Upload
phamhuong
View
212
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE CINCIAS MDICAS
ALINE CRISTINA GONALVES
DOSAGEM DE CLORETO E SDIO NA SALIVA PELA TCNICA DO ELETRODO
ON SELETIVO DIRETO UMA POSSIBILIDADE PARA O DIAGNSTICO DA
FIBROSE CSTICA
CAMPINAS
2017
ALINE CRISTINA GONALVES
DOSAGEM DE CLORETO E SDIO NA SALIVA PELA TCNICA DO ELETRODO ON
SELETIVO DIRETO UMA POSSIBILIDADE PARA O DIAGNSTICO DA FIBROSE
CSTICA
Tese apresentada Faculdade de Cincias Mdicas da Universidade
Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a
obteno do ttulo de Doutora em Cincias, na rea de concentrao
Sade da Criana e do Adolescente.
ORIENTADOR: CARLOS EMLIO LEVY
COORIENTADOR: ANTONIO FERNANDO RIBEIRO
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE VERSO
FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA
ALINE CRISTINA GONALVES, ORIENTADA PELO
PROF. DR. CARLOS EMLIO LEVY E COORIENTADA
PELO PROF. DR. ANTONIO FERNANDO RIBEIRO.
CAMPINAS
2017
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO
ALINE CRISTINA GONALVES
ORIENTADOR: CARLOS EMLIO LEVY
COORIENTADOR: ANTONIO FERNANDO RIBEIRO
MEMBROS:
1. PROF. DR.CARLOS EMLIO LEVY
2. PROF. DR. EDSON ANTUNES
3. PROFa. DRa. FERNANDA LOUREIRO ANTUNES ORSI
4. PROFa. DRa. GIESELA FLEISCHER FERRARI
5. PROF. DR. JOS ESPIN NETO
Programa de Ps-Graduao em Sade da criana e do adolescente da Faculdade de
Cincias Mdicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora
encontra-se no processo de vida acadmica do aluno.
Data: DATA DA DEFESA [31/07/2017]
minha famlia e amigos.
AGRADECIMENTOS
Aos meus amados pais Maria Elena e Luiz Carlos, obrigado por terem me ensinado
sobre dignidade, respeito, lealdade, honestidade, perseverana e amor. Agradeo
tambm pela dedicao, compreenso, apoio e incentivo. A vocs minha profunda
gratido, admirao e respeito.
Aos meus amados irmos Lus Eduardo e Lus Guilherme, muito obrigada pelo
apoio, incentivo e compreenso.
Ao meu querido e amado tio Antonio Carlos, obrigada pela confiana, apoio em
todas as minhas escolhas.
Aos colegas e amigos da ps-graduao: Ktia A. Aguiar, Fernando Marson, Tas
Hortncio, Renata Guirau, Higor, Simone Mesquita, Talita, Renan Mauch, Carla
Gomes, Adriana Vinagre e Arthur Kmint pelos momentos de descontrao e pelas
trocas de conhecimento;
minhas amigas irms Mariana Zorrn Mei Hsia Pu e Mayara Hidalgo Magri, muito
obrigada pela amizade, apoio, incentivo e compreenso.
CAPES e FAPESP pelo financiamento deste projeto e concesso de bolsa.
Ao meu orientador Prof. Dr. Carlos Emlio Levy, muito obrigada.
Ao meu coorientador, Prof. Dr. Antonio Fernando Ribeiro pela confiana, apoio,
incentivo, ensinamentos, pacincia e orientaes constantes. Minha gratido e
respeito.
Ao Prof. Dr. Andr Moreno Morcillo, agradeo pela anlise estatstica e pela
pacincia em ensinar.
Ao Prof. Dr. Jos Dirceu Ribeiro muito obrigada pelo incentivo e apoio.
Ao Prof. Dr. Edgard Ferro Collares, agradeo a pacincia e disposio em ensinar.
Profa. Dra. Elizete Ap. Lomazi por ter permitido a realizao da pesquisa no
laboratrio de Gastropedediatria do HC-Unicamp, pelo apoio e amizade.
Dra. Maura F. Goto muito obrigada pela disposio em ensinar, incentivo e
amizade.
Ao Prof. Dr. Gabriel Hessel muito obrigada pelas contribuies.
Dra. Regina M. Holanda Mendona; obrigada pelas contribuies, apoio e
amizade.
Profa. Dra. Ilma Ap. Paschoal, muito obrigada por compartilhar conosco sua ideia
de usar o equipamento de gasometria para quantificar os ons da saliva.
Aos biomdicos do Laboratrio de Gastropediatria do HC-Unicamp Jos da Silva
Nogueira Jnior e Jaqueline Shimizo Mores. Agradeo especialmente ao Jnior pela
pacincia, amizade, disponibilidade em contribuir com coletas de suor, me ensinar e
ajudar na dosagem de elastase.
Profa. Dra. Carmen Bertuzzo, Dra. Luciana Bonadia e Dr. Fernando Augusto de
Lima Marson, muito obrigada pela amizade e por contribuirem com o estudo
gentico dos pacientes com FC.
Profa. Dra Lilia Souza Li, muito obrigada pelo apoio e importantes orientaes na
minha transio do mestrado para o doutorado.
Comisso Julgadora do exame de qualificao e de defesa, Prof. Dr. Edson
Antunes e Profa. Dra. Fernanda Loureiro Orsi, agradeo as contribuies e por
aceitarem nosso convite.
Comisso Julgadora do exame de Defesa da Tese, Prof. Dr. Jos Espin Neto e
Profa. Dra. Giesela Fleischer Ferrari, pelo aceite em compor a banca e pelas
importantes contribuies.
Aos queridos pacientes do ambulatrio de fibrose cstica da pediatria e seus
responsveis, que apesar de uma rotina intensa de exames, consultas e internaes
aceitaram participar desse estudo. MUITO OBRIGADA.
Ao Servio de Odontologia do Hospital de Clnicas da Unicamp, muito obrigada pela
acolhida e colaborao constante.
Eliane Cristina, Marielza e Cristina do Laboratrio de Gasometria da Diviso de
Patologia Clnica HC Unicamp pela disponibilidade e pacincia;
Paulo Henrique de Oliveira e Bruna de Almeida Bianchini da Secretaria do
Departamento de Patologia Clnica da FCM-Unicamp, ao Gilson Alves Duarte,
secretrio da enfermaria de pediatria do HC-Unicamp, Marcia da Secretaria de
Ps-graduao da Sade da Criana e do Adolescente. Obrigada.
Agradeo a todos os funcionrios da FCM e do HC-Unicamp que de alguma forma
contriburam com a realizao desse estudo.
RESUMO
Doenas sistmicas, como a fibrose cstica (FC), influenciar tanto na
quantidade de saliva produzida quanto na qualidade deste fludo, uma vez que
pode afetar os constituintes qumicos e as propriedades fsicas da mesma.
Vrios estudos confirmam o valor diagnstico da saliva. A FC caracteriza-se
por um defeito no transporte inico atravs da membrana celular nas clulas
epiteliais das vias areas, pncreas, glndulas salivares, sudorparas, intestino
e aparelho reprodutor. H evidncias cientficas de que as concentraes de
cloreto e sdio na saliva de pacientes com FC so significativamente maiores
quando comparadas com as concentraes desses ons em indivduos no-FC.
Esse fato nos estimulou a investigar a viabilidade da dosagem de cloreto na
saliva como mtodo diagnstico alternativo ao teste de suor, sendo que o teste
da saliva de baixo custo e fcil acesso ao equipamento no ao sistema pblico
de sade. Objetivo: Avaliar a dosagem do cloreto da saliva, pela tcnica de
eletrodo on seletivo direto como possibilidade de mtodo para diagnstico da
fibrose. Casustica e mtodos: Estudo transversal, prospectivo, com um grupo
de pacientes com fibrose cstica selecionados no CERFC Unicamp e um grupo
controle com indivduos sem evidncias de doena. As concentraes de
cloreto e sdio da saliva foram analisadas pela tcnica de eletrodo on seletivo
direto e os mesmos ons do suor foram dosados respectivamente por
titulometria e por fotometria de chama. Ambos os grupos (FC e Controle) foram
compostos por 125 participantes a partir de 2 meses de idade, independente de
gnero ou etnia. Resultados: As concentraes de cloreto e sdio na saliva
foram estatisticamente maiores nos pacientes com FC quando comparados
com o grupo controle. Com aplicao da curva ROC determinamos o cut-off de
14,5 mmol/L para o cloreto na saliva 1 (Sensibilidade=80,6%; especificidade=
68,1%; valor preditivo positivo=71,6%; preditivo negativo=77,8%). Concluses:
Nossos resultados sugerem uma concordncia nas concentraes de cloreto e
sdio na saliva e no suor, ou seja, ambos fluidos tem comportamento
fisiologicamente semelhante, evidenciando a possibilidade do uso da dosagem
de cloreto e sdio na saliva pela tcnica de eletrodo on seletivo direto como
um teste de triagem e/ ou complementao diagnstica.
Palavras-chave: Saliva. Cloreto. Fibrose cstica-diagnstico.
ABSTRACT
Background: Systemic diseases, such as cystic fibrosis (CF), influence both the
amount of saliva produced and the quality of this fluid, as the chemical constituents
and the physical properties. Several studies confirm the diagnostic value of saliva.
CF is characterized by a defect in ionic transport through the cell membrane in
epithelial cells of the airways, pancreas, salivary glands, sweat glands, intestine and
reproductive system. There is scientific evidence that chloride and sodium
concentrations in the saliva of CF patients are significantly higher when compared to
the concentrations of these ions in non-CF subjects. This fact stimulated us to
investigate the feasibility of chloride dosage in saliva as an alternative diagnostic
method to the sweat test, because the saliva test is low cost and the equipment has
easy access in the public health system. Objective: To evaluate the possibility use of
saliva chloride dosage by the direct selective ion electrode technique as an
alternative diagnostic method for cystic fibrosis. Patients and methods: A cross-
sectional, prospective study with a group of patients with cystic fibrosis selected at
CERFC Unicamp and a control group of individuals with no evidence of disease. The
chloride and sodium concentrations of the saliva were analyzed by the direct
selective ion electrode technique and the same sweat ions were measured
respectively by titration and by flame photometry. Both groups (FC and Control) were
composed of 125 participants since 2 months of age, regardless of gender or
ethnicity. Results: The chloride and sodium concentrations in saliva were statistically
higher in the CF patients when compared to the control group. With the application of
the ROC curve we determined the cut-off of 14.5 mmol / L for chloride in saliva 1
(Sensitivity = 80.6%, specificity = 68.1%, positive predictive value = 71.6%, negative
predictive value = 77.8%). Conclusions: Our results suggest a concordance of
chloride and sodium concentrations in saliva and sweat, that means that both fluids
have a physiologically similar behavior, evidencing the possibility of the use of the
chloride and sodium dosage in the saliva by direct ion selective electrode technique
as a screening and / or diagnostic complementary test.
Keywords: Saliva. Chloride. Diagnosis-cystic fibrosis.
LISTA DE ILUSTRAES
Fluxograma 1. Passo a passo para a confirmao do diagnstico da FC......22
Figura 1. Glndulas salivares maiores.............................................................24
Fluxograma 2. Conduta aps coleta do TIR no Servio de Triagem Neonatal
da Unicamp........................................................................................................30
Figura 2. Salivette..........................................................................................31
Figura 3. Equipamento de gasometria.............................................................32
Figura 4. Estimulao e coleta de suor............................................................34
Figura 5. Acondicionamento e dosagem de EL-1............................................37
Figura 6. Estgios no processo de validao do ensaio diagnstico...............39
Fluxograma 3. Distribuio do pacientes para cada amostra coletada...........41
Box plots1 e 2. Comparao do comportamento fisiolgico dos ons cloreto e
sdio na saliva e suor entre os grupos.............................................................51
Figura 7. Definio dos pontos de corte para o nvel de cloreto da na saliva 1 e
2 , aps Curva Roc............................................................................................52
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Classes das variantes do gene CFTR e seu efeito na protena CFTR.................................................................................................................17
Tabela 2. Manifestaes clnicas da fibrose cstica de acordo com a faixa etria..................................................................................................................19
Quadro 1. Principais componentes orgnicos e inorgnicos da saliva.............25
Tabela 3. Doenas com teste do suor com valores superiores a 60 mEq/L.....28
Tabela 4. Caractersticas clnicas e laboratoriais de pacientes com fibrose
cstica.................................................................................................................42
Tabela 5. Variantes do gene CFTR identificadas no grupo FC.........................43
Tabela 6. Caracterizao dos pacientes do grupo FC de acordo com a classe
das variantes......................................................................................................44
Tabela 7. Caractersticas clnicas e laboratoriais de pacientes com fibrose
cstica com somente doena gastrointestinal, somente com acometimento
pulmonar e os que possuem ambas, doena gastrointestinal e pulmonar........45
Tabela 8. Anlise comparativa da concentrao de cloreto e sdio no suor com
os mesmos ons na saliva, coletada durante 1 minuto (saliva 1) e durante 3
minutos (saliva 2), para o grupo fibrose cstica (GFC) e grupo controle(GC)....46
Tabela 9. Anlise comparativa, pareada por idade das concentraes de
cloreto e sdio no suor com os mesmos ons da saliva 1 e saliva 2, para o
grupo fibrose cstica e grupo controle...............................................................47
Tabela 10. Anlise comparativa da concentrao de cloreto no suor com
cloreto da saliva 1 e saliva 2, para homozigotos e heterozigotos para variante
F508del..............................................................................................................48
Tabela 11. Anlise descritiva das concentraes de cloreto em suor e saliva 1
e 2 de acordo com as classes de variantes.......................................................40
Tabela 12. Anlise comparativa de pacientes com fibrose cstica com
insuficincia pancretica e suficientes pancreticos.........................................50
Tabela 13. Propriedades do teste de forma resumida......................................53
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AMP-cclico adenosina monofosfato cclico
CERFC- Unicamp Centro Especializado de Referncia em Fibrose Cstica da Unicamp
Cl- Cloreto
CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator
CIPED Centro de Investigao em Pediatria
CV Coeficiente de variao
DNA Deoxyribonucleic acid
DRFC Diabetes relacionado a fibrose cstica
EL-1 Elastase fecal -1
ENAc Canal de sdio
FC Fibrose Cstica
FCM Faculdade de Cincias Mdicas
GFC Grupo Fibrose Cstica
GC Grupo controle
HC Hospital de Clnicas
IC Intervalo de confiana
LAFIP Laboratrio de Fisiologia Pulmonar
mEq/ L Mili equivalente por litro
mmol/L Mili mol por litro
Na+ Sdio
PCR Polymerase chain reaction [Reao em cadeia polimerase]
RNAm Ribonucleic Acid [cido ribonucleico (ARN) mensageiro]
Rpm Rotaes por minuto
TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TIR Tripsinognio imunorreativo
TNN Triagem Neonatal
TS Teste do Suor
UNICAMP Universidade Estadual de Campinas
VEF1 Volume expiratrio forado no primeiro segundo
VFC Capacidade vital forada
http://dictionary.cambridge.org/pt/dicionario/ingles-portugues/chainhttp://dictionary.cambridge.org/pt/dicionario/ingles-portugues/reaction
SUMRIO
1. INTRODUO ............................................................................................15
2. OBJETIVO...................................................................................................26
3. CASUSTICA E METODOLOGIA ..................................................................27
3.1. Desenho do estudo ................................................................................ 27
3.2. Populao do estudo .............................................................................. 27
3.3. Mtodos...................................................................................................29
3.3.2. Coleta e anlise das amostras.............................................................29
3.4. Dados clnicos e laboratoriais...................................................................34
3.5. Anlise estatstica.....................................................................................38
4. RESULTADOS............................................................................................41
5. DISCUSSO...............................................................................................54
6. CONCLUSO.............................................................................................60
7. REFERENCIAS............................................................................................61
8. APNDICES................................................................................................73
Apndice I.......................................................................................................73
Apndice II......................................................................................................74
Apndice III.....................................................................................................75
Apndice IV.....................................................................................................77
Apndice VI.....................................................................................................80
15
1. INTRODUO
Fibrose cstica (FC) uma doena gentica autossmica recessiva,
hereditria e multissistmica, que apresenta ampla gama de variantes genticas e
clnica1,2.
Na Europa, desde o sculo XVIII, observou-se que as crianas com suor
salgado morriam precocemente. Em 1905, Landsteiner descreveu o leo meconial
relacionando-o com insuficincia pancretica excrina. Fanconi3 descreveu
pacientes com caractersticas clnicas da doena celaca, porm com insuficincia
pancretica excrina e doena pulmonar associada.
Dorothy Hansine Andersen4 foi a primeira a descrever a FC caracterstica
do pncreas e correlacionar com a doena pulmonar e doena intestinal; tambm foi
ela a primeira a realizar a suplementao de enzima pancretica para o tratamento
de crianas com FC.
Di SantAgnese e seus colaboradores5 foram os primeiros a analisar e
descrever cientificamente as concentraes de cloreto e sdio no suor de indivduos
com e sem FC e observaram que esses ons eram maiores em pacientes com FC,
dessa forma corroborando com a sabedoria popular que, desde a Idade Mdia,
atribua a baixa expectativa de vida a crianas que tinham suor salgado.
O gene da FC, denominado CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane
Regulator), foi localizado, clonado e sequenciado por Riordan et al 6. O CFTR que
est presente nos elementos do complexo de Golgi 7,8, localiza-se no brao longo do
cromossomo 7, e tem como funo codificar um RNAm de 6,5 quilobases que
transcreve uma protena transmembrana reguladora de transporte inico (CFTR),
composta de 1480 aminocidos9, 10
A FC, tambm conhecida como mucovicidose11 uma das doenas
autossmicas letais mais comuns, afetando cerca de 70.000 indivduos na
populao mundial e no Brasil temos 3511 pessoas com FC, sendo que desses, 956
nasceram no estado de So Paulo12,13,14,15.
Estudos sobre o mecanismo dessa doena e suas causas de variao
fenotpica, bem como o desenvolvimento de tratamentos, demonstram que a
16
gentica e fisiopatologia desempenham importante papel na investigao da fibrose
cstica16.
De acordo com Cystic fibrosis mutation database17 mais de 2000
variantes da doena foram encontradas no gene CFTR. Nessa base de dados
constam 322 variantes estudadas, das quais 281 comprovadamente causam FC; 21
causam diferentes consequncias clnicas; 12 no causam FC e 8 possuem
significncia desconhecida. Essas mutaes so distribudas em seis classes (ver
tabela 1) de acordo com a ausncia da protena CFTR e/ou alteraes qualitativas e
quantitativas na protena18, que funciona como um canal de cloreto (Cl-) localizado
na membrana apical das clulas epiteliais, regulando o movimento transepitelial de
gua e ons 6,14,19 .
17
Tabela 1. Classes das variantes do gene CFTR e seu efeito na protena CFTR.
Adaptado de: Culling e Ogle. Genetic Counselling Issues in Cystic Fibrosis. Paediatric
Respiratory Reiews 2010; 11: 7579. CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator. Amaral
MD. Novel personalized therapies for cystic fibrosis: treating the basic defect in all patients. Jornal of
internal medicine 2015; 277: 155-166....
A classe da variante herdada, bem como a heterogeneidade allica,
associada ao de genes modificadores e fatores ambientais pode levar a uma
expresso fenotpica variada, com quadro clnico polimorfo e multissistmico 20,21
(ver Tabela 2).
As manifestaes clnicas da FC so: (i) infeco pulmonar crnica com
excessiva inflamao, levando deteriorao progressiva da funo do pulmo
(95%dos pacientes), (ii) azoospermia (mais de 90% dos homens afetados), (iii)
insuficincia pancretica (80% dos casos), (iv) diabetes mellitus associada doena
pancretica (20% dos adultos), (v) leo meconial em recm-nascidos (17%) e (vi)
doena obstrutiva do trato biliar (15% a 20% dos pacientes) 22, 24. A deteriorao da
Classe da variante Efeito na protena CFTR Exemplo de variantes
I Defeito na sntese proteica
1717-1G->A
G542X
W1282X
II Defeito no trfego at a membrana ou
processamento anormal
F508del
N1303K
A561E
III Defeito na regulao proteica
G551D
R560T
G1349D
IV Reduo na condutncia
R117H
R334W
G85E
V Reduo na sntese A455E
3849+10kb C>T
VI Reduo da estabilidade proteica c.120del23
rF508del
18
funo pulmonar a principal causa de morte em pacientes com FC. Atualmente,
pessoas com FC tm expectativa de vida de aproximadamente 40 anos de idade,
graas a triagem neonatal (TNN), ao reconhecimento das formas leve da doena e a
teraputica agressiva15.
Tambm h m digesto e m absoro de gorduras, protenas e em
menor proporo de hidrato de carbono. As fezes so esteatorricas, volumosas,
plidas e de odor ftido. O tratamento clssico inclui reposio enzimtica,
fisioterapia respiratria, mucolticos e antibioticoterapia agressiva. Uma proporo de
pacientes com graves sintomas pulmonares requer transplante e com menor
frequncia transplante de fgado 22, 25 .
19
Tabela 2. Manifestaes clnicas da fibrose cstica de acordo com a faixa etria
FAIXA ETRIA RGO MANIFESTAES CLNICAS
Recm-nascidos
Pulmonar Atalectasia e hiperinsuflao
Gastrointestinal
leo meconial, peritonite meconial, retardo na eliminao do mecnio, obstruo intestinal, desidratao hiponatrmica
Outros
Distrbios de coagulao por fatores K-dependentes
Ictercia prolongada
Lactentes
Pulmonar Sndrome do lactente chiador, pneumonias de repetio, atalectasia e/ou hiperinsuflao pulmonar
Gastrointestinal Esteatorria, prolapso retal
Nutricional Desnutrio, baixo ganho ponderal
Pr escolares
e
escolares
Pulmonar
Pneumonia de repetio, tosse crnica, sinusopatia crnica, atelecasia ou hiperinsuflao pulmonar, bronquiectasia hemoptise, hipertenso pulmonar, cor pulmonale
Gastrointestinal
Obstruo intestinal, esteatorria, prolapso retal, insuficincia pancretica, hipertenso portal, cirrose heptica
Nutricional Desnutrio, baixo ganho ponderal, hipovitaminose A, D ou E
Outras Baqueteamento digital
Adolescente
e
adultos
Pulmonar
Pneumonias de repetio, tosse crnica, sinusopatia crnica, bronquiectasias, atalectasia, hiperinsuflao pulmonar, hipertenso pulmonar, cor pulmonale
Gastrointestinal
Esteatorria, hipertenso portal, prolapso retal, insuficincia pancretica, pancreatite, cirrose heptica
Nutricional Desnutrio, baixo ganho ponderal, hipovitaminose A, D ou E
Outras Diabetes mellitus, osteopenia, infertilidade
Fonte: Adaptada de Ribeiro JD, Ribeiro MAGO, Ribeiro AF. Controversies in cystic
fibrosis from pediatrician to specialist. J Pediatr 2002; 78 (Supl.2): S171-S18.
Basicamente, a FC caracterizada pelo defeito no transporte inico
atravs da membrana celular nas clulas epiteliais das vias areas, pncreas,
glndulas salivares e sudorparas, intestino e aparelho reprodutor 24, resultando em
secrees mucosas espessas e viscosas, que causam obstruo ao nvel de ductos
e canalculos glandulares 1,26. O grau em que o transporte de ons alterado em um
20
indivduo com fibrose cstica determinado pelo efeito na quantidade e funo CFTR
de cada variante causadora da doena 27.
O mecanismo de produo de saliva tem semelhanas com a produo
de suor 26,28,29. As glndulas salivares so compostas de clulas acinares (serosa,
mucosas e seromucosa), ductais (intercalar, estriados e excretores) e clulas
mioepiteliais (localizado entre as clulas da membrana basal e acinares); sendo sua
estrutura semelhante a das glndulas sudorparas 30.
Tanto nas glndulas salivares como nas sudorparas, a secreo
glandular primria na regio dos cinos tem composio inica muito semelhante ao
fluido intersticial. Quando essa secreo hipertnica passa pelos ductos glandulares,
os ons cloreto e sdio so absorvidos respectivamente pelos canais de cloreto
(CFTR) e canal de sdio (ENaC). Em pessoas com FC, os canais de cloreto
estimulados por monofosfato cclico de adenosina (AMPc) no funcionam, somente
os canais estimulados pelo clcio (Ca++) ionoforo so abertos, causando uma
diminuio na permeabilidade para os ons cloreto, resultando num fluido hipertnico
26, 31, 32, 33.
Determinadas doenas sistmicas, como a FC, podem comprometer o
funcionamento das glndulas salivares, influenciando tanto na quantidade de saliva
produzida quanto na qualidade deste fludo, uma vez que pode afetar os
constituintes qumicos e as propriedades fsicas da mesma34. Baseando-se na
fisiologia28,29 e nos estudos de Ctalan et al.26, Jimenez-Reyes e Sanchez-Aguirrre35
e Gonalves et al.36, observam-se semelhanas do funcionamento das glndulas
salivares com as glndulas sudorparas.
H cerca de 3 a 4 milhes de glndulas sudorparas no corpo humano
que liberam transpirao ou suor. As glndulas sudorparas so divididas em
mercrinas (crinas) e as apcrinas. O suor produzido por essas glndulas
(aproximadamente 600 mL/dia) composto por gua, ons (sendo que o cloreto e o
sdio esto em maior quantidade), aminocidos, uria, cido rico, glicose e cido
lctico. A principal funo das glndulas sudorparas mercinas a termorregulao
atravs da evaporao37.
O teste padro ouro para o diagnstico da FC a determinao dos
eletrlitos no suor (Teste do Suor), sendo esta anlise j utilizada h mais de 50
21
anos. A iontoforese realizada pela anlise inica quantitativa do suor estimulado
pela pilocarpina38,39, sua interpretao deve ser correlacionada com o contexto
clnico, sendo necessria a realizao de no mnimo 2 testes do suor positivos,
preferencialmente com intervalo de semanas entre um teste e outro40.
Concentraes de cloreto no suor 60 mmol/L indicam diagnstico de FC,
concentraes inferiores a 30 mmol/L indicam que o diagnstico de FC improvvel,
no entanto no descarta o diagnstico. Valores intermedirios (30-59 mmol/L) de
cloreto no suor so indicativos de testes adicionais (diferena de potencial nasal,
biopsia retal) ou da anlise gentica para confirmao diagnstica (Fluxograma 1).
Casos de FC atpica podem apresentar difculdade ao diagnstico, devido
a ampla variabilidade clnica e gentica, sendo que essa ltima pode causar
diferentes efeitos na proteina CFTR que tem um importante papel na modulao da
expresso clnica da doena e consequentes concentraes de cloreto no suor com
valores intermedirios.
Alm do teste do suor, recomenda-se a pesquisa de variante gentica,
na presena de um contexto clnico ou histria familiar41,42, todavia, considerando-se
que o custo do sequenciamento gentico alto, a pesquisa gentica fica restrita, em
geral, somente para as mutaes mais frequentes, de forma que nem sempre
possvel identificar as variantes envolvidas17.
22
Fluxograma 1. Passo a passo para a confirmao do diagnstico da FC.
Na FC, alm do aumento da viscoelasticidade da saliva existem eletrlitos
e protenas em diferentes concentraes, quando comparado com a saliva de
ndivduos sem a doena 43, 44. Os eletrlitos em maior concentrao na saliva so
cloreto, sdio, potssio e bicarbonato. Esses eletrlitos se originam do soro, a partir
do qual so transportados para os cinos e ductos salivares 36, 45.
Cataln et al.26, observaram em camundongos homozigotos para a
variante F508del, pouca ou ausncia da proteina CFTR e como consequncia os
nveis de Na+ e Cl na saliva foram significativamente elevados. A disfuno da
protena CFTR, diminui a permeabilidade da membrana celular para o cloreto,
causando dificuldades de transporte inico. Consequentemente, a concentrao de
Cl na membrana apical das clulas epiteliais aumenta 46.
Gonalves et al 36 em estudo com o uso indito do equipamento de
gasometria (tcnica eletrodo on seletivo direto) para dosagem de ons na saliva
mostram que a concentrao de cloreto e sdio da saliva de indivduos com fibrose
cstica maior quando comparado com os ons de indivduos sem FC, sugerindo a
23
possibilidade de um novo mtodo para diagnstico da fibrose cstica. A coleta de
saliva segura, no invasiva e relativamente simples, de baixo custo, no necessita
de punes e pode ser coletada repetidamente 43.
A saliva possui componentes orgnicos e inorgnicos, sendo as
concentraes de potssio e bicarbonato tipicamente mais elevadas na saliva
quando comparado com fluido intersticial 47. A composio do fluido salivar pode
variar de acordo com o mtodo de coleta, diretamente do ducto gandular (partida,
submandibular, sublingual, glndula salivar menor) ou diretamente da cavidade oral
48, assim como a saliva produzida a partir de diferentes glndulas varia ligeiramente
com um ou mais constituintes. preconizado o uso da saliva total para fins de
diagnsticos 30, 49, 50, 51, 52. A coleta de saliva deve ser realizada de forma
padronizada53.
H trs pares de glndulas salivares maiores (Figura 1) onde: as
partidas produzem 25% da saliva total ou mista, as glndulas submandibulares
65% e sublinguais que compem apenas 4% da saliva total50, 51, 54. Alm das
glndulas salivares maiores, existem numerosas glndulas salivares menores (8%
da saliva total) presentes por toda cavidade oral e orofaringe, podendo tambm ser
encontradas na laringe, traquia e nasofaringe26. A saliva possui 2 tipos de secreo
de protenas:
Secreo serosa - contm ptialina, tambm conhecida como amilase.
Secreo mucosa - contm mucinas que tem a funo de lubrificar e
proteger a mucosa oral.
As partidas produzem apenas secreo serosa, enquanto que as
glndulas submandibulares e sublinguais secretam saliva serosa e mucosa, j as
glndulas salivares menores produzem apenas secreo mucosa 54.
Na cavidade oral, a saliva uma mistura de secrees das glndulas
salivares e de substncias provenientes do fluido crevicular (pequena quantidade de
lquido encontrado no sulco gengival, contendo protenas plasmticas que melhoram
a aderncia da ligao epitelial, com propriedades antimicrobianas exercendo a
atividade do anticorpo), secrees brnquicas ou nasais, clulas epiteliais, restos de
alimentos, microrganismos e seus produtos metablicos 48, e leuccitos orais 55, 56.
Tem amplo espectro de protenas, peptdeos, cidos nucleicos, eletrlitos e
hormnios. Embora essa secreo reflita a sade e bem-estar corporal, sua
24
utilizao como fluido diagnstico no bem estabelecida, principalmente devido a
falta de compreenso das biomolculas presentes na saliva e sua relevncia para a
etiologia da doena, combinada com a falta de sistemas de deteco de alta
sensibilidade como meio de diagnstico 52. Contudo, estudos confirmam o valor
diagnstico da saliva 57, 58, 59.
Pesquisas sobre o uso da saliva como fluido diagnstico tem-se
intensificado, dessa forma apontando para um futuro promissor de diagnsticos para
aplicaes personalizadas, incluindo decises clnicas e previses de resultados
ps-tratamento 52, 60.
Figura 1. Glndulas salivares maiores.1- Glndula partida; 2- Glndula
submandibular; 3- Glndula sublingual.
A produo diria de saliva varia de 0,5 a 1 litro. Noventa e nove porcento
de saliva composta por gua e menos de 1% dos componentes salivares so
elementos slidos, principalmente protenas e eletrlitos e o pH salivar varia entre 6
e 7, para facilitar o efeito digestivo da ptialina47.
O sistema nervoso parassimptico dominante e contnuo, com a
estimulao desse sistema temos a produo de uma saliva serosa rica em
enzimas, j um estmulo ao sistema simptico produz uma saliva mucosa com
volume menor, sendo a saliva uma secreo cem porcento controlada pelo sistema
nervoso 61. A composio desse fluido sofre muitas alteraes devido a vrios
fatores fisiolgicos e no fisiolgicos, como: ritmo circadiano, natureza e durao do
1
2
3
25
estmulo, condies da higiene bucal, tipo de dieta alimentar, uso de medicamentos,
etc 62.
Quadro 1. Principais componentes orgnicos e inorgnicos da saliva 63,64.
COMPONENTES ORGNICOS COMPONENTES INORGNICOS
Protenas Cloreto
Imunoglobulinas Bicarbonato
Enzimas Sdio
Glicoprotenas Potssio
Glicose Clcio
Hidrognio
Fluoreto
Tiocianato
Fosfato
Se demonstrada confiabilidade da dosagem do cloreto e sdio da saliva
pelo equipamento de gasometria, teremos um novo mtodo diagnstico da FC, com
vantagens: de a coleta no ser invasiva, de minimizar o estresse do paciente e de
oferecer poucos riscos para o mesmo, alm de ser um mtodo com custo acessvel,
indolor, de rpida coleta e anlise, quando comparado ao teste do suor, atualmente,
padro ouro para diagnstico da fibrose cstica.
26
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Avaliar a dosagem do cloreto da saliva, pela tcnica de eletrodo on
seletivo direto (equipamento de gasometria) como possibilidade de mtodo
diagnstico da fibrose cstica.
2.1.1. OBJETIVOS ESPECFICOS
A- Comparar as concentraes de cloreto e sdio do suor dosadas pelas
tcnicas de fotometria de chama / titulometria com os ons na saliva pela tcnica de
eletrodo on seletivo direto, no grupo de pacientes com fibrose cstica e no grupo de
indivduos sem a doena;
B- Verificar a utilidade diagnstica da dosagem de cloreto na saliva pela
tcnica de eletrodo on seletivo direto;
C- Comparar os nveis de cloreto na saliva e suor de acordo com as
variantes genticas para o gene CFTR do grupo FC;
D- Verificar se a saliva coletada no primeiro minuto menos estvel que a
coletadada nos 3 minutos subsequente;
E- Comparar as concentraes de cloreto na saliva e no suor entre
suficientes e insuficientes pancreticos do GFC.
27
3. CASUSTICA E METODOS
3.1. Desenho do estudo
Transversal prospectivo
3.2. Populao do estudo
Fizeram parte desse estudo:
- Crianas e adolescentes encaminhados ao Laboratrio de
Gastropediatria do HC-Unicamp para realizao do teste do suor;
- Indivduos com diagnstico de FC confirmado em acompanhamento no
Centro Especializado de Referncia em Fibrose Cstica da Unicamp
(CERFCUnicamp);
- Estudantes da FCM-Unicamp, funcionrios do HC e FCM- Unicamp e
parentes desses;
- Todos oriundos da mesma regio geogrfica.
Grupo caso (GFC)
Critrios de incluso: Indivduos com idade superior a dois 02 meses
independente de gnero ou etnia, com dois testes do suor com cloreto acima de 60
mEq/L e/ou com duas 2 variantes do gene CFTR identificadas, que concordaram
em participar do estudo e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
(TCLE).
Critrios de no incluso: Pacientes cujos pais ou responsveis se
recusaram a assinar o TCLE (Apndice I); crianas com menos de 2 meses de
idade.
Critrios de excluso: Pacientes que no conseguiram coletar volume de
suor ( 80mg) e/ou saliva (< 600 microlitros) suficientes.
28
Grupo controle (GC)
- Critrios de incluso: Participantes a partir de 02 meses de idade
independente de gnero ou etnia, sem evidncias de doena aparente, que no
fizessem uso contnuo de qualquer medicamento, que concordaram em participar do
projeto e assinaram o TCLE (Apndice II).
Critrios de no incluso: Pessoas com doenas crnicas ou agudas, ou
com qualquer doena relacionada a alterao de eletrlitos no suor (ver Tabela 3).
Critrios de excluso: Indivduos que no conseguiram coletar volume de
suor (80mg) e/ou saliva (< 600 microlitros) suficientes.
Tabela 3. Doenas com teste do suor com valores superiores a 60 mEq/L65.
Reversvel Irreversvel
Insuficincia adrenal Displasia ectodrmica
Anorexia nervosa Sindrome de Klinefelter
Dermatite atpica Disfuno autonmica
Doena celaca Colestase familiar
Hipoparatiroidismo familial
Disfuno autonmica
Hipotiroidismo Sndrome de Mauriac
Desnutrio Hipogamaglobulinemia
Pseudohipoaldosterismo Mucopolissaridose tipo I
Doena de armazenamento de glicognio tipo
I (Doena de Von Gierke)
3.2.1.Tamanho da amostra
O clculo do tamanho da amostra foi baseado na correlao de Sperman.
Dessa maneira, admitindo que o coeficiente de correlao, no mnimo 0,30; =0,05
e =0,10 e poder da amostra de 90% 66, foram necessrios 226 indivduos [grupo
controle (n=113) e grupo caso (n=113)].
29
3.2.3. Aspectos ticos
O projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comit de tica em Pesquisa
(CEP) da Faculdade de Cincias Mdicas (FCM) da UNICAMP, registrado sob o
nmero 157/2010. Foram respeitadas as condies ticas pertinentes ao protocolo e
seguidos rigorosamente os princpios enunciados na Declarao de Helsink II de
20/08/1947 e da Resoluo 196/96 do Comit Nacional de tica em Pesquisa
(CONEP).
Os sujeitos foram includos somente aps leitura e assinatura do Termo
de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE Apndice I e II) por um dos pais ou
responsvel legal, ou pelo prprio paciente, mantendo-se o anonimato dos mesmos
bem como dos dados coletados.
3.3. Mtodos
3.3.1. Local de coleta do suor e saliva
As amostras de suor foram coletadas na rotina do Laboratrio de
Gastropediatria do HC-UNICAMP por dois biomdicos habilitados e com tempo de
experincia superior a trs anos e a saliva coletada pela pesquisadora responsvel
pelo projeto, no mesmo local da coleta do suor.
3.3.2. Coleta e anlise das amostras
De acordo com o Programa de triagem neonatal para fibrose cstica do
Estado de So Paulo69 todo nascido vivo com primeira coleta do teste do pezinho
(amostra de sangue total seco em papel filtro) realizada idealmente entre o 3 e o 7
dia de vida que apresente TIR maior ou igual a 80ng/ml convocado para uma
segunda coleta entre o 16 e o 30 dia de vida. Quando TIR maior ou igual a 80ng/ml
nessa segunda amostra a criana convocada para realizar o teste do suor.
Anteriormente, desde a implantao da triagem neonatal em 2010, crianas com
valores de TIR maior ou igual a 70 ng/ml 68 eram convocadas, sendo que o ponto de
corte foi modificado em 03/08/2015.
30
Fluxograma 2. Conduta aps coleta do TIR no Servio de Triagem Neonatal da
Unicamp. IRT: Tripsinognio imunorreativo; CERFC: centro Especializado de
referencia em Fibrose cstica. Fonte: Goto, MF. Triagem Neonatal para Fibrose Cstica
Unicamp.
A respeito da coleta de saliva, foram coletadas duas amostras, sendo a
saliva 1 coletada durante 1 minuto e a saliva 2 coletada nos trs minutos
subsequentes a primeira coleta. Para crianas com menos de 2 anos de idade foi
coletada apenas a saliva 2 e a amostra de suor, para participantes a partir de 02
anos de idade, duas amostras de saliva (saliva 1 e saliva 2) foram coletas no
mesmo momento que a amostra de suor.
3.3.2.1. Padronizao da coleta e anlise das concentraes de cloreto e
sdio nasaliva
Foram coletadas duas amostras de saliva sendo a saliva 1 coletada
durante 1 minuto e a saliva 2 coletada nos trs minutos imediatamente
subsequentes primeira amostra. Para crianas com menos de 2 anos de idade foi
coletada apenas a saliva 2, ou seja, uma amostra nica coletada em trs minutos.
Antes de iniciar a coleta das amostras do estudo foi realizada a anlise de
uma mistura de saliva (10 ml) de vrios voluntrios para o teste de repetitividade e
de reprodutitbilidade. Para o teste de repetitividade: 400 microlitros de saliva foram
31
dispensados em cada um dos 17 tubetes graduados, os quais foram enumerados e
dosados no mesmo dia por duas bilogas distintas do Laboratrio de Gasometria do
HC-Unicamp.
Para o teste de reprodutibilidade: 400 microlitros de saliva foram
colocados em cada um dos 17 tubetes graduados, os quais foram enumerados e
dosados em dias e horrios diferentes pelas duas bilogas do Laboratrio de
Gasometria do HC-Unicamp para dosagem de cloreto e de sdio na saliva pela
tcnica do eletrodo on seletivo direto.
importante enfatizar que as amostras foram dosadas pelas bilogas de
forma cega, sem conhecimento de que se tratasse da mesma amostra. Com o
objetivo de verificar a confiabilidade da dosagem de cloreto e sdio da saliva
utilizando o equipamento de gasometria (tcnica eletrodo on seletivo direto), foi
aplicado o teste de repetitividade que consiste em repetir a dosagem de uma mesma
amostra no mesmo dia e laboratrio, para ento calcular o coeficiente de variao.
Para a coleta de saliva foi previamente solicitado aos participantes que
uma hora antes da coleta no escovassem os dentes, no fizessem uso de
enxaguatrio bucal e jejum durante o mesmo perodo.
Em ambos os grupos, a coleta de saliva foi realizada com o Salivette
(Sarstedt-Germany - http://www.sarstedt.com) (Figura 2.). Para indivduos a partir de
02 anos de idade, aps a retirada da tampa do tubete do tipo eppendorf, o rolete de
algodo foi inserido na boca do paciente. A saliva produzida no primeiro minuto foi
coletada em tubete. Em seguida o indivduo permaneceu com outro rolete de
algodo na boca durante trs minutos. Aps esse tempo, o rolete de algodo foi
colocado em novo tubete e tampado.
Figura 2. Salivette. Fonte:http://www.sarstedt.com
http://www.sarstedt.com/http://www.sarstedt.com/
32
Aps a coleta da amostra, o Salivette foi identificado pelo nmero de
identificao da ficha clnica (apndice III) do paciente. Os Salivettes foram mantidos
em refrigerao a 3C por um perdo mximo de 05 dias, antes da centrifugao.
Aps a centrifugao por 15 minutos em 1500 rotaes por minuto (rpm), as
amostras foram quantificadas em volume e uma amostra de 400 microlitros foi
acondicionado num tubete graduado estril e identificado. Amostras com menos de
600 microlitros foram desprezadas.
O equipamento ABL (modelo 835, Radiometer, Dinamarca) (Figura 2.)
analisa lactato, pH, glicose, eletrlitos e gazes do sangue, ar expirado, plasma e
soro pela tcnica eletrodo on seletivo direto.
Figura 3. Equipamento de gasometria. (A).Viso frontal interna e (B). Seo de medio. Fonte: Manual doUtilizador do ABL835.
Para a dosagem de cloreto e sdio da saliva pela tcnica do eletrodo on
seletivo direto fizemos as seguintes etapas: No display do equipamento de
gasometria (ABL, modelo 835, Radiometer, Dinamarca) selecionamos outros
fluidos, correo para outros fluidos, microamostras (35 a 400 microlitros), modo
capilar, os parmetros a serem avaliados e pressionamos a tecla ENTER.
3.3.2.2. Teste do Suor padro ouro para diagnstic da FC
Realizado no Laboratrio de Gastropediatria do HC da UNICAMP, o Teste
do Suor (TS) feito pelo mtodo clssico de Gibson e Cooke38, ou seja, pela anlise
A
[
A
B
[
A
33
inica quantitativa do suor (iontoforese) por meio da estimulao da pele pela
pilocarpina (Figura 3).
Aps a limpeza da pele com gaze e gua deionizada, a regio foi seca
com gaze. Em seguida, dois eletrodos de cobre (2,5 x 2,5 cm) so colocados sobre a
pele usando gaze embebida com 0,8% de soluo de nitrato de pilocarpina (eletrodo
positivo) e outra gaze com cido sulfrico 0,002% (eletrodo negativo). Aplicou-se
uma corrente de 2,5 miliampers durante 10 minutos. Depois da iontoforese, os
eletrodos so removidos e a pele limpa novamente com gua destilada e seca com
gaze. Ento, coloca-se o papel de filtro (WhatmanTM), previamente pesado (em
balana de preciso) sobre a rea estimulada com pilocarpina, cobre-se com um
plstico e veda-se com fita adesiva. Aps 30 minutos, o papel de filtro com o suor
coletado foi removido, retornado para pesa filtro e foi novamente pesado.
Considerou-se o peso mnimo da amostra de suor de 80 mg para a realizao das
dosagens de cloreto e de sdio.
O suor eludo do papel de filtro com 10 ml de gua destilada. A
concentrao de cloreto aferida pela tcnica de titulometria e a de sdio pela
fotometria de chama.
Formula para calcular dosagem de cloreto no suor:
O resultado positivo quando a concentrao de cloreto maior do que
60 mmol/L. Quando o valor menor que 30 mmol/L considerado improvvel o
diagnstico de FC. Os valores indeterminados entre 30 60 mmol/L so
considerados indicativos para que o teste seja repetido41, 70.
B
Cl- (mEq/L)= quantidade de nitrato de prata titulado X 100 / peso suor (g)
B
34
Figura 4. Estimulao e coleta de suor. (A) Iontoforese com pilocarpina e
(B) colocao do papel filtro para coleta do suor.
3.4. Dados Clnicos e Laboratoriais
Todos os participantes desse estudo foram submetidos ao exame
antropomtrico e teste do suor.
Os indivduos do GFC foram classificados de acordo com os seguintes
parmetros clnicos e laboratoriais:
Doena gastrointestinal - usamos exame de esteatcrito, endoscopia,
ultrasson de abdmen total, antecedente de leo meconial ou de sndrome
de obstruo do intestino distal, reposio enzimtica e idade de incio da
mesma, uso de cido ursodesoxiclico e/ou inibidores de bomba de
prtons.Os dados foram coletados de pronturios.
Funo pancretica excrina dosamos a elastase fecal-1
Doena pulmonar consultamos no pronturio a porcentagem predita
de VEF1 e VFC da espirometria (a partir de 6 anos de idade), tomografia
de trax (a partir de 6 anos de idade), radiografia de trax,
ecocardiograma (hipertenso pulmonar), cultura de escarro e/ou secreo
A
B
35
de orofaringe, sintomas clnicos (tosse, sibilos, estertores), sinusopatias e
plipos nasais.
Classes das variantes do gene CFTR variantes do gene CFTR
identificadas foram consultadas no pronturio e banco de dados do
Laboratrio de Gentica da FCM, caso o paciente no tivesse realizado o
estudo gentico, o mesmo foi solicitado.
Diabetes Relacionada a FC informao de TTOG e de uso de
insulina obtidos por consulta ao pronturio
Idade ao diagnstico e/ou primeiras manifestaes clnicas.
Os dados coletados foram anotados numa ficha clnica (Apndice III) e
posteriormente transcritos na forma de arquivo em banco de dados em Excel.
3.4.1. Exame Antropomtrico
Todos os participantes desse estudo foram submetidos ao exame
antropomtrico.
A aferio dos dados antropomtricos (peso e estatura) foi realizada no
Laboratrio de Gastropediatria pela pesquisadora responsvel.
Foram obtidas as medidas de peso e altura segundo as recomendaes
de Lohman et al 67.
Estudo gentico
A presena de mutaes do gene CFTR foi determinada no Laboratrio
de Gentica Molecular da FCM-Unicamp, de acordo com a rotina por
sequenciamento ou multiplex ligation-dependent probe amplification. Foi usado, o
mtodo do fenol/clorotofrmio para a extrao do DNA, e, em todas as anlises
genticas, a concentrao do DNA foi de 50 ng/mL, determinada por um
espectrofotmetro (NanoVueT; GE Healthcare Biosciences, Pittsburgh, PA, EUA). A
36
presena da mutao F508del e de mutaes frequentes na populao brasileira foi
determinada por PCR (reao em cadeia polimerase) 71, 72.
Avaliao da funo pancretica excrina e doena gastrointestinal
na Fibrose cstica
Elastase fecal - 1
A funo pancretica excrina foi avaliada no Laboratrio de
Gastropediatria do HC-Unicamp pela pesquisadora responsvel, sob superviso do
biomdico do laboratrio. A dosagem de elastase fecal-1(EL-1) foi realizada pelo
mtodo imunoenzimtico (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ELISA) ScheBo
Pancreatic Elastase 1 Stool Test, como preconiza o fabricante (Figura 5.).
O perodo de armazenamento das amostras foi por um perodo mximo
de 6 meses a uma temperatura mdia de -22C. Esse exame usa dois anticorpos
monoclonais contra elastase humana no reage contra elastase suna, presente nas
enzimas pancreticas humana, tem uma correlao significativa com a elastase
duodenal e concentraes de amilase, tripsina e bicarbonato, no sofrendo
influncia da terapia de reposio enzimtica, dessa forma no necessria a
interrupo da reposio enzimtica para realizar esse exame. A dosagem da EL-1
possui sensibilidade de 96% e especificidade de 100%. Sua desvantagem o alto
custo 13, 73, 74.
A identificao precoce e precisa da insuficincia pancretica (PI) melhora
a eficcia da terapia de substituio de enzimas pancreticas e do estado nutricional
75.
EL-1 uma enzima excretada pelo pncreas e no degradada no trato
gastrointestinal 76. A dosagem dessa enzima no confivel durante as primeiras 2
semanas aps o nascimento, porque nesse perodo os nveis de EL-1 so baixos,
tanto em crianas prematuras como em crianas a termo, por esse fato no
indicado para a triagem neonatal 77, 78, 79.
37
So considerados com insuficincia pancretica excrina, pacientes com
valores de EL-1 abaixo de 200 g/g 73, 77, 80, 81, 82.
Figura 5. Acondicionamento e dosagem de EL-1. (A) Acondicionamento e
(B) pesagem das amostras de fezes, (C) preparo para dosagem, (D, E, F) dosagem
de EL-1.
Esteatcrito
Esse um mtodo semi-quantitativo simples para avaliar a absoro de
gordura. Phuapradit et al 83 props este mtodo para medir a gordura fecal em
recm-nascidos. Foi realizado no Laboratrio de Gastropediatria do HC- Unicamp
pelos biomdicos do setor, de acordo com a rotina do servio.
Os pacientes que trouxeram amostras de fezes para dosagem de EL-1,
da mesma amostra foi reservada uma alquota para a dosagem do esteatcrito.
Balano de gordura (Dosagem da gordura fecal Van de Kemer)
O Balano de gordura fecal foi realizado no Laboratrio de
Gastroenterologia Gastrocentro/Unicamp, conforme a rotina do servio.
A quantificao de gordura nas fezes de 72 horas, pelo mtodo de Van de
Kramer, um dos testes mais utilizados para o diagnstico de m absoro de
gordura. Em crianas a excreo fecal de gordura superior a 3,5 g considerada
esteatorria. Quando se utiliza este mtodo, o paciente deve receber uma
A
D E
B
C
38
quantidade estvel de gordura durante a coleta de fezes, a qual deve ser recolhida e
armazenada em sua totalidade.
Doena pulmonar na Fibrose cstica
Para avaliar a presena de doena pulmonar foram considerados os
seguintes parmetros: cultura de secreo brnquica, tomografia, presena de
sinusopatia, presena de plipos nasais, uso de medicamentos para o trato
respiratrio (i.e. antibiticos, corticoides, alfa dornase).
Para crianas acima de 6 anos foi avaliada a espirometria e considerados
os parmetros volume expiratrio forado no primeiro segundo (VEF1) e capacidade
vital forada (VFC).
A espirometria considerada foi a realizada no ltimo ano pelo Laboratrio
de Fisiologia Pulmonar (LAFIP) do Centro de Investigaes Peditricas (CIPED) da
UNICAMP, sob as normas da American Thoracic Society and European Respiratory
Society (ATS-ERS), sendo o VEF1 avaliado em porcentagem do valor predito
(Rodrigues et al., 2002), (onde) e classificado em: Normal (80%), leve (60-79%),
moderado (41 a 59%) e grave ( 40%).
3.5. Anlise estatstica
Os dados foram processados com Software Statistical Package for Social
Sciences (SPSS)84for Windows verso 16. O nvel de significncia do estudo de
5% foi submetido anlise descritiva para obteno das frequncias absoluta e
correlao das variveis analisadas. As comparaes das mdias das variveis
entre o grupo caso e o controle foram realizadas pelo teste de Mann-Whitney e o
teste de Wilcoxon foi usado para avaliao e comparao de duas amostras
pareadas.
A dosagem de ons da saliva pelo equipamento de gasometria no
validada, dessa forma fizemos os testes de reprodutividade e repetitividade das
amostras.
Aps aplicao da curva ROC foi calculada a sensibilidade diagnstica,
que segundo o National Committee for Clinical Laboratory Standard 85, a proporo
39
das amostras conhecidas de doentes com resultado positivo pela tcnica proposta e
a especificidade diagnstica, que a proporo das amostras conhecidas de no
doentes com resultado negativo num ensaio.
A acurcia de um teste a proporo de acertos, ou seja, o total de
verdadeiramente positivos e os verdadeiramente negativos em relao amostra
estudada e reflete a sua sensibilidade e especificidade, respectivamente 86. Alm da
acurcia calculamos o valor preditivo positivo o valor preditivo negativo.
A validao da dosagem de cloreto na saliva para diagnstico da FC foi
realizada seguindo os estgios recomendados86,87, 88 (Figura 6).
Figura 6. Estgios no processo de validao do ensaio diagnstico86, 87.
Estgio 1- Viabilidade; Estgio 2 - desenvolvimento e padronizao; Estgio 3- caracterizao da
performance do ensaio; Estgio 4- monitoramento do desempenho do teste pela validade; Estgio 5-
monitoramento da extenso dos critrios de validao.
De acordo com Hulley e Cummings66 e WHO89 para determinar a validade
de um teste diagnstico deve-se: certificar-se da necessidade do teste (vantagens
do novo teste em relao ao existente; benefcios para os pacientes, com a
introduo do novo teste; custos do teste proposto em nvel individual e em sade
pblica); estabelecer o critrio de amostragem (definir a populao de referncia e a
40
populao de estudo, calcular o tamanho da amostra (estipular o nmero mnimo e
suficiente de participantes para se estimar a sensibilidade e especificidade do teste
com intervalo de confiana (IC) de 95%), esclarecer as questes ticas (riscos da
aplicao do teste e benefcio da deteco de indivduos positivos, ateno mdica
aos indivduos positivos, confidencialidade dos resultados), esclarecer a fonte de
seleo dos participantes, (informar sobre a incluso de casos graves, moderados e
leves); descrever o teste proposto e o padro ouro; descrever os procedimentos para
a aplicao do novo teste e do padro ouro e analisar os dados (apresentar os
resultados em termos de sensibilidade, especificidade e valores preditivos com
respectivos IC95%).
Como nossos dados no possuem distribuio normal, aplicamos testes
estatsticos no-paramtricos, sendo recomendado que os dados incluam: a mdia e
desvio padro ou curva ROC para determinao do ponto de corte; a tabela 2x2
para estimativas de sensibilidade e especificidade. Medidas de disperso
comumente utilizadas em avaliao de testes diagnsticos so varincia, desvio-
padro e coeficiente de variao (CV). Essas medidas so concordantemente
recomendadas na avaliao da impreciso do teste, sendo o desvio padro mais
usado que a varincia. Em uma comparao de dois grupos de dados, o grupo com
menor desvio-padro tem as observaes mais homogneas; o grupo com maior
desvio padro exibe maior variabilidade. Como o desvio-padro tem unidade de
medida, no tem sentido comparar desvios-padro para duas quantidades no
relacionadas. A variabilidade entre dois ou mais conjuntos de dados que
representam quantidades variadas com diferentes unidades de medida, pode ser
comparada utilizando o coeficiente de variao90.
Comparamos diferentes fluidos (suor e saliva) dosados por diferentes
tcnicas (titulometria e fotometria de chama, versus eletrodo on seletivo direto) e
com isso obtivemos grandezas diferentes, no sendo possvel aplicar o Mtodo de
Bland e Altman. De acordo com Bland e Altman91 e Altman e Bland92, o coeficiente
de correlao uma medida de associao no sendo apropriada para avaliar
concordncia entre 2 mtodos.
41
4. RESULTADOS
Os grupos foram pareados por idade, sendo que a idade mdia em anos
foi de 10,28, com mediana de 9, desvio padro de 10,14, sendo a idade mnima
0,16 e a mxima de 45, o range foi de 44,92.
O GFC foi composto por 67 pacientes do gnero feminino (mdia de
idade=11,2 anos) e 58 do masculino (mdia de idade=9,2 anos). A idade (anos) ao
diagnstico dos pacientes com FC foi: mdia=4,35; desvio padro=7,47; range=38).
Do GC fizeram parte 67 (pessoas) indivduos do gnero feminino (mdia
de idade=10,9 anos) e 58 do mascullnino (mdia de idade= 9,5 anos). A
caracterizao (mais) detalhada do grupo de participantes com diagnstico de
fibrose cstica (GFC) pode ser observada nas tabelas 4 e 5, e o nmero de amostras
coletadas de suor, e saliva 1 e 2, bem como os integrantes de cada grupo consta no
fluxograma 3.
Fluxograma 3. Distribuio do pacientes para cada amostra coletada.
42
Tabela 4. Caractersticas clnicas e laboratoriais de pacientes com fibrose cstica
(n=125 pronturios vistos).
*Pacientes acima de 06 anos de idade; **Pacientes com 03 ou mais culturas de escarro ou
secreo de orofaringe consecutivas, positivas para microrganismos patognicos para indivduos
com fibrose cstica93
; F: feminino; M: masculino; ***08 pacientes no dosaram a elastase
pancretica
43
Tabela 5. Variantes do gene CFTR identificadas no grupo FC.
NI: no identificado
No GFC (n=125), 100 (F=57 e M=43) tem doena pulmonar, sendo 56
heterozigotos para F508del e 26 homozigotos para a F508del, 19 pacientes tiveram
leo meconial e 64 pacientes so insuficientes pancreticos, sendo que 8 no tem
dosagem de EL-1.
Dezesseis pacientes com FC (F=8, M=8; F508del / no identificada=6,
F508del / F508del=6), apresentam apenas doena gastrointestinal. Os que
44
apresentam somente a doena pulmonar so 14 (F=11, M=3; F508del / outras de
Classe 3,4,5= 3; F508del / no identificada= 6, Classe I / Classe II=1,Classe I /
Classe IV= 2, Classe II / Classe IV= 2) (Tabela 7).
Oitenta e cinco dos 125 pacientes com FC apresentam doena pulmonar
e gastrointestinal, sendo 45 do gnero feminino e 40 do gnero masculino. A
mutao mais frequente foi a F508del em heterozigose (F508del / no
identificada=27 e F508del/ outras variantes=14).
Tabela 6. Caracterizao dos pacientes do grupo FC de acordo com a classe das
variantes.
Na tabela 7, observamos que a mdia da concentrao de cloreto no
suor, Saliva 1 e Saliva 2 foi maior no subgrupo de pacientes com doena
gastrointestinal, assim como no de doena gastrointestinal + doena pulmonar,
quando comparada ao subgrupo que tem apenas doena pulmonar.
45
Tabela 7. Caractersticas clnicas e laboratoriais de pacientes com fibrose cstica com
somente doena gastrointestinal (n=16), somente com acometimento pulmonar (n=14) e os
que possuem ambas, doena gastrointestinal e pulmonar (n=85).
PARMETROS Subgrupos Mdia Mediana DP Mnimo Mximo
Idade Doena Gastrointestinal 4,32 1,5 6,03 0,16 41
(anos) Doena Pulmonar 19,23 16,5 14,54 0,25 45
D. Gastro +D. Pulmonar 10,03 10 9,27 0,16 41
Idade Diagnstico Doena Gastrointestinal 1,87 0,29 3,30 0,16 41
(anos) Doena Pulmonar 12,98 7,5 12,69 0,16 38
D. Gastro +D. Pulmonar 3,30 0,75 6,02 0,16 31
Cl- Suor Doena Gastrointestinal 124,48 121,78 31,08 82,78 182,23
(mEq/L) Doena Pulmonar 107,44 119,21 32,92 37,5 147,45
D. Gastro +D. Pulmonar 124,25 125,8 27,17 31,12 205,53
Cl- Saliva 1 Doena Gastrointestinal 29 22 16,67 6 18
(mmol/L) Doena Pulmonar 16,8 16 5,95 8 28
D. Gastro +D. Pulmonar 26,87 23 14,48 6 77
Cl- Saliva 2 Doena Gastrointestinal 23,06 21,5 11,59 51 58
(mmol/L) Doena Pulmonar 15,81 17 6,44 8 25
D. Gastro +D. Pulmonar 25,25 21 16,77 6 88
Para o teste de repetitividade e reprodutibilidade da concentrao de
cloreto na saliva o coeficiente de variao foi 3,2% e 6,01%, respectivamente. Para o
on sdio os coeficientes de variao de repetitividade e reprodutibilidade foram 0%.
A mdia da quantidade de saliva coletada foi: saliva 1= 83 l no grupo FC
e 89 l no grupo controle, com p valor de 0,089. Na saliva 2 houve diferena
estatisticamente significante entre os grupos (GFC=1 ml GC= 1,08 ml), o p= 0,0045.
Com relao ao gnero, no houve diferena estatstica significante para as
concentraes de cloreto (suor: p= 0,480; saliva 1 p=0,612; saliva 2 p= 0,539).
Numa anlise comparativa das concentraes de cloreto no suor com as
concentraes do mesmo on da saliva dosado pela tcnica do eletrodo on seletivo
direto, vimos que o comportamento fisiolgico dos ons cloreto e sdio na saliva e
suor dos grupos (FC e Controle) semelhante (Tabela 7,8 e Box plots 1 e 2),
embora a saliva seja menos concentrada que o suor (Tabela 8, 9 e 10).
46
Tabela 8. Anlise comparativa da concentrao de cloreto e sdio no suor com os
mesmos ons da saliva, coletada durante 1 minuto (saliva 1) e durante 3 minutos (saliva
2), para o grupo fibrose cstica (GFC) e grupo controle(GC).
*Probabilidade do Teste de Wilcoxon, comparando as concentraes de cloreto e sdio (Fibrose Cstica X Caso).
*
47
Tabela 9. Anlise comparativa, pareada por idade das concentraes de cloreto e sdio no
suor com os mesmos ons da saliva 1 e saliva 2, para o grupo fibrose cstica (GFC) e grupo
controle(GC).
*Probabilidade do teste de Wilcoxon, comparando as concentraes de cloreto e sdio (Fibrose Cstica X
Caso).
48
Tabela 10. Anlise comparativa da concentrao de cloreto no suor com cloreto da
saliva 1 e saliva 2, para homozigotos e heterozigotos para variante F508del.
* Teste de Mann-Whitney:Homozigotos versus Heterozigotos
Na Tabela 10 notamos que embora sem diferena estatstica significante
a concentrao de cloreto tanto no suor como na saliva 1 maior para os
homozigotos [mdia de idade= 9,58 anos (mn.=0,16; mx.=41)] quando comparada
com a mesma concentrao de heterozigotos [mdia de idade= 10,11 anos
(mn.=0,16; mx.=45)], os quais demostraram ter valores de cloreto maior na saliva
2, tambm no estatisticamente significante.
A concentrao de cloreto na saliva 2 de pacientes menores de 3 anos de
idade, quando comparamos homozigotos (n=9) e heterozigotos (n=21) para a
variante F508del, vimos que: para a saliva 2 p=0,667 e para o suor p=0,154.
Assim como no suor, na saliva 1 a mediana e o valor mnimo foram
menores no subgrupo com 1 variante de classe II e a outra no identificada (Tabela
11).
49
Tabela 11. Anlise descritiva das concentraes de cloreto em suor e saliva 1 e 2 de
acordo com as classes de variantes.
* 0: variante no identificada
Foram dosadas 117 amostras de EL-1, sendo que dessas 03 pacientes
foram excludos da nossa casustica (02 pacientes no compareceram para a coleta
da amostra de saliva e suor, e 01 a quantidade de suor coletada foi inferior a 80mg
nas 02 tentativas). Nos insuficientes pancreticos (n=33) a concentrao de cloreto
no suor foi maior (p
50
Tabela 12. Anlise comparativa de pacientes com fibrose cstica com insuficincia pancretica
(n=78) e suficientes pancreticos (n=33).
*Teste de Mann-Whitney: Suficientes pancreticos versus Insuficientes pancreticos [Idade: p=0,044; Idade ao
diagnstico: p=0,003; Estatura: p=0,190; Peso: p=0,069; Suor cloreto: p
51
CFControl
250
200
150
100
50
0
168
75
107
73
68
60
112
201
56
73
SALIVA 2 CHLORIDE (GASOMETRICANALYSIS) [mmol/L]
SALIVA 1 CHLORIDE(GASOMETRIC ANALYSIS) [mmol/L]
SWEAT CHLORIDE (mEq/L)
CFControl
200
150
100
50
0
SALIVA 2 SODIUM (GASOMETRICANALYSIS) [mmol/L]
SALIVA 1 SODIUM (GASOMETRICANALYSIS) [mmol/L]
SWEAT SODIUM (mEq/L)
Box plots1 e 2. Comparao do comportamento fisiolgico dos ons cloreto e sdio
na saliva e suor entre os grupos.
52
Cloreto Saliva 1
Cloreto Saliva 2
Figura 7. Definio dos pontos de corte para o nvel de cloreto da na saliva 1 e 2 , aps
Curva Roc.
Para as amostras de saliva 1 [GFC(n=79) e GC (n=82)] os pacientes com
diagnstico de FC que foram identificados tambm pela saliva foram 67 pacientes
(verdadeiro positivo foi 84%) (Tabela 8) e dos GC 53 pessoas sem FC foram
detectadas pela saliva (verdadeiro negativo= 64,63%) (Tabela 13). Sendo assim o
Sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo do cloreto na saliva1, usando ponto de corte 14,5 mmol / L
Estimativa IC95%
Sensibilidade 80,6 % 70,2 a 88,5
Especificidade 68,1 % 56,7 a 78,0
Valor Preditivo Positivo 71,6 % 61,1 a 80,6
Valor Preditivo Negativo 77,8 % 66,3 a 86,8
Sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo do cloreto na saliva2, usando ponto de corte 13,5 mmol / L.
Estimativa IC95%
Sensibilidade 78,9 % 70,8 85,7
Especificidade 60,5 % 51,3 69,2
Valor Preditivo Positivo 66,7 % 58,4 74,2
Valor Preditivo Negativo 74,2 % 64,6 82,3
53
grau de concordncia do teste da saliva com o padro ouro foi de 84,8% e a
acurcia do teste da saliva 1 foi de 74,5%.
Tabela 13. Propriedades do teste da saliva 1 de forma resumida.
54
5. DISCUSSO
Gonalves e colaboradores36 usando a tcnica de eletrodo on seletivo
direto (ABL Radiometer) observaram que os nveis inicos de cloreto e sdio na
saliva de pacientes com fibrose cstica so significativamente maiores quando
comparado aos mesmos ons salivares de indivduos saudveis, resultado esses
concordantes com pesquisas anteriores35, 94, 95, 96. Isso nos permitiu aventar a
hiptese de que a dosagem de cloreto na saliva pelo equipamento de gasometria
poderia ser um mtodo tambm til para triagem e/ou diagnstico da fibrose cstica.
A dosagem quantitativa de eletrlitos no suor, obtida pelo mtodo da
iontoforese com pilocarpina, descrito originalmente por Gibson e Cooke38 um
mtodo aceito para o diagnstico de FC97. No entanto, esse mtodo maior tempo,
cuidados para prevenir a evaporao da amostra, balana de preciso e habilidade
para dosar a composio eletroltica de amostras diludas35. J para a anlise da
concentrao de cloreto na saliva precisamos apenas do Salivete (Sardest-
Germany - http://www.sarstedt.com), centrifuga e equipamento de gasometria.
importante destacar que a coleta de saliva segura, no invasiva e relativamente
simples, de baixo custo, no necessita de punes e pode ser coletada
repetidamente sem desconforto para o paciente43, 98.
Entre as limitaes do teste do suor tambm h a dificuldade obter o
volume de suor suficiente, em crianas com menos de 03 meses de idade99. Alm
da idade outros fatores influenciam a obteno do volume adequado do suor:
gnero, peso, etnia, hidratao e o sistema de coleta usado100.
A anlise do cloreto no suor deve ser realizada no mesmo dia da coleta,
pois embora o suor seja coletado com papel filtro o qual pesado novamente aps a
coleta e armazenado em recipiente tampado hermeticamente, a amostra permanece
estvel por at 72 horas a 4 C 99. O tempo de armazenamento do suor coletado
pelo sistema Macroduct ainda no foi estabelecido22. Com o teste de
reprodutibilidade, observamos que as amostras de saliva podem ser armazenadas
por uma semana, sem alteraes nas concentraes de cloreto e sdio, quando
mantidas a uma temperatura de 3 C.
55
Baseando-se na fisiologia28, 29 e nos estudos 26, 36, notamos semelhanas
do funcionamento das glndulas salivares com as glndulas sudorparas.
Massie e seus colaboradores101 fizeram um estudo comparativo dos
nveis de cloreto no suor em 43 crianas heterozigotas para F508del, com 6
semanas de idade e mais uma vez com a idade de 6 a 12 meses de idade,
encontraram aumentos e diminuies nos valores de cloreto entre os perodos. A
qualidade e quantidade de funcionamento do CFTR (canal de cloreto) influenciam na
concentrao de cloreto no suor102, porm em nossos resultados embora a
concentrao de cloreto no suor e na saliva 1 de homozigotos seja maior quando
comparada com heterozigotos para a variante F508del, no houve diferena
estatisticamente significativa.
No existem dados longitudinais sobre a concentrao de cloreto no suor
de indivduos com duas semanas ou mais de vida. Para um pequeno nmero de
pessoas submetidas ao teste de suor, os valores de cloreto permanecem no
intervalo de dvida diagnstica por meses ou mesmo anos41. Em um estudo
realizado no Canad, trs e meio por cento dos pacientes com FC tinham a
concentrao de cloreto no suor inferior a 60 mmol / L e apenas 1,2% tinham o valor
do cloreto inferior a 40 mmol / L17.
As variantes nas quais a AMPc tem reduo na condutncia (classe IV)
foram associadas a uma dimminuio significativa, resultando em concentraes de
cloreto no suor com valores intermedirios. No entanto, pacientes com mutaes
que causam sntese reduzida ou processamento parcialmente defeituoso da
protena CFTR (classe V) apresentaram concentraes de cloreto no suor
semelhantes s das classes I, II e III 9,16, 17,18.
A variao no gene CFTR a causa predominante da variedade das
concentraes de cloreto no suor. Pacientes com FC com mutaes CFTR Classe I-
III, a funo do canal CFTR ausente ou mnima e resulta em insuficincia
pancretica excrina e concentrao elevada de cloreto no suor. A funo CFTR
residual em pacientes com FC com mutaes de Classe IV-VI est associada
suficincia pancretica excrina e nveis de cloreto no suor acima ou abaixo de 60
mmol/ L 102,116.
O custo para a pesquisa de mutaes menos frequentes elevado, por
isso no realizado na rotina. Na literatura constam evidncias cientficas de a idade
56
em que o teste realizado uma considerao importante ao interpretar o valor de
cloreto no suor, que eletrlitos no suor de recm-nascidos saudveis diminuem
gradualmente ao longo das primeiras semanas de vida97, 103,104, 105, que alguns
indivduos sem FC podem ter concentraes de cloreto no suor entre 60 e 80
mmol/L106. Em nosso estudo participaram crianas a partir de 2 meses de idade e
nossa anlise foi pareada por idade.
Ademais, Servidoni et al107 num estudo realizado em 14 centros (9
pblicos e 5 privados) do estado de So Paulo, observaram que no h
uniformidade nas etapas executadas na realizao do teste do suor e nem
seguimento das diretrizes internacionalmente estabelecidas para esse exame. As
principais condies inadequadas encontradas nesses centros foram: coleta de
quantidade insuficiente de suor, a falta de equipamentos para estimulao ou
anlise clnica, ausncia de POP (Procedimento Operacional Padro) e o uso de
equipamentos de medio no certificados e obsoletos.
Na FC a condutncia de sdio tambm alterada, ou seja, a
concentrao de sdio no suor elevada, porque a atividade do ENaC (canal de
Na+) em parte dependente da atividade da CFTR108. Os guidelines no
recomendam o uso de concentrao de sdio do suor para diagnstico de FC. No
entanto, alguns laboratrios usam este valor para fins de controle de qualidade
109,110. Tambm dosamos o sdio e fizemos nosso controle de qualidade.
Apesar do teste do suor ter alta sensibilidade e especificidade, h casos
de em que o esse exame no define o diagnstico, sendo necessrios recursos de
auxlio diagnstico, incluindo a anlise de DNA e exames complementares (i.e.
medida da diferena de potencial nasal, avaliao da funo CFTR em bipsias
retais e evaporimetria)111, 112, 113. Talvez seja essa a categoria que o teste da saliva
poderia ser includo, pois com a sensibilidade de 80,6% e especificidade de 68,1%
no podemos sugerir a dosagem de cloreto na saliva para diagnstico da FC, mas
como mtodo de triagem ou auxlio diagnstico. A ideia do uso da saliva como matriz
biolgica para mtodos de diagnstico existe h muito tempo, e a possibilidade de
novo mtodo usando esse fluido pode ser pertinente e vivel devido facilidade de
coleta da saliva e quantidade de informaes determinantes em seus constituintes 62,
102, 114.
57
Notamos que a saliva coletada no primeiro minuto mais adequada para
a dosagem de cloretos quando comparada saliva 2, devido menor variabilidade.
Recm-nascidos com tripsinognio imunoreativo (TIR) positivo devem ter
o diagnstico confirmado pelo teste do suor. Embora o TIR no seja um teste
diagnstico para a FC, pode conduzir a testes que permitam excluir ou confirmar o
diagnstico9. Crianas com leo meconial podem ter os valores do TIR normal. Tem
sido relatadas dificuldades de coleta de quantidade suficiente de suor em lactentes39,
99.
Eng et al.100, realizaram uma pesquisa envolvendo 103 crianas com FC e
notaram que o valor mdio de cloreto no suor no perodo de 3 a 7 dias de idade era
menor, quando comparado com testes realizados de 8 a 14 dias de idade, em
seguida observou-se que o valor do cloreto no suor foi menor com 6 semanas de
idade, quando comparado com os dois perodos anteriores. Este declnio gradual
nos valores de cloreto no suor sugere que os resultados do teste do suor so mais
confiveis aps 2 semanas de idade.
Os pacientes com FC tambm tm pobre condutncia de sdio, e, assim,
elevada concentrao de sdio no suor, porque a atividade do ENaC (canal de Na+)
em parte dependente da atividade da CFTR 108.
Alm disso, alguns estudos sugerem que a proporo de cloreto e sdio
muitas vezes diferente em pacientes com FC104,115 e, portanto, poderia fornecer
informaes adicionais ao analisar os testes de suor com concentraes de cloreto
com valores intermedirios.
A variao no gene CFTR a causa predominante da variao do cloreto
no suor. Indicam tambm que o teste do suor tem uma importante variabilidade
dentro no mesmo laboratrio de anlise e que as concentraes de cloreto no suor
de um mesmo indivduo, dosadas no mesmo dia variaram em mdia 7,1 mmol / L.
Esse valor semelhante a outras estimativas relatadas (8,5 mmol / L em indivduos
com FC que tiveram pelo menos uma mutao G551D em CFTR) 116. Esta variao
provavelmente no exclusiva dos indivduos com FC, pois os estudos de todos os
pacientes que se submeteram ao teste do suor encontraram variabilidade das
concentraes de cloreto do mesmo indivduo variando entre 8,3 e 20,2%
(coeficiente de variao mdio)102.
58
Traeger et al.117 demonstram que o cloreto do suor diminui em relao ao
primeiro ano de vida e depois, lentamente aumenta com a idade. Por esse motivo,
eles sugerem que o intervalo de referncia do cloreto do suor para diagnstico da
FC deve ser subdividido em grupos.
Mais de 5 dcadas aps o desenvolvimento do teste do suor ainda h
lacunas no nosso conhecimento, incluindo intervalos de referncia para alguns
grupos etrios e estabilidade de amostras de suor. Alm disso, os mtodos
modernos de quantificao da concentrao de cloreto precisam ser explorados
como alternativas aos mtodos analticos originais para a medio de eletrlito no
suor 95.
Crossley118 demonstrou o aumento do tripsinognio imunorreativo, no
sangue, dessa forma contribuindo para a criao de um protocolo para a Triagem
Neonatal para FC, a qual continua se expandindo em todo mundo e a idade ao
diagnstico diminuindo. A dosagem do TIR um teste de triagem e requer um teste
confirmatrio, o Teste do suor. Contudo os valores de referncia estabelecidos como
normais para o TIR no so bem estabelecidos 70, 119.
No estudo de Hammond et al.120 observaram que o cut-off de 70 ng/ml
confere ao teste a sensibilidade em torno de 90% e uma especificidade de 98%. J
na coorte realizada no Brasil121 verificou-se um alto nmero de falso-positivos
primeira dosagem da TIR, o qual reduzido significativamente aps a segunda
dosagem e, mais ainda, aps o teste de suor. No Brasil no h um consenso de qual
o melhor valor a ser estabelecido como cut-off e os valores de sensibilidade,
especificidade, valores preditivos positivo e negativo do teste no podem ser
obtidos, pois no conhecido o nmero de crianas com FC que no foram
identificadas pelo protocolo de triagem.
De acordo com o National Screening Committee122 as caractersticas
necessrias de um programa de triagem so: ser clinicamente, socialmente e
eticamente aceitvel; ser de fcil acesso a todas as classes econmicas; ter baixo
custo e possuir estrutura de suporte que garanta o controle de qualidade.
Caractersticas essas notadas na dosagem de cloreto na saliva pela tcnica do
eletrodo on seletivo direto, contudo novos estudos com casustica maior de anlise
comparativa entre o mtodo da triagem atual e a anlise de saliva, para que
59
possamos verificar a viabilidade da implantao da dosagem do cloreto pela tcnica
do eletrodo on seletivo direto. Como qualquer mtodo de triagem, a TNN acaba
tambm por colocar sob suspeita crianas que, na realidade, so saudveis (falsos-
positivos) 123.
O protocolo atual de TNN para a fibrose cstica prev que 02 dosagens
alteradas de TIR e 02 testes do suor alterados (acima de 60 mEq / L), so
necessrios para a confirmao do diagnstico de Fibrose Cstica. O rastreamento
neonatal para FC tem sido um assunto de discusso e um dilema na comunidade
cientfica dos ltimos 10 anos. O ndice de falsos-positivos pela dosagem de TIR tem
variado 5 a 10%. Resultados falsos-negativos podem estar associados presena
de leo meconial, idade gestacional do recm-nascido, visto que os valores de TIR
tendem a diminuir aps a terceira semana de vida124,125, resultando no diagnstico
de FC em apenas 1 a 2% dos casos 126, 127.
Com o uso da dosagem do cloreto e sdio da saliva pelo equipamento de
gasometria, teremos um novo mtodo de auxlio diagnstico para a FC, com
vantagens de ser de baixo custo (Salivette=R$1,00; Gasometria= R$15,65),
indolor, coleta e anlise em 25 minutos, no invasivo, facilidade de coleta em
qualquer idade, mltiplas amostras podem ser obtidas facilmente, dispensa a
presena do paciente no laboratrio, riscos mnimos de contaminao cruzada,
transporte e armazenagem da amostra, requer menos manipulao durante os
procedimentos de diagnstico em comparao com o teste do suor 50,128,129 que o
tempo de estimulao e coleta duram no mnimo 40 minutos e seu custo de
aproximadamente R$150,00, para paciente at 2 anos de idade38, 130, 131, 132. Se
compararmos a dosagem do tripsinognio imunorreativo (TIR) com a dosagem de
cloreto na saliva pelo equipamento de gasometria, esse ltimo tambm vantajoso
com relao ao tempo de coleta e anlise e o custo do exame, mas necessrio
que se faa um estudo comparando os mtodos.
60
6. CONCLUSO
Os resultados obtidos nesse estudo com as metodologias utilizadas
sugerem uma concordncia nas concentraes de cloreto e sdio da saliva e suor,
ou seja, ambos fluidos tem comportamento fisiologicamente semelhante, sendo
significativamente maiores em pacientes com fibrose cstica em relao aos
controles. Evidenciando a possibilidade do uso da dosagem de cloreto e sdio na
saliva pela tcnica de eletrodo on seletivo direto (equipamento de gasometria) como
um teste de triagem e auxlio diagnstico para a fibrose cstica.
A saliva coletada no primeiro minuto demonstrou menor variabilidade,
quando comparada com a amostra de saliva coletada nos 3 minutos subsequentes.
Comparando os nveis de cloreto na saliva 1 e no suor de homozigotos
e heterozigotos para a variante F508del observamos que a concentrao desse on
maior em homozigotos.
Quando fizemos a anlise de acordo com as classes das variantes
genticas vimos que o subgrupo com uma variante de classe 1 e outra no
identificada a concentrao de cloreto no suor e na saliva 1 e 2 foi maior, seguido do
subgrupo com duas variantes de classe 2.
A concentrao de cloreto na saliva e suor de insuficientes
pancreticos foi maior (sem diferena estatstica significante) do que a concentrao
do mesmo on nos suficientes pancreticos.
61
7.REFERNCIAS
1. Quinton PM. Cystic fibrosis: a disease in electrolyte transport. FASEB J 1990;4:
27092717.
2. O'Sullivan BP, Freedman S.D. Cystic fibrosis. Lancet, 373 (2009), pp. 18911904.
3. Fanconi G, Uehlinger E, Knauer C. Das Coeliakie-syndrom bei angeborener
zystischer Pankreasfibromatose und Bronchiektasien. Wien Med Wchnschr. 1936;
86:753-756. German [Celiac syndrome with congenital cystic fibromatosis of the
pancreas and bronchiectasis].
4. Andersen DH. Cystic fibrosis of the pncreas and its relation to celiac disease. Am
J Dis Child. 1938; 56:344-399.
5. Di Sant'Agnese PA, Darling RC, Perera GA, Shea E. Abnormal electrolyte
composition of sweat in cystic fibrosis of the pancreas; clinical significance and
relationship to the disease. Pediatrics. 1953; 12(5):549-63.
6. Riordan JR, Rommens JM, Kerem BS, Alon NOA, Rozmahel R, Grzelczak Z,
Tsui, LC. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of
complementary DNA. Science 1989; 245: 1066-1073.
7. Simson JA, Fenters R, Chao J. Electron microscopic immunostaining of kallikrein
in rat submandibular glands. J Histochem Cytochem. 1983; 31: 301306.
8. Yahiro J, Nagato T. Distribution of kallikrein in striated duct cells of monkey
submandibular glands. Arch Oral Biol. 2002; 47: 631635.
9. Mishra A, Greaves R, Massie J. The limitations of sweat electrolyte reference
intervals for the diagnosis of cystic fibrosis: a systematic review. Clin Biochem Rev.
2007; 28:60-76.
10. Rogan MP, Stoltz DA, Hornick DB. Cystic fibrosis transmembrane conductance
regulator intracellular processing, trafficking, and opportunities for mutation-specific
treatment. Chest 2011; 139:14801490.
11. Litllewood J. Looking back over 40 years and what the future hold. 2004.
Disponvel em:
62
63
22. Slis MSN, Torres JFM, Martnez IM, Sells FP. Lung transplantation and the
development of diabetes mellitus in adult pacients whith cystic fibrosis. 2007;
43(2):86-91. Disponvel em:
http://www.archbronconeumol.org/cgibin/wdbcgi.exe/abn/abneng.mrevista.
23. Castellani C e Assael BM. Cystic fibrosis: a clinical view. Cell Mol Life Sci. 2017;
74(1):129-140.
24. Kaplan E, Shwachman H, Perlmutter AD, Rule A, Khaw KT, Holsclaw DS.
Reproductive failure in males with cystic fibrosis. N Engl J Med. 1968; 279(2):65-9.
25. Park RW e Grand RJ. Gastrointestinal manifestations of cystic fibrosis: a review.
Gastroenterol. 1981; 81:1143-1161.
26. Cataln MA, Nakamoto T, Gonzalez-Begne M, Camden JM, Wall SM, Clarke LL,
Melvin JE. Cftr and ENaC ion channels mediate NaCl absorption in the mouse
submandibular gland. J Physiol. 2010; 588(Pt 4):713-24.
27. Romey M. C. et al. A naturally occurring sequence variation that creates a YY1
element is associated with increased cystic fibrosis transmembrane conductance
regulator gene expression. J. Biol. Chem. 275, 35613567 (2000).
28. Guyton AC e Hall JE. Tratado de fisiologia mdica. 12 edio. Editora Elsevier,
Rio de Janeiro 2011.
29. Johnson LR. Fundamentos
