AŞI SUŞU OLARAK KULLANILACAK ŞAP VİRUSU PLAK ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/27341/TEZ.pdf · Uzm.Vet.Hek.Hidayet BOZOĞLU ve Kontrol Bölümü’nde görevli laborant arkadaşlarım

TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ

SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

AŞI SUŞU OLARAK KULLANILACAK ŞAP VİRUSU PLAK

MORFOLOJİSİNDEKİ FARKLILIKLARIN

GENETİK OLARAK İNCELENMESİ

Müge FIRAT SARAÇ

VİROLOJİ ANABİLİM DALI

DOKTORA TEZİ

DANIŞMAN

Prof. Dr. Yılmaz AKÇA

2011- ANKARA

TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ

SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

AŞI SUŞU OLARAK KULLANILACAK ŞAP VİRUSU PLAK

MORFOLOJİSİNDEKİ FARKLILIKLARIN

GENETİK OLARAK İNCELENMESİ

Müge FIRAT SARAÇ

VİROLOJİ ANABİLİM DALI

DOKTORA TEZİ

DANIŞMAN

Prof. Dr. Yılmaz AKÇA

Bu tez, Tarımsal Araştırmalar Genel Müdürlüğü tarafından TAGEM/HS/11/14/01/195 proje

numarası ile desteklenmiştir.

2011 – ANKARA

iii

İÇİNDEKİLER

Kabul ve Onay ii

İçindekiler iii

Önsöz vi

Simgeler ve Kısaltmalar vii

Şekiller ix

Çizelgeler x

1. GİRİŞ 1

1.1. Genel Bilgiler 1

1.2. Etiyoloji 2

1.2.1. Şap Virusunun Genel Özellikleri 2

1.2.2. Şap Virusu Genomunun Özellikleri 3

1.3. Epidemiyoloji 6

1.3.1. Şap Virusunun Tipleri ve Moleküler Epidemiyolojisi 7

1.4. Patogenez ve Patoloji 9

1.5. Klinik Belirtiler 10

1.6. Şap Viruslarının Teşhisi ve Tiplendirilmesi 11

1.7. Kontrol ve Mücadele 13

1.8. Türkiye’de Şap Hastalığının Durumu 14

1.9. Plak Morfolojisi ve Mutasyonlar 16

1.10. Tezin Amacı 18

2. GEREÇ VE YÖNTEM 19

2.1. GEREÇ 19

2.1.1. Hücre Kültürü 19

2.1.2. Araştırmada Kullanılan Viruslar 19

2.1.2.1. Aday Viruslar 19

2.1.2.2. Kontrol Viruslar 20

iv

2.1.3. Primerler 21

2.2. YÖNTEM 23

2.2.1. Hücre Kültürlerinin Hazırlanması 24

2.2.2. Epitelden Virus Süspansiyonunun Hazırlanması 25

2.2.3. Virus İzolasyonu 25

2.2.4. İndirekt Sandviç ELISA 26

2.2.5. Plak Test 27

2.2.6. RNA Ekstraksiyonu 28

2.2.7. Viral RNA’nın Ters Transkripsiyonu 29

2.2.8. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) 30

2.2.9. PCR Ürününün Agaroz Jel Elektroforezi 31

2.2.10. PCR Ürününün Agaroz Jelden Purifiye Edilmesi 32

2.2.11. Nükleotid Dizileme Reaksiyonu ve Elde Edilen Nükleotid

Dizilerin Değerlendirilmesi

33

3. BULGULAR 34

3.1. Virus İzolasyonu 34

3.2. İndirekt Sandviç ELISA 34

3.3. Plak Test 35

3.3.1. Aday Virus 1 (A tipi 1) 35





3.3.6. Aday Virus 6 (O tipi 1) 37





3.3.11. A22 Irak Kontrol Virusu 38

3.3.12. A Tur 04-06 Kontrol Virusu 38

3.3.13. O1 Manisa Kontrol Virusu 38

v

3.4. PCR 58

3.5. Nükleotid Dizileme Reaksiyonu 58











3.5.11. A22 Irak Kontrol Virusu 61

3.5.12. A Tur 04-06 Kontrol Virusu 62

3.5.13. O1 Manisa Kontrol Virusu 62

4. TARTIŞMA 64

5. SONUÇ VE ÖNERİLER 76

ÖZET 79

SUMMARY 80

KAYNAKLAR 81

EKLER 93

Ek - 1 Standart genetik kodlar 93

Ek - 2 Amino asitler ve sembolleri 93

Ek - 3 VP1 genine ait diziler 94

Ek - 4 3A genine ait diziler 109

Ek - 5 cre genine ait diziler 114




ÖZGEÇMİŞ 135

vi

ÖNSÖZ

Şap hastalığı, çift tırnaklı hayvanların akut ve çok bulaşıcı viral bir hastalığıdır. Hastalığın etkeni olan şap virusunun yedi farklı serotipi (O, A, C, Asia1, SAT1, SAT2 ve SAT3) vardır. Bir tiple geçirilen hastalık sonucu diğer tiplere karşı koruyucu antikor oluşmaması, şap virusunun rüzgarla bulaşma dahil çeşitli yayılma modelleri ile bir ülkenin kendi içinde ve sınırları geçerek hastalığın görülmediği bölgelerde hastalığın oluşabilmesi, ülkemiz için kaçak hayvan hareketlerinin kontrolünün zorluğu ve RNA’lı olan virusun tür benzeri yapısında olması hastalıkla mücadeleyi güçleştiren sebeplerdendir. Diğer RNA’lı viruslarda olduğu gibi yüksek mutasyon oranı ve hızlı replike olabilme yeteneğinin beraberinde getirdiği tür benzeri yapı sebebi ile şap virusu populasyonları genetik ve antijenik olarak heterojendir, varyantların karışımından oluşur ve bu nedenle mevcut aşı suşlarının koruma oluşturmadığı yeni alttip ve varyantların oluşumu sık olarak şekillenmektedir. Hastalığın endemik olduğu bölgelerde kontrol uygulaması olarak hayvanlar yılda en az iki kere aşılanmaktadır. Şap aşılarının hazırlanmasında aşının formülasyonuna katılan suşun sahada seyreden salgının etkeni olan suşa karşı koruma oluşturması gerekmektedir. Aşıların hazırlanmasında önemli konulardan bir tanesi de büyük hacimli hücre kültürlerinde plak morfolojisi yönünden orijin virusla aynı özelliklerde virus üretilmesidir. Şap viruslarının monolayer ve süspanse hücre kültürlerine adaptasyonları sırasında ortaya çıkan farklı plak fenotiplerinin genetik düzeyde incelenmesi için söz konusu fenotipik değişikliklerden sorumlu olabilecek mutasyonların sorgulanması, şap virusu ve şap aşısı üretimine yönelik çalışmalara katkı sağlayabilir. Bu tez çalışması Tarımsal Araştırmalar Genel Müdürlüğü (TAGEM) tarafından TAGEM/HS/11/14/01/195 proje numarası ile desteklenmiştir. Tez çalışmamda yardımlarını esirgemeyen Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Viroloji Anabilim Dalı Başkanı Prof.Dr.İbrahim BURGU’ya, Danışman Hocam Prof.Dr.Yılmaz AKÇA’ya, çalışmamın her aşamasında yardım ve desteklerini gördüğüm Prof.Dr.Aykut ÖZKUL ve Prof.Dr.Feray ALKAN’a, değerli katkılarından dolayı Tez İzleme Komitesi Üyelerine ve Viroloji Anabilim Dalı Öğretim Üyelerine, çalışmalarımın yürütülmesini sağlayan Şap Enstitüsü Müdürlüğü’ne, yardım ve katkılarını eksik etmeyen Moleküler Epidemiyoloji Laboratuvarı’nda görevli Dr.Ünal PARLAK ve Uzm.Vet.Hek.Fuat ÖZYÖRÜK’e, Kontrol Bölüm Başkanı Uzm.Vet.Hek.Hidayet BOZOĞLU ve Kontrol Bölümü’nde görevli laborant arkadaşlarım Banu BAYRİ ÖZBİLGE ile Ömer ŞİŞMAN’a, Tip Tayini, Hücre Bankası ve Süspanse Hücre Kültürü Laboratuvarları personeline, sonsuz manevi destekleri ile her zaman yanımda olan Nilüfer’e, Babam’a ve Eşim Erkin’e ve teşekkürün yetersiz kalacağı Annem’e teşekkürlerimi sunarım.

vii

SİMGE ve KISALTMALAR

aa Amino asit

An30-31 Ankara30-31

A/C/G/T Adenine/Cytosine/Guanine/Thymine

BHK Baby Hamster Kidney

bp base pair

°C degree Celsius

cDNA complementary Deoxyribose Nucleic Acid

CHO Chinese Hamster Ovary

Cl-13 BS31 Clone-13 Brescia31

cm2 Santimetrekare

CO2 Karbondioksit

CPE Cytopathological Effect

cre cis-acting replication element

DNA Deoksiribonükleik Asit

DNaz Deoksiribonükleaz

dNTP Deoksi-Nükleotid Trifosfat

DTT Dithiothreitol

EDTA Etilen Daimin Tetra Asetik Asit

EITB Enzyme Linked Immuno Electrotransfer Blot

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

FMDV Foot-and-Mouth Disease Virus

GMEM Glasgow Minimum Essential Medium

HSPG Heparan Sülfat Proteoglikan

IBRS Swine Kidney Cell Line

ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses

Ig Immunglobulin

viii

IRES Internal Ribozomal Entry Site

L Litre

Log Logaritma

MgCl2 Magnezyum klorür

mg Miligram

µg Mikrogram

ml Mililitre

µl Mikrolitre

µm Mikrometre

mM Milimolar

mRNA messenger RNA

MMLV Moloney Murine Leukemia Virus

MOI Multiplicity of Infection

NASBA Nucleic Acid Sequence Based Amplification

nt Nükleotid

O.D. Optical Density

OIE Office International des Epizootica (Dünya Hayvan Sağlığı Örgütü)

ORF Open Reading Frame

PFU Plaque Forming Unit

RNA Ribonucleic Acid

RNaz Ribonükleaz

RT-PCR Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction

SAT South African Territories

SP Sığır Pasajı

TPB Tryptose Phosphate Broth

TUR TÜRKİYE

UTR Untranslated Region

VIAA Virus-Infection Associated Antigen

VP1-4 Viral Protein1-4

VPg Virus genome-linked protein

WRL World Reference Laboratory

ix

ŞEKİLLER

Şekil 1.1. Şap virusunun 5’UTR’sinde yer alan yapılar 4

Şekil 1.2. Şap virusunun genomu ve translasyon ürünleri 5

Şekil 1.3. VP1 geni nükleotid dizilerine göre tanımlanmış şap virusu O (a) ve A

(b) topotipleri

9

Şekil 2.1.1. BHK-21 An31 (a) ve BHK-21 An30 (b) monolayer hücre kültürlerinin

mikroskop altındaki görüntüleri

19

Şekil 3.1. Virus 1’e ait P1 (a), P11 (b) ve P15 (c) plak görüntüleri 39

Şekil 3.2. Virus 2’ye ait P1 (a), P12 (b) ve P15 (c) plak görüntüleri 39

Şekil 3.3. Virus 3’e ait P1 (a), P2 (b), P7 (c) ve P15 (d) plak görüntüleri 39

Şekil 3.4. Virus 4’e ait P1 (a), P18 (b) ve P15 (c) plak görüntüleri 40

Şekil 3.5. Virus 5 e ait P1 (a), P11 (b) ve P15 (c) plak görüntüleri 40

Şekil 3.6. Virus 6’ya ait P4 (a), P16 (b) ve P15 (c) plak görüntüleri 40

Şekil 3.7. Virus 7’ye ait P1 (a), P6 (b) ve P15 (c) plak görüntüleri 41

Şekil 3.8. Virus 8’e ait P1 (a), P6 (b), P10 (c), P11 (d) ve P15 (e) plak görüntüleri 41

Şekil 3.9. Virus 9’a ait P1 (a), P9 (b), P11 (c) ve P15 (d) plak görüntüleri 42

Şekil 3.10. Virus 10’a ait P1 (a), P10 (b) ve P15 (c) plak görüntüleri 42

Şekil 3.11. A22 Irak kontrol virusuna ait P1 (a), P12 (b) ve P15 (c) plak görüntüleri 43

Şekil 3.12. A Tur 04-06’ ya ait P1 (a), P7 (b) ve P15 (c) plak görüntüleri 43

Şekil 3.13. O1 Manisa kontrol virusuna ait P1 (a), P9 (b) ve P23 (c) plak

görüntüleri

43

x

ÇİZELGELER

Çizelge 2.1.1. Çalışmada kullanılan aday viruslara ait bilgiler 20

Çizelge 2.1.2. Çalışmada kullanılan aşı suşu niteliğindeki kontrol viruslara ait

bilgiler

20

Çizelge 2.1.3. Çalışmada kullanılan primerler 22

Çizelge 2.2.1. Çalışmada kullanılan referans nükleotid dizilere ait bilgiler 33

Çizelge 3.1. Virus 1’e ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri 44

Çizelge 3.2. Virus 2’ye ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri 45




Çizelge 3.6. Virus 6’ya ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri 49

Çizelge 3.7. Virus 7’ye ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri 50


Çizelge 3.9. Virus 9’a ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri 52

Çizelge 3.10. Virus 10’a ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri 53

Çizelge 3.11. A22 Irak kontrol virusuna ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve

plak test bilgileri

54

Çizelge 3.12. A Tur 04-06 kontrol virusuna ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve

plak test bilgileri

55

Çizelge 3.13. O1 Manisa kontrol virusuna ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve

plak test bilgileri

56

Çizelge 3.14. Çalışılan virusların cre, VP4, VP2, VP3, VP1 ve 3A gen

bölgelerinde tespit edilen aminoasit değişimleri

63

1

1. GİRİŞ

1.1. Genel Bilgiler

Şap hastalığı ülkeler arası canlı hayvan ve hayvansal ürün ticaretini olumsuz yönde

etkileyen, büyük ekonomik kayıplara neden olan, çift tırnaklı hayvanların akut ve

çok bulaşıcı viral bir hastalığıdır (Bachrach, 1968; Pereira, 1981; Gebauer ve ark.,

1988). Hastalığın ilk yazılı tanımlaması Fracastorius tarafından İtalya’da 1546

yılında yapılmıştır. 1897 yılında ise Loeffler ve Frosch şap hastalığına filtre edilebilir

ve bakterilerden daha küçük özellikte bir ajanın sebep olduğunu bularak, hayvanlarda

hastalığa neden olan bir virusun ilk olarak tanımlamasını yapmışlardır (Bachrach,

1968; Samuel ve Knowles, 2001; Sobrino ve ark., 2001). Hayvan ve hayvansal

ürünlerin ulusal ticaretinde en önemli sınırlama olarak bilinen şap hastalığı Dünya

Hayvan Sağlığı Örgütü (OIE)’nün hastalıktan ari ülkeler ve bölgeler için resmi bir

liste oluşturduğu ilk hastalıktır (Archetti ve ark., 1994; Leforban, 1999; Sobrino ve

ark., 2001; Alexandersen ve ark., 2003).

Şap virusu diğer tek iplikçikli RNA viruslarında olduğu gibi doğal şartlarda

yüksek mutasyon oranına sahiptir ve antijenik olarak birbirinden farklı yedi serotipi,

çok sayıda alttipi ve varyantı vardır (Sobrino ve ark., 1986; Steinhauer ve Holland,

1987). Bu çeşitlilik, hastalıkla mücadelede aşı kullanımını güçleştiren bir etmendir.

Hastalığın endemik olduğu ülkelerde uygun serotipte inaktif aşılarla yapılan

koruyucu aşılamalar ile hastalığın insidensinin düşürülmesine yönelik önlemler

alınmaktadır (Doel, 2003). Mevcut aşıların koruma oluşturamadığı sahadaki yeni

antijenik varyantların varlığı şap aşısı üretiminde önemli bir problemdir. Bir serotip

içindeki antijenik varyasyon uygun aşının etkisiz olmasına yol açabilir. Belli bir

salgın için uygun aşı suşunun ve yeterli antijenik kütleyi üretebilmek için hücre

kültüründe yüksek ürün vererek üreyen virusların seçilmesi önemlidir. Bunun için aşı

üretiminde kullanılmak üzere, sahada salgına neden olan virusun hücre kültüründe

pek çok ardışık pasajının yapılması gerekir (Piatti ve ark., 1995).

2

1.2. Etiyoloji 1.2.1. Şap Virusunun Genel Özellikleri

Şap virusu Picornavirales takımı, Picornaviridae ailesi, Apthovirus cinsi içerisinde

yer alır. Picornaviridae ailesi Ağustos 2009’da Uluslararası Virus Taksonomi

Komitesi (ICTV) tarafından resmi olarak tanınan 12 cinsten oluşur (Enterovirus,

Cardiovirus, Apthovirus, Hepatovirus, Parechovirus, Erbovirus, Kobuvirus,

Teschovirus, Sapelovirus, Senecavirus, Tremovirus ve Avihepatovirus) (Knowles,

2009; ICTV Picornaviridae Study Group, 2009).

Şap virusu, pH 7-9 değerleri arasında stabil olmakla beraber virusun en

dayanıklı olduğu pH değerleri pH 7,2-7,6 arasındadır. Şap virusu, çeşitli kimyasal

maddeler ile asit (asetik, formik, fosforik, sitrik, sülfürik asitler) ve alkali (sodyum

karbonat, sodyum metasilikat, sodyum hidroksit) pH değerlerinde inaktive olur. Şap

virusunun saha şartlarında inaktivasyonu için yüzde dörtlük sodyum karbonat ve

yüzde birlik sodyum hidroksit kullanılabilir (Shafyi, 1968; Olechnowitz ve Engler,

1970). Virus asit şartlara (<pH 6,0) (Randrup, 1954), 50°C’nin üzerindeki

sıcaklıklara ve morötesi ışığa karşı hassas olmakla beraber kontamine yemde ve

uygun iklime sahip çevre koşullarında bir aya kadar, kemik iliği ve lenf bezlerinde

ise uzun süre persiste kalabilir (Wild ve ark., 1969).

Şap virusunun in vivo izolasyonunda, süt emen fareler ve kobayların deney

hayvanı olarak kullanılabileceği belirtilmiştir (Rowlands, 2008). Şap virusunun geniş

çaplı üretimi için in vitro metotların geliştirilmesinin gerekli olduğu anlaşıldıktan

sonra, sığır dil epitel hücrelerinin virusun geniş çaplı üretiminde kullanılabileceği

gösterilmiştir. Şap virusunun üretiminde monolayer ve süspanse hücre hatlarının

avantajları fark edildikten sonra ise, virusun çoğaltılmasında domuz böbrek (PK) ve

bebek hamster böbrek (BHK) hücre kültürleri kullanılmaya başlanmıştır (Brown,

2003). Şap virusunun in vitro olarak üretildiği diğer hücre kültürleri; dana tiroid,

dana testis, dana böbrek, kuzu böbrek, domuz böbrek ve sığır dil epiteli gibi primer

3

ve Mengeling-Vaughn domuz böbrek hücre hattı (MVPK-1), sığır böbrek hücre hattı

olan LF-BK, domuz böbrek hücre hattı olan IBRS ve hamster akciğer hücre hattı

olan HmLu gibi devamlı hücre kültürleridir (Aktaş, 1998).

1.2.2. Şap Virusu Genomunun Özellikleri Şap virusu partikülü küresel, yaklaşık 30 nanometre çapında ve zarfsızdır. Tek

iplikçikli, pozitif polariteli ve enfeksiyöz genomik RNA’nın tekli bir kopyası ile

birlikte virus tarafından kodlanan ve ikozahedral bir kapsit oluşturan dört değişik

kapsit proteininin; VP1 (1D), VP2 (1B), VP3 (1C) ve VP4 (1A) 60 kopyasından

oluşur.

Şap virusu genomu yaklaşık 8 500 nükleotidden oluşur (Clarke ve ark., 1987).

Viral genom tek bir açık okuma alanı (ORF) içerir ve iki ayrı çevrilmeyen bölgeye

(5’UTR ve 3’UTR) ayrılır (Sobrino ve ark., 2001). 1 300 nükleotid uzunluğunda olan

şap virusu 5’UTR’si, diğer picornaviruslara göre oldukça uzundur (Rowlands, 2008).

5’UTR’de bulunan gen bölgelerinden; S-parçasının (Belsham, 2005), uzunluğu farklı

izolatlara göre 80-450 nükleotid arasında değişen poli (C) bölgesinin (Harris ve

Brown, 1977; Escarmis ve ark., 1992) ve birbiri ardından tekrar edilen çoklu (2-4)

pseudo düğümlerin genomdaki rolleri henüz bilinmemektedir. RNA replikasyonuna

katılan bir ilmek yapısı olan cis-aracılı replikasyon elemanı (cre), diğer

picornaviruslarda genomun değişik yerlerinde bulunmakla beraber sadece şap virusu

genomunda kodlayıcı bölgenin dışında ve 5’UTR’de yer almaktadır. Bu bölge RNA

sentezinin başlaması için gerekli korunmuş bir motif olan AAACA dizisine sahiptir

(Belsham, 2005). Cre’den sonra yaklaşık 450 nükleotid uzunluğunda olup

translasyonun internal başlangıcına katılan internal ribozomal giriş bölgesi (IRES) yer

alır. Translasyon, IRES’de bulunan ve 84 nükleotidden oluşan 2 AUG kodonu ile

başlar (Sobrino ve ark., 2001; Mason ve ark., 2003).

4

Şekil 1.1. Şap virusunun 5’UTR’sinde yer alan yapılar (Rowlands, 2008)

Enfekte hücrelerdeki şap virusu RNA’sı; VPg (3B) proteininin, genomik

RNA’nın 5’UTR’sine bağlanmasından sonra şapka yapısını kaybederek serbest bir

5’UTR’sine sahip olur. VPg hücresel bir enzim tarafından bölündükten sonra, IRES

yönetiminde bir poliprotein üretilir. Bu poliproteinin viral proteazlar tarafından

bölünmesi sonucu, genom replikasyonuna destek veren ve yeni bir enfeksiyon

siklusu başlatacak yeni virus partiküllerinin üretimi için gerekli olan çeşitli yapısal ve

yapısal olmayan proteinler şekillenir (Mason ve ark., 1994; Racaniello, 2007).

Poliproteinin ilk bileşeni L proteindir (Mason ve ark., 2003; Belsham, 2005). Daha

sonra kapsit protein öncüsü P1 gelir.

P1 viral proteazlar tarafından parçalanarak VP0, VP1 ve VP3 protomerlerine

ayrılır. Beş protomer birleşerek bir pentameri ve oniki pentamer de birleşerek boş

kapsiti oluşturur. Kapsit, yeni sentezlenmiş bir RNA molekülü ile birlikte provirionu

oluşturur. Son olgunlaşma basamağı ise VP0’ın VP4 ve VP2’ye parçalanması ile

virionun salınmasını kapsar (Fox ve ark., 1987; Mason ve ark., 1994; Verdaguer ve

ark., 1994). Yapısal proteinlerin virion içinde üç boyutlu düzenlenmeleri, aşılama ve

enfeksiyona karşı yanıta neden olan antijenik bölgeleri sağlar. Bu yapılar ayrıca;

hücre reseptörlerine bağlanma, genomun hücrelere girişi ve kapsitin çevresel

faktörlere karşı dayanıklılığını belirlemeye aracılık eder (Hernandez ve ark., 1996;

Mason ve ark., 2003). VP1, VP2 ve VP3 kapsit yüzeyinde bulunurken, VP4 RNA ile

temas eden içsel bir proteindir (Grubman ve Baxt, 2004; Belsham, 2005; Fry ve ark.,

2005). Diğer picornaviruslara göre şap virusunun protein tabakası genellikle daha

5

ince ve dış yüzeyi daha pürüzsüz olup (Rowlands, 2008), konakçı hücre reseptörü ile

etkileşimde rol oynayan ve geçici bir çıkıntı olan kanyona sahip değildir (Hogle ve

ark., 1985). Dış yüzeydeki genel pürüzsüz yapı için VP1’in yüzeyinde bir çıkıntı

oluşturan, 140-160 aminoasit dizisinde yer alan ve immunodominant antijenik

bölgeyi kapsayan G-H kıvrımı bir istisnadır (Acharya ve ark., 1989).

Şekil 1.2. Şap virusunun genomu ve translasyon ürünleri (Racaniello, 2007)

P2 ve P3 öncüleri yapısal olmayan proteinleri (2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D)

kodlar. 2A proteininin viral replikasyonda rolü olduğu düşünülmektedir. 2B ve 2C

proteinleri endoplazmik retikulumdan golgi aparatına doğru olan transportu bloke

ederek salgısal yolu inhibe ederler (Moffat ve ark., 2007). Ayrıca RNA replikasyonu,

yapısal proteinlerin katlanması ve virus kaynaklı sitopatik etkilerde görev alırlar. 3A

ve 3B proteinleri hücresel membranlar ile çok yakından ilişkili kritik RNA

replikasyonu faktörleridir (Mason ve ark., 2003). 3A’nın hücresel membranlar ile

etkileşiminin sitopatik bir etkiye neden olduğu gösterilmiştir (Beard ve Mason, 2000).

2B ve 3C proteinlerinin serotipler arasında en çok korunan bölgeler oldukları

belirtilmiştir (Carrillo ve ark., 2005). 3’UTR ise, heterojen dizilimli yaklaşık 100

nükleotid uzunluğunda bir bölge ve poli (A) bölgesi olmak üzere iki bileşenden oluşur

(Belsham, 2005).

6

Şap virusu hücre içine alındığında, replikasyonun ilk basamağı olan viral

RNA’nın translasyonu şekillenir. RNA, replikasyonda mRNA işlevi görür (Mason ve

ark., 2003). Genomun replikasyonu, 3D proteini (virus tarafından kodlanan RNA

polimeraz) tarafından cre’nin yardımı ile gerçekleştirilir (Goodfellow ve ark., 2003;

Bedard ve Semler, 2004). Viral RNA’nın tek bir molekülü enfeksiyonu başlatmak için

yeterlidir. Şap virusunun RNA bağımlı polimerazının düşük doğruluğa sahip olduğu

ve kopyalanan 103-105 nükleotidde bir mutasyon oranı ile mutant soyların devamını

arttırdığı öngörülmektedir (Holland ve ark., 1982; Sobrino ve ark., 1983). Şap virusu

populasyonları genetik ve antijenik olarak heterojendir, varyantların karışımından

oluşur ve diğer RNA virusları gibi tür benzeri (quasispecies) yapısındadır (Martinez

ve ark., 1992; Sa-Carvalho ve ark., 1997; Domingo, 2002).

1.3. Epidemiyoloji Şap hastalığı Afrika, Asya ve Güney Amerika’nın büyük bölümünde endemiktir.

Ayrıca uluslararası sınırları geçerek daha önceden hastalıktan ari olan bölgelerde

epidemilere neden olduğu 2000 yılında Japonya ve Güney Kore, 2001 yılında ise

İngiltere ve Avrupa’daki salgınlarda gösterilmiştir (Knowles ve ark., 2001). OIE’nin

haftalık hastalık bilgilerine göre 2010 yılında Japonya ve Güney Kore’de, 2011

yılında ise Bulgaristan’da hastalık tekrar teşhis edilmiştir (OIE, Hayvan Sağlığı

Bilgileri, Haftalık Hastalık Bilgisi-WAHID Interface, 2010-2011). Şap virusunun

geniş bir konakçı aralığına sahip olması, enfekte hayvanlar tarafından yüksek

konstantrasyonda salınması, duyarlı hayvanlarda küçük dozlarla bile enfeksiyon

oluşturabilmesi, hızlı bir replikasyon sürecine sahip olması ve rüzgarla yayılım dahil

çoklu bulaşma modelleri ile yayılabilmesi gibi özelliklerinden dolayı şap hastalığı

kontrol ve eradikasyonu zor ve pahalı olan bir hastalıktır (Donaldson ve ark., 1982).

Artiodactyla takımı içinde bulunan hayvanlar, birkaç istisna dışında şap

hastalığına duyarlıdır. Hastalığın epidemiyolojisinde büyük öneme sahip olan sığır,

domuz, koyun ve keçi, özellikle Asya ve Güney Amerika’da su bufaloları, Afrika

bufaloları, kudu ve impalalar hastalığın doğal epidemiyolojisinde rol oynayan

7

gruptur. Geyik, deve, lama, Hindistan filleri ise belli şartlar altında epidemiyolojik

risk oluşturabilecek hayvanlardır (Alexandersen ve Mowat, 2005). Şap virusu genel

olarak enfekte hayvan hareketleri ile, daha az sıklıkta ise kontamine hayvan ürünleri

ile yayılır (Alexandersen ve ark., 2002). Duyarlı hayvanlar şap virusu ile enfekte

diğer hayvanlar veya enfekte bir çevre ile aracısız veya aracılı temas sonucunda

enfekte olabilirler (Alexandersen ve ark., 2003). Uzun menzilli hava yolu ile bulaşma

nadir görülmesine rağmen, uygun iklim ve meteoroloji koşullarında virusun rüzgarla

yayılabilmesi de önemli bir bulaşma şeklidir (Alexandersen ve ark., 2002;

Alexandersen ve ark., 2003; Alexandersen ve Mowat, 2005).

1.3.1. Şap Virusunun Tipleri ve Moleküler Epidemiyolojisi Şap virusunun genetik heterojenite ve çeşitliliği sonucu, özellikle virusun antijenik

özelliklerini önemli ölçüde etkileyen kapsit proteinlerinin yüzey kıvrımlarında oluşan

aminoasit değişimlerine göre serolojik olarak yedi serotipi (O, A, C, Asia1, SAT1,

SAT2 ve SAT3) tanımlanmıştır (Bachrach, 1968; Pereira, 1981). Serotipler;

epidemiyolojik olarak çeşitlilik gösterir, aralarında çapraz bağışıklık yoktur ve her

serotip kendi içinde alttiplere ayrılmaktadır. Bu çeşitliliğin yüksek mutasyon oranı,

tür benzeri populasyon dinamikleri (Domingo ve ark., 2005) ve rekombinasyon

(Carrillo ve ark., 2005; Jackson ve ark., 2007) sonucu olduğu düşünülmektedir. Bu

nedenle şap virusunun bir serotipi ile geçirilen hastalık veya bir serotipe karşı yapılan

aşılama, diğer serotiplere ve bazen aynı serotip içinde bulunan diğer alttiplere karşı

çapraz koruma oluşturmaz (Brooksby, 1982; Mattion ve ark., 2004). Şap virusu

serotiplerinin dünya üzerindeki dağılımı eşit değildir. A ve O serotipleri yayılımı en

fazla görülen serotiplerdir ve Afrika’nın pek çok bölgesinde, Asya’nın çeşitli

bölgelerinde, Uzak Doğu’da (A serotipi bu bölgede görülmez) ve Güney Amerika’da

görülür. SAT serotipleri sadece Afrika kıtasında görülür. C serotipi Hint Alt

Kıtası’nda ve Asia1 serotipi ise genelde Güney Asya’da görülür. Şap virusunun yedi

serotipi nükleotid ve aminoasit dizileri gruplandırıldığında tip spesifik dallara,

coğrafik dağılımlarına göre ise topotip (genotip) olarak adlandırılan genetik gruplara

8

ayrılır. Yüzde seksenbeşten fazla nükleotid benzerliği olan izolatlar aynı grup veya

topotip içerisine alınır (Knowles ve Samuel, 2003).

O serotipi şap virusları, VP1 geni nükleotid dizileri karşılaştırıldığında genetik

ve coğrafik olarak birbirlerinden farklı evrimsel soylar olan on adet topotipe ayrılır.

Bu topotipler; Avrupa-Güney Amerika (Euro-SA), Orta Doğu-Güney Asya (ME-

SA), Güneydoğu Asya (SEA), Katay (CHY), Batı Afrika (WA), Doğu Afrika-1 (EA-

1), Doğu Afrika-2 (EA-2), Doğu Afrika-3 (EA-3), Endonezya-1 (ISA-1) ve

Endonezya-2 (ISA-2) olarak adlandırılır. Endonezya topotipleri 1983’den beri tespit

edilememiştir ve kayboldukları düşünülmektedir (Knowles ve ark., 2005). 1999

yılında Tayvan’da farklı bir O alttipi tespit edilmiştir. O PanAsia olarak

isimlendirilen bu alttip Asya’dan Türkiye’ye ve 2001 yılında İngiltere’ye kadar

ulaşmıştır (Mahy, 2005). Filogenetik karşılaştırmalar sonucunda ME-SA

topotipindeki şap viruslarının, 2001 yılından itibaren Orta Doğu ve Güney Asya’dan

izole edilen O serotipi viruslar arasında baskın duruma geçtiği belirlenmiştir. Orijinal

PanAsia suşunun değişime uğraması ile birçok virus dalı ortaya çıkmıştır ve

bunlardan bir tanesi olan O PanAsia-2 pandemik suşu Hindistan’dan batıya doğru

yayılarak 2008 ve 2009’da Orta Doğu’da yeni salgınlarla devam etmiştir. O PanAsia-

2, 2005 yılından beri Pakistan’ın batısındaki bölgede diğer bütün O serotipi

suşlarının yerini almıştır (Knowles ve ark., yayınlanmamış veri).

Yedi serotip içerisinde en fazla yeni alttip oluşumunun görüldüğü ve bu

sebeple aşılama ile kontrolde zorluklara sebep olan serotip A’dır (Kitching, 2005). A

serotipinin epidemiyolojisinde alt dalların çok sık görülmesi ve bu serotip içinde çok

fazla antijenik çeşitlilik oluşmasının sebebinin, az gözlemlenen bölgeler ve türler

içerisinde virusun uzun süreli sirkülasyonu esnasında düzenli olarak şekillenen

rekombinasyonlar olabileceği bildirilmiştir (Kitching, 2005; Li ve ark., 2007).

Bununla birlikte birçok yeni A serotipi suşunun düzenli olarak ortaya çıkıp daha

sonra neden kaybolduğu hala bilinmemektedir (Kitching, 2005). Knowles ve Samuel

(2003) tarafından üçyüz tane tam ve kısmi VP1 nükleotid dizisinin karşılaştırılması

sonucu; Avrupa-Güney Amerika (Euro-SA), Asya ve Afrika olmak üzere üç tane A

topotipi bildirilmiştir. Dünya Referans Laboratuvarı (WRL)’nın verilerine göre 2005

9

yılında İran’da A serotipinin yeni bir suşu tespit edilmiştir. A/IRN/2005 olarak

olarak isimlendirilen bu suş hızla İran dışına yayılmıştır. Bu suşun yapısal genom

bölgeleri evrimsel başlangıç noktalarını A22 suşundan almaktadır. A/IRN/2005

suşunun çok yüksek virulense sahip olduğu ve bütün yaş gruplarındaki sığırlarda

şiddetli hastalık belirtilerine sebep olduğu tespit edilmiştir (Klein ve ark., 2007).

(a) (b)

Şekil 1.3. VP1 geni nükleotid dizilerine göre tanımlanmış şap virusu O (a) ve A (b) topotipleri (Knowles ve Samuel, 2003)

Asia1 serotipi antijenik olarak diğer serotiplere göre daha az düzeyde değişiklik

göstermektedir ve tek bir genotip içerisinde iki ayrı gruba ayrıldığı bildirilmiştir

(Muthuchelvan ve ark., 2001). Başka bir çalışmada ise Asia1’in genotip I-IV olarak

bilinen dört farklı genotipe ayrıldığı bildirilmiştir (Gurumurthy ve ark., 2002).

1.4. Patogenez ve Patoloji Şap virusu vücuda giriş bölgesinde (üst solunum yolunun mukoza ve lenfoid

dokusunda veya deri bütünlüğünün bozulduğu bölgelerde dermal ve subdermal

dokuda) replike olmakla beraber (Kitching, 2002a), çoğunlukla farengeyal bölgedeki

boynuzlaşmamış hücreler primer enfeksiyon bölgesidir (McVicar ve Sutmoller,

1976). Virus daha sonra serbest olarak veya mononükleer hücreler ile ilişkili şekilde

10

kan dolaşımına geçer ve vücuda yayılarak sekonder replikasyonun şekillendiği

glanduler doku, deri ve ağızda bulunan boynuzlaşmış stratum spinosum tabakasında

affinite gösterdiği alanlara gider. Buradaki hücrelerde veziküller şekillenir.

Veziküllerin birleşmesi ile hastalığın karakteristik özelliğini oluşturan aft ve bullalar

oluşur. Bunlar genellikle kabuklaşır ve kabuklar yirmidört saat sonra düşer.

Kabukların ayrılmasından sonra kırmızı renkte ülserler açığa çıkar. Birkaç gün sonra

lezyonların üzerinde nekrotik epitel parçaları meydana gelir. Özellikle ağız

bölgesinde ve dil üzerinde hastalığa özgü granülasyon dokusu oluşur. Rumen,

retikulum ve omasum epitelinde makroskopik lezyonlar gelişebilir. Virus genç

hayvanlarda miyokardium hücrelerine saldırır ve özellikle sol ventrikül duvarında

çizgili bir görünüm şeklinde makroskopik gri alanlar gözlemlenebilir. İskelet kası

hücrelerinde hiyalin dejenerasyonu şekillenebilir (Kitching, 2002a; Alexandersen ve

ark., 2003).

1.5. Klinik Belirtiler Şap hastalığında inkübasyon süresi; alınan virus miktarına, virus suşuna ve konakçının

bireysel faktörlerine bağlı olarak sığırlarda iki-ondört gün (Kitching, 2002a), koyun ve

keçilerde ise üç-sekiz gün (Kitching ve Mackay, 1994) arasında değişir. Bir-iki gün

süren yüksek ateşten (40°C) sonra dil, sert damak, dudaklar, diş etleri, merme, koroner

bant ve interdigital boşlukta çeşitli sayıda veziküller gelişir. Özellikle laktasyondaki

sığırlarda memelerde de veziküller gelişebilir. Genç hayvanlarda virus yeni gelişen

kalp hücrelerine saldırarak hasara neden olduğu için veziküller şekillenmeden önce

ölüm görülebilir (Kitching, 2002a).

Akut enfekte sığırlarda yoğun miktarda salivasyon görülür ve önce mukoid

sonra mukoprulent hale gelen burun akıntısı tüm mermeyi kaplar. Dildeki veziküller

çoğunlukla birleşir ve dorsal epitelin büyük kısmı yer değiştirebilir. Ağızdaki

veziküller genellikle yirmidört saat içinde koparak yüzeysel erozyonlar oluşur. Ağız

lezyonları hızla iyileşir, erozyonlar fibrin tabakası ile dolar ve pembe fibröz doku

oluşur. Ayak lezyonlarının iyileşmesi daha uzun zaman alır ve lezyonlar sekonder

11

bakteriyel enfeksiyona yatkındır. Laktasyondaki sığırlardaki meme lezyonları süt

sağımını zorlaştırır ve veziküllerin parçalanması sonucu çoğunlukla sekonder mastitis

gelişir. Hastalıktan etkilenen hayvanlar kolaylıkla kondisyon kaybına uğrar. Süt

verimindeki düşüş kalan laktasyon süresince düzelmez. Bir yaşından küçük hayvanlar

tiroid gibi glanduler dokulardaki hasara bağlı olarak gelişimlerini gerektiği ölçüde

tamamlayamazlar (Kitching, 2002a). Koyun ve keçilerde ise hastalığın klinik

belirtilerinin belirlenmesi daha zordur, hastalığın ilk belirtisi topallıktır ve çoğu zaman

ağızda veziküller görülmeyebilir (Hughes ve ark., 2002). Sekonder enfeksiyon

görülmeyen yetişkin hayvanlar hızla iyileşir (Kitching ve Hughes, 2002).

1.6. Şap Viruslarının Teşhisi ve Tiplendirilmesi Şap hastalığının teşhisi hastalığın klinik bulgularına, enfeksiyonun erken döneminde

şap virusunun identifikasyonuna ve iki haftadan sonraki dönemde ise hastalığın

serolojisine dayanır. Persiste enfekte veya taşıyıcı hayvanların teşhisi ise

özofarengeyal sekretlerden virus izolasyonu ile yapılır (Thomson, 1994). Akut

vakalarda vezikül epiteli ve vezikül sıvısı yüksek konsantrasyonlarda şap virusu

içerdiği için tanı materyali olarak kullanılır (Oliver ve ark., 1988). Epitel örneklerinin

uygun olmadığı durumlarda kan ve akut vakalarda yüksek miktarda virus içeren

tükrük tanı materyali olarak kullanılabilir (Thomson, 1994).

Şap virusu pek çok hücre kültüründe çabuk üreyerek hızlı bir şekilde

sitopatolojik etki (CPE) oluşturur. Şap virusu izolasyonu için en sık kullanılan hücre

kültürleri primer veya sekonder buzağı tiroid hücreleri, IBRS-2 veya BHK-21 hücre

hatlarıdır (House ve Yedloutschnig, 1982). Şap hastalığının tanısı ve saha suşlarının

tiplendirilmesinde önceleri kullanılan komplement fikzasyon testi yerini daha hassas,

daha spesifik ve daha çok numune ile çalışma olanağı veren ELISA sistemlerine

bırakmıştır. Virus izolasyonu için hücre kültürü pasajları, ELISA ile birlikte

doğrulayıcı test olarak kullanılmaktadır (Hamblin ve ark., 1984; Roeder ve Le Blanc

Smith, 1987; Ferris ve Dawson, 1988). Son yıllarda şap hastalığının tanısı için RT-

PCR geliştirilmiş ve bu amaçla çeşitli prosedürler bildirilmiştir (House ve Meyer,

12

1993; Reid ve ark., 1998; Moss ve Haas, 1999). Gerçek zamanlı PCR (Reid ve ark.,

2001), nükleik asit dizi analizi temelli amplifikasyon (NASBA) (Collins ve ark.,

2002) ve mikroçip testi (McGall ve Christians, 2002) üzerinde çalışılan diğer

tekniklerdir.

Serumda şap virusuna karşı oluşan antikorların tespiti için mikro virus

nötralizasyon testi (VNT) veya ELISA kullanılmaktadır. VNT, serumda antikor tespiti

için OIE tarafından “altın standart” olarak önerilmektedir (Alexandersen ve ark.,

2003). Şap virusunun aşı ve saha suşlarının eşleştirme testleri de temel olarak VNT ve

ELISA gibi in vitro metodlara dayanır ve eşleştirme yapılacak her bir aşı suşuna karşı

hazırlanmış antiserum havuzları kullanılarak “r” değerinin (relationship value)

hesaplanması ile bulunabilir (Rweyemamu ve ark., 1978; Rweyemamu, 1984; Paton

ve ark., 2005). Ayrıca, monoklonal antikor panelleri ve viral kapsid genlerinin

nükleotid dizi analizleri de bu serolojik testleri tamamlayıcı olarak kullanılabilirler

(Paton ve ark., 2005).

Şap hastalığında, yapısal olmayan proteinlere karşı oluşan antikorların tespiti ile

aşılı hayvanlar ve hastalığı atlatan hayvanların ayrımı için ELISA, EITB ve saf yapısal

olmayan protein antijenlerinin eksprese edildiği viral (baculovirus) veya plasmid

(Escherichia coli) ekspresyon sistemleri geliştirilmiştir. Ayrıca viral polimerazı

kodlayan 3D genine karşı oluşan antikorlar, viral enfeksiyon ilişkili antijen (VIAA)

testi ile tespit edilebilir (Kitching, 2002b).

Plak test; çoğalma özellikleri ve sitopatolojileri birbirinden farklı olan virus

varyantlarının enfektivitesinin ölçülerek kantitatif olarak test edilmesine ek olarak,

virusun ısı ve ilaç uygulaması gibi sadece belli şartlar altında plak oluşturabilen veya

değişik ölçü ve şekillerde plak oluşturabilen genetik olarak farklı varyantlarının

klonlanmasında da kullanılmaktadır (Condit, 2007).

13

1.7. Kontrol ve Mücadele Şap hastalığı ile mücadelede etkin olan kurallar OIE’nin Hayvan Sağlığı Kodu’nda

belirtilmiştir. Bu kurallara göre ülkenin bir bölgesi, ülke geneli veya birkaç bölge

birlikte değerlendirilebilir. Hastalık mücadelesinde uygulanan stratejiye göre

bölgeler; aşılamanın olmadığı hastalıktan ari bölge, gözetim altındaki bölge, aşılama

ile hastalıktan arındırılmış bölge, tampon bölge ve enfekte bölge şeklinde

tanımlanmaktadır (Şap Enstitüsü Müdürlüğü, 2010b). Şap hastalığının kontrolü,

ülkenin hastalık kontrol politikaları ve epidemiyolojik durumuna bağlıdır.

Hastalıktan ari ülkelerde kontrol, hastalığın varolduğu ülkelerden hayvan ve

hayvansal ürünlere uygulanan katı sınırlamalar ile virusun ülkeye girişinin

önlenmesine yöneliktir. Bu ülkelerde karantina ve salgın görülmesi durumunda

zorunlu kesim uygulanır. Hastalığın endemik olduğu ülkelerde ise uygun serotipte

inaktif aşılarla yapılan koruyucu aşılamalar ve sanitasyon uygulamaları kombine

edilerek hastalığın insidensinin düşürülmesine yönelik önlemler alınmaktadır (Doel,

2003). Aşılamayı takiben oluşan koruyucu bağışıklık, enfeksiyonu takiben oluşandan

daha kısa sürelidir. Bu nedenle yılda iki veya daha fazla aşılamaya ihtiyaç vardır

(Sutmoller ve ark., 2003).

Belirli bir virus suşundan hazırlanmış olan şap aşısı tarafından, antijenik olarak

ilişkili fakat identik olmayan saha virusuna karşı oluşturulan çapraz korumanın

başarısında aşı ile ilişkili en önemli iki kriter; aşının güçlü bir bağışıklığı ne kadar iyi

uyarabildiği (potens) ve saha virusu ile ne kadar yakın ilişkili olduğudur (antijenik

uyum). Aşının potensini etkileyen faktörler; antijenin miktarı ve kalitesi, kullanılan

adjuvant ve aşının formülasyonudur. Kontrol programlarında kullanılacak ve aşı

antijen rezervlerinde saklanacak aşı suşlarının şap virusunun en uygun suşları

arasından seçimi, salgınlardan toplanan temsili saha izolatlarının uygun aşı suşları ile

eşleştirilmesi temeline dayanır (Rweyemamu ve ark., 1978; Rweyemamu, 1984;

Paton ve ark., 2005). Eğer yeni bir salgının virusuna karşı aşı hazırlamak

gerekiyorsa; aşı suşu olarak seçilen aday varyant, uygun doku kültürü hücrelerine

adapte edilerek gerekli testleri tamamlandıktan sonra süspanse hücre kültürlerinde

büyük miktarlarda üretilir (Piatti ve ark., 1995). Daha sonra binari etilenimin (BEI)

14

gibi bir aziridin ile iki basamaklı inaktivasyona tabi tutulur, konsantre ve purifiye

edilir. Purifikasyon aşamasından sonra inaktive viral materyal, antijen bankası için

sıvı azot içerisinde dondurularak yıllarca saklanabilir veya adjuvantlar ile formüle

edilerek aşı şişelerine doldurulur. Kalite kontrolleri tamamlanan aşı kullanıma hazır

hale gelir (Doel, 2003; Lombard ve ark., 2003; Paton, 2005; Lombard ve Fussel,

2007).

1.8. Türkiye’de Şap Hastalığının Durumu Şap hastalığı ülkemizde eskiden beri bilinmekte olup, hastalığın seyri ve sonuçlarına

ait ilk bilgiler 1914 yılında Ziraat İstatistiği’nde yayınlanmıştır (Sütçü ve ark., 1978).

Şap hastalığı sığırcılık sektörü açısından Türkiye’nin en önemli hastalığıdır (Parlak ve

ark., 2007). Şap virusu suşları Türkiye’ye doğu ve güneydoğu sınırından hayvan

hareketleri ile giriş yapar ve bu bölgelerde hastalık endemik olup yıl boyunca rapor

edilir (Rweyemamu ve ark., 2008). Türkiye’de şap hastalığı mihraklarında yapılan

incelemelerde hastalığın en yaygın bulaşma yolunun aracısız bulaşma olduğu

bildirilmiştir (Aktaş, 1998). 1990’dan itibaren şap virusunun ülke içinde kısa mesafeli

yayılmasından çok, yerel üretimin karşılayamadığı artan et ihtiyacına bağlı olarak

uzun mesafeli kontrolsüz hayvan hareketlerinin baskın risk faktörü olduğu

belirtilmekte (Gilbert ve ark., 2005) ve hayvan pazarlarının önemli rolü olduğu

düşünülmektedir (Aktaş, 1998). Yapılan genetik analizler sonucunda Afganistan,

Pakistan, Suudi Arabistan, İran ve Türkiye’deki virus suşlarının birbiri ile ilişkili

oldukları gösterilmiştir. Bunun sebebi muhtemelen şap virusunun Güney-Orta

Asya’dan batıya doğru yayılmasıdır (Rweyemamu ve ark., 2008).

Ülkemizde 1914 yılından beri değişik tarihlerde A, O, SAT-1 ve Asia1 tipleri

teşhis edilmiştir. SAT-1 tipi 1963 yılında saptanmıştır. Asia1 tipi ilk defa 1973

yılında saptanmış olup, 1984-1999 yılları arasında sadece belli illerde sınırlı

sürelerde (3 yıldan az) dolaşımda kalmıştır ve 2002 yılından bu yana

görülmemektedir. A ve O serotipleri 1952 yılından beri endemik olarak

gözlenmektedir (Aktaş, 1998; Tufan, 2006). Yılda iki kez yapılan aşılama ve sıkı

15

kontrol uygulamalarına rağmen A ve O serotipleri halen rapor edilmektedir (Parlak

ve ark., 2007). İlk görülme yerleri doğu illeri olduğu için A ve O serotiplerinin

ülkemize sınırdan giriş yaptığı düşünülmektedir ve VP1 nükleotid dizileri temel

alındığında komşularımızda persiste olarak sirküle olan suşlar ile evrimsel olarak bir

bütünlük sergiledikleri gösterilmiştir (Aktaş, 1998; Parlak ve ark., 2007).

Ülkemizde halen seyretmekte olan A serotipi suşu ilk olarak 2005 yılı Ağustos

ayında tespit edilmiş olan A/IRN/2005’tir ve özellikle 2006 ilkbaharında büyük

problemlere sebep olmuştur (Klein ve ark., 2007). Ülkemizde halen seyretmekte olan

O serotipi suşu ise, Hindistan’dan batıya doğru Orta Doğu’ya kadar gelerek 2006

yılından beri ülkemizde sığır, koyun ve keçilerde görülmekte olan ve 2007 yılı Şubat,

Nisan ve Eylül aylarında Trakya’ya kadar ulaşan O PanAsia-2 pandemik suşudur

(Knowles ve ark., yayınlanmamış veri).

Tarım ve Köyişleri Bakanlığı tarafından, 2008 İlkbahar Şap Aşısı Kampanyası

ile Avrupa Birliği destekli ve üç yıl süreli “Türkiye’de Şap Hastalığı’nın Kontrolü

Projesi” başlatılmıştır. Bu proje kapsamında; Türkiye genelinde sığır varlığının yılda

iki kez, koyun varlığının ise yılda bir kez olmak üzere üç yıl süre ile yoğun

aşılanması, hastalığın surveylansının yapılması ile hastalık mihraklarının takibi ve

dezenfeksiyonu planlanmıştır. Büyükbaş hayvanlarda Trakya’da ve Anadolu’da

(Ağrı, Ardahan, Artvin, Gaziantep, Hakkari, Hatay, Iğdır, Kars, Kilis, Mardin,

Şanlıurfa, Şırnak, Van illeri) trivalan şap aşısı, diğer illerde ise bivalan şap aşısı

kullanılması kararlaştırılmıştır. Hastalık çıkması durumunda sıkı karantina

yöntemleri uygulanarak bu bölgelerden canlı hayvan ve risk taşıyan ürünlerin

çıkışına izin verilmemesi, Trakya Bölgesi’nde mihraklarda hasta ve hastalıktan

şüpheli hayvanlara kesim metodu uygulanması kararlaştırılmıştır (Tarım ve Köyişleri

Bakanlığı Koruma ve Kontrol Genel Müdürlüğü, 2009). Trakya’da 2007 yılı Kasım

ayından bu yana şap hastalığı görülmediği için Trakya kesiminin "Aşılı Arilik"

statüsü için OIE’ye başvuru yapılmıştır. Başvuru 24-28 Mayıs 2010 tarihleri arasında

Paris, Fransa’da düzenlenen OIE Genel Kurulu’nda değerlendirilerek, Trakya “Şap

Hastalığından Aşılı Arilik” statüsü kazanmıştır (Şap Enstitüsü Müdürlüğü, 2010a).

16

1.9. Plak Morfolojisi ve Mutasyonlar Şap aşılarının sahada uygulandığı hayvanlarda yüksek bir bağışıklık meydana

getirebilmesi için iyi bir aşı suşunun; üretildiği sisteme kolay adapte olması,

adaptasyonu takiben iyi bir antijenite ve enfektivite vererek üremesi, üreme sırasında

orijin virusla serolojik, immunolojik ve plak morfolojisi yönünden homolog bir

yapıda olması, immunojen partikülün inaktivan maddelere karşı dayanıklı ve aşı

durumuna geldiğinde uzun süreli ve sahada mevcut aynı alttipin çeşitli varyantlarına

karşı dominant özellikleri olması, aşının saklanması esnasında 146S partiküllerinin

stabil kalması gerekir (Okay ve ark., 1979; Öztürkmen, 1982). Homolog virusların

aşıdaki koruma güçleri heterolog viruslara göre daha fazladır. Bu bakımdan güçlü bir

aşı üretmek için, özellikle süspanse kültürde plak morfolojisi yönünden orijin virusla

aynı karakterde virus üretmek ve mümkün olduğu kadar ilk pasajlara yakın tohum

virus kullanmak zorunluluğu ortaya çıkmaktadır. İleri pasajlarda virusların meydana

getirdikleri plak morfolojilerindeki değişim virusun homolog olmaktan uzaklaştığını

göstermektedir (Okay ve ark., 1979). Suşların plak varyantlarının ve antijenik

farklılıklarının üretim metodlarından mı yoksa pasajlar sonucu mu meydana

geldiğinin saptanması gerekmektedir (Okay ve ark., 1979; Öztürkmen, 1982).

RNA viruslarının hızlı replikasyonu, yüksek mutasyon oranları ve geniş

populasyon ölçüleri viral tür benzerleri olarak adlandırılan genetik olarak yüksek

ölçüde heterojen virus populasyonlarının oluşumuna yol açar. Viral tür benzerleri,

populasyonun bireysel genomlarında var olan bazı çoklu mutasyonların sabitlenmesi

ile değişik koşullara hızlı bir şekilde adapte olabilir (Domingo ve ark., 1985; Domingo

ve ark., 2001; Domingo, 2006). Diğer RNA virusları gibi tür benzeri yapısında olan

şap virusu populasyonları da genetik ve antijenik olarak heterojen olup varyantların

karışımından oluşur (Martinez ve ark., 1992; Sa-Carvalho ve ark., 1997; Domingo,

2002) ve bu nedenle aynı populasyondaki şap virusları, genotipik ve fenotipik olarak

farklı özellikler gösterirler (Mateu ve ark., 1989). Virus populasyonu içindeki genom

çeşitliliği, in vivo veya in vitro immun baskı veya yeni bir konağa giriş gibi çevresel

değişiklere uyumlu varyantların hızlı seleksiyonuna izin verir. Bu seleksiyon

17

hayvanların persiste enfeksiyonu süresince veya hücre kültüründe yayılma süresince

oluşabilir (Sa-Carvalho ve ark., 1997).

Mutant viruslar hakkında yapılan fenotipik çalışmalardan birisi de plak ölçüsü

ve morfolojisinin araştırılmasıdır (Bridgen ve Elliott, 2000). Virus karışımları bazen

tek bir partikül tarafından üretilebilen aynı plak morfolojisine sahip değişik parenteral

genomlardan projeni üreten toplu partiküller içerebilirler. Ayrı plaklardan virusların

karşılaştırılması ve tek bir enfeksiyöz partikülden çoğalan viral populasyonların

evrimi ile ilgili çalışmalar tür benzeri kavramının gelişiminde yararlı olmuştur.

Ayrıca, virusların biyolojik klonlarının kullanımı ile viral tür benzerlerinin dinamik

davranışı hakkında önemli kavramlar tespit edilmiştir. Tek bir plaktan köken alan bir

virus soyu en güç genetik darboğaz olan viral populasyonun geçici olarak tek bir

enfeksiyöz genoma indirgenmesine sebep olur. Populasyonun bileşimi katlanarak

değişir ve büyüme sabitlerindeki çok küçük değişiklikler, zaman içinde bileşimde

büyük değişiklikleri ifade eder. Çeşitli varyantlar içeren küçük populasyonlar

büyüdüğünde, yavaş varyantlar çoğunlukla gözden kaçar. Plak gelişimi sırasında

ortaya çıkmaya başlayan her hangi nötral olmayan bir mutasyon, plağın gelişimi

sırasında yayılacak olan baskın genomlar tarafından sarılır. Bir mutasyon kesinlikle

nötral bile olsa, plaktan örneklenen genomların dizilenmesinde bir mutasyon olarak

kabul edilebilmesi için plak gelişimi sırasında çok erken dönemde oluşması gereklidir.

Daha genel terimlerle her replikasyonda mutant partiküller oluşma olasılığı söz

konusu olduğundan, doğru mutasyon oranı her zaman tespit edilemeyebilir. Tek bir

plak bile heterojen genom populasyonu tarafından oluşturulabilir ve bu populasyonun

optimizasyonunun derecesi virusun girdiği replikasyon siklusu sayısına bağlıdır.

Genel olarak, bir plağın gelişimi sırasında negatif seleksiyon gelişmesi için yeterli

zaman bulunamaz ve daha sağlam genomlarla yarışabilecek mutantlar populasyonda

kalarak bir sonraki transfer için seçilme şansına sahip olurlar (Domingo ve ark.,

2001).

18

1.10. Tezin Amacı

Güçlü bir aşı üretmek için, özellikle büyük hacimli süspanse kültürde plak

morfolojisi yönünden orijin virusla aynı karakterde virus üretilmesi çok önemlidir.

Türkiye’de şap aşısı ile ilgili çalışmaların yapıldığı Şap Enstitüsü’nde yapılan aşı

üretim çalışmaları sırasında ve geçmişte yapılmış olan çalışmalarda yaşanan önemli

bir istenmeyen durum olarak; ilerleyen pasajlarda plak morfolojisi yönünden ana

(orijin) virusa göre değişiklik gösteren bazı virusların oluştuğu ve bu viruslar

kullanılarak hazırlanan aşılarda ana virusa göre aşı üretim miktarı ve kalitesini

etkileyen düzeyde, enfektif titre ve 146S gibi değerlerde önemli düşüşler

gözlenmiştir. Bu durum, aşının kalitesinde olumsuzluklar yaratarak ekonomik olarak

kayıplara neden olabilecek önemli bir faktördür. Bir aşı suşundan bir üretim döngüsü

sonucunda elde edilecek aşı miktarı ve kalitesi ekonomik olarak önemli olduğu için,

bu çalışma sonucu elde edilecek bulgular daha az maliyetle daha kaliteli şap aşısı

üretmek için yapılan çalışmalara bilgi sağlayabilir. Bu çalışmada; aşı suşu adayı

olarak seçilen A/IRN/05 ve O PanAsia-2 suşlarına dahil saha suşlarının ve güncel

bazı aşı suşlarının (O1 Manisa, A22 Irak, A Tur 04-06) monolayer ve süspanse hücre

kültürlerine adaptasyonları sırasında ortaya çıkan farklı plak fenotiplerinin VP1,

VP2, VP3, VP4, 3A ve cre genleri düzeyinde incelenmesi için bu genlerde söz

konusu fenotipik değişikliklerden sorumlu olabilecek mutasyonların sorgulanması

amaçlanmıştır.

19

2. GEREÇ VE YÖNTEM

2.1. GEREÇ

2.1.1. Hücre Kültürü

Çalışmada orijini İtalya Brescia Enstitüsü olan BHK-21 Cl-13 BS31 hücre kültürü

hattının, Şap Enstitüsü şartlarında endüstriyel üretime adapte edilmiş monolayer

üreme özelliği gösteren BHK-21 An31 ve BHK-21 An30 ile süspanse üreme özelliği

gösteren BHK-21 An30 hücre kültürü hatları kullanıldı.

(a) (b)

Şekil 2.1.1. BHK-21 An31 (a) ve BHK-21 An30 (b) monolayer hücre kültürlerinin mikroskop altındaki görüntüleri

2.1.2. Araştırmada Kullanılan Viruslar 2.1.2.1. Aday Viruslar

Bu çalışmada; 2007 yılında Türkiye’nin çeşitli illerindeki şap hastalığı şüpheli

sığırlardan alınarak tanı amacı ile Şap Enstitüsü’ne gönderilmiş olan 10 adet dil

epiteli, Tip Tayini Laboratuvarı’nda elde edilmiş olan ELISA sonuçları (pasaj 0-P0

olan orijinal virus süspansiyonun tipi ve optik dansitesi-O.D.) ve dil epitel arşivindeki

20

stok durumları incelenerek aday virus olarak seçildi ve çalışmada kullanıldı (Çizelge

2.1.1.).

Çizelge 2.1.1. Çalışmada kullanılan aday viruslara ait bilgiler

Virus Kodu Tipi ve O.D.’si (P0 için)

İli Hastalık Çıkış Tarihi

Laboratuvara Geliş Tarihi

1 A-1,3 Isparta 23.02.2007 28.02.2007

2 A-1,1 Isparta 23.02.2007 28.02.2007

3 A-2,0 Ankara 28.09.2007 01.10.2007

4 A-1,4 Iğdır 30.10.2007 05.11.2007

5 A-1,8 Bolu 01.12.2007 04.12.2007

6 O-2,1 Rize 13.01.2007 18.01.2007

7 O-2,0 Denizli 22.01.2007 30.01.2007

8 O-1,7 Kırklareli 25.02.2007 02.03.2007

9 O-2,4 Balıkesir 13.09.2007 18.09.2007

10 O-1,9 Nevşehir 19.09.2007 26.09.2007

2.1.2.2. Kontrol Viruslar

Çalışmada kullanılan aşı suşu niteliğindeki kontrol viruslara ait geçmiş tarihlerde

yapılan sığır pasajlarından elde edilmiş dil epitelleri Şap Enstitüsü’nden temin edildi

(Çizelge 2.1.2.).

Çizelge 2.1.2. Çalışmada kullanılan aşı suşu niteliğindeki kontrol viruslara ait bilgiler

Kontrol Virus Coğrafik Orijin ve İzolasyonTarihi

Çalışmada Kullanılan Sığır Pasajı (SP) Numarası ve Tarihi

O1/Manisa/TUR/69 Türkiye-1969 SP5-07.08.2000

A22/IRAK/24/64 Irak-1964 SP2-22.12.2006

A/TUR/04/06 Türkiye-2006 SP2-26.01.2009

21

2.1.3. Primerler Çalışmada kullanılan primerlerden; NK61 ve NK72 (Knowles ve Samuel, 1998),

3135F, 535F, 1025R, 5265F ve 5450R (Christensen ve ark., 2006) ile CMAL1

(Uzman Veteriner Hekim Fuat ÖZYÖRÜK, Moleküler Epidemiyoloji Laboratuvarı,

Şap Enstitüsü) Şap Enstitüsü Moleküler Epidemiyoloji Laboratuvarı’nda rutinde

kullanılan primerlerden seçilerek kullanıldı. A-1296F, A-1575F, A-2041F, A-2289R,

A-2492F, A-2683R, A-2993R, A-3321R, O4F, O5F, O5R, O6F, O6R2, O7F, O7R

ve O8R; “Batı Avrasya’da Şap Virusunun Yüksek Çözünürlüklü Moleküler

Epidemiyolojisi için Uygulama Teknikleri” isimli proje kapsamında WRL Pirbright-

İngiltere’de tasarlanmış olan primerlerden seçildi ve bu çalışma için de özel bir

firmaya1 sentezlettirilerek kullanıldı. OVP3F, OVP3R, AVP4/2F-Mg, AVP4/2R-Mg,

AVP3F-Mg ve AVP3R-Mg bu çalışma için tasarlandı ve özel bir firmaya1

sentezlettirilerek kullanıldı. Çalışmada kullanılan primerlerin listesi Çizelge 2.1.3.’de

verildi.

1 Metabion International, Almanya.

22

Çizelge 2.1.3. Çalışmada kullanılan primerler

Primer

Nükleotid Dizisi (5’-3’)

Gen

Tip

Ürün Büyüklüğü (bp)

Kullanım Amacı

3135F NK61

ACAAACGTACAGGGGTGGGT GACATGTCCTCCTGCATCTG

VP1

A

896

PCR

CMAL1 NK61

CCACAAATGTACAGGGATGGG GACATGTCCTCCTGCATCTG

VP1

O

896

PCR

NK72

GAAGGGCCCAGGGTTGGACTC

VP1

A O

823 825

Nükleotid dizi reaksiyonu

535F 1025R

GAGAAAYGGGACGTCTGCGC GTCRCCTATTCAGGCATAGAAG

cre

A O

491

PCR Nükleotid dizi reaksiyonu (R primerler ile)

5265F 5450R

TATGTTCAAGCCTCAACCACC CACTTTCAAACCGACAGGTT

3A

A O

755

A-1296F A-2289R A-1575F A-2683R A-2041F A-2993R A-2492F A-3321R

GAGCCTTTCTTC GACTGGGTC WCACCTCCACGTCCCAGC GGGTGGTARGCGATCGACG GCTGTTTTRGGGTCTGTTGTCACC AYTCGAGTGTGGGAGTCACS GTAC GCCACCATGTASCGG CTGGACYCTGGTRGTGATGG TGGTGGTGACAGGGTCTGC

VP4 VP2 VP3

A

994 1109 953 830

O4F O5R O5F O6R2 O6F O7R O7F O8R

GTGGACCACCCGCTCTC TCTGGCACCATGGCCAC CAGAACCARTCAGGCAACACTG GCCTCAGCCACATCAAGG CTGACCACAAAGGTGTCTAYGG GTCAGACGC GGTGTACGC CACGTYGCGGGTGAGTTCC CGGGACCCAGGTRAGGTTYC

VP4 VP2 VP3

O

953 1026 921 961

OVP3F OVP3R

GGTACACAAACCTTGGACCCTCG YGAGACRTCCGTGTGYTGGC

VP3

O

898

AVP4/2F-Mg AVP4/2R-Mg

TAYGCGATCGACGACGAGG AATGCTGCTGGTGGTCAGTGG

VP4 VP2

A 957

AVP3F-Mg AVP3R-Mg

CATGACAGCCCACATCACGG CGYTGAGCCTGTGTCTCWCC

VP3

A 936

Uluslararası Biyokimya Birliği (IUB) Kodları nükleotid simgeleri (R: A veya G; S: C veya G; W: A veya T; Y: C veya T)

23

2.2. YÖNTEM Araştırmanın yöntemsel algoritması aşağıda sunulduğu şekilde gerçekleştirildi:

5 adet A tipi - 5 adet O tipi - 3 adet kontrol virus

BULGULARIN KARŞILAŞTIRILMASI

Epitel arşivinden tipi ve O.D. si belli olan epitellerin seçilmesi

2.2.2. Epitelden virus süspansiyonunun hazırlanması

2.2.1. Hücre kültürlerinin hazırlanması

2.2.3. Virus izolasyonu

2.2.4. ELISA

BHK-21 An31 monolayer hücre kültürüne adaptasyon

BHK-21 An30 monolayer hücre kültürüne adaptasyon

BHK-21 An30 süspanse hücre kültürüne adaptasyon

Serotipik identifikasyon

2.2.5. Plak test

Enfektif titre ve fenotipik değerlendirme Moleküler viroloji

(2.2.6.-2.2.11.)

6 gene ait nükleotid diziler

24

2.2.1. Hücre Kültürlerinin Hazırlanması Çalışmada kullanılan virusların izolasyonları, çoğaltılmaları ve plak testlerinde

önceden duyarlılık ve sterilite kontrolleri yapılmış monolayer hücre kültürü hatları

olan BHK-21 An31 ve BHK-21 An30 hücre yapısının çalışma boyunca aynı kalması

amacı ile gerekli miktarlarda çoğaltılarak -196°C’de stoklandı ve kullanılacağı zaman

çözdürüldü. Monolayer hücre kültürlerinin çoğaltılması amacı ile 150 cm2’lik1, virus

ekimleri için ise 25 cm2’lik2 hücre kültürü şişeleri ve hücre üretme vasatı olarak %10

ticari sığır serumu3 ile %90 Glasgow minimum temel vasatı (GMEM)4 kullanıldı.

Monolayer hücre pasajı bilinen yöntemle yapıldı. Hazırlanan hücre kültürleri, virus

ekimine kadar CO2’li etüvde 37°C’de inkübasyona bırakıldı. Süspanse hücre kültürü

ise çalışma esnasında Şap Enstitüsü’nde hücre üretme tanklarında çoğaltılan ve aşı

üretiminde kullanılan süspanse BHK-21 An30 süspanse hücre kültürü hattından alındı.

Burker Hemositometre5 kullanılarak ve %10 tripan mavisi solüsyonu ile boyandıktan

sonra süspanse hücrenin ml’deki sayısı mikroskopta bulundu. %10 sığır serumu ve

%90 6M vasatı (Şap Enstitüsü’nün kendi oluşturduğu formülasyon) içeren süspanse

hücre üretme vasatını ortamdan uzaklaştırmak amacı ile süspanse hücre 800 rpm’de

santrifüj edildi. Süpernatant atıldı ve pelet ml’sinde 2,0x106 hücre olacak şekilde virus

üretme vasatı ile sulandırıldı. Virus üretme vasatı olarak %10 oranında triptoz fosfat

brot (TPB)6, %1 sodyum bikarbonat ve %1 antibiyotik (gentamisin) eklenerek

kullanıma hazır hale getirilen GMEM7 kullanıldı. Hücre toplam miktarı 50 ml olacak

şekilde 70 ml kapasiteli manyetik karıştırıcılı mini cam fermentörlere taksim edildi ve

fermentörler manyetik karıştırıcı aleti üzerine alınarak 37°C’de inkübasyona bırakıldı.

1 NUNC, Kat. No: 159920. 2 Greiner Bio-One, Kat. No: 690170. 3 PAA Adult Bovine Serum, Kat. No: B 15-313. 4 AppliChem GMEM BHK 21, Kat. No: A 1321-1/5. 5 Burker-Superior, Almanya. 6 Invitrogen, GIBCO, Kat. No: 18050. 7 Invitrogen, GIBCO GMEM BHK 21 1X, Kat. No: 21710.

25

2.2.2. Epitelden Virus Süspansiyonunun Hazırlanması Sahadan gelen dil epitelleri ve referans olarak seçilen viruslara ait dil epitellerinden

virus süspansiyonlarının hazırlanması daha önceden bildirilen (Ferris ve Dawson,

1987) yönteme göre yapıldı. Bu amaçla, 1g dil epiteli steril bir havan içerisinde

steril kum ile ezilerek 9 ml PBS ile homojenize edildi, +4°C’de ve 3 000 rpm’de 30

dakika santrifüj edildi. Üstteki süpernatant alınarak 0,45 µm1 ve 0,20 µm’lik2

filtrelerden geçirildi ve etiketlendirilerek bir sonraki işleme kadar -80°C’de

saklandı.

2.2.3. Virus İzolasyonu Çalışmada kullanılan virusların hücre kültürlerine adapte olmaları amacı ile Şap

Enstitüsü Protokolü’ne göre öncelikle BHK-21 An31, daha sonra da BHK-21 An30

hücre kültürü hatlarında virus pasajları yapıldı. Bu amaçla virus süspansiyonları 25

cm2’lik hücre kültürü şişelerinde hazırlanan ve monolayer üreme özelliği gösteren

BHK-21 An31 ve BHK-21 An30 hücre kültürlerine adsorbsiyonlu ekim yöntemi ile

ekildi. Hücre kültürlerinin yüzeyleri virus ekiminden önce serum kalıntısını

uzaklaştırmak amacı ile 2 defa virus üretme vasatı ile yıkandı. Virusların enfektif

titrelerine göre 0,05 enfeksiyon dozunda (MOI) olacak şekilde (1 virus partikülü/20

hücre) 1 ml virus ekimi yapılarak CO2’li etüvde 1 saat 37°C’de inkübasyona

bırakıldı. Bu süre sonunda ekimi yapılan virus ortamdan uzaklaştırıldı. Hücre

kültürlerinin yüzeyi virus üretme vasatı ile tekrar yıkandı. Daha sonra 5 ml virus

üretme vasatı ilave edilerek CO2’li etüvde 37°C’de inkübasyona bırakıldı.

İnkübasyon süresince CPE ve pH değişiklikleri yönünden kontrol edildi. Virus

kültüründe %75-80 CPE görüldüğü zaman -20°C’ye kaldırıldı. Dondurulan virus

kültürü bir sonraki virus pasajında kullanılacağı zaman hızlıca çözdürülerek

+4°C’de ve 3 000 rpm’de 30 dakika santrifüj edildi. Süpernatant alınarak bir kısmı

tekrar hücre kültürüne ekildi, bir kısmı testlerde kullanılmak üzere porsiyonlandı.

1 Millex, Kat. No: SLHV033RS. 2 Millex, Kat. No: SLGPO33RS.

26

Hücre kontrol olarak hazırlanan hücre kültürü şişeleri için aynı işlemler sadece

vasat kullanılarak yapıldı. Virus ekimleri hücre kontrol ile mikroskobik olarak

karşılaştırıldı. Tüm viruslar 24 saat içerisinde %90-100 CPE oluşturarak BHK-21

An31 monolayer hücre kültürüne adapte olduktan sonra, aynı işlemler tekrarlanarak

süspanse hücre kültürüne adaptasyon için geçiş hücresi olan BHK-21 An30

monolayer hücre kültüründe adaptasyon çalışmaları yapıldı.

Monolayer hücre hatlarında adaptasyonları tamamlanan virusların süspanse

hücre kültüründe pasajları yapıldı. Bu amaçla, başlangıç hücre konsantrasyonu

2,0x106 hücre/ml olarak hazırlanan manyetik karıştırıcılı mini cam fermentörlere 0,05

MOI dozunda virus ekimi yapıldı. Fermentörler manyetik karıştırıcı aleti üzerine

alınarak 37°C’de inkübasyona bırakıldı. Fermentörlerden belli aralıklarla numune

alınarak mikroskopta CPE yönünden kontrol edildi. %90 ve üzeri CPE şekillendiği

zaman +4°C’de ve 3 000 rpm’de 30 dakika santrifüj edildi. Süpernatant alınarak bir

kısmı tekrar hücre kültürüne ekildi, bir kısmı testlerde kullanılmak üzere

porsiyonlandı ve geri kalanı -80°C’de saklandı. Hücre kontrol olarak hazırlanan

fermentöre virus ekilmedi, virus ekimleri ile aynı şartlarda inkübasyona bırakıldı,

mikroskopta hücre morfolojisi ve sayısı incelendi. Hücre kontrol 800 rpm’de 10

dakika santrifüj edilerek süpernatantı alındı ve testlerde kullanılmak üzere

porsiyonlandı.

2.2.4. İndirekt Sandviç ELISA

Çalışma için seçilen aday ve kontrol virusların hücre kültüründe yapılan her virus

pasajı sonrasında indirekt sandviç ELISA ile tip tayinleri yapıldı. Her virus

pasajında kullanılan hücre kontrol de teste alındı. Test, Roeder ve Le Blanc Smith

(1987) tarafından bildirilen yönteme göre yapıldı. Bu amaçla, WRL’ndan temin

edilen tip (A, O, Asia1) spesifik tavşan hiperimmun serumları ile bir gece

öncesinden kaplanan tek kullanımlık ELISA tableti1 PBS ile yıkandı ve kurutuldu.

1 NUNC, Kat. No: 442404.

27

Araştırmada kullanılan viruslar, her bir tip için spesifik antikor ile kaplı üçer

göze olacak şekilde tabletin uygun gözlerine konuldu. 37°C’de 1 saat inkübasyonu

takiben, WRL’ndan temin edilen şap virusu spesifik poliklonal kobay hiperimmun

serumu tüm gözlere konularak tabletler tekrar 37°C’de 1 saat inkübasyona bırakıldı.

Daha sonra tüm gözlere horse-radish peroksidaz (HRPO) ile işaretli konjugat1 (anti-

kobay IgG) titresi oranında sulandırılarak ilave edildi. 37°C’de 1 saat inkübasyonu

takiben hidrojen peroksit ile aktive edilen substrat2 (orthophenilaminediamine-OPD)

ilave edildi ve 15 dakika oda ısısında inkübasyona bırakıldı. Reaksiyonun

durdurulması için 1,25 M. sülfürik asit durdurucu solüsyonu kullanıldı. Sonuçlar

492 nm dalga boyunda spektrofotometrede okutuldu. Elde edilen üç göz O.D.

değerlerinin ortalaması 0,1 ve üzeri olanlar tip spesifik şap virusu olarak

değerlendirildi.

2.2.5. Plak Test Virusların enfektivite titrelerini hesaplamak ve plak morfolojilerini incelemek amacı

ile Şap Enstitüsü Protokolü’ne göre plak test yapıldı. Bu amaçla; enfektivite titresi

ölçülecek virusların, virus üretme vasatı ile 10-1’den 10-6’ya kadar dilusyonları

yapıldı. Her virus pasajında kullanılan hücre kontrol de teste alındı. 48 saat

öncesinde hazırlanmış, %100 kaplı monolayer hücre ihtiva eden 6 gözlü tek

kullanımlık hücre kültürü tabletlerine3 her dilüsyondan 0,1 ml olacak şekilde ekim

yapıldı ve CO2’li etüvde 37°C’de 1 saat adsorbsiyona bırakıldı. Bu süre sonunda her

göze 3 ml örtme vasatı (%50 gum4 + %50 2X GMEM karışımı) konularak tabletler

48 saat CO2’li etüvde 37°C’de inkübasyona bırakıldı. İnkübasyon süresi sonunda

vasatları dökülerek her göze 2 ml %20 formol ve %2,5 kristal viyole ile hazırlanan

boyama solüsyonu ilave edildi. 2 saat oda ısısında bekletildikten sonra boya

dökülerek tabletler çeşme suyu ile dikkatlice yıkandı ve kurumaya bırakıldı.

1 DAKO, P0141. 2 Amresco, J348-50J. 3 Orange Scientific, Kat. No: 2030500. 4 SIGMA-ALDRICH, Gum Tragacanth, Kat. No: 9000-65-1.

28

Tabletler kuruduktan sonra değerlendirmeye alındı. Değerlendirmede

sayılabilen plakların bulunduğu son göz okunarak plak sayısının ortalaması alındı.

Daha sonra aşağıda yazılı olan formülde yerine konularak enfektivite titresi PFU/ml

olarak bulundu.

Plakların sayıldığı dilüsyon x Ortalama plak sayısının logaritması

Enfektivite titresi =

(PFU/ml) İnokulasyon hacmi

Ayrıca yapılan plak testlerden sonra plak morfolojileri incelendi ve plakların

çapları ölçüldü. Bazı virusların plak klonları seçildi. Plak klonlarının elde edilmesi

amacı ile belirlenen tek bir plağın sınırları içinden 5 µl örtme vasatı alınarak 45 µl

vasatla karıştırılarak bir sonraki inokulasyona kadar -20°C’de saklandı. Seçilen her

plak klonu 2 defa daha plak teste alınarak, toplamda 3 kez plak purifikasyonu

gerçekleştirildi.

2.2.6. RNA Ekstraksiyonu Viral RNA’nın ters transkripsiyonu için gerekli olan şap virusu genomik RNA’sının

virus süspansiyonlarından elde edilmesi amacı ile spin kolon teknolojisi ile

hazırlanmış ticari kitin protokolüne1 göre RNA ekstraksiyonu yapıldı. Bu amaçla 2

ml’lik nükleazlardan ari toplama tüpüne 250 µl virus süpansiyonu konuldu. Üzerine

hücrenin lize olmasını sağlayan TMR1 solüsyonundan 500 µl eklenerek 1-2 dakika

vortekslendi. Üzerine yine hücrenin lize olmasını sağlayan TMR2 solüsyonundan

500 µl ve TMR3 solüsyonundan 250 µl eklenerek tüpler 5 defa ters yüz edilerek

karıştırıldı. Karışım buz üzerinde 5 dakika inkübasyona bırakıldı. +4°C ve 10 000

rpm’de 10 dakika santrifüj edildi. Bu karışımdan 1 000 µl süpernatant pelete zarar

vermeden yeni bir 2 ml’lik toplama tüpüne alındı. Üzerine RNA’nın yıkanması için

kullanılan TMR4 solüsyonundan 800 µl eklendi ve pipetasyon yapılarak karıştırıldı.

1 Mobio-Ultra Clean Tissue RNA Isolation Kit, Kat. No: 15000-50.

29

Bu karışımdan 650 µl alınarak 2 ml’lik toplama tüpüne yerleştirilen ve RNA’yı

bağlama özelliğindeki silis membranlı spin filtreye yüklendi ve 10 000 rpm’de 30

saniye santrifüj edildi. Tüpe geçen sıvı ortamdan uzaklaştırıldı. Kalan süpernatant ve

TMR4 karışımı bitene kadar aynı işlem uygulandı. Spin filtreye RNA’nın yıkanması

için kullanılan TMR5 solüsyonundan 500 µl eklendi ve 10 000 rpm’de 30 saniye

santrifüj edildi. Tüpe geçen sıvı ortamdan uzaklaştırıldı. TMR5 kalıntısı kalmaması

amacı ile 13 000 rpm’de 1 dakika santrifüj edildi. Filtre 2 ml’lik temiz bir toplama

tüpüne alındı. RNA’nın sulandırılması amacı ile beyaz filtre membranının ortasına

gelecek şekilde içinde RNaz içermeyen su bulunan TMR6 solüsyonundan 50 µl

eklendi. 10 000 rpm’de 30 saniye santrifüj edildi. Filtre atıldı. Elde edilen RNA

örnekleri etiketlenerek kullanılacağı zamana kadar -80°C’de saklandı.

2.2.7. Viral RNA’nın Ters Transkripsiyonu Viral RNA’nın ters transkripsiyonunun yapılarak cDNA elde edilmesi amacı ile

Knowles ve Samuel (1998) tarafından daha önceden bildirilen yöntem temel alındı.

Bu amaçla öncelikle 0,7 µl 25 pmol/µl konsantrasyonundaki random hekzamer

primeri1 ve 7 µl RNA, nükleazlardan ari toplama tüpüne konularak kısa süreli

santrifüj edildi. Isısal döngü cihazına2 yerleştirilerek 90°C’de 1 dakika ve 70°C’de 1

dakika inkübe edildi.

1 Ella Biotech, Almanya. 2 Eppendorf, Mastercycler Personal, Almanya.

30

Bu esnada aşağıda bildirilen RT reaksiyonu karışımı hazırlandı:

Bileşen Miktar (µl)

10 mM dNTP karışımı1 1,25

5X RT buffer2 2,5

RNazin3 (3,0 U/µl) 0,5

Nükleazlardan ari su4 0,5

DDT5 0,5

MMLV Ters transkriptaz6 (200U/µl) 0,25

Toplam 5,5

Isısal döngü cihazından alınan tüpler kısa süreli santrifüj edildi ve üzerine

hazırlanan RT karışımından 5,5 µl ilave edilerek tekrar kısa süreli santrifüj edildi.

Isısal döngü cihazına konularak 42°C’de 60 dakika ve 94°C’de 10 dakika inkübe

edildi. Cihazdan alınan tüpler kısa süreli santrifüj edildi. Elde edilen cDNA hemen

kullanılmayacak ise bir sonraki işleme kadar -20°C’de saklandı.

2.2.8. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Çalışmada nükleotid dizileri elde edilmesi istenen gen bölgelerinin amplifikasyonu

için yapılan PCR; içinde magnezyum klorür (MgCl2), 10X PCR buffer ve Platinum

Taq DNA Polimeraz bulunan ticari kitin7 protokolüne göre yapıldı.

1 Fermentas, Kat. No: R0192. 2 Fermentas, Kat. No: EP0442. 3 Fermentas, Kat. No: E00381. 4 Fermentas, Kat. No: R0582. 5 Fermentas, Kat. No: R0861. 6 Fermentas, Kat. No: EP044.

7 Invitrogen, Platinum Taq DNA Polymerase, Kat. No: 10966-030.

31

Bu amaçla 0,5 ml’lik nükleazlardan ari toplama tüpü içerisinde aşağıda bildirilen

PCR karışımı hazırlandı:

Bileşen Konsantrasyon Miktar (µl)

MgCl2 50 mM 1,50

10X PCR buffer 1X 5,00

10 mM dNTP karışımı Her biri 0,2 mM 1,00

Primer 1 10 µM 1,00

Primer 2 10 µM 1,00

Platinum Taq DNA polimeraz (5 U/µl) 1,0 U 0,20

Nükleazlardan ari su 35,30

cDNA 5,00

Toplam 50,00

Hazırlanan karışım kısa süreli santrifüj edildi. Isısal döngü cihazında 94°C’de 4

dakika, 94°C’de 1 dakika - 55°C’de 1 dakika - 72°C’de 1 dakika 35 döngü ve 72°C’de

5 dakika inkübe edildi. İnkübasyonu takiben PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi

yapılarak bant oluşumu incelendi ve ürünler hemen kullanılmayacak ise bir sonraki

işleme kadar -20°C’ de saklandı.

2.2.9. PCR Ürününün Agaroz Jel Elektroforezi PCR ürünlerinin görüntülenmesi amacı ile % 1,5’luk agaroz jel hazırlandı. Bu

amaçla; 0,45 g agaroz1, 1X tris-borat-EDTA tampon çözeltisi (TBE)2 ile 30 ml’ye

tamamlanarak ısı ile eritildi. Erimiş olan agaroz jel soğutulmaya bırakıldı ve 5 mg/µl

konsantrasyonundaki stok etidyum bromidden3 her 10 ml için 1 µl ilave edilerek,

final konsantrasyonu 0,5 µg/ml olacak şekilde agaroz jel hazırlandı.

1 Scharlau, Kat. No: 9012-36-6. 2 Fermentas, Kat. No: B52. 3 SIGMA-ALDRICH, Kat. No: E8751.

32

Elektroforez tankına tarak yerleştirildikten sonra agaroz jel döküldü. Yüzeyin

düzgün şekil alması ve jelin donması için 15 dakika beklendi. Bu işlem sonunda jel

üzerine 1X TBE eklenerek tarak jelden alındı. Her bir örnek için 1 µl 6X yükleme

tamponu1 üzerine 5 µl PZR ürünü ilave edilerek pipetasyonla karıştırıldı ve jel

üzerindeki gözlere 5 µl aktarıldı. Daha sonra 1 µl moleküler ağırlık merdiveni2, 1 µl

yükleme tamponu ve 4 µl su ile karıştırılarak jelin uygun gözüne aktarıldı. 20

dakika-100 volt koşullarında gerçekleştirilen elektroforez sonrasında, örneklere ait

bant oluşumu görüntüleme cihazı3 ile kontrol edildi.

2.2.10. PCR Ürününün Agaroz Jelden Purifiye Edilmesi PCR ürününün agaroz jelden purifiye edilerek nükleotid dizileme reaksiyonuna

hazırlanması, spin kolon teknolojisi ile hazırlanmış ticari kitin4 protokolüne göre

yapıldı. Bu amaçla ilk olarak, PCR ürünlerinin elde edileceği % 1,5’luk agaroz jel

hazırlandı. Jel donduktan sonra, 50 µl PCR ürün örneği ve 10 µl 6X yükleme

tamponu 0,2 ml’lik toplama tüpü içerisinde karıştırılarak otomatik pipet yardımı ile

jel üzerindeki gözlere yüklendi. Daha sonra 1 µl moleküler ağırlık merdiveni, 1 µl

yükleme tamponu ve 4 µl su ile karıştırılarak jelin uygun gözüne aktarıldı.

Elektroforez, 20 dakika-100 volt koşullarında gerçekleştirildi. PCR ürünleri

morötesi ışık kaynağı kullanılarak steril bistüri ile jelden kesildi. PCR ürününü

içeren jel parçası 1,5 ml’lik toplama tüpüne alındı. Jel parçasının ağırlığı tartıldı ve

her 10 mg jel parçası için 60 µl GS1 (jeli çözdürücü tampon) eklendi. En az 15

dakika olacak şekilde, jel parçası eriyene kadar 50°C’de inkübasyona bırakıldı. Her

3 dakikada bir karıştırıldı. Jel parçası eridikten sonra 5 dakika daha inkübasyonda

tutuldu. Jel ekstraksiyon kolonu 2 ml’lik yıkama tüpüne yerleştirildi ve GS1

içerisinde erimiş olan jel kolona yüklendi. Oda ısısında 10 000 rpm’de 1 dakika

santrifüj edildi. Tüpe geçen sıvı ortamdan uzaklaştırıldı. Kolona 500 µl GS1 eklendi

1 Fermentas, Kat. No: RO611. 2 Invitrogen, Kat. No: 10488-058. 3 Kodak Gel Logic 1500, Amerika Birleşik Devletleri. 4 Invitrogen-Quick Gel Extraction Kit, Kat. No: K 2100-12.

33

ve oda ısısında 1 dakika inkübasyona bırakıldı. 10 000 rpm’de 1 dakika santrifüj

edildi. Tüpe geçen sıvı ortamdan uzaklaştırıldı. Kolona içerisinde etanol bulunan

W9 yıkama solüsyonundan 700 µl eklendi ve oda ısısında 5 dakika inkübasyona

bırakıldıktan sonra 10 000 rpm’de 1 dakika santrifüj edildi. Tüpe geçen sıvı

ortamdan uzaklaştırıldı. W9 kalıntısı kalmaması amacı ile tekrar 10 000 rpm’de 1

dakika santrifüj edildi. Kolon 1,5 ml’lik yeni bir tüpe alındı. Kolon membranının

ortasına gelecek şekilde TE solüsyonu (nükleazlardan ari su) eklendi. Oda ısısında 1

dakika inkübasyona bırakıldı. 10 000 rpm’de 2 dakika santrifüj edildi. Kolon atıldı.

Tüp üzerine gerekli bilgiler yazıldıktan sonra elde edilen purifiye DNA, 2.2.9.’da

anlatıldığı şekilde % 1,5’luk agaroz jelde yürütülerek nükleotid dizileme analizi için

yeterli kalitede olup olmadığı kontrol edildi. Daha sonra kullanılacağı zamana kadar

-20°C’de saklandı.

2.2.11. Nükleotid Dizileme Reaksiyonu ve Elde Edilen Nükleotid Dizilerin

Değerlendirilmesi

Nükleotid dizileme reaksiyonu özel bir firmaya1 yaptırıldı. Nükleotid diziler,

ClustalX (Thompson ve ark., 1997) ve GeneDoc (Nicholas ve ark., 1997) yazılımları

kullanılarak GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) numaraları Çizelge

2.2.1.’de verilen referans nükleotid diziler ile hizalandı ve MEGA4 (Tamura ve ark.,

2007) yazılım paketi kullanılarak FASTA formatına çevrildi. Verilerin

dökümantasyonunda ise BioEdit Version 7.0.1 yazılım paketi (Hall, 1999) kullanıldı.

Çizelge 2.2.1. Çalışmada kullanılan referans nükleotid dizilere ait bilgiler

Referans Nükleotid Dizi Genbank Numarası Referans

A24/Cruzeiro/BRA/55 Kapsit genleri AJ251476 (Knowles ve ark., 1999)

A/PAK/3/2006 3A geni EF117837 (Klein ve ark., 2006)

O1/Manisa/TUR/69 Kapsit genleri AJ251477 (Aktaş ve Samuel, 2000)

O/NY00 cre geni AY333431 (Zheng ve ark., 2004)

O/KEN/1/91 3A geni AF335006 (Heath ve ark., 2001)

1 RefGen, ODTÜ Teknokent, Ankara.

34

3. BULGULAR

3.1. Virus İzolasyonu Bu çalışma için BHK-21 hücre kültürü hatlarında virus izolasyon çalışmasına alınan

13 adet virusun; BHK-21 An31 monolayer hücre kültüründe 1.-6. (O1 Manisa

kontrol virusu için 1.-13.), BHK-21 An30 monolayer hücre kültüründe 7.-12. (O1

Manisa kontrol virusu için 14.-20.) ve BHK-21 An30 süspanse hücre kültüründe

13.-15. (O1 Manisa kontrol virusu için 21.-23.) pasajları tamamlanarak hücre

kültürü adaptasyon çalışmaları yapıldı. O1 Manisa kontrol virusunun adaptasyonu

diğer viruslara göre daha fazla pasaj yapılarak tamamlanabildi. BHK-21 An31 ve

BHK-21 An30 monolayer hücre kültürü hatlarında yapılan son pasajlarda bütün

viruslar 24 saatten daha kısa sürede %90-100 CPE oluşturdu. BHK-21 An30

süspanse hücre kültüründe yapılan son pasajlarda ise Virus 5 ve A Tur 04-06

kontrol virusu hariç bütün viruslar 24 saatten daha kısa sürede % 90-100 CPE

oluşturarak adaptasyonlarını tamamladı. Virus 5 ve A Tur 04-06 kontrol virusu ise

BHK-21 An30 süspanse hücre kültüründe yapılan pasajlarda CPE oluşumu

göstermedi ve bu hücre kültürüne adapte olmadı. Bütün virus pasajları için hücre

kontrol olarak hazırlanan ve virus ekilmeyen hücre kültürlerinde CPE oluşumu

görülmedi.

3.2. İndirekt Sandviç ELISA Bütün virus pasajlarından elde edilen pasaj sıvıları indirekt sandviç ELISA testinde

çalışılarak virusların tip tayinleri yapıldı. İndirekt sandviç ELISA testinde çalışılan

viruslardan Virus 1, Virus 2, Virus 3, Virus 4, Virus 5, A22 Irak ve A Tur 04-06

kontrol virusları A serotipi; Virus 6, Virus 7, Virus 8, Virus 9, Virus 10 ve O1 Manisa

kontrol virusu O serotipi olarak tiplendirildi. Virus 5’in BHK-21 An30 süspanse

hücre kültüründe yapılan 1. ve 3. pasajında (P13 ve P15), Virus 10’un BHK-21 An31

hücre kültüründe yapılan 1. pasajında (P1) ve A Tur 04-06 kontrol virusunun BHK-

35

21 An30 süspanse hücre kültüründe yapılan 2. ve 3. pasajında (P14 ve P15) menfi

(negatif) sonuç alındı. Hücre kontrol olarak hazırlanan ve virus ekilmeyen hücre

kültürleri de menfi sonuç verdi. Aday viruslar ve kontrol viruslara ait indirekt

sandviç ELISA sonuçları; Çizelge 3.1.-3.13.’de verildi.

3.3. Plak Test Çalışılan virusların bütün virus pasajlarından elde edilen pasaj sıvıları, plak teste

alınarak enfektivite titreleri hesaplandı ve plak morfolojileri incelendi. Hücre

kontrol olarak hazırlanan ve virus ekilmeyen hücre kültürleri plak oluşturmadı.

BHK-21 An30 süspanse hücre kültüründeki son pasajların pasaj sıvısından yapılan

plak testte; Virus 2 için büyük ve küçük plak, Virus 3 için büyük ve küçük plak,

Virus 6 için küçük plak ve Virus 8 için orta boy plak fenotipi gösteren farklı plak

klonları seçildi. Bu klonlar iki defa daha plak teste alınarak plak pasajı yapıldı ve

nükleotid dizilerinde bir farklılık olup olmadığı araştırıldı. Bunlardan büyük klonlar

PK1, küçük klonlar PK2, diğerleri ise PK olarak adlandırıldı. Aday viruslar ve

kontrol viruslara ait plak test bilgileri Çizelge 3.1.-3.13.’de ve plak

morfolojilerindeki değişimleri gösteren fotoğraflar Şekil 3.1.-3.13.’de verildi.

3.3.1. Aday Virus 1 (A tipi 1) Aday Virus 1’in (A tipi 1) plak çapı ölçülerinin pasajlar arasında farklı olduğu; P2

ve P10’da plak çapı ortalamasının P1’e göre artmasına rağmen diğer pasajlarda

küçüldüğü, P6’dan itibaren 1,0 mm ve daha küçük çapta küçük plakların oluştuğu

ve küçük plakların sayısının süspanse hücre pasajlarında çok arttığı tespit edildi.

36

3.3.2. Aday Virus 2 (A tipi 2) Aday Virus 2’nin (A tipi 2) plak çapı ölçülerinin pasajlar arasında farklı olduğu;

ilerleyen pasajlarda P1’e göre plak çapı ortalamasının küçüldüğü, P9’dan itibaren

1,0 mm ve daha küçük çapta küçük plakların sayısının arttığı tespit edildi.

3.3.3. Aday Virus 3 (A tipi 3) Aday Virus 3’ün (A tipi 3) plak çapı ölçülerinin pasajlar arasında farklı olduğu; P2,

P3, P4, P5, P6, P7 ve P13’de plak çapı ortalamasının P1’e göre artmasına rağmen

diğer pasajlarda küçüldüğü, P2 ve P5 hariç bütün pasajlarda 1,0 mm ve daha küçük

çapta küçük plakların oluştuğu tespit edildi.

3.3.4. Aday Virus 4 (A tipi 4) Aday Virus 4’ün (A tipi 4) plak çapı ölçülerinin pasajlar arasında farklı olduğu; P8,

P9, P10 ve P11’de plak çapı ortalamasının P1’e göre artmasına rağmen diğer

pasajlarda küçüldüğü, ilk pasajdan itibaren 1,0 mm çapında küçük plakların

oluştuğu ve küçük plakların sayısının son süspanse hücre pasajında çok arttığı tespit

edildi. P14’de test ikinci defa tekrarlanmasına rağmen plak oluşumu şekillenmedi.

3.3.5. Aday Virus 5 (A tipi 5) Aday Virus 5’in (A tipi 5) plak çapı ölçülerinin pasajlar arasında farklı olduğu; P3,

P8 ve P9’da plak çapı ortalamasının P1’e göre artmasına rağmen diğer pasajlarda

küçüldüğü, P10’dan itibaren 1,0 mm’den daha küçük çapta plakların oluştuğu tespit

edildi. P14’de test ikinci defa tekrarlanmasına rağmen plak oluşumu şekillenmedi.

37

3.3.6. Aday Virus 6 (O tipi 1) Aday Virus 6’nın (O tipi 1) plak çapı ölçülerinin pasajlar arasında birbirine yakın

olduğu; P2, P3, P4 ve P5’de plak çapı ortalamasının P1’e göre bir miktar artmasına

rağmen diğer pasajlarda daha küçük olduğu, ilk pasajdan itibaren 1,0 mm çapında

küçük plakların oluştuğu ve ilk pasajlarda bulanık olan plak görüntülerinin daha

sonra netleşerek belirgin hale geldiği tespit edildi.

3.3.7. Aday Virus 7 (O tipi 2) Aday Virus 7’nin (O tipi 2) plak çapı ölçülerinin pasajlar arasında birbirine yakın

olduğu; P2, P3, P4 ve P5’de plak çapı ortalamasının P1’e göre bir miktar artmasına

rağmen diğer pasajlarda daha küçük olduğu, ilk pasajdan itibaren 1,0 mm çapında

küçük plakların oluştuğu ve ilk pasajlarda bulanık olan plak görüntülerinin daha

sonra netleşerek belirgin hale geldiği tespit edildi.

3.3.8. Aday Virus 8 (O tipi 3) Aday Virus 8’in (O tipi 3) plak çapı ölçülerinin pasajlar arasında farklı olduğu ve

bir artıp bir azaldığı, daha sonra tekrar artıp azaldığı tespit edildi. 1 mm çapındaki

küçük plakların P3, P4, P5 ve P7 hariç bütün pasajlarda oluştuğu ve ilk pasajlarda

bulanık olan plak görüntülerinin daha sonra netleşerek belirgin hale geldiği görüldü.

3.3.9. Aday Virus 9 (O tipi 4) Aday Virus 9’un (O tipi 4) plak çapı ölçülerinin pasajlar arasında farklı olduğu ve

bir artıp bir azaldığı, daha sonra tekrar artıp azaldığı, P9 ve P15 hariç bütün

pasajlarda plak çapı ortalamasının P1’e göre arttığı tespit edildi. 1 mm çapındaki

küçük plakların P6, P11 ve P12 hariç bütün pasajlarda oluştuğu görüldü.

38

3.3.10. Aday Virus 10 (O tipi 5) Aday Virus 10’un (O tipi 5) plak çapı ölçülerinin pasajlar arasında farklı olduğu; P2

ve P4’de plak çapı ortalamasının P1’e göre bir miktar arttığı, P6’da eşit olduğu ve

diğer pasajlarda azaldığı, ilk pasajdan itibaren 1,0 mm çapında küçük plakların

oluştuğu tespit edildi.

3.3.11. A22 Irak Kontrol Virusu A22 Irak kontrol virusunun plak çapı ölçülerinin pasajlar arasında farklı olduğu; P2,

P3 ve P4’de plak çapı ortalamasının P1’e göre bir miktar artmasına rağmen diğer

pasajlarda azaldığı, ilk pasajdan itibaren P2, P3 ve P4 hariç 1,0 mm çapında küçük

plakların oluştuğu tespit edildi.

3.3.12. A Tur 04-06 Kontrol Virusu A Tur 04-06 kontrol virusunun plak çapı ölçülerinin pasajlar arasında farklı olduğu;

P3’de plak çapı ortalamasının P1’e göre bir miktar arttığı, P12’da eşit olduğu ve

diğer pasajlarda azaldığı, ilk pasajdan itibaren 1,0 mm çapında küçük plakların

oluştuğu tespit edildi. P14’de test ikinci defa tekrarlanmasına rağmen plak oluşumu

şekillenmedi.

3.3.13. O1 Manisa Kontrol Virusu O1 Manisa kontrol virusunun plak çapı ölçülerinin pasajlar arasında farklı olduğu;

P9, P10, P11, P12, P14 ve P15’de plak çapı ortalamasının P1’e göre bir miktar

artmasına rağmen diğer pasajlarda azaldığı, P1 ve P9 hariç 1,0 mm çapında küçük

plakların bütün pasajlarda oluştuğu tespit edildi.

39

(a) (b) (c) Şekil 3.1. Virus 1’e ait P1 (a), P11 (b) ve P15 (c) plak görüntüleri

(a) (b) (c) Şekil 3.2. Virus 2’ye ait P1 (a), P12 (b) ve P15 (c) plak görüntüleri

(a) (b) (c)

(d) Şekil 3.3. Virus 3’e ait P1 (a), P2 (b), P7 (c) ve P15 (d) plak görüntüleri

40



(a) (b) (c) Şekil 3.6. Virus 6’ya ait P4 (a), P6 (b) ve P15 (c) plak görüntüleri

41

(a) (b) (c) Şekil 3.7. Virus 7’ye ait P1 (a), P6 (b) ve P15 (c) plak görüntüleri

(a) (b) (c)

(d) (e) Şekil 3.8. Virus 8’e ait P1 (a), P6 (b), P10 (c), P11 (d) ve P15 (e) plak görüntüleri

42

(a) (b) (c)

(d) Şekil 3.9. Virus 9’a ait P1 (a), P9 (b), P11 (c) ve P15 (d) plak görüntüleri

(a) (b) (c) Şekil 3.10. Virus 10’a ait P1 (a), P10 (b) ve P15 (c) plak görüntüleri

43

(a) (b) (c) Şekil 3.11. A22 Irak kontrol virusuna ait P1 (a), P12 (b) ve P15 (c) plak görüntüleri

(a) (b) (c) Şekil 3.12. A Tur 04-06 kontrol virusuna ait P1 (a), P7 (b) ve P15 (c) plak görüntüleri

(a) (b) (c) Şekil 3.13. O1 Manisa kontrol virusuna ait P1 (a), P9 (b) ve P23 (c) plak görüntüleri

44

Çizelge 3.1. Virus 1’e ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri

Pasaj Yapılan Hücre

Pasaj No

Toplandığı

Saat

ELISA

O.D.si ve Tipi

Enfektif Titre (PFU)

Log10/1,0 ml

Sayılabilen Plakların

Sayısı

Sayılabilen Plakların Çapı (mm)

Dağılımı Ortalaması

Monolayer BHK-21 An31

P1 30 3,9-A 7,7 19 4,0-6,0 5,8

P2 20 0,8-A 7,6 5 6,0-8,0 7,2

P3 18 0,6-A 7,2 20 3,0-6,0 5,6

P4 17 1,4-A 7,4 26 3,0-7,0 5,2

P5 16,5 0,5-A 7,7 46 2,0-6,0 3,6

P6 16 1,2-A 8,3 22 1,0-7,0 4,2


P7 31 2,7-A 7,3 25 1,0-7,0 3,6

P8 24 3,9-A 7,0 11 1,0-5,0 3,7

P9 18 2,5-A 7,2 21 1,0-6,0 3,1

P10 17 1,9-A 7,0 12 5,0-8,0 6,5

P11 17 3,6-A 7,0 38 1,0-7,0 3,6

P12 15,5 2,8-A 7,5 27 1,0-4,0 1,8

Süspanse BHK-21 An30

P13 18 1,7-A 7,6 96 0,5-2,0 0,8

P14 17 2,5-A 6,6 136 0,5-4,0 1,0

P15 16 2,2-A 6,7 50 0,5-3,0 1,2

45

Çizelge 3.2. Virus 2’ye ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri


Pasaj No

Toplandığı

Saat

ELISA

O.D.si ve Tipi


Log10/1,0 ml


Sayısı




P1 27 1,5-A 7,2 24 3,0-7,0 5,1

P2 20 1,4-A 7,3 16 3,0-6,0 4,2

P3 19 0,7-A 7,4 29 3,0-6,0 4,6

P4 18 3,9-A 7,4 32 3,0-6,0 4,3

P5 17 3,7-A 7,5 15 3,0-6,0 4,8

P6 16 0,5-A 8,2 19 3,0-6,0 3,7


P7 47 3,9-A 6,3 21 2,0-6,0 3,8

P8 17 2,7-A 8,0 30 2,0-6,0 3,1

P9 17 2,6-A 4,6 53 0,5-4,0 1,3

P10 17 1,9-A 5,2 44 1,0-6,0 2,5

P11 17 2,7-A 6,4 121 0,5-2,0 1,0

P12 16,5 2,2-A 7,1 74 1,0-4,0 1,3


P13 18 1,3-A 6,5 113 0,5-3,0 0,6

P14 17 2,0-A 6,0 129 0,5-4,0 0,9

P15 16 2,3-A 6,3 110 0,5-3,0 0,8

46



Pasaj No

Toplandığı

Saat

ELISA

O.D.si ve Tipi


Log10/1,0 ml


Sayısı




P1 25 1,7-A 7,8 65 1,0-4,0 1,8

P2 19 2,0-A 7,2 28 3,0-6,0 4,5

P3 20 2,1-A 7,4 28 1,0-6,0 3,7

P4 23 2,0-A 7,4 25 1,0-5,0 3,9

P5 22 1,6-A 6,5 29 2,0-5,0 3,4

P6 18,5 1,2-A 6,4 23 0,5-4,0 3,0


P7 24 2,0-A 5,6 34 1,0-5,0 2,9

P8 21 2,8-A 5,2 16 0,5-3,0 1,3

P9 20 1,3-A 5,4 33 1,0-4,0 1,8

P10 20 1,5-A 5,1 62 1,0-4,0 1,8

P11 19 1,9-A 5,3 31 0,5-3,0 1,1

P12 19 1,1-A 4,9 42 0,5-3,0 1,5


P13 24 0,2- A 3,6 44 0,5-4,0 2,0

P14 24 0,3- A 3,5 35 0,5-3,0 1,1

P15 24 0,2- A 5,4 85 0,5-1,0 0,7

47



Pasaj No

Toplandığı

Saat

ELISA

O.D.si ve Tipi


Log10/1,0 ml


Sayısı




P1 39 1,5-A 8,4 64 1,0-4,0 2,4

P2 19 2,1-A 7,4 80 1,0-3,0 2,0

P3 20 2,0-A 7,7 49 1,0-3,0 2,0

P4 19,5 1,9-A 7,5 33 1,0-4,0 1,4

P5 23 0,9-A 7,3 69 1,0-3,0 2,0

P6 19 1,1-A 7,8 54 1,0-3,0 2,1


P7 22 0,9-A 8,4 17 1,5-4,0 2,3

P8 21 2,1-A 7,5 28 2,0-6,0 3,4

P9 20 1,2-A 5,8 31 2,0-5,0 3,3

P10 21 1,3-A 5,0 10 2,0-7,0 4,2

P11 19 1,3-A 2,9 10 1,0-4,0 2,6

P12 19 0,8-A 4,1 23 1,0-3,0 1,8


P13 40 0,3-A 2,6 7 0,5-2,0 0,7

P14 40 0,3-A Plak yok Plak yok Plak yok Plak yok

P15 24 0,2-A 5,7 73 0,5-1,5 0,7

48



Pasaj No

Toplandığı

Saat

ELISA

O.D.si ve Tipi


Log10/1,0 ml


Sayısı




P1 27 1,9-A 8,6 37 2,0-7,0 4,4

P2 18 2,6-A 7,2 17 3,0-5,0 3,9

P3 17 1,0-A 7,3 18 2,0-6,0 4,7

P4 18 0,5-A 7,5 30 2,0-5,0 3,7

P5 21 0,6-A 7,6 28 2,0-6,0 4,1

P6 17 0,3-A 7,2 18 2,0-6,0 3,7


P7 23 1,4-A 7,1 15 2,0-6,0 4,0

P8 21 2,5-A 6,3 19 4,0-6,0 5,5

P9 20 1,2-A 6,1 11 1,5-6,0 4,6

P10 20 1,3-A 6,4 23 0,5-6,0 4,0

P11 19 1,3-A 6,1 55 0,5-6,0 1,8

P12 19 0,7-A 5,6 45 0,5-6,0 1,2


P13 40 Menfi 3,8 47 0,5-6,0 1,9

P14 40 0,3-A Plak yok Plak yok Plak yok Plak yok

P15 40 Menfi 4,4 38 0,5-1,5 0,5

49

Çizelge 3.6. Virus 6’ya ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri


Pasaj No

Toplandığı

Saat

ELISA

O.D.si ve Tipi


Log10/1,0 ml


Sayısı




P1 49 Menfi 2,7 7 1,0-2,0 1,1

P2 45 0,3-O 7,2 16 1,0-3,0 2,1

P3 43 0,3-O 6,5 23 1,0-3,0 1,9

P4 45 1,1-O 6,2 49 1,0-5,0 2,6

P5 23 0,2-O 6,3 30 0,5-3,0 1,6

P6 18 0,2-O 5,4 140 0,5-4,0 0,7


P7 18 0,2-O 5,8 87 0,5-1,0 0,5

P8 16 0,2-O 3,3 80 0,5 0,5

P9 17 0,2-O 3,6 113 0,5-2,0 0,5

P10 17 0,3-O 6,5 35 0,5 0,5

P11 16 0,1-O 6,6 75 0,5-1,0 0,7

P12 15 0,1-O 7,5 89 0,5-1,0 0,9


P13 18 0,5-O 6,8 57 0,5 0,5

P14 18 0,3-O 6,8 117 0,5-4,0 0,7

P15 18 0,8-O 7,0 62 0,5-1,0 0,6

50

Çizelge 3.7. Virus 7’ye ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri


Pasaj No

Toplandığı

Saat

ELISA

O.D.si ve Tipi


Log10/1,0 ml


Sayısı




P1 49 Menfi 4,3 20 1,0-2,0 1,3

P2 45 0,2-O 6,2 65 1,0-2,0 1,6

P3 43 0,6-O 7,3 54 1,0-3,0 1,5

P4 45 1,4-O 5,6 35 1,0-3,0 1,8

P5 40 1,7-O 7,7 23 1,0-3,0 1,7

P6 18 0,5-O 5,3 110 0,5-3,0 0,6


P7 31 0,2-O 5,5 135 0,5 0,5

P8 16 0,2-O 3,3 168 0,5-4,0 0,5

P9 17 0,2-O 5,5 120 0,5 0,5

P10 17 0,2-O 6,6 44 0,5 0,5

P11 16 0,4-O 6,9 90 0,5-1,0 0,7

P12 15 0,4-O 7,6 47 0,5-1,0 0,8


P13 18 0,4-O 6,7 45 0,5-1,0 0,6

P14 18 1,0-O 6,7 101 0,5-5,0 0,8

P15 18 1,1-O 6,9 124 0,5-2,0 0,8

51



Pasaj No

Toplandığı

Saat

ELISA

O.D.si ve Tipi


Log10/1,0 ml


Sayısı




P1 47 0,3-O 6,4 84 1,0-3,0 1,8

P2 39 0,3-O 7,5 28 1,0-5,0 2,4

P3 22 0,4-O 7,3 19 2,0-5,0 3,1

P4 21 1,2-O 6,6 40 2,0-5,0 3,8

P5 23 1,4-O 7,1 42 2,0-5,0 4,5

P6 22 0,5-O 7,2 57 1,0-4,0 2,7


P7 47 0,3-O 6,5 35 2,0-3,0 2,1

P8 25 0,2-O 6,6 63 0,5-2,0 0,8

P9 17 0,3-O 5,0 84 0,5-2,0 0,7

P10 17 0,3-O 7,0 104 0,5-2,0 1,2

P11 16 0,5-O 7,5 20 1,0-3,0 1,9

P12 15 0,5-O 7,9 41 1,0-4,0 2,8


P13 18 0,7-O 7,2 51 1,0-5,0 3,0

P14 17 0,9-O 7,0 49 1,0-4,0 2,4

P15 17 1,1-O 7,0 32 1,0-4,0 2,4

52

Çizelge 3.9. Virus 9’a ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri


Pasaj No

Toplandığı

Saat

ELISA

O.D.si ve Tipi


Log10/1,0 ml


Sayısı




P1 46 0,3-O 6,2 18 1,0-3,0 1,6

P2 37 0,2-O 7,5 33 1,0-3,0 2,4

P3 22 0,1-O 7,0 50 1,0-3,0 2,2

P4 30 0,3-O 6,3 37 1,0-4,0 2,2

P5 25 0,5-O 6,5 34 1,0-5,0 2,4

P6 18 0,9-O 7,6 17 2,0-5,0 3,4


P7 47 0,5-O 6,3 15 1,0-5,0 3,0

P8 45 0,5-O 6,6 24 1,0-3,0 2,2

P9 25 0,6-O 6,7 154 1,0-3,0 1,2

P10 24 0,2-O 7,1 47 1,0-3,0 1,9

P11 21 0,9-O 7,3 23 2,0-4,0 3,0

P12 16 0,7-O 7,4 24 3,0-5,0 4,0


P13 18 1,2-O 5,6 42 0,5-5,0 1,8

P14 17 0,7-O 4,7 36 0,5-5,0 2,7

P15 17 0,7-O 5,6 65 0,5-4,0 1,2

53

Çizelge 3.10. Virus 10’a ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri


Pasaj No

Toplandığı

Saat

ELISA

O.D.si ve Tipi


Log10/1,0 ml


Sayısı




P1 48 Menfi 6,3 33 1,0-5,0 2,8

P2 21 0,3-O 7,0 36 1,0-5,0 3,2

P3 46 0,4-O 7,0 39 1,0-4,0 2,1

P4 48 0,6-O 6,4 22 1,0-4,0 3,0

P5 30 0,4-O 6,6 45 1,0-4,0 2,6

P6 24 1,8-O 6,3 15 1,0-4,0 2,8


P7 48 1,0-O 4,3 44 1,0-4,0 1,8

P8 40 1,2-O 5,4 18 0,5-4,0 2,0

P9 34 0,8-O 5,5 23 0,5-4,0 1,8

P10 28 0,2-O 4,1 70 0,5-3,0 1,3

P11 24 1,5-O 3,0 14 1,0-4,0 1,9

P12 20 1,7-O 3,6 29 1,0-4,0 1,7


P13 18 1,6-O 4,5 33 0,5-4,0 1,1

P14 17 0,8-O 5,6 77 0,5-4,0 1,1

P15 16 1,8-O 5,6 75 0,5-4,0 0,9

54

Çizelge 3.11. A22 Irak kontrol virusuna ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri


Pasaj No

Toplandığı

Saat

ELISA

O.D.si ve Tipi

Enfektif Titre(PFU)

Log10/1,0 ml


Sayısı




P1 25 1,8-A 8,1 38 1,0-4,0 2,8

P2 20 2,9-A 7,2 17 3,0-7,0 4,7

P3 18 4,0-A 7,6 38 2,0-5,0 3,4

P4 21 3,1-A 8,0 43 2,0-5,0 3,4

P5 17 2,8-A 6,8 80 1,0-4,0 1,6

P6 17 2,3-A 7,5 100 1,0-3,0 1,6


P7 31 3,9-A 7,1 74 1,0-5,0 2,0

P8 16 3,3-A 6,5 41 0,5-7,0 2,0

P9 16,5 3,0-A 5,4 30 0,5-5,0 1,5

P10 17 2,9-A 6,5 95 0,5-7,0 1,4

P11 16 3,3-A 7,1 65 0,5-5,0 1,5

P12 15 3,0-A 6,2 105 0,5-4,0 0,8


P13 18 1,8-A 5,9 90 0,5-5,0 1,1

P14 17 2,4-A 5,8 51 0,5-3,0 1,4

P15 16 2,7-A 6,0 62 0,5-4,0 1,4

55

Çizelge 3.12. A Tur 04-06 kontrol virusuna ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri


Pasaj No

Toplandığı

Saat

ELISA

O.D.si ve Tipi

Enfektif Titre(PFU)

Log10/1,0 ml


Sayısı




P1 37 1,1-A 6,9 36 1,0-5,0 3,8

P2 24 0,9-A 6,5 30 0,5-4,0 3,1

P3 24 1,0-A 7,3 20 1,0-6,0 5,7

P4 24 0,3-A 7,4 27 1,0-4,0 2,4

P5 22 0,5-A 7,2 77 0,5-3,0 1,6

P6 21 0,4-A 7,5 31 0,5-5,0 2,0


P7 32 0,4-A 7,1 66 0,5-3,0 1,8

P8 29 0,4-A 7,6 35 0,5-4,0 2,2

P9 24 0,8-A 6,7 45 1,0-4,0 2,7

P10 19 0,4-A 7,1 45 1,0-4,0 2,3

P11 19 0,4-A 6,2 14 0,5-5,0 3

P12 18,5 0,5-A 5,3 19 1,0-7,0 3,8


P13 40 0,1-A 3,5 27 1,0-5,0 2,9

P14 40 Menfi Plak yok Plak yok Plak yok Plak yok

P15 40 Menfi 3,6 52 0,5-4,0 1,3

56

Çizelge 3.13. O1 Manisa kontrol virusuna ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri


Pasaj

No

Toplandığı

Saat

ELISA

O.D.si ve Tipi

Enfektif Titre(PFU)

Log10/1,0 ml


Sayısı




P1 30 0,9-O 5,3 32 2,0 2,0

P2 48 1,0-O 6,4 51 1,0-2,0 1,4

P3 21 1,4-O 6,2 45 1,0-2,0 0,9

P4 27 0,5-O 5,5 23 1,0-3,0 1,3

P5 31 0,8-O 6,6 22 1,0-2,0 1,8

P6 35 1,2-O 6,6 26 1,0-2,0 1,6

P7 26 0,7-O 6,6 40 1,0-3,0 1,8

P8 24 0,8-O 6,6 84 1,0-4,0 1,4

P9 44 0,7-O 5,1 12 2,0-5,0 3,0

P10 33 1,7-O 6,6 24 1,0-5,0 2,6

P11 19 1,4-O 6,5 28 1,0-5,0 2,3

P12 19,5 1,4-O 7,1 47 1,0-5,0 2,6

P13 19 0,9-O 7,5 30 1,0-5,0 1,7

57

Çizelge 3.13. Devam O1 Manisa kontrol virusuna ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri


Pasaj

No

Toplandığı

Saat

ELISA

O.D.si ve Tipi

Enfektif Titre(PFU)

Log10/1,0 ml


Sayısı




P14 35 1,5-O 7,3 22 1,0-4,0 2,2

P15 46 1,0-O 7,0 44 1,0-4,0 2,1

P16 51 1,4-O 6,6 33 1,0-3,0 1,6

P17 46 1,3-O 7,1 48 1,0-5,0 1,9

P18 42 0,4-O 6,9 37 1,0-3,0 1,6

P19 27 0,5-O 5,7 43 1,0-3,0 1,5

P20 18,5 0,5-O 4,2 16 1,0-2,0 1,4


P21 24 0,2-O 5,3 149 0,5-4,0 0,9

P22 19 0,2-O 5,6 95 0,5 0,5

P23 18 0,1-O 5,3 100 0,5 0,5

58

3.4. PCR Çalışılan virusların orijinal virus süspansiyonları (P0), BHK-21 An31 monolayer

hücre kültüründeki ileri pasaj olan 6. pasajları (P6), BHK-21 An30 monolayer hücre

kültüründeki ileri pasaj olan 5. pasajları (P11) ve BHK-21 An30 süspanse hücre

kültüründeki son pasajlarının (P15) pasaj sıvıları VP1, 3A ve cre gen bölgelerinin

eldesi için PCR ile çalışıldı. Aynı amaçla; O1 Manisa kontrol virusu için P0, P13,

P20 ve P23 pasaj sıvıları kullanıldı. Virusların P0 ve P15 (O1 Manisa kontrol virusu

için P0 ve P23) pasaj sıvıları VP4, VP2 ve VP3 gen bölgelerinin eldesi için PCR ile

çalışıldı. Virus 2, Virus 3, Virus 6 ve Virus 8’e ait plak klonları VP1, 3A ve cre gen

bölgelerinin eldesi için PCR ile çalışıldı. Virus 3’e ait plak klonundan cre gen

bölgesi, bütün plak klonları ve Virus 5’den ise VP4, VP2 ve VP3 gen bölgeleri PCR

ile elde edilemedi.

3.5. Nükleotid Dizileme Reaksiyonu Çalışılan virusların P0, P6, P11 ve P15 için (O1 Manisa için P0, P13, P20 ve P23)

639 nükleotid uzunluğunda olan VP1, 459 nükleotid uzunluğunda olan 3A ve 54

nükleotid uzunluğunda olan cre gen bölgeleri nükleotid dizileri elde edildi. Ayrıca

P0 ve P15 (O1 Manisa aşı suşu için P0 ve P23) için 255 nükleotid uzunluğunda olan

VP4, 654 nükleotid uzunluğunda olan VP2 ve 663 nükleotid uzunluğunda olan VP3

gen bölgeleri de elde edilerek, çalışılan tüm gen bölgelerinin referans nükleotid

diziler ile hizalamaları gerçekleştirildi. Virus 2, Virus 3, Virus 6 ve Virus 8’e ait

plak klonlarının VP1, 3A ve cre gen bölgeleri de hizalandı. Hizalama yapıldıktan

sonra referans nükleotid diziler çıkarılarak her virusa ait pasajlar arasındaki

nükleotid dizi farklılıkları tespit edildi. Pasajlar arasında nükleotid değişimi görülen

nükleotid diziler, aminoasit dizilerine çevrilerek aminoasit düzeyinde meydana

gelen anlamlı farklılıklar tespit edildi. Virus 3’e ait plak klonundan cre gen bölgesi,

bütün plak klonları ve Virus 5’den ise VP4, VP2 ve VP3 gen bölgeleri PCR ile elde

edilemediği için bu gen bölgelerinin nükleotid dizileri elde edilemedi. Virus 10’a ait

P15 VP4 gen dizisinin ilk 18 nükleotidi eksik olarak elde edildi. Araştırma

59

kapsamında test edilen tüm viruslara ait ilgili gen bölgeleri itibarıyla elde edilen

nükleotid dizilerinin ve pasajlar arasında nükleotid değişimi görülen dizilerden

anlamlı aminoasit değişimi gösteren aminoasit dizilerinin hizalanmalarına ilişkin

bulgular tablolar halinde EKLER bölümünde sunuldu (değişim görülmeyen diziler

için konsensus nükleotid dizileri verildi).

3.5.1. Aday Virus 1 (A tipi 1) Virus 1’in VP1 geninde; P0, P6 ile P11, P15 arasında T48K ve Q110K olarak 2

aminoasitte, VP3 geninde; P0 ile P15 arasında T178G olarak 1 aminoasitte değişim

tespit edildi (Çizelge 3.-14.). Virus 1’in 3A, cre, VP4 ve VP2 genlerinde pasajlar

arasında anlamlı bir değişim tespit edilmedi.

3.5.2. Aday Virus 2 (A tipi 2) Virus 2’nin VP1 geninde; P0, P6 ile P11, P15, PK1, PK2 arasında D199G olarak 1

aminoasitte, VP2 geninde; P0 ile P15 arasında E131K olarak 1 aminoasitte değişim

tespit edildi (Çizelge 3.-14.). Virus 2’nin 3A, cre, VP4 ve VP3 genlerinde pasajlar


3.5.3. Aday Virus 3 (A tipi 3) Virus 3’ün VP2 geninde; P0 ile P15 arasında W129C, E131K, L134R ve T201A

olarak 4 aminoasitte değişim tespit edildi (Çizelge 3.-14.). Virus 3’ün VP1, 3A, cre,

VP4 ve VP3 genlerinde pasajlar arasında anlamlı bir değişim tespit edilmedi.

60

3.5.4. Aday Virus 4 (A tipi 4) Virus 4’ün VP1 geninde; P0, P6 ile P11, P15 arasında H57R ve Q110R olarak 2

aminoasitte değişim tespit edildi (Çizelge 3.-14.). Virus 4’ün 3A, cre, VP4, VP2 ve

VP3 genlerinde pasajlar arasında anlamlı bir değişim tespit edilmedi.

3.5.5. Aday Virus 5 (A tipi 5) Virus 5’in VP1 geninde; P0, P6, P15 ile P11 arasında H57R, P0, P6, P11 ile P15

arasında H108R ve P0, P6 ile P11, P15 arasında Q110R olarak 3 aminoasitte

değişim tespit edildi (Çizelge 3.-14.). Virus 5’in 3A ve cre genlerinde pasajlar


3.5.6. Aday Virus 6 (O tipi 1) Virus 6’nın VP1 geninde; P0 ile P6, P11, P15, PK arasında E198K olarak 1

aminoasitte, VP3 geninde; P0 ile P15 arasında H56R ve D60G olarak 2 aminoasitte

değişim tespit edildi (Çizelge 3.-14.). Virus 6’nın 3A, cre, VP4 ve VP2 genlerinde

pasajlar arasında anlamlı bir değişim tespit edilmedi.

3.5.7. Aday Virus 7 (O tipi 2) Virus 7’nin VP1 geninde; P0 ile P6, P11, P15 arasında T13A, S30T ve E198K

olarak 3 aminoasitte, VP3 geninde; P0 ile P15 arasında H56R ve D60G olarak 2

aminoasitte değişim tespit edildi (Çizelge 3.-14.). Virus 7’nin 3A, cre, VP4 ve VP2

genlerinde pasajlar arasında anlamlı bir değişim tespit edilmedi.

61

3.5.8. Aday Virus 8 (O tipi 3)

Virus 8’in VP1 geninde; P0, P6 ile P11, P15, PK arasında E83K ve R172W olarak 2

aminoasitte değişim tespit edildi (Çizelge 3.-14.). Virus 8’in 3A, cre, VP4, VP2 ve

VP3 genlerinde pasajlar arasında anlamlı bir değişim tespit edilmedi.

3.5.9. Aday Virus 9 (O tipi 4) Virus 9’un VP1 geninde; P0, P6, P11 ile P15 arasında T96K, P0, P6 ile P11, P15

arasında E138K ve E198K olarak 3 aminoasitte, 3A geninde; P0, P6, P11 ile P15

arasında T119A, N139D ve V143A olarak 3 aminoasitte, VP2 geninde; P0 ile P15

arasında L137R olarak 1 aminoasitte, VP3 geninde; P0 ile P15 arasında C34R olarak

1 aminoasitte değişim tespit edildi (Çizelge 3.-14.). Virus 9’un cre ve VP4


3.5.10. Aday Virus 10 (O tipi 5) Virus 10’un VP1 geninde; P0, P6 ile P11, P15 arasında E138K ve E198K olarak 2

aminoasitte, VP2 geninde; P0 ile P15 arasında L137R olarak 1 aminoasitte değişim

tespit edildi (Çizelge 3.-14.). Virus 10’un 3A, cre, VP4 ve VP3 genlerinde pasajlar


3.5.11. A22 Irak Kontrol Virusu A22 Irak kontrol virusunun 3A geninde; P0 ile P6, P11, P15 arasında L129P olarak 1

aminoasitte, VP2 geninde; P0 ile P15 arasında E131K olarak 1 aminoasitte değişim

tespit edildi (Çizelge 3.-14.). A22 Irak kontrol virusunun VP1, cre, VP4 ve VP3


62

3.5.12. A Tur 04-06 Kontrol Virusu A Tur 04-06 kontrol virusunun VP1 geninde; P0, P6 ile P11, P15 arasında Q110K,

P0, P6, P11 ve P15 arasında E174A olarak 2 aminoasitte, VP3 geninde; P0 ile P15

arasında D174G olarak 1 aminoasitte değişim tespit edildi (Çizelge 3.-14.). A Tur

04-06 kontrol virusunun 3A, cre, VP4 ve VP2 genlerinde pasajlar arasında anlamlı

bir değişim tespit edilmedi.

3.5.13. O1 Manisa Kontrol Virusu O1 Manisa kontrol virusunun VP1 geninde; P0, P13 ile P20, P23 arasında H108R

olarak 1 aminoasitte değişim tespit edildi (Çizelge 3.-14.). O1 Manisa kontrol

virusunun 3A, cre, VP4, VP2 ve VP3 genlerinde pasajlar arasında anlamlı bir

değişim tespit edilmedi.

63

Çizelge 3.14. Çalışılan virusların cre, VP4, VP2, VP3, VP1 ve 3A gen bölgelerinde tespit edilen aminoasit değişimleri

Virus adı

cre VP4 VP2 VP3 VP1 3A

Virus 1

- - - T178G (P15)* T48K, Q110K (P11)* -

Virus 2

- - E131K (P15)* - D199G (P11)* -

Virus 3 - - W129C, E131K, L134R, T201A (P15)*

- - -

Virus 4

- - - - H57R, Q110R (P11)* -

Virus 5

- - - - H57R (P11)*, R57H (P15)*, H108R (P15)*, Q110R (P11)*

-

Virus 6

- - - H56R, D60G (P15)*

E198K (P6)* -

Virus 7

- - - H56R, D60G (P15)*

T13A, S30T, E198K (P6)* -

Virus 8

- - - E83K, R172W (P11)* -

Virus 9 - - L137R (P15)* C34R (P15)* T96K (P15)*, E138K (P11)*, E198K (P11)*

T119A, N139D, V143A (P15)*

Virus 10

- - L137R (P15)* - E138K, E198K (P11)* -

A22 Irak

- - E131K (P15)* - - L129P (P6)*

A Tur 04-06

- - - D174G (P15)* Q110K (P11)*, E174 A (P15)* -

O1 Manisa

- - - - H108R (P20)* -

* Parantezlerin içindeki rakamlar değişikliğin saptandığı pasajın sayısıdır

64

4. TARTIŞMA

Aşılarda kullanılan virusların, monolayer hücrelerde yapılan plak testlerden elde

edilen plak ölçüleri yönünden çoğu zaman heterojen oldukları bilinmektedir. Plak

varyantlarının sabit kaldığı durumlar ise, virus populasyonunda oluşan attenüasyon

(Kanda ve Melnick, 1959; Rapp, 1964) ve antijenik değişim (Hare ve Morgan,

1962; Takemoto ve Habel, 1959) gibi diğer değişikliklere bağlanmıştır. Şap aşısı

üretiminde doğru serolojik suş seçilse bile kullanılan laboratuvar üretim

sistemlerinin ve metodolojinin virusun biyolojik karakterlerinde büyük

değişikliklere sebep olduğu ve aynı alttipte viruslarda plak varyantlarının meydana

gelebildiği, sonuç olarak üretilen aşının değeri üzerinde büyük değişiklikler

oluşabildiği geçmişte yapılan çalışmalarda belirtilmiştir (Cowan, 1966; Cowan,

1970; Erol ve ark., 1979; Gürhan ve Dakılır, 1994). Bu değişikliklerin immuniteyi

de etkileyebileceği saptanmış ve plak varyantlar gösteren şap viruslarının antijenik

olarak birbirinden farklı olabileceği görülmüştür (Cowan, 1968; Martinsen, 1971;

Erol ve ark., 1979). Preston ve arkadaşlarının (1981) yaptığı bir çalışmada ise,

SAT1Nig10/75 şap virusunun küçük ve büyük plak varyantları arasında antijenik

benzerlik olduğu belirtilmiştir. Şap virusunun plak varyantları ile ilgili olan pek çok

araştırmada, büyük plak varyantının hayvanlarda doğal hastalığı oluşturan vahşi tip

virus olduğu düşünülmüştür (Erol ve ark., 1975). Sahada hastalık yapan O1 tipinin

ise küçük plak morfolojisinde olduğu, monolayer pasajlarda plak morfolojisini

değiştirmemesine rağmen süspanse pasajlarda çok küçük plaklar oluşturduğu

bildirilmiştir (İlerle ve Tan, 1987).

Bu araştırmada, şap aşılarının hazırlanmasında aşı suşu adayı olarak seçilen şap

virusu saha suşlarının ve güncel bazı aşı suşlarının, monolayer ve süspanse hücre

kültürlerine adaptasyonları sırasında ortaya çıkan farklı plak fenotipleri genetik

düzeyde incelenerek, söz konusu fenotipik değişikliklerden sorumlu olabilecek

mutasyonlar sorgulanmıştır. Bu amaçla VP1, VP2, VP3, VP4, 3A ve cre gen

bölgeleri incelenmiştir.

65

Araştırma kapsamında çalışılan virusların hepsinde VP1 geni RGD motifinin

pasajlar arasında korunduğu tespit edilmiştir. VP1 geni yüzeyinde bir çıkıntı

oluşturan 140-160 aminoasit dizisinde yer alan G-H kıvrımı, immunodominant

antijenik bölge olan RGD (arjinin-glisin-aspartik asit) motifini kapsar (Acharya ve

ark., 1989). Şap virusunun saha suşlarının RGD motifi tarafından aracılık edilen

etkileşim ile RGD-bağımlı integrinleri kullandıkları belirtilmiştir (Jackson ve ark.,

1996; Fry ve ark., 1999; Jackson ve ark., 2000; Jackson ve ark., 2003). İntegrinler

ECHO virus (Bergelson ve ark., 1992) ve coxsackievirus tip A9 (Roivainen ve ark.,

1991) olmak üzere iki picornavirus için daha reseptör olarak tanımlanmıştır. RGD

aracılı şap virusunun ayrıca integrin aracılı yolu kullanmadan özellikle virus-antikor

kompleksinde olduğu gibi Fc reseptörü ile de hücrelere girebildiği belirtilmiştir

(Mason ve ark., 1993; Baxt ve Mason, 1995). A12 tipi şap virusunun RGD dizisinin,

hücreye bağlanma ve enfektivite için gerekli olduğu ve bu dizide mutasyon (Mason

ve ark., 1994) veya delesyon (McKenna ve ark., 1995) gösteren virusların hücre

kültürlerinde enfeksiyon oluşturmadıkları belirtilmiştir. Virusun hücreye

tutunmasında önemli bir rol oynayan VP1 geninde bulunan 193. rezidünün hücre

kültürlerinde yeterli enfeksiyonu oluşturmak için heparan sülfatın tanınmasında

etkili olduğu gösterilmiştir (Fry ve ark., 1999; Jackson ve ark., 1996). VP1’in G-H

kıvrımı dışında 41.-60. ve 190.-213. rezidüleri, antijenik varyasyonun görüldüğü

diğer en önemli bölgeler olarak bildirilmiştir (Brown, 1988).

Mbayed ve arkadaşları (1997) tarafından A/81/Castellanos/Arg/87 virusunun

sığır böbrek hücrelerinde yapılan 25 pasajından sonra seçilen viral

populasyonlarının bazı biyolojik ve biyokimyasal özelliklerinin çalışılması ile bu

virusun in vitro evrimi hakkında bilgiler elde edilmiştir. Aynı araştırmacılar, VP1

geni RGD motifine yakın olup antijenik bölge 1’de bulunan 149. aminoasitin

modifikasyonunun immun baskı altında gereken dayanıklılıktan sorumlu olduğunu

önermişlerdir. VP1 geni 149. aminoasit pozisyonunda serinin proline değiştiği hem

laboratuvar varyantlarında (Bolwell ve ark., 1989b), hem de A tipi şap viruslarının

saha izolatlarında (Weddell ve ark., 1985) görülmüştür. Mbayed ve arkadaşları

(1997) tarafından açıklanan VP1 geninde görülen diğer mutasyonlar; S47P, N85H/S

66

ve T110K değişimleridir. Bunlardan 110. pozisyondaki değişimin plak çapının

kazanılmış fenotipi ile ilişkili olabileceği, bu değişimin görüldüğü viruslarda hem

küçük plak hem de normal ölçüdeki plakların oluştuğu fakat bu değişimin

görülmediği viruslarda vahşi tip plak yapısının korunduğu belirtilmiştir. Mbayed ve

arkadaşları (1997) tarafından A tipi viruslar için plak çapının kazanılmış fenotipi ile

ilişkili olabileceği belirtilmiş olan VP1 geni 110. pozisyonunda, araştırmadaki A tipi

viruslardan Virus 1 için Q110K, Virus 4 için Q110R, Virus 5 için Q110R ve A Tur

04-06 kontrol virusu için Q110K mutasyonları tespit edilmiştir. Bu virusların birinci

pasajlarından itibaren çok homojen bir vahşi tip plak yapısı göstermedikleri, fakat

ilerleyen pasajlarda çok küçük plak oluşumu şekillendiği gözlenmiştir. Bu

araştırmada VP1 geni 110. pozisyonda mutasyon görülmeyen diğer viruslar için de

karışık plak yapısı izlendiği için, bu pozisyonun plak morfolojisi için önemi olup

olmadığı anlaşılamamıştır. O tipi virusların hiçbirinde bu pozisyonda mutasyon

şekillenmemiştir.

VP1 geninde Virus 1 için tespit edilen T48K ile Virus 4 ve Virus 5 için tespit

edilen H57R mutasyonlarının antijenik varyasyonun görüldüğü önemli bölgelerden

olan 41.-60. rezidüler arasında olmalarından dolayı antijenik olarak önemli ve plak

morfolojisi ile ilişkili olabilecekleri düşünülmüştür. Virus 2’de tespit edilen D199G

ile Virus 6, Virus 7, Virus 9 ve Virus 10’da tespit edilen E198K mutasyonlarının

antijenik varyasyonun görüldüğü önemli bölgelerden olan 190.-213. rezidüler

arasında olmalarından dolayı antijenik olarak önemli ve plak morfolojisi ile ilişkili

olabilecekleri düşünülmüştür. Virus 9 ve Virus 10’da tespit edilen E138K

mutasyonunun, çalışılan O tipi viruslarda G-H kıvrımı başlangıcının ikinci

pozisyonunda yer almasından dolayı antijenik olarak önemli ve plak morfolojisi ile

ilişkili olabileceği düşünülmüştür.

Şap virusu VP3 geni 56. rezidü için pek çok yapısal ve antijenik bilgi vardır.

Örneğin bu pozisyon VP2’nin E-F kıvrımı (131.-134. rezidüleri), VP2’nin B-C

kıvrımı (70.-80. rezidüleri), VP3’ün 58.-61. rezidüleri ve VP1’in 193.-197.

rezidüleri dahil olmak üzere üç dışsal kapsit proteininin kısımlarından oluşan

67

antijenik bölge D’ye dahildir. Bu reseptörün plak morfolojisi ve konakçı aralığını

değiştirdiği görülmekle beraber, heparine bağlanan virusların hala integrine de

bağlanabildikleri belirtilmiştir. BHK hücrelerinde yapılan seri pasajlarla birlikte

şekillenen adaptasyonun daha yavaş şekillendiği ve heparine bağlanma

yeteneklerinin bir sonucu olarak hücre kültüründe daha etkili rekabet edebilen

virusların seçimi ile sonuçlandığı görülmüştür. Heparine bağlanan virusların

sığırlarda önemli ölçüde attenüe olmasının; virus tarafından yeni bir reseptöre

bağlanma özelliğinin elde edilerek, virus replikasyonu için uygun olmayan

bölgelerden virusun ayrılması ile hastalığın ortadan kaldırılabildiğinin göstergesi

olduğu belirtilmiştir (Sa-Carvalho ve ark., 1997).

Sa-Carvalho ve arkadaşları (1997) ile Morioka ve arkadaşları (2008) tarafından

O tipi viruslar için belirtilen VP3 geni 56. ve 60. rezidülerdeki mutasyonlar, bu

araştırmada sadece O tipi viruslar olan Virus 6 ve Virus 7’de tespit edilmiştir. Bu iki

virusun VP3 geni nükleotid dizileri incelendiğinde, P0 ile P15 arasında H56R

mutasyonu ile orijinal virus için histidin olan aminoasitin hücre pasajlarından sonra

arjinine ve D60G mutasyonu ile aspartik asitin glisine dönüştüğü tespit edilmiştir.

Ayrıca Virus 1 için T178G, Virus 9 için C34R ve A Tur 04-06 kontrol virusu için

D174G mutasyonu VP3 geninde tespit edilen diğer mutasyonlardır. D174G ve

T178G mutasyonlarının, XingWen ve arkadaşları tarafından (2010) bildirildiği üzere

VP3 için heparin bağlanma alanı olan 173. rezidüye yakın olmalarından dolayı plak

morfolojisini etkiliyor olabilecekleri düşünülmüştür.

Sa-Carvalho ve arkadaşları (1997) tarafından O1 serotipindeki şap viruslarının

plak fenotipi, hücre kültüründe virusun konakçıda yayılımı ve heparine

bağlanmasını etkileyen kapsit rezidüleri tespit edilmiştir. İn vitro kültürde heparine

bağlanan virusların seçildiği ve bu heparine bağlanan virusların sığırlarda attenüe

olduğu gösterilmiştir. Ek olarak, heparine bağlanan virus yüksek dozda inokule

edildiği sığırlardan geri elde edildiğinde kapsitte heparine bağlanma yeteneğini yok

eden değişiklikler olduğu saptanmıştır. Şap virusu izolatına bağlı olarak

enfeksiyonun başlamasına aracılık eden iki hücresel reseptör ailesi; heparan sülfat

68

proteoglikanlar (HSPG) ve integrinlerdir. Hücre kültürü hatlarına adapte olmuş pek

çok virus heparan sülfata yüksek eğilim kazanır ve hem hücreye tutunmada hem de

bunu izleyen dönemde HSPG’ı reseptör olarak kullanır. Heparan sülfat için

bağlanma bölgesi üç ana kapsit proteini olan VP1, VP2 ve VP3’ün lokalize olduğu

virion yüzeyindeki sığ çöküntüdür (Sa-Carvalho ve ark., 1997; Fry ve ark., 1999;

Jackson ve ark., 2000; Jackson ve ark., 2003). Sa-Carvalho ve arkadaşları (1997),

inceledikleri iki O1 Campos izolatının BHK hücre kültüründe farklı plak

morfolojileri gösteren iki varyant içerdiğini tespit etmişlerdir. Bu varyantlardan bir

tanesinin BHK ve CHO hücrelerinde replike olup küçük ve belirgin plak

oluşturduğunu, diğerinin ise sadece BHK hücrelerinde gelişip büyük ve düzensiz

plak oluşturduğunu belirtmişlerdir. Bu iki varyantın kapsidlerini kodlayan cDNA

kullanılarak, orijinal varyantların fenotiplerini gösteren kimerik viruslar

üretmişlerdir. Bu virusların ve bunlara ait kapsit genlerinin kısımları değiştirilerek

oluşturulan hibridlerin analizleri sonucunda, VP3 geninde bulunan 56. kodon hücre

tropizmi ve plak fenotipi için kritik belirleyici olarak identifiye edilmiştir. Belirli bir

biçimde CHO’da gelişen belirgin plak fenotipi VP3 geni 56. kodondaki rezidüde

bulunan yüksek yüklü arjinin varlığına bağlanmıştır. Virusun saha suşlarında bu

aminoasitin histidin olduğu, hücre kültürüne adaptasyonda ise bu pozisyonda

heparan sülfata yüksek afinite oluşturan arjinine sahip olan virusların seçildiği

belirtilmiştir. Genetik olarak tasarlanmış Arg 3056 virusu sığırlarda yüksek ölçüde

attenüe olurken, yüksek dozda bu virustan inokule edilen hayvanlardan virus tekrar

alındığında virusun CHO hücrelerinde üreme yeteneğini kaybettiği belirtilmiştir. Bu

virusun, VP3 geni 56. pozisyonda yüklenmemiş bir rezidü veya VP2 geni 134.

pozisyonda uzamsal ve antijenik olarak ilişkili pozisyonda lizin ile yerdeğiştirmiş

negatif yüklü glutamik asit içerdiği tespit edilmiştir. Bu sonuçlara göre hem VP2

geni 134. pozisyonda hem de VP3 geni 56. pozisyonda heparine bağlanmak için

pozitif yüklü rezüdülere ihtiyaç olduğu belirtilmiştir. Sonuçlar beraber ele

alındığında, O tipi şap viruslarının in vitro kültüründe heparine bağlanan virusların

seçildiği ve heparine bağlanan virus fenotipine sahip virusların doğal konakta

attenüe olduğu belirtilmiştir. Yine bu araştırmacılar tarafından VP3’ün β B-

çıkıntısında (56./60. rezidüler) bulunan aminoasitlerin hem plak fenotipi hem de

CHO hücrelerinde yayılma yeteneği sağladığı gösterilmiştir. Özellikle, bu bölgede

69

yüksek pozitif yüklü olan virusların (arjinin/alanine karşı histidin/aspartik asit) CHO

hücrelerinde geliştiğini ve BHK hücrelerinde küçük net plaklar oluşturduğunu

belirtmişlerdir. Aynı araştırmacılar tarafından, VP1 geni 134. rezidüsü ile

moleküller arası disülfid bağı oluşturabilen VP2 geni 130. rezidüsündeki sistein

varlığı veya yokluğunun veya VP1 geni 133. rezidüsünde oluşan valinin glutamik

asite değişiminin plak morfolojisi veya CHO hücrelerinde yayılmada hiçbir etkisinin

olmadığı belirtilmiştir. O1 küçük net plak fenotipi rekabet avantajının kapsit

dizilerindeki değişikliklerden kaynaklandığı ve diğer viral genlerden bağımsız

olduğu açıklanmıştır. BHK hücre kültürlerinde yayılma süresince ise VP2 geni 130.

rezidüsündeki sistein ve VP3 geni 56. rezidüsündeki arjinin genotipinin rekabet

avantajı olduğu önerilmiştir. CHO hücrelerine adaptasyonun daha hızlı şekillendiği,

VP3 geni 60. rezidü ve VP1 geni 133. rezidünün BHK plak fenotipi ve CHO

hücrelerinde gelişmede önemli belirteçler olmadıkları açıklanmıştır. Bu son

değişimin kapsit VP2 geni 134. rezidü/VP3 geni 56. rezidü bölgesindeki net pozitif

yükü azalttığı ve negatif yüklü heparine veya heparan sülfat moleküllerine

bağlanmayı azaltabileceği belirtilmiştir.

Morioka ve arkadaşları (2008) tarafından O/JPN/2000 suşunun izolasyonu

sırasında küçük ve büyük plak fenotipi gösteren iki biyotipin kapsit nükleotid dizileri

karşılaştırıldığında VP2 geni 133. aminoasitinde N133D mutasyonu ile asparjinin

aspartik asite ve VP3 geni 56. aminoasitinde R56H mutasyonu ile arjininin histidine

dönüştüğü belirtilmiştir.

XingWen ve arkadaşları tarafından (2010) domuzdan izole edilmiş

O/Fujian/CHA/5/99 suşunun biyolojik özelliklerini araştırmak amacı ile yapılmış olan

plak test, süt emen farelerde patojenite ve şap virusu genomunun tüm uzunluğunca

dizi analizi sonuçları bildirilmiştir. Üç günlük süt emen farelerde yapılan patojenite

çalışmaları sonucunda; domuzdan izole edilmiş O/Fujian/CHA/5/99 suşunun, sığırdan

izole edilmiş O/Tibet/CHA/1/99 suşuna göre daha yüksek virulense sahip olduğu

açıklanmıştır. Bu iki suşun plak fenotipleri yönünden birbirinden farklı oldukları,

O/Fujian/CHA/5/99 suşu büyük plak oluştururken O/Tibet/CHA/1/99 suşunun küçük

70

plak oluşturduğu tespit edilmiştir. O/Fujian/CHA/5/99 suşunun kapsit genlerinde

tespit edilen 14 aminoasit değişiminden çoğunun VP2 geninde bulunup antijenik

bölge 2’yi oluşturan B-C ve E-F kıvrımlarına ve VP1 geninde antijenik bölge 1’i

oluşturan G-H kıvrımına yakın olduğu açıklanmıştır. Bunlardan, heparin bağlanma

alanlarına (VP2 için 134. ve 135. rezidüleri, VP3 için 173. rezidüsü) yakın değişimler

olan VP2 genindeki E136G ve VP3 genindeki A174 S ile VP1 geni antijenik bölge

1’deki T142A, A152T ve Q153P aminoasit değişimlerinin plak çapını ve süt emen

farelerde patojeniteyi etkileyebileceği belirtilmiştir.

Bu araştırmada VP2 geninde Virus 2 için E131K, Virus 3 için W129C,

E131K, L134R ve T201A, Virus 9 için L137R, Virus 10 için L137R ve A22 Irak

kontrol virusu için E131K mutasyonları tespit edilmiştir. Daha önceki

araştırmacıların belirttiği üzere W129C ve L137R mutasyonlarının antijenik bölge

2’ye yakın olmaları, E131K ve L134R mutasyonlarının ise yine antijenik bölge

2’deki E-F kıvrımında (131.-134. rezidüler arası) yer alarak heparin bağlanma

alanlarına yakınlık göstermeleri sebebiyle antijenik olarak önemli olabilecekleri ve

virusun hücreye adaptasyonu sırasında hücresel reseptörlerle etkileşimini

değiştirerek plak morfolojisini etkiliyor olabilecekleri düşünülmüştür.

Bolwell ve arkadaşları (1989a) tarafından BHK hücre kültüründe monolayer

ve süspanse pasajları yapılan A22 Irak 24/64 aşı suşunun plak çapının süspanse

pasajdan sonra monolayer pasaja göre küçüldüğü, küçük plak çapı kazanılmasının

konakçı hücrede gelişmek için bir adaptasyon olduğu ve plak çapındaki küçülmenin

hücre kültüründen seçilen varyantlarda görüldüğü belirtilmiştir. Bu araştırıcılar

tarafından monolayer ve süspanse hücrelere adapte olmuş virusların kapsit gen

bölgelerinden elde edilen nükleotid dizileri karşılaştırıldığında, tüm kapsit

bölgesinde oniki nükleotid değişimi olduğu bildirilmiştir. Bu nükleotid

değişimlerinin; VP4, VP3 ve VP1’de herhangi bir aminoasit değişimi oluşturmadığı,

VP2 geninde ise G82E, T88K ve Y207H olarak üç aminoasitte değişime neden

olduğu açıklanmıştır. VP2 geni 82. rezidüsünde görülen mutasyonun, bu rezidünün

VP1 geni G-H kıvrımına yakın lokalize olmasından dolayı süspanse hücreye adapte

71

varyantların fenotipi için anahtar olduğu düşünülmüştür. Bolwell ve arkadaşları

(1989a) tarafından bildirilen diğer bir konu; her ne kadar monolayer ve süspanse

BHK-21 hücreleri arasında reseptörel farklılıklar tam olarak bilinmese de süspanse

hücrelerin integrinlerin değişik bir dizisini sergiliyor olabileceğidir. Süspanse

hücreye adapte olan varyantın her iki hücre tipine de iyi şekilde bağlanmasının, bu

virusun hem monolayer hem de süspanse hücre yüzeyinde bulunan değişik bir

reseptöre bağlanabildiği veya ana virus monolayer hücredeki bir integrine

bağlanarak sınırlanırken, süspanse hücredeki reseptöre bağlanamadığı varsayımı

önerilmiştir.

Mason ve arkadaşları (2002) tarafından şap virusu genomunun replikasyonu

için kesin varlığı gereken cre bölgesindeki AAACA motifinde mutasyon oluşturulan

replikonların plak fenotipleri incelendiğinde; bunlardan üç tanesinin vahşi tip virustan

önemli ölçüde küçük, bir tanesinin ise daha büyük plaklar oluşturduğu, ayrıca cre

3’ucuna alındığı zaman plak fenotipinin küçüldüğü gösterilmiştir. Bu araştırma

kapsamında çalışılan viruslarda ise cre bölgesi AAACA motifinde veya diğer

rezidülerinde herhangi bir mutasyon görülmemiştir.

Rosas ve arkadaşları (2008) tarafından 3A ve 3B’nin viral enfeksiyona

katılımları ekspresyon sistemleri kullanılarak çalışılmış ve yalnızca 3A veya 3A ve

3B proteinlerini eksprese eden klonların enfekte hücrelerin yüzdesini, plak oluşturma

ünitesini ve virus ürününü arttırdığı açıklanmıştır. Pacheco ve arkadaşları (2003) ise

3A geni 93.-102. ve 133.-143. aminoasitlerinde delesyon oluşturdukları virusların

sığır kökenli hücrelerde zayıf fakat domuz kökenli hücrelerde iyi replike olduğunu,

BHK hücrelerinde şekilleri ve ölçüleri aynı olan plaklar oluşturduklarını

belirtmişlerdir. Bu araştırmada 3A geninde tespit edilen mutasyonların plak

morfolojisi düzeyindeki olası etkileri mevcut bilgilerle ortaya konulamamıştır

Şap virusu dışındaki viruslarla ilgili bildirilmiş olan plak fenotipi çalışmaları

da vardır. Hohdatsu ve arkadaşları (1990) tarafından Getah virus Kanagawa suşu, bu

suştan plak klonlaması ile elde edilen büyük ve küçük plak varyantları ve sadece

72

küçük plak oluşturan Haruna suşunun süt emen fareler için patojenitesi ve plak

ölçüleri çalışılarak, Getah virusların patojenitesinin süt emen farelerde plak çapı ile

bir ilişkisi olmadığı bildirilmiştir. Schloer ve Hanson (1968) tarafından ise

Newcastle virusunun (NDV) yüksek virulense sahip suşlarının çeşitli tipte plaklar

içerdikleri ve bu heterojenitenin laboratuvar pasajları sırasında mutantların birikmesi

sonucu oluştuğunun tartışılabilir bir bulgu olduğu belirtilmiştir. Ancak saha

olgularından elde edilen virusların ikinci ve üçüncü pasajlarında da iki veya üç tipte

plak görülmesi sonucunda, plak heterojenitesinin laboratuvar kültürlerine özgü

olmadığı önerilmiştir. Ayrıca ortalama ve standart sapmaya dayanarak plak

ölçüsünün kantitatif bir özellik olarak tanımlanmasının eksik bir bilgi olarak,

dayanıklı klonların elde edilmesindeki zorlukların bir parçası olabileceği

belirtilmiştir.

Bu araştırmada Virus 2, Virus 3, Virus 6 ve Virus 8 için seçilen plak

klonlarının seçildikleri pasajın dizisi ile aynı nükleotid diziye sahip olduğu, Virus 2

ve Virus 3 için farklı fenotiplerde iki plak klon seçilmesine rağmen bunların

nükleotid dizilerinin de hem birbiri ile hem de seçildiği pasajın nükleotid dizisi ile

aynı olduğu gözlenmiştir. Piatti ve arkadaşları tarafından (1995) da plak seçiminin

her zaman virusun pedigrisini garanti etmediği ve ayrıca virusun çoğaltılmasındaki

koşulların varyantların seçiminde kilit faktör olduğu belirtilmiştir. Çelik (1998)

tarafından yapılan bir çalışmada BHK-21 hücre kültürlerinde seri pasajlar sonucu

üreme süresinin uzaması nedeni ile tohum virus olma özelliğini kaybettiği

düşünülen monolayer O virusu 15. pasaj (MOP-15) şap virusu suşu klonlanarak,

klon viruslar ile tohum virusun antijenik karakterleri karşılaştırılmış ve aynı

zamanda bu viruslarla hazırlanan aşıların in vivo bağışıklık özellikleri araştırılmıştır.

Plak test sonucunda tohum virusun küçük plak, plak klon virusların seçildiği MOP-

15 şap virusunun çok küçük plak ve plak klon virusların küçük plak oluşturduğu

belirtilmiştir. Klon virusların MOP-15 şap virusuna göre üreme sürelerinin kısaldığı,

146S antijen miktarı, antijenik ve enfektif titrelerinin yükseldiği belirtilmiştir. Klon

viruslar ve tohum virusun ise antijenik titrelerinin komplement fikzasyon testinde

paralellik gösterdiği, 146S antijen miktarları, ELISA antijenik titreleri ve enfektif

73

titrelerinin benzerlik gösterdiği tespit edilmiştir. Sonuç olarak tohum virus olarak

kullanılabilme özelliklerini kaybetmiş MOP-15 virusundan klonlama yöntemi ile

antijenik ve immunojenik olarak üstün bir virus elde edilebileceği ortaya konulmuş

olmakla beraber klon virusun tohum virus olarak kullanılabilmesi için O tipi saha

virusları ile çapraz bağışıklık testlerinin yapılması ve dominantlık faktörünün

incelenmesi önerilmiştir.

Araştırmadaki plak test enfektif titre sonuçlarının, indirekt sandviç ELISA

O.D. değerleri ile uyumsuz olduğu (enfektif titrenin düşük olduğu pasajda O.D. nin

yüksek olduğu veya tam tersi, plak testte sonuç alınamadığı halde ELISA’da

pozitiflik görülmesi veya tam tersi) tespit edilmiştir. Bu nedenle ELISA sadece

virusların serotipik identifikasyonu amacı ile kullanılmıştır. Plak çaplarında genel

olarak küçülme tarzında meydana gelen değişimlerin görüldüğü bazı viruslarda bu

küçülmeyle birlikte enfektif titrede de düşüşler tespit edilmiş olmakla beraber, genel

olarak plak çapındaki değişimlerle enfektif titrelerin ilişkili olmadıkları tespit

edilmiştir.

Bu araştırmada VP1 geninde Virus 5 için H108R, Virus 7 için T13A ve S30T,

Virus 8 için E83K ve R172W, Virus 9 için T96K, A Tur 04-06 kontrol virusu için

E174A ve O1 Manisa kontrol virusu için H108R, VP2 geninde Virus 3 için T201A,

VP3 geninde Virus 9 için C34R, 3A geninde Virus 9 için T119A, N139D, V143A

ve A22 Irak kontrol virusu için L129P olarak tespit edilen mutasyonların plak

morfolojisi düzeyindeki olası etkileri mevcut bilgilerle ortaya konulamamıştır ve

ileri çalışmalara ihtiyaç duymaktadır. VP4 geni nükleotid dizilerinde ise virus

pasajları arasında herhangi bir mutasyon tespit edilmemiştir. Bu durumun VP4’ün

kapsitin iç kısmında yer alarak yüksek derecede korunmasından ve hücresel

reseptörlerle ilişkili fonksiyonu olmamasından kaynaklanabileceği düşünülmüştür.

Pasajlar arasında hiçbir mutasyonun görülmediği cre ve VP4 genlerinin bu araştırma

için plak morfolojisi değişimleri ile ilişkili olmadıkları düşünülmüştür. Bu nedenle

daha sonra yapılacak benzer çalışmalarda sadece dış kapsit proteinlerini kodlayan

VP1, VP2 ve VP3 genleri üzerine yoğunlaşılaşılması önerilmektedir.

74

Araştırmada ilerleyen virus pasajlarına paralel olarak meydana gelen

mutasyonlar incelendiğinde, 41 mutasyondan sadece 5 tanesinin (Virus 6 için

VP1’de tespit edilen E198K, Virus 7 için VP1’de tespit edilen T13A, S30T, E198K

ve A22 Irak kontrol virusu için 3A’da tespit edilen L129P) orijinal virus

süspansiyonunun BHK-21 An31 monolayer hücresine adapte edilmesinden sonra

şekillendiği belirlenmiştir. Diğer tüm mutasyonların BHK-21 An30 hücre kültürü

pasajlarında şekillendiği tespit edilmiştir. Bunun sebebinin, farklı hücre kültürlerine

adaptasyon sırasında şekillenen koşullara uyum sağlamak için oluşan bir seleksiyon

olabileceği düşünülmüştür. Yalnızca bir virus için BHK-21 An30 monolayer

pasajında VP1 geninde geri dönüşümlü bir mutasyon görülmüştür. Bu virus için

orijinal süspansiyon ve BHK-21 An31 monolayer pasajındaki VP1 dizisi BHK-21

An30 monolayer pasajında değişmiş fakat süspanse pasajda tekrar orijinale

dönmüştür. Plak morfolojilerindeki değişimler incelendiğinde ise genel olarak

bütün viruslarda ilerleyen pasajlarda küçük plak tipi baskın hale geçmekle birlikte,

tür benzeri kavramını destekler nitelikte çalışılan her virus için serotiplerin kendi

içinde bile birbirinden farklı ve değişken plak fenotipleri olduğu görülmüştür.

Genel olarak küçük plak fenotipinin baskın duruma geçmesinin sebebi olarak,

Bolwell ve arkadaşları (1989a) tarafından belirtilmiş olan BHK hücre kültürü

monolayer ve süspanse pasajlarında küçük plak çapı kazanılmasının konak hücrede

gelişmek için bir adaptasyon olabileceği ve plak çapındaki küçülmenin hücre

kültüründen seçilen varyantlar için normal olarak görülebileceği düşünülebilir.

Fakat Schloer ve Hanson’ın (1968) belirttiği gibi, yüksek virulense sahip suşların

çeşitli tipte plaklar içermeleri ve bu heterojenitenin laboratuvar pasajları sırasında

mutantların birikmesi sonucu oluşması da tartışılabilir bir bulgu olarak

düşünülebilir. Çünkü bu araştırmada, Schloer ve Hanson’ın (1968) belirttiği gibi

saha olgularından elde edilen bazı virusların ikinci ve üçüncü pasajlarında, hatta

birinci pasajlarında bile birden fazla tipte plak görülmesi plak heterojenitesinin

laboratuvar kültürlerine özgü olmadığını düşündürmektedir.

Bu araştırma kapsamında incelenen virusların ilerleyen hücre kültürü

pasajlarında dış kapsit genlerinde tespit edilen mutasyonlardan heparin bağlanma

75

alanlarına yakın olanların, daha önceki araştırmacıların bildirdiği üzere hayvanlarda

patojeniteyi etkileyip etkilemeyeceğinin daha sonra yapılacak hayvan denemeleri

ile araştırılabileceği ve bu çalışmanın ileride yapılabilecek şap virusu çalışmaları

için yararlı olabileceği düşünülmektedir. Ayrıca ileride yapılacak çalışmalar

açısından virusların süspanse hücrelere adaptasyonunun sağlanmasından sonra

tekrar monolayer hücrelere inokule edilmesinin, bu mutasyonlarda ne gibi

değişimlere neden olabileceği de önemli bir araştırma konusu olarak karşımıza

çıkmaktadır. Bu araştırmadan elde edilen bulgular neticesinde sorgulanması önem

arz eden bir diğer konu da kültür ortamı değişikliğinin neden olduğu fenotipik

değişikliklerin virusların immunojeniteleri üzerine etkisi olmalıdır.

76

5. SONUÇ ve ÖNERİLER

Bu araştırmada, 2007 yılında Türkiye’nin çeşitli illerinde hastalığa sebep olmuş beş

adet A/IRN/2005 suşu ve beş adet O PanAsia-2 suşundan olmak üzere on adet aşı

suşu aday virusu ve A22 Irak, A Tur 04-06 ve O1 Manisa olmak üzere üç adet aşı

suşu niteliğindeki kontrol virusunun monolayer (BHK-21 An31 ve BHK-21 An30) ve

süspanse (BHK-21 An30) hücre kültürüne adaptasyon çalışmaları ile ELISA ve plak

testleri yapılmış, ilerleyen pasajlar sırasında plak morfolojilerinde meydana gelen

değişiklikler VP1, VP2, VP3, VP4, 3A ve cre genleri düzeyinde incelenmiş ve bu

genlerde söz konusu fenotipik değişikliklerden sorumlu olabilecek mutasyonlar

sorgulanmıştır. Çalışılan virusların da tür benzeri yapısında olan diğer şap virusu

populasyonları gibi fenotipik ve genotipik olarak heterojen varyantların

karışımından oluştukları ve hücre pasajları sırasında değişen ortam şartlarına uyum

sağlamak için populasyon içindeki sağlam varyantların fenotipik ve genotipik

özelliklerini gösterdikleri düşünülmüştür.

Araştırma kapsamında çalışılan virusların VP1 geninde tespit edilen

mutasyonlar incelendiğinde daha önceden A tipi viruslar için plak çapının kazanılmış

fenotipi ile ilişkili olabileceği belirtilmiş olan 110. pozisyonda iki adet A tipi virusta

Q110K ve iki adet A tipi virusta Q110R mutasyonlarının şekillendiği tespit

edilmiştir. Bir adet A tipi virusta şekillenen T48K ve D199G, iki adet A tipi virusta

şekillenen H57R, dört adet O tipi virusta şekillenen E198K ve iki adet O tipi virusta

şekillenen E138K mutasyonlarının antijenik olarak önemli pozisyonlarda

olmalarından dolayı plak morfolojisi ile ilişkili olabilecekleri düşünülmüştür.

Virusların VP2 geninde tespit edilen mutasyonlar incelendiğinde bir adet A

tipi virusta şekillenen W129C ve L134R, üç adet A tipi virusta şekillenen E131K ile

iki adet O tipi virusta şekillenen L137R mutasyonlarının VP2 geni antijenik bölge

2’ye ve heparin bağlanma alanına yakın olmalarından dolayı daha önceki

araştırmacılar tarafından belirtildiği üzere antijenik olarak önemli olabileceği ve

77

virusun hücreye adaptasyonunda hücresel reseptörlerle etkileşimini değiştirerek plak

morfolojisini etkiliyor olabilecekleri düşünülmüştür.

Virusların VP3 geninde tespit edilen mutasyonlar incelendiğinde daha önceden

hücre tropizmi ve plak fenotipi için kritik belirleyici olarak identifiye edildiği

bildirilmiş olan VP3 geni 56. kodonda şekillenen H56R mutasyonu, D60G

mutasyonu ile birlikte iki adet O tipi virusta tespit edilmiştir. Birer adet A tipi virusta

şekillenen D174G ve T178G mutasyonlarının ise, VP3 için heparin bağlanma alanı

olan 173. rezidüye yakın olmalarından dolayı önemli olabilecekleri düşünülmüştür.

Bu araştırmada VP1 geninde tespit edilen T13A, S30T, E83K, T96K, H108R,

R172W ve E174A, VP2 geninde tespit edilen T201A, VP3 geninde tespit edilen

C34R ve 3A geninde tespit edilen T119A, L129P, N139D ve V143A mutasyonlarının

plak morfolojisi düzeyindeki olası etkileri mevcut bilgilerle ortaya konulamamıştır ve

ileri çalışmalara ihtiyaç duymaktadır. Pasajlar arasında hiçbir mutasyonun

görülmediği cre ve VP4 genlerinin ise bu araştırma için plak morfolojisi yönünden

potansiyel gen bölgeleri olmadıkları düşünülmüştür. Daha sonra yapılacak benzer

çalışmalarda sadece dış kapsit genleri olan VP1, VP2 ve VP3 genleri üzerine

yoğunlaşılması önerilebilir.

Türkiye’de ilk olarak yapılan bu çalışma sonucunda elde edilen bulguların,

şap virusu ile ilgili yapılabilecek başka çalışmalara bilgi sağlayabileceği

düşünülmektedir. İlerleyen hücre kültürü pasajlarında dış kapsit genlerinde tespit

edilen mutasyonlardan heparin bağlanma alanlarına yakın olanların yapılacak

hayvan denemeleri ile daha önceki araştırmacıların bildirdiği üzere hayvanlarda

patojeniteyi etkileyip etkilemeyeceği, virusların süspanse hücrelere adaptasyonunun

sağlanmasından sonra tekrar monolayer hücrelere inokule edilmesinin şekillenmiş

mutasyonlarda ne gibi değişimlere neden olabileceği ve kültür ortamı değişikliğinin

neden olduğu fenotipik değişikliklerin virusların immunojeniteleri üzerine etkisinin

tespiti daha sonra çalışılması önerilebilecek konulardır.

78

Ayrıca, bu çalışmanın Türkiye’de şap aşısı üretimi konusunda da katkısı

olacağı düşünülmektedir. Nitekim, çalışma sırasında Aday Virus 8 (O tipi 3)’in

BHK-21 hücre hatlarında yapılan virus pasajlarında plak test sonucu elde edilen

enfektif titrelerinin araştırmada çalışılan diğer O tipi viruslara göre farklılık

göstermesi üzerine, ülkemizde 2006 yılından beri salgınlara neden olan O PanAsia-

2 için hazırlanacak aşıda kullanılacak aşı suşu olarak değerlendirilebileceği

düşünülmüş ve bu bağlamda O tipi aday virusların süspanse kültürdeki son

pasajlarının 146S değerleri de incelenmiştir. Bu çalışmalar sonucunda çalışmada

kullanılan aday viruslar içinde en yüksek enfektif titreye sahip olduğu belirlenmiş

olan Virus 8’in 146S için de en yüksek değeri verdiği tespit edilmiştir. Bu

farklılığın plak morfolojisindeki değişimlerle ilişkisini tam olarak ortaya koyan

bilimsel veriler olmamakla birlikte, Virus 8 için elde edilen 146S verisi Şap

Enstitüsü Müdürlüğü tarafından önemli bir veri olarak değerlendirilerek, Virus 8’in

O PanAsia-2 suşu için aşı suşu adayı olarak deneysel bağışıklık çalışmalarına

alınmasına karar verilmiştir. Şap Enstitüsü’nde yapılan bu çalışmalar sonucunda

oldukça tatminkâr immunojenite özelliği sergileyen deneysel aşının diğer

kontrolleri de tamamlanarak O Tur 07 adıyla 2011 Bahar Dönemi Şap Aşısı

Kampanyası’ndan itibaren resmi aşı suşu olması için Şap Enstitüsü Müdürlüğü

tarafından Tarım ve Köyişleri Bakanlığı’na başvuru yapılmıştır.

79

ÖZET

Aşı Suşu Olarak Kullanılacak Şap Virusu Plak Morfolojisindeki Farklılıkların Genetik Olarak İncelenmesi

Bu çalışmada, şap aşılarının hazırlanmasında aşı suşu adayı olarak seçilen saha suşlarının ve güncel bazı aşı suşlarının BHK-21 hücre kültürlerine adaptasyonları sırasında ortaya çıkan farklı plak fenotiplerinin genetik düzeyde incelenmesi ve söz konusu fenotipik değişikliklerden sorumlu olabilecek mutasyonların sorgulanması amaçlanmıştır. Bu amaçla, 2007 yılında Türkiye’nin çeşitli illerinde hastalığa sebep olmuş beş adet A/IRN/2005 suşu ve beş adet O PanAsia-2 suşundan olmak üzere on adet aşı suşu aday virusu ve A22 Irak, A Tur 04-06 ve O1 Manisa olmak üzere üç adet aşı suşu niteliğindeki kontrol virusunun BHK-21 hücre kültürlerine adaptasyon çalışmaları, ELISA ve plak testleri yapılarak, pasajlar arasında plak morfolojilerinde meydana gelen değişiklikler genetik düzeyde incelenmiş ve söz konusu değişikliklerden sorumlu olabilecek mutasyonlar sorgulanmıştır. Viruslara ait orijinal virus süspansiyonları, monolayer BHK-21 An31 hücre kültüründe altıncı pasaj, monolayer BHK-21 An30 hücre kültüründe beşinci pasaj ve süspanse BHK-21 An30 hücre kültüründeki son pasajlarından elde edilen VP1, 3A ve cre genlerine ait nükleotid diziler ve orijinal virus süspansiyonları ile süspanse BHK-21 An30 hücre kültüründeki son pasajlarından elde edilen VP4, VP2 ve VP3 genlerine ait nükleotid diziler her virus için kendi içinde karşılaştırılmıştır.

Çalışılan virusların hücre kültürlerine adaptasyonları için yapılan pasajlar sırasında plak ölçülerinde genel olarak küçülme ve heterojen plak morfolojisi oluştuğu tespit edilmiştir. Nükleotid diziler incelendiğinde; VP1 genindeki T48K, H57R, Q110K, Q110R, E138K, E198K ve D199G, VP2 genindeki W129C, E131K, L134R ve L137R ve VP3 genindeki H56R, D60G, D174G ve T178G mutasyonlarının daha önceki çalışmacıların bildirdikleri doğrultusunda plak morfolojisi ile ilişkili olabilecekleri düşünülmüştür. VP1 genindeki T13A, S30T, E83K, T96K, H108R, R172W ve E174A, VP2 genindeki T201A, VP3 genindeki C34R ve 3A genindeki T119A, L129P, N139D ve V143A mutasyonlarının plak morfolojisi ile ilişkisi ise mevcut bilgilerle ortaya konulamamıştır. Pasajlar arasında hiçbir mutasyonun görülmediği cre ve VP4 genlerinin bu çalışma için plak morfolojisi yönünden potansiyel gen bölgeleri olmadıkları düşünülmüştür. İlerleyen hücre pasajlarında plak fenotiplerinde görülen değişimlerin ve diziler arasındaki aminoasit farklılıklarının, şap virusunun tür benzeri doğasının sonucu olarak populasyon içinde değişken ortam şartlarına uyum sağlayan baskın varyantların özelliklerini göstermeleri sonucu şekillendiği düşünülmüştür. Elde edilen bulgular şap aşısı üretimi ve şap virusu ile ilgili yapılabilecek başka çalışmalara bilgi sağlayabilir.

Anahtar Sözcükler: Hücre kültürü, genetik analiz, plak fenotipi, şap virusu

80

SUMMARY Genetical Investigation On The Differences of Plaque Morphology of FMDV Which Will Be Used As Vaccine Strain

In this study, it was aimed to genetically investigate the different plaque phenotypes that occured during the adaptation of field strains which were selected as candidate vaccine strains to prepare vaccine for foot-and-mouth disease and some current vaccine strains to BHK-21 cell cultures and to examine the mutations that may be responsible for such phenotypical alterations. For this purpose; the studies for adaptation to BHK-21 cell lines, ELISA and plaque assays of ten candidate vaccine strain viruses of five A/IRN/2005 strain and five O PanAsia-2 strain which have caused the disease in several provinces of Turkey in 2007 and three vaccine strains A22 Iraq, A Tur 04-06 and O1 Manisa which were used as control viruses were done and the plaque morphology alterations occured between the passages were genetically investigated and the mutations that may be responsible for these alterations were examined. The nucleotide sequences of VP1, 3A and cre genes obtained from the original virus suspensions, the sixth passage in monolayer BHK-21 An31 cell line, the fifth passage in monolayer BHK-21 An30 cell line and the last passage of the viruses in suspension BHK-21 An30 cell line and the nucleotide sequences of VP4, VP2 and VP3 obtained from the original virus suspensions and the last passage of the viruses in suspension BHK-21 An30 cell line were compared in itself for each virus.

During the passages of the studied viruses for their adaptation to cell lines, a general decrease in the plaque sizes and heterogeneous plaque morphology formation was determined. When the nucleotide sequences were investigated; T48K, H57R, Q110K, Q110R, E138K, E198K and D199G mutations in VP1, W129C, E131K, L134R and L137R mutations in VP2 and H56R, D60G, D174G and T178G mutations in VP3 were thought to may be related with plaque phenotype according to the declarations of previous researchers. The relationship between mutations T13A, S30T, E83K, T96K, H108R, R172W and E174A in VP1, T201A in VP2, C34R in VP3 and T119A, L129P, N139D and V143A in 3A and plaque morphology were not able to revealed with existent information. It was thought that cre and VP4 genes in which no mutation was observed between the passages were not the potential genes for plaque morphology for this study. The alterations in plaque phenotypes which were observed in progressive cell culture passages and the aminoacid differences between the sequences were thought to show the properties of dominant variants in the population which were accommodated to changeable media conditions occured as a result of quasispecies nature of foot-and-mouth disease virus. The findings obtained may supply information for other studies that will be done about foot-and-mouth disease vaccine production and foot-and-mouth disease virus.

Key Words: Cell culture, genetic analysis, plaque phenotype, FMDV

81

KAYNAKLAR

ACHARYA, R., FRY, E., STUART, D., FOX, G., ROWLANDS, D., BROWN, F. (1989). The three-dimensional structure of foot-and-mouth disease virus at 2.9 A resolution. Nature, 337: 709-716.

AKTAŞ, S. (1998). Molecular epidemiology of foot-and-mouth disease virus types O and A in Turkey. PHD Thesis. Reading University, UK.

AKTAŞ, S., SAMUEL, A. R. (2000). Identification of antigenic epitopes on the foot and mouth disease virus isolate O1/Manisa/Turkey/1969 using monoclonal antibodies. Rev. Sci.Tech., 19: 744-753.

ALEXANDERSEN, S., BROTHERHOOD, I., DONALDSON, A. I. (2002). Natural aerosol transmission of foot-andmouth disease virus to pigs: minimal infectious dose for strain O1 Lausanne. Epidemiology and Infection, 128: 301–312.

ALEXANDERSEN, S., ZHANG, Z., DONALDSON, A. I., GARLAND, A. J. (2003). The pathogenesis and diagnosis of foot-and-mouth disease. Journal of Comparative Pathology, 129: 1-36.

ALEXANDERSEN, S., MOWAT, N. (2005). Foot-and-mouth disease: host range and pathogenesis. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 288: 9-42.

ARCHETTI, I. L., AMADORI, M., DONN, A., SALT, J., LODETTI, E. (1994). Detection of foot-and-mouth disease virus-infected cattle by assessment of antibody response in oropharyngeal fluids. Journal of Clinical Microbiology, 33(1): 79-84.

BACHRACH, H. L. (1968): Foot-and-mouth disease virus. Annual Review of Microbiology, 22: 201-244.

BAXT, B., MASON, P. W. (1995). Foot-and-mouth disease virus undergoes restricted replication in macrophage cell cultures following Fc receptormediated adsorption. Virology, 207:503–509.

BEARD, C., MASON, P. W. (2000). Genetic determinants of altered virulence of Taiwanese foot-and-mouth disease virus. Journal of Virology, 74(2): 987-991.

BEDARD, K., SEMLER, B. L. (2004). Regulation of picornavirus gene expression. Microbes and Infection, 6: 702-713.

BELSHAM, G. J. (2005). Translation and replication of FMDV RNA. CTMI, 288: 43-70.

BERGELSON, J. M., SHEPLEY, M. P., CHAN, B. M. C., HEMLER, M. E., W.FINBERG, R. (1992). Identification of the integrin VLA-2 as a receptor for echovirus 1. Science, 255:1718–1720.

82

BOLWELL, C., BROWN, A. L., BARNETT, P. V., CAMPBELL, R. O., CLARKE, B. E., PARRY, N. R., OULDRIDGE, E. J., BROWN, F., ROWLANDS, D. J. (1989a). Host cell selection of antigenic variants of foot-and-mouth disease virus. J. Gen. Virol., 70: 45-57.

BOLWELL, C., CLARKE, B., PARRY, N., OULRIDGE, E., BROWN, F., ROWLANDS, D. (1989b). Epitope mapping of foot and mouth disease virus with neutralizing monoclonal antibodies. J. Gen. Virol., 70: 59–68.

BRIDGEN, A., ELLIOTT, R. M. (2000). Chapter 9: Reverse genetics of RNA viruses. In: RNA Viruses A Practical Approach, Ed: A. J. Cann, Oxford University Press, p. : 223.

BROOKSBY, J.B. (1982). Portraits of viruses: foot-and-mouth disease virus. Intervirology, 18(1-2):

1-23.

BROWN, F. (1988). Use of peptides for immunization against foot-and-mouth disease virus. Vaccine, 6: 180-182.

BROWN, F. (2003). The history of research in foot-and-mouth disease. Virus Research, 91: 3-7.

CARRILLO, C., TULMAN, E. R., DELHON, G., LU, Z., CARRENO, A., VAGNOZZI, A., KUTISH, G. F., ROCK, D. L. (2005). Comparative genomics of foot-and-mouth disease virus. Journal of Virology, 79: 6487-6504.

CHRISTENSEN, L. S., PARLAK, Ü., ÖZCAN, C., ÇOKÇALIŞKAN, C., SAREYYÜPOĞLU, B., GRAM-HANSENL, L., TEZEL, A., ÖZYÖRÜK, F. (2006). Characterization, including VP1 and full-length sequencing of type A and O strains collected from foot-and-mouth disease outbreaks since 1996 in Turkey. 2006 Report of Session of the Research Group of the Standing Technical Committee European Commission for the Control of Foot and Mouth Disease, Paphos/Cyprus.

CLARKE, B. E., BROWN, A. L., CURREYL, K. M, NEWTON, S. E., ROWLANDS, D. J., CARROLL, A. R. (1987). Potential secondary and tertiary structure in the genomic RNA of foot and mouth disease virus. Nucleic Acid Research. 15(17): 7067-7079.

COLLINS, R. A., KO, L. S., FUNG, K. Y., LAU, L. T., XING, J., YU, A. C. H. (2002). A method to detect major serotypes of foot-and-mouth disease virus. Biochem. Biophys. Res. Commun., 297(2): 267-274.

CONDIT, R. C. (2007). Principles of virology. In: Fields Virology, 5th Edition, Vol. I, Ed: D. M., Knipe, P. M. Howley, p. : 27-57.

COWAN, K. M. (1966). Heterogenecity of antibodies by cattle infected with foot-and-mouth disease virus. A. J. Vet. Res., 27(120): 1217-1228.

COWAN, K. M. (1968). Antigenic heterogenecity of FMDV as demonstrated with 7 days postinfection guinea pig serum by Ouchterlonyanalysis. Fen. Proc., 27: 733-745.

COWAN, K. M. (1970). Immunochemical studies of foot-and-mouth disease. Differences in antigenic determinant site recognation by guinea pig 19S and 7S antibodies. The Journal of Immunology, 104(2).

83

ÇELİK, N. (1998). Şap O1 Manisa 1969 tohum ve klon viruslarının antijenik karakterlerinin karşılaştırılması ve bunlardan hazırlanan aşıların bağışıklık özelliklerinin araştırılması. Doktora Tezi. Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü.

DOEL, T. R. (2003). FMD vaccines. Virus. Res., 91: 81-99.

DOMINGO, E. (2002). Quasispecies theory in virology. Journal of Virology, 76: 463-465.

DOMINGO, E. (Ed.), (2006). Quasispecies: concepts and implications for virology. In: Current topics in microbiology and immunology series. Springer Verlag, Berlin, Germany, Vol: 289.

DOMINGO, E., MARTINEZ-SALAS, E., SOBRINO, F., DE LA TORRE, J., PORTELA, A., ORTIN, J., LOPEZ-GALINDEZ, C., PEREZ-BRENA, P., VILLANUEVA, N., NAJERA, R., VANDEPOL, S., STEIHAUER, D., DEPOLO, N., HOLLAND, J. (1985). The quasispecies (extremly heterogeneous) nature of viral RNA genome populations: biological relevance [a review]. Gene, 40: 1–8.

DOMINGO, E., BIEBRICHER, C. K., EIGEN, M., HOLLAND, J. J. (Ed.), (2001). Multiplication strategies of RNA genetic elements. In: Quasispecies and RNA Virus Evolution: Principles and Consequences, Landes Bioscience, Georgetown, Texas, U. S. A. , Eurekah.com, Austin, Texas, U. S. A., p. : 7-24.

DOMINGO, E., PARIENTE, N., AIRAKSINEN, A., GONZALEZ-LOPEZ, C., SIERRA, S., HERRERA, M., GRANDE-PEREZ, A., LOWENSTEIN, P. R., MANRUBIA, S. C., LAZARO, E., ESCARMIS, C. (2005). Foot-and-mouth disease virus evolution: Exploring pathways towards virus extinction. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 288: 149-173.

DONALDSON, A. I., GLOSTER, J., HARVEY, L. D., DEANS, D. H. (1982). Use of prediction models to forecast and analyse airborne spread during the foot-and-mouth disease outbreaks in Brittany, Jersey and the Isle of Wight in 1981. Vet. Rec., 110: 53±7.

EROL, N., WHITELAND, A. P., GÜRSOY, C., ŞENEL, E., GIRARD, H. C. (1975). Plaque and antigenic characteristics concerning O1 FMD virus. Report of the meeting of the Research Group of the Standing Technical Committee of the European Commission for the control of foot-and-mouth disease. Appendix XLX, 104-109.

EROL, N., ŞENEL, E., GÜRSOY, Ç. (1979). Sahadan temin edilerek çeşitli kültür metodları ile üretilen O tipi şap virus suşlarının kalitatif ve kantitatif immünojenik değerlendirilmeleri üzerinde çalışmalar. Şap Enstitüsü Mecmuası, 1: 275-305.

ESCARMIS, C., TOJA, M., MEDINA, M., DOMINGO, E. (1992). Modifications of the 5’ untranslated region of foot-and-mouth disease virus after prolonged persistence in cell culture. Virus Res., 26: 113-125.

FERRIS, N. P, DAWSON, M. (1988). Routine application of enzyme-linked immunosorbent assay in comparison with complement fixation for the diagnosis of foot-and-mouth and swine vesicular diseases. Veterinary Microbiology, 16: 201-209.

FOX, G., STUART, D., ACHARYA, K. R., FRY, E., ROWLANDS, D., BROWN, F. (1987). Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of foot-and-mouth disease virus. J. Mol. Biol., 196: 591-597.

84

FRY, E. E., LEA, S. M., JACKSON, T., NEWMAN, J. W., ELLARD, F. M., BLAKEMORE, W. E., ABU-GHAZALEH, R., SAMUEL, A., KING, A. M., STUART, D. I. (1999). The structure and function of a foot-and-mouth disease virus-oligosaccharide receptor complex. EMBO J., 18: 543-554.

FRY, E. E., STUART, D. I., ROWLANDS, D. J. (2005). The structure of foot-and-mouth disease virus. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 288: 71-101.

GEBAUER, F., TORRE, DE LA J. C., GOMES, I., MATEU, M. G., BARAHONA, H., TIRABOSCHI, B., BREGMAN, I., AUGÉ DE MELLO, P., DOMINGO, E. (1988). Rapid selection of genetic and antigenic variants of foot-and-mouth disease virus during persistence in cattle. Journal of Virology, 62(6): 2041-2049.

GILBERT, M., AKTAŞ, S., MOHAMMED, H., ROEDER, P., SUMPTION, K., TUFAN, M., SLINGENBERG, J. (2005). Patterns of spread and persistence of foot-and-mouth disease types A, O and Asia-1 in Turkey: a meta-population approach. Epidemiol. Infect., 133: 537–545.

GOODFELLOW, I. G., KERRIGAN, D., EVANS, D. J. (2003). Structure and function analysis of the poliovirus cis-acting replication element (CRE). Rna-a Publication of the Rna Society, 9: 124-137.

GRUBMAN, M. J., BAXT, B. (2004). Foot-and-mouth disease. Clin. Microbiol. Rev., 17(2): 465-493.

GRUMURTHY, C. B., SANYAL, A., VENKATAMARAN, R., TOSH, C., GEORGE, M., HEMADRI, D. (2002). Genetic diversity in the VP1 gene of foot-and-mouth disease virus serotype Asia1. Arch. Virol., 147: 85-102.

GÜRHAN, B., DAKILIR, G. (1994). Çeşitli illerden temin edilen O1 tipi şap virusu suşlarının BHK-21 monolayer ve süspanse hücre kültürlerine adaptasyonu ve halen aşı suşu olarak kullanılan O1 Manisa ile immunolojik yönden karşılaştırılması. Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi, 7(5): 143-152.

HALL, T. A. (1999): BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series, 41: 95-98.

HAMBLIN, C., ARMSTRONG, R. M., HEDGER, R. S. (1984). A rapid enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of foot-and-mouth disease virus in epithelial tissues. Veterinary Microbiology, 9: 435–443.

HARE, J. D., MORGAN, H. R. (1962). A polyoma variant with new antigenic determinants. Virology, 19: 105-107.

HARRIS, T. J., BROWN, F. (1977). Biochemical analysis of a virulent and an avirulent strain of foot-and-mouth disease virus. J. Gen. Virol., 34: 87-105.

HEATH, L. E., VOSLOO, W., NEL, L. H. (2001). Analyses of the 3A non-structural protein-coding region of foot-and-mouth disease virus isolates from Africa (Yayınlanmamış veri).

85

HERNANDEZ, J., VALERO, M. L., ANDREU, D., DOMINGO, E., MATEU, M. G. (1996). Antibody and host cell recognation of foot-and-mouth disease virus (serotype C) cleaved at the Arg-Gly-Asp (RGD) motif: a structural interpretation. J. Gen. Virol., 77: 257-264.

HOHDATSU, T., TAKAHASI, N., IDE, S., YAMAGISHI, H., SAITO,H., FUJISAKI, Y., KOYAMA, H. (1990). The relation between pathogenicity and plaque size of Getah virus Kanagawa strain in suckling mice. Jpn. J. Vet. Sci., 52(3): 519-526.

HOGLE, J. M., CHOW, M., FILMAN, D. J. (1985). Three-dimensional structure of poliovirus at 2.9 A resolution. Science, 229: 1358-1365.

HOLLAND, J., SPINDLER, K., HORODYSKI, F., GRABAU, E., NICHOL, S., VANDEPOL, S. (1982). Rapid evolution of RNA genomes. Science, 215: 1577-85.

HOUSE, J. A., YEDLOUTSCHNIG, R. J. (1982). Sensitivity of seven different types of cell cultures to three serotypes of foot-and-mouth disease virus. Canadian Journal of Comparative Medicine, 46: 186-189.

HOUSE, C., MEYER, R. F. (1993). The detection of foot-and-mouth disease virus in oesophageal–pharyngeal samples by a polymerase chain reaction technique. Journal of Virological Methods, 43: 1–6.

HUGHES, G. J., MIOULET, V., KITCHING, R. P., WOOLHOUSE, M. E., ALEXANDERSEN, S., DONALDSON, A. I. (2002). Foot and mouth disease virus infection of sheep: implications for diagnosis and control. Vet. Rec., 150: 724-727.

ICTV PICORNAVIRIDAE STUDY GROUP (2009). Picornavirus Type Classification: New and Re-Classified Types. Erişim:

[http://www.picornastudygroup.com/types/index.html]. Erişim Tarihi: 10.10.2009.

İLERLE, M. A., TAN, B. (1987). Sahada hasta sığırlardan elde edilecek O tipi çeşitli saha suşlarının sığır dili epiteline adaptasyonu (Frenkel metodu ile) ve adapte olmuş bu suşların karakteri üzerine çalışmalar. Şap Enstitüsü Mecmuası, I: 253-274.

JACKSON, T., ELLARD, F. M., GHAZALEH, R. A., BROOKES, S. M., BLAKEMORE, W. E., CORTEYN, A. H., STUART, D. I., NEWMAN, J. W., KING, A. M. (1996). Efficient infection of cells in culture by type O foot-and-mouth disease virus requires binding to cell surface heparan sulfate. J. Virol., 70: 5282-5287.

JACKSON, T., SHEPPARD, D., DENYER, M., BLAKEMORE, W., KING., A. M. (2000). The epithelial integrin alphavbeta6 is a receptor for foot-and-mouth disease virus. J. Virol., 74: 4949-56.

JACKSON, T., KING, A. M. Q., STUART, D. I., FRY, E. (2003). Structure and receptor binding. Virus Res., 91: 33-46.

JACKSON, A. L, O’NEILL, H., MAREE, F., BLIGNAUT, B., CARRILLO, C., RODRIGUEZ, L., HAYDON, D. T. (2007). Mosaic structure of foot-and-mouth disease virus genomes. J. Gen. Virol., 88: 487-492.

86

KANDA, Y., MELNICK, J. L. (1959). In vitro differentiation of virulent and attenuated polioviruses by their growth characteristics on MS cells. J. exp. Med., 109: 9-24.

KITCHING, R. P. (2002a). Clinical variation in foot-and-mouth disease: cattle. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz., 21(3): 499-504.

KITCHING, R. P. (2002b). Identification of foot-and-mouth disease virus carrier and subclinically infected animals and differentiation from vaccinated animals. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz., 21(3): 531-538.

KITCHING, R. P., (2005). Global epidemiology and prospects for control of foot-and-mouth disease. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 288:133-148.

KITCHING, R. P., MACKAY, D. K. (1994). Foot and mouth disease virus. State Vet. J., 4: 7-10.

KITCHING, R. P., HUGHES, G. J. (2002). Clinical variation in foot-and-mouth disease: sheep and goats. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz., 21(3): 505-512.

KLEIN, J., NORMANN, P., ALEXANDERSEN, S. (2006). Genetic analysis of the highly invasive FMDV subtype A/Iran/2005 (Yayınlanmamış veri).

KLEIN, J., HUSSAIN, M., AHMAD, M., NORMANN, P., AFZAL, M., ALEXANDERSEN, S. (2007). Genetic characterisation of the recent foot-and-mouth disease virus subtype A/IRN/2005. Virology Journal, 4:122.

KNOWLES, N. J. (2009). ([email protected]). Welcome to the home of Picornaviruses. Erişim: [http://www.picornaviridae.com/]. Erişim Tarihi: 10.10.2009.

KNOWLES, N. J., SAMUEL, A. R. (1998). RT-PCR and sequencing protocols for the molecular epidemiology of exotic virus diseases of animals. OIE/FAO World Reference Laboratory for Foot-and-Mouth Disease, Molecular Epidemiology Group.

KNOWLES, N. J., SAMUEL, A. R., AKTAŞ, S., ROWE, C. A., ABRAMS, C. C., NEWMAN, J. W. I., KING, A. M. Q. (1999). Phylogenetic comparison of the capsid-coding region of all seven foot-and-mouth disease virus serotypes (Yayınlanmamış veri).

KNOWLES, N. J., SAMUEL, A. R., DAVIES, P. R., KITCHING, R. P., DONALDSON, A. I. (2001). Outbreak of foot-and-mouth disease virus serotype O in the UK caused by a pandemic strain. Veterinary Record, 148: 258–259.

KNOWLES, N. J., SAMUEL, A. R. (2003): Molecular epidemiology of foot-and- mouth disease virus. Virus Research, 91: 65-80.

KNOWLES, N. J., SAMUEL, A. R., DAVIES, P. R., MIDGLEY, R. J., VALARCHER, J. F. (2005). Pandemic strain of foot-and-mouth disease virus serotype O. Emerging Infectious Diseases, 11(12): 1887-1893.

87

KNOWLES, N. J., WADSWORTH, J., SHIRAZI, M. H. N., PARLAK, Ü., ÖZYÖRÜK, F., FERRIS, N., HUTCHINGS, G. H., STIRLING, J. M., KING, D. P., PATON, D. J. Recent Spread of Foot-and-Mouth Disease Virus Serotype O PanAsia-2, a New Epizootic Lineage Derived from the PanAsia Strain (Yayınlanmamış veri).

LEFORBAN, Y. (1999). Prevention measures against foot-and-mouth disease in Europe in recent years. Vaccine, 17:1755–1759.

LI, D., SHANG, Y. J., LIU, X. T., CAI, X. P. (2007). Molecular relationships between type Asia 1 new strain from china and type O Panasia strains of foot-and-mouth-disease virus. Virus Genes, 35: 273-279.

LOMBARD, M. F., DUBOURGET, P. G., SCHUMACHER, C. L. (2003). Strategic reserves, advantages and disadvantages: the manufacturer’ s experience. In: Foot-and-Mouth Disease: Control Strategies. Ed: B.Dodet, M.Vicari. Paris: Elseiver, p. : 221-231.

LOMBARD, M. F., FUSSEL, A. E. (2007). Antigen and vaccine banks: technical requirements and the role of the European antigen bank in emergency foot and mouth disease vaccination. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz., 26(1): 117-134.

MAHY, B. W. J. (2005). Introduction and history of foot-and-mouth disease virus. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 288: 1-8.

MARTINEZ, M. A., DOPAZO, J., HERNANDEZ, J., MATEU, M. G., SOBRINO, F., DOMINGO, E., KNOWLES, N. J. (1992). Evolution of the capsid protein genes of foot-and-mouth disease virus: Antigenic variation without accumulation of amino acid substitutions over six decades. Journal of Virology, 66(6): 3557-3565.

MARTINSEN, J. S. (1971). Two plaque size variants of foot-and-mouth disease virus differing in neutralization by guinea pig antisera. Res. Vet. Sci., 12: 399-400.

MASON, P. W., BAXT, B., BROWN, F., HARBER, J., MURDIN, A., WIMMER, E. (1993). Antibody-complexed foot-and-mouth disease virus, but not poliovirus, can infect cells via the Fc receptor. Virology, 192:568–577.

MASON, P. W., RIEDER, E., BAXT, B. (1994). 1994 RGD sequence of foot-and-mouth disease virus is essential for infecting cells via the natural receptor but can be bypassed by an antibody-dependent enhancement pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 91: 1932-6.

MASON, P. W., BEZBORODOVA, S. V., HENRY, T. M. (2002). Identification and characterization of a cis-acting replication element (cre) adjacent to the internal ribosome entry site of foot-and-mouth disease virus. Journal of Virology, 76(19). 9686-9694.

MASON, P. W., GRUBMAN, M. J., BAXT, B. (2003). Molecular basis of pathogenesis of FMDV. Virus Research, 91: 9-32.

MATEU, M. G., MARTINEZ, M. A., ROCHA, E., ANDREU, D., PAREJO, J., GIRALT, F., SOBRINO, F., DOMINGO, E. (1989). Implications of a quasispecies genome structure: effect of frequent, naturally occurring amino acid substitutions on the antigenicity of foot-and-mouth disease virus. Proc. Natl. Acad. Sci., 86:5883–5887.

88

MATTION, N., KONIG, G., SEKI, C., SMITSAART, E., MARADEI, E., ROBIOLO, B., DUFFY, S., LEON, E., PICCONE, M., SADIR, A., BOTTINI, R., COSENTINO, B., FALCZUK, A., MARESCA, R., PERIOLO, O., BELLINZONI, R., ESPINOZA, A., TORRE, J. L., PALMA, E. L. (2004). Reintroduction of foot-and-mouth disease in Argentina: characterisation of the isolates and development of tools for the control and eradication of the disease. Vaccine, 22(31-32): 4149-4162.

MBAYED, V., SCHIAPPASCASSI, M., COROMINAS, A., CAMPOAS, R. (1997). Characteristic

in vitro evolution pattern of foot and mouth disease virus A81:Castellanos:Arg:87. Virus Research, 48: 157–163.

MCGALL, G. H., CHRISTIANS, F. C. (2002). High density genechip oligonucleotid probe arrays. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 77: 22-41.

MCKENNA, T. S. C., LUBROTH, J. RIEDER, E., BAXT, B., MASON, P. W. (1995). Receptor binding-site-deleted foot-and-mouth disease (FMD) virus protects cattle from FMD. J. Virol., 69: 5787–5790.

MCVICAR, J. W., SUTMOLLER, P. (1976). Growth of foot-and-mouth disease virus in the upper respiratory tract of non-immunized, vaccinated and recovered cattle after intranasal inoculation. J. Hyg. (Lond..), 76: 467-481.

MOFFAT, K., KNOX, C., HOWELL, G., CLARK, S. J., YANG, H., BELSHAM, G. J., RYAN, M., WILEMAN, T. (2007). Inhibition of the secretory pathway by foot-and-mouth disease virus 2BC protein is reproduced by coexpression of 2B with 2C, and the site of inhibition is determined by the subcellular location of 2C. J. Virol., 81: 1129-39.

MORIOKA, K., FUKAI, K., OHASHI, S., SAKAMOTO, K., TSUDA, T., YOSHIDA, K. (2008). Comparison of the characters of the plaque-purified viruses from foot-and-mouth disease virus. J. Vet. Med. Sci., 70(7): 653-8.

MOSS, A., HAAS, B. (1999). Comparison of the plaque test and reverse transcription nested PCR

for the detection of FMDV in nasal swabs and probang samples. Journal of Virological Methods, 80: 59–67.

MUTHUCHELVAN, D., VENKATARAMANAN, R., HEMADRI, D., SANYAL, A., TOSH, C. (2001). Sequence analysis of recent Indian isolates of foot-and-mouth disease virus serotypes O, A and Asia1 from clinical materials. Acta Virol., 45: 159-167.

NICHOLAS, K.B., NICHOLAS, H.B. JR.DEERFIELD, D.W. (1997). GeneDoc: Analysis and Visualization of Genetic Variation, EMBNEWS, 4: 14.

OIE (2010-2011). Hayvan sağlığı Bilgileri, Haftalık Hastalık Bilgisi - WAHID Interface. Erişim: [http://www.oie.int/wahis/public.php?page=weekly_report_index]. Erişim Tarihi: 06.11.2010-16.01.2011.

OKAY, G., KIVILCIM, Y., CERİTOĞLU, T. (1979). O1 tipi şap virusunun sahadaki hasta hayvanlardan elde edilecek suşunun BHK süspanse hücre kültürlerinde üretilmesi ve kültür karakterleri üzerinde çalışmalar. Şap Enstitüsü Mecmuası, I: 229-252.

OLECHNOWITZ, A. F., ENGLER, E. (1970). [pH inactivation of the foot-and-mouth disease virus]. Arch. Exp. Veterinarmed., 24; 461-471.

89

OLIVER, R. E., DONALDSON, A. I., GIBSON, C. F., ROEDER, P. L., LE BLANC SMITH, P. M., HAMBLIN, C. (1988). Detection of foot-and-mouth disease antigen in bovine epithelial samples: Comparison of sites of sample collection by an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and complement fixation test. Researc in Veterinary Science, 44: 315-319.

ÖZTÜRKMEN, H. (1982). İnvitro olarak üretilen O1 (Manisa) şap virusunun değişik plak karakterlerinin immuniteye etkileri üzerinde araştırmalar (Uzmanlık Tezi). Şap Enstitüsü Mecmuası, I: 123-140.

PACHECO, J. M., HENRY, T. M., O’DONNELL, V. K., GREGORY, J. B., MASON, P. W. (2003). Role of nonstructural proteins 3A and 3B in host range and pathogenicity of foot-and-mouth disease virus. Journal Of Virology, 77(24): 13017–13027.

PARLAK, Ü., ÖZYÖRÜK, F., KNOWLES, N. J., ARMSTRONG, R. M., AKTAŞ, S., ALKAN, F., ÇOKÇALIŞKAN, C., CHRISTENSEN, L. S. (2007). Characterisation of foot-and-mouth disease virus strains circulating in Turkey during 1996–2004. Arch. Virol., 152: 1175–1185.

PATON, D. J., VALARCHER, J. F., BERGMAN, I., MATLHO, O. G., ZAKHAROV, V. M., PALMA, E. L., THOMSON, G. R. (2005). Selection of foot and mouth disease vaccine strains-a review. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz., 2005, 24(3): 981-993.

PEREIRA, H. G. (1981): Foot-and-mouth disease virus. In: Virus Diseases of Food Animals, Vol. II, Ed.: P. G. Gibbs. New York: Academic Press, p. : 333-363.

PIATTI, P., HASSARD, S., NEWMAN, J. F. E., BROWN, F. (1995). Antigenic variants in a plaque-isolate of foot-and-mouth disease virus: Implications for vaccine production. Vaccine, 13(8): 781-784.

PRESTON, K. J., OWENS, H., MOWAT, G. N. (1981). Relationship between plaque size and the immunising ability of the foot-and-mouth disease virus SAT1Nig10/75. Archives of Virology, 70: 63-67.

RACANIELLO, V. R. (2007). Picornaviridae: The viruses and their replication. In: Fields Virology, 5th Edition, Vol. I, Ed: D. M., Knipe, P. M. Howley, p. : 796-838.

RANDRUP, A. (1954). On the stability of bovine foot-and-mouth disease virus dependent on pH; investigations on the complement fixing and the immunizing antigen as well as on the infective agent. Acta. Pathol. Microbiol. Scand., 35: 388-95.

RAPP, F. (1964). Plaque differentiation and replication of virulent and attenuated strains of measles virus. J. Baet., 88: 1448-1458.

REID, S. M., FORSYTH, M. A., HUTCHINGS, G. H., FERRIS, N. P. (1998). Comparison of reverse transcription polymerase chain reaction, enzyme linked immunosorbent assay and virus isolation for the routine diagnosis of foot-and-mouth disease. Journal of Virological Methods, 70: 213–217.

REID, S. M., FERRIS, N. P., HUTCHINGS, G. H., ZHANG, Z., BELSHAM, G. J., ALEXANDERSEN, S. (2001). Diagnosis of foot-and-mouth disease by real-time fluorogenic PCR assay. Veterinary Record, 149: 621–623.

90

ROEDER, P. L., LE BLANC SMITH, P. M. (1987). Detection and typing of foot-and- mouth disease virus by enzyme linked immunosorbent assay: a sensitive, rapid and reliable technique for primary diagnosis. Research in Vet. Sci., 43: 225-232.

ROIVAINEN, M., HYYPIA, T., PIIRAINEN, L., KALKKINEN, N., STANWAY, G., HOVI, T. (1991). RGD-dependent entry of coxsackievirus A9 into host cells and its bypass after cleavage of VP1 protein by intestinal proteases. J. Virol., 65: 4735–4740.

ROSAS, M. F., VIEIRA, Y.A., POSTIGO, R., MARTIN-ACEBES, M. A., ARMAS-PORTELA, R., MARTINEZ-SALAS, E., SOBRINO, F. (2008). Susceptibility to viral infection is enhanced by stable expression of 3A and 3AB proteins from foot-and-mouth disease virus. Virology, 380(1): 34-45.

ROWLANDS, D. J. (2008). Foot and mouth disease viruses. In: Encyclopedia of Virology, 3rd Edition, Vol. II, Ed.: B. W. J. Mahy, M. H. V. Van Regenmortel. Elsevier, Academic Press, p. : 265-274.

RWEYEMAMU, M. M. (1984). Antigenic variation in foot-and-mouth disease: studies based on the virus neutralisation reaction. J. Biol. Standard, 12(3): 323-337.

RWEYEMAMU, M. M, BOOTH, J. C., HEAD, M. M., PAY, T. W. F. (1978): Microneutralisation tests for serological typing and subtyping of foot and mouth disease virus strains. J. Hyg. (Lond.) 81: 107–123.

RWEYEMAMU, M. M., ROEDER, P., MACKAYS, D., SUMPTION, K., BROWNLIE, J., LEFORBAN, Y., VALARCHER, J. F., KNOWLES, N. J., SARAIVA, V. (2008). Epidemiological Patterns of Foot-and-Mouth Disease Worlwide. Transboundary and Emerging Diseases. 55: 57–72.

SA-CARVALHO, D., RIEDER, E., BAXT, B., RENATO RODARTE, R., TANURI, A., MASON, P.W. (1997). Tissue culture adaptation of foot-and-mouth disease virus selects viruses that bind to heparin and are attenuated in cattle. Journal of Virology, 71(7): 5115–5123.

SAMUEL, A. R., KNOWLES, N. J. (2001). Foot-and-mouth disease virus: cause of the recent crisis for the UK livestock industry. Trends in Genetics, 17(8): 421-424.

SCHLOER, G. M., HANSON, R. P. (1968). Relationship of plaque size and virulence for chickens of 14 representative Newcastle disease virus strains. Journal of Virology, 2(1): 40-47.

SHAFYI, A. (1968). pH resistance of foot-and-mouth disease virus and its complement-fixing antigen. Am. J. Vet. Res., 29: 1469-1478.

SOBRINO, F., DAVILA, M., ORTIN, J., DOMINGO, E. (1983). Multiple genetic variants arise in the course of replication of foot-and-mouth disease virus in cell culture. Virology, 128: 310-8.

SOBRINO, F., PALMA, E.L., BECK, E., DAVILA, M., DE LA TORRE, J.C., NEGRO, P., VILLANUEVA, N., ORTIN, J., DOMINGO, E. (1986). Fixation of mutations in the viral genome during an outbreak of foot-and-mouth disease: heterogeneity and rate variations. Gene, 50: 149-159.

91

SOBRINO, F., SAIZ, M., JIMENEZ-CLAVERO, M., NUNEZ, J.I., ROSAS, M. F., BARANOWSKI, E., LEY, V. (2001). Foot-and-mouth disease virus: a long known virus, but a current threat. Vet. Res., 32(1): 1-30.

STEINHAUER, D. A., HOLLAND, J. J. (1987). Rapid evolution of RNA viruses. Annu. Rev. Microbiol., 41: 409-433.

SUTMOLLER, P., BARTELING, S. S., OLASCOAGA, R. C., SUMPTION, K. J. (2003). Control and eradication of foot-and-mouth disease. Virus. Res., 91: 101-144.

SÜTÇÜ, M., ERDEM, H., GÜRHAN, S. İ. (1978). Sahada hasta hayvanlardan elde edilecek O tipi şap virusu suşlarının BHK monolayer doku kültürüne adaptasyonu, bu kültürlerde üretilmesi ve virusların karakterleri üzerinde çalışma. Şap Enstitüsü Mecmuası, I: 205-228.

ŞAP ENSTİTÜSÜ MÜDÜRLÜĞÜ (2010a). Duyurular. Erişim: [http://www.sap.gov.tr/page.php?ID=7]. Erişim Tarihi: 10.10.2010.

ŞAP ENSTİTÜSÜ MÜDÜRLÜĞÜ (2010b). Şap hastalığı. Erişim: [http://www.sap.gov.tr/sap_hastaligi.htm]. Erişim Tarihi: 24.03.2010.

TAKEMOTO, K. K., HABEL, K. (1959). Virus-cell relationship in a carrier culture of Hela cells and coxsackie A9 virus. Virology, 7: 28-44.

TAMURA, K., DUDLEY, J., NEI, M., KUMAR, S. (2007). MEGA4: Molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution, 24: 1596-1599.

TARIM VE KÖYİŞLERİ BAKANLIĞI KORUMA KONTROL GENEL MÜDÜRLÜĞÜ (2009). Şap Hastalığı, Hayvan Hastalık ve Zararlıları ile Mücadele Programı Kitapçığı, s. : 16-21.

THOMSON, G. R. (1994). Foot-and-mouth disease. In: Infectious Diseases of Livestock with Special Reference to Southern Africa, Vol. II, Ed: J. A. W. Coetzer, G. R. Thomson, R. C. Tustin. Cape Town, Oxford, New York: Oxford University Press, p. : 825-852.

THOMPSON, J. D., GIBSON, T. J., PLEWNIAK, F., JEANMOUGIN, F.HIGGINS, D. G. (1997). The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res, 25: 4876-4882.

TUFAN, M. (2006). Animal health authorities and transboundary animal diseases in Turkey. J. Vet. Med., 53: 35-37.

WEDDELL, G., YANSURA, D., DOWBENKO, D., HOATLIN, M.,GRUBMAN, M., MOORE, D., KLEID, D. (1985). Sequence variation in the gene for the immunogenic capsid protein VP1 of foot and mouth disease virus type A. Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 2618–2622.

WILD, T. F., BURROUGHS, J. N., BROWN, F. (1969). Surface structure of foot-and mouth disease virus. J. Gen. Virol., 4: 313-320.

92

XINGWEN, B., HUIFANG, B., PINGHUA, L., PU, S., WENDONG, K., YIMEI, C., ZENGJUN, L., ZAIXIN, L., XIANGTAO, L. (2010). Genetic characterization of the cell-adapted PanAsia strain of foot-and-mouth disease virus O/Fujian/CHA/5/99 isolated from swine. Virol. J., 7: 208.

VERDAGUER, N., MATEU, M. G., BRAVO, J., TORMO, J., GIRALT, E., ANDREU, D., DOMINGO, E., FITA, I. (1994). Crystallization and preliminary X-ray diffraction studies of a monoclonal antibody Fab fragment against foot-and-mouth disease virus and of its complex with the main antigenic site peptide. Proteins, 18: 201-203.

ZHENG, M., JIN, N. Y., ZHANG, H. Y., WEI, T., YIN, G. F., NU, H. J., QIN, X. B. (2004). Foot-and-mouth disease virus O/NY00 (Yayınlanmamış veri).

93

EKLER

Ek - 1 Standart genetik kodlar

T C A G

T

TTT Phe [F]

TTC Phe [F]

TTA Leu [L]

TTG Leu [L]

TCT Ser [S]

TCC Ser [S]

TCA Ser [S]

TCG Ser [S]

TAT Tyr [Y]

TAC Tyr [Y]

TAA [son]

TAG [son]

TGT Cys [C]

TGC Cys [C]

TGA [son]

TGG Trp [W]

T

C

A

G

C

CTT Leu [L]

CTC Leu [L]

CTA Leu [L]

CTG Leu [L]

CCT Pro [P]

CCC Pro [P]

CCA Pro [P]

CCG Pro [P]

CAT His [H]

CAC His [H]

CAA Gln [Q]

CAG Gln [Q]

CGT Arg [R]

CGC Arg [R]

CGA Arg [R]

CGG Arg [R]

T

C

A

G

A

ATT Ile [I]

ATC Ile [I]

ATA Ile [I]

ATG Met [M]

ACT Thr [T]

ACC Thr [T]

ACA Thr [T]

ACG Thr [T]

AAT Asn [N]

AAC Asn [N]

AAA Lys [K]

AAG Lys [K]

AGT Ser [S]

AGC Ser [S]

AGA Arg [R]

AGG Arg [R]

T

C

A

G

G

GTT Val [V]

GTC Val [V]

GTA Val [V]

GTG Val [V]

GCT Ala [A]

GCC Ala [A]

GCA Ala [A]

GCG Ala [A]

GAT Asp [D]

GAC Asp [D]

GAA Glu [E]

GAG Glu [E]

GGT Gly [G]

GGC Gly [G]

GGA Gly [G]

GGG Gly [G]

T

C

A

G

Ek - 2 Aminoasitler ve sembolleri

A Ala Alanin M Met Metionin C Cys Sistein N Asn Asparjin D Asp Aspartik asit P Pro Prolin E Glu Glutamik asit Q Gln Glutamin F Phe Fenilalanin R Arg Arjinin G Gly Glisin S Ser Serin H His Histidin T Thr Tironin I Ile İzolösin V Val Valin K Lys Lizin W Trp Triptofan L Leu Lösin Y Tyr Tirozin

94

Ek - 3 VP1 genine ait diziler

95

96

97

98

99

100

101

102

103

104

105

106

107

108

109

Ek - 4 3A genine ait diziler

110

111

112

113

114

Ek - 5 cre genine ait diziler

115


116

117

118


119

120

121

122

123

124

125

126

127


128

129

130

131

132

133

134

135

ÖZGEÇMİŞ

I. Bireysel Bilgiler

Adı : Müge Soyadı : FIRAT SARAÇ Doğum Yeri ve Tarihi : Ankara-1981 Uyruğu : T.C. Medeni Durumu : Evli İletişim Adresi ve Telefonu : Tarım ve Köyişleri Bakanlığı Şap

Enstitüsü Müdürlüğü, Eskişehir Yolu 7.km, ANKARA 0 312 287 36 00

II. Eğitimi

1999-2004 : Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi 1992-1999 : Ankara Atatürk Lisesi 1987-1992 : Ankara Kurtuluş İlkokulu Yabancı Dili : İngilizce

III. Ünvanları

2004 : Veteriner Hekim

IV. Mesleki Deneyimi

Haziran-Aralık/2009 :WRL-Pirbright/İNGİLTERE 2006- : Şap Enstitüsü 2004-2006 : Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Viroloji

Anabilim Dalı

V. Bilimsel İlgi Alanları

Moleküler Viroloji, Biyoinformatik, Aşılar, Üretim Öncesi ve Sonrası Aşı Kontrolü

Yayınları:

ÖZYÖRÜK, F., PARLAK, Ü., FIRAT-SARAÇ, M. (2010). FMDV- A/IRN/2005 endemics in WestEurasia: Estimation of coascelent events in the population history. Bildiri, EuFMD Açık Toplantısı, 27 Eylül-1 Ekim 2010, Viyana-AVUSTURYA.

136

FIRAT-SARAÇ, M., PARLAK, Ü., ÖZYÖRÜK, F., ABDUL-HAMID, F. N., VALDAZO-GONZÁLEZ, B., WADSWORTH, J., KNOWLES, N. J., KING, D. P. (2010). Full-genome sequence analysis of foot-and-mouth disease viruses in Western Eurasia. Bildiri, EuFMD Açık Toplantısı, 27 Eylül-1 Ekim 2010, Viyana-AVUSTURYA.

ALKAN, M., GÜRCAN, S., FIRAT SARAÇ, M., GÜLTEKİN, Y., ARSLAN, A., UZUNLU, E., AKYÜZ, Ş., AYNAGÖZ, G. (2008). Development of a foot-and-mouth disease vaccine potency test without conducting animal challenge experiment. Bildiri, EUFMD Açık Toplantısı, 14-17 Ekim 2008, Erice/Sicilya-İTALYA.

PINAR, D., OĞUZOĞLU, T. Ç., DEMİR, A. B., FIRAT, M., BAŞARAN, Z., AKÇA, Y. (2006). Bir damızlık sığır yetiştiriciliği işletmesinde BVDV ve BLV enfeksiyonları. Bildiri, VII. Ulusal Mikrobiyoloji Kongresi, 26-28 Eylül 2006, Antalya-TÜRKİYE.

FIRAT-SARAÇ, M., ABDUL-HAMID, F. N., VALDAZO-GONZÁLEZ, B., WADSWORTH, J., PARLAK, Ü., ÖZYÖRÜK, F., KNOWLES, N. J., KING, D. P. (2010). Application of tools for high-resolution molecular epidemiology of foot-and-mouth disease virus in Western Eurasia. Poster, EPIZONE 4. Toplantısı, 7-10 Haziran 2010, St Malo-FRANSA.

VI. Bilimsel Etkinlikleri

Yer Aldığı Projeler:

Application of tools for high-resolution molecular epidemiology of foot-and-mouth disease virus in Western Eurasia. FAO Destekli Proje.

Molecular epidemiology of foot-and-mouth disease virus in Asia. AB 6. ÇP EPIZONE Destekli Proje.

BOZOĞLU, H., ÇOKÇALIŞKAN, C., ARSLAN, A., FIRAT SARAÇ, M., SAREYYÜPOĞLU, B., UZUNLU, E. Enstitüde üretilen yağ adjuvantlı şap aşılarında bağışıklık süresinin belirlenmesi. Şap Enstitüsü Projesi.

BOZOĞLU, H., ÇOKÇALIŞKAN, C., ARSLAN, A., FIRAT SARAÇ, M., SAREYYÜPOĞLU, B., UZUNLU, E. Enstitüde üretilen yağ adjuvantlı şap aşılarının raf ömrünün belirlenmesi. Şap Enstitüsü Projesi.

BOZOĞLU, H., ÇOKÇALIŞKAN, C., ARSLAN, A., FIRAT SARAÇ, M., SAREYYÜPOĞLU, B., UZUNLU, E., ÖZTÜRK, N. TURVAC-OIL yağ adjuvantlı şap aşılarının doz aşımı ve tekrarlayan doz çalışması. Şap Enstitüsü Projesi.

137

Verdiği Seminerler:

Şap Hastalığının Karıştığı Hastalıklar Ve Ayırıcı Tanısı, Şap Enstitüsü, Şubat 2008, Ankara. Avrupa Domuz Vebası, Doktora 2. semineri, Mayıs 2006, Ankara.

Virusların Doğada Devamlılıkları, Doktora 1. semineri, Aralık 2005, Ankara.

Katıldığı Paneller:

EPIZONE 4. Toplantısı, 7-10 Haziran 2010, St Malo-FRANSA.

TAGEM 2010 Yılı Program Değerlendirme Toplantıları-Hayvan Sağlığı

Program Değerlendirme Toplantısı, 15-19 Mart 2010, Antalya-TÜRKİYE. EPIZONE 1. Toplantısı, 30 Mayıs-1 Haziran 2007, Lublin/Pulawy-POLONYA.

Ulusal Veteriner Hekimliği Öğrencileri Araştırma Kongresi, İstanbul Üniversitesi Veteriner Fakültesi, 2001, İstanbul-TÜRKİYE.

Documents

AŞI SUŞU OLARAK KULLANILACAK ŞAP VİRUSU PLAK ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/27341/TEZ.pdf · Uzm.Vet.Hek.Hidayet BOZOĞLU ve Kontrol Bölümü’nde görevli laborant arkadaşlarım