AKTİF POMPA ve PORİN KAYBI: Tehdit mi?

M. Ufuk Hasdemir AKG 2014, Askeri Müze, İstanbul

Bakterilerde Antibiyotik Direnci

• Hedefte değişiklik • Enzimatik modifikasyon veya

inaktivasyon • Aktif Pompa • HD geçirgenliğinde azalma

Bakterilerde Hücre Yüzeyi

Gram-negatif • Sitoplazmik membran • Peptidoglikan tabaka

• Dış membran

• Biyofilm

Lipooligosakkarit

Gram-pozitif • Sitoplazmik membran • Peptidoglikan tabaka

• Teikoik asit

• Biyofilm Polisakkarit-teikoik

asit

Gram Pozitif

DM

O antijeni

Teikoik asit

İM

PORİN

Gram Negatif

PS

P

P

Lipid A

KDO

KDO

KDO

Hep Hep Glu Gal Ram Man

P

P

Hep

Kor polisakkarit O Aj

Yağ asitleri

İMPERMEABİLİTE •Anyonik LPS •LPS - kuvvetli yan bağlar •Doymamış yağ asiti eksikliği PORİN KAYBI / MUTASYONU

Pseudomonas aeruginosa Vibrio cholera Salmonella enterica Azitromisin, Klaritromisin Eritromisin Roksitromisine DOĞAL DİRENÇ

İlaç Permeabilitesinde Azalma: Doğal Direnç

İlaç Permeabilitesinde Azalma: Kazanılmış Direnç

Porin gen ekspresyonunu düzenleyen genlerde mutasyon

Porin değişikliğine yol açan mutasyonlar P. aeruginosa OprD porin kaybı İMİPENEM R

İlaç Permeabilitesinde Azalma: Kazanılmış Direnç

A. baumannii’ CarO porini KARBAPENEM R 43 kDa’luk porin Porin kaybı Oxa-24 artışı ile ilişkili

A. baumannii CarO kaybı veya

mutasyonu

Isolate 2 Isolate 9 Isolate 13 Isolate 14

Oxa-23 N P N N

Oxa-24 N N P P

Oxa-58 N N P P

Imp-1 N N N N

Vim-2 N N N N

MIC μg/ml

Antibiotic Isolate 2 Isolate 9 Isolate 13 Isolate 14

Imipenem 8 8 64 32

Meropenem 4 4 8 8

Cloxacillin >512 >512 >512 >512

E. aerogenes, E. cloacae, K. pneumoniae, S. enterica, S. marcescens OmpF OmpC porin kaybı Amg, β-laktam, kloramfenikol, florokinolon

İlaç Permeabilitesinde Azalma: Kazanılmış Direnç

Antimikrobiyal ilaçların aktif efluksu

• Fosfotransferaz (translokasyon) sistemlerinin kontrolunda

• Enerji bağımlı integral membran proteinleri

• İlacın intraselüler konsantrasyonunu azaltırlar

Membran Transportu • Polar ve apolar gruplar içeren bileşikler membranı kolay geçer

Kolay difüze olabilen bir bileşik hücre için zaralı olabilir

Sitoplazmik membran

Aktif Transport Sistemleri

Kolay difüze olan moleküllere karşı doğal korunma

C

C

C

OH

NO2

H

H

OH

H

N

H

C

O

CHCl2

apolar

polar Ampifilik Ab.

Gram-Pozitiflerde Aktif Transport Sistemleri

14

Gram NegatiflerdeAktif Transport Sistemleri

15

Aktif Transport Sistemleri

Primer

• ABC transport sistemleri (ATP-binding cassette)

• ATP hidrolizi

Sekonder

• İlaç transportuyla eş zamanlı olarak H+ veya Na+’ın translokasyonunu katalizlemek üzere respirasyonla oluşturulan katyon-gradiyent enerji

Sekonder Aktif Transport Sistemleri

• Major facilitator süper ailesi (MFS)

• Small multidrug resistance süper ailesi (SMR)

• Multidrug and toxic compound extrusion’ (MATE) süper ailesi

• Resistance-nodulation-cell division (RND) süper ailesi

Aktif Efluks: Klinik Önem

Gram Pozitif Bakteriler

Gram Pozitif - İlaç Efluksu

Staphylococcus aureus

• NorA, MsrA, QacA

Streptococcus pneumoniae • PmrA, EmeE, MefA/E

Substratları

• Florokinolonlar

• Makrolidler

• Dörtlü amonyum bilesikleri

Klinikte önemli direnç

S. aureus NOR CIP NAF VAN

CLSI 16 4 8 32

BSAC 2 8

SA1199 0.5 0.5 0.5 0.5

SA1199B 64 16 0.5 0.5

SA1199-3 16 4 0.5 0.5

Staphylococcus aureus NorA

Gram Pozitif - İlaç Efluksu

Enterococcus faecalis EmeA

• NorA ile yakın homoloji

Florokinolonlar

Makrolidler

Kloramfenikol

Novobiyosin

Amikasin

Gram Pozitif - İlaç Efluksu

• Streptococcus pyogenes MefA

Makrolidler

• Streptococcus agalactiae MreA Kloramfenikol

Makrolid

Gram Pozitif - İlaç Efluksu

Plazmid kontrolu

• QacA, QacB ve Tet(K)

Kinolonlar

Tetrasiklinler

Monovalan/divalan antimikrobiyal katyonlar (boyalar, dörtlü amonyum bileşikleri, diamidinler, biguanidinler)

• S. aureus’ta QacA (MFS)

Amikasin, kloramfenikol

Aktif Pompa: Klinik Önem

Gram Negatif Bakteriler

Gram-Negatif Bakteriler

ABC, MFS, MATE, SMR, RND RND ailesi: Çoklu ilaç direnci E. coli AcrAB-TolC P. aeruginosa MexAB-OprM

• Kromozomal • Doğal ve kazanılmış direnç • Membran Füzyon Proteini ve Dış Membran

Proteini ile kompleks

RND: Enterobacteriaceae

Escherichia coli • AcrAB-TolC • AcrAD-TolC • AcrEF-TolC • MdtABC-TolC • YhiUV-TolC

Enterobacter aerogenes • AcrAB-TolC Salmonella enterica serovaryant typhimurium • AcrAB-TolC

P. vulgaris, K. pneumoniae, S. marcesens AcrAB homologları

TolC

Periplazma

İM

AcrA

DM

AcrB RND pompa proteini

İlaç

• Lipofilik Beta-laktamlar

• Kloramfenikol • Florokinolon • Makrolid • Novobiyosin • Fusidik asit • Sodyum dodesil

sulfat • Trimetoprim/sulfa.

Substratlar AcrAB-TolC

• Safra tuzları • Organik çözücüler • Benzalkonyum • Metotreksat • Etidyum bromid • Akriflavin • Kristal viyole • Triklozan • Triton-X100

E. coli CIP CHL TET CO-TRIM

CLSI 4 32 16 4/16

BSAC 8 16 2 4

WT(W3110) 0.015 8 1 >32

tolC:: 0.0025 1 1 1

acrAB:: 0.0025

1 0.12 16

acrD:: 0.015 8 0.12 >32

acrEF:: 0.0025

1 1 >32

S. enterica serovar T

NA CIP TET C TRIC

CLSI 32 4 ? 16 32

BSAC 16 2 ? 2 16

WT(SL1344) 4 0.06 4 4

acrB: 1 0.015 2 0.5

acrB +++ 32

0.5 16 16 0.5

acrD:: 4 0.03 4 4 0.06

acrF:: 4 0.06 4 1 0.12

TolC:: 1

0.015 0.5 1 0.015

RND: S. enterica serovar Typhimurium

RND: Diğer Gram negatifler

Haemphilus influenzae • AcrAB-TolC Neisseria gonorrhoeae • MtrCDE (N. meningitidis’ te homolog) Campylobacter jejuni • CmeABC • CmeDEF Vibrio cholerae • ??-TolC Francisella tularensis, Yersinia pestis, Brucella spp. AcrAB-TolC homologları

• Florokinolon • Ampisilin • Kloramfenikol • Nalidiksik asit • Sefotaksim • Gentamisin • Rifampisin • Etidyum bromid • Akridin • Protamin • Sodyum dodesil

sulfat • Deoksikolat

CmeABC MtrCDE • Florokinolon • Azitromisin • Makrolid • Rifampisin • Etidyum bromid • Kristal viyole • Yağ asitleri • Triton-X-100

C. jejuni CIP E AMP TET C TRIC

CLSI 4 8 32 16 32

BSAC 1 16 2 8

WT 0.25 0.5 4 0.5 1 4

cmeB:: 0.12 0.25 2 0.25 0.5 1

cmeB +++ 8

4 32 16 16 32

cmeF:: 0.25 0.5 0.5 0.25 1 1

RND: Campylobacter jejuni

Pseudomonas aeruginosa - RND

• MexAB-OprM

• MexCD-OprJ

• MexXY-OprM

• MexEF-OprN

• MexJK-OprM

• MexGHI-OpmD

C Kourtesi. The Open Microbiology Journal, 2013; 7 (Suppl 1-M3): 34-52. JT Floyd.Recent Res. Devel. Membrane Biol, 3, 2013: 15-66 ISBN: 978-81-308-0529-0 L Avrain. www.cli-online.com

P. aeruginosa: MexAB-OprM

• İntrinsik direnç Tetrasiklin, makrolid, kloramfenikol,

norfloksasin, -laktam • Yüksek düzey direnç -laktamlar (inhibitörler dahil), meropenem,

kinolonlar, makrolidler, tetrasiklin, kloramfenikol, novobiyosin, sulfonamidler, trimetoprim, boyalar, deterjanlar

• İmipeneme etkisiz • N-açil homoserin (elastaz, piyosiyanin)

laktonların efluksu

RND: Pseudomonas aeruginosa

Yüksek düzey ekspresyon • MexCD-OprJ Kinolon, tetrasiklin, makrolid, trimetoprim,

kloramfenikol, sefalosporin. • MexEF-OprN Kinolon, kloramfenikol, trimetoprim,

imipenem (OprD azalması) • MexXY-OprM Aminoglikozid direnci

P.aeruginosa CIP E AMP TET

CLSI 512 4 32 16

BSAC 256 8 8 2

WT (PAO1) 64 0.12 64 16

mexAB-M:: 0.5 0.03 2 1

MexAB-M +++ 256 0.25 256 64

MexAB-M +++ 128 1 256

mexCD-OpRJ 0.002 1 0.12

mexXY-OpRM 0.25 512 64

mexXY-OprM +++

0.5 8 32

RND: Pseudomonas aeruginosa

RND: Acinetobacter baumannii

• AdeABC

Aminoglikozid, β-laktam, florokinolonlar, tetrasiklin, tigesiklin, eritromisin, kloramfenikol, trimetoprim

• AdeIJK

• AdeFGH

39

C Kourtesi, AR Ball, YY Huang, et al. The Open Microbiology Journal, 2013; 7 (Suppl 1-M3): 34-52. T Dal, B Aksu, JM Pages, U Over-Hasdemir. JAC. 2013; 68:1200-11

A. baumannii GEN NET OFX CTX MEM TET

CLSI 16 32 8 64 16 16

BSAC 2 4 16 4 2

BM4454 8 64 16 64

BM adeB:: <0.25 4 4 8

U10247 2 8 0.5 2

U11177 16 64 2 32

RND: Acinetobacter baumannii

Stenotrophomonas maltophilia RND

SmeAB-C Florokinolon

Beta-laktam

AgM

SmeDE-F Florokinolon

Eritromisin

Tetrasiklin

Organik çözücüler

41

Burkholderia spp. RND

Burkholderia cepacia

CeoAB-OprM Kloramfenikol

Florokinolon

Trimetoprim

B. pseudomallei, B. mallei

BpeEF-OprC

Trimetoprim direnci

B. cenocepacia

Bcc kompleks L Nicole AAC, 2013; 57:4381

42

Bacteroides fragilis RND

mex lokusları ile filogenetik ilişki

BmeABC

Metranidazol

Kinolon

Karbapenem

Ve bir çok antibiyotiğe direnç

43

E. coli ABC MacAB-TolC ML

MFS EmrAB-TolC NA, CCCP, EB,TL

MFS MdfA/Cmr/CmlA C, PU, RF, T, EB,

RD,TPP, IPTG

MFS Tet TS

MATE YdhE FK, AK, TTP

SMR EmrE AK, EB, DAB, MV

V. chole.. MFS VceAB NA, DK, PKP, CCCP,

PMA

MATE VcmA FK, C, S, AK, DA, DO,

EB

V. phaemo.. MATE NorM FK, C, S, EB

P.aerugin.. SMR EmrE AG, AK, EB

B.cepa... MFS BcrA T, NA

B. theta.. MATE BexA FK, EB

B. fragilis MFS NorA NOR, EB, PM

Diğer Çoklu Direnç Pompaları

Mikobakterilerde ilaç efluks sistemleri

• MFS ve ABC efluks sistemleri yaygın

• SMR nadir

• RND çok yeni saptandı

JT Floyd. Recent Res. Devel. Membrane Biol, 3, 2013: 15-66 ISBN: 978-81-308-0529-0. C Kourtesi. The Open Microbiology Journal, 2013; 7 (Suppl 1-M3): 34-52.

Mycobacterium tuberculosis

MFS ailesi • Rv1634 Florokinolon • Tap ve P55 Aminoglikozid ve tetrasiklin • EfpA İzoniazid, siprofloksasin,

norfloksasin, gentamisin

• JefA İsoniazid ve etambutol ABC • DrrAB Tetrasiklin, eritromisin,

etambutol, norfloksasin, streptomisin, klormafenikol, antrasiklin daunorubisin, doksirubisin direnci

Mycobacterium tuberculosis

RND • MmpL7 İzoniyazid • MmpL5 Azol direnci SMR • Mmr Etidyum bromid,

Eritromisin, Akriflavin,tetrafenil fosfonyum,

safranin O ve pironin Y

Mycobacterium spp.

M. smegmatis MFS LfrA FK, EB

M. fortiutum MFS Tap AgM, T

Mantarlarda ilaç efluks sistemleri

Saccharomyces cerevisiae

İlaç direncinin kaynağı

Candida albicans

CaCdr1p, CaCdr2p (ABC)

S. cerevisiae Pdr5p ve memeli G-tip efluks ile ilişkili

CaMdr1p (MFS)

AZOL DİRENCİ RD Cannon. Microbiology, 2007; 153: 3211-3217. C Kourtesi. The Open Microbiology Journal, 2013; 7 (Suppl 1-M3): 34-52

Biyofilm ve efluks sistemleri

Planktonik hücrelere kıyasla antimikrobiyal ilaçlara daha dirençliler Pseudomonas aeruginosa MexAB-OprM ekspresyonu biyofilmde çok yüksek Aztreonam, gentamisin, tetrasiklin, ve tobramisin direnci PA1874-1877 efluks sisteminin ekspresyonu biyofilm içindeki hücrelerde çok yüksek

SM Soto. Virulence, 2013; 4:3, 223-229.