AKTIVASI JALUR KOMPLEMEN KOMPLEMEN ALTERNATIF DENGAN

MELANIN JAMUR

Melanin adalah pigmen biologi kompleks yang dibentuk dengan polimerasisasi oksidatif

dan/atau kandungan indolic. Pigmen ini telah diimplikasikan dalam pathogenesis beberapa

infeksi mikroba, keganasana, gangguan degenerasi, dan penyakit autoimun. Penelitian saat

ini telah menunjukkan bahwa melanin mempunyai sifat antigenic dan anti inflamasi.

Temuan ini menyebabkan peneliti melakukan eksplorasi selanjutnya terhadap interaksi

melanin dengan system imun. Partikel melanin (“ghosts”) diisolasi dari sel neoformans

Cryptococcus dan Aspergillus niger conidia dan selanjutnya diinkubasi dalam serum

normal yang mengandung komplemen C3 125I yang dilabel. Hasil menunjukkan bahwa

deposisi fragmen C3 ke dalam ghost melanin terjadi dalam 1 menit setelah inkubasi,

dengan deposisi maksimum terjadi setelah 12 menit untuk C.neoformans yang diperoleh

dari ghost melanin dan setelah 25 menit untuk ghost melanin A. niger. Pemblokan aktivasi

jalur klasik tidak mempengaruhi kinetic deposisi total C3 ke dalam ghost melanin,

mengindikasikan bahwa melanin mengaktivasi komplemen melalui jalur alternative.

Analisis immunofluoresensi paru-paru dari mencit galur BALB/c yang diinjeksi secara

intratekal dengan C.neoformans yang mengandung ghost melanin menunjukkan deposisi

fragmen C3 ke dalam ghosts. Granuloma kecil juga diamati di sekeliling ghosts. Akan

tetapi, melanisasi sel C.neoformans tidak mengubah konetik atau deposisi total fragmen C3

ke dalam sel jamur. Temuan bahwa permukaan melanin dapat mengaktivasi system

komplemen memperkirakan mekanisme potensial dalam pathogenesis beberapa proses

degenerasi atau proses autoimun yang meliputi sel melanisasi sama seperti peranan

potensial melanin lain dalam virulensi melanin yang diproduksi oleh miroorganisme.

Melanin merupakan pigmen muatan negative dengan permukaan hydrophobic yang

dibentuk dari polimerisasi oksidatif kandungan phenolic dan atau indolic (5,44). Pigmen ini

disintesis oleh mikroorganisme yang mewakili semua kingdom biologi dan diimplikasikan dalam

proses fisiologi dan patologi yang luas, termasuk pathogenesis beberapa infeksi mikroba (5,44),

melanoma malignan (14, 34), penyakit Parkinson (9, 12, 45), uveitis ruang anterior traumatic (3,

4, 18), dan vitiligo (22, 43). Melanin adalah imunologi aktif, karena mereka dapat menginduksi

sel T bebas antibody kuat yang berespon pada mencit (27) dan mempunyai sifat anti inflamasi (1,

25).

Cryptococcus neoformans adalah suatu hifa yang tidak berkapsul seperti jamur yang

dikenal sebagai pathogen pada individu yang mengalami penurunan system imun, termasuk 6-

8% pasien dengan AIDS (24). Terdapat bukti yang nyata bahwa C.neoformans mensintesis

melanin selama infeksi (28, 29, 36). Eksperimen in vitro menunjukkan bahwa melanin adalah

dilokalisasi dalam dinding sel cryptococcal (39) dan dapat menyumbangkan virulensi dalam

bagian tersebut karena kemampuannya untuk mengikat dan menetralisasi oksidan (11, 15-17, 32,

42), peptide mikrobicidal (10), dan obat-obatn anti jamur (41). Melanisasi juga meningkatkan

muatan negative C.neoformans (26), yang menyebabkan pengurangan kepekaan sel melanin

terhadap fagositosis oleh sel efektor host (2, 39).

Komponen system komplemen memegang peranan penting dalam resistensi infeksi

cryptococcal, karena deposisi komplemen fragmen C3 ke dalam kapsul polisakarida sel

C.neoformans adalah penting untuk fagositosis optimal dan kejelasan jamur (6-8, 19). Walaupun,

sifat imunologi melanin, interaksi pigmen ini dengan system komplemen belum diteliti. Tujuan

penelitian ini adalah menentukan (i) apakah melanin alami dapat berinteraksi dengan system

komplemen dan (ii) apakah melanisasi C.neoformans mempengaruhi aktivasi kompelemen

melalui sel jamur. Penelitian kami menunjukkan bahwa melanin dapat mengaktivasi jalur

komplemen alternative; akan tetapi, melanisasi tidak mempengaruhi kinetic deposisi total

fragmen C3 ke dalam sel neoformans.

Material dan Bahan

Sel jamur. C. Neoformans serotype strain D 3501 dan 24067 dan strain Aspergillus niger

J9901 diambil dari koleksi kultur jenis Amerika.

Melanisasi sel jamur. C. neoformans 3501 ditumbuhkan dalam medium minimal (15

mM glukosa, 10 mM MgSO4, 29,4 mM KH2PO4, 13 mM glycine, 3 UM vitamin B, pH 5,5)

dengan atau tanpa 1 mM L-3,4 didydroxyphenylananine (L-DOPA) selama 8 hari pada suhu 30

C dalam rotatory putaran 150 rpm. Hanya sel yang tumbuh dengan L-DOPA menjadi melanin.

C.neoformans 24067 ditumbuhkan selama 15 hari dengan medium minimal L-DOPA.

A. niger ditumbuhkan pada agar dekstrose Sabaroud (pH 5,6) selama 5 bulan suhu 30 C

agar melanisasi mempunyai conidia.

Isolasi melanin jamur. Melanin diekstraksi dari melanin C.neoformans 24067 dan

A.niger conidia dengan perlakuan dengan enzim proteolytic dan glycolytic, dengan denaturasi

oleh ekstraksi kloroform, dan dengan pencampuran HCL seperti yang telah dijelaskan

sebelumnya (34). Partikel melanin juga dikenal sebagai ghost melanin (40) dikumpulkan dari

sentrifugasi, dicuci, dan dialysis dalam air suling selama 10 hari. Ghost melanin dicuci dan

disuspensikan dalam larutan asam posfat (PH 7,4). Walaupun kemurnian ghost melanin tidak

dapat dibuat secara ekuivokal karena kurangnya pengetahuan mengenai struktur melanin.

Serum dan protein serum. Darah dikumpulkan dari sedikitnya 10 donor. Sel diisolasi,

disimpan pada suhu 85 C. C3 diisolasi dari plasma beku dan dilabel dengan 125I menggunakan

Iodogen.

Analisis kinetic ikatan C3 in vitro. Aktivasi kinetic dan ikatan fragmen C3 terhadap

ghost melanin atau sel C.neoformans 3501 (melanisasi atau non melanisasi) dinilai dalam

campuran yang mengandung (i) 40% serum normal manusia (ii) GVB mengandung gelatin , 0,15

mM CaCl2 dan 1 mM MgCL2 (iii) 125 I-label C3 untuk menyediakan aktivitas spesifik 50.000

cpm/ug. (iv) 6,0 x 105 ghost melanin atau sel cryptococcal yang dipanaskan. Tube mengandung

semua reagen kecuali sel ghost melanin yang dipanaskan selama 5 menit suhu 37 C dan reaksi

diinisiasi dengan penambahan sel ghosts. Duplikasi sebanyak 30 uJ sampel diinkubasi selama

interval 1,2,4,6,8,10,16,20, dan 25 menit dan ditempatkan dalam 150 uJ larutan dengan 0,1%

sodium dodecyl sulfat dan 20 mM EDTA.

Immunofluoresensi (IF) analisis ikatan C3 terhadap melanin. C.neoformans yang

mengandung ghost melanin (4x105) diinkubasi dalam 40% NHS selama 2,4,8,16 menit. 125I-C3

tidak ditambahkan dalam reaksi campuran. Setelah reaksi dihentikan, ghost melanin dicuci 3 kali

dengan PBS, resuspensi dalam 100 uJ 1.25 dilusi fluorescin isothyocyanate (FITC).-antiserum

konjugasi C3. Dalam PBS mengandung 1% serum albumin sapi diinkubasi selama 1 jam suhu 0

C.

Analisis Immunohistokimia ikatan C3 melanin. 5 mencit galur BALB/c (umur 6-8

minggu) diinjeksi secara intratekal dengan 107 C. Neoformans yang mengandung ghosts. Mencit

kemudian dibunuh setelah 7 hari injeksi., dan paru-parunya dikumpulkan untuk dianalisis.

Jaringan setebal 4 um diparafin dalam xylene dan direhidrasi dengan inkubasi serial dalam

larutan dengan pengurangan konsentrasi ethanol.

Hasil

Aktivasi komplemen dengan melanin in vitro. Ghosts melanin diisolasi dari sel

C.neoformans melanin in vitro 24067 dan A.niger 19901 conidia kemudian diinkubasi dalam

NHS 40% ke dalam ghost melanin yang terjadi di awal setelah 5 menit inkubasi. Mencapai

deposisi maksimum kira-kira 1,9 x 106 fragmen C3 per C. neoformans yang mengandung ghost

melanin setelah 12 menit dan 1,3 x 106 fragmen C3 per A. niger yang mengandung ghosts

melanin setelah 25 menit (gambar 1). Perlakuan NHS dengan EGTA dapat mencegah aktivasi

jalur klasik CA2+ (13,31), tidak mempengaruhi kinetic atau deposisi total fragmen C3 ke dalam

ghost melanin (data tidak ditunjukkan) mengindikasikan bahwa komplemen aktivasi dengan

melanin terjadi melalui jalur alternative. Perbedaan antara jalur klasik dan alternative sulit untuk

dibuat, akan tetapi karena konsentrasi 10 fold MgCl2 lebih tinggi digunakan dalam reaksi

pencampuran aktivasi perubahan komplemen, yang menyediakan stabilisitas lebih baik dalam

pencampuran. Konsentrasi MgCl2 meningkat untuk menghitung EGTA. Jika analisis

C.neoformans yang mengandung melanin ghosts dalam NHS menyebabkan deposisi inisial

fragmen C3 yang terjadi pada sisi fokal diskret. Jumlah sisi fokal diskret meningkat dengan

meningkatnya waktu inkubasi, tetapi distribusi C3 tidak pernah mencapai konfluens (gambar 2).

Peneliti tidak menggunakan melanin sintetik dalam penelitian ini, karena melanin sintetik

biasanya dibuat oleh inkubasi precursor (seperti L-DOPA) dengan oksidan kimia, seperti H2O2

untuk meningkatkan tingkat polimerisasi ke dalam melanin. Akan tetapi, selama formasi sintetik

melanin, oksidan ini menginduksi model polimerisasi lain (33) sebagai degradasi beberapa

informasi penting dalam jalur melanogenic alami (37); oleh karena itu, produk akhir mungkin

mengandung campuran beragam struktu polimerisasi. Oleh Karena itu, jika oksidan kimia tidak

digunakan, banyak reaksi pencampuran atau inkubasi dalam jangka panjang yang dibutuhkan

untuk mendapatkan melanin yang cukup.

Komplemen aktivasi melanin in vivo. Diperkirakan 107 C.neoformans yang mengandung ghost

melanin diinjeksikan intratekal ke dalam BALB/c mencit untuk menentukan apakah ghost

melanin dapat mengaktifkan komplemen dalam jaringan.

Komplemen Kinetik aktivasi dengan melanin atau non melanin C.neoformans in vitro.

Melanin dan non melanin C.neoformans sel 3501 diinkubasi dalam 40% NHS yang mengandung 125I-label C3 untuk menentukan apakah melanin dapat mempengaruhi aktivasi komplemen

dengan sel cryptococcal. Untuk kedua melanin dan non melanin C.neoformans, deposisi jumlah

fragmen C3 yang dapat diukur ke dalam sel terjadi hanya setelah 4 menit, mencapai maksimum

fragmen per sel 1,5 x 107 C3 setelah 16 menit inkubasi (gambar 4). Tidak ada perbedaan tepat

dalam jumlah ikatan fragmen C3 antara sel melanin dan non melanin yang diamati pada waktu

tertentu setelah data dikorelasikan untuk menghitung perbedaan dalam ukuran kapsul antara sel

melanin dan non melanin.

PEMBAHASAN

Melanin adalah molekul aktif imunologis (1,25,27). Oleh karena itu, melanin meningkatkan

muatan negative sel C.neoformans (26) dan mempengaruhi interaksi mereka dengan sel efektor

host (2,37). Observasi ini menyebabkan penulis melakukan eksplorasi dengan sifat aktivasi

potensial komplemen melanin dan apakah melanin mempunyai efek dalam aktivasi kompelemen

oleh C.neoformans. analisis IF dan kuantitaitf menunjukkan bahwa inkubasi melanin jamur

dalam NHS menginduksi deposisi fragmen C3 pada sisi fokal diskret yang gagal menjadi

konfluen di permukaan ghost melanin. Ini merupakan perbedaan kualitatif yang penting dari pola

deposisi C3 yang diamati dengan sel C. neoformans yang berkapsul dan tidak berkapsul, dimana

deposisi C3 menjadi konfluens. Kegagalan deposit konfluens C3 pada melanin ghosts dapat

merefleksikan permukaan heterogen dan/atau perbedaan penting antara partikel dalam aksi jalur

alternative protein regulasi factor H dan factor I (30).

Kira-kira 1,9 x 106 fragmen C3 yang berikatan dengan masing-masing C.neoformans

yang mengandung melanin ghost setelah 12 menit inkubasi NHS, dimana diperkirakan 1,3 x 106

fragmen C3 yang berikatan pada masing-masing A.niger yang mengandung melanin setelah 25

menit. Perbedaan ini muncul dalam kapasitas pengikatan yang disebabkan oleh perbedaan dalam

ukuran antara melanin jamur seperti C.neoformans yang mengandung melanin (35) oleh karena

itu menyebabkan permukaan deposisi fragmen C3 yang lebih besar. Analisis IF juga

menunjukkan deposisi fragmen C3 ke dalam C.neoformans yang mengandung melanin ghosts,

mengindikasikan bahwa melanin dapat mengaktifkan system komplemen in vivo.

Disamping kemampuan melanin untuk mengaktivasi komplemen, melanisasi

C.neoformans tidak mempengaruhi kinetic atau deposisi total fragmen C3 ke dalam kapsul

polisakarida sel cryptococcal. Melanin dalam C.neoformans ditemukan dalam dinding sel (39),

dimana lapisan ekstraseluler milieu terbuat dari kapsul polisakarida dan oleh karena itu tidak

mampu berinteraksi dengan system komponen dan komplemen. Peningkatan muatan negative

dalam sel melanin tidak cukup signifikan dalam mempengaruhi interaksi kapsul polisakarida

dengan molekul C3. Walaupun penulis tidak dapat menunjukkan perbedaan dalam tingkat

aktivasi kompelemen antara sel melanin dan non melanin, ekstraseluler atau dinding sel yang

berikatan dengan melanin dihasilkan dari patohen yang tidak berkapsul yang mempengaruhi

aktivasi komplemen melalui permukaan microbial. Interaksi pemaparan melanin microbial

dengan system komplemen dapat menyebabkan deplesi kompelemn, yang pada gilirannya

menghasilkan pengurangan kepekaan terhadap komplemen yang dimediasi oleh fagositosis oleh

sel efektor host. Hal ini dapat menyediakan mekanisme lain untuk melanin dalam virulensi

pathogen microbial.

Penelitian saat ini menunjukkan bahwa melanin sintetik dan alami mempunyai sifat

antiinflamasi (1,25), yang mungkin disebabkan oleh kemampuan melanin untuk menteralisir

radikal bebas dan oksidan (17,23) dan untuk menekan produksi proinflamasi sitokin (1, 25).

Hasil dari penelitian kami mengindikasikan bahwa melanin dapat mengaktivasi jalur

komplemen alternative, menyebabkan mekanisme yang dapat menginduksi respon inflammasi.

Aktivasi komplemen dengan partikel melanin dapat diharapkan untuk menghasilkan komplemen

kemotaktik dan proinflamasi komplemen. Dalam penelitian penulis, kami mencatat bahwa

injeksi melanin dalam paru-paru memperoleh respon inflamasi yang diindikasikan dengan

formasi granuloma kecil. Walaupun temuan ini menyebabkan sifat kontradiksi melanin, sangat

mungkin bahwa struktur kompleks pigmen ini terlihat mempunyai peranan yang berlawanan.

Hasil penulis menyetakan kemungkinan bahwa melanin alami lainnya, mungkin termasuk

melanin manusia, mempunyai potensialisasi untuk mengkatifkan komplemen in vivo.

Kemampuan ini dapat mengindikasikan aktivitas biologi untuk melanin yang dapat

menyumbangkan pathogenesis beberapa penyakit autoimun dan penyakit degenerative.