Aktivitas Sitotoksik Natural Killer Cell: Pengukuran terhadap Mekanisme

Induksi ApoptosisNatural Killer Cell Cytotoxic Activity:

Measurement of the ApoptoticInducing Mechanisms

Clinical and Experimental Medical Sciences, Vol. 1, 2013, no. 8, 373 - 386

dr. Ayu Puspitasari., dr. Lisanti R., dr. Pancoro P., dr.Marsha D.C., dr. Zendy S.

Pembimbing :DR.dr. Kusworini Handono, M.Kes, Sp.PK

ABSTRAK

Aktivitas sitotoksik Natural Killer cell (sel NK) sangat penting untuk membersihkan

virus dan sel-sel yang berubah

menjadi ganas. Tujuan dari

penelitian ini adalah untuk

meneliti mekanisme

apoptosis dari sel NK yang bertujuan untuk melakukan

pengukuran tambahan

terhadap fungsi efektor sel NK. 19 kontrol yang sehat (umur = 31 ± 7,2

tahun) berpartisipasi

dalam penelitian ini. Flow

cytometric protocols menilai

aktivitas sitotoksik sel NK melawan sel

tumor K562, protein litik,

degranulasi dan produksi interferon gamma. Pelepasan perforin berkorelasi

secara signifikan dengan aktivitas sitotoksik (r = -

0.46, p <0,05) dan degranulasi (r = -0.60, p <0,05).

Hasil ini menunjukkan

bahwa perforin mungkin

digunakan sebagai pengukuran tambahan

terhadap fungsi efektor sel NK

sitotoksik.

Kata kunci

PENDAHULUAN

Natural Killer cell (sel NK) sel imun bawaan yang melisiskan sel-sel yang terinfeksi dan berubah menjadi ganas melalui aktivitas sitotoksik [10].

Sel NK sitotoksik mengandung banyak granul sekretori yang menyimpan dan melepaskan death-inducing protein (perforin dan granzyme)

Perforin memfasilitasi pengiriman granzyme ke sel target dengan

membentuk pori pada endosome dan membran plasma sel target [15, 31].

Pelepasan granzyme mengaktivasi 3 jalur apoptosis berbeda pada sel target. Pada

manusia, granzyme B (GrzB) dan granzyme A (GrzA) aktivator apoptosis yang paling

poten [5, 14]

Sel NK juga memulai apoptosis sel target melalui death receptor

pathway

Death receptor pathway meningkatkan produksi sel NK dari sitokin interferon gamma

( IFN - γ ) [28 , 29] .

Subyek Penelitian

19 orang sehat ♂:♀=10:9

(31±7,2th)

- FBC- Uji C-reactive

protein

Metode Penelitian

Isolasi PBMC(106)

+10% FBS

1% streptomyocin/penisilin larutan sodium piruvat

larutan buffer HEPES

Isolated NK cell(106)

+10% FBS

1% streptomyocin/penisilin larutan sodium piruvat

larutan buffer HEPES

Sel

Pemeriksaan aktivitas sel NK sitotoksik (flow cytometer)

Sel Efektor

(PKH-26)

Sel Target K562 (105)

25 : 1

50 : 1100 :

1

Dosis Respon

PBMCPKH – K562 25:1/50:1/10

0:1

NK cellPKH – K562

25:1/50:1/100:1

Inkubasi dg 5% CO2 37°C slm 4 jam

+7-AADFITC

@ 10.000 kejadian di analisis

Jumlah sel-sel K562 yang

apoptosis pada flow cytometer

Kontrol PBMCKontrol NK

cell

Semua sampel dibuat duplikat

PBMC – K56225 : 1

NK cell – K56225 : 1

Inkubasi dg 5% CO2 37°C slm 4 jam

@ 10.000 kejadian di analisis pada Flow

Cytometer

Perforin, GrzA -> + CD16 FITC

GrzB -> + CD56 PE

Kontrol PBMC

Kontrol NK cell

+fluorochromeconjugated monoclonal

Ab (pewarnaan permukaan CD spesifik sel NK)

Persentase gated lymphocytes CD56 + /CD16 + dan protein-protein litik.

+

Semua sampel dibuat duplikat

Pewarnaan Intraseluler Protein LitikDeteksi perforin, Grz A dan GrzB di dalam sel NK

Pengukuran Degranulasi & Interferon ɣ

Ekspresi sel NK pada

CD107a

Pewarnaan

intraseluler

+ Monensin -> cegah degradasi CD107a + Brefeldin -> hambat eksositosis IFN - γ

+

PBMC – K56225 : 1

NK cell – K56225 : 1

Inkubasi dg 5% CO2 37°C slm 6 jam

@ 10.000 kejadian di analisis pada Flow Cytometer

PBMC – PMA/I

NK cell – PMA/I

+ CD107a FITC (deteksi sel NK

yang terdegranulasi)

persentase gated lymphosytes positive CD107a dan IFN - γ

+CD56 PE ; pewarnaan intraseluler menentukan produksi IFN -γ

Kontrol

PBMC

Kontrol NK cell

Semua sampel dibuat duplikat

Analisa Statistik

1.Independent sample T beda signifikan pria & wanita (FBC, Uji c reaktif protein).

2.Analisis varian berulang pd 2 variabel dependen (ANOVA) data pengukuran lisis K562, protein litik, CD107a/IFN-ɣ.

3.Bonferronii’s multiple comparison signifikansi (p<0,05).

4.Korelasi Spearman hub. signifikan antr mekanisme induced apoptosis & aktivitas sitotoksik (lisis K562).

HASIL

Karakteristik Partisipan

Perbedaan yang signifikan (p<0.05)

dari sel darah putih, monocytes, sel darahmerah, haemoglobin, haematokrit dan konsentrasi corpuscular haemoglobin yang dibandingkan antara laki-laki dan perempuan

Peningkatan aktivitas NK Cell Cytotoxic di PBMCs

Aktivitas NK cell cytotoxic telah ditentukan oleh jumlah dari sel K562 yang apoptosis dan lisis.

Di dalam sampel PBMC, peningkatan rasio efektor target menyebabkan peningkatan yang signifikan (p<0.01) dari aktivitas NK cell cytotoxic ketika rasio 25:1, yang dibandingkan dengan 50:1 dan 100:1 (figure 1[A]).

Tidak ada perbedaan signifikan yang ditemukan pada aktivitas cytotoxic dalam sampel NK sel yang diisolasi (figure 2[B]).

Perbandingan aktivitas cytotoxic dengan perbedaan rasio di PMBC dan NK sel yang diisolasi menunjukan tidak adanya perbedaan yang signifikan (data tidak ditunjukan)

Berkurangnya lisis protein NK sel di PMBC

Perforin, GrzA dan GrzB dalam NK sel telah ditemukan di sampel (Figure 2 [B]) dan NK sel yang diisolasi (Figure 2 [C]).

Protein lisis telah dibandingkan di kontrol dan sampel yang distimulasi K562, dan hasilnya tidak ada perubahan yang signifikan.

Ekspresi dari protein lisis lebih tinggi pada NK sel yang diisolasi.

Peningkatan degranulasi NK sel dan Stimulasi menghasilkan IFN-γ

NK sel telah distimulasi untuk degranulasi dan menghasilkan IFN-γ. Perbandingan antara sel yang distimulasi K562 dan sampel control menunjukan tidak ada perbedaan yang signifikan dalam ekspresi CD107a dan IFN-γ (Figure 3[B]).

Ketika hasil dari sel yang distimulasi PMA/I dibandingkan dengan sampel control, didapatkan peningkatan yang signifikan (p<0.05) dalam ekspresi CD107a dan IFN-γ baik dalam PBMC maupun sampel NK sel yang diisolasi.

 

Korelasi antara mekanisme apoptosis NK sel dan aktivitas cytotoxic

Korelasi yang signifikan ditemukan antara NK sel perforin dan aktivitas cytotoxic di 25:1 (table 2).

Pada NK sel yang distimulasi dengan K562, korelasi yang dignifikan juga ditemukan antara protein lisis (perforin, GrzA and GrzB) dan ekspresi CD107a.

Aktivitas NK sel sitotoksik dalam sampel PBMC(A) dan sel NK yang terisolasi (B). Plot kotak menunjukkan lisisnya sel NK dari sel K562 pada tiga rasio. Kotak mewakili untuk setiap ratio interquartile range (IQR), dan menunjukkan distribusi data. Garis tengah di setiap kotak mewakili nilai median.

GAMBAR 1

Protein litik dalam sel NK. Cytometry figures mengalir dari sampel sel NK yang terisolasi (A) mewakili jumlah CD56+/CD16+ sel NK yang mengekspresikan perforin, GrzA dan GrzB. Protein litik dalam sampel PBMC(B) dan sampel sel NK yang terisolasi (C) tidak menunjukkan perbedaan stimulasi patogen yang signifikan. Data disajikan sebagai mean±standard error mean.

GAMBAR 2

CD107a dan IFN-γ pada PBMC dan Sel NK yang terisolasi. Aliran Cytometry mewakili gambaran sel NK dari sampel PBMC mengekspresikan CD107a dan IFN-γ (A). Dalam sampel kontrol, 1,22% dari limfosit mengekspresikan CD107a dan IFN-γ. Ketika sel-sel tersebut dirangsang dengan sel K562 dan PMA/I, jumlah sel NK yang mengekspresikan CD107a dan IFN-γ ditingkatkan menjadi 15,84 dan 19,60% secara berturut-turut. IQR pada sampel sel PBMC dan sel NK meningkat dari kontrol ke sel K562 dan PMA/ I yang telah terangsang (B). Nilai rata-rata untuk sampel diwakili oleh garis ditengah kotak.

GAMBAR 3

  Males Females P Value

Total Participants (N) 10 9  

White blood cells (x109/L) 6.641 ± 1.494 5.216 ± 0.653 0.017*

Neutrophils (x109/L) 3.683 ± 0.928 2.977 ± 0.955 0.121

Lymphocytes (x109/L) 2.028 ± 0.474 1.636 ± 0.470 0.089

Monocytes (x109/L) 0.558 ± 0.127 0.357 ± 0.118 0.002*

Eosinophils (x109/L) 0.284 ± 0.360 0.160 ± 0.079 0.331

Basophils (x109/L) 0.089 ± 0.037 0.158 ± 0.220 0.340

Red Blood Cells (x1012/L) 5.370 ± 0.430 4.763 ± 0.277 0.002*

Haemoglobin (g/L) 156.400 ± 8.181 138.111 ± 11.731 0.001*

Haematocrit (L/L) 0.445 ± 0.026 0.407 ± 0.034 0.013*

Mean corpuscular volume (fL) 83.080 ± 3.889 85.556 ± 6.619 0.328

Mean corpuscular haemoglobin (pg) 29.240 ±1.730 29.078 ± 2.491 0.870

Mean corpuscular haemoglobin concentration (g/L) 351.900 ± 7.475 339.556 ± 6.598 0.001*

Red cell distribution width (%) 11.660 ± 0.353 12.611 ± 1.140 0.039

C reactive protein (mg/L) 0.599 ± 0.324 0.829 ± 0.699 0.384

TABEL 1

  

R P value

  Perforin& Cytotoxic Activity -0.467 0.044

  Perforin& CD107a -0.571 0.029

  GrzA& CD107a -0.561 0.049

  GrzB& CD107a -0.536 0.042

 

TABEL 2

PEMBAHASAN

Aktifitas sitotoksik merupakan suatu proses yang penting untuk menjaga kesehatan karena menjamin terhapusnya sel –sel yang terinfeksi kuman patogen dan sel – sel yang berubah menuju keganasan.

Penelitian terbaru yang dilakukan menguji mekanisme induksi apoptosis pada jalur aktivitas sitotoksik sel NK, untuk menentukan sebuah tolak ukur tambahan mengenai fungsi efektor sel NK.

Perforin secara signifikan berkorelasi dengan aktivitas sitotoksik dan degranulasi, sehingga kita mungkin dapat menggunakannya sebagai tolok ukur tambahan untuk aktivitas sitotoksik dari sel NK.

Dimana perforin adalah sebuah protein litik yang dilepaskan oleh sel NK untuk menginduksi apoptosis terhadap sel target,

Perforin dalam sel NK secara signifikan berkorelasi dengan aktifitas sitotoksik dan degranulasi. Kedua korelasi tersebut bersifat negatif, menunjukkan bahwa penurunan perforin berhubungan dengan peningkatan degranulasi dan aktivitas sitotoksik.

Korelasi antara pelepasan perforin dengan lisis sel tumor dan degranulasi menunjukkan bahwa perforin mungkin dapat digunakan sebagai indikator tambahan terhadap fungsi efektor sel NK dan bermanfaat dalam kepentingan klinis untuk mengidentifikasi defisiensi / kelemahan / penyakit yang mempengaruhi aktifitas sitotoksik.

Critical Appraisal

Was the diagnostic test evaluated in a Representative spectrum of patients (like those in whom it would be used in practice)?

Answer : Unclear Comment : Penelitian ini dilakukan dengan

mengambil sample darah orang sehat dengan batasan usia 31 ± 7,2 tahun namun dalam metode penelitian tidak disebutkan apakah subyek penelitian dipilih secara random atau telah di screening terlebih dahulu.

Critical Appraisal

Was the reference standard ascertained regardless of the index test result?

Answer : Unclear Comment : Karena untuk mendeteksi

aktivitas sitotoksik NK sel selama ini menggunakan metode tradisional Chromium Release Assay (CRA) dan flow cytometric based cytotoxic assay. Pada penelitian ini dilakukan flow cytometric based cytotoxic assay namun tidak diketahui apakah dilakukan perbandingan dengan metode CRA.

Critical Appraisal

Was there an independent, blind comparison between the index test and an appropriate reference ('gold') standard of diagnosis?

Answer : UnclearComment : Pada penelitian ini tidak

disebutkan apakah dilakukan perbandingan dengan metode tersebut.

Critical Appraisal

Are test characteristics presented?Pada penelitian ini tidak dapat dilakukan penentuan spesifisitas dan sensibilitas karena data-data yang diperlukan pada jurnal ini tidak dicantumkan dengan jelas

Critical Appraisal

Were the methods for performing the test described in sufficient detail to permit replication?

Answer : YesCommnent : Karena metode yang

dilakukan pada penelitian ini sudah jelas sehingga penelitian ini dapat dilakukan di tempat lain

TERIMA KASIH