZTERÁZ IZOENZIMEK ALAPJÁN............................................................................................................. 107

30. AZ ANTOCIÁNOK KIVONÁSA ÉS TULAJDONSÁGAIK VIZSGÁLATA .................................111

31. A NIKOTINTARTALOM MEGHATÁROZÁSA..............................................................................113

5

32. NÖVÉNYRÉSZEK C-VITAMIN TARTALMÁNAK MEGHATÁROZÁSA JODOMETRIÁSMÓDSZERREL.................................................................................................................................................115

FÜGGELÉK ......................................................................................................................................................118

FELHASZNÁLT IRODALOM........................................................................................................................128

6

ELŐSZÓ

Az agrármérnökök képzésében a növényélettani gyakorlatok célja az, hogy

segítséget nyújtson a növények életfolyamatainak teljesebb megismeréséhez, az

elméleti anyag mélyebb elsajátításához, és ezzel a tudományosan megalapozott

növénytermesztői szemlélet kialakításához. Lényeges szempont, hogy a hallgatók

megismerjék a kísérletezés eszközeit, módszereit, tudják az adatokat értelmezni,

tudjanak elemezni, következtetéseket levonni az eredményekből. Fontos, hogy olyan

módszereket ismerjenek meg, amelyeket későbbi növényekkel kapcsolatos

kutatómunkájuk során - szakdolgozat, TDK munka stb. készítésekor - is

hasznosíthatnak. A feladatok sikeres megoldása során szerzett élmény elősegíti az

elmélet maradandóbb rögzülését, bevésését, a gyakorlati munka a megszerzett

tudást a készség fokára emeli.

Az 1996/97-es tanévtől bevezetett új tanterv keretében növényélettani gyakorlataink

óraszáma az A és B típusú tárgyakat együtt számolva kb. felére csökkent a

korábbiakhoz képest. A mérések időigénye miatt az A típusú Növényélettan tárgy

heti 1x40 perces gyakorlatait kéthetente összevontan tartjuk meg.

Főként ezen új körülmények szükségessé tették a korábbi Növényélettani

gyakorlatok című oktatási segédletünk átdolgozását és kibővítését. E változtatások

keretében, jegyzetünkben az egyes méréseket több háttér-információval láttuk el,

amit a hallgatók már otthon elolvashatnak a gyakorlatra készülve, így több idő marad

a tényleges mérés végzésére. Növeltük a demonstrációs gyakorlatok arányát, ahol a

hallgatók egy-egy kísérletnek csak bizonyos fázisait illetve végeredményét fogják

tanulmányozni. A jegyzet anyagának bővítését új műszereink (Beckman VIS-UV

spektrofotométer, poliakrilamid gélelektroforetikus készülékek) is lehetővé tették.

7

LABORATÓRIUMI RENDSZABÁLYOK

• A kijelölt feladatokat és a hozzájuk kapcsolódó elméleti részeket (előadásokanyaga) a gyakorlatok előtt át kell tanulmányozni, a gyakorlatokra felkészülten kellérkezni.

• Hallgatók felügyelet nélkül nem dolgozhatnak a laboratóriumban.• A laboratóriumban a dohányzás szigorúan tilos.• A gyakorlatokon védőköpeny viselése kötelező.• A kísérlet megkezdése előtt készítsünk elő minden szükséges eszközt, vegyszert.• A laboratóriumban használt vegyszerek nagy része mérgező, ezért a

vegyszerekkel óvatosan bánjunk! Szigorúan tilos a vegyszerek, de a kísérletekhezhasznált növényi részek, termések megízlelése is, ez utóbbiak ugyanis márszennyeződhettek vegyszerekkel, pl. a laboratóriumban. Tilos a laboratóriumbanenni, illetve az ott levő edényekből inni, vagy azokban ételt tartani.

• Kísérletekhez vegyszereket csak megfelelő dugóval, csavaros fedővel elzárt,egyértelműen feliratozott, címkézett üvegekben, műanyagdobozokbantárolhatunk.

• A szilárd vegyszereket vegyszerkanállal vegyük ki a vegyszeres edényből, utána akanalat töröljük meg papírtörlővel.

• A folyadékok kiméréséhez tiszta, száraz pipettát, vagy mérőhengerekethasználjunk. A maró, mérgező anyagok esetében biztonsági pipettát használjunk.

• A vegyszer használata után az üveget a saját dugójával azonnal zárjuk le,különben a vegyszerek kipárologhatnak, összekeveredhetnek, elfolyósodhatnakstb. A kivett dugót az alsó felével sohase helyezzük az asztalra, mertszennyeződést viszünk vele az üvegbe, illetve az asztal felületére.

• A kísérlet végén megmaradt anyagot - különösen az oldatokat - sohase tegyükvissza abba az üvegbe, amelyből kivettük.

• A lefolyóba szilárd (pl. növényi maradványok), kenőcsös (zsírok, olajok),tűzveszélyes (pl. éter, benzol), valamint erősen savas vagy lúgos kémhatású (pl.HCl, H2SO4, NaOH stb.) anyagokat ne öntsünk, mert elzáródást, robbanást, illetvea csővezeték súlyos károsodását idézheti elő. Az előzőekben felsorolt anyagokatminden esetben a kijelölt üveg vagy műanyag edényekben kell összegyűjteni.

• Az elszennyezett, használaton kívüli edényeket azonnal ürítsük ki az előbbiekbenleírtak figyelembevételével, majd esetleges öblítést követően vigyük a mosogatóhelyiségbe.

• A 0,5 literesnél nagyobb üvegeket szállítás közben ne csak a nyakuknál fogjuk,hanem alulról is támasszuk alá.

• Kellemetlen szagú, mérgező, tűzveszélyes anyagokkal vegyifülkében dolgozzunk.• A kémcsövet hevítéskor, melegítéskor ne tartsuk nyílásával se magunk, se

társunk felé.

8

• Arcunkat, szemünket, kezünket védjük a szétfröccsenő anyagoktól. Különösentömény savakkal, lúgokkal végzett munka esetén védőeszközök (pl. szemüveg,kesztyű) használata kötelező.

• A bőrünkre került erős savakat, lúgokat bő vízzel mossuk le, majd bikarbónát,illetőleg híg ecetsavas lemosással közömbösítsük.

• Erős savak, különösen kénsav hígításánál mindig a savat öntjük a vízbe és nemfordítva.

• Könnyen gyulladó, robbanó anyagokat (pl. benzin, éter) nyílt láng közelében nemtarthatunk. Ezen anyagok csak elektromos berendezéssel melegíthetők. Tűz ésrobbanásveszélyes anyagokkal csak akkor dolgozhatunk, ha a laboratóriumbannyílt lángot nem használunk. Megfelelő szellőztetésről gondoskodni kell.

• Laboratóriumi tűz esetében fontos, hogy gyorsan és ésszerűen intézkedjünk. Kistüzet (pl. főzőpohárban), az edény letakarásával, esetleg nedves ruhadarabsegítségével oltunk el, nagyobb mennyiség meggyulladásakor a kézi tűzoltókészüléket használjuk. A környezetből távolítsuk el a gyúlékony anyagokat.Ruhánk meggyulladásakor azonnal a laboratóriumban található zuhany alá kellállni.

• Nedves kézzel tilos hozzányúlni feszültség alatt álló elektromos készülékekhez,kapcsolókhoz és dugaszolóaljzatokhoz. Áramütés esetén a központi kapcsolóvaláramtalanítunk, és csak azután nyúlhatunk a sérülthöz. Majd friss levegőrevisszük és mesterséges légzést alkalmazunk. Azonnal orvost kell hívni!

• Laboratóriumi centrifuga használata előtt a rotorban egymással szembekerülőcentrifugacsöveket ki kell egyensúlyozni!

• A laboratóriumban elsősegélydobozt és közömbösítő oldatokat helyeztünk el. Aközömbösítő oldatok közül

lúgmaráskor 0,5 %-os ecetsavatsavmaráskor 2 %-os szódabikarbónátszemlúgmaráskor 2 %-os bórsavatszemsavmaráskor 2 %-os bóraxot használjunk.

• A balesetveszélyt és a baleseteket mindig komolyan kell venni. Minden sérüléstazonnal jelenteni kell a gyakorlatvezetőnek.

9

1. PLAZMOLÍZIS VIZSGÁLATOK

A növényi sejtek membránjainak permeabilitása (áteresztőképessége, átjárhatósága)

és a permeabilitást befolyásoló különböző tényezők hatása, jól megfigyelhető a

plazmolízis tanulmányozásával. Plazmolízis (plazma „leoldás”) előidézéséhez az élő

sejteket a sejtnél negatívabb vízpotenciálú oldatba (plazmolitikum) kell helyezni. A

plazmolízis jelenségének oka az, hogy az alkalmazott plazmolitikum hatására a sejt

vizet veszít mind a plazmából, mind a vakuólumból, így térfogatcsökkenés következik

be. A sejt citoplazmájának nagymértékű zsugorodását a sejtfal egy idő után nem

tudja követni, így elkülönülnek, elválnak egymástól. Ez a folyamat mikroszkóposan is

jól követhető. (Megjegyezzük, hogy a citoplazmához való tapadása miatt a sejtfal

először enyhén bedomborodik, kissé negatívvá válik a nyomáspotenciál (ψp), de ha

az oldott anyagok át tudnak diffundálni a sejtfalon, akkor a sejtfal és a citoplazma

kezd elválni egymástól, és a sejtfal visszatér az eredeti helyzetébe.)

A plazmolízis bekövetkeztének két fontos feltétele van: 1. a sejtfal legyen átjárható a

plazmolitikum számára, hogy bejuthasson a sejtfal és a plazmalemma közé. 2.

Tartós plazmolízis bekövetkezésének feltétele az is, hogy a plazmolitikum oldott

anyaga ne tudjon áthatolni a plazmalemmán, különben a plazmolízis legfeljebb

átmeneti lesz: a víz gyorsabban jut ki a sejtből, mint ahogy oda a külső oldott anyag

behatol; ám később a plazmolízis fokozatosan megszűnik a plazmolitikum oldott

anyagának bejutása és az ezt követő vízvisszaáramlás miatt, más szóval

deplazmolízis következik be. Deplazmolízis következik be akkor is, ha a plazmolizált

sejtet tiszta vízbe helyezzük.

Az alkalmazott plazmolitikumtól, az abban található ionoktól függően a plazmatömlő

zsugorodásának morfológiája különbözik, így a plazmolízisnek különböző típusai

jöhetnek létre.

Határplazmolízisről beszélünk, ha a plazmolízis olyan kismérvű, hogy a citoplazma

csak a sarkokban válik le kissé a sejfaltól.

10

1. ábra Határplazmolízis (Allium cepa buroklevél epidermisz-nyúzat)

Az 1. ábrán a hagyma (Allium cepa) epidermisz-nyúzatának sejtjeiben a sejtüreget

hatalmas antociános vakuólum tölti ki, a vékony plazmatömlő a sejtfalhoz szorul. (A

mikroszkópban az alkalmazott kezelés esetén általában csak a színes vakuólumot

látjuk. A citoplazmát csak a sapkaplazmolízisnél figyelhetjük meg jól.)

Konvex plazmolízis jön létre akkor, ha a plazmolitikum alkáli ionokat (K+, Na+)

tartalmaz nagy koncentrációban.

2. ábra Konvex plazmolízis (Allium cepa buroklevél epidermisz-nyúzat)

A plazmolízis ezen típusa esetében a plazmatömlő lekerekített, gömb, vagy ovális

alakzatot vesz fel. A jelenség magyarázata az, hogy az alkáli ionok bizonyos fokban

hígítják a plazmát, csökkentik annak viszkozitását és ezért a plazmatömlő a felületi

feszültség hatására gyorsan legömbölyödik. A viszkozitás csökkenését az idézi elő,

hogy a kis ionsugárral rendelkező alkáli ionok erősen hidratált állapotúak, vastag

vízburok veszi körül őket, és ez a plazmatömlő „hígulását” idézi elő. Az ionok

hidratáltsági állapota révén felvett víz mennyisége azonban kisebb, mint a sejtből

eltávozott víz mennyisége, és létrejön a plazmatömlő zsugorodási jelensége. A

konvex plazmolízis visszafordítható állapota a sejteknek.

11

Konkáv plazmolízis jön létre akkor, ha a plazmolitikumként alkalmazott oldat alkáli

földfém ionjait (pl. Ca++) tartalmazza.

3. ábra Konkáv plazmolízis (Allium cepa buroklevél epidermisz-nyúzat)

A konkáv plazmolízis során a citoplazma a sejtfalról csipkés, konkáv felszínek

kialakításával válik le, a plazmalemma bizonyos pontokon (valószínűleg a

plazmodezmák mentén) a sejtfalhoz tapad. A sejtfalról leváló plazmát helyenként

plazmaszálak (Heckt-féle fonalak) kötik a sejtfalhoz. Az alkáli földfém ionok a

citoplazma állományát tömörítik, szemben az alkáli ionokkal, növelik annak

viszkozitását. A plazmatömlő a sejtfal felszínéhez nem egyforma erővel tapad

mindenhol, így a zsugorodáskor a már említett "csipkés" konkáv felszínek jönnek

létre. A viszkozitás-növelő hatás magyarázata az, hogy az alkáli földfém ionok, pl. a

kalcium ionok nagyobb ionsugárral és vékonyabb hidrátburokkal rendelkeznek, mint

az alkáli ionok, ezek térbelileg közelebb kerülnek a plazmakolloidokhoz, azok

töltéseit befolyásolhatják, minek következtében a plazma-részecskék hidratációs

köpenye vékonyodik, mely fokozza a plazma viszkozitását, így a zsugorodási hatást

fokozza. A konkáv plazmolízis visszafordítható állapota a sejteknek. Megjegyezzük,

hogy a plazmolízis kezdetben a plazmolitikumtól függően hosszabb-rövidebb ideig

konkáv formájú de később, a kontrakció előrehaladtával - a felületi feszültség

hatására - konvex formába mehet át.

Sapkaplazmolízis a konvex plazmolízis egy különleges formája, amely

káliumrodanidot (káliumszulfocianid, KSCN) tartalmazó plazmolitikummal idézhető

elő és kialakulásában a határhártyák eltérő permeabilitásának is szerepe van. A

folyamat konvex plazmolízisként kezdődik, majd a sejtüreg közepére zsugorodott

plazmatömlő két vége eleinte félhold, majd sapkaszerűen vastagodni kezd. A

sapkaplazmolízis jelensége azzal magyarázható, hogy a plazmolízis alatt a

12

plazmalemma áteresztőképessége fokozódik - a tonoplaszté még nem - és így a

citoplazmába bejutott, de onnan a tonoplaszt ellenállása miatt a vakuólumba tovább

jutni nem képes kálium és rodanid ionok erősen duzzasztják a fehérjéket. Ennek a

duzzasztó hatásnak az eredménye a sejt két végében, a hossztengely irányában

kialakuló sapka. A duzzadás következtében a citoplazma rövid idő múlva az egész

sejtlument kitölti (→tonoplasztplazmolízis). A folyamat alatt a vakuólum térfogata

nem változik meg jelentékeny mértékben, amit azzal magyarázhatunk, hogy

szemben a plazmalemmával a tonoplaszt még megőrizte féligáteresztő képességét.

A tonoplaszt nagyobb ellenállása - melynek a sejt normális működése szempontjából

jelentősége van, hiszen a vakuólumban a citoplazma számára mérgező anyagok is

tárolódnak - elsősorban a két membrán kémiai összetételében lévő különbségből

adódik és nem azok vastagságából. (A plazmalemma átlagos vastagsága: ≈10 nm, a

tonoplaszté: ≈7,5 nm, a tonoplaszt több lipidet tartalmaz.) A sapkaplazmolízis a

sejtek visszafordítható állapota.

4. ábra Sapkaplazmolízis (Allium cepa buroklevél epidermisz-nyúzat)

Tonoplasztplazmolízis a sapkaplazmolízis fokozott változata, amikor a megduzzadt

plazma teljesen kitölti a vakuólum és a sejtfal közötti teret. Pl. a káliumrodaniddal

váltható ki. Tonoplasztplazmolízis akkor lép fel, amikor már csak a tonoplaszt az

egyedül működő membrán. A folyamat elején a vakuólum összehúzódik, - a

citoplazmába került ionok hatására a vakuólumból víz áramlik ki - miközben a

citoplazma térfogata növekszik.

Későbbiekben a tonoplaszt is elveszíti szemipermeabilitását és ez a vakuólum

duzzadásához, végül a tonoplaszt szétszakadásához vezet.

13

A sapka- és a tonoplasztplazmolízissel egyidejűleg megváltozik a sejtmag alakja is.

Először megduzzad, majd a sejtmaghártya szétreped és a sejtmagtartalom kiömlik.

Ezt nevezzük karioptízisnek.

A plazmolízis jelenségét különböző sejtélettani vizsgálatoknál gyakran használják:

- a növényi sejt élő állapotának vizsgálatához (Csak élő sejt mutat plazmolízis

jelenséget, mert az elhalt plazma az oldott anyagokat átengedi, így a koncentráció-

különbség egyszerű diffúzióval kiegyenlítődhet. Az élő sejt membránja

szemipermeábilis (féligáteresztő), míg az elölt, vagy elhalt sejt membránja elveszti

e tulajdonságát és permeábilissé lesz.)

- a sejt permeabilitási viszonyainak tanulmányozására

- a sejtek ozmotikus potenciál értékének mérésére

- a citoplazma viszkozitásának jellemzésére, melynek a növény hő-, fagy- és

szárazságtűrésében lehet szerepe.

Néhány oldott anyag (pl. alkoholok) olyan gyorsan lép be a sejtbe, hogy plazmolízis

egyáltalán nem jön létre. Ezek rendszerint irreverzibilis membrán károsítók és a

növényi sejt pusztulását okozzák.

Vannak olyan anyagok is (pl. a PEG = polietilén-glikol), amelyek nagy méretük miatt

nem jutnak át a citoplazma membránon és a sejt zsugorodását okozzák. Ez a

citorrízis jelensége. Ilyenkor – plazmadús, fiatal sejteknél - a protoplazma

zsugorodásakor magával húzza a sejtfalat. Megjegyezzük, hogy a tartós zsugorodott

állapot a sejt pusztulását okozhatja.

A plazmolízis ritka jelenség a természetben, de átmenetileg kialakulhat, ha a külső

ozmotikus potenciál (ψπ) gyorsan csökken, pl. amikor sós mocsárból forró napokon

víz párolog el.

Előfordulhat, hogy a sejtek hipotóniás környezetbe kerülnek, melynek hatására a

citoplazma „cseppek” formájában kiáramlik a sejtekből. A jelenséget plazmoptízisnek

nevezzük.

14

A növények az ozmoregulációnak nevezett jelenséggel képesek a környezeti

ozmotikus változásokból adódó káros hatások kivédésére.

Érdekességként megjegyezzük hogy a protoplasztok (sejtfalnélküli sejtek)

előállításának egyik korai lehetősége az volt, hogy a szöveteket plazmolizálták, majd

metszeteket készítettek. Ilyenkor azokból a sejtekből, amelyeknél a

metszetkészítésre használt eszközzel csak a sejtfalat vágták át - és az

összezsugorodott plazmatömlőt nem sértették fel - ép protoplasztokat lehetett

kinyerni. (A növénybiotechnológiában alkalmazott protoplasztfúziókhoz - pl.

szomatikus hibridek előállításához - ma már a protoplasztokat a sejtfal enzimatikus

lebontásával állítják elő.)

1/a Élő és elhalt szövetek permeabilitásának vizsgálata; a konkáv, a konvex és a

deplazmolízis tanulmányozása

Színes, antociános hagyma-boruléklevelek domború, sötétvörös felületét szikével kis

négyzetekre osztva gyengén bevágjuk, s az így körülvágott kis epidermisz

darabkákat csipesszel leemeljük.

Az epidermisz darabkákat tárgylemezre cseppentett vízben lefedve vizsgáljuk.

Mikroszkóp alatt kiválasztunk egy egysejtsoros, ép sejtű, antociántartalmú

nyúzatrészt és lerajzoljuk.

A továbbiakban újabb epidermisz darabkákat helyezünk tárgylemezre és 10 %-os

KNO3, illetve egy másik tárgylemezen 10 %-os CaCl2 oldatot cseppentünk rájuk,

majd fedőlemezzel lefedjük mindegyiket. A változást megfigyeljük és lerajzoljuk, a

változáshoz szükséges időtartamot feljegyezzük.

Konkáv plazmolízist a CaCl2-vel, a konvex plazmolízist a KNO3-mal kezelt

preparátumokon tanulmányozhatjuk. Bizonyos időn belül a plazmolizált, de élő sejtek

képesek újból vizet felvenni; ez a deplazmolízis. A vizsgálatokat úgy végezzük, hogy

a plazmolitikummal kezelt és már plazmolizálódott preparátumra, a fedőlemez mellé

15

vizet cseppentünk, amit szűrőpapírral átszívatunk. Néhány perc múlva a sejtek ismét

eredeti turgorállapotba kerülnek.

Helyezzünk néhány nyúzatdarabot 2-3 percre forró vízbe, majd ezeket is kezeljük a

fenti plazmolitikumokkal. Ebben az esetben plazmolízis nem következik be, mivel a

forralással megszüntettük a plazmahártyák szemipermeabilitását.

A megfigyelteket rajzoljuk le, és a jelenségeket értelmezzük!

Ügyeljünk a sejthártyák helyes rajzolására!

1/b Sapka- és tonoplasztplazmolízis vizsgálata káliumszulfocianiddal

Antociános vöröshagyma epidermisznyúzatára 10 %-os káliumszulfocianid (KSCN)-

oldatot cseppentünk, fedőlemezzel lefedjük és mikroszkópba tesszük. Néhány

másodperc múlva beáll a konvex plazmolízis, majd 10-20 perc múlva a

sapkaplazmolízis. A sapkaplazmolízis előkészítése során ügyeljünk arra, hogy a

sejtek környezetébe ne kerüljön pl. csapvízből, vagy vegyszerből származó Ca++, az

ugyanis a K+ ionok duzzasztó hatását és ezzel a sapkaplazmolízis kialakulását képes

meggátolni.

Okulármikrométer alkalmazásával jól megfigyelhető a plazma további duzzadása, és

15-20 perc elteltével a megduzzadt plazma teljesen kitölti a plazmolizált vakuólum és

sejtfal közti teret. (Ez a sapkaplazmolízis fokozott változata, amit az irodalomban

„tonoplasztplazmolízisnek” is neveznek.) Amíg azonban a sapka tovább duzzad, a

vakuólum, illetve az azt körülvevő tonoplaszt jó ideig megtartja eredeti

plazmolízisfokát.

Megfigyeljük a mikroszkópi képet, tapasztalatainkat rögzítjük, a jelenséget lerajzoljuk.

1/c Ca++-ionok jelentősége a plazmolíziskor fellépő határhártya-sérüléseknél

A növényi sejt plazmolízisekor a zsugorodó citoplazmafelületen, elsősorban

plazmalemmán, sérülések jönnek létre. A keletkezett szakadások azonban a

rendszerben jelenlevő Ca++-ionok hatására azonnal regenerálódnak. Ezen

16

„regenerációs” jelenség oka a felületi precipitáció, ami Ca++-ionok jelenlétében megy

végbe.

Allium cepa antociános epidermiszéből nyúzatokat készítünk, amelyekből néhányat

2 M-os karbamid-oldatban tárgylemezen lefedünk. Megfigyeljük a plazmolízis idejét,

és milyenségét. A több nyúzat közül 3 darabot (amelyeket még nem kezeltünk

karbamiddal) 0,1 M-os nátrium-oxalát-oldattal kezelünk 1 percig. Mivel az oxalát-

ionok a felületi rétegben elhelyezkedő Ca++-ionokkal oldhatatlan Ca-oxalát

csapadékot adnak, ilyen módon mintegy eltávolítjuk a citoplazmafelületek felületi

precipitációjához feltétlenül szükséges Ca++-ionokat.

A kezelt nyúzatdarabok közül egyet 2 M-os karbamid-oldattal, egyet 1 M-os CaCl2-

oldattal kezelünk. Megfigyeljük a plazmolízis típusában beálló változást, és a

folyamat idejét is rögzítjük. A harmadik nyúzatdarabot mossuk ki csapvízzel! A

csapvíz nagy mennyiségű Ca++-iont tartalmaz. Az így előkészített nyúzatdarabot

plazmolizáljuk 2 M-os karbamid-oldattal és figyeljük meg a plazmolízis idejét és

típusát. Indokoljuk részletes magyarázattal a lejátszódott folyamatokat!

Megjegyzés: A plazmolízis idejét a plazmolitikum hozzáadásától kezdve számítjuk

addig, amíg a nyúzatdarab közepén elhelyezkedő sejtek is plazmolizálódnak és a

jelenségre jellemző képet veszik fel.

Anyagok és eszközök

vöröshagyma (lila húsú)

10 %-os KNO3-oldat, 10 %-os CaCl2-oldat, 10 %-os KSCN-oldat, 2 M-os karbamid,

0,1 M-os Na-oxalát, 1 M-os CaCl2-oldat

tárgylemez, fedőlemez, lándzsatű, vegyszeres kanál, csipesz, fogászati csipesz,

szike, szűrőpapír, főzőpohár, cseppentő, mikroszkóp, üvegbot, óraüveg

17

2. TRAUBE-FÉLE SEJT TANULMÁNYOZÁSA

Ismeretes, hogy a sejtben előforduló plazmahártyák nem tökéletes féligáteresztők,

azaz egy idő után elveszítik ezt a tulajdonságukat. Olyan hártyát, amely az oldatból

csak az oldószert engedi át - és ezt a tulajdonságot hosszabb ideig is megtartja -

csak mesterségesen tudunk készíteni. Így pl., ha 4 %-os CuSO4 oldatot tartalmazó

kémcsőbe sárgavérlúgsó K4Fe(CN)6-kristálykákat dobunk, vagy vízüveg-oldatba

CoCl2, illetve FeCl3-kristálykákat szórunk, akkor a kristályok felületén „tökéletes”

szemipermeábilis hártya jön létre.

Magyarázat: A sárgavérlúgsó-kristályka a rézszulfát oldatban az érintkezési felületen

rézferrocianid hártyát képez:

K4Fe(CN)6 + 2 CuSO4 = Cu2Fe(CN)6 + 2 K2SO4

E szemipermeábilis hártyán belül a kristályanyag (sárgavérlúgsó) koncentrált oldata

keletkezik, ami az ozmózis törvényei szerint vizet vesz fel. A belső feszültség

következtében létrejött térfogat-növekedés hatására a hártya el is szakadhat, de a

külső és belső oldat érintkezési felületén félig áteresztő hártya, illetve új tömlő

képződik. A folyamat akkor szűnik meg, amikor a külső ozmotikus potenciál

lényegében azonos lesz a hártya, illetve a tömlő belsejében uralkodó ozmotikus

potenciállal. Ekkor a ki- és bediffundálódó oldószer között dinamikus egyensúly áll

be. A vízüvegoldat és a CoCl2-, illetve FeCl3-rendszer viselkedésének magyarázata

ugyanaz a következő egyenletek szerint:

CoCl2 + Na2SiO3 = Co(SiO3) + 2 NaCl

2 FeCl3 + 3Na2 SiO3 = Fe2(SiO3)3 + 6 NaCl

A jelenséget megfigyeljük és lerajzoljuk a Traube-féle sejteket.

Anyagok és eszközök

K4(Fe(CN)6 kristályos, CoCl2-kristály, FeCl3-kristály, 4 %-os CuSO4-oldat, vízüveg

kémcsövek, kémcsőállvány, vegyszerkanál

18

3. CITOPLAZMA-VISZKOZITÁS VIZSGÁLATA

Az élő állapotú sejtekben a kloroplasztiszok közel egyenletesen oszlanak el. Az ilyen

sejtek centrifugálása során a kloroplasztiszok ülepedni kezdenek, ülepedésük a

citoplazma viszkozitásának függvénye. Ha a sejteket a citoplazma viszkozitását

befolyásoló anyagokkal kezeljük, a viszkozitást változtató hatásnak megfelelően

változik a kloroplasztiszok ülepedési folyamata is. Ez a jelenség tanulmányozható

kálium és kalcium ionok hatásának kitett sejtekben, ugyanis kálium ionok hatására

csökken, kalcium ionok hatására nő a citoplazma viszkozitása.

A munka menete

1. Vallisneria spiralis leveleiből kis darabot kivágunk és azt tárgylemezre helyezzük.

(A Vallisneria az akváriumok kedvelt vízinövénye.)

2. Szikével az epidermiszt és az alatta elhelyezkedő asszimiláló szövet felső rétegét

lekaparjuk, így elérhető, hogy 1-2 sejtsornyi réteget kapjunk.

3. A kaparékot eltávolítjuk és a levéldarabot vízzel lecseppentve lefedjük,

mikroszkóppal megfigyelhető, hogy a kloroplasztiszok a citoplazmában közel

egyenletes eloszlásban vannak. (20x-os nagyítású objektívet használunk, hogy

nagyobb területről nyerjünk áttekintést.)

A látott mikroszkópos képet rajzoljuk le!

4. Egy-egy levéldarabot műanyag-centrifugacsőbe erősítünk leukoplaszttal úgy, hogy

a levél tengelye a csőtengellyel párhuzamosan helyezkedjen el.

5. Az egyik centrifugacsőbe 0,2 n káliumnitrátot, a másikba pedig 0,2 n

kalciumnitrátot öntünk addig, hogy a leveleket az oldatok elfedjék. Ezt követően kb.

fél óráig állni hagyjuk az anyagokat.

6. A centrifugacsöveket táramérlegen kitárázzuk, majd 1000-1500 fordulat/perc

fordulatszámmal centrifugáljuk a csöveket 10 percig.

19

7. A leveleket az 1.-3. pontig leírtak szerint mikroszkóppal megvizsgáljuk, azzal a

különbséggel, hogy nem vízzel, hanem a megfelelő oldattal cseppentjük le a

vizsgálati anyagot a lefedés előtt.

Mindkét preparátum mikroszkópos képét lerajzoljuk a jegyzőkönyvbe.

A kísérletet nagyobb fordulatszámmal is elvégezhetjük. A plazma viszkozitásának

jellemzésére azt a fordulatszámot használhatjuk, amelyiknél a kloroplasztiszok

elmozdulása észlelhetővé vált.

Anyagok és eszközök

Vallisneria spiralis

0,2 n káliumnitrát, 0,2 n kalciumnitrát

mikroszkóp, tárgylemez, fedőlemez, centrifuga, centrifugacső, táramérleg, szike

20

4. NÖVÉNYI SZÖVETEK VÍZPOTENCIÁLJA (ψψψψ) ÉS ANNAK MÉRÉSE

A vizes oldatnak egy rendszer bármely pontján és a tiszta víznek ugyanolyan

hőmérsékleten és légköri nyomáson mért kémiai potenciál-különbségét

vízpotenciálnak (ψ = pszí) nevezzük. A tiszta víz kémiai potenciálját 25°C-on 1 bar (=

102 kPa) nyomáson 0-nak veszik. A vízpotenciál kifejezésére az energia/térfogat,

azaz a nyomás mértékegységeit használjuk (bar, Pa). A víz mindig a

szabadenergiatartalom-csökkenés irányába, vagyis a negatívabb vízpotenciálú hely

felé mozdul el. A vízpotenciállal kapcsolatos összefüggések levezetését a fizikai-

kémia tárgyalja.

A vízpotenciált alapvetően meghatározza: 1. a vízmolekulák kötéseiben jelenlévő,

munkára felhasználható energiamennyisége (szabadenergia = kémiai potenciál) 2. a

vízmolekulák mennyisége (koncentráció). A víz koncentrációja a tiszta vízben a

legnagyobb, oldott anyagok, vagy valamilyen mátrix (pl. kolloid részecske,

elektromos töltésű felszín, kapilláris, amihez kötődnek a víz molekulák) jelenléte

csökkentik a rendszerben lévő víz mennyiségét és a vízgőznyomást. Ez a

vízgőznyomás-csökkenés felel meg az ozmotikus és a mátrixpotenciálnak.

A vízpotenciál (ψ) a növényi sejtre alkalmazva a következő részpotenciálokból

tevődik össze:

ψ = ψp - ψπ - ψm

ahol ψp = nyomáspotenciál, ψπ = ozmotikus potenciál, ψm = mátrix potenciál

Az ozmotikus potenciál és a mátrixpotenciál mindig negatív szám, vagy nulla. Az

ozmotikus és mátrixpotenciál (vízgőznyomás csökkenések) miatt a sejtekbe

vízbeáramlás történik, ami egy belső hidrosztatikai nyomást, a nyomás potenciált

hozza létre. A nyomáspotenciál pozitív szám, vagy nulla, ha negatív fali nyomás

nincs. A xilémben azonban a nyomáspotenciál általában negatív a transzspiráció

alatt, de pozitív is lehet a gyökérnyomás eredményeként a guttáló növényekben. A

három részpotenciál értékének összege (a vízpotenciál) negatív szám, kivéve a

21

teljes turgor állapotában lévő sejtet, ahol a vízpotenciál nulla. Ebben az esetben a

pozitív nyomáspotenciál kiegyenlíti a negatív ozmotikus és mátrixpotenciált.

Noha a vízpotenciál kifejezést mint modern termodinamikai fogalmat már az 1960-as

évek végén bevezették, még ma is előfordul, hogy a modern és a klasszikus

fogalmakat keverten használják. E fogalmak az alábbiak szerint felelnek meg

egymásnak. (A táblázatban felsoroltakon kívül még egyéb elnevezések, rövidítések

is előfordulnak.)

modern (termodinamikai) fogalom klasszikus fogalom

vízpotenciál (ψ) szívóerő (S vagy SZ) vagy diffúziós

nyomás különbség (DPD) S = DPD = -ψ

ozmotikus potenciál (ψπ) vagy

oldatpotenciál (ψs)

ozmotikus nyomás, ozmotikus érték (π)

π = - ψπ = - ψs

nyomáspotenciál vagy fali nyomás (ψp) turgornyomás (P)

mátrixpotenciál (ψm) nincs megfelelője

A vakuolizált sejt vízpotenciálját nagyrészt a sejtnedv vízpotenciálja szabja meg. A

sejt vizet vesz fel a sejtnedvnél nagyobb vízpotenciálú oldatból, és vizet ad le az

annál kisebb (negatívabb) vízpotenciálú oldatba.

A sejtek és szövetek vízpotenciáljának mérésére szolgáló eljárások többsége olyan

közeg vízpotenciáljának a meghatározásán alapul, amelyből a sejt vagy a sejtek nem

vesznek fel, de nem is adnak le vizet.

Lehetetlen megmérni a sejtek vízpotenciálját egy sértetlen soksejtű növényben,

mivel a potenciál rögtön változni kezd a szövet kimetszésekor, egyebek között a

szöveti tenzió megszűnése és a párologtatás miatt, az izolált szövetekkel végzett

mérések csak megközelítőleg adják meg a pontos értéket.

Fontos, hogy a szövet kimetszése után olyan gyorsan el kell végezni a mérést,

amilyen gyorsan csak lehet.

22

4/a Vízpotenciál meghatározására alkalmas módszerek

A. Térfogatmérő módszerek

Ld. 4/b feladatnál leírtakat.

Ha a szövet szerkezete nem homogén, azaz az egyik oldalán merev kutikula vagy

vastag falú sejtek akadályozzák a duzzadást vagy a zsugorodást, a másik oldalon

levő sejtek vízpotenciálja megbecsülhető a különböző ozmotikus potenciálú

oldatokba merítés okozta elgörbülés mértékéből.

Annak az oldatnak, amelyben egy egyenes szövetdarab nem görbül meg, a

vízpotenciálja megközelítőleg ugyanolyan, mint a bele helyezett sejteké.

B. Gravimetriás módszer

Mérlegen pontosan lemért szövetszeleteket ismert ozmotikus potenciálú

oldatsorozatba helyezik. Körülbelül egy óra múlva a szövetszeleteket kiveszik az

oldatból, a felszínéről a nedvességet szűrőpapírok között leitatják, s újra lemérik a

tömegét.

Annak az oldatnak a vízpotenciálja azonos a szövetével, amelyben nem következik

be tömegváltozás.

Vízbe merítés helyett a szöveteket különböző gőznyomás mellett nedves levegőn is

hagyhatjuk. A szövetből a levegőbe vagy a levegőből a szövetbe áramló víz

mennyisége a szövet és a levegő vízpotenciál különbségétől függ.

Ügyelni kell arra, hogy a hőmérsékletet nagyon pontosan ellenőrizzük, mert a

vízpotenciál és a gőznyomás közötti viszony a hőmérséklet változásával módosul.

C. Csardakov-módszer

Ismert vízpotenciálú nádcukor vagy mannitol oldatsorozatot valamilyen színezékkel,

például metilénkékkel megfestjük. Az ismeretlen vízpotenciálú szövetet először

ismert vízpotenciálú festetlen oldatokba helyezzük körülbelül egy órára, amíg az

egyensúlyi állapot kialakul. Ezután a szövetet kivesszük az oldatból és a megfelelő

23

ozmotikus potenciálú, megfestett oldatokból egy cseppet adunk pipettával mindegyik

oldat felszíne alá.

Ha a szövet vizet vett fel az oldatból, az oldat koncentrációja és sűrűsége is

növekedni fog, s így a festett csepp emelkedni kezd, míg ha a szövet vizet vesztett,

azaz az oldat hígult, a festett csepp ennek mértékében süllyed.

Annak az oldatnak a vízpotenciálja egyezik meg a szövet vízpotenciáljával,

amelyben a megfestett oldat úgy diffundál szét a cseppből, hogy az közben se nem

süllyed se nem emelkedik.

D. Refraktométeres módszer

Ld. 4/c feladatnál leírtakat.

Az oldat víztartalmának élő szövet jelenlétében bekövetkező változása

refraktométerrel is nyomon követhető.

Amikor a törésmutató nem változik, akkor azonos a sejtek vízpotenciálja a velük

érintkező oldat vízpotenciáljával.

E. Pszichrometriás módszer

Az oldat ozmotikus potenciáljához hasonlóan a szövetdarabok vízpotenciálja is

megmérhető termoelemes légnedvességmérő készülékkel.

Ha annak a szövetnek, amelyből víz párolog el a nedves levegőbe, megmérjük a

hőmérsékletét, és azt összevetjük ugyanilyen körülmények között elhelyezett ismert

ozmotikus potenciálú oldatok hőmérsékletével, az adatokból a szövet vízpotenciálja

kiszámítható.

A rendelkezésre álló módszerek közül ezzel az eljárással lehet a vízpotenciált a

legpontosabban meghatározni.

24

F. Nyomáskamra módszer

5. ábra A leveles hajtás vízpotenciáljának mérésére használatos nyomáskamra

vázlata

E módszer lényege, hogy egy 5000 kPa gáznyomásnak is ellenálló kamrába úgy

helyeznek el egy levelet, vagy egy leveles szárat, hogy a levélnyél, vagy a szár

vágott vége kiáll az edény szájára rögzített zárószerkezetből. Ezután valamilyen inert

gázt, például nitrogén gázt engednek a kamrába, s a gáz nyomását addig növelik,

míg folyadék nem jelenik meg a növénynek a kamrából kiálló vágott felületén. Ekkor

egyensúlyi helyzet áll fenn, a levél sejtjei és a farészben levő nedv között, és a gáz

nyomás pontosan ellensúlyozza a levél sejtjeinek a vízpotenciálját.

(Forrásmunka: Sutcliffe, J. F. 1982. A növények és a víz. Mezőgazdasági Kiadó,

Budapest)

4/b Burgonyagumó vízpotenciáljának meghatározása méretváltozás alapján

A mérés lényege, hogy eltérő koncentrációjú, de ismert vízpotenciálú cukoroldat-

sorozatba szövetdarabokat helyezünk és megfigyeljük a szövetdarabok méretének

változását. A szövetdarabok méretváltozását az okozza, hogy a

szövetdarab/cukoroldat határfelületen a víz - a termodinamika törvényének

25

megfelelően - a negatívabb potenciálú hely felé áramlik. Ezért a

szövetdarab/cukoroldat relatív vízpotenciál értékeknek megfelelően a szövet duzzad,

vagy zsugorodik. Amelyik oldatban a burgonyaszelet meghosszabbodik, annak a

vízpotenciálja pozitívabb, mint a sejtek vízpotenciálja, amelyikben megrövidül, ott a

cukoroldat vízpotenciálja negatívabb, mint a sejtek vízpotenciálja, amelyik oldatban

hossza nem változik, - izoozmotikus - annak értéke azonos a sejtével. A szövet

vízpotenciálja (szívóereje) egyenlő ezen oldat bar-ban kifejezett vízpotenciáljával.

Valamely sejt vagy szövet vízpotenciáljának nagysága tehát azon oldat

vízpotenciáljával egyenlő, amelyben mérete, térfogata vagy tömege nem szenved

változást.

A munka menete

1 térfogatmólos nádcukoroldatból kémcsövekben 0,1 M-tól 1,0 M-ig terjedő hígítási

sorozatot készítünk (10-10 ml-t) 0,1 mólos emelkedéssel. A hígítási sorozatot duplán

készítsük el, mert a feladat "B" részénél szükség van egy kontroll sorozatra is.

Nagyméretű burgonyagumóból négyzetes alapterületű szövetoszlopokat vágunk ki. A

szövetoszlopok végét az egyik oldalon lévő két távolabbi szemközti élre kihegyezzük,

majd az így előkészített, kb. 2-3 cm-es, de azonos méretű darabok hosszát üveglap

alatt elhelyezett mm-papíron megmérjük. A szövetoszlopok előkészítésével és a

méréssel igyekezzünk, a kiszáradást el kell kerülni!

Az első hígítási sorozat mindegyikébe egy-egy szövetoszlopot helyezünk, és a

kémcsöveket gumidugóval bedugaszoljuk. 1-1,5 óra múlva a szövetoszlopok hosszát

ismét megmérjük oly módon, hogy a bedugaszolt kémcsöveket mm-papírra

helyezzük, és az előző méréspontok távolságát ismét leolvassuk és feljegyezzük. (A

mérést azért végezzük ily módon, mert az oldatból eltávolított szeletek leitatásakor a

szövetekre ható nyomás nagymértékben befolyásolja az eredményeket.)

A kísérlet végén a burgonya-oszlopokat vegyük ki a cukoroldatból és a koncentráció

növekvő sorrendjében, helyezzük az oszlopokat üveglapra. Fél óra múlva figyeljük

meg az egyes oszlopok színváltozását. Adjunk rá magyarázatot!

26

4/c Burgonyagumó vízpotenciáljának meghatározása refraktométeres méréssel

Az előzőekben leírt vizsgálat értékelését refraktométerrel is elvégezzük. A

mérésekhez ABBE-féle refraktométert használunk. A cukoroldat törésmutatója a

koncentrációval nő, minél töményebb az oldat, annál nagyobb a törésmutató értéke.

Mérjük meg a tiszta cukoroldat-sorozat (kontroll) törésmutatóját, majd a gyakorlat

végén a burgonyaszeleteket tartalmazó oldatokét! A cukoroldatok közül azt kell

kiválasztani, amelyiknek a törésmutatója nem változott meg a burgonyaszelet

jelenlétében. A refraktométer használatát a gyakorlatvezető mutatja meg.

A feladat "b" és "c" részének közös értékelése:

A kísérlet elejéről és végéről származó mérési eredményeket foglaljuk táblázatba és

állapítsuk meg a szövet vízpotenciál értékét a mellékelt táblázat segítségével!

Szacharóz oldat Burgonya-oszlop mérete A szacharóz oldat törésmutatója

koncentráci-ója

(mól/liter)

vízpotenciál-ja (ψψψψ) bar-

ban 20°°°°C-on

a kísérletelején (mm)

a kísérletvégén (mm)

különbség(∆∆∆∆)

burgonyanélkül akísérletelején

burgonyávala kísérlet

végén

különbség(∆∆∆∆)

0,1 -2,670,2 -5,360,3 -8,240,4 -11,260,5 -14,500,6 -18,010,7 -21,770,8 -25,870,9 -30,091,0 -35,05

Izoozmotikus oldat:................................mól/liter Burgonya szöveténekvízpotenciálja:........................bar

Anyagok és eszközök

burgonya gumó

27

1,0 M-os szacharóz oldat, aceton

kémcsövek, kémcsőállvány, szike, cseppentő, főzőpohár, 2db 10ml-es pipetta, mm-

papír, burgonyavágó, vatta, üveglap, dugók, csipesz, üvegbot, ABBE-féle

refraktométer, törlőruha

28

5. NÖVÉNYI SZÖVETEK OZMOTIKUS POTENCIÁLJÁNAK (ψψψψππππ) MÉRÉSE

5/a Ozmotikus potenciál mérésére alkalmas módszerek

A. Sejtnedvextrakciós módszer

A magasabbrendű növények sejtjeiből nehéz tiszta sejtnedvet kivonni. Egyik

különleges módszer az, amikor levéltetvek segítségével nyerik ki az ép növény

háncsrészében levő rostacsövekben található nedvet. A levéltetű beszúrja szipókáját

egy edénnyalábba, s megkeres vele egy rostacsövet. Ha ilyenkor átmetszik az állat

szipókáját, a szipóka növényben maradt csonkján keresztül egy cseppnyi nedv

préselődik ki a háncsrészből. Ez az eljárás nem terjedt el.

A leggyakrabban egyszerűen kipréselik a sejtnedvet a parenchímasejtekből.

Óvatosan kell eljárni, hogy a sejtek minél kevésbé roncsolódjanak. Ezért a présbe

helyezett szöveteket fokozatosan növekvő nyomással préselik.

A membránok úgy tehetők permeábilissé az oldott anyagokra, hogy a szövetet

megfagyasztják, majd kiolvasztják. Az extrahált sejtek ozmotikus potenciálja

krioszkópos eljárással (ld. a feladat 5/b részénél), ozmométerrel vagy

pszichrométerrel határozható meg.

B. Plazmometriás módszer

Ez az eljárás egyedi sejtek vizsgálatára alkalmas. Az eljárás lényege, hogy a

vakuólum térfogatát (Vt) megmérik, majd a sejtet ismert ozmotikus potenciálú oldatba

(ψe) helyezik.

A plazmolízis után újra meghatározzák a vakuólum térfogatát (Vp). A sejtnedv

ozmotikus potenciálját (ψπ) a következő képlettel számolják ki:

ψπ = ψe . [Vp/Vt]

Föltéve, hogy egyensúlyi állapotban a plazmolizált sejt sejtnedvének a vízpotenciálja

egyenlő ψπ -vel, azaz a citoplazmatikus nyomás és a mátrixpotenciál figyelmen kívül

hagyható.

29

E módszerrel csak olyan sejtek esetében várható elég pontos eredmény, amelyek

szabályos alakúak, és ezekből is csak akkor, ha a plazmolizált protoplazma

hozzávetőleg szintén szabályos alakú, úgyhogy a vakuólum térfogata a méretek

mikroszkóppal való megméréséből kiszámítható.

A gyakorlatban az előnyös, ha a vizsgálandó szövet sejtjeinek egész populációját

plazmolizáljuk, s kiválasztjuk közülük azokat a sejteket, amelyeknek szabályos az

alakjuk és megfelelően plazmolizálódtak.

C. Határplazmolízis módszere

Ez az eljárás azon a feltételen alapul, hogy kezdődő plazmolízis esetén a sejtnedv

ozmotikus potenciálja egyenlő a külső oldat ozmotikus potenciáljával, azaz a

nyomáspotenciál nulla, a mátrixpotenciál és a citoplazma vízpotenciálja pedig elég

kicsi, s így eltekintünk tőlük.

Mivel elég nehéz meghatározni a plazmolízis kezdőpontját egy-egy sejtben, a

módszer főként homogén szövetekben föllelhető sejtpopuláció sejtnedvének átlagos

ozmotikus potenciáljának megállapítására való.

Az 50 %-os plazmolízisnek megfelelő ozmotikus potenciált tekintik a határplazmolízis

esetén a vakuólumban lévő nedv középértékének.

(Forrásmunka: Sutcliffe, J. F. 1982. A növények és a víz. Mezőgazdasági Kiadó,

Budapest)

5/b Növényi szövetek ozmotikus potenciáljának (ψπ) meghatározása

krioszkópiával

A növények ozmotikus potenciálja meghatározható a fagyáspontcsökkenés

jelensége alapján. Ismert tény, hogy a híg oldatok ozmotikus potenciálja

(oldatpotenciálja) állandó hőmérsékleten arányos az oldatban oldott anyagok

koncentrációjával. A nem disszociáló anyagok 1 mólos vizes oldatainak moláris

fagyáspont-csökkenése Tm = 1,86 °C. Mivel az ozmotikus potenciál a

30

koncentrációval arányos, a fagyáspont-csökkenésből (T) koncentrációra, illetve az

ozmotikus potenciálra lehet következtetni. Ha tehát egy oldat T-vel jelölt fagyáspont-

csökkenését meghatározzuk, ozmotikus potenciálját kiszámíthatjuk abból kiinduIva,

hogy 1,86 °C fagyáspont-csökkenésnek 0 °C-on -22,70 bar felel meg. Ha az

ozmotikus potenciált 20 °C-ra akarjuk megadni, akkor a Gay-Lussac törvény

alkalmazható.

1,86°C T -22,7 . T = → ψπ' = = - 12,2043 . T

-22,70 bar ψπ' 1,86 273 + t

ψπ = ψπ' . 273

T = mért fagyáspontcsökkenés (°C)t = hőmérséklet (példánkban t =20 °C)ψπ' = ozmotikus potenciál 0 °C-on (bar)ψπ = ozmotikus potenciál 20 °C-on (bar)

A munka menete

A gyakorlaton cukorrépa (Beta vulgaris cv. altissima) répatest-présnedvének

ozmotikus potenciálját határozzuk meg. A jól fejlett répatest súlypontjából, e feletti és

ez alatti részéből kb. 4-5 g-ot Petri-csészébe reszelünk. 10 percig a 3 minta felét

főzőpohárban, lefedve 100 °C-on vízfürdőben tartjuk. (Az élő szervekből kipréselt

nedv általában kisebb töménységű, mint a megölt szervekből származó présnedv,

mert az elhalt membránok elveszítik szemipermeábilis tulajdonságukat.) Várjuk meg,

míg a minták kihűlnek, majd darabka géz segítségével készítsünk présnedvet. A 3

minta másik felét - amit nem tartottunk vízfürdőn - közben szintén kipréseljük. Mérjük

meg a 6 minta szárazanyagtartalmát kézirefraktométerrel, vagy ABBE-féle

refraktométerrel! A mérések között acetonos vattával töröljük le a műszer prizmáját.

31

(A mérés során a minták hőmérsékletében ne legyen nagy eltérés!) Figyeljük meg,

hogy a répatest melyik részében található a legtöbb szárazanyag!

Krioszkópokban fagyasszuk le a 6 mintát és állapítsuk meg a fagyáspontcsökkenést!

A jegyzőkönyvben a 6 minta T, ψπ' , ψπ értékét és a refraktométeren leolvasott

értékeket kell megadni.

6. ábra OX-102 típ. krioszkóp

Az OX-102 típusú krioszkóp használata

A vastag falú hűtőedényt /1/ töltsük meg jégből, konyhasóból és kevés vízből álló

hűtőkeverékkel, amelynek a hőmérséklete 5-8 °C-kal legyen a 0 °C alatt. A fedőt

tegyük az edényre és nyílásaiba helyezzük el a szerelvényeket. A hűtőkeveréket

32

időnként a keverővel /4b/ keverjük meg és a hőmérsékletét a hőmérőn /8/ kísérjük

figyelemmel.

A vizsgálandó folyadékból (feladatunkban a cukorrépa présnedvéből) annyit öntsünk

a fagyasztóedénybe /3/, hogy a 0,01 °C pontos hőmérő /7/ higanyzsákja teljesen

belemerüljön a folyadékba. Ügyeljünk arra, hogy a hőmérő se a fagyasztóedény

falához, se a belső keverőhöz /4a/ ne érjen. Ezután állítsuk a fagyasztóedényt a

hűtő-kémcső /2/ dugónyílásán keresztül a hűtőköpenybe úgy, hogy a két edény fala

egymást ne érintse. Az így összeállított berendezést tegyük a hűtőedény /1/ középső

nagy nyílásán keresztül a hűtőkeverékbe. Az összeállítás után a fagyasztóedény

tartalmát kevergessük, hogy a vizsgálati anyag egyenletes hűlését elősegítsük. A

hőmérséklet csökkenése meglehetősen lassan történik, mert a légköpeny és a

fagyasztóedény közti levegőréteg hőszigetelőként szerepel. Amint a folyadék

hőmérséklete 0,5 - 1 °C-kal a várható fagyáspont alá süllyed, a belső keverő /4a/

erélyes mozgatásával indítjuk meg a fagyást. A folyadék ugyanis legtöbbször nem

fagy meg magától, hanem „túlhűtés” következik be. Ilyenkor a folyadék fagyását

könnyebb elindítani, ha a fagyasztóedény /3/ oldalnyílásán keresztül a folyadék

megfagyott kristályait, esetleg külön lehűtött üveggyöngyöt juttatunk a túlhűtött

folyadékba. A fagyás beálltakor a felszabaduló fagyáshő a hőmérő higanyszálát

hirtelen a fagyáspont hőmérsékletére emeli fel, melyen a higanyszál megállapodik. A

készülékkel előbb a tiszta oldószer, majd az oldat fagyáspontját az ismertetett

módon meghatározva, a mért hőmérsékleti értékek különbségeiből az oldat

fagyáspontcsökkenése adódik. (A feladat során a tiszta oldószer fagyáspontját nem

kell meghatározni, mert vizes oldatról van szó és tudjuk, hogy a víz fagyáspontja

0°C-on van.)

Az eljárás mérési pontossága 1-3 %.

(A hűtőedény fedelén külön nyílások vannak a hűtőkeverék hőmérsékletének

mérésére szolgáló hőmérő /8/, a megolvadt hűtőkeveréknek a fedő leemelése nélküli

eltávolítására alkalmas szivornya /5/ és a gumis pipettát tartalmazó kémcső /6/

részére. Ebben a hűtőkeverék hőmérsékletén tarthatjuk a fagyasztóedénybe /3/

szükség esetén pótlandó anyagot.)

33

Megjegyezés: A módszer hibaforrása az, hogy a préslé egy része nem sejtnedv,

hanem a sejtfalból és a plazmából származó "törmelék". E módszer elsősorban

erősen vakuolizált szövetekre alkalmazható.

Anyagok és eszközök

cukorrépa, konyhasó, jég, aceton

krioszkópok, reszelő, Petri-csésze, főzőpohár, kézirefraktométer, ABBE-féle

refraktométer, kémcsövek, géz, facsipesz, lábas, szike, tölcsér, kémcsőállvány,

vegyszerkanál

34

6. KÜLÖNBÖZŐ TÍPUSÚ NÖVÉNYEK VÍZTARTÓ KÉPESSÉGÉNEKÖSSZEHASONLÍTÁSA

A növények vízmegtartó képességét elsősorban az határozza meg, hogy melyik

ökológiai csoportba tartoznak. Más a xerofiton, a mezofiton, illetve a higrofiton

növények vízmegtartó képessége. E képesség szoros összefüggésben van a

növények morfológiájával (pl. hajtás/gyökér arány, kutikula vastagsága,

gázcserenyílások száma és elhelyezkedése stb.), de a növények fejlődési és

fiziológiai állapota, az anyagcsere intenzitása is hatással van a vízmegtartó

képességre.

Például a kultúrnövényeinknél - melyeknek többsége mezofiton – levágva a

leveleket, a fiatal levelek rendszerint hamarabb elvesztik víztartalmukat, mint az

idősebbek, mert kutikulájuk vékonyabb. Ép növényeken azonban más a helyzet. A

fiatal levelek plazmája kevés szabad vizet tartalmaz, élénk anyagcserét folytat, és

ennek folytán képes elvonni a vizet az idősebb levelektől, aszályban tehát azok

víztartalmának rovására életben marad. A vékonyabb kutikulájú fiatal levelek

élénkebb párologtatása ugyancsak hozzájárulhat ahhoz, hogy az idősebb levelek

vize a fiatalabb levelekbe áramlik. Az elölt növényi szervek hamarabb elvesztik

víztartalmukat, mint az élők. Ha a légzést gátoljuk, a határhártyák permeabilitásának

növekedése miatt szintén csökken a vízmegtartó képesség.

Kísérletünkkel nyomon tudjuk követni három különböző ökológiai csoportba tartozó

növény laboratóriumi körülmények közötti vízmegtartó képességét.

Kísérleti növények: xerofiton (szukkulens): Buxus sempervirens, mezofiton:

Pelargonium zonale, higrofiton: Vallisneria spiralis

A munka menete

A különböző típusú növények leveléből dugófúróval 5-5 korongot kivágunk, vagy

néhány kisebb levelet leválasztunk. A növények leveléről a nedvességet

35

szűrőpapírral felitatjuk, a korongokat (leveleket) növényenként torziós mérlegen

lemérjük és Petri-csészébe tesszük. A mérést 10 percenként ismételjük, mindig

feljegyezve az időpontot és az akkor megállapított tömeget. 60 perc múlva a

vizsgálatot befejezzük és az adatokat táblázatba rendezzük.

A szárazanyag-tartalom (eredeti víztartalom) meghatározásához helyezzünk

növényenként 5 db ismert össztömegű levélkorongot (levelet) szárítószekrénybe

(105 °C) 1 óra időtartamra, majd mérjük vissza.

Az egyes időpontokban kapott értékekből kiszámítjuk a vízveszteségeket a friss

tömeg százalékában és táblázatba foglaljuk, illetve grafikonon ábrázoljuk.

A visszamért szárazanyagot is a friss tömeg százalékában fejezzük ki! A

szárazanyag-tartalom ismerétében számoljuk ki az eredeti víz %-t ( = 100 - sz.a.%)

és ezt is növényenként ábrázoljuk a grafikonon!

NövényFriss tömeg (mg)Idő (perc) 10 20 30 40 50 60 10 20 30 40 50 60 10 20 30 40 50 60A növény aktuálistömege (mg)Vízveszteség (mg)Vízvesztés a frisstömeg % - ábanSzárazanyag (mg)Eredeti víz tart. (%)

Anyagok és eszközök

Buxus sempervirens, Pelargonium grandiflorum, Vallisneria spiralis

torziós mérlegek, olló, csipesz, Petri-csésze, szűrőpapír, főzőpohár, mm-papír

36

7. A KUKORICA AKTUÁLIS TELÍTETTSÉGI HIÁNYÁNAK ÉSIGÉNYBEVÉTELÉNEK MEGÁLLAPÍTÁSA

A növények víztartalmuk bizonyos hányadát átmenetileg elveszíthetik anélkül, hogy

jelentős károsodást szenvednének, elpusztulnának. Tartós szárazság esetén

azonban felborul a növények vízmérlege, a vízleadásukat nem egyenlíti ki a

vízfelvételük. Ez a turgeszcencia csökkenéséhez, a levélzet lankadásához vezet. A

lankadást a növények kiheverik, ha pl. éjszaka a vízmérlegük helyre áll. Amennyiben

a növények már éjszaka sem nyerik vissza turgorukat, a vízhiányok összegződése

irreverzibilis károsodáshoz, hervadáshoz vezet. Ilyenkor már a gyökérszőrök is

elpusztulnak és megszakad a növény és a talaj közötti kapcsolat.

Az aktuális és a kritikus telítettségi hiány értékének ismerete az öntözés

szempontjából különösen fontos. Az aktuális telítettségi hiány (vízdeficit) azt a

vízmennyiséget jelenti %-ban, ami a vizsgálati időpontban mért víztartalom és a

maximális víztartalom értéke közötti különbség (a maximális víztartalom %-ban

kifejezve). A kritikus telítettségi hiány azt a vízdeficitet jelenti, amelynél a növény

helyrehozhatatlanul károsodik. Ennek értéke elsősorban a növényfajtól függ, de

külső és belső tényezők is befolyásolják.

Amennyiben a kritikus telítettségi hiány értékét ismerjük, a naponként mért

vízvesztés menetéből előre jelezhetjük - hogy az időjárás változatlansága esetén -

mikorra válik elkerülhetetlenné az öntözés.

Azt is kiszámíthatjuk, hogy a szárazság hány százalékra vette igénybe bizonyos

időpontokban a növény kiszáradástűrését. Ez az igénybevétel százaléka.

aktuális telítettségi hiányIgénybevétel = X 100

kritikus telítettségi hiány

37

A munka menete

1. Kukorica levelekből parafaalátéten dugófúróval 20 db 1cm átmérőjű korongot

vágunk. Ügyeljünk arra, hogy a korongok a levelek azonos helyéről származzanak.

Ha a leveleket szántóföldön gyűjtjük be, tegyük nylon zacskóba őket, hogy a

vizsgálat megkezdéséig a további vízvesztést minimálisra csökkentsük.

10 korongot tömegmérés (A) után világos helyre állított Petri-csészében vízbe

teszünk, 10 db-ot szárítószekrényben 105 °C-on súlyállandóságig szárítunk.

2. Kb. 2 óra múlva a levélkorongokat kivesszük a vízből is és a szárítószekrényből is.

A vizes korongokat szűrőpapírral megszárítjuk és tömegüket megmérjük (T). A

szárítószekrényből származókat exszikkátorban hűlni hagyjuk, majd újra megmérjük

a tömegüket (SZ).

Az eredmények kiértékelése

A telített levél víztartalma: vízmax = T - SZ

Az aktuális víztartalom: vízakt = A - SZ

Aktuális telítettségi hiány %: Hakt = [(vízmax - vízakt) / vízmax] . 100

Számoljuk ki a kukorica levelek igénybevételét! A kukorica kritikus telítettségi hiánya

60 %.

Számoljuk ki a kukorica szukkulencia fokát!

szukkulencia fok = víztartalom (g) / kétszeres levélfelület (dm2) =

= vízmax / a 10 korong területének kétszerese (dm2)

Anyagok és eszközök

kukorica levelek

parafaalátét, dugófúró, Petri-csésze, szárítószekrény, exszikkátor, mérleg

38

8. PROLIN-PRÓBA A VÍZHIÁNY KIMUTATÁSÁRA

Optimális vízellátás esetén csak nyomokban mutatható ki a levelekből a prolin.

Vízhiány hatására a kloroplasztot tartalmazó szövetekben a prolin koncentrációja

megnő, tartós szárazság esetén a prolin koncentráció az összes aminosav-tartalom

80 %-át is elérheti.

A prolin felhalmozódása számos biokémiai változás eredménye lehet. Pl. csökken a

beépülése a fehérjékbe, mérséklődik oxidatív lebomlása a mitokondriumokban;

akkumulációja mégis legnagyobb mértékben a glutaminsav prolinná való fokozottabb

átalakulásából ered.

A prolin felhalmozódása több szempontból előnyös. Higroszkópossága,

vízoldékonysága következtében növeli az erősen kötött víz mennyiségét. Erősíti a

vízstressz hatására labilissá váló sejtszerkezetet.

Fontos szerepe van a fiziológiai szárazság tolerálásában is, melyet a talajokban levő

nagy sótartalom valamint alacsony talajhőmérséklet vált ki.

A munka menete

Különböző mértékű szárazságstressznek kitett, valamint optimális vízellátottságú

növények levelét 60 °C-on tömegállandóságig szárítjuk. A szárított levelekből a

vizsgálathoz bemérünk 200 mg-ot, majd dörzscsészében késhegynyi kvarchomok

jelenlétében pár ml 20 %-os etanollal pépesre dörzsöljük.

Az extraktum térfogatát etanollal mérőhengerben 10 ml-re egészítjük ki, majd az

egészet centrifugacsövekbe öntjük és 6000-es fordulatszámon 15 percig

centrifugáljuk.

Centrifugálás után a felülúszót 10 ml-es osztott kémcsőbe töltjük át. (aminosav

törzsoldat)

Izatin-indikátor papírra a vizsgálandó levélextraktumok számával megegyező 2 cm

átmérőjű kört rajzolunk ceruzával.

39

E körökbe az aminosav törzsoldatból pipettával pár cseppet szélesztünk

csigavonalban úgy, hogy a folt a kör belsejét kitöltse.

A nedves foltokat felvitel után infralámpa alatt megszárítjuk, majd az izatin-indikátor

papírokat előhívás céljából 15-20 percre kb. 60 °C-os szárítószekrénybe tesszük.

Az izatin-indikátor papíron levő foltok színeződése alapján állapítsuk meg a

vízellátottság, illetve vízdeficit mértékét.

Az izatin-indikátor papíron lévő foltok színeződése és a levélextraktum prolintartalma

között az alábbi összefüggés áll fenn:

A tiszta izatin-indikátor papír sárga színű, míg kevés prolintartalom esetén, az

indikátor papíron levő folt barnásrózsaszínes színeződést mutat.

Enyhe vízdeficit esetén a folt zöldes árnyalatú, s a vízdeficit növekedésével

fokozatosan átmegy zöldes-kék, majd kék színbe.

Közepes vízhiány esetén már kék színű a folt, s ez a kék szín a vízhiány illetve

prolinfelhalmozódás mértékével arányosan mélyül.

Erős vízdeficit esetén a folt sötétkék színű.

Megjegyzés:

A vizsgált növényi részekből, levelekből aminosav törzsoldatot is készíthetünk

későbbi analízisekhez. Az aminosav törzsoldat valamint az izatin-indikátor papír

készítésének leírása a függelékben található.

Anyagok és eszközök

különböző mértékű szárazságstressznek kitett és öntözött növények levelei

20 %-os etanol, kvarchomok, izatin-indikátor papír

10 ml-es osztott kémcső, pipetta, hajszárító, dörzscsésze, szárítószekrény,

centrifuga

40

9. A SZTÓMÁK VISELKEDÉSE KÜLÖNBÖZŐ pH-ÉRTÉKŰ PUFFEROLDATOKBAN

Eltérően más epidermisz sejtektől, a zárósejtek kloroplasztiszokat tartalmaznak,

melyeknek a sztómanyitódás fotoaktív reakciójában alapvető szerepük van. Ezekben

a kloroplasztiszokban mindkét fotokémiai rendszer megtalálható, viszont nem

működik bennük a Calvin-ciklus. A zárósejtekben található keményítő az epidermisz

alatti mezofillumsejtekben asszimilált cukrokból szintetizálódik. Ezek a cukrok éjjel

vándorolnak be a zárósejtekbe, ahol keményítővé alakulnak. Éjjel a legtöbb növény

zárva tartja sztómáit, emiatt a légzésből származó és távozni nem tudó CO2

savasítja a sejtek környezetét. Reggel a fényre beinduló fotoszintézis miatt, az oldott

CO2 tartalom lecsökken, ezért a pH emelkedni kezd. A semleges irányba elmozduló

pH kedvez a keményítő lebontásának és ezáltal ozmotikusan aktív anyagok

képződésének (kálium-malát). A kálium-malát felhalmozódása a vakuólumban

vízfelvételhez vezet, ez a zárósejtek turgorát és a sztóma nyitódását idézi elő.

Megjegyezzük, hogy a fénynek más hatása is van: biztosítja a K+ felvételhez

szükséges ATP, és az almasav kialakulásához szükséges NADPH2 képződését az

aciklikus elektrontranszport működtetése révén, másrészt aktivál két, az almasav

kialakulásában szerepet játszó enzimet; a PEP-karboxilázt és a NADP-specifikus

almasav-dehidrogenázt. Éjjel, sötétben a fény ezen hatásai nem működnek, ezért

kálium-malát nem képződik, viszont a meglévő kálium-malát a légzésben lebomlik.

Ez a víz kiáramlását, a turgor csökkenését, a sztómák záródását idézi elő.

A pH változás (amit normál körülmények között elsősorban a fény és CO2 befolyásol)

tehát a glikolízis és a glükoneogenezis szabályozásával hat a sztóma nyitódásra.

A pH-nak ezt a hatását közvetlenül is demonstrálni tudjuk az alábbi kísérlettel.

Célkitűzés: Annak bemutatása, hogy a pH-érték milyen módon befolyásolja a

sztómák működését.

41

A munka menete

Készítsünk acetát-puffer sorozatot a következők szerint:

pH-érték 3,5 4,5 6,0 7,0

0,1 n ecetsav, ml 9,5 6,7 0,6 -

0,1 n Na-acetát, ml 0,5 3,3 9,4 10,0

Muskátli levélfonákáról húzzunk le kis epidermisz-darabokat és helyezzünk 1-1-et

minden pufferoldatba. Szobahőmérsékleten, szórt fény mellett tartva, 1 óra múlva

vegyük ki a nyúzatokat, tegyük tárgylemezre, és a megfelelő pufferanyaggal

megcseppentve fedjük le azokat. Mikroszkóppal vizsgálva állapítsuk meg a sztómák

nyitottsági fokát. Nyitott, közepesen nyitott és zárt kategóriák szerint értékeljük!

Kiértékelés, következtetés

- Írjuk a pH-értékek alá a nyitottsági fokot!

pH-érték 3,5 4,5 6,0 7,0

nyitottsági fok ..... ..... ..... .....

- Milyen összefüggésben vannak a pH értékváltozásai a fotoszintézis intenzitásával?

- Készítsünk rajzot a különböző nyitottsági állapotban lévő sztómákról!

Anyagok és eszközök

muskátlilevelek

0,1 n ecetsav, 0,1 n Na-acetát

óraüvegek, tárgylemez, fedőlemez, szemcseppentő, mikroszkóp

42

10. SZTÓMÁK VIZSGÁLATA KOLLÓDIUMOS LEVONATON

A növények vízgazdálkodásában fontos szerepet játszik a gázcserenyílások

egységnyi területre eső száma és nyitottsági foka. A sztómák számának és

nyitottságának megállapítására több módszer alkalmazható (pl. infiltrációs,

porométeres stb.) köztük a kollódiumos eljárás is. Éteres kollódiumoldat a levélen

vékony bevonatot, hártyát alkot. A lehúzott hártyán az epidermisz felületének pontos

lenyomata látható. A kollódiumos módszerrel ugyanazon levélről bármikor és

bármennyi lenyomatot készíthetünk anélkül, hogy a levél megsérülne. Hátránya,

hogy csak szőrképlet nélküli leveleken alkalmazható.

A munka menete

Különböző fajhoz tartozó növények levelének színére és fonákára ecsettel 4 % -os

kollódiumoldatot kenünk. Az oldószer elpárolgása után képződött vékony

kollódiumhártyát csipesszel lehúzzuk és mikroszkóp alatt megszámoljuk a levél

színéről és fonákáról származó hártyadarabkákon a látómezőbe eső sztóma

lenyomatokat. A látómezőbe eső sztóma számát 5 számlálás középértéke alapján

adjuk meg. A látómező területének kiszámításához a látómező átmérőjét

tárgymikrométer segítségével mérjük meg. A sztómák hosszának, szélességének és

a nyitottság fokának megállapításához okulár mikrométert használjunk. A

jegyzőkönyvbe adjuk meg a különböző fajok levelének színén és fonákán

megállapított sztómasűrűséget, a sztómák hosszát, szélességét és nyitottságát.

Anyagok és eszközök

különböző levelek

4 %-os kollódiumoldat

mikroszkóp, okulár és tárgymikrométer, csipesz, tárgy- és fedőlemez, ecset

43

11. VÍZKULTÚRÁS KÍSÉRLETEK

11/a A vízkultúrás kísérletek általános szempontjai

A tápelemek szükségességét, jelentőségét legszembetűnőbben a vízkultúrás

kísérletekkel igazolhatjuk.

A víztenyészeteket elsőként SACHS (1860) és KNOP (1865) alkalmazta. A tápoldat

különböző sók keverékének vizes oldata, amely a növény növekedése, fejlődése

szempontjából szükséges makroelemeket vagy azok nagy részét megfelelő

koncentrációban tartalmazza.

Azt a tápoldatot, amelyben az adott növény számára szükséges valamennyi

makroelem megtalálható alap vagy teljes tápoldatnak nevezzük. Ellenkező esetben

hiányos tápoldatról beszélünk. Ha az alaptápoldathoz mikroelemeket is adagolunk,

akkor az úgynevezett kiegészített tápoldatot kapjuk.

A tápoldatok összetételét, sajátságát mindig az adott növényfaj igénye illetve a

kísérlet célja határozza meg. Nincs általánosan elfogadható, univerzális oldat, mert

különböző a növények igénye az ásványi anyagok mennyiségét és az egymáshoz

viszonyított arányát tekintve. A növények különböző fejlődési stádiumaiban is

különböző igényeket támasztanak a tápoldatok összetétele iránt.

Minden tápoldatban megtalálható a N, P, K, Ca, Mg, S, Fe és fő mikroelemként a B,

Mn, Cu, Zn, Mo.

A tápoldatokban az egyes elemek különböző vegyületekben fordulnak elő, eltérő az

egyes tápoldatok kémhatása valamint a sókoncentráció. Különbség van még a

tápoldatokban előforduló mikroelemekben, adalék-anyagokban és a pufferoló

képesség tekintetében.

Az a megfelelő tápoldat, amely kellő mennyiségben tartalmazza a növény számára

szükséges valamennyi tápelemet, és amelyben a helyesen megválasztott

makroelem készlet megakadályozza a közeg jelentősebb mértékű

44

kémhatásváltozását. Ez utóbbi cél eléréséhez olyan sópárokat kell választani,

melyek az oldat pH-jára gyakorolt hatásukat illetően valamilyen módon kompenzálják

egymást, az egyik fiziológiailag savas, a másik fiziológiailag lúgos hatást fejt ki.

Az optimális tápoldatnak a legnagyobb termést kell biztosítania azon legkisebb

koncentráció esetén, amelynek emelése nem ad további javulást.

Fontos, hogy a szükséges tápelemek koncentrációja feleljen meg a felvétel

gyorsaságának, figyelembe véve az edény térfogatát valamint az oldatcsere

gyakoriságát, a kémhatás stabilitását valamint könnyű diffúziót a gyökérzónában.

A makroelemek szokásos koncentrációját meghatározza: a növényfaj, a növény

fajtája, növény kora, az oldatcsere gyakorisága, a megvilágítás erőssége, a

levegőztetés gyakorisága, más ionok koncentrációja.

A tápoldatok összkoncentrációja általában 0,1-0,5 % közötti.

Általános elv, hogy fiatalabb növényeknek hígabb, idősebbeknek fokozatosan

töményebb oldatot kell adni.

A korszerű tápoldatok ozmotikus potenciálja -0,4 és -1,0 bar között van. Fontos,

hogy az ozmotikus potenciál ne legyen negatívabb -1,0 illetve -1,5 bar-nál.

A közeg kémhatása legtöbb esetben 4,5 - 6,0 pH-érték közötti.

4 pH alatt károsodik a gyökér, és ezáltal gyengül a tápanyagok felvétele, lelassul a

növekedés. A pH-érték felső határa pH 9 körül van. 9 pH-hoz közel a P, Ca, Fe és

sok mikroelem (pl. Mn) felvehetősége csökken.

A vízkultúrás kísérletek során használt edények térfogata függ: a növényfajtól, a

növény fajtájától, a kísérlet körülményeitől, a kísérleti céltól, az oldatcsere

gyakoriságától.

A kísérlet során a tápoldatot többször kell cserélni. Az oldatcsere gyakoriságát

befolyásolja: a növény faji tulajdonsága, a kísérlet célja, az edény térfogata.

Az oldatcserék között naponta pótolni kell a transzspiráció következtében beálló

vízveszteséget.

45

Az oldatot levegőztetni kell, hogy a gyökerek tápanyagfelvétele hatékonyan

működjön. A tápközeg levegőztetésére általában sűrített levegőt használnak, melyet

üvegcsövön át juttatnak a tápoldatba.

A levegőztetés időtartama, gyakorisága függ: a növényfajtól, a növény fajtájától, a

növény korától, az edény térfogatától, az edény felszínének nagyságától.

A kísérlet kezdetén általában 15-20 percig szükséges levegőztetni.

A tápoldatokat gyakran meg kell újítani, hogy a tápanyagok koncentrációja csak

kevéssé változzon.

(Forrásmunka: Haraszty Á. 1979. Növényszervezettan és növényélettan.

Tankönyvkiadó, Budapest; Szalai I. 1994. A növények élete. JATEPress, Szeged)

11/b Hiánytünetek vizsgálata fiatal egyszikű és kétszikű növényeknél

Az ásványi tápelemek jelentőségét a növények növekedésében, fejlődésében jól

tanulmányozhatjuk az alábbi vízkultúrás kísérlettel. A növény számára optimális

tápanyagellátás (teljes tápoldat) esetén nem lépnek fel hiánytünetek a növényen.

Ezzel szemben, ha a növényt hiányos tápoldatban neveljük, a növényen

hiánytünetek jelentkeznek.

Az alábbi kísérlet során egyes ásványi anyagok (N, P, Fe, Mg) hiánytüneteit

figyelhetjük meg.

A munka menete

Az ásványi anyagokat tartalmazó törzsoldatokból különböző összetételű tápoldatokat

készítünk (lásd a mellékelt táblázatot).

A tápoldatokat a tenyészedényekbe öntjük, majd belehelyezzük a sziklevél nélküli

bab és kukorica csíranövényeket. A kísérleti edényeket sötét papírral (alufóliával)

borítsuk be az algásodás megakadályozására.

46

A kísérlet időtartama alatt folyamatosan gondoskodni kell a tápoldatokból elpárolgott

víz pótlásáról, valamint a növények kiemelésével a gyökerek gázcseréjének

biztosításáról. Fontos továbbá, hogy a tápoldatokat hetente újítsuk meg.

A hiánytünetek kialakulása hosszabb időt vesz igénybe, ezért a kísérlet kiértékelése

5-6 hét múlva történjék. 2-3 hét után Fe-EDTA kiegészítést adva a vashiányos

növényeknél megfigyelhetjük a hiánytünet megszűnését.

A kísérlet során kövessük figyelemmel: a hiánytünetek kialakulását, a növények

magasságát, a gyökerek hosszát, az internódiumok, levelek számát, a szár, a

levelek és a gyökerek színét, a növények friss tömegét, a hajtás és gyökér arányát.

A tápoldatok összetétele (1l-be bemérendő törzsoldatok ml-e)

Törzsoldatok Teljes N-mentes P-mentes Fe-mentes Mg-mentes

10 % - os oldatokCa(NO3)2

.4H2O 5 - 5 5 5(NH4)2SO4 2,5 - 2,5 2,5 2,5MgSO4

.7H2O 2,5 2,5 2,5 2,5 -KNO3 2,5 - 2,5 2,5 2,5KH2PO4 1,25 1,25 - 1,25 1,25KCl - 2,5 1,25 - -K2SO4 - 2,5 - - 2,5CaCl2.2H2O - 5 - - -Fe-EDTA (1 % - os) 3 3 3 - 3

0,1 % - os oldatokH3BO3 3 3 3 3 3MnCl2.4H2O 2 2 2 2 2CuSO4

.5H2O 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1ZnSO4

.7H2O 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1Al2(SO4)3

.18H2O 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05NiSO4

.6H2O 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05CoCl2.6H2O 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05H2MoO4 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025H2O 977,875 977,875 977,875 980,875 977,875

47

Anyagok és eszközök

bab és kukorica csíranövények

tenyészedény, mérőhenger, mikropipetta, törzsoldatok

(Forrásmunka: Ördög V. - Molnár Z. - Péter J. 1995. Növényélettani gyakorlatok.

PATE Mosonmagyaróvár)

11/c Hiánytünetek határozó kulcsa

A. A hiánytünetek többnyire az idősebb vagy az alsó leveleken jelennek meg; a

hatás lokalizált, vagy általános

I. A hatás többnyire az egész növényre kiterjed; az alsó levelek többnyire

elszáradnak, vagy elhalnak

1.A növény felső levelei világoszöldek, az alsóbb levelek sárgák, világos vagy barna

foltokkal; a szár rövid és gyenge, ha a hiány a fejlődés későbbi szakaszában

jelentkezett -----------------------------------------------------------------------------NITROGÉN

2.A növény abnormálisan sötétzöld, gyakran vöröses vagy bíborszínű; az alsó

levelek néha sárgák, száradva zöldesbarnák vagy feketék. A hajtás rövid és

gyenge, ha a hiány a fejlődés későbbi szakaszában lépett fel -------------FOSZFOR

II. A hatás többnyire lokalizált; a levelek foltosak vagy klorotikusak; az alsó leveleken

elhalt szöveti foltokkal, vagy azok nélkül; az alsó levelek kicsinyek, de nem

száradnak el

1.A foltos vagy klorotikus levelek – típusos esetben - vörösödő, néha elhalt foltokkal;

a levél csúcsa és széle csészeszerűen felgörbül; a szár gyenge ------MAGNÉZIUM

48

2.A foltos vagy klorotikus leveleken nagy, vagy kicsiny elhalt szöveti foltok vannak;

2.a. Az elhalt szövetfoltok kicsinyek, rendszerint a csúcson és az érközökben,

többnyire a levélszéleken; a szár gyenge ----------------------------------------KÁLIUM

2.b. A foltok (pettyek) általánosak, gyorsan nagyobbodók, általában a levélerek

között; a levelek kicsinyek, a szár internódiumai rövidek ------------------------CINK

B. A hiánytünetek csak a rügyleveleken jelennek meg (lomblevélen nem), a tünetek

lokalizáltak

I. A csúcsrügy elhal, a következő fiatal levelek a csúcsukon elhaltak, vagy a bázison

torzultak

1.A terminális rügy fiatal levelei először horgasak, majd elhalás előtt a csúcson és a

bázison kiegyenesednek, később ezeken a pontokon kimetszettek -------KALCIUM

2.A terminális rügyek fiatal levelei alapjaikon világoszöldek, végül itt eltörnek; a

később fejlődött levelek törpék, a csúcsi rész elhal -----------------------------------BÓR

II. A csúcsrügy általában életben marad; a fiatal levelek fonnyadtak, vagy

klorotikusak; elhalási foltok nélkül; az erek világosak, vagy sötétzöldek

1.A fiatal levelek állandóan fonnyadtak, foltok, vagy jellemző klorózis nélkül; a szár a

csúcs alatt képtelen felegyenesedni; a fejlődés későbbi szakaszán a hiány akuttá

válik -----------------------------------------------------------------------------------------------RÉZ

2.A fiatal levelek nem hervadtak; klorózis esetében elhalt szöveti foltokkal, vagy

anélkül

2.a. Az elhalt szöveti foltok elszórtan helyezkednek el a levél felületén, a kisebb erek

zöldek, hálózatos szerkezetet formálnak ---------------------------------------MANGÁN

2.b. Elhalt foltok nem jelennek meg; a klorózis nem terjed ki az erekre, azok világos-

vagy sötétzöldek

a. A fiatal levelek erei és intercostalis szövetei világoszöldek ------------------KÉN

49

b. A fiatal levelek klorotikusak, az erek sötétzöldek, a szár rövid és fejletlen ------

-----------------------------------------------------------------------------------------------VAS

(Forrásmunka: Szalai I. 1994. A növények élete. JATEPress, Szeged)

Megjegyzés:

Az egyes kultúrnövények hiánytüneteinek pontosabb meghatározásához jól

használható az alábbi könyv: Bergman, W. 1979. Termesztett növények táplálkozási

zavarainak előfordulása és felismerése. Mezőgazdasági Kiadó, Budapest

50

12. FOTOSZINTETIKUS PIGMENTEK VIZSGÁLATA

A fotoszintetizáló növények zöld színét klorofillok adják. A magasabb rendű

növények a- és b-klorofillt tartalmaznak, az algákban egyéb klorofillok is előfordulnak

(klorofill-c,-d,-e). A klorofillok mellett járulékos pigmentként karotinoidok (karotinok,

xantofillok) is találhatók, melyek a klorofillokhoz hasonlóan szerepet játszanak a

fotoszintetikusan aktív fény elnyelésében és továbbításában, de a karotinoidok

speciális funkciója az, hogy védőpigmentként megvédik a klorofillokat a

fotodestrukciótól. A karotinoidok nem képesek a fényenergia kémiai energiává

alakítására, ezt a feladatot a reakciócentrumokban (P680, P700) a fehérjékkel

kapcsolódó klorofill-a molekulák látják el. Ezzel függ össze az, hogy míg klorofill-b

illetve karotinoidhiányos mutánsok léteznek, olyan fotoszintetikusan aktív magasabb

rendű növényt még nem találtak, amely klorofill-a-t ne tartalmazott volna.

(Megjegyezzük, hogy a karotinoidhiányos mutánsok szélsőségesen fényérzékenyek

és fotoszintézisre csak igen alacsony fényintenzitás mellett képesek.)

A fotoszintetikus pigmentek a kloroplasztiszok belső membránrendszerében

fehérjékhez kapcsolódva találhatók. E kapcsolat miatt torzul a pigmentek

fényelnyelésért felelős π-elektronfelhők szerkezete, ezért megváltozik a

fényelnyelőképességük, abszorpciós maximumuk eltolódik a szerves oldószerekben

mért abszorpciós maximumhoz képest. A szerves oldószerek a fehérjéket

denaturálják, a pigmenteket kivonják a pigment-protein komplexekből. A

színanyagok a kloroplasztiszok fehérjéihez kötődnek, ezért a vízmentes szerves

oldószerek nem alkalmasak a nyers klorofill oldatok előállítására. A klorofill és

fehérje közötti kötéseket először el kell bontani és erre a víztartalmú szerves

oldószerek alkalmasabbak.

A kloroplasztisz szerkezetéhez való kapcsolódás formája és erőssége ugyanazon

pigment különböző abszorpciós maximummal rendelkező formáit alakítja ki (in vivo

pigmentformák). Ezek lehetővé teszik a fény széles sávban történő abszorbeálását.

51

A klorofillok porfirinvázas vegyületek: négy pirrolgyűrűt metinhidak (-CH=) ciklikusan

kapcsolnak össze (ciklikus tetrapirrolszármazékok). A pirrolgyűrűk metinhidakkal

nem kapcsolódó szénatomjaihoz metil-, etil-, vinilcsoport kötődik. A III. pirrolgyűrű és

a szomszédos metinhíd között öt szénatomos gyűrű (izociklus pentanongyűrű) jön

létre, aminek karboxilcsoportját metilalkohol észterifikálja. A IV. gyűrűhöz

propionsavgyök kapcsolódik, aminek karboxilját egy 20 szénatomos telítetlen

alkohol, a fitol észteresíti. Ezáltal a molekula amfipatikussá (hidrofil és hidrofób

sajátosságúvá) válik. A porfirinvázban centrális fématomként magnézium található.

Az a-klorofillban a II. pirrolgyűrű egyik szubsztituense metil-, a b-klorofillban

aldehidgyök.

A karotinoidok (karotinok, xantofillok) 8 izoprénegységből álló 40 szénatomos

vegyületek. A molekulalánc gerincét izoprén egységek alkotják, két végén általában

jonongyűrűk vannak. A karotinokkal ellentétben a xantofillok jonongyűrűin OH-

csoportok is találhatók.

Fejlett levelekben a karotinoid tartalom a klorofill mennyiségének 1/3-a, azaz a

kloroplasztiszok szárazsúlyának 8-10 %-a, illetve a levél szárazsúlyának 0,5-1 %-a.

Előfordulásukra a következő moláris arány jellemző:

klorofill-a : klorofill-b : xantofill : karotin = 8 : 2 : 3 : 3

A különböző fotoszintetikus pigmentek mennyisége és aránya összefüggésbe

hozható a növény fiziológiás állapotával.

12/a Kloroplasztisz színanyagainak szétválasztása megoszlási papír-

kromatográfiával

A papírkromatográfiáról

A kromatográfiás szűrőpapírt alkotó cellulózrostok vizet kötnek meg, és ez a

cellulózhoz kötött víz képezi a megoszlási kromatográfia álló fázisát. A szűrőpapírba

beszívódó benzol alkotja a mozgó oldószerfázist. Amikor a benzol eléri az

elválasztandó anyagkeveréket a startvonalnál, az anyagkeverék feloldódik, és

megoszlás jön létre a papírhoz kötött vizes fázis és a benzolos fázis között.

52

Végeredményben, mire az oldószer (benzol) a papírcsík hosszában végigvándorol,

igen nagy számú megoszlás játszódik le az álló és mozgó fázis között. A benzolos,

mozgó fázisban jobban oldódó xantofill nagyobb utat tesz meg, mint a benzollal

telített vizes fázisban is jól oldódó klorofillok, amelyek az álló fázisban elidőzve

lemaradnak. Az erősen apoláros jellegű karotin az oldószer frontjával együtt mozog,

mivel az álló fázisban gyakorlatilag nem oldódik.

A munka menete

A friss, zöld növényi részt késhegynyi MgCO3 és kevés kvarchomok jelenlétében

eldörzsöljük. Vízelvonás céljából késhegynyi vízmentes Na2SO4-et adunk az

összezúzott anyaghoz. A homogenizátumot néhány milliliter kloroformmal

extraháljuk, majd tölcsérben, kevés vattán keresztül jól zárható széles nyílású

üvegedénybe szűrjük. Igyekezzünk minél töményebb színanyag oldathoz jutni.

Kromatográfiás papírból kb. 2 cm széles csíkot vágunk ki. A papírcsík egyik végét a

kloroformos extraktumba mártjuk és azt 1-2 cm magasságig szívatjuk. Ha a kivonat

híg, a felszívatást megismételjük, miután az oldószer elpárolgott, esetleg többször is,

de mindig ugyanolyan magasságig. Az extraháló szer elpárolgása után a papírcsík

végét tiszta oldószerbe helyezzük, és a színanyagokat egyetlen egyenes, vékony

sávba szívatjuk össze, ez lesz a startvonal, ceruzával oldalt jelöljük meg. (A

startvonalnak kb. egy tompa zöld színes ceruzával húzott egyeneshez kell

hasonlítania.) Ezután megvárjuk, amíg a papírcsíkról teljes mértékben elpárolog a

kloroform.

A futtatást 250 ml-es hengerben végezzük. Az edény lezárását parafa dugóval oldjuk

meg. Az üveghenger aljába benzolt öntünk futtatószernek, majd parafa dugóhoz

illetve dróthoroghoz kapcsolva a kromatográfiás papírcsíkot belógatjuk a

mérőhengerbe egyelőre úgy, hogy ne érjen az eluáló folyadékba. 15 perces

ekvilibrálás (futtatószer gőzeivel való telítés) után a papírcsík alját leengedjük a

benzolba. A kapillaritás révén felfelé vándorló eluáló szer magával viszi a

53

színanyagokat. A vándorlási sebességet a két oldószerfázis közötti megoszlás

határozza meg. Ügyeljünk arra, hogy futtatás közben a papír ne érjen a mérőhenger

falához és ne is mozgassuk a hengerben lévő benzolt! A munka során nagyon

óvatosan járjunk el, mert a benzol oldószergőzei erősen karcinogének. Célszerű

vegyifülkében dolgozni, illetve a mérőhengert végig bedugaszolva tartani.

A kromatografálás befejezése után megjelöljük az oldószerfrontot: a papíron: azt a

pontot, ameddig a benzol felemelkedett. Megszárítjuk a kromatogrammot és

ceruzával megjelöljük az egyes komponensek határait. Megjelöljük az egyes

komponensek foltjainak súlypontját és kiszámítjuk az Rf -értékét (retenciós faktor),

amely az anyag súlypontja és a start-, illetve az oldószerfront és a startpont

távolságának hányadosa. Az oldószer útja mindig hosszabb (esetleg egyenlő) az

anyag által megtett távolságnál (-gal), ezért az Rf -érték 1-nél kisebb (esetleg egyenlő

1-el). Gyakran Rf . l00 értéket adnak meg. A papírcsíkot beragasztjuk a gyakorlati

jegyzőkönyvbe. (A kész kromatogrammon levő színes sávok fény hatására néhány

nap múlva elhalványodnak, majd el is tűnnek.)

A futtatás végén a színanyagok sorrendje:

Az oldószerfront mögött a narancssárga karotin, majd a citromsárga xantofill

frakciója (ez lehet kettős sáv is) után kékeszöld klorofill-a, ezt követően a sárgászöld

klorofill-b található.

12/b A levelek klorofill és karotinoid tartalmának meghatározása

spektrofotométerrel, a nyers pigmentkivonat abszorpciós spektrumának

felvétele

A pigmentkivonat színanyagainak mennyiségét meghatározhatjuk spektorofotométer

segítségével, ha ismerjük az abszorpciós maximumokat. A klorofillok két abszorpciós

maximummal jellemezhetők: az egyik a kék, a másik a vörös tartományban található.

Az a- és b-klorofill abszorpciós görbéje nem fedi egymást, a b-klorofill két maximuma

közelebb van egymáshoz. A karotinoidok csak a kék tartományban abszorbeálnak.

54

80 %-os acetonban a karotinoidoknak 440 nm-nél, a klorofilloknak a vörös

tartományban - ahol nem zavar a karotinoidok fényelnyelése - 663 nm-nél (kl-a) és

645 nm-nél (kl-b) van az abszorpciós maximuma. Ezek az értékek olyan távol esnek

egymástól, hogy nem zavarják az egyes színanyagok mennyiségi meghatározását.

Az abszorpciós maximumok helyzete függ az oldószertől.

A munka menete

A vizsgált növény leveléből lemérünk 0,2 g-ot, majd előhűtött dörzscsészében,

késhegynyi kvarchomokkal és MgCO3-al, 1-2 ml 80 %-os acetonnal eldörzsöljük. (A

magnézium-karbonátot azért adjuk a keverékhez, hogy a sejtnedv savas vegyületeit

közömbösítse és így megakadályozza a magnézium kihasadását, feofitin képződését

a klorofill molekulákból.) A pigmentek extrakciójához további kb. 10 ml acetont (80

%-os) adunk részletekben az intenzíven dörzsölt, kevert homogenizátumba. Az

egyes extrakciós lépésekben keletkező tiszta extraktumot mérőhengerbe töltjük. A

kivonást addig végezzük, míg végül a dörzscsészében visszamaradt anyag

elszíntelenedik. (A kivonás ideje 3 percnél ne legyen hosszabb!) A mérőhengerben

összegyűjtött extraktumot - melynek homogénnek kell lennie, szövetdarabokat,

kvarchomokot stb. nem tartalmazhat - 80 %-os acetonnal kiegészítjük 15 ml-re, majd

az egészet centrifugacsőbe töltjük és 5 percig 5000-es fordulaton hidegben

centrifugáljuk.

Centrifugálás után az oldatot tölcsér segítségével óvatosan 20 ml-es kalibrált

kémcsőbe töltjük és 80 %-os acetonnal 20 ml végtérfogatra egészítjük ki, lezárjuk és

jól összerázzuk. Ezután a kivonatunkat küvettába töltjük. Egy másik küvettába 80 %-

os acetont öntünk vakpróbának. Spektrofotométer segítségével megfelelő

hullámhosszúságon lemérjük a klorofill-a, a klorofill-b és a karotinoidok extinkcióját.

Az extinkció mérésével egyidőben vegyük fel pigmentkivonatunk abszorpciós

spektrumát 400 és 700 nm között.

Az extinkció méréséhez és a spektrumfelvételhez is a Beckman DU 65-ös

spektrofotométer Quant I Soft-PacTM Module „PROG6: PeakPick” programját

használjuk. A program a spektrumot megrajzolja és ki is nyomtatja.

55

A kísérlet kiértékelése

Számítsuk ki a levelek klorofill-a és -b, valamint a karotinoidok mennyiségét friss

tömegre vonatkoztatva.

A számításokhoz az alábbi képleteket használjuk:

Kl-a = [9,78 . E663 - 0,99 . E645] . [V/(1000 . W)]

Kl-b = [21,4 . E645 - 4,65 . E663] . [V/(1000 . W)]

Kar = [4,69 . E440 - 0,268 . (5,13 . E663 + 20,41 . E645)] . [V/(1000 . W)]

ahol E = az oldat adott hullámhossznál mért extinkciója

V = az extraktum végtérfogata ml-ben (példánkban 20 ml)

W = a bemért levélanyag friss tömege g-ban (példánkban 0,2 g)

A pigmenttartalmat mg pigmentkomponens/g friss tömegben kapjuk meg.

Számoljuk ki a különböző pigmentek arányát az egyes fajoknál, illetve az etiolált

növényeknél. Elemezzük a kapott abszorpciós spektrumot.

Figyelem!

A gyakorlat során a szerves oldószerek tűzveszélyességét fokozottan figyelembe kell

venni! Az oldószereket tartalmazó üvegeket ne hagyjuk nyitva, csak a szükséges

mennyiségeket használjuk fel és igyekezzünk átgondoltan, gyorsan dolgozni, hogy

minél kevesebb oldószergőz kerüljön a levegőbe, ezzel is elkerülve belégzésüket! A

kivonat előállítását és az egész analízist a lehető leggyorsabban, célszerűen gyenge

szórt fényben végezzük, a kivonatot tartalmazó kémcsövet alufóliába tekerjük be a

felhasználásig, mert a színanyagok fotooxidációra érzékenyek és kémiailag

átalakulnak.

Anyagok és eszközök

56

zöld növények (búza, kukorica, muskátli stb.), etiolált növények ugyanezen fajokból

benzol, kloroform, 80 %-os aceton, MgCO3, Na2SO4 vízmentes

kvarchomok, parafa dugó, dörzscsésze, Whatman No. 1-es (vagy Schleicher-Schüll

2043 b) kromatografáló papír, Petri-csésze, olló, ceruza, vatta, hajszárító, tölcsér,

250 ml-es és 25 ml-es mérőhenger, fedeles üvegdoboz, vonalzó, Beckman DU 65-

ös spektrofotométer, K-24D hűthető centrifuga, centrifugacsövek, 20 ml-es kalibrált

kémcső

57

13. FOTOSZINTÉZISES O2-TERMELÉS JODOMETRIÁS MEGHATÁROZÁSA(WINKLER-MÓDSZER)

Vízbe merített, megvilágított levél O2-t termel, amely vízben - a telítési határig -

oldódik. Az oldott O2-t jodometriásan meghatározhatjuk. Mivel az O2 csak kis

mértékben oldódik a vízben (1 bar nyomáson 1 liter víz 15 °C-on 10,2309 mg; 20 °C-

on 9,2878 mg; 25 °C-on 8,4633 mg O2-t nyel el), a vizsgálatot viszonylag rövid idő

alatt kell elvégezni. A módszer intercellulárisokat nem tartalmazó növények esetében

ad megbízható eredményt, egyébként a meghatározás nem pontos.

A munka menete

1. Elodea canadensisről vágjunk le 4 db kb. 10 cm hosszú darabot, papírtörlővel

itassuk le a vizet róluk, majd mérjük le a tömegüket és jegyezzük fel.

2. 6 kémcső mindegyikébe tegyünk 5-5 db kicsiny üveggolyót és mérjünk be

mérőhengerrel 20-20 ml szénsavtartalmú csapvizet. (Célszerű a csapból

főzőpohárba nagyobb mennyiségű csapvizet engedni, és ezt használni a

kimérésekhez, ezzel a vízminták kiindulási oldott gáztartalmát egységesítjük.)

Közülük 4 kémcsőbe Elodea hajtást helyezünk úgy, hogy a víz teljesen ellepje, majd

néhány csepp paraffinolajjal valamennyi kémcső vízfelületét zárjuk el a levegőtől.

Helyezzünk a növényeket tartalmazó kémcsövek közül kettőt 1 óra időtartamra

napfényre vagy 500 W-os villanyégő elé. (Ügyeljünk arra, hogy a víz ne

melegedhessen fel túlságosan, a kémcsöveket vízzel telt főzőpohárba tegyük!) A

másik kettő növényeket tartalmazó kémcsövet pedig ugyancsak 1 órára tegyük sötét

helyre.

3. Határozzuk meg a növény nélküli kémcsövek vízének O2 tartalmát a

következőképpen: a kémcső vízébe (a kémcső aljába) 0,5 ml lúgos KI oldatot és 0,5

ml MnCl2-oldatot juttatunk. Ezután olajjal színültig töltjük a kémcsövet, hogy ne

maradjon benne levegő. Újunkkal befogjuk a nyílást és a kémcsövet néhányszor

58

megfordítgatva összerázzuk. A Mn(OH)3 csapadékot az üveggolyók jól eloszlatják. A

kémcső egész tartalmát most 50 ml-es Erlenmeyer-lombikba öntjük várunk 3-4

percet, míg a Mn(OH)3 csapadék leülepszik, utána adjunk hozzá - a csapadék fölé

rétegezve - 1,5 ml 25 %-os HCl-t. Az olajréteggel fedett folyadékot óvatosan,

mozgatással kevergetjük. Némi I2 - kiválást észlelünk. Keményítő (0,2 %-os)

indikátor jelenlétében 0,01n Na2S2O3-mal megtitráljuk az oldatot.

A színváltozás: kékből színtelenre.

A vizsgálat során a következő reakciók játszódnak le:

2 MnCl2 + 4 NaOH = 4 NaCl + 2 Mn(OH)2

2 Mn(OH)2 + 1/2 O2 + H2O = 2 Mn(OH)3

2 Mn(OH)3 + 6 HCl = 2 MnCl2 + 6 H2O + Cl2Cl2 + 2 KI = 2 KCl + I22 Na2S2O3 + I2 = 2 NaI + Na2S4O6

4. Egyórai megvilágítás illetve sötétben tartás után vegyük ki a növényeket a másik

négy kémcsőből és vizük I2-tartalmát az előbbihez hasonlóan állapítsuk meg.

Az adatok feldolgozása

A titrálásnál 1ml 0,01n Na2S2O3 megfelel 0,08 mg oxigénnek. A sötétben tartott

kémcsövekben a légzéshez felhasznált oxigén mennyiségét mérjük, a növény nélküli

kémcsövekben pedig a csapvíz eredeti oxigéntartalmát határozzuk meg. Számoljuk

ki a fotoszintézisből származó O2 mennyiségét és a légzésnél elhasznált O2

mennyiségét korrekcióba véve a növény nélküli oldat O2-tartalmát! (A két ismétlésnél

kapott adatokat átlagoljuk!) Számoljuk ki a g friss tömegre vonatkoztatott

fotoszintézis során képződő O2-mennyiségét mg-ban!

Az egyes vízminták oxigéntartalma (mg): titrálásnál fogyott 0,01n Na2S2O3 ml-e

szorozva 0,08 –al.

A = a növény nélküli víz eredeti oxigéntartalma mg-ban (két minta átlaga)

59

B = a sötétben tartott kémcsövek vizének oxigéntartalma mg-ban (két minta átlaga)

C = a megvilágított kémcsövek vizének oxigéntartalma mg-ban (két minta átlaga)

L = 1g növény által a légzésnél átlagban felhasznált O2 mennyisége (mg)

L = (A-B)/a sötétben tartott növények tömegének (g) átlaga

F = 1g növény által a fotoszintézisben átlagban termelt O2 mennyisége (mg)

F = [(C-A)/a megvilágított növények tömegének (g) átlaga] + L

Anyagok és eszközök

Elodea canadensis

lúgos KI oldatot, MnCl2-oldat, 0,01 n Na2S2O3, keményítőindikátor, 25 %-os sósav,

paraffinolaj

kémcsövek, pipetta, főzőpohár, 500 W-os villanyégő, 50 ml-es Erlenmeyer-lombik,

büretta, kémcsőállvány, üveggolyó, mérőhenger, mérleg

60

14. A FOTOSZINTÉZIS SORÁN KÉPZŐDÖTT KEMÉNYÍTŐ KIMUTATÁSASACHS-FÉLE JÓDPRÓBÁVAL

A Calvin-ciklushoz kapcsolódó fotoszintetikus polimer szénhidrát szintetizáló út

végterméke, a keményítő nappal (fényben) a kloroplasztiszban halmozódik fel. Éjjel

(sötétben) a keményítő keményítő-foszforiláz hatására anorganikus foszfáttal

foszforilálódik, és glükóz-1-foszfátra (G1P) bomlik. A G1P-ból G6P, F6P, FDP majd

triózfoszfátok keletkeznek. Ez utóbbiak kivándorolnak a citoplazmába, ahol egy

reakciólánc végén uridin-difoszfo-glükózból és F6P-ból szacharóz-foszfát majd

szacharóz keletkezik. A szacharóz a mezofillumsejtekből elszállítódik a felhasználás,

illetve raktározás helyére. Megjegyezzük, hogy a légrések zárósejtjeibe is - ahol

ellentétes a keményítő felhalmozódás és lebomlás napi menete a

mezofillumsejtekével - ilyenkor vándorol be a mezofillumsejtekben keletkezett

szénhidrát.

Kísérletünkkel kimutathatjuk, hogy sötétben a keményítő nagy része kiürül a

levelekből, illetve fény hatására a megvilágított részeken újból képződik.

A munka menete

Muskátli növényeket a kísérlet megkezdése előtt 1-2 nappal helyezzünk sötétbe,

hogy keményítőtartalmuk elszállítódjék, illetve elhasználódjék. A sötét kezelés után

erősítsünk a levelekre alufóliából különböző mintázatokat úgy, hogy azok a

szembelevő oldalakat azonos módon fedjék, de legyenek jellegzetes le nem fedett

területek a levélen. Az így előkészített leveleket tegyük ki erős megvilágításnak, pl.

lámpával világítsuk meg. Körülbelül 4 óra múlva a leveleket vágjuk le és tegyük

főzőpohárba, melyben 96 %-os alkohollal elszíntelenedésükig elektromos főzőlapon

főzzük azokat. A főzőpoharat óraüveggel fedjük le, melyről az elpárolgott alkohol

visszacsöpög. Főzés közben az alkoholt 1-2 alkalommal ki kell cserélni. A klorofill

nélküli fehér leveleket merítsük 10 percre Petri-csészében tartott Lugol-oldatba.

61

Ezután főzőpohárban vízben többször öblítsük át. A levél fényérte részei lilás

színűek lesznek, mely a keményítő jelenlétére utal (keményítő-jód reakció). Az

előhívott leveleket szűrő- vagy újságpapír közé téve lepréselhetjük és

megszáríthatjuk.

Anyagok és eszközök

muskátli

Lugol-oldat, alkohol

főzőpohár, óraüveg, Petri-csésze, elektromos főzőlap, szűrőpapír

62

15. A FOTOSZINTÉZIS SORÁN KÉPZŐDÖTT SZACHARÓZ MENNYISÉGIMEGHATÁROZÁSA

A fotoszintetikus szénhidrátszintézis végterméke nem minden esetben a keményítő.

Sok egyszikű esetében a szacharóz szolgál szénhidrátforrásként.

A következő kísérletben a fotoszintézis során képződött szacharóz mennyiségi

meghatározását végezzük el. A meghatározást fenol-kénsavas színreakció alapján

végezzük. 1 %-nál kisebb koncentrációjú cukoroldatok fenol és tömény kénsav

jelenlétében narancsvörös színeződést okoznak, amely jól fotometrálható.

A munka menete

Az 1 hetes kukorica csíranövények leveleiből 1 g-ot mérjünk be, majd daraboljuk fel.

A feldarabolt leveleket tegyük 50 ml-es Erlenmeyer-lombikba és öntsünk rá 19 ml

desztillált vizet. A lombik nyílását parafilmmel zárjuk le. Digeráljuk az anyagot

vízfürdőn fél óra hosszat, s ezután a kivonatot öntsük le. A kivonat 1 ml-éhez

kémcsőben 1 ml 90 %-os vizes fenololdatot és óvatosan 5 ml tömény kénsavat

adunk. A keletkezett narancsvörös színű oldatot 500 nm-en fotometráljuk.

A hitelesítő görbét 50-250 µg/ml töménységű szacharóz oldatokból kell készíteni.

A görbe alapján határozzuk meg a levelek szacharóz tartalmát (mg cukor/g friss

tömeg).

Anyagok és eszközök

1 hetes kukorica csíranövények, 90 %-os vizes fenol-oldat, tömény kénsav, 250

µg/ml-es szacharóz törzsoldat

Beckman DU 65-ös spektrofotométer, pipetta, Erlenmeyer-lombik, kémcső, szike,

olló, táramérleg, desztillált víz, vízfürdő, parafilm

63

16. LÉGZÉSVIZSGÁLAT FRENYÓ-FÉLE "IDŐTITRÁLÁSSAL", A 2,4-DHATÁSA A LÉGZÉSRE

A növekedésszabályozó anyagok - köztük a gyomirtóként is használatos 2,4-diklór-

fenoxi-ecetsav (2,4-D) - bizonyos koncentrációban a növényi légzést serkenti. A

légzés intenzitásának növekedését, az auxinok hatására megfigyelhető, érzékeny

növényeknél jellemző növekedési zavarokhoz vezető fokozott nukleinsav- és

fehérjeszintézis váltja ki. 2,4-D hatóanyagú gyomirtószert a kereskedelemben több

változatban is forgalmaznak, pl. Dezormon, Dikamin D. Ezek a szerek elsősorban a

széles levelű kétszikű gyomnövényeket irtják jól.

A légzés intenzitását a következőképpen határozhatjuk meg: zárt edényben,

fenolftaleinnel színezett ismert mennyiségű és koncentrációjú lúg fölé helyezzük a

vizsgálandó - gyomirtóval kezelt és kezeletlen - növényrészeket. A légzés termelte

CO2 semlegesíti a lúgot, amit a szín eltűnése jelez. A semlegesítés idejéből, a

semlegesített lúg mennyiségéből, a szövet tömegéből következtetünk a légzés

intenzitására.

A munka menete

1. Burgonyagumóból dugófúróval vágjunk ki 2 db egyforma 4-5 cm hosszú

szövetdarabot, mérjük le a tömegüket, majd gombostű segítségével rögzítsük őket

egy-egy gumidugóhoz.

2. Az egyik gumóhenger felületét 2,4-D hatóanyagú gyomirtószerrel átitatott vattához

nyomkodjuk.

3. 2 db 50 ml-es Erlenmeyer-lombikba mérjünk 2-2 ml, fenolftaleinnel megfestett

0,001 n NaOH oldatot, majd az előkészített dugókkal zárjuk le a lombikokat.

Jegyezzük fel az időpontot.

4. A lombik alján levő folyadékot időnként mozgassuk meg. Jegyezzük fel azt az

időtartamot, amely alatt a termelt CO2 közömbösíti a lúgot.

64

Kiértékelés

1 ml 0,001 n NaOH-ot 0,044 mg CO2 semlegesít. A közömbösítés idejének

ismeretében kiszámítjuk, hogy az adott növényi rész mennyi CO2-ot termel 1 óra

alatt. Számoljuk ki, hogy a burgonya 1 g tömegű szövete mennyi CO2-ot termel 1 óra

alatt. Hasonlítsuk össze a 2,4-D-vel kezelt szövet CO2 termelését a kontroll

szövetével.

Anyagok és eszközök

burgonyagumó

0,001 n NaOH, fenolftalein indikátor, 2,4-D hatóanyagú gyomirtószer

50 ml-es Erlenmeyer-lombik, gumidugó, gombostű, dugófúró, mérleg

65

17. KATALÁZ ENZIM AKTIVITÁSÁNAK VIZSGÁLATA

A kataláz rendkívül elterjedt Fe-porfirin tartalmú enzim a növényi szövetekben. A

sejtek kataláztartalma elsősorban a peroxiszómákban és glioxiszómákban lokalizált,

a kloroplasztisz nem tartalmaz katalázt. A kataláz funkciója a mérgező hidrogén-

peroxid bontása, ami in vitro a következő bruttó egyenlet szerint megy végbe:

kataláz2 H2O2 → 2 H2O + O2 (katalitikus működésmód)

A kataláz a reakció során a H2O2 molekulához kapcsolódik, ebből a komplexből

katalitikus reakció esetén, újabb H2O2 molekulával reakcióba lépve, az enzim

szabaddá válása mellett víz és oxigén keletkezik.

A katalázoknak katalitikus működésükön kívül - különösen alacsony H2O2

koncentráció mellett - peroxidatív funkciójuk is van. Ilyenkor a peroxid megkötése

után az enzim valamely hidrogéndonorral (RH) reagál, mikor is az enzim és a donor

szabaddá válása mellett víz keletkezik.

katalázH2O2 + RH → R + 2H2O (peroxidatív működésmód)

A szervezetben számos enzimatikus reakció jár H2O2 termeléssel. A H2O2-t az

aktivált oxigénformák közé soroljuk, belőle elektronfelvétellel hidroxil szabad gyök

(OH.) keletkezhet, ez pedig gyökös láncreakciókat indíthat el. A C3-as növényekben

jellegzetes H2O2 termelő hely a fotorespiráció során a peroxiszóma, ahol a glikolsav

FAD-tartalmú glikolsav-oxidáz segítségével glioxálsavvá oxidálódik és közben H2O2

keletkezik, amit a kataláz bont. Ugyancsak keletkezhet H2O2 pl. a sejtfalban a

lignifikáció során, vagy olajos magvak raktározószövetében a glioxiszómákban, az

olajok lebontása során.

A növények öregedése során a kataláz aktivitása csökken, ami a szabad gyökök és

peroxidok akkumulációjához vezet, ez pedig elsősorban a membrán lipidek és ezáltal

a membránok károsodását idézi elő. Kinetinkezeléssel mérsékelni lehet a kataláz

aktivitásának csökkenését.

66

17/a A kataláz aktivitásának mérése titrálással

A kataláz mérésére egyéb módszerek mellett, a titrimetriás módszer is alkalmazható.

A kataláz aktivitás egysége az 1 g növényi anyag által 1 óra alatt elbontott H2O2

mennyisége.

A munka menete

2,5 g növényi anyagot - a gyakorlat során különböző korú leveleket, vagy különböző

fotoszintézis típusú (C3, C4) növényeket is felhasználhatunk - kvarchomokkal

dörzscsészében homogenizálunk, 10 ml pufferoldat kis részletekben való

hozzáadásával. A homogenizált anyagot szintén pufferoldattal centrifugacsőbe

bemossuk és centrifugáljuk. A centrifugacsőből a felülúszót mérőlombikba öntjük át

és pufferrel 25 ml-re töltjük. Az így nyert enzimkivonat minden 10 ml-e kb. 1 g

növényi anyagot tartalmaz. Ezután 2 Erlenmeyer-lombikban elkészítjük a következő

reakcióelegyeket:

E = 10 ml enzimkivonat + 5 ml 0,5 %-os H2O2-oldat

K = 10 ml felfőzött enzimkivonat + 5 ml 0,5 %-os H2O2 (kontrollnak)

Mindkét Erlenmeyer-lombikban lévő anyagot 1 óráig 25 °C-on inkubáljuk, majd 10 ml

higított kénsavval megállítjuk az enzimtevékenységet. A mintákat 0,1 n

permanganáttal halvány rózsaszínig titráljuk.

1 ml 0,1 n permanganát 1,7008 mg H2O2-nek felel meg.

A kísérlet kiértékelése

67

Számítsuk ki a kataláz-enzim által elbontott H2O2 mennyiségét és ennek alapján,

hasonlítsuk össze a vizsgált növényi részek kataláz-aktivitását.

Enzimaktivitás = (K - E) . f . 1,7008 H2O2 mg/óra/g növény

Anyagok és eszközök

zöld növényi részek (bab, kukorica, búza levelek, szára, gyökere)

hígított (1:5) kénsav, 0,1 n KMnO4-oldat, 0,5 %-os H2O2, 0,15 M-os 7,0 pH-jú

foszfátpuffer

kés, dörzscsésze törővel, kvarchomok, K-24D hűthető centrifuga, 100 ml-es

mérőlombik, mérleg, Erlenmeyer-lombik, büretta, elektromos főzőlap

17/b A kataláz enzim aktivitásának mérése Frenyó-módszerrel

(Használati utasítás a Frenyó-féle kataláz-mérő eszközhöz)

Az eszköz két változatban szerepel. Az egyik Y alakú, a másik egyenes, de

recipiensén kis kiöblösödés van. Ezt az utóbbi típust szoktuk használni, pl. levélből

kiszúrt korongok katalázaktivitásának mérésére.

Mintavétel levelekből

Legkisebb méretű (kb. 3-6 mm átmérőjű) dugófúrót használjunk. Tegyünk a

levéllemez alá parafadugót és így metszünk ki belőle 10-20 korongot. (Átlagminta

esetén más-más növényegyed leveléből szúrjuk ki a korongokat). Ha leszedett

levelekkel dolgozunk; akkor egymásra tehetjük azokat, és egyszerre fúrhatjuk át az

egészet. Szükség esetén egyetlen levéllemezt is össze Iehet hajtogatni, hogy

egyetlen átszúrással sok korongot kapjunk. (A kutató természetesen maga dönti el,

hogyan célszerű eljárni.)

A szövetkorongok bejuttatása a recipiens öblébe

68

A recipienst vízszintesen tartjuk. Öbléhez közelítjük a levélkorongokat tartalmazó

dugófúró nyílását. Pálcika (hurkapálcika, üvegbot stb.) segítségével úgy toljuk ki a

szövetkorongokat, hogy a recipiens öblébe essenek. Szükség esetén megigazítjuk a

korongokat.

A recipiens megtöltése hidrogén-peroxid oldattal

Miután a levélkorongokat elhelyeztük a recipiens öblében, a nyílásával fölfelé tartott

recipiens egyenes részébe 1 %-os (esetleg hígabb, de nem töményebb) H2O2-

oldatot juttatunk pipettával. A legtöbb recipiensen 1,5 ml-nél jel található, idáig

töltsük. A folyadék még ne érintkezzék a levélkorongokkal! Illesszük a recipiens

nyílásába a becsiszolt mérőkapillárist.

A mérés elvégzése

Ha a berendezést a mérőkapillárisnál fogva hirtelen megfordítjuk úgy, hogy a

recipiens fölfelé kerüljön, a mérőkapilláris pedig lefelé irányuljon, akkor a reagens

folyadék és a levélkorongok találkoznak. A levélkorongok sebfelületén, vagyis a

kerületén lévő sejtek kataláz enzime elkezdi bontani a reagenst.

A sebzett sejtek kataláz-enzimének a hatására oxigén gáz szabadul fel, a fejlődő gáz

pedig a mindenkori térfogatának megfelelően folyadékot szorít ki a recipiens teréből

a lefelé irányuló mérőkapillárisba. A térfogat ezen éppúgy leolvasható, mint az

osztott pipettán.

Reagáltatás közben enyhén rázogatni kell (a metronóm szárának mozgását

utánozva) a készüléket, hogy a korongok mindig újabb folyadékrésszel

találkozzanak. (A kapilláris végét nem szabad befogni!). A méréshez stopper, vagy

másodperc-mutatós karóra szükséges. Egyszerűbbnek látszik annak mérése, hogy

időegység (pl. 1 perc) alatt mennyi oxigén fejlődik, azaz az oxigén mennyi folyadékot

szorít bele a mérőkapillárisba. Ez a mérés mégsem ajánlható, mert az így kapott

eredmény nem egyszerűen arányos a katalázaktivitással. Inkább ajánlható a

következő mérési mód: megnézzük, hogy pl. a kezeletlen levelekből kiszúrt

szövetkorongok mennyi idő alatt fejlesztenek annyi oxigént, hogy a kiszorított

folyadékoszlop eléri a mérőkapilláris közepe táján kiválasztott valamelyik jól

leolvasható jelet. Ha most a kísérleti növény variánsaiból vett ugyanolyan korongok

69

mondjuk fele annyi idő alatt mutatják ugyanazt a hatást, akkor a katalázaktivitás

kétszer olyan intenzív. (Célszerű megfigyelni, hogy ha pl. 20 korong hatására a

folyadékoszlop 1/2 perc alatt éri el a jelet, akkor ugyanolyan 10 korong 1 perc alatt

eléri-e a jelet, vagyis ugyanolyan 10 korong 1 perc alatt fejleszt-e ugyanannyi

oxigént.)

Tisztítás két mérés között

Mérés után a recipienst vízzel kiöblítjük, megszárítani nem szükséges. A

mérőkapillárist azonban csak szárazon használjuk, máskülönben folyadékcseppek

dugaszolják el. Percek alatt használhatóvá tesszük a kapillárist, ha egyik végét 96 %-

os alkoholba merítjük. A behatolt alkoholt végigfolyatjuk a kapillárisban és kirázzuk

belőle. Azután gumilabdával (pipettaballonnal) néhányszor átfújatjuk, amíg meg nem

szárad. Ha ez nem volna kéznél, vízlégszivattyúval, sőt szájjal is szárazra szívhatjuk.

Belefújni nem szabad, mert párás lesz.

Anyagok és eszközök

zöld növényi részek

0,5 vagy 1 %-os H2O2-oldat, 96 %-os etanol

Frenyó-féle kataláz-mérő eszköz, dugófúró, parafa dugó, hurkapálcika vagy üvegbot,

pipettaballon, stopperóra

70

18. A POLIFENOLOXIDÁZ ÉS A PEROXIDÁZ ENZIMEK AKTIVITÁSÁNAKEGYÜTTES MÉRÉSE

A polifenol-oxidázok csoportjába több, a szubsztrátspecifitás alapján különböző,

réztartalmú enzim tartozik. A lehetséges természetes szubsztrátok számát még

megközelítőleg sem ismerjük, a növényekben előforduló fenolszármazékok

rendkívüli variabilitása miatt. A polifenoloxidázok egyes, a mitokondriális légzési

lánctól eltérő végoxidációs rendszerekben (exomitokondriális légzés, direkt oxidáció)

a polifenolokat színes anyagokká, kinonokká oxidálják a levegő oxigénjének

jelenlétében. Pl. :

p-difenol-oxidáz2 p-difenol + O2 → 2 p-kinon + 2 H2O

A kinonok aminosavakkal és fehérjékkel kapcsolódva alakítják ki azt a jellegzetes

barna színű komplexet, amit sebzett növényi szöveteknél, pl. hámozott burgonyánál

lehet megfigyelni. Ez a barnulási reakció csak oxigén jelenlétében játszódik le, a

vízbe helyezett szeletelt burgonyagumó nem barnul. Ép szövetekre a reakció azért

nem jellemző, mert a polifenoloxidáz és szubsztrátja (fenolok) intakt, egészséges

szövetekben egymástól térben elkülönítettek, más-más kompartmentekben

találhatók, csak a sejtek, membránok sérülésekor kerülnek egymás közelébe.

A peroxidázok különböző H-donorokat (RH2) képesek eloxidálni H2O2, vagy szerves

peroxidok (ROOH) jelenlétében, közöttük különböző fenolokat is.

peroxidázRH2 + H2O2 → R + 2 H2O

A peroxidázoknak nagy szerepe van a ligninszintézisben. A növényi peroxidázok

vastartalmú enzimek, amelyeknek hatócsoportja protohem.

Mindkét enzim meghatározása azon alapul, hogy a szubsztrátumként használt

pirogallol hatásukra narancsszínű purpurogallinná oxidálódik és a keletkezett festék

mennyisége arányos az enzim aktivitásával.

71

A munka menete

Homogenizáljunk 2,5 g burgonyagumó szövetet 25 ml pH = 6,5 foszfátpufferrel, majd

szűrőpapíron szűrjük át. A szűrletből további kiegészítés nélkül vegyünk ki 3-szor 5

ml-t.

Állítsuk össze a következő reakcióelegyeket:

a, 50 ml 0,25 %-os pirogallol oldat 0,06 M-os pH = 6,5 foszfátpufferben,

0,25 ml 0,5 %-os H2O2 oldat

5 ml enzimkivonat

b, 50 ml 0,25 % -os pirogallol oldat 0,06 M-os pH = 6,5 foszfátpufferben,

0,25 ml desztillált víz

5 ml enzimkivonat

c, 50 ml 0,25 %-os pirogallol oldat 0,06 M-os pH = 6,5 foszfátpufferben,

0,25 ml desztillált víz

5 ml felfőzött enzimkivonat

10 percig vezessünk át finoman elosztott légáramot az edényeken, majd 20 perc

múlva a reakciót állítsuk le 10 ml hígított (1:5) kénsavval.

Az oldatokat Beckman DU-65-ös spektrofotométeren 430 nm hullámhosszon

fotometráljuk. A keletkezett purpurogallin mennyiségét hitelesítő görbe segítségével

állapíthatjuk meg. A kalibrációs görbét 100 µg/ml purpurogallin törzsoldat hígításaiból

készítettük és tároltuk a spektrofotométer memóriájában.

A c mintánál kapott értékeket levonjuk az a-ból és b-ből. Az így kapott a1(=a-c)

értékekből levonva b1(=b-c) értékeket, megkapjuk a peroxidáz aktivitását, b1 pedig a

polifenoloxidáz aktivitását adja.

A keletkezett purpurogallin mennyiségeket számítsuk át 1g szövetre és 1 órára. Az

enzim aktivitásokat mg purpurogallin/g növényi anyag/óra egységben adjuk meg.

72

Anyagok és eszközök

burgonyagumó

0,06 M-os pH = 6,5 foszfátpuffer, kvarchomok, 0,25 %-os pirogallol oldat 0,06 M-os

pH = 6,5 foszfátpufferben oldva, 0,5 %-os H2O2-oldat, 100 µg/ml purpurogallin

törzsoldat

Beckman DU-65-ös spektrofotométer, levegőztető inhalátor, mérőhenger, pipetták,

250 ml-es lombik, dörzsmozsár

73

19. DEHIDROGENÁZ ENZIMEK KIMUTATÁSA TTC SEGÍTSÉGÉVEL(VETŐMAGVAK ÉLETKÉPESSÉGÉNEK VIZSGÁLATA)

A légzési folyamatban számos enzim vesz részt. Ezek közül, a dehidrogenázokat

TTC segítségével, színreakcióval mutathatjuk ki. A módszer lényege, hogy az élő

növényi részekben - magvakban, rügyekben - működő dehidrogenázok a színtelen

fenol típusú trifeniltetrazolium-kloridot (TTC) rózsaszínű trifenil-formazánná

redukálják. A rózsaszínű formazán jelzi a növényi szövetek, vetőmagvak

életképességét. Magvak vizsgálata esetén a módszer előnye az, hogy azokon a

fajokon, amelyek magja lassan csírázik, vagy nyugalmi állapotban van (és ezért

ilyenkor közvetlenül csírázóképességet nem is lehet vizsgálni), a vetőmag

életképességét biokémiai vizsgálattal határozhatjuk meg, nem kell a csíraképesség

eldöntése céljából a nyugalmi állapot végét, illetve az elhúzódó csírázás eredményét

megvárni.

7. ábra A dehidrogenázok redukált koenzimének (NADH2) oxidálása TTC-vel vörös

színű trifenilformazán keletkezése közben. A reakció flavinenzim közreműködésével

megy végbe.

A tetrazóliumsók (használható a trifenil-tetrazólium jód és bróm származéka is)

magvizsgálatokban való elterjedésének okai, hogy viszonylag gyorsan behatolnak a

sejtekbe, rövid idő alatt redukálódnak, a redukció irreverzibilis és a redukció

végbemeneteléhez különös beavatkozásra nincs szükség, a redukált alakjuk színes

és stabil, a kivált formazán a redukció helyén marad, és bár fitotoxikusak de a

74

vizsgálatot végzőre veszélytelenek. A TTC-módszer minden növény magjára

alkalmazható életképesség kimutatása céljából.

A százalékban kifejezett életképesség azt jelzi, hogy a vizsgált magmennyiség

milyen arányban tartalmaz olyan élő magvakat, amelyekről feltételezhető, hogy

megfelelő körülmények között csírázásnak indulva ép csíranövényekké, majd

szántóföldön, kedvező körülmények között normális növényekké fejlődnek. Az

életképesség tulajdonképpen potenciális csírázóképesség, az életképességi

százalék pedig a maximálisan kicsíráztatható magvak számát jelzi. Csírázáskor a

külső környezeti feltételek és a magvak állapota (biológiailag érett, nincs

magnyugalomban, nem sérült stb.) között összhang van. Minél jobban eltér

egymástól e két fő tényező, annál nagyobb a különbség az életképesség és a

csírázóképesség százalékai között.

(A csírázóképesség a fajazonos és ép magvakból, a legkedvezőbb laboratóriumi

feltételek közti csíráztatással, meghatározott idő alatt kapott normális csírák

százalékát jelenti. A csírázóképesség természetesen a mag életképességét is jelzi,

de nem biztos, hogy minden TTC-vel életképesnek minősített mag csírázásakor

normális fejlődést mutató csírát fogunk kapni.)

A munka menete

25 db, előre duzzasztott kukoricaszemet szikével pontosan az embrió

hossztengelyében megfelezünk. A kettévágott szemek egyik felét Petri-csészébe

tesszük és annyi TTC-oldatot öntünk a csészébe, hogy a magvakat ellepje. A Petri-

csészéket sötét helyre tesszük és kb. 3-4 óra múlva (a gyakorlaton idő hiányában 1

óra múlva) megszámláljuk a rózsaszínűre színeződött, életképes szemeket. A

kettévágott szemek másik felét főzőpohárba helyezzük és leöntjük annyi desztillált

vízzel, hogy ellepje azokat. A főzőpoharat ezután közvetlenül elektromos főzőlapra

helyezzük és kb. 10 percig forraljuk. A főzött szemekről a vizet eltávolítjuk és TTC-

oldatot öntünk rá. Megfigyeljük 1 óra múlva, hogy van-e színreakció.

A kísérlet kiértékelése

75

Számítsuk ki a kukoricaszemek életképességét, amelyet %-ban fejezünk ki, és

magyarázzuk is meg a jelenséget.

Az életképesség eldöntéséhez használjuk a 8. ábrát. (A szemen pirosan

elszíneződött részek az ábrán satírozva vannak. + életképes, - nem életképes)

8. ábra Kukoricaszem TTC-reakciója (Szabó L.Gy.,1980)

Megjegyzés:

1. Szabályos életképesség vizsgálatoknál nagy számú, pl. 2x100 db fajazonos, tiszta

vetőmagot kell kiválasztani és megfelelően preparálni.

2. A különböző magvakat különböző ideig kell vízben majd TTC-ben áztatni. Pl.

kukoricaszemek esetében 3-4 órán keresztül kell vízben, majd ugyanennyi ideig TTC

oldatban áztatni.

Anyagok és eszközök

duzzasztott kukoricaszemek

0,1 %-os frissen elkészített TTC-oldat

Petri-csésze, főzőpohár, vízfürdő

76

20. A KEMÉNYÍTŐ ENZIMES LEBONTÁSÁNAK VIZSGÁLATA

Gabonafélék szemtermésének csírázásakor a fejlődő csíra és a szkutellum

gibberellineket választ ki (A), amelyek az aleuronrétegbe transzlokálódnak (B), és ott

hidrolitikus enzimek (α-amiláz, proteáz, glükonáz, ribonukleáz) de novo szintézisét

indukálják. Ezek az enzimek bejutnak az endospermiumba (C) és a vízben

oldhatatlan tartalék tápanyagokat oldható vegyületekre bontják. Ezek egyrészt az

aleuronrétegbe (E), másrészt a szkutellumon keresztül a fejlődő csírába (F) jutnak,

ahol a növekedéshez szükséges szervesanyag- és energiaforrásként hasznosulnak.

Az endospermiumban a keményítő hidrolitikus elbontása nagy energiaveszteséggel

egybekötött elbontási folyamat, mert a glikozidkötések energiája, mint reakcióhő válik

szabaddá. Az amilázok bontó hatása csak a raktározó szövetekben bizonyított.

9. ábra Csírázó gabonaszemek tartalék tápanyagainak mobilizálása, a gibberellinek

szerepe (magyarázatot ld. a szövegben)

A vizsgálat elve

77

Néhány napos csíranövényekből enzimkivonatot készítünk, mely amilázokat

tartalmaz. Az alfa-amilázok a keményítőmolekula láncközi kötéseit bontják, a béta-

amilázok a keményítőből és a dextrinekből, a lánc nemredukáló végétől kezdve

maltóz-egységeket hasítanak le, így alfa-amiláz hatására főként dextrinek

/(C6H10O5)x/, a béta-amilázra maltóz /C12H22O11/ keletkezik. Ezen specifikus hatásuk

alapján endo- és exoamiláznak is mondják őket. Mindkét enzim bontja az el nem

ágazó amilózt és az elágazó amilopektint is, de csak az alfa-1,4-glikozidos

kötéseket. Az elágazó molekulák 1,6-kötései miatt relatíve nagy molekulájú, ún.

"határdextrinek" is keletkeznek a bontás során. Ezeket az izo-amilázok (1,6-

glükozidáz) bontják el. A maltóz lebontását glükózzá a maltáz enzim (alfa-

glükozidáz) katalizálja. Az enzimkivonatokkal lebontjuk a keményítőt és kimutatjuk a

keletkezett termékeket.

A keményítőt jódpróbával mutatjuk ki, amely azon alapul, hogy a jódmolekulák az

amilóz spirálisan csavarodott szerkezetének (hélix-konformáció) belsejébe

beépülnek, ahol van der Waals-vonzás rögzíti őket. A jódmolekulák itt más jellegű

(apoláris) környezetben vannak, mint vizes vagy alkoholos oldatban. Ez a környezeti

hatás a jódmolekulák elektronszerkezetét kis mértékben megváltoztatja, aminek az a

következménye, hogy az amilóz-hélix apoláros belsejében más hullámhosszú fényt

nyelnek el, mint vizes oldatban. Innen ered a jód színváltozása.

A jód és a keményítő kék színű reakciója mindenkor bekövetkezik, ha az amilózlánc

legalább 35 glükózmaradványt tartalmaz. A rövidebb dextrinláncok a jóddal

ibolyaszínt adnak, ami a molekulalánc rövidülésével mindinkább vörösbe megy át és

13 glükózmaradvány esetén vörös színű jódkomplex képződik. Még rövidebb

dextrinláncok esetén a színeződés egyre világosabb lesz és 6 glükózmaradványon

túl a jódkomplexnek semmiféle színeződése nem következik be.

78

A munka menete

Enzimpreparátum készítése

Homogenizáljunk 4-5 napos árpa csíranövényekből kb. 2-3 g-ot dörzsmozsárban,

kvarchomokkal és 30 ml desztillált vízzel. Mossuk be a homogenizátumot a

centrifugacsövekbe és centrifugáljuk K-24D centrifugával 10 percig 10000-es

fordulatszámon. A felülúszót öntsük le, és 60 ml-re egészítsük ki desztillált vízzel. Az

így elkészített enzimkivonat keményítőmentes legyen (ezt jódpróbával állapítsuk

meg).

Az enzimkivonat hatásának vizsgálata

a) Az enzimhatást különböző enzimkoncentrációk és állandó hőmérséklet mellett

vizsgáljuk a következő összeállítás alapján:

1. 3 ml 1 %-os keményítő-oldat + 0,5 ml amiláz-oldat

2. 3 ml 1 %-os keményítő-oldat + 1,0 ml amiláz-oldat

3. 3 ml 1 %-os keményítő-oldat + 2,0 ml amiláz-oldat

4. 3 ml 1 %-os keményítő-oldat + 4,0 ml amiláz-oldat

5. 3 ml 1 %-os keményítő-oldat + 4,0 ml felfőzött amiláz-oldat

Az oldatokat kémcsőbe készítsük el és mindegyiket desztillált vízzel egészítsük ki 7

ml-re, majd helyezzük el azokat 40°C-os termosztátba. Kövessük a keményítő

elbomlását 3 perces időközökben, cseppanalízissel, oly módon, hogy fehér

porcelánlapra vigyünk fel 5 jódcseppet egymás mellé, s mindegyikhez adjunk egy

csepp vizsgálandó anyagot. Amikor a jód barna színe nem változik, az elbomlás

véget ért. A keményítőbontás befejezése után mutassuk ki a maltózt Fehling-

próbával: egy kémcsőbe tegyünk 2 ml Fehling-I (CuS04) és 2 ml Fehling-II

(NaOH+Seignette só)-oldatot. Adjunk hozzá 4 ml-t a vizsgálandó anyagból, majd 5

percre állítsuk forró vízfürdőbe. A redukáló cukrok, így a maltóz is, a tiszta sötétkék

Fehling-oldatot vörös Cu2O-csapadék kiválásával egyidejűleg elszínezik.

79

b) Az enzimhatást az oldat különböző pH-értékei mellett vizsgáljuk:

Készítsünk Mc Ilvain-féle pufferoldat-sorozatot a következő pH értékekre: 2,2 - 3,0 -

4,0 - 5,0 - 6,0 - 7,0 - 8,0

Tegyünk kémcsövekbe 2-2 ml-t az egyes pufferoldatokból és mindegyikhez adjunk 2

ml keményítő- és 2 ml amiláz-oldatot. Helyezzük a kémcsöveket 40 °C-os

termosztátba, és jódreakcióval kövessük a keményítő lebomlás ütemét. Ügyeljünk

arra, hogy az elbomlási időt pontosan az enzim (amiláz) és a szubsztrátja (keményítő

oldat) összeelegyítésének időpontjától kezdve mérjük!

Mc Ilvain-féle pufferoldat

Törzsoldat I. 0,2 mólos Na2HPO4

II. 0,1 mólos citromsav

pH 2,2 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,00,2 mólosNa2HPO4

0,2 2,05 3,85 5,15 6,31 8,23 9,72

0,1 móloscitromsav

7,95 6,15 4,85 3,80 3,69 1,17 9,72

Kiértékelés, következtetés

- Ábrázoljuk grafikonon a) az enzim koncentráció függvényében

b) a pH függvényében a keményítő elbontás idejét!

- A grafikonok alapján értékeljük az enzimműködés sajátosságait!

- Miért gátolhatja és serkentheti a pH változás az enzimműködést?

- Mi által befolyásolja a hőmérséklet az enzimműködést?

Anyagok és eszközök

árpa csíranövények

keményítő-oldat, jódoldat, Fehling I-II reagens, 0,2 M Na2HPO4, 0,1 M citromsav

dörzsmozsár, főzőpohár, pipetta, kémcsövek, fehér porcelánlap, centrifuga,

elektromos főzőlap, termosztát, vízfürdő, mm-papír

80

21. A POLARITÁS TANULMÁNYOZÁSA NÖVÉNYEKEN

A polaritás a növényi és állati sejtek, szervek, ill. az egész szervezet két pólusának

fiziológiailag és morfológiailag eltérő jellege.

A polaritás vagy „sarkosság” mélyreható alak- és élettani differenciálódás bizonyos

szervezet vagy szerv csúcsa (apikális pólusa) és alapi része (bazális pólusa) között.

A polaritás jelenségét növényi sejtek esetében az auxin és más, közelebbről még

nem ismert tényezők egyenlőtlen eloszlása eredményezi. Lényege a különböző

gradiensek kialakulásában van. Mindazok a külső és belső tényezők, amelyek a

különféle anyagok vagy aktivitások eloszlását megváltoztatva gradienseket tudnak

létrehozni a növényben egyben a polaritás kiváltói is.

A polaritás egyebek mellett, az auxinok áramlásának irányától függ. Az a pólus,

amely felé az auxinok vándorolnak, a bazális pólus, és ahonnan vándorolnak, az

apikális pólus.

A polaritás fogalma azt is jelzi, hogy a citoplazma a sejten belül egész tömegében

nem azonos tulajdonságú. A tulajdonságok a sejt pólusától a szemben álló másik

pólusig, a „polaritástengely” mentén - sokszor folyamatosan - változnak. A polaritás

következtében a sejtek két ellentétes pólusa különböző módon reagál a környezeti

feltételekre. A polaritás hormongradienseket hoz létre, ugyanakkor ezek a

gradiensek erősítik a polaritást.

Az auxinoknak fontos szerepe van a polaritás kialakulásában. A bazipetális

transzport révén az egyszer determinálódott polaritás legtöbbször végleges és

maradandó.

A polaritás jelenségével magyarázható, pl. az, hogy in vitro mikroszaporitás, vagy

egyéb vegetatív szaporítás esetén csak az a hajtásdarab fog növekedni, amelyiknek

a bazális részét dugtuk a táptalajba, illetve tápközegbe, mert a tápanyag felvételhez

szükséges járulékos gyökeret csak a bazális póluson tud fejleszteni a hajtás. A

81

bazális póluson felhalmozódó sok auxin, illetve az itt kialakuló auxin/citokinin arány

elősegíti a járulékos gyökerek differenciálódását.

Ennek igazolására kísérjük figyelemmel a nedves légtérben felfüggesztett fűzfaágak

új hajtásainak és gyökereinek megjelenését.

A munka menete

1. Magas üveghengert vagy 1 literes mérőhengert nedves szűrőpapírral bélelünk ki.

Az edény aljára kevés vizet öntünk. Kartonpapírból készített fedőlappal befedjük. A

fedőlapra 3 db kb. 30 cm hosszú, friss, rügyes fűzfaágat függesztünk fel: az egyiket

alapjával lefelé (normális helyzetben), a másikat csúcsával lefelé (fordítva), a

harmadikat is normális helyzetben de úgy, hogy középső szakaszán a kérget 2-3 cm

szélesen, gyűrű alakban eltávolítjuk (pl. szemzőkéssel vagy szikével).

2. Az ágdarabok ne érjenek a vízbe, a kísérletet sötétbe állítsuk be. Vigyázzunk arra,

hogy a hengerben a relatív páratartalom mindig magas legyen.

2-3 hét múlva a hajtások és a járulékos gyökerek képződése alapján értékeljük a

polaritás jelentőségét.

Anyagok és eszközök

Salix viminalis (vagy más Salix faj) fiatal ágdarabjai

nagyméretű mérőhenger vagy üveghenger, szűrőpapír, kartonpapír, cérna,

szemzőkés vagy szike

82

22. NÖVEKEDÉSSZABÁLYOZÓ ANYAGOK HASZNÁLATA GYÖKEREZTETÉSIMÓDSZEREKNÉL

22/a A gyökereztetés főbb szempontjai

GYÖKEREZTETÉSHEZ ALKALMAZHATÓ SZEREK

A járulékos gyökérképződés elősegítésére legtöbbször az alábbi auxinhatású

vegyületeket használják:

indol-3-vajsav (IBA) Nagyon aktív gyökeresedést serkentő anyag. Relatíve lassan

bomlik le, gyengén transzlokálódik és így nagy része a kezelés helyén marad.

Kereskedelemben Indolvajsav WP, Gyökereztető por B néven forgalmazzák.

indol-3-ecetsav (IES) Az IBA-nál gyengébb hatású, és a felhasználásakor figyelembe

kell venni, hogy sterilizálatlanul gyorsan lebomlik.

α-naftilecersav (α-NAA) Szintén igen jó gyökereztető szer. Toxikusabb hatású, mint

az IBA és IES, ezért alacsonyabb koncentrációban kell alkalmazni.

Kereskedelemben Rhizopon B, Gyökereztető por A, Incit1,2,5,8 néven forgalmazzák.

A klór-fenoxiecetsavak közül jól alkalmazható megfelelő koncentrációban a 2,4-D,

2,4,5-T.

A különféle anyagok különböző típusú gyökérzetet eredményeznek, így pl. az

indolvegyületek szálasabb, a naftalinszármazékok zömökebb gyökeret produkálnak.

ALKALMAZÁSI MÓDSZEREK

Az auxinok dugványokba való bejuttatásának számos módszere közül a

legelterjedtebbek:

1. Gyors bemerítés módszere

A dugványok alját csupán kb. 3-5 percre mártják bele a hatóanyag viszonylag

tömény alkoholos oldatába, majd utána azonnal a gyökereztető közegbe ültetik. A

módszer előnye, hogy kicsi a felszerelésigénye, a kezelés rövid ideje alatt kevéssé

83

függ a külső körülményektől, mint a többi eljárás. Ugyanaz az oldat ismételten is

felhasználható.

Alkalmazandó koncentrációk: kb. 1000 ppm alacsony

kb. 5000 ppm közepes

10000-20000 ppm magas

2. Hosszabb idejű áztatás

E módszert leginkább akkor alkalmazzák, ha az auxinnal együtt más anyagokat

(citokinineket, vitaminokat) is be akarnak juttatni a dugványba. Ha vízben kevésbé

oldódó savat (IES, IBA, 2,4-D stb.) használunk, a kristályos anyagot kevés metil-

vagy etil-alkoholban kell feloldani, s ezt a törzsoldatot vízzel a kellő töménységre

hígítani. Az auxinok sói, észterei, aminjai vízoldékonyak. A dugvány-kötegek alját kb.

2,5 cm mélyen szokták az oldatba állítani, a kívánt ideig. A kezelés időtartama a

növénytől, a külső körülményektől és az oldat koncentrációjától függően 12h-tól 24h-

ig vagy több napig is tarthat. E módszernél az oldat csak egyszer használható fel az

auxinok bomlási készsége miatt.

Alkalmazandó koncentrációk: 10-20 ppm alacsony

50-100 ppm közepes

200 ppm magas

3. Púder módszer

Az eljárásnál vivőanyagként tiszta gyógyszertári talkumot használnak, mely

semmiféle hatóanyagot nem tartalmaz. Az auxin megfelelő mennyiségét metil- vagy

etil-alkoholban feloldják, hozzákeverik a púdert, majd az oldószert a pépes

keverékből elpárologtatják. A dugványok illetve dugvány-kötegek alját 2,5 cm

magasságig vízbe mártják és beleforgatják a púderbe, majd azonnal elültetik. Ez a

legelterjedtebb eljárás.

Alkalmazandó koncentrációk: 200-1000 ppm alacsony

2000-3000 ppm közepes

4000-5000 ppm magas

84

4. Egyéb eljárások

Az egész leveles dugvány bemerítése az oldatba

Az egész leveles dugvány permetezése

Az auxinoldat beinjekciózása a dugványba

Az auxinoldat vákumfiltrációval való bejuttatása

A gyökereztető közeg öntözése a hatóanyag oldatával

Lanolinpasztás eljárás, miszerint az auxint tartalmazó lanolint a dugvány bazális

részének oldalára kenik (legelőnytelenebb eljárás)

A KÜLÖNFÉLE NÖVÉNYEK SZÁRDUGVÁNYAINAK AUXINSZÜKSÉGLETE

Az auxinkoncentráció helyes megválasztása rendkívül fontos, amitől nagyban függ a

kezelés sikere. Minden esetre érvényes dózist azonban nem lehet megadni, mert a

szükséges koncentráció számos körülménytől függ:

a. A növény faji tulajdonságai

A legkisebb töménység a lágyszárú egyéves növényeknek kell, ezek ugyanis

könnyen gyökereznek.

Közepes koncentrációt igényelnek a legtöbb fás növény fiatal hajtásdugványai.

Legerősebb töménységet a legnehezebben gyökerező erősen fás hajtások

(Rhododendron, citromfélék) és különösen az örökzöldek (fenyőfélék, ciprusfélék)

dugványainak esetében kell alkalmazni.

b. Kezelési idő

Fordítottan arányos a koncentrációval.

c. Gyökereztetési közeg

A gyökereztetési közeg szintén befolyásolja az auxinszükségletet. Így pl. a homok

nagyobb koncentrációt kíván, mint a homok-tőzeg keveréke.

d. Hőmérséklet

Ugyanaz a töménység magasabb hőmérsékleten jobban hat, mint alacsonyabb

hőmérsékleten, mivel az auxin felvétele és transzlokációja magasabb hőmérsékleten

gyorsabb.

85

A sikerre vezető koncentrációt minden esetben kísérleti úton kell meghatározni, és

előre ki kell próbálni. Mivel a magas dózis valamennyi módszernél károsodást, sőt a

dugványok pusztulását okozhatja, tanácsos először alacsonyabb koncentrációkkal

próbálkozni.

KÜLSŐ KÖRNYEZETI FELTÉTELEK HATÁSA A GYÖKEREZTETÉSRE

A kezelt dugványok számára a transzspiráció csökkentése érdekében biztosítani kell

a páradús környezetet. Ugyanebből a célból csökkenteni kell a párologtatási

felületet, azaz a leveleket kevés kivételtől eltekintve el kell távolítani a hajtásról. A

levelek eltávolítása azonban csak az auxinkezelés után történjék, mert a hormon a

transzspirációs árammal szívódik fel a szárba, ennek biztosításához pedig

kezdetben a levelek jelenléte szükséges. A növény igénye szerinti hőmérséklet

fenntartása ugyancsak lényeges.

KIEGÉSZÍTŐ KEZELÉSEK

1. Etiolálás

A dugványok rendszerint könnyebben gyökereznek, ha az anyanövény előzőleg

sötétben nevelkedett. Az etiolált dugványok jobban reagálnak az auxinokra is.

2. Sebzés

Fás növényeknél, melyek nehezen gyökereznek, a bázishoz közel az epidermisz

vagy kéreg hosszanti bemetszése vagy egy hosszirányú csík eltávolítása elősegíti a

gyökeresedést. Ennek oka az, hogy a sérült sejtekből úgynevezett "sebhormonok",

azaz a sejtosztódást stimuláló citokininek szabadulnak fel.

3. Cukor-kezelés

Nádcukornak 2-4 %-ban az auxinoldatba való keverése ugyancsak előnyös a

gyökeresedés szempontjából. A gombafertőzés elkerülése végett azonban fungicid

anyagokat is kell adni a keverékhez.

86

4. Vitamin adagolás

A B-komplex tagjai (B1, B2, B6-vitamin, biotin vagy H-vitamin, nikotinsav), mint a

sejtosztódás és gyökérnövekedés stimulátorai, megfelelően adagolva fokozzák a

gyökeresedést.

5. N-vegyületek

Tapasztalatok szerint aminosavak és ammónium-foszfát adása a hormon oldathoz

általában szintén stimuláló hatású.

6. Citokininek adása

Megfelelő koncentrációban adva az auxinoldathoz, szintén fokozza a dugványok

gyökeresedését.

(Forrásmunka: Varga M. 1976. Növekedésszabályzó anyagok gyakorlati

alkalmazása a növénytermesztésben. JATE, Szeged)

22/b Az α-naftil-ecetsav hatása a dugványok gyökérképzésére

A dugványozás vegetatív szaporítási eljárások egyike, melynek során a szülővel

genetikailag megegyező új növényeket nevelünk. A szaporítás sikerét meghatározza

a dugványok gyökérképzésének intenzitása. A gyors gyökérképződést legtöbbször

auxinhatású vegyülettel segítjük elő. Megjegyezzük, hogy csak a gyökér (járulékos

gyökér) differenciálódása igényel magas auxinkoncentrációt, a gyökér

növekedéséhez alacsony auxinkoncentrációra van szükség, sőt a túlzottan nagy

auxinkoncentráció a gyökérnövekedést gátolja. Egyes eredmények szerint az

auxinnak mind a differenciálódásnál, mind a növekedésnél megfigyelt hatása nem

közvetlenül az auxin jelenlétével, hanem az auxin hatására jelentkező fokozott

etiléntermeléssel magyarázható. Erre bizonyítékul szolgál az, hogy az optimálisnál

nagyobb auxinkoncentráció növekedésgátló hatását az etilénszintézis inhibitoraival

(pl. kobalt-kloriddal) fel lehet oldani, illetve az etilénné átalakuló klór-etil-foszfonsav

(pl. az Ethrel nevű szintetikus regulátorban) szintén serkenti a járulékos gyökerek

kialakulását.

87

A munka menete

3-4 hetes fejlett primer levéllel rendelkező bab növények föld feletti részét levágjuk.

Az alsó 1-2 cm-es részt a NES (α-naftil-ecetsav) 1000-2000 ppm-es oldatába

mártjuk 3-4 percre. (A NES-t célszerű kevés alkoholban feloldani, majd tovább

hígítani vízzel, ld. függelék.) A kontroll növényeket csak etanol/víz 1:5 arányú

keverékébe mártjuk. A kezelést követően a felületet vízzel öblítjük, majd a

növényeket úgy helyezzük nedves szűrőpapírral bélelt, kevés vizet tartalmazó,

alufóliával elsötétített Erlenmeyer-lombikba, hogy a vágásfelület 1-2 cm-re a víz

felszíne alatt legyen. A növényeket 25 °C-on, fényen tartjuk.

7-10 nap elteltével összehasonlítjuk a kezelt és a kontroll növények járulékos

gyökérképződését. Megszámoljuk a járulékos gyökerek számát, mérjük a

leghosszabb gyökerek hosszát.

Anyagok és eszközök

3-4 hetes babnövények

NES 2000 ppm-es 96 %-os etanolos oldata, etanol

Erlenmeyer-lombik, alufólia

88

23. A GIBBERELLIN HATÁSA A HOSSZANTI NÖVEKEDÉSRE

A gibberellinek általános hatása a hajtás hosszanti növekedésének fokozása. Ez

felhasználható a gibberellinek kimutatására, illetve mennyiségi meghatározásra.

A munka menete

A búzaszemeket a kezelést megelőzően 30 °C-on 2 napig csapvízen áztatjuk. A

kísérlethez 0,5 mm-es koleoptillal rendelkező növényeket válogatunk ki.

A kiválogatott szemeket a GA3 0 - 0,1 - 1,0 - 10,0 - 100,0 ppm-es oldatával átitatott

steril vattára helyezzük. Az 5 cm átmérőjű Petri-csészékbe 2-3 mm vastagságban

helyezzük el a vattát és 3 ml gibberellin oldattal nedvesítjük.

Azt követően, hogy a vatta kissé megszáradt a csírázó szemeket húszasával újabb

Petri-csészébe rakjuk át, a vattát 5 ml vízzel nedvesítve. A Petri-csészéket fedjük és

két napra fényre helyezzük, majd 3 ml vízzel kiegészítve, kifedve, nedves

körülmények között fényen tartjuk.

5-7 nap elteltével a mezokotil és a második levélhüvely közötti távolságot mérjük.

Anyagok és eszközök

búzaszemek

100 ppm-es gibberellin oldat, desztillált víz

Petri-csésze, szűrőpapír, termosztát, vatta

89

24. A CCC NÖVEKEDÉSGÁTLÓ HATÁSA

A CCC /chlor-colin-chlorid/ egyike a legrégebben és legáltalánosabban használt

növekedésszabályozó anyagoknak. Kereskedelemben Bercema CCC, CCC Siefes,

Cycocel 460 néven forgalmazzák, kalászosok szárszilárdítására használják.

Növekedésgátló hatását a gibberellinszintézis közvetett gátlásán keresztül fejti ki

(gibberellininhibitor). Hatásmechanizmusa feltehetően a következő: gátolja a

szövetek kolin-észterázát, ezáltal a szövetekben jelenlévő acetil-kolin nem bomlik le,

és ez gátolja a gibberellin szintézist. Mivel a gibberellin szint lecsökken, ezért a

megnyúlásos növekedés is mérséklődik, ez rövidebb, de erősebb internódiumok

kialakulását eredményezi, ami a gabonák megdőlésének csökkentése, jobb

betakaríthatósága szempontjából kedvező.

Megjegyezzük, hogy a CCC-vel kezelt növények hideg- és fagytűrése, sőt

betegségekkel szembeni rezisztenciája is nő. A jobb fagytűrésre a magyarázatot az

adja, hogy a CCC a gibberellinekkel részben közös biokémiai úton keletkező

szteroidok bioszintézisét is gátolja, ezért azok szintje lecsökken a membránokban,

másrészt a CCC kolin része beépül a foszfolipidekbe (megnő a foszfatidil-kolin szint),

és ez a változás a membránok összetételében a membránok fázisváltozás

hőmérsékletének csökkenését eredményezi: alacsonyabb hőmérsékleten mennek át

folyadékkristályos állapotból gélszerű állapotba.

A munka menete

10-3 mólos CCC törzsoldatból koncentrációsorozatot készítünk: a tízszeresére

hígított törzsoldat koncentrációja 10-4 mól. Ezt ismét tízszeresére hígítva 10-5 mólos

oldatot nyerünk. A legkisebb vizsgálandó koncentráció: 10-8 mól.

Búza, árpa szemeket 24 óráig különböző koncentrációjú CCC oldatban áztatunk.

Kontrollként desztillált vizet használunk. A kezelést követően a szemeket kerti földbe,

90

cserepekbe vetjük. 2-3 hét elteltével mérjük a kezelt növények kontrollhoz

viszonyított magasságát.

Anyagok és eszközök

búza vagy árpa szemek

10-3 mólos CCC törzsoldat

pipetta, lombikok, cserepek

91

25. SALÁTA HIPOKOTIL-TESZT A GIBBERELLINEK KIMUTATÁSÁRA

A növényi szövetekben természetesen előforduló gibberellinek és gibberellinszerű

anyagok kimutatásához számos biológiai tesztet dolgoztak ki, mint pl. a törpe

kukorica és törpe borsó teszt; borsó epikotil teszt; zab levélkorong teszt; gabona

levélszekció tesztek; rizs csíranövény teszt; árpa endospermium teszt; salátamag

csírázási teszt; saláta hipokotil teszt. Utóbbi teszt alapja, hogy a saláta hipokotil

megnyúlása arányos a gibberellin koncentrációval. A teszt kivitelezése viszonylag

egyszerű, a csíranövények kis méretük folytán nagy számban használhatók, tehát

szériavizsgálatra rendkívül alkalmas eljárás. Érzékenység és specifitás

szempontjából azonban az árpa endospermium, valamint a törpe-növény tesztek

jobbnak minősíthetők.

A munka menete

Csíráztassunk salátamagot nedves papírt tartalmazó Petri-csészében, 25 °C-on

sötétben, míg a hipokotilok hossza a 4-5 mm-t el nem éri (kb. 36 óra). Készítsünk a

100 mg/l koncentrációjú GA3 törzsoldatból 0,01 - 0,1 - 1,0 - 10,0 mg/l-es hígításokat.

A különböző hígítású oldatok néhány ml-ével nedvesítsünk meg Petri-csészébe tett

szűrőpapírt és helyezzünk rá 20-20 db azonos fejlettségű saláta csíranövényt.

Állítsunk be kontrollt desztillált vízzel. Inkubáljuk a csíranövényeket állandó fényen

25 °C hőmérsékleten. 48 óra elteltével mérjük meg a hipokotilok hosszát. Számítsuk

ki a hipokotilok átlaghosszát az egyes koncentrációk esetében és fejezzük ki a

megnyúlást a kontroll százalékában.

Anyagok és eszközök

saláta csíranövény

100 mg/l-es gibberellinsav (GA3) törzsoldat

Petri-csésze, pipetta, csipesz, szűrőpapír, vonalzó, tálca, termosztát

92

26. AZ ETILÉN KIMUTATÁSA BORSÓEPIKOTIL-TESZT SEGÍTSÉGÉVEL

A teszt a légtérben lévő etilén jelenlétének kimutatására alkalmas. Azon alapszik,

hogy a borsó epikotil görbület alatti része (nem osztódó szövetek) etilén jelenlétében

megduzzad, a görbület feletti levelek nem nyílnak szét, és az epikotil növekedése a

kontrollhoz viszonyítva gátolt. A megnyúlási zónában az etilén gátolja a sejtek

hosszanti megnyúlását, a sejtnagyobbodást azonban nem, így izodiametrikus óriás

sejtek jönnek létre (apoláros sejtnagyobbodás). A borsó hajtáscsúcsában (osztódó

szövetek) az etilén a sejtosztódást és a DNS szintézist is gátolja.

A munka menete

2-3 cm epikotillal rendelkező etiolált borsó csíranövényeket 100 ppm-es 2-klóretil-

foszfonsav (etefon) hatóanyaggal permetezzük. (A szert Ethrel néven

növekedésszabályozó anyagként forgalmazzák a kereskedelemben, hatóanyaga 40

% etefon.) A 2-klóretil-foszfonsav a növényben etilén képződés közben bomlik.

A kontroll növényeket desztillált vízzel kezeljük.

A szerrel kezelt és a kontroll növényeket külön inkubátorban, sötét, 20 °C-os

termosztátba helyezzük.

A kiértékelést 4-5 nap elteltével végezzük.

Anyagok és eszközök

etiolált, 2-3 cm-es borsó csíranövények

100 ppm-es 2-klóretil-foszfonsav oldat (ETHREL-ből készítve)

exikkátor, termosztát

93

27. A CSÍRANÖVÉNYEK SZABAD AMINOSAVAINAK KIMUTATÁSAKÖRPAPÍR-KROMATOGRÁFIÁVAL

A csíranövények nitrogén-anyagcseréje nagyon intenzív. A gyökerekben és

hajtásban egyaránt nagy mennyiségben képződnek aminosavak, melyek elsősorban

a fehérjék, de minden egyéb N-tartalmú szerves vegyület szintézisének alapanyagát

képezik.

A növényi fehérjék aminosav-összetétele a környezeti tényezők változásainak

hatására nem változik, ugyanakkor a növények szabad aminosavainak spektruma a

külső behatásokra érzékenyen reagál. A nitrogén-ellátás és az ásványos táplálkozás

eltérései, a fertőző növényi betegségek, valamint a vízellátás, a hőmérséklet és

napfénytartam különbségei a növények szabad aminosavtartalmában 200-300 %-os

eltérést is előidézhetnek: az egyik aminosav koncentrációja erősen nőhet, amikor

más aminosavaké csökken. Igen jellegzetes, pl. kórokozókkal fertőzött szövetekben

a savamidok (glutamin, aszparagin), vízhiány esetén pedig a prolin felhalmozódása.

Megjegyezzük, hogy pl. a pillangósokban olyan különleges szabad aminosavakat is

azonosítottak, amelyek fehérjékben nem, vagy csak ritkán fordulnak elő, és állati

szervezetekből teljesen hiányoznak. Kémiailag e vegyületek valamelyik fehérjeépítő

aminosav homológjai, azoktól CH2 csoporttal különböznek. Pl. az azetizin-2-

karbonsav a prolin homológja. E különleges aminosavak szerepe még tisztázásra

vár, de ismereteink szerint a fehérjeszintézis inhibitorai, illetve a növények

védekezési reakciójában is szerepet játszhatnak. Pl. a pipekolsav (hidroxi-prolin

homológ) fertőzött növények leveleiből jelentős koncentrációban kimutatható.

A körpapír-kromatográfia a megoszlási kromatográfia egyik esete, ahol a papírt kör

alakúra vágják és az eluáló szert a papír közepére viszik. Az elválasztandó anyagot

a kör alakú papír közepétől kis távolságra elhelyezkedő koncentrikus körre visszük

fel a 10. ábra szerint. A körpapír-kromatográfia előnye, hogy egyszerű, kis helyet

94

elfoglaló berendezésben végrehajtható, és rövid idő alatt elfogadható elválasztást

ad.

A gyakorlaton az eluáló szert papírkanóc (= összetekercselt kromatográfiás

papírcsík) segítségével juttatjuk a papírra úgy, hogy a papír közepét dugófúróval

kilyukasztjuk és ide bedugjuk a kanócot. A papírt felosztjuk 4 részre és az "A", illetve

"B" szektorra az ismert összetételű kontroll-oldatokat visszük fel.

10. ábra A körpapírkromatográfia elrendezése

A "C" és "D" körívre az alábbiak szerint készített ismeretlen összetételű oldatokat

vigyük fel. A papíron csak grafitceruzával jelöljünk!

A munka menete

A feladatot sötétben tartott (etiolált) és fényen tartott csíranövényeken

párhuzamosan végezzük el.

5 napos búza csíranövények hajtás- (1g) és gyökérrendszerét (2g), külön-külön

dörzscsészében kvarchomok segítségével 15-15 ml 80 %-os etanollal eldörzsöljük. A

homogenizátumokat tölcsérbe tett szűrőpapíron megszűrjük, majd az oldatot

óraüvegen infralámpa alatt bepároljuk. A visszamaradt anyagot 1-1,5 ml desztillált

vízben feloldjuk. A növényi kivonatokból, valamint a standard aminosav-oldatokból is

mikropipettával 20-20 µl-t viszünk fel a papírra, a startvonalnak számító körívekre.

Ha ez a mennyiség egyszerre nem vihető fel a körívre, a maradékot a folt

95

beszáradása után ugyanoda cseppentjük. Megjegyezzük, hogy a "D", illetve a "C"

szektorba gyökér-, illetve hajtáskivonatot vittünk.

Futtatószernek butanol-ecetsav-víz 4:1:5 arányú elegyét használjuk, amit egy Petri-

csésze aljba öntünk. (A futtató oldatot kitöltés előtt fel kell rázni!) A Petri-csészére

helyezzük a papírlapot, benne a kanóccal, egyelőre úgy, hogy a kanóc ne érjen a

futtató oldatba és a papírlapra tesszük a Petri-csésze fedelét.

A kromatografáló papír kb. 15 perc alatt telítődik az oldószer gőzeivel, ekkor

lenyomjuk a papírkanócot, ezzel megkezdődik a szétválasztás. Ügyeljünk arra, hogy

a Petri-csészék pereme szorosan zárjon.

A futtatás befejezésekor (az oldószerfront eléri a Petri-csésze szélét) ceruzával

megjelöljük az oldószerfrontot, és megszárítjuk a kromatogrammot. A megszárított

kromatogrammokat ninhidrinnel (0,2 g/100 ml) hívjuk elő. Az előhívás során

ügyeljünk arra, hogy a ninhidrinnel egyenletesen porlasszuk be a kromatogrammot

és a szer ne follyon végig a papíron, mert ez összemosná a foltokat. (Vigyázzunk

arra, hogy a ninhidrin ne kerüljön a bőrünkre és ne is lélegezzük be!) A ninhidrines

kezelés után melegítsük (max 80 °C-on), illetve szárítsuk meg a kromatogrammot

(pl. infralámpával) - a foltok a melegítés során fognak megjelenni. Az előhívott

kromatogrammon körülrajzoljuk a foltokat és kiszámítjuk az Rf - értékeket. (Rf - érték

= az egyes foltok középpontjának távolsága a startvonaltól osztva az

oldószerfrontnak a startvonaltól mért távolságával). A standard oldatokkal történő

összehasonlítás alapján állapítsuk meg, hogy a csíranövények hajtása és gyökere

milyen szabad aminosavakat tartalmaz. Hasonlítsuk össze az etiolált és a fényen

tartott növények aminosav-kivonatával készített kromatogramokat. Megfigyeléseinket

rögzítsük és a kromatogramokat mellékeljük a kísérleti jegyzőkönyvbe.

Az egyes kontroll-oldatokban levő aminosavak és azok sorrendje a kromatografáló

papíron, a felcseppentés helyétől kiindulva:

"A" : cisztin, aszparaginsav, glutaminsav, metionin, leucin

"B" : aszparagin, glutamin, tirozin, valin, fenilalanin

Megjegyzés:

96

1. Amennyiben a felvitt aminosavmennyiség az 1 mg-ot meghaladja, valamennyi

komponens a startpont közelében halmozódik fel és kromatogram teljesen

használhatatlan lesz. Jó kromatogramot csak akkor kapunk, ha a felvitt

anyagmennyiség 20-60 µg között van.

2. A színfoltok, amelyeket az aminosavak és a peptidek a ninhidrinnel adnak, csak

rövid ideig tartósak. Néhány nap múlva az éles határok (különösen fény hatására)

kezdenek eltűnni, a foltok elszíntelenednek. A ninhidrinnel kapott foltokat

rézreagenssel állandósíthatjuk, stabilis rézkomplexek keletkezése útján. A

rézkomplexfoltok kárminpiros színűek.

Anyagok és eszközök

etiolált és fényen tartott búza csíranövények

futtató oldat (butanol-ecetsav-víz 4:1:5 arányban), 1 µg/µl-es aminosav-oldatok (a

felsorolás szerint) 0,1 n HCl-ben, ninhidrines előhívó oldat, rézreagens, kvarchomok,

80 %-os etanol

Petri-csészék, Whatman No. 1-es papír, kromatografáló papírcsíkok, mikropipetta,

dörzscsésze, olló, hajszárító, szárítószekrény vagy infralámpa, óraüvegek,

üvegtölcsérek, szűrőpapír, permetező készülék

97

28. A NÖVÉNYI KIVONATOK FEHÉRJETARTALMÁNAK MEGHATÁROZÁSA

Növényélettani, biokémiai kutatások során enzimaktivitás mérésekkor,

gélelektroforetikus elválasztások előtt, stb., gyakran szükség van a növényi

kivonatunk fehérjetartalmának ismeretére. A növényi sejt protein készlete nagy

számú, különböző proteinből áll, amelyek egymástól nemcsak az aminosavak

szekvenciájában, hanem a kémiai és fizikai sajátosságok tekintetében is

különböznek. Ezek a különbségek olyan nagyok, hogy nem lehet egy sejt, vagy egy

szövet összproteinjét egyetlen módszerrel meghatározni.

Mivel a proteinek extrahálása függ az extrahálószer összetételétől, a pH-tól és az

ionerősségtől, vizsgálataink során azt a protein frakciót határozzuk meg, amely egy

meghatározott pH-értéknél és meghatározott ionerősség mellett az alkalmazott

oldószerben oldódik. Mivel sok protein magasabb hőmérsékleten denaturálódik és

ezáltal oldhatatlan lesz, célszerű a meghatározásokat 15 °C-nál nem magasabb

hőmérsékleten végezni.

A fehérjék kimutatására sok módszer ismeretes; kicsapási- és színreakciók. A

kivonat protein mennyiségére lehet következtetni - bár meglehetősen pontatlanul - a

proteinoldat 280 nm-nél mért fényelnyeléséből is. A színreakciók a /Biuret-,

Xanthoprotein-, Millon-reakció stb./ a fehérjék alkotórészeire, a bennük előforduló

csoportokra jellemzőek.

28/a A fehérje mennyiségének meghatározása Biuret-reakcióval

A Biuret-reakció peptidekre és fehérjékre specifikus. A legalább két peptidkötést

tartalmazó láncok kupri-ionok hatására alkalikus közegben lila színeződést adnak. A

színeződés mértéke a protein mennyiséggel függ össze. Fotometrálással állapítjuk

meg a protein-mennyiséget kalibrációs görbe felhasználásával.

98

E módszer - a Lowry-féle módszerhez képest - kevésbé érzékeny az aminosav

összetételre, a különböző aminosav-összetételű proteinek a színintenzitást nem

befolyásolják. Jelentős interferencia nem lép fel, de minden olyan anyag, amely 540

nm-nél abszorbeál zavarja a meghatározást.

A módszer 10 és 1200 µg /ml koncentrációk között használható fehérje mérésre.

A munka menete

Mérjünk le 1 hetes babnövény gyökeréből és szikleveléből 5-5 g-ot, és hideg

dörzscsészében kevés kvarchomokkal 5 ml pH 7,5 foszfátpufferrel homogenizáljuk.

A sejttörmeléket 4x-es mullszöveten átpréseljük és a szövetnedvet hideg

főzőpohárban felfogjuk. A présnedveket 4000-es fordulatszámmal centrifugáljuk 10

percig. Az enyhén zavaros felülúszót (nyers fehérjekivonat) öntsük át kalibrált

kémcsőbe, és egészítsük ki a kivonatokat azonos térfogatúakra foszfátpufferrel. Ezt

az oldat használjuk fel a fehérjekimutatáshoz.

A fehérjekivonatból pipettázzunk 2 ml-t centrifugacsőbe és adjunk hozzá 2 ml 10 %-

os triklór-ecetsavat. A keletkező csapadékot centrifugáĺjuk le, és mossuk addig 5 ml

80 %-os alkohollal, amíg teljesen színtelen lesz. Rövid centrifugálás után öntsük el

az alkoholt, majd a csapadékhoz adjunk 1 ml desztillált vizet és 4 ml Biuret-reagenst

és kémcsőkeverővel jól rázzuk fel. A teljes feloldódás után kb. 25 perc múlva

fotometráljuk 540 nm-nél.

Kalibrációs görbe készítése

10 mg/ml kristályos marhaszérum-albumint tartalmazó törzsoldatból a következő

hígításokat készítsük el.

Hígításisor 0. (vak) 1. 2. 3. 4. 5.Törzsoldat, ml - 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0Desztillált víz, ml 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 -Biuret-reagens, ml 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0

99

A mintákat jól rázzuk össze és kb. 25 perc múlva fotometráljuk az oldatokat 540 nm-

nél. Vakpróbaként a 0. mintát használjuk.

A méréshez a Beckman DU 65-ös spektrofotométer Protein Assay Soft-Pac

Module "PROG9:Biuret" programját használjuk.

Kiértékelés, következtetés

Az összehasonlító görbe alapján - illetve a spektrofotométer programjának

eredményei alapján - állapítsuk meg a kivonatok protein-koncentrációját. Számoljuk

ki az eredeti szövetek 1 g-jának fehérje tartalmát is figyelembe véve a hígításokat és

azt, hogy 5-5 g szövetből indultunk ki.

Hol képződnek a sejtben aminosavak és fehérjék?

Anyagok és eszközök

7 napos bab csíranövények

7,5 pH-jú foszfátpuffer, 10 %-os triklór-ecetsav, 80 %-os alkohol, Biuret-reagens,

marhaszérum-albumin (BSA) 10 mg/ml-es oldata

dörzscsésze, porcelántálak, pipetta, kvarchomok, 4x-es mullszöveten, centrifuga,

spektrofotométer

28/b A fehérje mennyiségének meghatározása Lowry-módszerrel

A fehérjetartalmat fotometriás módszerrel határozzuk meg. A meghatározás alapja,

hogy a fehérjék tirozin és triptofán aminosavai alkalikus pH-n redukálják a Folin-

Ciocalteu reagenst, aminek következtében kék színű komplex keletkezik. A

keletkezett szín intenzitása erősen függ az inkubációs időktől, ezért ezek pontos

betartására fokozottan ügyeljünk. A reakció az egyik legáltalánosabban használt

fehérje-meghatározási módszer. A fehérjetartalmat előzőleg készített kalibrációs

100

görbéről olvassuk le. A fehérje-meghatározás az oldatban jelenlévő pufferektől,

detergensektől, kelatizálószerektől és az aminosavösszetételtől (tirozin, triptofán)

erősen függ. (A klorofill jenléte is zavaró, ezért szerves oldószerrel el kell távolítani a

kivonatból.)

A módszer 100-szor érzékenyebb, mint a Biuret-reakció.

A munka menete

Kukorica levelekből bemérünk 2 g-ot, majd dörzsmozsárban homogenizáljuk 10 ml

7,5 pH-jú foszfátpufferrel és 10 percig 6000-es fordulatszámmal centrifugáljuk. A

centrifugálás során kapott felülúszót használjuk a fehérje-meghatározáshoz (eredeti

kivonat).

A fehérjekivonatból pipettázzunk 2 ml-t centrifugacsőbe és adjunk hozzá 2 ml 10 %-

os triklór-ecetsavat. A kicsapott fehérjét 10 percig 4000-es fordulattal centrifugáljuk.

Centrifugálás után a folyadékot öntsük el, a csapadékhoz pedig adjunk néhány ml 80

%-os alkoholt. Kémcsőkeverővel jól keverjük meg, és tegyük félre kb. 10 percre. Az

oldószer extrahálja a pigmenteket; a fehérjepelyhek elszíntelenednek. Az oldatot

ismét centrifugáljuk, a színes oldószert lehetőleg maradéktalanul elöntjük, a kevés

maradék alkohol elpárolog. Szerves oldószerrel végzett kicsapás hatására a

fehérjetartalmú csapadék tömörré válik, és nehezen oldódik híg lúgban. A

csapadékhoz adjunk 1ml 1n NaOH-ot, majd a fehérje oldódása után 9 ml desztillált

vizet, ezzel az oldatot lúgra nézve 0,1 n-ra állítjuk be. (Ha a fehérje nehezen

oldódna, a lúgos oldatot forró vízfürdőn is melegíthetjük.)

Fehérje meghatározás:

0,5 ml mintához (fehérjekivonat 0,1n NaOH-ban) 4 ml C oldatot adunk, összerázzuk

és 10 percig állni hagyjuk. Ezután a D oldatból 0,5 ml-t adunk hozzá, majd ismét

azonnal összerázzuk. 30 perc elteltével a mintát fotometráljuk.

A oldat: 2 %-os Na2CO3 0,1 n NaOH-ban oldva

101

B1 oldat: 1 %-os CuSO4.5H2O

B2 oldat: 2 %-os Na-K-tartarát

C oldat: 0,5 ml B1 és 0,5 ml B2 oldatot összekeverünk, majd 50 ml A oldatot

adunk hozzá ("C" mindig frissen készítendő)

D oldat: Gyári Folin-Ciocalteu reagens és desztillált víz 1:1 arányú elegye

Kalibrációs görbét - melyet a fotométer memóriájában tárolunk - humán szérum

albuminból (HSA) készítünk 40-400 µg tartományban a táblázatnak megfelelően.

Kémcsőszáma

1,0 mg/ml-esHSA oldat (µµµµl)

Desztillált víz(µµµµl)

C oldat (ml) D oldat (ml) µµµµg feh./teszt

0. (VAK) - 500 4,0 0,5 0,01. 40 460 4,0 0,5 40,02. 60 440 4,0 0,5 60,03. 80 420 4,0 0,5 80,04. 100 400 4,0 0,5 100,05. 150 350 4,0 0,5 150,06. 200 300 4,0 0,5 200,07. 250 250 4,0 0,5 250,08. 300 200 4,0 0,5 300,09. 350 150 4,0 0,5 350,010. 400 100 4,0 0,5 400,0

A méréshez a Beckman DU 65-ös spektrofotométer Protein Assay Soft-Pac

Module "PROG 8:Lowry LS" programjátot használjuk. Ezt a programot akkor

használjuk, ha a koncentráció 25 µg/ml felett van (alacsony érzékenységű mérés 500

nm-en). Ha az oldatunk fehérjetartalma igen nagy, akkor 0,1 n NaOH-val hígítjuk.

Számoljuk ki az eredeti kivonat fehérje koncentrációját figyelembe véve a

hígításokat.

Megjegyzés:

102

Ha híg fehérjekivonattal dolgozunk (a kivonat fehérje koncentrációja 25 µg/ml alatt

van), akkor a méréshez a Beckman DU 65-ös spektrofotométer Protein Assay Soft-

Pac Module "PROG 7:Lowry HS" programját használjuk (nagy érzékenységű

mérés 750 nm-en) és annak megfelelő koncentráció tartományban készítsünk

standardokat.

Anyagok és eszközök

kukorica levelek

pH 7,5 foszfátpuffer, 1 n NaOH, 80 %-os alkohol, 1mg/ml-es HSA oldat, reagensek:

ld. a szövegben

Beckman DU 65-ös spektrofotométer, dörzsmozsár, centrifugacső, kémcsövek,

kémcsőkeverő

28/c A fehérje mennyiségének meghatározása Bradford-módszerrel

A Bradford-módszer mikrogramm mennyiségű fehérje gyors és érzékeny fotometriás

meghatározására alkalmas. Ez a módszer négyszer érzékenyebb, mint a Lowry-féle

módszer. A mérés színreakción alapul, amit a Coomassie Brilliant Blue G-250 festék

(CBBG-250) fehérjékkel való komplexe ad. A vörös színű festék fehérjéhez

kapcsolódva kék színűvé alakul át. A szín 2 perc alatt alakul ki és 1 órán át stabil. A

mérés során kevés interferencia van, a meghatározást a fehérjeoldatban levő egyéb

anyagok (puffer-komponensek, detergensek, stb.) csak kevésbé befolyásolják,

hatásuk a kontroll megválasztásával kiküszöbölhető. A módszerrel 1 és 140 µg/ml

fehérjekoncentrációk között mérhetünk, ha 10 µg/ml alatt, illetve felett külön-külön

standard sorozatot használunk. Ebben a leírásban 10 µg/ml alatti méréshez

használható protokollt adunk meg.

A munka menete

103

Homogenizáljunk 1 hetes bab növény gyökeréből 1 g szövetet 5 ml 7,5 pH-jú

foszfátpufferrel. A homogenizátumot centrifugáljuk 6000-es fordulattal 10 percig. A

felülúszóból (eredeti kivonat) vegyünk ki 1 ml-t és készítsünk 3-4 tagú, ötös léptékű

hígítási sorozatot az extrakciós pufferrel, hogy a feltételezett fehérjekoncentráció a

mérhető (illetve ebben a mérésben ≤ 10 µg/ml ) tartományba essen.

Standardok készítése és mérése

µµµµg feh. /ml 0. (VAK) 2,5 5,0 7,5 10,01 mg/ml BSA

(µµµµl)- 7,5 15,0 22,5 30

0,15 M NaCl(µµµµl)

300 292,5 285,0 277,5 270,0

CBBG-250oldat (ml)

2,7 2,7 2,7 2,7 2,7

Mérjük össze a táblázat szerinti komponenseket, majd 5 perc múlva mérjük az

extinkciójukat.

A minta koncentrációjának megállapítása

Mérjünk be 300 µl megfelelően hígított vizsgálandó oldatot egy centrifugacsőbe és

adjunk hozzá 2,7 ml Coomassie Brilliant Blue G-250 oldatot. Kémcsőkeverővel

gondosan rázzuk össze, de kerüljük el az oldat túlzott habosodását. Mérjük meg 4-5

perc múlva 595 nm-nél a minta extinkcióját.

Számoljuk ki az eredeti kivonat fehérjekoncentrációját a hígítások

figyelembevételével.

Megjegyzés:

A méréshez a Beckman DU 65-ös spektrofotométer Protein Assay Soft-Pac

Module "PROG 6:Bradford" programját használjuk.

Anyagok és eszközök

104

1 hetes bab növény

pH 7,5 foszfátpuffer, 1 mg/ml BSA, 0,15 M NaCl, CBBG-250 oldata

dörzsmozsár, centrifuga, centrifugacsövek, kémcsőkeverő, mikropipetták

105

29. FEHÉRJÉK VIZSGÁLATA POLIAKRILAMID GÉLELEKTROFORÉZISSEL

29/a A poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE) jellemzői

A növényi fehérjék (polipeptidek, enzimek) vizsgálatára az egyik legalkalmasabb

módszer a gélelektroforézis. A gélelektroforézis egy olyan elválasztási technika, ahol

valamely gélszerű hordozóra felviszik a vizsgálandó anyagot, majd a gélt elektromos

erőtérbe helyezik. Az erőtér hatására megindul a minta egyes frakcióinak vándorlása

töltésüktől függően az ellentétes pólus felé. Az eltérő vándorlási sebesség miatt a

frakciók elválnak egymástól. A szétvált frakciókat speciális festéssel láthatóvá lehet

tenni és amennyiben a gélen – megfelelő körülmények között - ismert méretű

(tömegű) standardokat is futtattunk, akkor a frakciók méretét is meghatározhatjuk.

A gélelektroforézisnek több változata ismert a hordozók szerint. Kezdetben a

keményítőgéleket, majd az agargéleket használták, mindkettőnek ma is speciális

alkalmazási területe van. A poliakrilamidgélek 1959-ben jelentek meg.

A poliakrilamidgél az akrilamid és metilén-bisz-akrilamid monomerekből képződő

kopolimer. A lineáris poliakrilamid-struktúrát helyenként metilénhidak stabilizálják. Ez

térhálós szerkezetet eredményez. A polimerizációs folyamat tetrametil-etiléndiamin

indikátor (TEMED) vagy dimetilamino-propionitril (DMAPN) és perszulfát katalizátor

jelenlétében, vagy riboflavin jelenlétében fotokatalitikus úton (fényhatásra) indítható

meg. Térhálós szerkezete folytán a gél molekuláris szitaként viselkedik. A

pórusnagyság az akrilamid monomer koncentrációjával függ össze (7,5 %-os gél

esetében 50 Å). A poliakrilamid gélelektroforézis számos előnnyel rendelkezik a

keményítő gélelektroforézissel szemben: felbontó képessége nagyobb, a gél

átlátszó, így kvantitatív kiértékelésre is alkalmas. Egyik alkalmazási formája, a „disc”-

elektroforézis 50-200 µg-nyi fehérjemennyiség elektroforetikus vizsgálatát is lehetővé

teszi. A PAGE a 103 és 106 D (dalton) közé eső molekulatömegű molekulák töltés és

méret szerinti elválasztására alkalmas.

106

A PAGE hátrányaként szokták felemlegetni, hogy az akrilamid monomer rákkeltő

hatásúnak és idegméregnek bizonyult. Az alapvető laboratóriumi munkavédelmi

előírások betartásával (kesztyű használata) azonban felhasználása veszélytelenné

tehető.

A PAGE-t lehet csövekben, illetve üveglapok között kiöntött gélen végezni. A

géllapokra épülő technika előnyösebb a csövek alkalmazásánál. Módot ad

kétdimenziós technikák végzésére, másrészt egy gélen számos minta precíz

összehasonlító elemzését teszi lehetővé.

A gélek kiöntésére és készülékbe helyezésére speciális küvetták szolgálnak,

melyeket a futtatás előtt kell összeállítani. A küvetta részei a gélnek megfelelő

méretű üveglapok és a gél vastagságát meghatározó keskeny távtartó üvegcsíkok. A

mintafelvivőhelyeket tetszőleges fogszámú műanyag „fésű”-nek a még folyékony

monomer oldatba helyezésével lehet kialakítani. A polimerizáció után a fésűt

eltávolítjuk. A fogak helyén a gélben „zsebek” maradnak vissza, oda juttatjuk be a

mintát. A minták felviteléhez mikropipettát használunk. Egy mintahelyre általában 5-

30 µl folyadék vihető fel.

A futtatáshoz használt berendezések rendszerint egy alsó és egy felső

puffertartályból épülnek fel, melyek a platina elektródokat is tartalmazzák. (A két

tartály között a gélen keresztül vándorol az áram.) Az elektródok érintésvédelemmel

ellátva, szabályozható, egyenáramú tápegységhez kapcsolódnak. A tartályokba

esetenként hűtőfolyadék keringető rendszer van beépítve. Ennek hiányában a

futtatást hűtőszekrényben végzik. A futtatás közben a gélek felmelegedését el kell

kerülni részben azért, mert egyenlőtlen futást eredményezne a géllap szélei és

közepe között („a gél mosolyog”), másrészt pedig inaktiválná az enzimeket, ami

izoenzim elválasztás esetén lehetetlenné tenné az enzimműködésre épülő speciális

festéseket. A megfelelő áramerősség és feszültség a puffer ionerősségétől függ. A

túlzott felmelegedés megelőzése érdekében a teljesítmény nem haladhatja meg az

50 W-ot.

A futtatás után kikapcsoljuk a tápegységet, eltávolítjuk a csatlakozó huzalokat, az

üveglemezeket rögzítő kapcsokat és a gélt festőtálba juttatjuk. A fehérjék

107

nemspecifikus festésére általában Coomassie Brillant Blue R 250 festéket

használunk. Ezzel csíkonként 0,5 µg fehérjét lehet minimálisan kimutatni. Gyakran

használják az ezüstfestést, azzal 0,01 µg fehérjét lehet minimálisan kimutatni.

A festet géleket fotózni szokták, kiértékelésük vizuálisan vagy géldenzitométerrel

történik.

A poliakrilamid gélelektroforézisnek a leírtakon túlmenően számos változata létezik.

29/b Burgonyafajták azonosítása poliakrilamid gélelektroforézissel a raktározott

fehérjék és az észteráz izoenzimek alapján

A hagyományos morfológiai jellemzésen alapuló módszerek mellett, egyes

esetekben szükség lehet biokémiai jellegű vizsgálatra is, egy genotípus pontos

azonosítása érdekében. Pl. in vitro körülmények között (in vitro génbankban) a

genotípusok morfológiájuk alapján nem azonosíthatók. Ugyancsak bizonytalan lehet

egy fajta azonosítása a kereskedelemben, amikor már nem az egész növény, csak

pl. a burgonya esetében a gumó áll rendelkezésünkre. Kereskedelmi, fajtavédelmi

szempontok, a genetikai stabilitás ellenőrzése tehát igényli ezeket a kemotaxonómiai

módszereket. Az egyes fajok, genotípusok azonosítására ma már több fehérje,

izoenzim és DNS technika áll rendelkezésünkre.

Burgonya esetében a gumó raktározott fehérjéinek és észteráz izoenzimjeinek

elektroforetikus spektruma megbízhatóan használható egy-egy fajta azonosítására.

A módszert az 1960-as években vezették be, azóta kétszer is közzétették az európai

burgonya fajták - gélelektroforetikus mintázatokat is tartalmazó - katalógusát.

108

A munka menete

Fehérje kivonat készítése

Készítsünk kivonatot különböző burgonya fajtákból. A kivonat készítéshez használt

gumónak frissen felszedettnek, érettnek és egészségesnek kell lennie. Amennyiben

már betárolt gumót vizsgálunk, akkor lehetőleg 4-10 °C-os tárolóból származzon és

legfontosabb, hogy a gumónak nyugalmi állapotban kell lennie, nem csírázhat.

A gumót hideg vízben mossuk meg és töröljük szárazra, majd -20 °C-on fagyasszuk

egy éjszakán át. Másnap szobahőmérsékleten kiolvasztjuk és homogenizátorral

(gyümölcscentrifuga) lét nyerünk belőle. A lé minden 10 ml-éhez 0,05 ml szulfit-

oldatot adunk, amivel a nem kívánatos oxidációs reakciókat gátoljuk meg.

Centrifugálással (10 perc, 3000 g-vel) eltávolítjuk a léből a keményítőt. (A szulfittal

kezelt oldat nagy részét kisebb adagokba szétporciózva lefagyaszthatjuk, így évek

múltán is alkalmazható fajtaazonosításra.)

A lecentrifugált mintánk felülúszójának 0,9 ml-éhez 0,1 ml festék-oldatot adunk, ami

cukor/amidofekete keveréke (ld. függelék). A festékkel a gélen nyomon tudjuk

követni az ionfront vándorlását, a cukorral pedig a minta fajsúlyát növeljük meg, ami

a minta felvitelénél az ülepedést segíti elő a zsebekben.

A gélküvetta összeállítása

Állítsunk össze az alábbiak szerint két küvettát. A küvetta két oldalát képező

üveglapok közé helyezzük a 3 mm-es távtartókat, majd szigetelőszalaggal oldalt

összeragasztjuk a lapokat. A küvetta aljába vékony szilikon csövet helyezünk, majd

itt is szigetelőszalaggal leragasztjuk. A küvettát oldalt erős csipeszekkel fogjuk össze

és a belső éleket körbe folyatjuk mikrohullámú készülékben felolvasztott 1 %-os forró

agarózzal. Az agaróz pillanatok alatt megdermed és ettől kezdve jól szigetel a

távtartók mentén.

A gél elkészítése és a futtatás

109

Az elválasztást 2 db 3 mm vastag, 6 %-os poliakrilamidgélen végezzük.

Ehhez főzőpohárban állítsuk össze a következő monomer-oldatot:

- 200 ml akrilamid (6 %) / bis-akrilamid (0,3 %) monomer pH 8,9 TRIS/bórsavas

pufferben

- 714 µl 10 %-os frissen készített Na-szulfit oldat

- 500 µl DMAPN (3-dimetilamino-propionitril)

- 4 ml 2 %-os frissen készített ammonium-perszulfát-oldat (AMPS)

Az oldatot az összemérés és óvatos keverés után azonnal a gélküvettába kell tölteni.

Ehhez a küvettát rögzítsük függőlegesen, majd óvatosan, buborékmentesen töltsük

bele a monomer-oldatot, és helyezzük bele a fésűt. A teljes polimerizálódás ideje

alatt (kb. 0,5-1 óra) a küvettát nem szabad mozgatni. A polimerizációt követően

óvatosan eltávolítjuk a fésűt, a szigetelőszalagokat és a szilikoncsövet, és a

gélküvettát csipeszekkel rögzítjük az elektroforézis készülék puffertartályához. Az

érintkező részeket itt is forró agarózzal futtatjuk be. A tartályokat feltöltjük

TRIS/bórsavas pufferrel.

Az összfehérje vizsgálathoz fajtánként 5-10 µl megfestett mintát vigyünk fel az egyik

gélre. Az észterázokhoz a másik gélre - azonos sorrendben - 3-5 µl-t mintát vigyünk

fel burgonya fajtánként. A minták felvitele után csatlakoztatjuk a készüléket a

tápegységhez, a készüléket hűtőszekrénybe helyezzük és 300 V feszültséggel

megindítjuk a futtatást úgy, hogy a vándorlás az anód felé történjen. A futtatást addig

végezzük, amíg a gélen a festékcsík el nem éri a gél alját (2-3 óra). Ekkor a

készüléket kikapcsoljuk, a géleket kiszedjük az üveglapok közül és megfestjük őket.

A gélek festése

A fehérjék nemspecifikus festéséhez a gélt Coomassie Brillant Blue R 250 0,025 %-

os oldatába helyezzük 3 óra időtartamra, vagy 0,01 %-os oldatba éjszakán át történő

festés esetén. (A gélfestő-oldat leírását a függelék tartalmazza.) Festés közben

célszerű a gélt enyhén rázatni. A festés után a gélt 3-4 alkalommal színteleníteni kell

víz/metanol/ecetsav 14:6:1 arányú keverékével (kb. 300 ml-el alkalmanként). A

110

színtelenítés során a gélnek azon részei, melyek nem tartalmaznak fehérjét,

elszíntelenednek, a fehérje-festék komplexek viszont jól látható kék csíkok

formájában jelennek meg.

Az észtározok megjelenítéséhez a másik gélt 200 ml 0,15 M-os pH 7,2

foszfátpufferbe helyezzük szobahőmérsékleten 5-10 percre, majd hozzáadunk 3 ml

acetonban feloldva 40 mg 1-naftil-acetátot (ezt használjuk az észterázok

szubsztrátumaként) és vízben oldva 100 mg Fast-Blue-RR sót. Kb. 1 óra alatt

megjelennek az észterázokra jellemző barna sávok, ezek az enzimreakció

következtében felszabaduló 1-naftol és a Fast-Blue-RR só színes komplexei. A

reakció leállításához a gélt a fehérjék festésénél használt színtelenítő oldatba

helyezzük.

Kiértékelés

Hasonlítsuk össze az egyes burgonya fajták fehérje és észteráz spektrumát!

Figyeljük meg a közös és az eltérő sávokat.

A géleket fotózás, vizuális vagy/és denzitométeres kiértékelés után nylon zacskóba

hegesztve szárítva, vagy nedvesen hosszú ideig tárolni lehet.

Anyagok és eszközök

különböző burgonya fajták gumói

szulfit-oldat, festék-oldat (cukor/amidofekete), 1 %-os agaróz, akrilamid (6 %) / bis-

akrilamid (0,3 %) monomer pH 8,9 TRIS/bórsavas pufferben, 10 %-os frissen

készített Na-szulfit oldat, DMAPN, 2 %-os frissen készített ammonium-perszulfát-

oldat (AMPS), Coomassie Brillant Blue R 250 0,025 %-os oldata, pH 8,9

TRIS/bórsavas puffer, víz/metanol/ecetsav 14:6:1 arányú keveréke, 0,15 M-os pH

7,2 foszfátpuffer, aceton, 1-naftil-acetát, Fast-Blue-RR só

elektroforézis készülék tartozékokkal, centrifuga, homogenizátor, kémcsövek,

Eppendorf-csövek, mikropipetták, szigetelőszalag, mikrohullámú készülék,

festőtálak, rázatógép, főzőpoharak

111

30. AZ ANTOCIÁNOK KIVONÁSA ÉS TULAJDONSÁGAIK VIZSGÁLATA

Az antociánok piros és kék virágok, valamint színes gyümölcsök nagy részének

színét adó flavan-vázas amfoter jellegű vegyületek. Szerkezetüket tekintve

antocianidin-glikozidok, melyekben a cukorpartner (pentóz, hexóz, vagy szacharóz)

egy festékkel (antocianidinnel) kapcsolódik. A vöröskáposzta cianidinje

szinapinsavval kapcsolódik.

Az antocianidin maga vízben oldhatatlan, azonban cukorral kapcsolódva már oldódik

a vakuólum sejtnedvében. Az antociánok főként felületi szövetekben találhatók, de

mélyebben elhelyezkedő szövetekben is előfordulnak rendszerint a sejtnedvben

oldva vagy ritkábban kristályosan. Ásványi és szerves savakkal jól kristályosodó

sókat képeznek.

Színük sokféleségét a bennük levő festék változatossága adja, de a közeg pH-ja is

befolyásolja a szín kialakulását. Savanyú közegben piros, lúgos közegben kék

színűek.

A festékeknek különböző ionokkal való komplexei fontosabb szerepet kapnak, mint a

pH-érték. A búzavirág kék színe pl. az antocianidin káliumsójától származik, nem

pedig a lúgos kémhatás következménye.

A virágpigmentek, köztük az antociánok biológiai szerepe sokféle. Elsősorban mint

színszűrők működnek, a pollen generatív sejtjeit védik a rövidhullámú sugarakkal

szemben, valamint védelmet nyújtanak a gombák és baktériumok támadása ellen is.

Színükkel a rovarokat már messziről csalogatják, segítve ezzel a megporzást. A

virágok különleges rajzolata az ún. "mézösvények" mutatják a rovaroknak a

nektárhoz vezető utat. A piros és kék színű virágokban, gyümölcsökben a

megporzást és a termésterjesztést (madarak) szolgálják. Az antociántartalmú levelek

a Nap hősugarait jobban hasznosítják (fagyvédelem).

Megjegyezzük, hogy a növények színének kialakításában az antociánok és a

korábban tárgyalt fotoszintetikus pigmentek mellett más vegyületek is részt vesznek.

Ilyenek, pl. a flavonol-glükozidok, melyek az antociánokkal rokon vegyületek, sok

112

növény - köztük a napraforgó - sárga virágszínét okozzák. Míg az antociánok okozta

szín a sejtnedv savas vagy lúgos jellegétől is függ, addig a flavonol-glükozidok színe

állandó.

Kísérletünkben antocián-kivonatot készítünk, és különböző pH-értékeknél vizsgáljuk

a színét.

A munka menete

Vékonyan szeleteljünk fel vöröskáposztát, 5-szörös mennyiségű desztillált vízben

főzzük fel, majd szűrjük le az oldatot. Az antocián-kivonatból tegyünk néhány ml-t

kémcsövekbe és adjunk hozzájuk 0,1 n sósavból annyit, amíg színük élénkvörös

lesz. Ekkor cianidin-klorid keletkezik. Ezután 0,1 n NH4OH-val semlegesítsük azt az

eredeti szín visszatéréséig. Adjunk több lúgot is az oldatba és figyeljük a szín

megváltozását (kékeszöld-zöld-sárga).

Készítsünk foszfátpufferrel oldatsorozatot; pH 2,1-11,2-ig. (A puffer receptjét a

függelék tartalmazza.) Töltsük be ezeket egy sorozat kémcsőbe (3-3 ml-t) és a

sorozathoz adjunk az antocián-extraktumból 5-5 ml-t. Figyeljük meg a színváltozást!

Mártsunk be a tömény antocián kivonatba egy-egy szűrőpapírcsíkot, majd szárítsuk

meg azokat. A száraz antociános papírra a pH érték növekedésének sorrendjében

cseppentsünk pufferoldatokat.

Ragasszuk be a jegyzőkönyvbe a papírcsíkokat és írjuk az egyes foltok mellé a pH

értékeket!

Anyagok és eszközök

vöröskáposzta (Brassica oleracea convar. capitata f. rubra)

0,1 n HCl, 0,1 n NH4OH, 0,066 M KH2PO4, 0,066 M Na2HPO4.2H2O, 0,066 M K3PO4

kémcsövek, pipetták, szűrőpapír, cseppentő, fazék, kés, tölcsér, elektromos főzőlap

113

31. A NIKOTINTARTALOM MEGHATÁROZÁSA

A nikotin a dohánynövény fő alkaloidja. A közönséges dohánylevél (Nicotiana

tabacum) finom minőségű fajták esetén 0,5-1,5 %, a durvább minőségű fajták esetén

2,5-3 % nikotint tartalmaz. A kapadohány (N. rustica) nikotintartalma szárazanyagra

számítva meghaladja az 5 %-ot. Vannak majdnem teljesen nikotin mentes fajták is,

némelyek pedig 15 % -ot tartalmaznak. A nagy nikotintartalmú fajtákból tiszta nikotint

állítanak elő. A tiszta nikotin színtelen, kábító szagú folyadék, erős idegméreg.

Levéltetvek, szilvamoly, szőlőmoly stb. ellen 0,1-0,2 %-os permetlében használják.

(Mérgező hatása megközelíti a hidrogéncianidét.) A halálos dózisa emberre 40-60

mg, ezért levélzöldség-féléknél tilos felhasználni. A nikotinon kívül a dohány többféle

mellékalkaloidot is tartalmaz (nikotirin, nikotein, nikoririn, nikotellin). A nikotin nagy

részének szintézise a dohány gyökerében játszódik le.

A nikotin a természetben a citromsav, borkősav, almasav, vagy más szerves savak

sójaként fordul elő. A só formájában való extrahálás vízzel vagy alkohollal könnyen

és gyorsan megvalósítható, de az eljárásnak a további vizsgálatot nehezítő hibája

az, hogy az alkohol, de még inkább a víz az alkaloidok mellett egyéb extrahálható

anyagokat is kiold. Ezért előnyben részesítjük azt az eljárást, amely a nikotint, mint

szabad bázist vonja ki. Ez esetben a növényi anyagot lúgosítani kell, és valamilyen

szerves oldószerrel extrahálni.

A BOGNÁR-féle térfogatos meghatározás elve az, hogy meglúgosított dohányból

éter-petroléterrel kivonjuk a nikotint, amelyet metilvörös indikátor jelenlétében 0,01 n

sósavval közvetlenül megtitrálunk.

A munka menete

1. A mérést párhuzamosan végezzük két különböző minőségű dohányon. (A

gyakorlaton különböző minőségű cigarettákat használunk.)

114

Mérjünk be 1 g finoman porított dohányt a jódszám-lombikba, adjunk hozzá 2 ml 20

%-os nátrium-hidroxidot, üvegbottal keverjük jól el, végül öntsünk hozzá 20 ml éter-

petroléter keveréket. (Az éter-petroléter keveréket mérőhengerrel mérjük ki!)

2. A lúg a dohányban levő nikotint felszabadítja, az éter-petroléter keverék pedig

kioldja.

3. A bedugaszolt lombikot 1 órán át gyakori rázogatással kezeljük.

4. A keverékből 10 ml-t mérőhengerrel átöntünk egy másik lombikba és az oldószert

vízfürdőn, vegyifülkében elpárologtatjuk.

5. A maradékot kevés desztillált vízzel felvesszük, és 2-3 csepp metilvörös indikátor

hozzáadása után 0,01 n sósavval hússzínűre titráljuk. Számoljuk ki a különböző

minőségű dohányok nikotintartalmát szárazanyagra számítva!

A dohány nedvességtartalmát légszáraznak, 14 %-nak vegyük.

1 ml 0,01 n HCl 1,62 mg nikotinnak felel meg.

fogyott 0,01 n HCl ml . faktor . 1,62 . 100nikotin % =

bemért anyag fele mg-ban . 0,86

Anyagok és eszközök

különböző dohánytermékek

20 %-os NaOH, 0,01 n HCl, éter-petroléter (1:1) keveréke, metilvörös indikátor

mérleg, dörzsmozsár pisztillussal, üvegbot, 50 ml-es jódszámlombik, 40 ml-es

titrálólombik, 2 ml-es pipetta, 10 ml-es mérőhenger, 25 ml-es büretta, vízfürdő

115

32. NÖVÉNYRÉSZEK C-VITAMIN TARTALMÁNAK MEGHATÁROZÁSAJODOMETRIÁS MÓDSZERREL

A C-vitamin (aszkorbinsav) a sejtlégzésben nélkülözhetetlen vitamin, amit a Nobel-

díjas Szent-Györgyi Albert izolált először 1928-ban. A C-vitamin savanyú közegben

aránylag állandó, lúgosban gyorsan bomlik. Bomlását a fémek is - különösen a Cu

és a Fe - gyorsítják. Az aszkorbinsavnak a növényi sejtekben is fontos szerepe van a

gyökös reakciók kivédésében. Egyik ilyen szerepe pl. a kloroplasztiszban figyelhető

meg, ahol intenzív megvilágítás esetén - elegendő NADP hiányakor - az elektronok a

ferredoxinról a molekuláris oxigénre kerülnek és így rendkívül toxikus szuperoxidgyök

keletkezik, amit a szuperoxid-diszmutáz (SOD) nevű enzim tovább alakít hidrogén-

peroxiddá. Kloroplasztiszokban nem működik a kataláz, viszont a jelenlévő

aszkorbinsav segítségével az aszkorbinsav-peroxidáz képes a H2O2-ot bontani és

így a további gyökös reakciókat kivédeni.

aszkorbinsav-peroxidázaszkorbinsav + H2O2 → dehidro-aszkorbinsav + 2 H2O

A dehidro-aszkorbinsav még vitaminhatású vegyület, azonban további oxidáló

enzimek inaktívvá alakítják.

A C-vitamin dehidro-aszkorbinsavvá alakítását végzi az aszkorbinsav-oxidáz nevű

enzim is. C-vitamin-tartalmú konzervek készítésénél a növényi anyagot először forró

gőzzel leforrázzák, ezáltal a különböző enzimeket inaktíválják, így a C-vitamin-

tartalom jelentős részét meg tudják őrizni.

A mérésünk során alkalmazott módszer a valóságosnál kissé nagyobb C-vitamin

értéket szolgáltat, de a viszonylagos összehasonlításra jól beválik. A vizsgálandó

növényrész aszkorbinsav-tartalmát megsavanyított vízzel extraháljuk, hogy bomlását

gátoljuk. A titrálást kálium-jodáttal végezzük, ami a kálium-jodidból jódot szabadít fel.

116

Utóbbi az aszkorbinsavat dehidroaszkorbinsavvá oxidálja, amikor az aszkorbinsav

teljes mennyisége átalakul, a feleslegben lévő, felszabaduló jódtól a

keményítőindikátor megkékül.

A munka menete

A vizsgálandó növényrészt rozsdamentes szikével felaprítjuk és ebből 1 g-ot

porcelánmozsárba mérünk, bidesztillált vízzel készített 2 %-os sósavval nedvesítjük

a felaprózott anyagot, péppé dörzsöljük és kevergetés közben sósavval 10-15 ml-re

hígítjuk. A folyadékot tölcsérbe tett vattarétegen át mérőhengerbe szűrjük, 2 %-os

sósavval a mozsárban és dörzsölőn maradt törmeléket is néhányszor ráöblítjük. A

szüredéket ezután 2 %-os sósavval 50 ml-re feltöltjük és összerázzuk. A C-vitamin-

tartalmú szüredékből 10 ml-t Erlenmeyer-lombikba pipettázunk, 30 ml desztillált

vízzel, 5 ml 2 %-os sósavval, 5 ml 1 %-os KI-oldattal és 5 ml 0,2 %-os keményítő-

indikátorral elegyítjük. Ezután mikrobürettából 0,004 n KIO3-oldattal titráljuk, amíg a

kék szín kb. fél percig megmarad.

Az adatok feldolgozása

Számítsuk ki mg %-ban a vizsgált növényrész C-vitamin tartalmát!

0,3522 . i . a . 100C-vitamin, mg % =

bemért növényi anyag g-ban

i = a titráláshoz fogyott kálium-jodát ml-ben (több titrálás középértéke),

a = a teljes kivonat (50 ml) és egy-egy titrálásra kivett mennyiség (10 ml) hányadosa

(példánkban 5)

1 ml 0,004 n KIO3 oldat 0,3522 mg aszkorbinsavval equivalens.

117

Anyagok és eszközök

alma, citrom

2 %-os sósav, 1 %-os KI-oldat, 0,2 %-os keményítő-indikátor, 0,004 n KIO3-oldat

szike, dörzsmozsár, tölcsér, vatta, 50 ml-es mérőhenger, parafilm, 100 ml-es

Erlenmeyer-lombik, mikrobüretta

118

FÜGGELÉK

A függelékben azok a reagensek találhatók meg, melyek leírása az adott feladatnálnem, vagy csak részlegesen szerepel, illetve több feladatnál is szükség van rá.

Acetát pufferTörzsoldat: 0,1 n ecetsav (6,3 ml jégecet 1000 ml-re )

0,1 n Na-acetát (8,2 g Na-acetát 1000 ml-re)A két törzsoldatot az alábbi arányban keverjük:

A keverékpH-ja

0,1 nCH3-COOH

ml

0,1 nCH3-COONa

ml

A keverékpH-ja

0,1 nCH3-COOH

ml

0,1 nCH3-COONa

ml3,19 97 3 5,00 33,3 66,73,30 94 6 5,30 20 803,80 89 11 5,60 11 894,10 80 20 5,90 6 944,40 66,7 33,3 6,22 3 974,70 50 50

Akrilamid / bis-akrilamid monomer pH 8,9 TRIS/bórsavas pufferben11,9 g akrilamidot és 0,63 g metilén-bis-akrilamidot oldjunk fel 210 ml pH 8,9TRIS/bórsavas pufferben, majd szűrjük meg. Az oldatot (rendkívűl mérgező, bőrönkeresztül is!) hűtőszekrényben, sötétben legfeljebb egy hétig tároljuk.

Aminosav kivonat készítéseOptimális vízellátás mellett nevelt és vízhiányos, vagy egyéb módon kezelt növények(borsó, napraforgó, búza, paprika) hajtásait vagy kifejlett leveleit frisstömeg mérésután 60°C-on tömegállandóságig kiszárítva száraztömeget mérünk, majd elektromosőrlővel elporítjuk.200 mg levélport kevés kvarchomokkal és 20 %-os etanol néhány ml-ével pépesredörzsöljük és centrifugacsőbe öntjük úgy, hogy a végső térfogata 10 ml legyen.20 percig 6000 fordulattal centrifugáljuk, majd a felülúszót 10 ml-es üvegfiolábatöltjük és gumidugóval lezárjuk. (Ez az aminosav analízis törzsoldata)

Aminosav-oldatok (összehasonlításhoz)'A' oldat: 100 ml 0,1 n HCl-ben feloldunk 0,1-0,1g-ot a következő aminosavakból:cisztin, aszparaginsav, glutaminsav, metionin, leucin'B' oldat: 100 ml 0,1 n HCl-ben feloldunk 0,1-0,1g-ot a következő aminosavakból:aszparagin, glutamin, tirozin, valin, fenilalaninAz oldatok hűtőszekrényben több hónapig eltarthatók.Biuret-reagens

119

0,75 g CuSO4.5H2O-t és 3 g Na-K-tartarát.4H2O-t 100 ml desztillált vízben oldjunk fel,

adjunk hozzá 150 ml 10 %-os NaOH-oldatot és desztillált vízzel 500 ml-re hígítsukfel. (Hónapokig eltartható!)

CCC-oldat (10-3 M)Az eredeti töménységű Bercema CCC-ből (500g/l klórmekvát) kiveszünk 16 µl-t ésdesztillált vízzel kiegészítjük 50 ml-re.

Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBBG-250) oldataEgy 1 literes lombikban oldjunk fel 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250-t 50 ml 95%-os etanolban. Adjunk hozzá 100 ml 85 %-os foszforsavat. Egészítsük ki 1000 ml-re desztillált vízzel. Whatman No. 1 papíron szűrjük meg. 4°C-on tároljuk.

2,6-Diklórfenol-indofenol (0,001 n)-oldatM/15 6,9-7,0-es pH-jú SÖRRENSEN-féle foszfátpufferből 300 ml-t készítünk. (Afesték vizes oldata igen gyorsan bomlik). 0,0266 g 2,6 -diklórfenol-indofenolhoz 700ml desztillált vizet és 300 ml puffert adunk. Jól összerázzuk, és a következő naponleszűrjük. Ezután még két-három órán át állni hagyjuk, és időnként összerázzuk,majd sötét üvegbe öntjük. A festékoldat a titer ellenőrzés mellett kb. 20 napighasználható.Az oldat titerének megállapítása céljából fenti festékoldatból 10 ml-t Erlenmeyer-lombikba pipettázunk, 5 ml telített ammónium-oxalátot adunk hozzá ésmikrobürettával 0,001 n Mohr-sóval (ammónium-ferroszulfáttal) szalmasárga színigtitráljuk.Faktor: a fogyott Mohr-sóoldat ml száma szorozva a Mohr-só faktorával.0,001 n Mohr-só készítése és faktorozása: 0,3921 g Mohr-sót /NH4/2Fe/S04/2 . 6 H20(molsúly = 392,14) 0,02 n kénsavban oldjunk 1 literre. Ebből kipipettázunk 10 ml-t,hozzáadunk 1,5 ml 1,84 fajsúlyú, vízzel 1:2 arányban higított kénsavat, és 0,001 nKMn04-tal rózsaszínig titráljuk. A KMn04 titerét viszont nátrium-oxaláttal vagyoxálsavval állítjuk be.

Ecetsav (5 %-os)52,08 ml -t 1000 ml-re hígítva

Ecetsav (0,1 n)6,3 ml jégecetet 1000ml-re egészítsünk ki desztillált vízzel.

EtilalkoholAz alkohol különböző koncentrációban rendkívül gyakran alkalmazott oldószer. Akereskedelem 95-96 %-os tiszta szesz és vízmentes (abszolút) alkohol néven hozzaforgalomba. A különböző hígítású alkoholsorozatot 95-96 %-os tiszta szeszbőlállítjuk elő (a táblázat szerint), általában térfogat alapján, azonban analitikai célokrasokkal helyesebb a vízzel való keverés során bekövetkező fajsúlyváltozást alapulvenni. Hígításnál az alkohol előbb felmelegedik, majd az elegyben oldott gázok

120

lépnek ki. A fajsúlyt csak a megfelelő (+15 oC) hőmérsékleten és feltisztulás utánállapítsuk meg. A táblázatban 100 ml adott töménységű (hígítandó) alkoholhozadandó desztillált víz mennyisége (ml) van feltüntetve.

Előállí-tandó

%

A hígítandó alkohol százaléka

95 % 90 % 85 % 80 % 75 % 70 % 65 % 60 % 55 % 50 % 45 % 40 % 35 %90 6,5085 13,36 6,5680 20,16 13,79 6,8370 29,68 21,89 14,48 7,2070 39,16 31,05 23,14 15,35 7,6465 50,66 41,53 33,03 24,66 16,37 8,1560 63,16 53,65 44,48 35,44 26,47 17,58 8,7655 78,36 67,87 57,90 48,07 38,32 28,63 19,02 9,4750 96,36 84,71 73,90 63,04 52,43 41,73 31,25 20,47 10,3545 117,86 105,34 93,90 81,33 69,54 57,78 46,09 34,46 22,90 11,4140 144,86 130,30 117,34 104,01 90,76 77,58 64,48 51,43 38,46 25,55 12,835 178,86 163,48 143,01 132,83 117,82 102,84 87,93 73,08 58,31 43,59 27,6 14,330 224,4 206,22 188,57 171,05 153,61 136,04 118,94 101,71 84,54 67,45 50,6 33,4 16,8

Faktorozás a fotoszintetikus oxigéntermelés meghatározásához20 ml 0,1 n KJO3-at bemérünk titrálólombikba. Hozzáadunk 0,8-1,0 g KJ-ot. HCl-valvagy H2SO4-el kicsit megsavanyítjuk (1-2 csepp) megtitráljuk 0,1 n Na2S2O3-mal.indikátor: keményítőfaktor = 20,0/A A = fogyott Na2S2O3 ml

Faktorozás: 0,1 n KMnO4 faktorának beállítása (COOH)2.2H2O-ra

Analitikailag legtisztább (alt.) oxálsavból 0,1 n oldatot készítünk. Ehhez 6,3034 goxálsavat mérünk 1000 ml-re. 20 ml 0,1 n oxálsavoldatot mérünk titrálólombikba,hozzáadunk 10 ml 20 %-os H2SO4-oldatot és 70-80 °C-ra melegítjük, majd ezen ahőmérsékleten 0,1 n KMnO4-tal megtitráljuk. Kezdetben a mérőoldatot cseppenkéntadagoljuk az oldathoz és kevergetés közben addig várunk, míg az oldatelszíntelenedik. A permanganát ugyanis önmagában csak lassan reagál az oxaláttal,a reakció folyamán keletkező mangán(II) ionok azonban katalizálólag hatnak azoxidációra és így később a reakció pillanatszerűvé válik. Miután az első permanganátrészlet elszíntelenedet, a titrálást gyorsabban folytathatjuk mindaddig, míg végül azoldat az első csepp KMnO4 fölöslegtől észrevehetően ibolyaszínű lesz és aszíneződést 1-2 percig megtartja. A titrálást legalább háromszor végezzük el.Faktor: 20/A A = fogyott 0,1 n KMnO4-oldat (ml)

Fehling-oldatI. oldat: 69,28 g kristályos réz(II)-szulfát 1000 ml-re oldva.II.oldat: 364 g kálium-nátrium-tartarát és 100 g nátrium-hidroxid 1 literre oldva.Fenolftalein (1 %-os)

121

Oldjunk fel 0,5 g fenolftaleint 50 ml 96 %-os alkoholban és hígítsuk 50 ml vízzel. Azátcsapási területe pH 8,3-10

Festék-oldat gélelektroforetikus mintákhozOldjunk fel 1 mg Amidofekete 10 B festéket 5 ml desztillált vízben, adjunk hozzá 10 gszacharózt, majd desztillált vízzel egészítsük ki 10 ml-re. A mikrobás fertőződésmegakadályozása céljából adjunk hozzá 0,1 ml propilén-oxidot (erős méreg).

FoszfátpufferTörzsoldatok: 0,1 n HCl

0,066 M KH2PO4 (9,078 g/l)0,066 M Na2HPO4

.2H2O (11,876 g/l)0,066 M K3PO4 (14,156 g/l)

pH 0,1 nHClml

0,066 MKH2PO4

ml

0,066 MNa2HPO

4ml

0,066 MK2PO4

ml

2,1 9,5 0,5 - -3,6 0,5 9,5 - -4,7 - 10,0 - -5,6 - 9,5 0,5 -5,9 - 9,0 1,0 -6,2 - 8,0 2,0 -6,5 - 7,0 3,0 -6,6 - 6,0 4,0 -6,8 - 5,0 5,0 -7,0 - 4,0 6,0 -7,2 - 3,0 7,0 -7,4 - 2,0 8,0 -7,7 - 1,0 9,0 -8,0 - 4,5 - 5,59,8 - 5,0 - 5,010,7 - 3,0 - 7,011,2 - - 3,0 7,0

Foszfátpuffer észterázok festéséhez ( 0,15 M, pH 7,2)„A” oldat: 107,4 g Na2HPO4

.12 H2O-t oldjunk fel 2000 ml-re desztillált vízzel„B” oldat: 46,8 g NaH2PO4

.2 H2O-t oldjunk fel 2000 ml-re desztillált vízzelEgy gél festéséhez keverjünk össze 120 ml A oldatot és 80 ml B oldatot.

Futtató oldat (aminosavak elválasztásához)Elegyítsünk 400 ml butanolt 100 ml ecetsavval és 500 ml desztillált vízzel.Gélfestő-oldat

122

Oldjunk fel 30 g triklór-ecetsavat 800 ml desztillált vízben, adjunk hozzá 200 mlmetanolt és 70 ml ecetsavat. Ennek a keveréknek a 400 ml-hez adjunk 10 ml 1 %-osCoommassie Brillant Blue R 250 vizes oldatot.

H2O2 oldat1 %-os: 30 %-osból 16,6 ml-t 500 ml-re hígítunk0,5 %-os: 30 %-osból 8,3 ml-t 500 ml-re hígítva

Hg(ll)klorid-oldat (2 n)2,72g HgCl2 100ml-re oldva.

Izatinpapír-indikátor200 ml metanolhoz 5 ml ecetsavat és 2 g izatint adunk. Az izatin reagenstnagyméretű Petri-csészébe öntjük, és kromatografálópapír csíkokat áztatunk benne5 percig. Ezután a csíkokat szűrőpapírra helyezzük 10 percre, majd 80 oC-osszárítószekrényben 15 percig aktiváljuk. Fóliába csomagolva sötét helyen tároljuk.

Jódoldat12,7 g J2-ot és 25 g KJ-ot 35 ml vízben oldunk, majd vízzel 1l-re feltöltjük.

Karbamid 2 M-os oldata120,118 g karbamid-ot oldjunk fel 1000 ml-re desztillált vízzel.

Kálcium-acetát (normál)88 g kristályos Ca-acetát H2O-t desztillált vízzel 1 l-re oldjuk. Használat előttmészvízzel, fenolftalein jelenlétében halvány rózsaszínig titráljuk.

Kálciumklorid-oldat (tömény)80 g kristályos CaCl2-ot 100 ml-re oldunk.

Kálciumklorid 1 M-os oldata219,09 g CaCl2.6H2O-t oldjunk fel 1000 ml-re desztillált vízzel.

Kalciumnitrát 0,2 n oldata16,41 g Ca(NO3)2-t, vagy 21,81 g Ca(NO3)2

.3H2O-t, vagy 23,62 g Ca(NO3)2.4H2O-t

oldjunk fel 1000 ml-re desztillált vízzel.

KIO3-oldat (0,004 n)0,1427 g KIO3 desztillált vízzel 1 l-re oldva

KI-oldat (10 %-os)10 g KI-ot oldunk 100 ml frissen kiforralt és lehűtött vízben. Frissen készítendő.KJO3 0,1 n oldata

123

150-180 °C-on szárított KJO3-ból 1,7835 g-ot mérünk be 500 ml-re. Jól záródóüvegdugós üvegben korlátlanul eltartható és a tioszulfát titerének ellenőrzésérebármikor felhasználható.

Káliumjodidos jódoldat készítése (0,0003 n)0,03 n HCl-t készítünk (3 ml cc. sósavat 1 l-re hígítunk). 3-4 ml vízben feloldunk 0,38g színjódot és 0,8 g KI-t, és a 0,03 n sósavval kiegészítjük 1 literre. Így az oldat 0,003n lesz; ez a törzsoldat. Ez tovább hígítandó tízszeresre: 100 ml jódoldat + 900 ml0,03 n HCl.

Káliumnitrát 0,2 n oldataOldjunk fel 20,22 g KNO3-t 1000 ml-re desztillált vízzel.

Káliumpermanganát-oldat (0,1 n)Lemérünk 3,200 g KMnO4-ot. 1,5 l-es lombikban 1000 ml desztillált vízben feloldjuk.Az oldatot 1 óra hosszat forráspontja közelében tartjuk, de nem forraljuk, majdlehűlés után finom pórusú üvegszűrőn, vagy porcelán szűrőtégelyen keresztül(szűrőpapír nélkül) krómkénsavval tisztított, desztillált vízzel és mérőoldattal kiöblítettüvegdugós, sötét színű üvegbe szűrjük. A kész mérőoldatot portól és laboratóriumigőzöktől elzárva, fénytől és hőtől óvott helyen tartjuk. Az üveg szájára poharatborítunk, hogy a portól védjük a csiszolatot. A kapott oldat titerét legalább hetenteellenőrizzük. KMnO4-al való titráláshoz a büretta üveg csapját kevés vazelinnel (nemcsapzsírral) tömítsük.

KMnO4-reagens10 mg KMnO4-et mérjünk be, és ezt 100 ml 5 %-os NaOH-ban oldjuk fel. Analitikaitisztaságú vegyszereket és a lúghoz frissen készített desztillált vizet kellhasználnunk, mert a reagens a legkisebb szennyezésre is nagyon érzékeny.

Keményítő-indikátor oldatKéshegynyi (kb. 0,02-0,04 g) finoman elporított burgonyakeményítőt kémcsőben 3-5ml desztillált vízzel alaposan összerázzuk, hogy tejszerű folyadék álljon elő. Másikkémcsőbe 2/3 részig vizet teszünk és felforraljuk. A keményítőoldatot hirtelenmozdulattal a forró vízhez öntjük és az oldatot még egyszer felforraljuk.

Keményítő-oldat (amiláz mérésnél)Szuszpendáljunk 1 g oldódó keményítőt 10 ml vízben. Adjunk hozzá 90 ml forróvizet, majd melegítsük forrásig, hűtsük le, és adjunk hozzá teljes telítődésig Na- vagyK-kloridot. Ha keményítőcsiriz képződne, meg kell szűrni.

Kénsav (0.02 n)5,4 ml 96 %-os H2SO4-at desztillált vízzel 1000 ml-re töltünk fel.

Kénsav (25 %-os)

124

Kb. 50 ml desztillált vízhez kis részletekben 25,5 g tömény kénsavat mérünk, majdkihűlés után 100 ml-re egészítjük ki.

Kénsav (10 %-os)10,3 ml H2SO4 100 ml-re hígítva

Lugol oldat1 g KI és 1 g I2 100 ml desztillált vízre oldva.

Lúgos KI oldatot40 g NaOH + 20 g KI + 80 ml desztillált víz

Mangánklorid oldat100 g MnCl2.4H20 + 200 ml desztillált víz

Mértékegységek1 mikrométer (µm) = 0,0001 cm = 10-4 cm régi nevén mikron1 nanométer (nm) = 0,000 0001 cm = 10-7 cm régi nevén: millimikron1 angström (Å) = 0,000 000 01 cm = 10-8 cmNyomás egysége: pascal (Pa), dimenziója: kgm2s-2

(1 Pa = 1 Nm-2) 100 kPa = 1 bar = 0,987 atmoszféra

Metilvörös indikátor0,05 g metilvöröst 3,6 ml 0,05 n NaOH-vel eldörzsölünk és 250 ml 60 %-osalkoholban oldjuk, vagy vizes oldat esetében desztillált vízzel 100 ml-re feltöltjük.

Molális oldat1 mól oldott anyag 1000 g vízben (Szemben a moláris oldattal, ahol 1 mól oldottanyag 1 liter oldatban van.)

Nátrium-acetát 0,1 n oldata8,2 g kristályos nátrium-acetátot oldjunk fel 1000 ml-re desztillált vízzel.

Nátriumkarbonát-oldat28,6 g kristályos nátriumkarbonátot oldjunk 100 ml-re.

NaOH-oldat (n/20)0,2 g NaOH-ot oldjunk desztillált vízzel 100 ml-re.

125

Nátriumklorid 0,15 M-os oldata8,76 g NaCl-t oldjunk fel 1000 ml-re desztillált vízzel.

Nátrium-oxalát 0,1 M-os oldata13,4 g nátrium-oxalátot oldjunk fel 1000 ml-re desztillált vízzel.

Nátriumszulfát (telített)170 g Na2SO4 . 1H2O 1 liter vízben.

Nátriumszulfid-oldat5 g nátriumszulfidot 10 ml vízben oldunk, s az oldatot 30 ml glicerinnel elegyítjük.Néhány nap múlva az oldatot előzetesen szesszel kimosott, kis vattapamaton -szükség esetén többszöri felöntéssel - kristály tisztára szűrjük. Félévesnél régebbioldatot nem használunk.

Nátriumtioszulfát (0,1 és 0,01 n) oldata24,81 g Na2S2O3

.5H2O-t 1000 ml-es mérőlombikba viszünk, hozzáadunk kb. 0,2 gNa2CO3-t, 10 ml izobutilalkoholt (vagy amilalkoholt) és forralással CO2-mentesített,majd gyorsan lehűtött desztillált vízzel jelig töltjük. Az oldat beállítását 2-3 napi állásután végezzük el, végleges hatóértékét 2 hét múlva állapítjuk meg.A 0,01 n-os oldatot a 0,1 n oldat 10-szeres hígításával készítjük.

Nátronlúg (8 %-os)8 g NaOH-ot oldjunk 100 ml-re frissen kiforralt és lehűtött vízben. Vazelinnelvékonyan megkent üvegdugós üvegben tartjuk.

αααα-NES-oldat (2000 ppm)200 mg α-NES-t feloldunk 20 ml etilalkoholban. Gyengén melegítjük, majd feltöltjük100 ml-re desztillált vízzel.

NeutralvörösOldjunk fel 0,01 g neutrálvöröset 100 ml 50 %-os alkoholban. Átcsapási területe pH6,5-8.

Ninhidrin aminosavak és aminek számáraPermetezőoldat: 0,2 g ninhidrint oldjunk fel 95 ml metanolban, izopropanolban vagyvízzel telített n-butanolban. Az oldathoz adjunk 5 ml kollidint.

ppmparts per million, milliomod rész (pl. mg/kg illetve mg/l vagy µg/g illetve µg/ml)

126

Réznitrát oldat telített, vizes5 ml desztillált vízhez 20 g Cu(NO3)2

.3H2O-t adunk, és az üveget légmentesenlezárjuk. (Az oldatnak feloldatlan kristályokat kell tartalmaznia.)

Rézoldat ninhidrin komplex stabilizálására1 ml telített, vizes réznitrátoldathoz adjunk 0,2 ml 10 %-os salétromsavat és 4 mldesztillált vizet, majd töltsük fel metanollal 100 ml-re.

Salétromsav (kb. 2 n)141 ml 65 %-os salétromsavat oldjunk 1l-re.

Sósav (25%-os)65 ml 37 %-os HCl-t 100 ml -re egészítünk ki desztillált vízzel.

Sósav (0,1 n)8,6 ml tömény (37 %-os) HCl-t 1 l-re oldunk desztillált vízzel.

Sósavas ammónium-molibdát5 g ammónium-molibdátot 100 ml desztillált vízben melegítéssel feloldunk és ehhez30 ml tömény sósavat adunk.

Szacharóz oldat 1M-os1 térfogatmólos (moláris) nádcukoroldat készítéséhez lemérünk 342,3 g szacharózt,desztillált vízben feloldjuk és 1 literre feltöltjük. Frissen készítendő.

Szacharóz oldat ozmotikus potenciáljának bar-ban kifejezett értékei 20 °°°°C-onKoncen-tráció (M)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 90,0 0,00 0,26 0,54 0,80 1,07 1,34 1,61 1,87 2,14 2,410,1 2,67 2,95 3,21 3,48 3,75 4,01 4,28 4,54 4,81 5,080,2 5,36 5,64 5,94 6,22 6,51 6,79 7,07 7,37 7,65 7,940,3 8,24 8,53 8,83 9,12 9,41 9,71 10,00 10,30 10,62 10,940,4 11,26 11,58 11,90 12,22 12,53 12,86 13,18 13,51 13,84 14,180,5 14,50 14,83 15,16 15,49 15,85 16,20 16,57 16,93 17,29 17,650,6 18,01 18,37 18,75 19,11 19,49 19,86 20,24 20,61 20,99 21,370,7 21,77 22,16 22,56 22,95 23,35 23,74 24,15 24,59 25,01 25,440,8 25,87 26,30 26,72 27,15 27,55 27,96 28,36 28,77 29,17 29,680,9 30,09 30,59 31,10 31,50 32,01 32,52 33,02 33,53 34,04 34,541,0 35,05 35,56 36,16 36,67 37,18 37,68 38,19 38,70 39,30 39,81

Szulfit-oldat (burgonya fehérje-kivonat készítéséhez)10 g Na2SO3 + 7,5 g Na2S2O5 50 ml-re oldva desztillált vízben

127

TRIS/bórsavas puffer pH 8,9 fehérjék és észterázok gélelektroforetikuselválasztásáhozTörzsoldat készítése: Oldjunk fel 605 g Tris(hidroximetil)-aminometánt és 46 gbórsavat desztillált vízzel 5000 ml-re. A gélek futtatásánál és a monomer oldatkészítésénél ennek a törzsoldatnak az 1:7 arányú hígítását kell használni.

TTC oldat (0,1 %-os)1g TTC-ot 1000 ml desztillált vízben feloldunk. Sötétben több hónapig bomlás nélküleltartható.

128

FELHASZNÁLT IRODALOM

Allaga J. - Borka Gy. - Szabó P.-né 1994. Növényélettani gyakorlatok. PATE

Georgikon Mezőgazdaságtudományi Kar, Keszthely

Ausubel, F.M. - Brent, R. - Kingston, R.E. - Moore, D.D. - Seidman, J.G. - Smith, J.A.

- Struhl, K. 1995. Short protocols in molecular biology. John Wiley & Sons, Inc.,

USA

Brugovitzky E. 1957. Növényélettani vizsgálatok I-II. Mezőgazdasági és Erdészeti

Állami Könyvkiadó, Bukarest

Botz L. - M.-né Bordács M. - Szabó L. Gy. - Técsi L.I. 1995. Növényélettani

gyakorlatok. JPTE, Pécs

Dévényi T. - Gergely J. 1971. Aminosavak, peptidek, fehérjék. Medicina Könyvkiadó,

Budapest

Farkas G. 1984. Növényi biokémia. Akadémiai Kiadó, Budapest

Haraszty Á. 1979. Növényszervezettan és növényélettan. Tankönyvkiadó, Budapest

Hoffmann P. 1987. Fotoszintézis. Mezőgazdasági Kiadó, Budapest

Horváth-Köves-Mainé-Nagy-Pécsváradi-Szabó-Tari-Zsoldos 1993. Növényélettani

gyakorlatok. Munkafüzet. JATEPress, Szeged

Komáromy L. 1989. Biológiai gyakorlatok. POTE Pécs

Lévai L. 1985. Növényélettani gyakorlatok. DATE, Debrecen

Moore, T. C. 1981. Research Experiences in Plant Physiology - a Laboratory

Manual. Springer - Verlag, New York, Heidelberg, Berlin

Metzner, H. 1982. Pflanzenphysiologische Versuche. Gustav Fischer Verlag,

Stuttgart, New York

Nagy M. - Szabó M. 1980. Növényélettani gyakorlatok. Munkafüzet. JATE Szeged

Növényi fehérjék gélelektroforézises vizsgálata. 1986. OMIKK, Budapest

Ördög V. - Molnár Z. - Péter J. 1995. Növényélettani gyakorlatok. PATE

Mosonmagyaróvár

Pethő M. 1993. Mezőgazdasági növények élettana. Akadémiai Kiadó, Budapest

129

Rubin B. A. 1984. Növényélettani praktikum. Tankönyvkiadó, Budapest

Stegemann, H. - Schnick, D. 1985. Index 1985 of European Potato Varieties.

Mitteilungen aus der Biolog. Bundesanstalt, Heft 227.

Suba J. 1981. Növényélettani gyakorlatok. Tankönyvkiadó, Budapest

Sutcliffe, J. F. 1982. A növények és a víz. Mezőgazdasági Kiadó, Budapest

Szabó L. Gy.(szerk) 1980. A magbiológia alapjai. Akadémiai Kiadó, Budapest

Szalai I. - Frenyó V. 1962. Növényélettani kísérletek. Tankönyvkiadó, Budapest

Szalai I. 1994. A növények élete. JATEPress, Szeged

Szalai J. 1981. Növényélettani gyakorlatok. Kertészeti Egyetem, Budapest

Szilágyi S. - Sz.-né Somogyi E. 1979. Növényélettani gyakorlatok. Tankönyvkiadó,

Budapest

Varga M. 1976. Növekedésszabályzó anyagok gyakorlati alkalmazása a

növénytermesztésben. JATE, Szeged