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Profesor Patrocinante Dr. Rodolfo Amthauer M. Instituto de Bioquímica Facultad de Ciencias
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE POLIPÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS DE CHORO
ZAPATO (Choromytilus chorus)
Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Bioquímica y Título Profesional de Bioquímico
MAURICIO ALEJANDRO HERNÁNDEZ CEA
VALDIVIA – CHILE 2008
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar agradeceré al Dr. Amthauer por recibirme en su grupo de trabajo y
haber confiado en mí, entregándome las herramientas necesarias para mi formación
como bioquímico y persona. Le agradezco mucho a la Dra. Margarita Concha que fue al
igual que el Dr Amthauer clave en mi formación, con sus consejos y apoyo en lo
académico como en lo personal. También un agradecimiento especial a la profesora
Julieta Villanueva que nos estrego gratos momentos en el laboratorio y también una
gran ayuda al principio de este trabajo.
También les debo un agradecimiento a mis compañeros de laboratorio (Jorge, Ella,
Jackie, Bruno, Alin, Franz, Carlos Álvarez y Oyarzún)
También al laboratorio Vit C dirigido por la Dra. Ilona que nos facilito equipamiento para
el desarrollo de este trabajo, al igual que el laboratorio de enzimología, en especial al
Dr. Joel Asenjo que nos dio su valiosa ayuda en la purificación de proteínas que fue
crucial para el desarrollo este trabajo.
Entrego mis agradecimientos al Instituto de Biología Marina de la Universidad Austral de
Chile, en especial al Dr. Chaparro junto a su grupo de trabajo, que nos facilito las
instalaciones para la mantención de los especímenes, que fueron cruciales para la
realización de este trabajo.
También agradezco al Instituto de Embriología, y a todos sus académicos y en
particular al Dr. Oscar Goicoechea que nos facilitaron espacio físico y materiales en los
momentos difíciles, como fue el incendio de la Facultad de Ciencias.
A la Dra. Marcia Costa que nos facilito infraestructura y material para el cultivo de
bacterias en la última etapa de esta tesis.
Silvana a ti te agradezco ya que me has acompañado y cuidado durante esos últimos 2
años, te quedabas conmigo hasta tarde en el laboratorio acompañándome con una
paciencia y me apoyaste en todas mis ideas locas.
Para finalizar a mis padres que sin ellos no estaría escribiendo estas palabras, les
agradezco todo lo que en estos momentos soy y seré.
También tengo que recordar a mis amigos y familiares que confiaron en mí y siempre
me apoyaron.
Esta tesis fue financiada por DID-UACH S-200719 y FONDECYT 1050637
i
INDICE DE CONTENIDOS
Página
1. RESUMEN 1
1.1. SUMMARY 3
2. INTRODUCCIÓN 5
3. MATERIALES Y MÉTODOS 13
3.1. Materiales 13
3.1.1. Reactivos 13
3.1.2. Equipos 14
3.2. Métodos 16
3.2.1. Animales de experimentación 16
3.2.2. Microorganismos 16
3.2.3. Obtención de hemolinfa 16
3.2.4. Obtención de extractos ácidos 19
3.2.4.1. Hemocitos 19
3.2.4.2. Plasma 19
3.2.5. Extracción en fase sólida 19
3.2.6. Ensayos actividad antimicrobiana 20
3.2.7. Desafío experimental de animales con E. coli
inactivadas por calor. 21
3.2.8. Electroforesis en geles de poliacrilamida,
electrotransferencia y Westernblot 21
3.2.8.1. SDS-PAGE 21
3.2.8.2. Electrotransferencia 22
ii
3.2.8.3. Western Blot 23
3.2.8.4. Inmunodetección en gota (dot-blot). 24
3.2.8.5. Pre absorción de anticuerpo anti-KLH 24
3.2.9. Determinación de concentración de proteínas por
método de Bradford 25
3.2.10. Aislamiento de la proteína mayoritaria de la hemolinfa
de C. chorus (pMHCC) por cromatografía de Ni2+-
IMAC.
25
3.2.11. Cromatografía de exclusión en gel 26
3.2.11.1. Cromatografía columna Superdex 200 HR. 26
3.2.11.2. Cromatografía columna Trysacril GF05 27
3.2.12. Frotis y tinción de May-Grünwald Giemsa 27
4. RESULTADOS 29
4.1. Obtención de extractos ácidos de plasma de C. chorus. 29
4.2. Obtención de extractos ácidos desde hemocitos de C.
chorus. 34
4.3. Cinética de aparición de actividad antimicrobiana en
hemolinfa post-infección. 36
4.4. Análisis de las proteínas de la hemolinfa de C. chorus. 38
4.5. Aislamiento de la proteína mayoritaria de la hemolinfa de C.
chorus (pMHCC). 40
4.6. Actividad antimicrobiana de la proteína pMHCC 42
4.7. Caracterización parcial de la proteína mayoritaria de la
hemolinfa (pMHCC). 45
iii
4.8. Inmuno-detección de la proteína MHCC con anticuerpos anti
hemocianina de C. concholepas. 48
4.9. Identificación de hemocitos de C. chorus por morfología y
tinción. 52
4.10. Características de los hemocitos en C. chorus desafiados
con E. coli inactivadas por calor.. 56
5. DISCUSIÓN 61
6. CONCLUSIONES 79
7. BIBLIOGRAFIA 81
iv
INDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1
Punción del músculo abductor de C. chorus para la obtención de
hemolinfa
18
Figura 2
Esquema resumido de todo el procedimiento experimental
realizado en este trabajo.
28
Figura 3
Perfil de elusión y evaluación de la actividad antimicrobiana de las
fracciones obtenidas en la extracción en fase sólida.
30
Figura 4
Evaluación de la actividad antimicrobiana del material no retenido
en la columna Sep-Pak C18 y la fracción del lavado reliofilizada.
32
Figura 5
Eliminación de sales por cromatografía en Trysacril G045 y
evaluación de la actividad antimicrobiana.
33
Figura 6
Perfil de elusión y evaluación de la actividad antimicrobiana de las
fracciones obtenidas en la extracción en fase sólida de hemocitos.
35
Figura 7
Cinética de aparición de actividad antimicrobiana en hemolinfa
post-infección con E. coli DH-5α.
37
v
Figura 8
Separación de las proteínas del plasma de hemolinfa de 4 especies de
bivalvos.
39
Figura 9
Perfil de elución de plasma de Hemolinfa de C. chorus sometida a Ni2+-IMAC
y desalado.
41
Figura 10
Evaluación de la actividad antimicrobiana del plasma a distintos pH. 43
Figura 11
Actividad antimicrobiana de pMHCC purificada a distintos pH con 50µM
de Zn2+ y sin presencia de Zn2+.
44
Figura 12
Determinación del peso molecular en condiciones nativas por
cromatografía exclusión en gel con la resina Superdex 200.
46
Figura 13
Aislamiento de la proteína MHCC desde la fracción correspondiente al
V0 obtenido de la cromatografía de exclusión en gel.
47
Figura 14
inmuno-detección de hemocianina del plasma de C. chorus. 50
Figura 15
Inmuno-detección de hemocianina del plasmas de 4 especies de
bivalvos chilenos.
51
Figura 16
Tipos de hemocitos presentes en la hemolinfa C. chorus.
53
vi
Figura 17
Vistas de los campos ópticos en distintas horas post-desafío. 57
Figura 18
Activación de granulocito basófilo. 58
Figura 19
Distintos tipos de hemocitos encontrados en especímenes desafiados. 60
Figura 20
Modelo hipotético de acción de los componentes inmunes en C.
chorus.
78
vii
INDICE DE TABLAS
Página
Tabla I
Tamaños de distintos tipos de hemocitos obtenidos desde
distintas especies de bivalvos.
55
viii
LISTAS DE ABREVIATURAS
ACN Acetonitrilo
BCIP 5- bromo-4-cloro-3-indolilfosfato
BLUE-carrier Hemocianina de Concholepas concholepas
BSA Albúmina sérica de bovino
C. chorus Choromytilus chorus
Cg-Defensin Defensina C. gigas
EDTA Ácido etiléndiamino tetracético
FPLC Cromatografía liquida de mediana presión (Fast
Protein Liquid Chromatografy)
HPLC Cromatografía liquida de alta presión (High
Performance Liquid Chromatografy)
HRG Glicoproteína rica en histidinas (Histidine-rich
glycoprotein)
IgG Inmunoglobulina G
IMAC Cromatografia de afinidad a metales (Ion metal
afinity chromatografy)
KLH hemocianina de lapa (Keyhole limpet
hemocyanin)
LB Medio de cultivo líquido Luria-Bertani
L-DOPA L-Dopamina
LPS Lipopolisacarido
MAPK Proteínas quinasas activadas por mitógenos
ix
MES ácido 2-(N-morfolino) etanosulfonico
M-H Medio de cultivo Müeller-Hinton
MG-G May-Grünwald-Giemsa
NF-κB Factor nuclear- kappa B
NBT Nitroazul de tetrazolio
DO Densidad óptica
pMHCC Proteína mayoritaria de la hemolinfa de
Choromytilus chorus
PBS Tampón fosfato salino
PIPES Piperazina-1,4-bis(ácido 2-etanosulfonico)
PMSF Fluoruro de sulfonilfenilmetano
proPO Profenil-oxidasa
PO fenil-oxidasa
PSA Persulfato de amonio
ROS Especies radicales oxígeno (Radical Oxigen
Species)
SDS Dodecil sulfato de sodio
TEMED N,N,N´,N´-tetrametiletilendiamina
TFA Ácido tri-fluoro-acético
Tris Tris (hidroximetil) aminometano
UV Ultravioleta
ufc Unidades formadoras de colonias.
1
1. RESUMEN Los invertebrados marinos, como los bivalvos, dependen exclusivamente de su
sistema de inmunidad innata para hacer frente a las agresiones de patógenos. En
mitílidos del Atlántico se ha demostrado que los hemocitos presentes en la hemolinfa
sintetizan una variedad de péptidos antimicrobianos, los que son secretados a la
hemolinfa. En mitílidos endémicos de las costas de Chile los componentes del
sistema de inmunidad innata no han sido caracterizados, por ello en este estudio se
evaluó la actividad antimicrobiana de componentes de la hemolinfa de choro zapato
(Choromytilus chorus).
Es así que, utilizando las clásicas extracciones ácidas y en fase sólida para aislar
péptidos antimicrobianos de hemolinfa, hemos detectado una potente actividad
antibacteriana en fracciones que presentan muy baja y mediana hidrofobicidad.
Estos resultados indican que en el choro zapato existirían péptidos antimicrobianos
con características distintas a los descritos en otros mitílidos.
Por otra parte, se estudió la población de hemocitos por tinción con May-Grünwald-
Giemsa observándose al igual que lo descrito para otros mitílidos hemocitos
basófilos, eosinófilos granulares e hialinos. A su vez ensayos de desafío mostraron
un cambio en la morfología de los hemocitos observándose degranulación, y
aparición de un pigmento café correspondiente a melanina. Esta melanina es
sintetizada mediante un mecanismo ancestral de defensa llamado reacción de la
profeniloxidasa.
Por otra parte, la proteína más abundante de la hemolinfa de C. chorus tiene una
masa relativa de 75 kDa contrastando con lo descrito en otros mitílidos donde
predomina una proteína de 37 kDa. Esta proteína se aisló por Ni-IMAC, lo que indica
2
que podría corresponder a la familia de proteínas ricas en histidina (HRG), descritas
en otros mitílidos. A su vez, por cromatografía de filtración en gel en condiciones
nativas esta proteína mayoritaria de la hemolinfa posee un peso molecular aparente
por sobre 1 MDa. Adicionalmente, esta proteína se inmunodetectó por Western blot
con anticuerpos anti hemocianina de lapa y de C. concholepas, por lo que esta
proteína también podría poseer características de una hemocianina.
Interesantemente esta putativa HRG-Hemocianina de choro zapato exhibe actividad
antibacteriana, lo que se siguiere que podría ser un componente del sistema de
inmunidad innata.
3
1.1. SUMMARY Marine invertebrates, like bivalves depend exclusively on their innate immunity
system to deal with pathogen challenges. In Atlantic mussels it has been shown that
hemocytes present in haemolymph, synthesize a variety of antimicrobial peptides,
which are released to haemolymph. In endemic mussels of the Chilean coasts, the
innate immune system has not been characterized, therefore, the antimicrobial
activity of haemolymph components of C. chorus was evaluated in this work.
Using the classic acid and solid phase extractions to isolate antimicrobial peptides
from haemolymph, we detected a powerful antibacterial activity in fractions which
present very low and medium hydrophobicity These results indicate that in C. chorus
would contain antimicrobial peptides with different features than those described in
other mussels.
Using May-Grünwald-Giemsa staining haemocytes population was studied and as
well as in the other mythilids, basophylic, granular eosinophylic and hialine, were
observed. In addition, hemocytes in animals challenged whith E. coli significant
morphology change in haemocytes, including degranulation and appearence of a
brown pigment, corresponding to melanin were observed. This brown melanin is
synthesized by an ancient defense mechanism called the prophenoloxidase reaction.
On the other hand, the most abundant protein of haemolymph of C. chorus has a
molecular weight of 75 kDa, contrasting with what was described for other mussels,
in which a 37 kDa protein is the predominant. This protein was isolated by Ni-IMAC
chromatography, which indicates that it may belong to the Histidine Rich
Glycoprotein family (HRG), described in other mussels. The apparent molecular
weight for this protein determined by gel filtration chromatography under native
conditions was more than 1 MDa. Immunodetection of this protein with anti-key hole
4
limpet and C. concholepas haemocyanin antibodies by Western blot, suggests that
this protein may have haeomcyanin features. Interestingly, this putative HRG-
haemocyanin from C. chorus exhibits antibacterial activity, suggesting that it may be
a component of the innate immunity system.
5
2. INTRODUCCIÓN Los animales y las plantas han logrado sobrevivir en coexistencia con
microorganismos, muchos de ellos potencialmente patógenos, con un sorprendente
índice de supervivencia gracias a las diversas estrategias de defensa que han
desarrollado. Estas estrategias incluyen los mecanismos de inmunidad innata y una
forma más evolucionada conocida como inmunidad adquirida, esta última presente
sólo en vertebrados (Montaño y Vargas, 2002). El sistema inmune adquirido
proporciona una respuesta específica contra invasores presentes en el organismo,
mediada por la producción de anticuerpos y linfocitos activados, donde el tiempo y
especificidad de la respuesta varía de acuerdo al estado evolutivo del sistema
inmune (Du Pasquier, 2005; Pancer y Cooper, 2006).
La inmunidad innata constituye un mecanismo ancestral presente tanto en el reino
animal como vegetal (Ausubel, 2005). Este sistema inmunitario es de acción
inmediata y con mecanismos inespecíficos de reconocimiento del patógeno,
llevando a cabo respuestas tales como fagocitosis, activación de la coagulación,
formación de nódulos, encapsulación de patógenos, aglutinación y opsonización.
Además, se ha demostrado recientemente que el sistema inmune innato también
juega un papel regulatorio de la respuesta inmune adquirida (Janeway y Medzhitov,
2002; Pasare y Medzhitov, 2004).
Los mecanismos de defensa inespecíficos de los invertebrados están formados por
dos componentes claramente bien diferenciados: el celular, y componentes solubles
o humorales.
El componente celular en moluscos está representado por los hemocitos, los cuales
además de su rol defensivo también están involucrados en otras funciones,
6
incluyendo digestión (activación de hidrolasas lisosomales), transporte de
metabolitos, reparación de las valvas (Spark y Morado, 1988; Travers y col, 2008).
Los bivalvos dependen exclusivamente de la inmunidad innata para defenderse de
los organismos invasores. Estos mecanismos se han mantenido exitosos hace
milenios ya que estos moluscos son afectados por muy pocas enfermedades. Es
importante destacar que estos organismos viven en un medio poluto y rico en
bacterias (Parisi y col 2008).
En moluscos bivalvos, los órganos son bañados por la hemolinfa y hemocitos los
cuales son libres de viajar dentro de las cavidades corporales, proporcionando una
amplia oportunidad de detección de microorganismos invasores. Estos hemocitos
son capaces del reconocimiento mediado por lectinas (Pipe, 1990a; Renwrantz y
col., 1985), y de la migración quimiotáctica hacia los agentes patógenos invasores
(Cheng y Howland, 1979; Andrew y Insall, 2007), seguido por la endocitosis de
agentes patógenos (Bayne, 1990), al igual que, la liberación de material
antimicrobiano, activación del sistema profeniloxidasa (proPO), encapsulación e
iniciación de procesos inflamatorios.
En invertebrados, las injurias mecánicas o la presencia de objetos extraños, como
parásitos y microorganismos, resultan en la deposición de melanina a lo largo del
tejido dañado o el objeto invasor. La melanina sirve como una barrera mecánica
contra el intruso e incluso previene o retarda su crecimiento, pero también hay un
evento muy importante durante la formación de melanina, que es la producción de
intermediarios altamente reactivos y tóxicos de quinonas. La forma activa de la
enzima profenil-oxidasa (PO) es la responsable de estos procesos (Cerenius y
Söderhäll, 2004).
7
La activación de proPO es gatillada por patrones moleculares asociados a
patógenos como β-1,3-glucanos, lipopolisacarido (LPS) y peptidoglicano, como
también por factores endógenos que son producidos cuando hay daño de los tejidos
(Söderhall y Cerenius, 1998). Una cascada de serinoproteasas, (la cual aún no ha
sido caracterizada completamente), provoca el clivaje de la pro-forma, que es la
enzima activadora de profenoloxidasa (pro-ppA), lo cual libera y activa a ppA que es
capaz de clivar a proPO activando directamente a feniloxidasa (PO). La PO cataliza
la reacción que convierte a L-Dopa en melanina. La enzima activa además puede
catalizar la oxigenación de monofenoles a o-difenoles y algunas veces la oxidación
de o-difenoles a o-quinonas (Ashida y Brey, 1998).
Al mostrar las características de los hemocitos también cabe destacar los tipos de
hemocitos presentes en la hemolinfa.
Su clasificación ha generado una gran controversia por la disparidad de resultados y
clasificaciones contradictorias. La clasificación más aceptada de hemocitos en
moluscos fue establecida por Cheng en 1981, en la que se describen 2 tipos de
hemocitos; Hialinocitos, caracterizándose por contener muy pocos gránulos o
carecer de ellos, y los granulocitos, los cuales poseen gran cantidad de gránulos y
pueden ser de característica basófila o acidófila. Estos últimos presentan un núcleo
excéntrico.
En bivalvos sólo existe consenso en 2 grandes tipos celulares: Basófilos y
Eosinófilos (Cheng, 1981); a su vez, estos se dividen en granulares y agranulares.
Otro tipo celular que se presenta constantemente en los bivalvos y moluscos en
general son los Hialinos, para los cuales no se ha precisado bien los parámetros de
identificación (Mix, 1976; Cheng y Foley, 1975; Cheng, 1981; Auffret, 1988; Suresh y
Mohandas, 1990; Pipe, 1990a; Kumazagua y col, 1991).
8
En mitílidos, como por ejemplo Mytilus edulis, los hemocitos también se clasifican en
basófilos y eosinófilos (Friebel y Renwrantz, 1996; Wootton y col, 2003a). Entre los
hemocitos circulantes de la hemolinfa también encontramos el hialino (agranular) y
las células granulares. Estos dos poseen la capacidad de fagocitar, agregarse,
formar pseudópodos, y producir especies reactivas de oxigeno (Cima, y col 2000).
En estudios realizados en bivalvos mitílidos se ha descrito que los hemocitos
granulares contienen dos tipos de gránulos, distinguibles por su tamaño, coloración,
características tintoriales (MG-G), contenido de lectinas y de enzimas (Pipe, 1990a,
b). La presencia de una serie de enzimas hidrolíticas incluyendo proteinasas,
glicosidasas y sulfatasas en el seno de grandes gránulos sugiere que éstos son una
forma de lisosoma (Pipe, 1990b).
Además de las células libres, la hemolinfa contiene diversas sustancias
biológicamente activas, incluidas las proteínas citotóxicas de alta masa molecular
capaces de lisar eritrocitos de vertebrados (Hubert y col, 1997), como por ejemplo la
hemocianina, la cual es la proteína responsable del transporte de oxígeno en la
hemolinfa en invertebrados. En moluscos esta proteína también posee actividad
profenil-oxidasa (proPO) cuyo producto final es la melanina molécula y que posee la
función de ser una barrera mecánica para los patógenos, facilitando así su
fagocitosis por parte de los hemocitos (Nagai y col., 2001; Siddiqui y col 2006). En
estos últimos años en crustáceos se le ha descrito otra función a la hemocianina,
cual es, la de generar especies reactivas de oxígeno (Jiang y col., 2007) y a su vez
liberar péptidos antimicrobianos a la hemolinfa por clivaje de su carboxilo terminal
(Destoumieux-Garzón y col., 2001). En mamíferos también encontramos proteínas
antimicrobianas presentes en el plasma. Por ejemplo, en humanos la glicoproteína
rica en histidina o HRG (histidine-rich glycoprotein), la cual es una proteína de 75kDa
9
cuya principal función es el transporte de metales en el plasma, y que juega un rol
crucial en la coagulación. Esta también posee actividad antimicrobiana per se contra
bacterias gram negativas y positivas (Rydengård y col., 2007); a su vez libera
péptidos ricos en histidina (Kacprzyk y col., 2007), y su actividad es potenciada a pH
ácidos y en presencia de Zn2+ (Rydengård y col 2006). En moluscos bivalvos esta
proteína también se encuentra presente (Abebe y col., 2007). Por ejemplo, en M.
edulis se ha descrito que posee una masa de 63 kDa y que consiste en 3
subunidades de 35, 37 y 39 kDa (Nair y Robinson, 1999). Se la ha relacionado con
funciones de transporte de metales, más específicamente con unión de cadmio y
otros metales bivalentes (Nair y Robinson, 2001; Devoid y col., 2007).
Otro componente importante de la inmunidad innata son los péptidos
antimicrobianos, los cuales constituyen un medio rápido no específico para combatir
una amplia variedad de bacterias, hongos, virus e incluso protozoarios (Montaño y
Vargas, 2002; Wootton y col., 2003a; Gordon y Romanowski, 2005). En términos
generales los péptidos antimicrobianos son de baja masa, usualmente menores a 10
kDa, y están codificados en el genoma. En base a la información de la gran cantidad
de péptidos antimicrobianos aislados, identificados y caracterizados de distintas
especies, éstos se han agrupado en distintas clases considerando sus
características estructurales y bioquímicas: i) péptidos en los cuales predomina la
estructura de α-hélice, ii) péptidos en los cuales predomina la estructura de hoja β-
plegada, iii) péptidos ricos en cisteína, iv) péptidos con un alto contenido de un
aminoácido (Tincu y Taylor, 2004; Reddy y col, 2004). A pesar de las variaciones de
estructura y tamaño entre los distintos tipos de péptidos antimicrobianos, la mayoría
de ellos comparten la característica de ser anfipáticos. Precisamente el mecanismo
de acción antibacteriana de estos péptidos se debe a esta característica estructural.
10
La estructura anfipática facilita la interacción del péptido con la membrana del
organismo donde actúa formando poros o rompiendo la integridad de la membrana
(Brogden, 2005).
Por otra parte, es preciso señalar que en especies de Mitílidos del océano Atlántico
se han aislados péptidos antimicrobianos desde la hemolinfa y hemocitos (Mitta y col
1999; 2000a; 2000b). Los péptidos aislados y caracterizados de las dos especies
estudiadas Mytilus edulis y Mytilus galloprovincialis han sido clasificados en cuatro
grupos de acuerdo a su estructura primaria: defensinas, mytilinas, myticinas y
mytimicina (Mitta y col., 2000b). Esta diversidad de péptidos se explicaría por el
espectro de actividad que presentarían los distintos péptidos. Las defensinas y
myticinas serían especialmente activas contra bacterias Gram-positivas y son mucho
menos activas contra bacterias Gram-negativas y hongos. Mytimicina es
estrictamente fungicida. Mytilinas presentan un espectro más amplio de acción, ya
que sus distintas isoformas ejercen acción sobre bacterias Gram-negativas y
positivas (Mitta y col, 2000b).
La aparición de un número creciente de bacterias resistentes a los antibióticos
convencionales se ha convertido en un problema médico muy serio y de graves
consecuencias. El desarrollo de nuevos antibióticos con mecanismos de acción
diferentes es una necesidad prioritaria para hacer frente a la resistencia de los
microorganismos. En este contexto, los péptidos antimicrobianos naturales se
visualizan como excelentes candidatos dado su amplio espectro de acción
antimicrobiana, toxicidad altamente selectiva y a la dificultad que tienen las bacterias
para desarrollar resistencia a estos péptidos (Marshall y Arenas, 2003; Gordon y
Romanowski, 2005).
11
Los océanos cubren alrededor del 70% de la superficie del planeta y contienen
aproximadamente entre 3 a 500 x106 especies, lo que representa la mitad de la
biodiversidad total (Haug y col, 2002). De este total de especies, solamente la
macrofauna marina comprende entre 0,5 a 10x106 especies (De Vries y Hall, 1994).
De esta forma, el medio ambiente marino, en especial los invertebrados marinos
cuyo sistema de defensa descansa solamente en el sistema de inmunidad innata,
constituye una espectacular fuente de nuevos polipéptidos antimicrobianos. Una
revisión bibliográfica revela que, a pesar que Chile exhibe una extensa costa de mar
que aloja una gran variedad de especies nativas y exclusivas de invertebrados
marinos, no se han realizado estudios sistemáticos de péptidos antimicrobianos en
estas especies.
En vista de estos antecedentes se decidió realizar esta investigación la cual tiene el
objetivo de Identificación, purificación, y caracterización de péptidos antimicrobianos
de la hemolinfa de Choro Zapato chileno.
La hipótesis plantea que la Hemolinfa de moluscos nativos chilenos como el Choro
Zapato constituya una fuente de nuevos polipéptidos antimicrobianos de potencial
uso biotecnológico.
Para lograr corroborar la hipótesis se efectuaron los siguientes objetivos específicos:
1. Establecer un protocolo para extraer Hemolinfa de Choro Zapato Chileno.
2. Detectar la presencia de actividad antimicrobiana en el plasma de la
hemolinfa y extractos de hemocitos.
3. Aislar péptidos o proteínas con actividad antimicrobiana del plasma de
Hemolinfa y extractos de Hemocitos.
12
4. Ensayar la actividad de él o los polipéptidos aislados frente a distintas cepas
bacterianas.
5. Caracterizar los péptidos o las proteínas identificados que presenten mayor
actividad antimicrobiana.
13
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 MATERIALES
3.1.1 Reactivos
Amersham Pharmacia Biotech: Superdex 200 HR.
BioRad Labs: Persulfato de amonio, Azul de Coomassie R-250, de Coomassie G-
250, Tween 20, Precision Plus Protein Standards Dual Stain, Marcador peso
molecular preteñido Kaleidoscopy peptide.
Biosonda: Blue-carrier (Hemocianina de C. concholepas), anticuerpo anti I-FABP de
carpa preparado con blue-carrier como carrier
Calbiochem: Benzamidina, Cocktail inhibidores proteasas (Aprotinina, Pepstatina,
Benzamidina, PMSF, Leucopeptina).
Costar: Microplacas 96 pocillos (polipropileno) estériles.
Difco: Medio Müeller Hinton.
Equilab: Etanol técnico, Metanol técnico, Isopropanol técnico.
Fluka-Chemica: Cloruro de potasio
Jackson Immuno Research: Anticuerpo anti-IgG de conejo producido en cabra
conjugado con fosfatasa alcalina.
J.T.Baker: Acido clorhídrico, glicina, acrilamida, Agua ultrapura (HPLC), acetonitrilo
calidad HPLC, Guanidinio-HCl.
Merck, Darmstadt, Alemania: Hidróxido de sodio, citrato de sodio, cloruro de sodio,
ácido acético, ácido etilendiaminotetracético (EDTA), fluoruro de sulfonilfenilmetano
(PMSF), metanol, etanol absoluto, fosfato monoácido de sodio, fosfato diácido de
potasio, N,N´-metilenbisacrilamida, agar-agar granulado (libre de inhibidores),
14
dodecilsulfato de sodio (SDS), N,N,N´,N´-tetrametiletilendiamina (TEMED), glicerol
87%, Acido trifluoroacético calidad HPLC, β-mercaptoetanol, azida de sodio,
glutaraldehido 25%, Proteinasa K, Sulfato de zinc, Imidazol, solución May Grünwald
(solución azul de metileno-eosina), solución Giemsa, glucosa, azul de bromofenol,
azul de dextrano.
Millipore: Microcon YM-10, Centricon YM-10 Filtro nitrocelulosa 0,2µm y 0,44µm.
Novagen: His-Binding Resin
Promega: Nitroazul de tetrazolium (NBT), 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato (BCIP).
PALL Biopharmaceuticals: Trisacryl GF05
Sigma Chemical Co. : azul de bromofenol, ácido amino caproico, Melitina (M2272),
IgG de conejo, MES sal de sodio, PIPES Buffer, Agarosa-KLH, Bicinchoninc Acid
Protein Assay Kit.
Sudelab: Ácido acético técnico, Etanol técnico
Waters Associates: Sep-Pak Vac C-18 3ml (500mg)
Winkler: Estándar de peso molecular para geles de poliacrilamida,
Tris(hidroximetil)aminometano (Tris), carbonato de sodio.
3.1.2 Equipos
Agitador magnético Nuova Stirrer Thermolyne; autoclave Orthman; balanza Scaltec
SPO61; balanza analítica Scaltec SBA33; espectofotómetro Shimadzu UV-150-02;
fuente de poder BRL Modelo 500 Life Technologies, Inc.; fuente de poder Apparatus
Corporation EC250-90 E-C; microcentrífuga M-24 Boeco, Germany; microondas
Somela; micropipetas Gilson P-1000, P-200, P-100, P-20, P-10; micropipetas
Eppendorf P-1000, P-100; micropipeta Nichipet Ex P-5000, P-2; microscopio óptico
Zeiss Axioskop 2; cámara digital Nikon DXM 1200; pHmetro Orion 3 Star; Vortex
15
mixer VM-300; bomba de vacío Air Cadet Cole-Palmer Instrument Co.; sistema de
filtración Advantec MFS, Inc; cromatógrafo de baja presión (FPLC) BioLogic LP
(BioRad); colector de fracciones modelo 2128 de BioRad; Bio-dot de BioRad;
centrífuga refrigerada RC-5 Superspeed Du Pont Instruments Sorvall, rotor GSA y
SS-34; centrífuga Savant modelo SVC 100-H, trampa de condensación refrigerada
modelo RT-100A, bomba de vacío Savant VP190, agitador Heidolph polimax 1040;
estufa Memmert BE-300 D-91126 FRG Germany, Bio-Freezer Forma Scientific Inc.
Model 8425 S/N 82612-291; BioImager FX de BioRad, (FPLC) AKTA Prime Plus
Amershan, cámara de flujo laminar Nuaire TM Class II, lector de microplacas
Thermolab system multiscan 2.
16
3.2 Métodos
3.2.1. Animales de experimentación
Los especímenes de Choromytilus chorus y Mytilus chilensis fueron adquiridos en la
feria fluvial de Valdivia. Aulacomya ater y Ostrea chilensis provenían de Chiloé
facilitados por el Dr. Oscar Chaparro, los cuales fueron estabilizados en estanques
con agua de mar natural con una salinidad aprox. de 30ppm, bajo condiciones
controladas de temperatura (14 ± 1º C), oxigenación y alimentación (Izocrysis
galbana 500 ml cada 24 h) y ciclos de luz día de 12 h, en instalaciones facilitadas
por el Instituto de Biología Marina, Universidad Austral de Chile. Las muestras
fueron obtenidas aleatoriamente sin distinción de sexo.
3.2.2. Microorganismos
Se utilizaron como modelo de bacterias Gram negativas E. coli DH5α y como Gram
positivas P. citreus; este último es utilizado como bacteria de referencia para el
estudio del mecanismo de acción de péptidos y proteínas con acción antimicrobiana.
3.2.3. Obtención de hemolinfa
Entre las válvas del espécimen se colocó un tubo eppendorf para evitar que las
válvas se cierren. Luego con una jeringa de 3 ml con una aguja 23G se puncionó el
músculo abductor anterior (Figura 1) extayendo la hemolinfa, a la cual se agregó
solución antiagregante (compuesta de Citrato de Sodio 27 mM, Cloruro de Sodio 336
mM, Glucosa 115 mM, EDTA 9 mM, pH 7) en proporción 1:1. La hemolinfa se
centrifugó inmediatamente a 700 x g por 15 min para separar los hemocitos del
17
plasma. Tanto el plasma como los hemocitos se mantuvieron a -70º C hasta su
utilización.
18
Figura 1: Punción del músculo abductor de C. chorus para la obtención de
hemolinfa. Se puncionó suavemente el músculo abductor con la aguja 23G y se
retiró la hemolinfa.
19
3.2.4. Obtención de extractos ácidos
3.2.4.1. Hemocitos
Para obtener extractos ácidos de hemocitos, éstos se resuspendieron en una
proporción 5:1 (v/v) en solución tampón Tris-HCl 50 mM pH 8,7 conteniendo NaCl
50 mM y se homogenizan con 30 golpes en un “Potter” teflón vidrio en hielo. El
homogenizado se centrifugó a 10.000 x g por 20 min a 4º C. El sedimento que
contienen los organelos se resuspendió agregando 3:1 (v/v) de ácido acético 2 M y
los péptidos se extrajeron por sonicación (3 veces por 30 segundos) en hielo.
Finalmente, el extracto se centrifugó a 10.000 x g por 20 min a 4º C para eliminar
restos no solubles y el extracto ácido se almacenó a -70º C hasta su uso.
3.2.4.2. Plasma
El plasma de hemolinfa obtenido se diluyó 1:1 (v/v) en agua ultra pura acidificada
con 0,1% de ácido trifluroacético, el pH es ajustó a 3,9 con 1 M de HCl. Luego de
incubar en baño de hielo por 30 min con agitación suave se centrifugó a 10.000 x g
por 20 min a 4° C y el sobrenadante se guardó a -70º C hasta su uso (Mitta y col.,
1999; Charlet y col., 1996).
3.2.5. Extracción en fase sólida
La extracción en fase sólida de los péptidos se realizó cargando los extractos ácidos
de organelos o los sobrenadantes plasmáticos preparados como se describió
anteriormente (3.2.3.1 y 3.2.3.2) en dispositivos Sep-Pack Vac C18 (3 cm3, 500 mg,
Waters Corporation, Milford, MA) equilibrados en agua acidificada con 0,05% de
ácido trifluoroacético. Luego de lavar con agua acidificada, se realizaron 3 eluciones
20
sucesivas con 5, 40 y 80% de acetonitrilo en agua acidificada. Las fracciones
obtenidas fueron liofilizadas en un Speed-vac y se reconstituyeron con 400 µl de
agua ultra pura (Mitta y col. 1999). Todos los pasos están esquematizados en la
Figura 2.
3.2.6. Ensayos actividad antimicrobiana
La actividad antimicrobiana de los extractos ácidos y proteínas purificadas se analizó
por una modificación del método de inhibición del crecimiento bacteriano en
microplacas utilizando distintas concentraciones de los compuestos a evaluar.
(Bulet y col., 1991; Friedrich y col., 1999; Concha y col., 2004).
Las suspensiones bacterianas se efectuaron, creciendo las bacterias, almacenadas
a -70º C, en medio sólido agar LB, M-H, aptos para el crecimiento de Escherichia coli
DH-5α y Planococcus citreus durante toda la noche a 37º C para E. coli y a 26º C
para P. citreus. Posteriormente se tomó una colonia aislada de la cepa y se creció
en medio liquido LB y M-H (dependiendo si se trataba de E. coli o de P. citreus
respectivamente) durante toda la noche hasta obtener fase estacionaria para E. coli
y 48 h para P. citreus. Una alícuota de este cultivo se diluyó 1:1.000 con medio
fresco y se le dejó incubando hasta la fase exponencial. Luego se centrifugaron las
bacterias a 2500 x g y se lavaron con NaCl 0,085% estéril para finalmente ser
resuspendidas en medio liquido de modo de obtener una concentración final de
1x107 ufc/ml.
Para el ensayo antimicrobiano se tomó una alícuota de 90 µl de la suspensión
bacteriana diluida 1:500 (2x104 ufc) y se incubaron sin (control) y/o con diferentes
cantidades de extractos ácidos y proteínas contenidas en un volumen de 10 µl.
21
Se dejó incubar en microplaca de polipropileno por 12 h para E. coli a 37º C y 24 h
para P. citreus a 27º C y se midió la absorbancia a 600 mn en un lector de
microplacas.
3.2.7. Desafío experimental de animales con E. coli inactivadas por calor
Previo al ensayo se estabilizaron 12 especímenes de C. chorus en agua de mar
filtrada por 2 semanas, Durante este periodo se mantuvieron y alimentaron como se
describió en 3.2.1
Para realizar el desafío se cultivó E. coli DH-5α en medio LB hasta obtener un valor
de absorbancia de 1 a 600 nm, luego se recuperaron las bacterias por centrifugación
y se lavaron con NaCl 0,085% (p/v) y el sedimento se resuspendió en PBS estéril y
se autoclavó (1 atm a 121º C por 15 min). Con este procedimiento se obtienen las
bacterias inactivadas por calor.
El desafío se realizó inyectando con una jeringa de 1 ml y una aguja 23G en el
músculo abductor de C. chorus un volumen de 100 µl de la suspensión bacteriana,
que correspondiera aproximadamente a 5x105 ufc/ml de E. coli. Se inyectó a un
grupo de C. chorus con 100 µl de agua de mar estéril como control. La población
desafiada y control se mantuvieron en contenedores separados.
3.2.8. Electroforesis en geles de poliacrilamida, electrotransferencia y Western
blot
3.2.8.1. SDS-PAGE
Las proteínas de la hemolinfa fueron separadas por SDS-PAGE al 12,5% según lo
descrito por Laemmli (1970). Se utilizó un gel separador con la siguiente
composición: 12,5% (p/v) de poliacrilamida, tampón Tris-HCl 0,375 M (pH 8,8); SDS
22
0,1% [p/v]; persulfato de amonio 0,03% [p/v] y TEMED 0,1% [v/v]. Una vez
polimerizado el gel separador, se preparó un gel espaciador sobre éste con la
siguiente composición: de poliacrilamida 4% [p/v], tampón Tris-HCl 0,125 M pH 6,8,
SDS 0,1% [p/v]; persulfato de amonio y TEMED en iguales concentraciones que en
el gel separador. Las proteínas fueron solubilizadas en tampón de muestra
constituido por: Tris- HCl 62,5 mM pH 6,8; SDS 1% [p/v]; glicerol 10% [v/v], β-
mercaptoetanol 5% [v/v] y azul de bromofenol 0,05% [p/v] (como marcador del frente
iónico). Para facilitar la denaturación, las muestras fueron calentadas a 95º C por 5
min. Posteriormente las muestras se hicieron migrar aplicando una corriente
constante de 25 mA hasta que el frente iónico alcanzó el final del gel. El tampón de
electrodos contenía Tris-HCl 25 mM; glicina 0,19 M y SDS 0,1% [p/v]. Finalizada la
electroforesis, el gel se fijó con agitación orbital en una solución de isopropanol 25%
[v/v] y ácido acético 10% [v/v], durante 1 hora y posteriormente se tiñó con una
solución de azul de Coomassie R-250 0,3% [p/v], metanol 30% [v/v] y ácido acético
10% [v/v] durante 1 hora. Para desteñir el gel se utilizó una solución de desteñido
compuesta por una mezcla de metanol 30% [v/v], ácido acético 10% [v/v] hasta la
aparición de las bandas.
3.2.8.2. Electrotransferencia
Concluida la electroforesis, las proteínas separadas fueron electrotransferidas a una
membrana de nitrocelulosa utilizando un sistema semiseco (LABCONCO Semy Dry
Blotter) de acuerdo al procedimiento descrito por Bolte y col. (1997, 1998). El gel
separador se equilibró en tampón de electrotransferencia (Tris-HCl 25 mM pH 8,3,
glicina 192 mM, metanol 20% [v/v]) durante 30 min. Mientras transcurría este tiempo,
se colocaron 2 papeles filtro Whatman 3 MM prehumedecidos en solución tampón
23
ánodo 1 (Tris-HCl 0,3 M pH 10,4 y metanol 20% [v/v]), sobre el polo positivo de la
cámara (ánodo). A continuación se depositó una hoja de papel filtro humedecida en
tampón ánodo 2 (Tris-HCl 25 mM pH 10,4 y metanol 20% [v/v]); sobre ésta se ubicó
la membrana de nitrocelulosa previamente equilibrada por 10 min en H2O destilada.
El gel se colocó sobre la membrana, hacia el polo negativo (cátodo) y se agregaron
3 hojas de papel filtro humedecidas en tampón Tris-HCl 25 mM pH 9,4; ácido
aminocaproico 40 mM y metanol 20% [v/v] (tampón cátodo). Tanto los papeles filtros
como la membrana fueron cortados con las mismas dimensiones del gel.
La transferencia se llevó a cabo durante 2 h, aplicando una corriente constante de
2,5 mA/cm2. Finalizada la transferencia, se dejó secar la membrana a temperatura
ambiente sobre papel absorbente; el gel se fijó y tiñó como se describe en 3.2.6.1
para comprobar que la transferencia de proteínas desde el gel fue completa.
3.2.8.3. Western Blot
Para la inmunodetección, las membranas fueron bloqueadas con solución “Blotto”
(leche descremada 5% [p/v], PBS, Tween 20 0,05% [v/v]) por 1 h a temperatura
ambiente con agitación constante. Luego se incubó con suero anti-IFABP de carpa
el cual fue preparado en conejo contra un péptido de I-FABP conjugado a
hemocianina de C. concholepas por lo que es inmuno-reactivo contra la hemocianina
de loco, (diluido 1/5.000 en solución Blotto) por 3 h a temperatura ambiente.
Posteriormente las membranas fueron lavadas con Blotto 3 veces por 3 min cada
vez. Luego se incubó por 1 h con el segundo anticuerpo, suero anti-IgG de conejo
preparado en cabra y conjugado a fosfatasa alcalina (dilución 1/2.500) en la misma
solución en que se diluyó el primero, la incubación se realizó a temperatura
ambiente con agitación constante por 1 h. El exceso de segundo anticuerpo se
24
eliminó realizando 3 lavados por 3 min con solución PBS y se equilibró la membrana
con solución tampón para fosfatasa alcalina (Tris-HCl 100 mM pH 9,5; NaCl 100 mM;
MgCl2 5 mM) por 5 min. La actividad de fosfatasa alcalina se reveló a temperatura
ambiente con los sustratos NBT (0,33 mg/mL) y BCIP (0,17 mg/mL) diluídos en
solución tampón para fosfatasa alcalina, el tiempo de revelado fue hasta la aparición
de bandas de proteínas inmunoreactivas.
Finalmente la reacción se detuvo lavando las membranas en una solución de EDTA
5 mM por 5 min. Finalmente se lavaron las membranas con agua destilada,
dejándose secar a temperatura ambiente en papel absorbente.
3.2.8.4. Inmunodetección en gota (dot-blot).
Se agregó 10 µl de una solución de plasma de hemolinfa de C. chorus agregándose
aproximadamente 4 µg de proteínas por gota de plasma, se dejó secar con secador
de pelo, Se continuó con el procedimiento de inmunodetección como se indica en
3.2.6.3
3.2.8.5. Pre absorción de anticuerpo anti-KLH
Para preabsorber anticuerpos anti-KLH contenidos en el suero, se utilizó 1ml de
resina de agarosa-KLH. Ésta se mantuvo en PBS 1x, azida de Sodio 0,05% (p/v) y
antes de usarla fue equilibrada con 20 ml de PBS 1x. A la columna se agregó 2 ml
de antisuero anti-KLH, y se dejó reposar sin flujo durante 1 hora en la resina. Luego
se dejó fluir la columna colectando el antisuero preabsorbido contra KLH.
Posteriormente se probó si la preabsorción fue exitosa evaluando por dot-blot la
detección de un estándar de KLH. La resina posteriormente se regeneró aplicando
25
10 volúmenes de columna con una solución de NaCl 1 M y luego se retiró las sales
con 10 volúmenes de PBS con azida de sodio 0,05%.
3.2.9. Determinación de concentración de proteínas por método de Bradford
Para este método se realizó una curva de calibración, con un rango de
concentración de albúmina entre 0 a 100 µg/ml. El volumen de muestra utilizado fue
de 10 μl, el cual se diluyó hasta 0,1 ml con una solución de NaCl 0,15 M y
posteriormente se le agregó 1 ml del colorante. Finalmente se determinó
absorbancia a 595 nm. Como blanco se utilizó un volumen de 1 ml de solución de
colorante más 0,1 ml de de NaCl 0,15 M.
3.2.10. Aislamiento de la proteína mayoritaria de la hemolinfa de C. chorus
(MHCC) por cromatografía de Ni-IMAC.
Para este procedimiento se aprovechó la propiedad del Ni2+ para unirse a proteínas
que contienen secuencias ricas en histidinas (como requisito mínimo debe tener 6
histidinas en tándem para poder unirse a la resina). Para aislar esta proteína se
efectuó el siguiente procedimiento:
Se cargaron 3 a 5 ml de plasma de C. chorus al cromatógrafo utilizando un “loop” de
5 ml y se efectuó el programa de elución. Para esta cromatografía se utilizaron 3
soluciones:
1. Tampón de unión (5 mM imidazol con 0,5 M NaCl y 20 mM de Tris/HCl pH
7,9).
2. Tampón de lavado (60 mM imidazol 0,5 M NaCl 20 mM Tris/HCl pH 7,9).
3. Tampón de elución (200 mM imidazol 0,5 M NaCl 20 mM Tris/HCl pH 7,9).
26
Básicamente el tampón de unión se utilizó para equilibrar la columna, en el cual se
dejaron pasar por la columna de Ni2+-Sepharosa (1 cm x 10 cm Vc= 10 ml) 6
volúmenes de esta solución. A los 60,1 ml, el equipo cargó la muestra a la columna,
cambiando al mismo tiempo al tampón de lavado para retirar todas las proteínas que
se unen inespecíficamente a la columna, luego se produjo el cambio al tampón de
elución conteniendo imidazol (450mM) a los 100,1 ml, este eluyó la o las proteínas
retenidas en la columna. Y finalmente en la etapa de colección el colector de
fracciones se programó para colectar fracciones de 2 ml por tubo (se utilizaron en
total 38 tubos de 13x10) y el tiempo total de la cromatografía fue de 80 min a un flujo
constante de 2 ml/min.
3.2.11. Cromatografía de exclusión en gel
3.2.11.1. Cromatografía en columna de Superdex 200 HR
Se cargaron 0,4 ml de plasma de C. chorus a una columna de Superdex 200 HR (1
cm x 20 cm, Vc = 20 mL). La columna previamente equilibrada con tampón Tris-HCl
10 mM pH 7,5; NaCl 0.25 M, se acopló a un cromatógrafo de baja presión BioLogic
(BioRad). Este instrumento permitió monitorear la absorbancia a 280 nm y mantener
un flujo constante 0,5 ml/min. Las fracciones eluídas fueron colectadas tomando
fracciones de 1 ml. Para establecer el V0 se utilizó azul de Dextrano 0,05%. Las
fracciones se dializaron contra tampón acetato de amonio 10 mM, pH 7,5; con el fin
de eliminar las sales ya que el acetato de amonio es volátil y se puede eliminar con
el liofilizado. La purificación lograda a través del proceso antes descrito se evaluó
mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE.
27
3.2.11.2. Cromatografía en columna de Trysacril GF05
Para este ensayo se cargaron 0,2ml de fracción de lavado obtenida en 3.2.4 en una
columna Trysacril GF05 (1 cm x 10 Vc= 5ml) previamente equilibrada con 10
volúmenes de buffer Tris/HCl 20 mM pH 7,5 la cual se acopló a un cromatógrafo de
baja presión BioLogic (BioRad). Este instrumento permitió registrar la absorbancia a
280 nm y mantener un flujo constante 0,5 ml/min. Las fracciones eluídas fueron
colectadas tomando fracciones de 1 ml y a cada fracción se evaluó la actividad
antimicrobiana tal como se describe en 3.2.5.
3.2.12. Frotis y tinción de May Grünwald Giemsa
Se efectuó un frotis agregando una gota aprox. 30 µl de hemolinfa con solución
antiagregante en un portaobjeto limpio y con un cubreobjeto se esparció la gota (30
µl aproximadamente) desde un extremo del portaobjeto al otro. Luego se dejó secar
unos segundos, se fijó con metanol técnico por 5 min y se secó a 37º C. Después el
frotis seco se cubrió con la solución May Grünwald y se dejó reposar por 3 min,
posteriormente se le agregó la misma cantidad de agua destilada y se esperó 3 min
más, luego se eliminó con agua destilada para posteriormente cubrir el frotis con
Giemsa diluido (2 gotas de Giemsa por 1 ml de PBS) por 12 min, para finalmente
lavar con agua corriente y secar. Al momento de estar seco los preparados se
montaron con bálsamo de Canadá (30 µl aproximadamente) y se montó el
cubreobjeto, se dejó secar por 30 min. Las muestras se observaron al microscopio
Olympus BX51 equipado con una cámara Olympus de 10 mega pixeles. El análisis
de las imágenes obtenidas tanto como mediciones y conteo de células fue efectuado
en el programa Image-Pro plus 6.0
28
Figura 2: Esquema resumido de las etapas experimentales realizadas en este trabajo. Se extrae la hemolinfa, esta
se separa en plasma y hemocitos, de los cuales se preparan extractos ácidos y se efectúa la extracción en fase solida de
la cual se evalúan las actividades antimicrobianas de las distintas fracciones obtenidas. Por otra parte el plasma también
es sometido a cromatografía Ni2+-IMAC aislándose la proteína mayoritaria de la hemolinfa de C. chorus (pMHCC) y se
evaluó su actividad antimicrobiana.
29
4. Resultados
4.1. Obtención de extractos ácidos de plasma de C. chorus.
Se extrajo la hemolinfa de 40 especímenes de C. chorus obteniéndose
aproximadamente 500 ml de plasma, de los cuales 125 ml se utilizaron para una
primera extracción, otros 125 ml fueron utilizados en una segunda extracción y el
resto del plasma fue utilizado para otros ensayos.
Se efectuó la extracción en fase sólida, a través de cromatografía de absorción en
fase reversa siguiendo el protocolo descrito en materiales y métodos (3.2.3.2),
obteniéndose una fracción de lavado más 3 fracciones por cada elución con 5, 40 y
80% acetonitrilo, y se midió absorbancia a 225 nm para cada fracción. Con estos
datos se elaboró un perfil de elución (Figura 3A).
A cada una de las fracciones se les evaluó la actividad antimicrobiana sobre
bacterias gram positivas y gram negativas.
Como se muestra en la Figura 3B, dos fracciones produjeron una potente inhibición
del crecimiento de E. coli DH-5α, la fracción del lavado muestra un 75 % de
inhibición del crecimiento con una concentración de 45,1 µg/ml y la fracción 1 de la
elución con 40 % ACN causó un 89 % de inhibición con una concentración de 200
µg/ml. Así también estas mismas fracciones fueron activas para inhibir el crecimiento
del gran positivo P. citreus, en este caso con ambas fracciones se obtuvo un 100 %
de inhibición del crecimiento bacteriano. Como control positivo de inhibición del
crecimiento se uso melitina, la que a una concentración de 14 µM produce un 100 %
de inhibición del crecimiento tanto en E. coli como P. citreus. (Plaza, 2008).
Es importante señalar que la actividad antimicrobiana de la fracción del lavado
mostró variaciones en la actividad antimicrobiana entre distintas preparaciones,
30
Tubos0 2 4 6 8 10
A22
5nm
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8 Lavado
5% ACN
40% ACN
80% ACN
Figura 3: Perfil de elución y evaluación de la actividad antimicrobiana de las
fracciones obtenidas en la extracción en fase sólida. A perfil de elución de
extractos ácidos obtenidos en la extracción en fase sólida con la columna Sep-Pak
C18. Se obtienen fracciones correspondientes al lavado, con 5%, 40% y 80%
acetonitrilo, respectivamente. A estas fracciones se les midió la absorbancia a 225
mn. En los paneles B y C se muestra la evaluación de la actividad antimicrobiana: B
1,8x105 ufc/ml de E. coli DH-5α se incubaron por 12 h a 37º C con los distintos
extractos (4 µg de la fracción del lavado, 4,5 µg 5% ACN, 20 µg fracción 40% ACN,
20 µg fracción 80% ACN). C 1,8x105 ufc/ml de Planococcus citreus fueron
incubados por 24 h a 26º C con las fracciones de 5% ACN y 40% ACN. En ambos
casos el crecimiento bacteriano fue medido mediante turbidimetría a 620 nm.
A
31
alcanzando en varias de ellas el 100 % de inhibición del crecimiento de E. coli. Esta
fracción del lavado presentaba un pH 6,1. Con el fin de descartar la presencia de
trazas de acido tri-fluoro-acético (TFA) esta fracción fue reliofilizada y resuspendida,
obteniéndose un pH de 7,0. La fracción de lavado así obtenida presento una
actividad antimicrobiana similar a la no liofilizada (Figura 4A).
Con el propósito de saber si estos extractos son termolábiles, se incubó la fracción
del lavado a 95º C por 5 min. Como se observa en la Figura 4B el tratamiento por
calor inactivó completamente la actividad antimicrobiana de esta fracción.
La fracción del lavado posee una gran cantidad sales y probablemente otras
moléculas pequeñas, aparte de péptidos que podrían afectar la actividad
antimicrobiana. Para eliminar estas moléculas de bajo peso molecular una fracción
del lavado se sometió a una cromatografía de filtración (desalado) utilizando la
resina Trysacril GF05 (limite de exclusión 3 kDa)
Como se presenta en la Figura 5A, el perfil de elución muestra 2 picos, el primero
muestra una mayor absorbancia a los 9 minutos (se colectaron 2 fracciones de 1 ml
cada una) y el segundo a los 17 min (se colecto 1 fracción de 1 ml). De ambos picos
se obtuvieron fracciones que fueron liofilizadas y almacenadas a -70º C hasta su
utilización. Como se observa en la Figura 5B, tanto la fracción del pico A como la del
pico B no mostraron significativa actividad antimicrobiana. Sin embargo, al mezclar
ambas fracciones se restauró la actividad inhibitoria del crecimiento bacteriano.
.
32
Melitina Lavado Re-liofilizadoInhi
bici
ón d
el c
reci
mie
nto
bact
eria
no (%
)
0
20
40
60
80
100
Inhi
bici
ón d
el c
reci
mie
nto
bact
eria
no (%
)
0
20
40
60
80
100
Melitina Lavado Lavado (calentado 95ºC)
Figura 4: Evaluación de la actividad antimicrobiana del material no retenido en
la columna Sep-Pak C18 y la fracción del lavado reliofilizada. A: Se efectuó un
ensayo de inhibición del crecimiento bacteriano utilizando la fracción de lavado antes
y después de reliofilizar a la misma concentración de proteínas (Figura 3B). B: Igual
que en A excepto que la fracción de lavado se evaluó antes y después de calentar a
95º C por 5 min.
A
B
33
Figura 5: Eliminación de sales por Cromatografía en Trysacril G045 y
evaluación de la actividad antimicrobiana. A: Se cargaron 400 µl de la fracción
del lavado de la extracción en fase sólida en la columna Trysacril G045. Como fase
móvil se utilizó buffer carbonato de amonio 50 mM pH 7,5. Obteniéndose dos picos.
B. Se ensayó la actividad antimicrobiana de las fracciones obtenidas en la
cromatografía Trysacril. Como control de inhibición del crecimiento se utilizó melitina
14 µM. C. Evaluación de la actividad antimicrobiana de la mezcla de los 3 tubos
obtenidos de las fracciones de A. Como control se utilizo melitina a la misma
concentración utilizada en B
34
4.2. Obtención de extractos ácidos desde hemocitos de C. chorus
Se utilizaron aproximadamente 200 µl de un sedimento de hemocitos obtenidos de la
extracción de hemolinfa, que previamente estaban almacenados a -70 ºC. La
extracción en fase acida y en fase solida se realizó de acuerdo al protocolo descrito
en materiales y métodos 3.2.3.1
Como se muestra en la Figura 6B, la fracción del lavado posee una potente actividad
antimicrobiana, la fracción obtenida con el 40% ACN posee una modesta actividad
antimicrobiana y las obtenidas con el 80% de ACN no poseían actividad
antimicrobiana.
35
Tubos 0 2 4 6 8 10
A22
5nm
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
80% ACN
40% ACN
5% ACN
Lavado
% ACNLavado 5 40In
hibi
ción
del
cre
cim
ient
o ba
cter
iano
(%)
0
20
40
60
80
100
LavadoFracción 1Fracción 2Fracción 3
Figura 6: Perfil de elución y evaluación de la actividad antimicrobiana de las
fracciones obtenidas en la extracción en fase sólida de hemocitos. A: Perfil de
elución de extracción en fase sólida. Se obtuvieron fracciones correspondientes al
5%, 40% y 80% ACN a las cuales se les midió absorbancia a 225nm. B: Evaluación
de la actividad antimicrobiana de las distintas fracciones obtenidas de la extracción
en fase sólida; para ello, 1,8x105 ufc/ml de E. coli DH-5α se incubaron con los
distintos extractos (10 µg de la fracción del lavado, 6 µg de la fracción 5% ACN, 10
µg fracción 40% ACN, 10 µg fracción 80% ACN) y se midió la turbidez a 620 nm
luego de 12 h en un lector de microplacas.
B
A
36
4.3. Cinética de aparición de actividad antimicrobiana en hemolinfa post-
desafío.
En general los péptidos antimicrobianos se sintetizan y acumulan en los hemocitos,
y éstos frente a un desafío bacteriano son liberados a la hemolinfa (Charlet y col
1996). Con el fin de obtener una mayor cantidad de material antimicrobiano en la
hemolinfa se realizó un experimento de desafío. Para ellos se desafiaron 6
especímenes de C. chorus con una muestra de E. coli DH-5α inactivadas por calor,
como se especifica en materiales y métodos.
Como se observa en la Figura 7, la actividad antimicrobiana de la fracción del lavado
muestra un significativo aumento en el tiempo para los C. chorus desafiados, en
comparación con los animales controles.
Este resultado junto a la sensibilidad térmica de esta fracción, sugiere fuertemente
que la actividad antimicrobiana es de naturaleza peptídica.
37
Tiempo (h)0 10 20 30 40 In
hibi
cion
del
cre
cim
ient
o ba
cter
iano
(%)
0
20
40
60
80
100
Desafiado Diluido 1:10 No desafiado Diluido 1:10 Concentrado
Figura 7: Cinética de aparición de actividad antimicrobiana en Hemolinfa post-
infección con E. coli DH-5α. Se desafiaron 6 especímenes de Choro zapato
inyectándolos en el músculo abductor con 5x105 ufc/ml de E. coli DH-5α inactivadas
por calor. Como control se inyectaron 6 especímenes con agua de mar estéril. Cada
24 h, a dos especímenes se les extrajo Hemolinfa y se le midió la actividad de la
fracción Lavado diluida 1:10 obtenida desde el plasma.
38
4.4. Análisis de las proteínas de la hemolinfa de C. chorus
Con el fin de tener una idea de las distintas proteínas presentes en la hemolinfa se
realizó un análisis comparativo en relación con la hemolinfa de otros bivalvos, por
electroforesis en SDS-PAGE.
Como se observa en la Figura 8, los 4 bivalvos analizados presentan una proteína
predominante en la hemolinfa, la cual posee distintos pesos moleculares en cada
una de ellas. En C. chorus tiene un peso aproximado de 75 kDa mientras en M.
chilensis tiene un peso molecular de 37,5 kDa.
Se ha descrito que la proteína más abundante del plasma de M. edulis
correspondería a una glicoproteína rica en histidina (HRG) (Nair y Robinson, 1999).
39
Figura 8: Separación de las proteínas del plasma de hemolinfa de 4 especies
de bivalvos. SDS-PAGE al 12,5%. Carril 1: C. chorus (75 kDa); Carril 2: Mytilus
chilensis; Carril 3: Aulacomya ater; Carril 4: Ostrea chilensis; Carril 5: Estándar peso
molecular. El asterisco (*) indica HRG de M. chilensis 37,5 kDa
40
4.5. Aislamiento de la proteína mayoritaria de la hemolinfa de C. chorus
(pMHCC).
Para evaluar que la proteína mayoritaria de C. chorus pueda corresponder a una
HRG se realizó una cromatografía IMAC descrita para el aislamiento de proteínas
ricas en histidina (Nair y Robinson, 1999). En el caso de M. edulis se utilizó un
soporte Cd-IMAC para aislar HRG, en nuestro caso reemplazamos el metal bivalente
del soporte por Ni2+ (Mori y col 2000), como se describe en materiales y métodos.
3.2.9
Como se muestra en la Figura 9 se observa que se retuvo al menos una proteína en
la columna, la cual eluyó al agregar imidazol al buffer (pico C). En el inserto se
muestra que se logró aislar la proteína mayoritaria de la hemolinfa del choro zapato
ya que se observa una sola banda de 75 kDa (carril C).
A esta proteína se le denominó proteína mayoritaria de la hemolinfa de C. chorus
(pMHCC).
41
Figura 9: Perfil de elución de plasma de Hemolinfa de C. chorus sometida a
Ni2+-IMAC y desalado. Se retuvo una proteína en la columna la cual fue eluída al
incluir imidazol en el buffer. (a) pico de la fracción no retenida en la columna, (b)
fracción del lavado y (c) fracción del eluído. En el inserto se muestra un SDS-PAGE
en el que se aisló la proteína mayoritaria de la hemolinfa del choro zapato ya que se
observa una única banda de proteína que migra en la posición de 75 kDa (carril C),
P, corresponde al plasma total y E corresponde a el estándar de peso molecular.
42
4.6. Actividad antimicrobiana de la proteína pMHCC
Teniendo presente que en publicaciones recientes se ha descrito que la HRG de
humano exhibe actividad antimicrobiana, nos pareció importante evaluar si la
pMHCC, que correspondería a una putativa HRG, también exhibiría actividad
antimicrobiana.
En humanos la HRG muestra un máximo de actividad antimicrobiana solo cuando se
ensaya a pH 5,5 y concentraciones de Zn2+ 50 µM en el medio. Entonces, como
primera aproximación y considerando que la pMHCC es la proteína mayoritaria del
plasma se decidió ensayar la actividad antimicrobiana a diferentes pH, con y sin Zn2+
en el medio.
Como se muestra en la Figura 10, el plasma exhibe su máximo de actividad
antimicrobiana a pH 5,5 y cuando se agrega 50 µM Zn2+ en el medio.
Coincidentemente cuando se ensaya la proteína pMHCC purificada, también se
obtiene la máxima actividad antimicrobiana a pH 5,5 conteniendo 50 µM Zn2+ en el
medio (Figura 11).
Estos resultados sugieren que la proteína pMHCC puede jugar un papel como
componente o formando parte del sistema de inmunidad innato de este mitílidos.
43
pHControl 7,4 6,1 5,5In
hibi
ción
del
cre
cim
ient
o E.
col
i (%
)
0
20
40
60
80
100
120
50μM Zn2+ Sin Zn2+14μM Melitina
Figura 10: Evaluación de la actividad antimicrobiana del plasma a distintos pH.
E. coli DH-5α (1,8x105 ufc/ml) se incubaron por 12 h a 37º C con plasma de C.
chorus a distintos pHs 7,4; 6,1; 5,5 con 50 µM Zn2+ y sin Zn2+. Como control se utilizo
melitina 14µM
44
pHControl 7,4 6,1 5,5In
hibi
ción
del
cre
cim
ient
o E.
col
i (%
)
0
20
40
60
80
100
120
50μM Zn2+ Sin Zn2+ Melitina 14μM
Figura 11: Actividad antimicrobiana de pMHCC purificada a distintos pH con
50µM de Zn2+ y sin presencia de Zn2+. E. coli DH-5α (1,8x105 ufc/ml) se incubaron
por 12 h a 37º C con 4 µM de MHCC por cada ensayo. Como control positivo de
inhibición de crecimiento se incluyo melitina en el experimento.
45
4.7. Caracterización parcial de la proteína mayoritaria de la hemolinfa (pMHCC).
Se ha descrito para HRG de M. edulis que en condiciones nativas se encuentra
como un dímero de una masa de 63 kDa (Abebe y col., 2007). Con el fin de dilucidar
si pMHCC posee una estructura cuaternaria, se realizó una cromatografía de
filtración en gel con la resina Superdex 200 (la cual posee un rango de partición de
20 kDa hasta aproximadamente 1 MDa). Como estándares de peso molecular se
utilizó BSA, IgG de conejo y el V0 se obtuvo con azul de dextrano.
La Figura 12 muestra que un pico que se encuentra en la porción del V0, en el cual
se encontraría pMHCC, ya que esta es la proteína más abundante del plasma de la
hemolinfa. También se encontró un segundo pico en el cual se encontrarían péptidos
y compuestos de bajo peso molecular.
Con el fin de confirmar que la pMHCC se encontraba en la fracción correspondiente
al V0, se efectúo una cromatografía Ni-IMAC de la fracción correspondiente al V0,
obteniéndose un perfil similar a los obtenidos para plasma. Por lo tanto, se concluyó
que la proteína pMHCC se encuentra en el V0 de la cromatografía de exclusión en
gel tal como se muestra en la Figura 13.
46
Tiempo (min)
0 20 40 60 80 100
A28
0
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
A28
0
-0,010
-0,005
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
A28
0
-0,01
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
A28
0
-0,008
-0,006
-0,004
-0,002
0,000
0,002
0,004
0,006
0,008
0,010
IgGBSAAzul dextranoPlasma Hemolinfa
Figura 12: Determinación del peso molecular en condiciones nativas por
cromatografía exclusión en gel con la resina Superdex 200. Se cargó 400 µl de
plasma de C. chorus a una concentración de 3,2 mg/ml y se corrió la cromatografía
por 100 min. Para obtener el V0 se utilizó como control azul de dextrano 0,5%, y
como estándares de peso molecular IgG de conejo (150 kDa) a una concentración
de 3 mg/ml y BSA (66 kDa) a una concentración de 3 mg/ml.
47
Figura 13: Aislamiento de la proteína MHCC desde la fracción correspondiente
al V0 obtenido de la cromatografía de exclusión en gel. A, cromatografía de
exclusión en gel Superdex 200, se cargaron 400 µl de plasma y se colectó la
fracción correspondiente al V0 (pico a), a la cual se le efectúo una cromatografía
Ni2+-IMAC. B, se colectaron las fracciones correspondientes al eluído (pico C) con el
objetivo de dilucidar si la proteína de 75 kDa corresponde a la proteína aislada de
Ni2+-IMAC.
A
Tiem po (m in)
0 20 40 60 80
A28
0
-0,002
0,000
0,002
0,004
0,006
0,008
0,010
0,012
20
25
30
35
40
45
50 a
B
Tiempo (min)
0 20 40 60 80
A28
0
-1
0
1
2
3
4
5
Con
duct
anci
a
0
10
20
30
40
50
% B
0
20
40
60
80
100
120
a
b
c
48
4.8. Inmuno-detección de la proteína MHCC con anticuerpos anti hemocianina
de C. concholepas.
Los resultados anteriores muestran que la pMHCC formaría una estructura
cuaternaria de elevado peso molecular. Considerando que en otros moluscos la
proteína más abundante de la hemolinfa corresponde a una hemocianina, se
realizaron ensayos para determinar si pMHCC es reconocida por anticuerpos
dirigidos contra hemocianina de C. concholepas.
El ensayo de inmunodetección en gota demuestra que efectivamente tanto el plasma
de la hemolinfa como la proteína pMHCC purificada son inmunodetectadas por el
anticuerpo anti-hemocianina de C. concholepas (Figura 14A), como control negativo
se utilizó BSA inmovilizado.
A la luz de este resultado se decidió evaluar mediante análisis de Western blot.
Como se observa en la Figura 14B, en el carril 1, que corresponde al plasma, se
inmunodetectaron la cadena polipéptidica de 75 kDa, además de otras bandas. En
cambio, en el carril 2, que corresponde a la proteína aislada de Ni-IMAC, se observa
la inmunodetección de una sola banda. En el carril 3 que corresponde al V0 de la
cromatografía de exclusión en gel, además de inmunodetectarse la pMHCC se
inmunodetectó otra banda de menor peso molecular. Como control positivo se utilizó
hemocianina de C. concholepas (carril 4).
Por ensayos de dot blot se probó un anticuerpo anti-KLH, que es capaz de
imunodetectar proteínas del plasma de C. chorus y otros 3 bivalvos chilenos (A. ater;
O. chilensis; M. chilensis (Figura 15A). Este anticuerpo fue preabsorbido con una
columna KLH-agarosa para asegurarnos que sólo detectaba proteínas relacionadas
con KLH, ensayándose nuevamente los plasmas de los 4 bivalos por dot blot. Esta
vez no se observó inmunodetección (Figura 15B).
49
Estos resultados preliminares podrían indicar que la proteína mayoritaria circulante
en la hemolinfa de C. chorus, más otras proteínas de mayor peso molecular
formarían parte de un complejo proteico relacionado con la hemocianina.
50
Figura 14: inmuno-detección de hemocianina del plasma de C. chorus. A, Dot-
blot realizado con IgG de conejo anti hemocianina de C. concholepas. Por cada
gota se agregó 4 µg de proteínas en duplicado, correspondiente al plasma de C.
chorus y a MHCC, como control negativo se utilizó BSA 2 mg/ml. B, Western blot
con IgG de conejo anti hemocianina (dil 1:5000). Se cargó en cada carril 4 µg de: 1,
plasma C. chorus, 2, proteína aislada por Ni-IMAC de plasma C. chorus, 3, V0
cromatografía de exclusión en gel y 4, Hemocianina de C. concholepas.
250 ► 75 ► 50 ► 37 ►
E 1 2 3 4
Plasma C. chorus Proteína MHCC BSA 2mg/ml
B
A
51
Figura 15: Inmuno-detección de hemocianina del plasmas de 4 especies de
bivalvos chilenos. Dot-blot realizado con IgG de conejo anti KLH en 1, hemocianina
de C. concholepas (10 µl), 2, plasma M. chilensis (10 µl), 3, plasma C. chorus (10
µl), 4, plasma A. ater (10 µl) y 5, plasma O. chilensis (10 µl).
1 2 3 4 5
IgG anti KLH
IgG anti KLH preabsorbido con KLH
A
B
52
4.9. Identificación de hemocitos de C. chorus por morfología y tinción.
De acuerdo a lo descrito en la literatura, en bivalvos mitílidos existen 2 poblaciones
de hemocitos: basófilos, eosinófilos (Cheng, 1981). Estos se subdividen en
granulares, granulares pequeños y agranulares (Hialinos desgranulados) (Ashton-
Alcox y Ford, 1998). Estos hemocitos se han caracterizado por distintas técnicas,
desde la microscopia óptica y electrónica y más recientemente por citometría de
flujo.
Con el objetivo de conocer e identificar morfológicamente los tipos celulares
presentes en la hemolinfa de C. chorus se realizaron frotis de hemolinfa teñidos con
MG-G. Para, este caso solo se efectuó una caracterización morfológica, por
microscopia óptica. En la Figura 16 se muestran distintos tipos de hemocitos de la
hemolinfa de C. chorus, que podrían corresponder a los descritos en la literatura.
La Figura 16A muestra un tipo de hemocito de un tamaño de 16,35 ± 1,80 µm de
largo y 11,93 ± 1,85 µm de ancho presentando abundante citoplasma eosinófilo
carente de gránulos y un núcleo grande, céntrico y bien definido, indicado con la
flecha negra. Este hemocito correspondería a un eosinófilo agranular (Hialino), el
cual sería el segundo tipo de hemocito más abundante en la hemolinfa de C. chorus.
A su vez, se observan hemocitos basófilos muy teñidos en el citoplasma y con
prolongaciones claramente observables en la periferia, los que presentan un núcleo
más pequeño que el resto de los tipos de hemocitos observados el cual posee una
ubicación pericéntrica, como se indica por la flecha negra (Figura 16B). Este es el
más abundante en la hemolinfa y se encuentra en distintos tamaños desde los 9 µm
hasta los 20 µm de largo, presentando un tamaño promedio de 14,99 ± 4,27 µm de
largo y 14,13 ± 3,84 µm de ancho, siendo de una forma muy esférica (Figura 16B), el
cual correspondería a un hemocito basófilo.
53
Figura 16: Tipos de hemocitos presentes en la hemolinfa C. chorus. Tinción
MG-G, se fijo con metanol durante 10 min y luego se efectúo la tinción en el cual se
observan distintos tipos de hemocitos (A) eosinófilo agranular (Hialino) (B)
granulocito basófilo (C) Prohemocito (D) granulocito eosinófilo con grandes gránulos
basófilos (E) eosinófilo granular (azurófilos) (F) Eosinófilo con gránulos azurófilos.
Flechas blancas indican los gránulos teñidos de azul, flechas negras indican núcleo
de los hemocitos, flecha grande blanca indica una vacuola y la flecha roja indica
gránulos azurófilos.
54
Dentro de los tipos de hemocitos observados se encontró uno carente de gránulos,
con muy poca cantidad de citoplasma y un gran núcleo concéntrico (Figura 16C),
que de acuerdo a lo descrito en la literatura correspondería a la línea precursora de
los hemocitos, prohemocito. Solamente se pudo visualizar un solo ejemplar, tal vez
por su escasez en la hemolinfa dado que es una línea progenitora hematopoyética.
La Figura 16D muestra un hemocito que posee un citoplasma eosinófilo y dentro de
éste se encuentran una gran cantidad de gránulos basófilos grandes. Posee un
abundante citoplasma y un núcleo pericéntrico bien definido, y mide
aproximadamente 15,11 ± 0,89 µm de largo y 19,42 µm de ancho.
Otro tipo de hemocito, el cual de acuerdo con nuestros resultados es muy escaso en
la hemolinfa de C. chorus, es un tipo muy peculiar, cuyo citoplasma es abundante, y
en el cual se observan vacuolas muy definidas (Figura 16E, flechas blancas
gruesas), y presenta gránulos azurófilos, un núcleo central bien definido. Este
hemocito presenta unas dimensiones de 26,77 µm de largo y 14,16 µm de ancho.
Por último, se observó un tipo de hemocito eosinófilo granular, el cual se caracteriza
por su gran tamaño, con respecto al resto de hemocitos, con un tamaño aproximado
de 27,14 ± 4,7 µm de largo y 24,29 ± 3,4 µm de ancho, el cual posee un citoplasma
muy abundante con gránulos azurófilos (Figura 16F flechas rojas), con un núcleo
concéntrico bien definido.
En la Tabla 1 se resumen los tamaños de hemocitos descritos en distintas especies
de bivalvos, mostrándose las diferencias de tamaño observadas entre distintos tipos
celulares.
55
Tabla I: Tamaños (largo) de tipos de Hemocitos obtenidos desde distintas especies de bivalvos.
Tipo de células
Tridacna crocea1
(µm)
Ruditapes decussatus2
(µm)
Scrobicularia plana3
(µm)
M. edulis4 (µm)
C. chorus6
(µm) M.
galloprovincialis5
Eosinófilo granular 9,6 ± 0,1 13,42 ± 0,16 6,16 ± 0,091 12 ± 1 11,93 ± 1,85 -
Eosinófilo agranular 8,2 ± 0,2 11,44 ± 0,26 - 12 ± 1 24,29 ± 3,40 8,73 ± 0,54
Basófilo granular 13 ± 0,3 12,24 ± 0,35 6,00 ± 0,084 8 ± 1 14,99 ± 4,27 43,7 ± 0,91
Granulocito con
gránulos basófilos y acidófilos
- - - - 44,7 ± 1,34
Basófilo agranular - - 4.74±0.075 4 ± 1,5 - -
1 Nakayama K. y col 1995; 2 Lopez C. y col, 1997; 3 Wootton E. y Pipe R. 2003 ;4 Wootton E. y col 2003; 5 Carballal M. y col 1997; 6Resultados obtenidos de este estudio.
56
4.10. Características de los hemocitos en C. chorus desafiados con E. coli
inactivadas por calor.
Para tener una idea de la respuesta temporal de los hemocitos frente a un estimulo,
se efectuaron desafíos in-vivo con bacterias inactivadas siguiendo el procedimiento
descrito en detalle en materiales y métodos.
Al observar una panorámica de los hemocitos no desafiados y desafiados, en el
caso de los no desafiados se observa una gran población de basófilos (Figura 17 A y
B), los cuales corresponden a la mayor cantidad de hemocitos presentes en la
hemolinfa de C. chorus.
En cambio a las 24 h de desafío se observan fenómenos de agregamiento más
frecuente y la aparición de la coloración café característica de la melanina (Figura 17
C y D).
A las 48 h se ve una disminución de células por campo (Figura 18), y ya casi en su
totalidad se encuentran células con coloración café, las cuales estaban colmadas
con melanina (Figura 17 E y F). También se ven cambios en el núcleo, algunas
células se observaban con un núcleo lobulado (Figura 17 E flecha negra).
En la Figura 10 se muestra el cambio que sufre un hemocito basófilo granular
cuando comienza su activación hasta estar activado. Antes del desafío (Figura 18a)
se ve el citoplasma de un color azul característico de los basófilos, pero cuando han
pasado 24 después del desafío in-vivo, se comienza a ver una desaparición del color
(Figura 18b). Esto reflejaría el comienzo de la liberación del contenido de sus
gránulos y la aparición de gránulos cafés de melanina y luego a las 48 h de desafío
se observa una célula totalmente lleno de melanina (Figura 18c). El cual es el
producto final del sistema proPO.
57
Figura 17: Vistas de los campos ópticos en distintas horas post-desafío. Aquí
se observa una panorámica de los hemocitos no desafiados y desafiados. A,
corresponde a un campo con hemocitos sin desafiar en el cual hay una agrupación
de basófilos al igual que en B, en C y D, hemocitos desafiados por 24 h, las flechas
negras indican núcleos y las blancas indican gránulos de melanina. En E y F
hemocitos desafiados por 48 h; las flechas blancas indican gránulos de melanina y
las flechas negras indican núcleos.
58
Figura 18: Activación de granulocito basófilo. Para este ensayo se desafiaron 6
especímenes de Choro zapato inyectándolos en el músculo abductor con 100 µl de
una suspensión que contiene 5x105 ufc/ml de E. coli DH-5α inactivadas por calor.
Como control se inyectaron 2 especímenes con agua de mar estéril. Cada 24h, se
les extrajo hemolinfa a dos especímenes y se efectuaron frotis teñido con MG-G. a,
granulocito sin activar, b, granulocito activándose, c granulocito activado. Las
flechas blancas indican gránulos de melanina y las negras indican al núcleo.
59
Al observar los frotis de los hemocitos desafiados, se aprecian solo 4 tipos celulares
(Figura 19). En los 4 tipos de hemocitos se observa que el citoplasma está colmado
de melanina.
En un tipo celular se observan vacuolas de gran tamaño y muy abundantes, tal como
lo indica en la Figura 19A (flechas blancas grandes). A su vez, se observa un núcleo
ovalado no muy basófilo, indicado con la flecha negra, y se observa el citoplasma
saturado de gránulos de melanina. Este hemocito posee un tamaño de
aproximadamente 19,23 ± 1,04 µm. De acuerdo a su tamaño y la posición del núcleo
con respecto al citoplasma, correspondería a un eosinófilo. Se diferencia de los
eosinófilos no desafiados en los gránulos azurófilos y en su forma, la cual es más
uniforme.
En la Figura 19B se observa un hemocito hialino activado, con el citoplasma lleno de
gránulos de melanina y un núcleo de gran tamaño. Se diferencia del hemocito no
activado (Figura 16F) en que este último posee núcleo mucho menos basófilo, y no
se observan gránulos azurófilos en el citoplasma.
Se observaron hemocitos con núcleo segmentado y muy grande con respecto al
tamaño de la célula (Figura 19C), en los cuales también se observa una gran
cantidad de gránulos de melanina que cubren todo el citoplasma.
En los hemocitos basófilos granulares no se aprecian cambios de tamaño, no
obstante se observan diferencias en la composición de gránulos en el citoplasma
(Figura 19D) ya que los pequeños gránulos basófilos son cambiados por gránulos de
melanina, cambiando así su coloración azul (Teñido con MG-G) a café (aparición de
Melanina en el citoplasma).
60
Figura 19: Distintos tipos de hemocitos encontrados en especímenes
desafiados. Para este ensayo se desafiaron 6 especímenes de Choro zapato
inyectándolos en el músculo abductor con 100 µl de una suspensión de 5x105 ufc/ml
de E. coli DH-5α inactivadas por calor. Como control se inyectaron 2 especímenes
con agua de mar estéril, a las 48 h se extrajo hemolinfa y se realizaron los frotis y se
tiñeron con MG-G. En A se muestra un eosinófilo granular activado, en B se
observa uno hialino, y en C se observa un tipo celular con un núcleo segmentado, y
en D un basófilo activado. Las flechas blancas gruesas muestran las vacuolas, las
flechas blancas delgadas muestran los gránulos de melanina y la flecha negra
muestra el núcleo.
61
5. Discusión
Los mecanismos defensivos de los bivalvos están basados en la inmunidad innata, e
involucran componentes humorales y celulares presentes en la hemolinfa (Cheng,
1983; Hine, 1999). Dentro de los componentes humorales, se encuentran péptidos y
proteínas con propiedades antimicrobianas (Hubert y col 1996; Mitta y col 2000b),
mientras que los componentes celulares ejercen su acción mediante mecanismos
como por ejemplo fagocitosis o encapsulación del organismo invasor el que
subsecuentemente es destruido por acción de enzimas, compuestos antimicrobianos
y generación radicales de oxígeno (Pipe, 1990b; 1992).
Dados estos antecedentes se decidió efectuar un estudio de distintos componentes
de la inmunidad innata de C. chorus, incluyendo componentes humorales (péptidos y
proteínas antimicrobianas), y celulares (Hemocitos).
En el presente trabajo se comenzó centrando la atención en el estudio de los
componentes humorales de la hemolinfa de C. chorus, fundamentalmente péptidos
con actividad antimicrobiana. Para ello se prepararon extractos ácidos, a partir de la
hemolinfa de C. chorus y posterior separacion en fase sólida (Figura 3A). Algunas
fracciones de estos extractos presentaron actividad antimicrobiana contra bacterias
gram negativas como E. coli y gram positivas como P. citreus.
Los extractos más activos corresponden a la fracción del lavado de la extracción en
fase solida y la fracción eluída con 40% de ACN (Figura 3B, C y 6B).
La actividad de estos extractos varía entre individuos, por lo tanto cada preparación
poseía una actividad antimicrobiana distinta, destacando que la fracción
correspondiente al lavado presentó siempre una actividad mucho mayor a la de la
fracción eluída con 40% de ACN.
62
Estudios realizados en almejas muestran que entre individuos existen variaciones,
en la concentración de componentes proteicos presentes en la hemolinfa (Ford y
Paillard, 2007).
En el caso de la fracción correspondiente al lavado de la extracción en fase sólida se
observó que estos son muy activos contra E. coli y P. citreus (Figura 3 B y C)
obteniendo un 89% (E. coli) y 100% (P. citreus) de inhibición de crecimiento
bacteriano a muy bajas concentraciones de proteínas. Esta fracción no se encuentra
descrita en la literatura para péptidos antimicrobianos, ya que no se han buscado
moléculas antimicrobianas en esta fracción.
La fracción del 40% ACN es activa a mayores concentraciones (200 µg/ml) a las
encontradas para la fracción del lavado (45,1 µg/ml). Se esperaba una actividad
antimicrobiana para esta fracción ya que se ha descrito para M. edulis y M.
galloprovincialis la existencia de varios tipos de péptidos antimicrobianos aislados de
esta fracción, los cuales poseen actividad contra gram negativos, positivos y algunos
hongos (Mitta y col 1999; 2000a; 2000b; 2000c; 2000d).
Suponiendo que el material antimicrobiano de la fracción del lavado correspondiese
a péptidos, éstos deberían poseer una masa estimada de 5 kDa, ya que se ha
descrito para mitílidos péptidos que varían entre 4 a 6 kDa. De ser así, como se
observó 100% de inhibición del crecimiento bacteriano, la concentración de los
péptidos para lograr este efecto sería de alrededor de 9 µM. En contraste, si la
fracción del 40% correspondiese a péptidos de 5 kDa la concentración necesaria
para alcanzar el 100% de inhibición seria aproximadamente de 40 µM. En péptidos
antimicrobianos el rango de concentración apropiado para obtener una actividad
antimicrobiana efectiva es del orden micromolar (µM) como por ejemplo para el caso
63
de Mytilina G1, se necesitan concentraciones mayores a 5,6 µM para tener un
efecto antimicrobiano contra E. coli (Mitta y col 2000a).
Al evaluar la actividad antimicrobiana contra P. citreus se observó que ambas
fracciones aisladas desde la extracción en fase sólida necesitaban de
concentraciones 10 veces menores respecto a las requeridas para E. coli para
provocar un 100% de la inhibición del crecimiento bacteriano. Esto se correlaciona
muy bien con lo descrito para péptidos antimicrobianos, ya que las bacterias gram
negativas como E. coli poseen una mayor resistencia a los péptidos antimicrobianos
a diferencia de los gram positivos como P. citreus que son más susceptibles
(Gueguen y col, 2006).
Por ejemplo, se puede citar el caso de paradaxina, péptido antimicrobiano aislado
del pez Pardachirus marmoratus, en el cual la concentración mínima inhibitoria del
crecimiento de E. coli para este péptido es 13 µM, en cambio para un gram positivo
como A. calcoaceticus se necesita una concentración de 3 µM (Oren y Shai, 1996).
Luego de identificar los extractos que poseían actividad antimicrobiana, era
necesario saber a qué tipo de compuestos corresponderían estas fracciones.
Una opción que nos arrojaría luces de que este material antimicrobiano es de
naturaleza proteica sería evaluar su termolabilidad. La fracción correspondiente al
lavado de la extracción en fase sólida fue expuesta a altas temperaturas,
observándose desaparición de la actividad antimicrobiana. Este resultado nos indica
que este material es de una naturaleza sensible al calor, posiblemente proteica.
Generalmente los péptidos termoresistentes son estabilizados por puentes disulfuro
y porque poseen estructuras secundarias como hoja plegada β. Se puede citar el
caso de las tachyplesinas, péptidos antimicrobianos aislados de los hemocitos del
cangrejo herradura, en el cual las tachyplesinas son resistentes a la denaturación
64
por calor, debido a sus múltiples puentes disulfuro y su estructura de hoja plegada β
(Kawano y col, 1990; Laederach y col, 2002). Por lo tanto se puede inferir que el
material antimicrobiano encontrado en la fracción del lavado podría corresponder a
péptidos con estructuras de α-hélice y carentes de puentes disulfuros, confiriéndole
así su termolabilidad.
La fracción del lavado obtenida contenía gran cantidad de sales. Con el fin de
averiguar si estas sales son necesarias para observar la actividad antimicrobiana, se
utilizó una cromatografía de partición en gel con una columna Trysacril G05 (Figura
5A). Se separaron tres fracciones consistentes en moléculas de distinto tamaño. La
primera y segunda fracción contenían moléculas de mayor tamaño, posiblemente
péptidos; la tercera fracción contenía sales y pigmentos. Al evaluar la actividad
antimicrobiana de cada una de éstas fracciones, por separado se observo que
ninguna de las fracciones mostró indicios de actividad antimicrobiana por sí sola
(Figura 5B), aunque la actividad se recuperó al mezclarlas (Figura 5C). Esto nos
indica que la presencia de dos o más compuestos de fracciones distintas es
necesaria para ejercer la actividad antimicrobiana, pudiendo éstos actuar
conjuntamente o ser uno de ellos necesario para la activación del otro.
También existen péptidos que actúan a altas concentraciones de sales, como por
ejemplo las defensinas de C. gigas (Cg-Defensin), en las cuales la actividad
antimicrobiana se conserva intacta al encontrarse a altas concentraciones de sales,
similares a las del agua de mar (30 ppm de NaCl) (Gueguen y col, 2006), a
diferencia de lo observado en la mayoría de los péptidos antimicrobianos en los que
la actividad antimicrobiana disminuye al aumentar la concentraciones de sales como
ocurre en el caso de θ-defensinas de macaco Rhesus (Tran y col 2008).
65
En moluscos, generalmente los péptidos antimicrobianos se sintetizan y almacenan
en los hemocitos, y éstos frente a un desafío bacteriano son secretados a la
hemolinfa (Charlet y col, 1996; Mitta y col, 1999; 2000a; 2000b). Con el objetivo de
obtener una mayor cantidad de material antimicrobiano en la hemolinfa, se realizó un
experimento de desafío. Para ello se desafiaron 6 especímenes de C. chorus con
un inóculo de E. coli DH-5α inactivados por calor. La actividad antimicrobiana de la
fracción del lavado mostró un significativo aumento en el tiempo para los C. chorus
desafiados (Figura 7), en comparación con los animales controles.
En el modelo de Limulus, ha sido demostrado que los hemocitos son
extremadamente sensibles a sustancias microbianas como el lipopolisacarido (LPS)
y β-glucanos (Muta y Iwanaga, 1996). Bajo estimulación, los hemocitos son
espontáneamente degranulados y se liberan a la hemolinfa una serie de sustancias
involucradas en la defensa inmune incluyendo varios péptidos antimicrobianos (Saito
y col, 1995).
En Mytilus edulis y galloprovincialis que fueron desafiados con un cóctel bacteriano
(Vibrio aginolyticus, Micrococcus lysodeikticus, Vibrio splendidus, Vibrio anguillarum
y Poli I:C) se demostró que las concentraciones de material antimicrobiano
proveniente de hemocitos circulantes en el plasma o en sitios de injuria incrementan
después del desafío bacteriano (Mitta y col., 2000b; Pallavicini y col, 2008).
Además, en modelos de mitílidos, como consecuencia del desafío se produce
migración de los hemocitos y la aparición de señales de adherencia en estas células.
Se han observado hemocitos que contienen péptidos antimicrobianos como mytilina
rodeando el sitio de infección. Las células que contienen mytilina pueden fagocitar a
la bacteria y subsecuentemente liberar mytilina a las 24 a 48 h post desafío
66
bacteriano, incrementando en el plasma las concentraciones de mytilina y
defensinas (Mitta y col, 2000a).
Recientes estudios realizados en M. galloprovincialis mostraron una gran
variabilidad en la secuencia del péptido antimicrobiano myticina C, en los cuales se
han encontrado varias isoformas de este péptido en distintas especies de moluscos
(Padhi y Verghese, 2008). A su vez también un trabajo publicado recientemente
demostró una gran variabilidad en la secuencia del péptido myticina C entre
individuos de M. galloprovicialis (Costa y col, 2009). Estos antecedentes sugieren
que en el plasma y hemocitos de C. chorus podrían encontrarse uno o más
compuestos antimicrobianos nuevos.
Como se mencionó anteriormente hemos aislado en el extracto en fase sólida una
fracción del lavado con potente actividad antimicrobiana, la cual no ha sido descrito
en la literatura para otros mitílidos y que podría contener a nuevos péptidos
antimicrobianos, ya que estos nuevos compuestos no serian hidrofóbicos al no
quedar retenidos en el soporte SepPak C-18, el cual corresponde a una
cromatografía de absorción en fase reversa.
Los antecedentes mostrados en esta tesis nos sugieren que el material
antimicrobiano obtenido de la fracción del lavado podría tener naturaleza proteica,
como lo demuestra el aumento en el tiempo de la actividad antimicrobiana en el
plasma al efectuarse un desafío, termolabilidad y la presencia de ésta fracción en
hemocitos de C. chorus.
Considerando antecedentes obtenidos de la literatura, los que muestran que los
péptidos antimicrobianos detectados en hemocitos son sintetizados y almacenados
en ellos (Tincu y Taylor, 2004; Reddy y col, 2004), se sugiere como continuación a
esta investigación dirigir experimentos hacia la purificación de los compuestos
67
antimicrobianos contenidos en estos extractos. Por ejemplo, para la fracción del
lavado se deberían realizar distintas cromatografías como por ejemplo, intercambio
iónico, ya que, estos compuestos son de baja hidrofobicidad. En cambio para la
fracción correspondiente al 40% de la elución con ACN se deberían efectuar
cromatografías por HPLC en fase reversa, y posteriormente la secuenciación, si se
tratase de péptidos (Thompson y col, 2006).
Dentro de los componentes humorales era de gran relevancia el estudiar la proteína
más abundante de la hemolinfa de C. chorus, la cual se aisló, purificó y caracterizó
parcialmente.
Como primera aproximación se decidió efectuar un estudio comparativo de los
perfiles electroforéticos de la hemolinfa de 4 especies de bivalvos autóctonos
chilenos. Estas 4 especies tienen perfiles electroforéticos distintos, la proteína más
abundante de la hemolinfa en cada uno de éstos arroja distintos pesos moleculares
(Figura 8). Por ejemplo, la proteína más abundante de la hemolinfa de A. ater
presenta un peso calculado de 50 kDa, en cambio para M. edulis este es peso de 37
kDa.
En C. chorus esta proteína, se le calculó una masa de 75 kDa. Se ha descrito que la
proteína de 37 kDa en M. edulis corresponde a la proteína más abundante de la
hemolinfa (Nair y Robinson, 1999) lo cual concuerda con lo observado en M.
chilensis, que también posee una proteína abundante con un peso aproximado de
37 kDa.
Estudios realizados en M. edulis describen esta proteína como SBP1 (serum binding
protein 1), la cual posee una gran afinidad por metales bivalentes como el Ni2+, Cd2+
y Zn2+, y tiene un peso molecular calculado de 35,9 ± 1.8 kDa (Renwrantz y col
1998). Estudios posteriores aislaron esta proteína desde la hemolinfa de M. edulis a
68
través de una cromatografía Cd2+-IMAC, y la caracterizaron parcialmente,
bautizándola como HRG (Histidine-Rich Glycoprotein) (Nair y Robinson, 1999).
HRG se encuentra ampliamente distribuida entre distintas especies como es el caso
de los mamíferos (Scott y Bradwell, 1984), y desde hace algunos años se ha
identificado y cuantificado en 6 especies de bivalvos marinos (Abebe y col, 2007).
Con estos antecedentes se decidió aislar la proteína más abundante de la hemolinfa
por Ni-IMAC (Figura 9), obteniéndose ésta en la fracción del eluído. La electroforesis
en condiciones denaturantes mostró una única banda de 75 kDa (Figura 9 inserto).
Hemos nombrado a la proteína mayoritaria de la hemolinfa de C. chorus como
pMHCC.
Se sugiere por lo tanto, que la proteína más abundante de la hemolinfa de C. chorus
posee una gran cantidad de histidinas (Figura 9), ya que las formas tridentadas de la
histidina se unen a una gran variedad de metales de transición, y residuos de
histidilos también son capaces de unirse a metales (Morgan, 1981). Cabe destacar
que para eluír se utilizó Imidazol, lo que apoya la idea que la pMHCC es una
proteína rica en histidinas.
Para corroborar que efectivamente pMHCC es una HRG sería importante realizar en
el futuro una composición de aminoácidos de la proteína, ya que en caso de M.
edulis, HRG posee un porcentaje de histidina de un 13,7%. También resultaría
importante realizar una determinación de carbohidratos para esta proteína ya que
para M. edulis se describe un porcentaje de carbohidratos correspondiente al 11,6 %
para HRG (Nair y Robinson, 1999). HRG de M. edulis posee el mismo porcentaje de
histidinas que HRG de Humano.
En M. edulis HRG une metales pesados como el Cd2+ (Robinson y col, 1997;
Renwrantz y col, 1998), y más recientemente se describió que para distintos
69
moluscos bivalvos HRG une a varios metales divalentes, como por ejemplo Ni2+,
Hg2+, Zn2+ (Devoid y col, 2007). Esto sugiere que HRG está involucrado en el
transporte de metales en la hemolinfa.
En el caso de mamíferos a HRG humano se le han descrito funciones de transporte
de metales bivalentes, (Scott y Bradwell, 1984; Sarkar, 1989; Trisak y col, 1990).
A mediados del año 2007 se publicó que HRG de humanos poseía actividad
antimicrobiana (Rydengård y col, 2007) por lo cual, en un principio, se decidió
efectuar ensayos de inhibición del crecimiento bacteriano de E. coli con hemolinfa de
C. chorus, observándose una discreta actividad antimicrobiana (Figura 10) a pH 5,5
y en presencia de Zn2+. Coincidentemente al evaluar la actividad antimicrobiana de
pMHCC purificada, se obtuvo este mismo resultado bajo las mismas condiciones
dadas para el plasma (Figura 11).
Para encontrar una explicación lógica de por qué pMHCC actúa a pH ácido y
suplementado con Zn2+, se cita el caso de HRG humana, la cual, a pH fisiológico,
posee carga negativa (pI = 6,45) a causa del alto contenido de histidina (alrededor
del 13%), y puede adquirir una carga positiva por incorporación de Zn2+, o por
protonación de los residuos bajo condiciones ácidas (Jones y col, 2005).
A su vez estudios de modelamiento de la estructura de HRG sugieren que la región
rica en histdinas (HRR) es flanqueada por grupos de poli-prolina (II) formando una
estructura helicoidal, con numerosos grupos imidazol (dentro de residuos de
histidina) que protruyen hacia fuera de la unidad estructural, con pares de imidazoles
formando las unidades básicas de unión a Zn2+. (Jones y col, 2005; Borza y col,
1996).
También la influencia del pH y la concentración Zn2+ en la actividad antimicrobiana
son muy similares entre HRG y pMHCC. Es interesante notar que una concentración
70
similar de Zn2+ y un pH ácido potencian a la actividad antimicrobiana de HRG
(Rydengård y col, 2007). También se, ha visto que de esta proteína se liberan
péptidos ricos en histidinas (Kacprzyk y col, 2007).
A nivel fisiológico se ha descrito en mamíferos que en tejidos como la piel existe bajo
pH (aproximadamente 5) y estas condiciones ácidas suelen también estar presentes
en sitios afectados por injurias, ya que los leucocitos generan una disminución del
pH a nivel local cuando se activa el estallido respiratorio (Wright y col, 1986).
En mamíferos, la concentración total de Zn2+ en el plasma (10 a 18 µM) es más baja
que lo requerido para la actividad antimicrobiana de HRG, en cambio a nivel local
como es el caso del interior de los trombocitos pueden encontrarse niveles de Zn2+
entre un 25 a 60 % más altos, los cuales se liberan al sitio de injuria, cumpliendo
una importante función en la regeneración de tejidos (Gorodetsky y col, 1993).
Una hipótesis que correlacionaría los antecedentes mostrados anteriormente y los
resultados obtenidos con la pMHCC, sería que los hemocitos, en sitios de injuria,
disminuyan el pH al activar el estallido respiratorio y aumenten los niveles de Zn2+,
siendo ésta una aproximación a las condiciones que requiere pMHCC para ejercer
su efecto antimicrobiano.
Sorprendentemente la fracción aislada desde el plasma por cromatografía de
filtración en gel correspondiente a la pMHCC eluyó en el V0 de una columna
Superdex S200 lo que muestra que en condiciones nativas, pMHCC correspondería
a un gran complejo proteico, con un tamaño mayor a 1 MDa (Figura 12). Esto difiere
de HRG en M. edulis (66kDa) que posee una estructura cuaternaria de dímero (Nair
y Robinson, 1999). La fracción que contenía a esta proteína fue sometida a
cromatografía Ni-IMAC, para demostrar de manera inequívoca que se trataba de
pMHCC (Figura 13).
71
En otros invertebrados, la proteína mayoritaria de la hemolinfa de con un “core” de
histidinas, corresponden a la proteína transportadora de oxigeno llamada
hemocianina (Van Holde y Miller 1982). Por esta razón se hicieron ensayos para
estudiar si pMHCC presentaba características de hemocianina.
Tanto el plasma de C. chorus como la pMHCC purificada fueron sometidos a
inmunodetección utilizando anticuerpos anti-hemocianina de Concholepas
concholepas y lapa, observándose señal inmunoreactiva específica en ambos casos
(Figura 14 y 15). Esto nos indica que existen epítopes comunes entre las
hemocianinas de estos 2 gastrópodos y pMHCC.
En el camarón blanco (Penaeus vannamei) se ha aislado hemocianina utilizando
Ni2+-IMAC. Esta hemocianina está compuesta por 2 subunidades de 75 y 82 kDa. A
su vez, la estructura cuaternaria de la subunidad de la apo-hemocianina tiene un
peso de 400 kDa (Ciria y col, 1997). Esta proteína corresponde al 90-95% de las
proteínas totales del plasma de este camarón (Cariolou y Flytzanis, 1993; Chen y
Cheng, 1993).
En bivalvos se han descrito hemocianinas en muy pocas especies, pertenecientes
principalmente a la familia Protobranchiae (Morse y col, 1986). En publicaciones
recientes se ha podido obtener la secuencia completa de la hemocianina de Nucula
nucleus (Bergmann y col 2007), proteína de gran tamaño y que posee asimismo un
“core” de histidinas. Sin embargo, la proporción de ésta en el plasma, a diferencia de
la proteína de cangrejos, no es tan elevada. En mitílidos no se han descrito
hemocianinas lo que hace muy atractiva la idea que la pMHCC se comporte como
una hemocianina.
72
También a las hemocianinas se les ha descrito un rol en la inmunidad innata,
relacionándolas con el sistema proPO (Decker y Jaenicke, 2004) y la liberación de
péptidos antimicrobianos (Zhang y col, 2004).
Estudios recientes han mostrado que la hemocianina del cangrejo herradura genera
especies reactivas de oxigeno (ROS) como mecanismo de defensa ante infecciones
bacterianas (Jiang y col, 2007). Este estudio muestra que la activación del
mecanismo proPO es activado por proteasas liberadas por las mismas bacterias,
conjuntamente con la liberación de ROS. En el caso de que pMHCC fuera una
hemocianina, su actividad antimicrobiana podría explicarse por este mecanismo. La
actividad profenil-oxidasa ha sido descrita en otras especies de invertebrados, como
por ejemplo en Limulus polyphemus, Eurypelma californicum y Cancer magister
(Decker y col 2001).
Durante el desarrollo de esta tesis se pudo probar la actividad antimicrobiana de la
proteína mayoritaria de la hemolinfa de C. chorus, indicando que ésta podría jugar
un gran rol en la inmunidad innata de C. chorus, como también que podría estar
relacionada en el transporte de metales bivalentes. De ser así, ésta sería la primera
vez que las funciones de hemocianina y HRG son encontradas en la misma
proteína. Sin embargo, aún no hay evidencias concluyentes al respecto por lo que
será necesario seguir investigando sobre esta interesante proteína multifuncional
que podría tener más adelante un gran futuro biotecnológico en las áreas de la salud
e investigación.
Toda esta información resalta la gran plasticidad y diversidad de funciones que en
teoría podría desarrollar pMHCC, como HRG o hemocianina e incluso una
hemocianina con características funcionales de HRG. Esta idea es concordante con
73
un cúmulo de estudios que han demostrado que una misma proteína, puede
desarrollar varias funciones de manera simultánea.
Para finalizar se estudio un componente importantísimo de la inmunidad innata, la
cual es el componente celular, los hemocitos.
La identificación de los tipos de hemocitos presentes en la hemolinfa de
invertebrados ha causado gran controversia, por lo cual existen un gran número de
publicaciones sobre su clasificación (Hine, 1999), utilizando una diversidad de
metodologías, las cuales arrojan resultados dispares o contradictorios.
Dentro de estas metodologías, las más aceptadas son las de morfología y
estructura, establecidas por Cheng en 1981, en las que se encuentran la
microscopia óptica (tinciones y microscopia de difracción) y la microscopia
electrónica (morfología de microestructuras).
La microscopia óptica posee sus limitaciones, ya que con esta técnica sólo podemos
distinguir grandes gránulos y no micro-estructuras, a diferencia de la microscopia
electrónica, que nos entrega más detalles de las estructuras celulares pequeñas.
Otra herramienta muy útil es la citometría de flujo, la cual nos permite distinguir
poblaciones por tamaño celular, presencia o ausencia de gránulos y el tamaño de
estos (Ashton-Alcox y Ford, 1998; Allam y col, 2002).
Una poderosa herramienta en la identificación de hemocitos es la centrifugación por
densidad, la cual es capaz de separar físicamente diferentes tipos de hemocitos
(Cheng y col, 1980; Bachère y col, 1988; Xue y col, 2000).
En bivalvos esta controversia se mantiene, ya que al no existir marcadores
específicos de los tipos celulares, la identificación de éstos se ha vuelto engorrosa.
Sólo existe consenso en 2 grandes tipos celulares: basófilos y eosinófilos (Cheng
1981), a su vez, estos se dividen en granulares y agranulares.
74
Otro tipo celular que se presenta constantemente en los bivalvos y moluscos en
general son los hialinos, para los cuales no se ha precisado bien los parámetros de
identificación. Algunos autores los describen como agranulares o con muy pocos
gránulos (Mix, 1976), mientras que otros lo hacen como poseedores de un gran
núcleo con escaso citoplasma sin presencia de gránulos y de un tamaño pequeño
(Cheng, 1975, 1981; Auffret, 1988; Suresh y Mohandas, 1990; Pipe, 1990a;
Kumazagua y col, 1991).
En estos últimos años una herramienta que ha servido para clarificar esta nebulosa
ha sido la identificación de las enzimas responsables de los procesos defensivos,
como la peroxidasa y profeniloxidasa (proPO) cuyo producto final es la melanina.
También se ha evaluado la fagocitosis como forma de identificación (Wootton y col,
2003b).
En este estudio se evaluó las características morfológicas por tinción de estos
hemocitos con MG-G y análisis por microscopia óptica, mediante el cual se pudo
diferenciar algunos tipos celulares, tales como basófilos, eosinófilos (granulares y
agranulares), células ricas en vacuolas con gránulos azurófilos, y agranulares
(Figura 16).
Estos tipos han sido identificados en M. edulis, en el cual se separaron por
gradientes de Percoll, tipos celulares para luego identificarlos por tinción MG-G y
microscopia de contraste de fase (Pipe y col, 1997).
En moluscos, los tamaños de hemocitos son variables de una especie a otra, incluso
dentro de la misma familia (Nakayama y col, 1997; López y col, 1997; Wootton y
Pipe, 2003; Wootton y col, 2003; Carballal y col, 1997). Tal como se muestra en la
tabla I, se ven diferencias de tamaños entre especies de bivalvos e incluso entre
75
individuos de la misma familia, como es el caso de los mitílidos, presentándose
variaciones en el tamaño de los distintos tipos de hemocitos.
Con el fin de observar lo que sucedía a nivel de inmunidad celular, se decidió
efectuar desafíos in-vivo con E. coli inactivadas por calor. Al aplicar este tipo de
desafío se potencia la acción del LPS como molécula activadora del sistema inmune
(Canesi y col, 2002; Walker y Plows, 2003).
En términos generales las respuestas inmunes mediadas por hemocitos de
moluscos reflejan las respuestas celulares innatas de vertebrados, estas involucran
receptores de superficie celular incluyendo proteínas tipo integrinas y tipo lectinas,
así como receptores capaces de unirse a citoquinas de mamíferos, factores de
crecimiento y hormonas peptídicas. De igual forma hay evidencia que sugiere que
proteínas kinasas como PKA, PKC, FAK y MAPK, proteína G pequeñas como Ras, y
segundos mensajeros como AMPc y Ca2+, participan en la regulación de las
funciones de hemocitos de moluscos como la migración celular, fagocitosis o
producción de ROS (Humphries y Yoshino, 2003).
Recientes estudios han mostrado que los receptores tipo Toll son requeridos para el
reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMS) entre los
cuales se encuentran peptidoglicano, flagelinas, CPG DNA , ssRNA y LPS; así como
para la transducción de señal que lleva a la activación de factor nuclear- kappa B
(NF-κB) y las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK), y que culmina
en la activación de respuestas inmunes celulares (Yamamoto y Akira, 2005).
Al efectuar los ensayos de desafío se observaron cambios en la morfología de estos
tipos celulares, mostrando un patrón común que correspondía a la aparición de un
pigmento café en todo el citoplasma y la desaparición de los gránulos. En hemocitos
de C. chorus, ésto comienza a las 24 h con una degranulación, y la aparición de
76
gránulos cafés que se intensifica más a las 48 h (Figura 18), asimismo se
observaron células con el núcleo lobulado (Figura 19).
Nuestros resultados son concordantes con, estudios realizados en M. edulis que
muestran la aparición de un pigmento café (melanina) en los hemocitos luego de
sufrir un desafío bacteriano. Este pigmento está relacionado con la reacción de
proPO. Esta reacción está asociada a la defensa de los hemocitos a través de la
generación de intermediarios reactivos (Quinonas, proquinonas, radicales de O2· -),
los cuales son citotóxicos (Bodgan, 2007). En los sitios de injuria, la melanina es
generada por los hemocitos sirviendo como una barrera mecánica que impide el
crecimiento del invasor o incluso eliminando al agente invasor (Cerenius y Söderhäll,
2004).
A las 24 h luego del desafío, se observó una degranulación de los hemocitos,
probablemente debida a la liberación de material antimicrobiano al plasma. Esto se
ve mejor ejemplificado en la Figura 18, en la cual se ve la desaparición de gránulos
en basófilos, y la aparición de melanina, la cual cubre todo el citoplasma a las 48 h.
En cuanto a los extractos ácidos de la hemolinfa, podemos ver que el aumento de la
actividad antimicrobiana comienza a las 24 h y alcanza su máximo a las 48 h (Figura
7). Dada la correlación entre lo obtenido con los extractos ácidos de la hemolinfa y lo
observado en las células, podemos deducir que estos dos componentes del sistema
inmune innato actuarían en conjunto en la defensa de C. chorus ante los organismos
invasores, actuando la melanina como barrera mecánica contra el avance de los
organismos invasores, y los péptidos antimicrobianos como compuestos citotóxicos
encargados de eliminarlos (Mitta y col, 2000b; Söderhall y Cerenius, 1998). A su vez
se sugiere que en la hemolinfa, actuaria pMHCC en conjunto a los péptidos
antimicrobianos apoyando así la acción del componente celular.
77
En la Figura 20 se muestra un modelo tentativo para la acción de los componentes
inmunes celular y humoral en C. chorus. En él se destacan los aportes de esta tesis,
ubicándolos en el contexto de lo que se conoce de la respuesta del sistema de
inmunidad innata en otros invertebrados marinos. En esencia se propone que los
hemocitos son activados por organismos invasores que son portadores de patrones
moleculares asociados a patógenos (PAMPs) tales como LPS activando así toda la
maquinaria defensiva celular (fagocitosis, proPO, liberación de moléculas
antimicrobianas al plasma). A su vez esta activación celular generaría las
condiciones para que actúen los componentes humorales (activación del estallido
respiratorio provocando así la diminución del pH en el sitio de injuria, y el aumento
de los niveles de Zn2+ a nivel local). En este caso la pMHCC y los péptidos liberados
desde los hemocitos al plasma, resultando en una potente respuesta inmune más
efectiva y letal para los organismos invasores.
Esto concuerda muy bien con lo presentado anteriormente, ya que al englobar la
inmunidad humoral y la celular se ven varias correlaciones directas: se observa la
degranulación de los hemocitos, con una disminución de la cantidad de material
antimicrobiano en el interior de éstos, concomitante con un aumento de la cantidad
de este material en el plasma, y un aumento de la actividad de profeniloxidasa. Todo
esto nos indica que existe una respuesta compleja y un sofisticado sistema de
coordinación de sus componentes, frente a potenciales agentes invasores. Todos los
parámetros medidos son susceptibles de ser utilizados como un sensor de
activación del sistema inmune.
78
Figura 20: Modelo hipotético de acción de los componentes inmunes en C.
chorus. En la figura se explica el mecanismo de acción conjunto de los
componentes de la inmunidad innata en C. chorus tanto a nivel celular como
humoral. Patrones moleculares asociados a patógenos activarían los componentes
inmunes generando así la respuesta celular (fagocitosis, liberación de compuestos
citotóxicos, proPO), ésto generaría las condiciones para que actúen algunos
componentes de la inmunidad humoral como pMHCC, generando así una respuesta
conjunta entre los componentes celulares y humorales de forma más efectiva.
79
6. Conclusiones
• A diferencia de lo observado en otros mitílidos, en la hemolinfa de C. chorus
se logró detectar una potente actividad antimicrobiana en la fracción del
lavado de la extracción en fase sólida, que resultó ser termosensible.
También se detectó actividad antimicrobiana tanto frente bacterias gram
negativas como positivas, en la fracción eluída de la columna SepPak C-18
con 40% de ACN
• Se demostró que el desafío de C. chorus con bacterias inactivadas produce
un aumento en la actividad antimicrobiana de la fracción del lavado de la
extracción en fase sólida.
• En la hemolinfa se detectaron distintas poblaciones de hemocitos: basófilos,
eosinófilos y hialinos. El desafío del bivalvo con una bacteria inactivada
produjo de una manera tiempo dependiente la aparición de un pigmento café
correspondiente a melanina en los hemocitos.
• Se demostró actividad antimicrobiana del Plasma de C. chorus sobre E. coli y
P. citreus. Esta actividad fue mayor cuando el ensayo se realizó a pH 5,5 y
adicionándole 50 µM Zn2+.
• Por cromatografía en Ni2+-IMAC se aisló la proteína más abundante de la
hemolinfa de C. chorus (pMHCC), lo que sugiere que esta proteína podría
corresponder a una proteína rica en histidina (HRG). Esta proteína tambien
exhibe actividad antimicrobiana a pH 5,5 y 50 µM Zn2+.
• Se inmunodetectó a pMHCC con anticuerpos específicos contra hemocianina
de Concholepas concholepas y Keyhole limpet y a su vez se determinó que la
pMHCC probablemente presenta estructura cuaternaria ya que su PM
80
aparente en condiciones nativas fue mayor a 1 MDa lo cual concuerda con el
gran tamaño que presentan las hemocianinas de otros invertebrados
81
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