AGROBIOTECNOLOGÍA

CURSO 2016

TRABAJOS PRÁCTICOS

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA, BIOLOGÍA MOLECULAR y CELULAR

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

Docentes a cargo

Ruth Heinz Profesora Adjunta heinz.ruth@inta.gob.ar

Alejandro Mentaberry Profesor Consulto amentaberry@yahoo.com.ar

Docentes de Trabajos Prácticos

María Eugenia Segretin Jefa de Trabajos Prácticos mariasegretin@gmail.com

María Carolina Martínez Jefa de Trabajos Prácticos martinez.mc@inta.gob.ar

Martín Mecchia Jefe de Trabajos Prácticos mamecchia@hotmail.com

Nicolás Furman Ayudante 1° nicofurman@gmail.com

Martiniano Ricardi Ayudante 1° martiniano@fbmc.fcen.uba.ar

Información General

Departamento: Fisiología, Biología Molecular y Celular

Área Biotecnología

Carreras: Licenciatura en Ciencias Biológicas (optativa de grado) – Escuela de

Posgrado de la Facultad de Agronomía (UBA)

Cuatrimestre: Segundo

Inicio de clases: lunes 8 de agosto

Contacto: agbtexactas@gmail.com

Correlatividades:

Biología Molecular y Genética Molecular o Ingeniería Genética

Actividades

Clases teóricas

Se dictarán dos clases teóricas por semana de tres horas de duración, a cargo de

profesores del DFBMC o de profesores invitados externos. Las presentaciones

correspondientes a cada clase estarán disponibles en un sitio web especialmente

habilitado para ello. La administración del sitio estará a cargo del docente coordinador

de turno. En total se prevén 27 clases por un total de 80 h.

Seminarios

Se dictarán seminarios de 3 h de duración en los que los estudiantes expondrán, en

forma individual, un trabajo de investigación reciente sobre temas tratados en las clases

teóricas. Los trabajos de investigación serán seleccionados por los docentes y

asignados a los estudiantes con suficiente anterioridad. A comienzo del Seminario, el

docente a cargo seleccionará (en forma arbitraria) un grupo de cuatro estudiantes para

que oficien de "cuestionadores". Estos estudiantes deberán formular preguntas, críticas

y observaciones sobre el tema de Seminario y serán calificados por su participación.

Ello no obstará para que todos los demás participantes de la actividad puedan formular

las preguntas y observaciones que deseen. El docente a cargo actuará como motivador

de la discusión focalizando el debate alrededor de los puntos que considere relevantes.

En total se prevén diez Seminarios por un total de 30 h.

Trabajos prácticos

Los Trabajos Prácticos incluyen 5 Módulos organizados en 7 TP que se desarrollarán en

sesiones semanales de 3 h. Las sesiones incluirán cortas explicaciones sobre las técnicas a

implementar y una breve evaluación sobre el tema de la práctica (informe o examen de

práctica) a criterio de los docentes a cargo. En total se prevén prácticas y clases de

discusión y consultas de TPs por un total de 30 h.

Proyecto de Desarrollo Tecnológico (PDT)

Los alumnos encararán la elaboración de un PDT en agrobiotecnología, sobre un tema

de libre elección, de acuerdo con el formato comúnmente utilizado en este tipo de

presentaciones, el cual incluirá elementos de factibilidad técnica y económica. Se

desarrollará una clase de 2 h de duración sobre factibilidad económica de proyectos.

Durante el transcurso de la materia se facilitarán contactos con organizaciones de

productores, empresas y organismos estatales involucrados en campos específicos de

la actividad, así como reuniones de consulta. Cada PDT estará a cargo de un grupo de

cuatro estudiantes. Los PDT serán evaluados por un panel conformado por docentes y

expertos externos..

Visitas guiadas

Se organizarán visitas a los Institutos del INTA-Castelar en los que se realizan

investigaciones y desarrollos en agrobiotecnología. Se organizarán entrevistas

informales con investigadores de dicha institución para familiarizar a los estudiantes

con las distintas líneas de trabajo. Se considera que estas visitas pueden contribuir en

forma importante al desarrollo del PDT, por lo que se recomienda asistir a las mismas.

Está programada una vista de dos días a la EEA INTA Balcarce y a la empresa

Advanta Semillas, para familiarizar a los estudiantes con actividades de mejoramiento

vegetal del sector público y privado, visita a campo experimental y laboratorios de

ambas instituciones.

Carga horaria/horarios:

Clases teóricas 80 h/ lunes y miércoles de 18 a 21 h

Clases prácticas y Seminarios 60 h/ martes y viernes de 17 a 21 hs

Preparación de PDTs 20 h

Total 160 h

Desarrollo de actividades:

Clases Teóricas: aula a designar

Trabajos Prácticos: Laboratorios a designar y Laboratorio de Agrobiotecnología, Piso 2,

Pabellón II, Ciudad Universitaria.

Seminarios: aula a designar.

Presentación PDTs: aula a designar.

Evaluación y Régimen de Promoción

Para aprobar la materia se requerirá la aprobación de los exámenes parciales, de los

trabajos prácticos, y de un examen final con calificaciones mayores o iguales a 4

(cuatro). La materia podrá ser aprobada sin examen final cuando el promedio de los

parciales y del PDT sea mayor o igual que 7 (siete). A los efectos de la promoción, el

PDT tendrá el mismo peso que un examen parcial. Las notas se redondearán hacia el

dígito inmediato superior en el caso de fracciones mayores de 0,5 y hacia el dígito

inmediato inferior en el caso de 0,5 o fracciones menores de 0,5. Para el redondeo de la

nota de promoción, se considerará también el grado de participación y aprovechamiento

evidenciado en los Seminarios de Bibliografía y en los Trabajos Prácticos, según los

criterios de evaluación descriptos precedentemente.

Se realizarán 2 exámenes parciales sobre el Programa Teórico a lo largo del curso, y

existirá una fecha recuperatoria para ambos parciales. Se podrá recuperar un solo

parcial teórico. Para acceder a la promoción sin examen final se requerirá una

asistencia del 80% a las Trabajos Prácticos y Seminarios y del 70% a las Clases

Teóricas. Los exámenes parciales constarán de dos preguntas sobre temas

desarrollados en clases y de dos problemas en los que se deberá resolver una situación

imaginaria sobre la base de los elementos dados en el curso. Los dos problemas

podrán ser respondidos a libro abierto. Las preguntas y los problemas contribuirán con

un puntaje máximo de 2 (dos) puntos y de 3 (tres) puntos, respectivamente, sobre un

puntaje máximo total de 10 (diez) puntos.

La calificación del PDT tendrá en cuenta los aspectos económico-financieros y la

originalidad técnico-científica del proyecto. La nota se otorgará por consenso del jurado

que participe de la evaluación, el que se conformará con docentes de la materia y un

panel de expertos externos.

La nota final estará compuesta por:

Primer parcial: 30%

Segundo Parcial: 30%

PDT: 30%

Seminarios/TPs: 10%

Módulo I: Cultivo de tejidos

TP1: Organogénesis.

Módulo II: Transformación vegetal

TP 2: Transformación de Arabidopsis thaliana por infiltración con Agrobacterium tumafeciens.

TP 3: Transformación de Nicotiana tabacum mediante Agrobacterium tumafeciens

Módulo III: Expresión de proteínas en plantas

TP 4: Expresión transitoria de proteínas en Nicotiana benthamiana por agroinfiltración.

Módulo IV: Marcadores Moleculares

TP 5: Marcadores RAPD

TP 6: Marcadores microsatélites y AFLP

Módulo V: Bioinformática

TP 7: Exploración de bases de datos y herramientas de análisis genómicos

MÓDULO I

CULTIVO DE TEJIDOS

TP1. ORGANOGÉNESIS

INTRODUCCIÓN

A principios del siglo XX, el fisiólogo austríaco Haberlandt enunció la teoría de la totipotencialidad celular, proponiendo que todas las células vegetales tienen la capacidad para regenerar plantas completas.

La organogénesis constituye una de las posibles vías morfogenéticas para la diferenciación de plantas de novo. Consiste en la formación de yemas o de meristemas radiculares en forma directa, a partir de explantos (células, tejidos u órganos vegetales iniciadores del cultivo in vitro), o en forma indirecta, a partir de callos. Existe abundante bibliografía acerca de los variados factores que deben ser considerados para la manipulación exitosa de la organogénesis. Entre ellos, se mencionan variables tales como la edad fisiológica y el tamaño de los explantos, el estado de la planta madre y el período del año durante el cual se inicia el cultivo. También la luz, la temperatura, la consistencia del medio sintético y el pH son factores críticos para la iniciación de yemas in vitro.

Los reguladores del crecimiento desempeñan un papel fundamental en el desarrollo de la respuesta organogénica. La diferenciación de yemas se logra subcultivando los explantos o callos en un medio que contenga una baja relación auxina: citoquinina, en tanto que para la diferenciación de raíces se requieren medios con una relación auxina: citoquinina alta.

Relación intermedia Baja relación aux a cit Alta relación aux a cit (formación de callo) (formación de brotes) (formación de raíces)

BIBLIOGRAFÍA

Flick, C. E., Evans, D. A., and Sharp, W. R. (1983). Organogenesis. En Handbook of Plant Cell Culture, vol. 1, Techniques for Propagation and Breeding, D. A. Evans, W. R. Sharp, P. V. Ammirato and Y. Yamada (Ed.), pp. 13-81. New York, Macmillan.

Thorpe, T. A. (1980). Organogenesis in vitro: Structural, physiological, and biochemical aspects. En Perspectives in Plant cell and and Tissue Culture. International Reviews of Cytology, Supplement 11A, I. K. Vasil (Ed.), pp. 71-111.New York, Academic Press.

Protocolo de organogénesis in vitro para Saintpaulia spp.

a) Material vegetal

Como explantos, se utilizarán discos de 1 cm de diámetro y 3-4 mm de espesor de hojas de Saintpaulia spp. crecidas in vitro.

b) Protocolo experimental

b.1.) Preparación de los explantos Desinfectar superficialmente los explantos de hoja por inmersión en una solución de hipoclorito de sodio (lavandina) al 20 %, durante 20 minutos. Lavar con sucesivos enjuages de H2O estéril.

b.2.) Siembra

Cortar discos de hojas de 1 cm de diámetro sobre una superfície estéril (placa de Petri o vidrio autoclavados) dispuesta dentro del gabinete de flujo laminar. Disponerlos con la cara abaxial de la lámina en contacto con el medio sintético de cultivo. Repicar los explantos a medio fresco cada 15-20 días.

b.3.) Registro de resultados

Luego de aproximadamente 60 días de iniciado el cultivo in vitro, observar la aparición de neoformaciones. Las estructuras de novo aparecerán inicialmente en los márgenes o superficies de corte de los discos y/o pecíolos parcialmente desdiferenciados, bajo la forma de pequeños nódulos o grupos compactos de yemas.

b.4.) Rusticación

Las yemas obtenidas en el medio de iniciación se repicarán a MS2 (MS sin reguladores del crecimiento) para la diferenciación de raíces y la obtención de plantas completas. Una vez enraizados los brotes (1 mes de cultivo en MS2) se rusticarán a un sustrato mezcla (tierra:turba:vermiculita, 1:1:1) bajo condiciones de invernáculo, para la obtención de plantas completas.

c) Medios de cultivo Formulación medio básico, Medio Murashige/Skoog (MS): Macronutrientes mg/L NH4NO3 1650 KNO3 1900 CaCl2.2H2O 440 MgSO4.7H2O 370 Micronutrientes mg/L KI 0.83 H3BO3 6.2 MnSO4.H2O 22.3 ZnSO4.7H2O 8.6

Na2MoO4.2H2O 0.25 CuSO4.5H2O 0.025 CoCl2.6H2O 0.025 Na2EDTA 37.3 mg/L FeSo4.7H2O 27.8 Vitaminas mg/L Myo-inositol 100 Acido Nicotínico 0.5 Piridoxina-HCl 0.5 Tiamina-HCl 0.1 Glicina 2.0 pH 5.7 Medio de iniciación y multiplicación (MS1): Solución salina básica y orgánicos según Murashige/Skoog (MS), suplementada con sacarosa 3% y los reguladores del crecimiento ácido naftalenacético (ANA) y 6-bencilamino-purina (BA) en una relación 0,1:1 mg/L Medio de enraizamiento (MS2): Solución salina básica y orgánicos según Murashige/ Skoog (MS), sin la adición de reguladores del crecimiento

MÓDULO II

TRANSFORMACIÓN VEGETAL

TP2. TRANSFORMACIÓN DE ARABIDOPSIS THALIANA POR INFILTRACIÓN CON AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

INTRODUCCIÓN

Los métodos convencionales para la transformación genética de plantas vía Agrobacterium tumefaciens no han sido siempre exitosos, debido a una baja eficiencia de transformación y a la existencia de diferentes grados de variación somaclonal. Además, la regeneración de plantas a partir de callos suele ser dificultosa, al requerir trabajo intensivo y demandar un tiempo considerable.

En 1987, Feldmann y Marks describieron un nuevo procedimiento para la transformación de Arabidopsis thaliana denominado in planta. Este método, que consiste en la inmersión de semillas en una solución con Agrobacterium tumefaciens, tiene la ventaja de eliminar la etapa de cultivo de tejidos y regeneración de plantas, simplificando sustancialmente la mano de obra y acortando el tiempo requerido para obtener transformantes. En consecuencia, los eventos de variación somaclonal son minimizados y es posible obtener progenies genéticamente uniformes (no quiméricas). Sin embargo, la frecuencia de transformantes en la progenie de tales plantas es relativamente baja y muy variable.

En 1993, Bechtold y col. reportaron un nuevo método de infiltración por vacío. El mismo consiste en infiltrar en vacío primordios florales de Arabidopsis thaliana con suspensiones celulares de Agrobacterium tumefaciens. La infiltración permite que la bacteria se introduzca en los espacios intercelulares de los primordios florales elevando la frecuencia de transformación.

Una versión simplificada del método anterior (inmersión floral o floral dip) fue desarrollada por Clough y Bent en 1998. Ellos optimizaron el medio de infiltración y sustituyeron el vacío por el uso del surfactante Silwet L-77, que facilita la penetración de Agrobacterium en los tejidos vegetales. Estos autores determinaron mediante el uso de un gen indicador que los óvulos presentes dentro de las inflorescencias son los blancos de la transformación. La frecuencia de transformantes obtenida por este método es muy similar al método de infiltración por vacío: cercana al 0,5 - 1 % (un transformante por cada 100 semillas).

Durante el trabajo práctico, se infiltrarán inflorescencias de Arabidopsis thaliana con la cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens, que portan el plásmido pBI121 (ver figura 2). Este plásmido contiene un T-DNA con el gen npt II como marcador de selección (resistencia a kanamicina) y el gen uidA (ß-glucuronidasa) como gen reportero.

BIBLIOGRAFÍA

• Feldmann K A, Marks M D (1987) Agrobacterium-mediated transformation of germinating seeds of Arabidopsis thaliana: a non-tissue culture approach. Molecular and General Genetics, 208, 1-9.

• Bechtold, N., Ellis, J. and Pelletier, G. (1993). In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. Comptes Rendues Academie des Sciences de Paris, Sciences de la Vie, 316:1194–1199.

• Clough, S.J. and Bent, A.F. (1998). Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. The Plant Journal, 16:735-743.

• Ye, G.-N., Stone, D., Pang S.-Z., Creely, W., Gonzalez, K. and Hinchee M. (1999). Arabidopsis ovule is the target for Agrobacterium in planta vacuum infiltration transformation. The Plant Journal, 19:249-257.

• Desfeux, C., Clough, S.J. and Bent, A.F. (2000). Female Reproductive Tissues Are the Primary Target of Agrobacterium-Mediated Transformation by the Arabidopsis Floral-Dip Method. Plant Physiology, 123:895-904.

• Bent, A.F. (2000). Arabidopsis in planta transformation. Uses, mechanisms, and prospects for transformation of other species. Plant Physiology, 124:1540–1547.

Protocolo de transformación de Arabidopsis thaliana por infiltración con Agrobacterium

a)Material vegetal

Semillas de Arabidopsis thaliana cultivar Columbia

b) Protocolo experimental

Nota: Los pasos de los protocolos que se encuentran recuadrados indican que se trata de actividades que los docentes realizarán antes o después del turno de TP.

1) Sembrar las semillas de Arabidopsis en envases pequeños preparados con una mezcla de perlita, vermiculita y turba en partes iguales.

2) Dejar crecer las plantas en condiciones de invernadero (20-22°C, fotoperído 16 h luz / 8 h oscuridad), durante aproximadamente 6 semanas. Cortar las inflorescencias primarias a fin de permitir el desarrollo de las inflorescencias secundarias (optativo) para aumentar el blanco de la transformación. Realizar la infiltración 4-6 días luego de cortar las inflorescencias primarias. Si se desea lograr altas tasas de transformación, las plantas deben infiltrarse 2-3 veces en intervalos de 6-7 días.

3) Picar una colonia de Agrobacterium GV3101 e iniciar un cultivo en 500 ml de medio LB líquido con los antibióticos apropiados. Dejar crecer las bacterias durante una noche a 28°C en la oscuridad con agitación.

4) Centrifugar el cultivo y resuspender la bacteria en el Medio de Infiltración. Diluir hasta alcanzar una absorbancia a 600 nm (DO

600) = 0,80.

5) Colocar el cultivo resuspendido en la base de la cámara de infiltración (bandeja plástica). Invertir las macetas con las plantas de forma que los primordios florales (pero no la roseta) queden sumergidos en la solución.

6) Realizar una inmersión de 2 min, agitando suavemente. Escurrir y cubrir la superficie de las plantas con film plástico para mantener un alto porcentaje de humedad. Ubicar los potes de costado para escurrirlos, y mantenerlos en dicha posición, tapados con el film, en luz baja o en oscuridad durante las 12-14 h siguientes al tratamiento.

7) Al cabo de este período, descubrir las macetas y disponerlas verticalmente. Dejar crecer las plantas y cosechar las silicuas maduras formadas a partir de las flores presentes en el momento de la transformación

8) Recolectar las semillas y dejarlas secar al menos durante 15 días. Esterilizarlas superficialmente y sembrarlas en medio de cultivo conteniendo el agente selector (kanamicina). Los transformantes podrán diferenciarse aproximadamente en una semana.

9) Evaluar actividad histoquímica de β-glucuronidasa (ensayo de GUS). Ver el protocolo

en el TP

Para obtener mayor información acerca del protocolo de transformación de Arabidopsis, se puede consultar la siguiente página de internet: http://www.bch.msu.edu/pamgreen/protocol.htm

Medio de infiltración

Sacarosa 5 % Silwet L-77 0,005 % MgCl

2 10 mM

Pasos en la agroinfiltración de Arabidopsis

TP3. TRANSFORMACIÓN DE NICOTIANA TABACUM

MEDIANTE AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

INTRODUCCIÓN El uso de Agrobacterium tumefaciens como sistema de transformación para

producir plantas transgénicas está basado en el hecho de que durante la interacción de la bacteria con el tejido vegetal herido, un segmento de un plásmido Ti presente en la bacteria, llamado T-DNA, se copia y se transfiere a una célula vegetal, integrándose a su genoma. El ADN transferido contiene normalmente (en las bacterias silvestres) genes que codifican para enzimas involucradas en la síntesis de hormonas y metabolitos específicos denominados opinas. Como consecuencia de la expresión de estos genes, las células vegetales transformadas forman tumores de tallo o de raíces (en el caso de las infecciones con Agrobacterium tumefaciens o rhizogenes, respectivamente) con capacidad de crecimiento autónomo y de producción de opinas, las que son utilizadas por la bacteria como fuente de nitrógeno y de carbono.

Con el objeto de usar este sistema para obtener plantas transgénicas capaces de expresar un gen deseado se hacen las siguientes modificaciones al plásmido Ti:

• Para que el fenotipo de las plantas transgénicas sea normal, se eliminan de

la región del T-DNA los genes responsables de la inducción tumoral. • Se introduce en el T-DNA un gen dominante fácilmente seleccionable (por

ejemplo, el gen npt II que confiere resistencia a antibióticos aminoglucosídicos, como kanamicina).

• Además, se incluye dentro del T-DNA el gen de interés, el que puede conferir resistencia a distintos tipos de estrés o codificar proteínas de utilidad. También pueden utilizarse genes reporteros, los cuales permiten determinar la especificidad de tejido y el nivel de expresión del promotor que controla a dicho gen.

Para la introducción de genes mediada por este sistema en plantas es necesario

en la mayoría de los casos disponer de un sistema de cultivo de tejidos para la especie a transformar en el que la regeneración de plantas completas sea reproducible. Por otro lado, dicha especie debe ser susceptible a la infección por Agrobacterium. Frecuentemente se emplean explantos de hojas como material inicial para la transformación. La mayoría de los brotes regenerados a partir de estos explantos parecen ser de origen unicelular (originados a partir de una única célula transformada).

Durante la práctica, se trabajará con la cepa LBA 4404 de Agrobacterium tumefaciens que porta el plásmido Ti pAL4404, cuyo T-DNA ha sido delecionado (de manera que ya no tiene los genes para la síntesis de opinas) pero conserva intacta la región vir. Esta región aporta en trans las funciones de virulencia necesarias para la transferencia del T-DNA presente en un segundo plásmido, el vector binario, al genoma de la planta (Figura 1)

El plásmido binario a utilizar en el trabajo práctico es el pBI121 (figura 2), el cual es capaz de replicarse tanto en E. coli como en Agrobacterium. Incluye, entre los bordes derecho e izquierdo del T-DNA, el gen npt II como marcador de selección (confiere resistencia a kanamicina) y el gen reportero uidA, que codifica una ß-glucuronidasa bacteriana, bajo el control del promotor del virus de mosaico del coliflor 35S. La

actividad de esta enzima puede ser detectada mediante un ensayo histoquímico. Ambos genes se encuentran bajo el control de promotores y señales de terminación adecuados para su expresión en plantas (Figura 2). Este plásmido puede ser manipulado en Escherichia coli y luego introducido en Agrobacterium por conjugación o transformación. Este último método fue el utilizado para obtener las bacterias que se usarán en el trabajo práctico.

Durante el cocultivo de la bacteria con los explantos de hoja, los compuestos fenólicos liberados por los tejidos de la planta (especialmente las acetosiringonas) activan la transcripción de los operones de la región vir de Agrobacterium. Este proceso induce la escisión del T-DNA y, por un mecanismo todavía no completamente elucidado, su transferencia e integración al azar en el genoma de la planta. Tras el cultivo en un medio de regeneración adecuado, y en presencia del agente selectivo, las células de los discos de hoja que hayan incorporado este ADN darán lugar a la formación brotes y al desarrollo de plántulas. La detección de los productos codificados por los genes introducidos (npt II y uidA (ß-glucuronidasa)) permite confirmar la presencia del ADN exógeno (Figura 3). Nota: El tiempo necesario para obtener plantas transgénicas en condiciones de ser analizadas para verificar la presencia y expresión del transgén varía según las especies entre 3 y 4 meses. BIBLIOGRAFIA • An, G. (1985). High efficiency transformation of cultured tobacco cells. Plant

Physiology, 79:568-570. • Horsh, R., Fry, J., Hoffman, N., Eichholtz, D., Rogers, S. and Fraley, R. T. (1984). A

simple and general method for transferring genes into plants. Science, 227:1229-1231.

• Ooms, G., Bakker, A., Molendijk, M., Wullems, G. J., Gordon, M., Nester, E. W. and Schilperoort, R. A. (1982). T-DNA organization in homogeneous and heterogeneous octopine-type crown gall tissues of Nicotiana tabacum. Cell, 30:589-597.

• Bevan, M. (1984). Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. Nucleic Acids Research, 12:8711-8721.

• Sacristian, M. D. and Melchers, G. (1977). Regeneration of plants from habituated and Agrobacterium-transformed single cell clones of tobacco. Molecular and General Genetics, 152:111-117.

Figura 1. Agrobacterium tumefaciens LBA 4404, con el plásmido Ti pAL4404 y el vector binario pBI121.

Figura 2. Esquema del vector binario pBI121 tomado del catálogo de la compañía Clontech (1987).

Figura 3. Esquema del proceso de transformación de discos de hoja de tabaco por Agrobacterium.

Protocolo de transformación de discos de hojas de tabaco mediante Agrobacterium tumefaciens

a) Obtención de explantos y cocultivo con Agrobacterium 1) Se emplean plantas jóvenes de Nicotiana tabacum cv. Petit havana crecidas in vitro

bajo condiciones de esterilidad. 2) Preparar 2 placas de Petri con 20 ml de medio MS líquido. Rotular las placas como 1-

Transformación y 2-Controles. 3) Agregar a la placa 1-Transformación 20 µl de un cultivo crecido durante una noche

de LBA4404:pBI121. Este cultivo porta el plásmido para la expresión del gen de la -glucorinadasa (GUS, ver figura) a partir del promotor 35S CaMV el cual le confiere a la cepa resistencia a kanamicina.

4) Agregar a la placa 2-Controles 20 µl de un cultivo crecido durante una noche de

LBA4404. Esta cepa no porta ningún plásmido de expresión y será utilizada para los controles de REGENERACION y de SELECCION.

5) Sobre una superficie estéril, cortar con un bisturí trozos de aproximadamente 1 cm2

(discos) de hojas jóvenes y bien desarrolladas. Agregar aproximadamente 10 explantos en la placa 1-Transformación y 4 explantos en la placa 2-Controles. Incubar 5 minutos a temperatura ambiente.

6) Transferir los 10 explantos de la placa 1-Transformación a 2 placas de Petri

rotuladas TRANSFORMACION conteniendo MS sólido + ANA 0,1 mg/L + BAP 1mg/L.

7) Transferir 2 explantos de la placa 2-Controles a una placa de Petri rotulada

REGENERACION conteniendo MS sólido + ANA 0,1 mg/L + BAP 1mg/L. 8) Transferir 2 explantos de la placa 2-Controles a una placa de Petri rotulada

SELECCION conteniendo MS sólido + ANA 0,1 mg/L + BAP 1mg/L. 9) Incubar todas las placas a 22 °C, en oscuridad durante 48 h (COCULTIVO).

b) Transferencia de los explantos a medio selectivo luego de 48 hs de cocultivo con Agrobacterium. 10) Transferir los explantos de la placa TRANSFORMACION a frascos conteniendo MS

sólido + ANA 0,1 mg/L + BAP 1mg/L. + Kanamicina 50 ug/ml + cefotaxime 200 ug/ml. Rotular las placas como TRANSFORMACION-1.

11) Transferir los explantos de la placa REGENERACION a frascos conteniendo MS

sólido + ANA 0,1 mg/L + BAP 1mg/L. + cefotaxime (CONTROL DE

REGENERACIÓN). Rotular la placa como REGENERACION-1. 11) Transferir los explantos de la placa SELECCION a frascos conteniendo MS sólido +

ANA 0,1 mg/L + BAP 1mg/L. + Kanamicina 50 ug/ml + cefotaxime 200 ug/ml (CONTROL DE SELECCION). Rotular la placa como SELECCION-1.

9) Incubar los frascos a 24 °C, con un fotoperíodo de 16 h de luz / 8 h de oscuridad,

durante aproximadamente 1 mes. De ser necesario, repicar a frascos con medio fresco.

Nota: Cuando los brotes alcanzan un tamaño de 10-20 mm (al cabo de aproximadamente 6 semanas), se repican a medio MS sólido, sin hormonas, suplementado con el agente de selección (50 ug/ml de kanamicina) y el bacteriostático (200 ug/ml de cefotaxime). En este medio, los brotes enraizarán (si no lo hicieron en la etapa anterior). Después de 2 ó 3 repiques sucesivos las plántulas que hayan enraizado en medio selectivo estarán en condiciones de ser transferidas a tierra (etapa de rusticación).

c) Soluciones MS30 Macronutrientes MS 20X 50 ml Micronutrientes MS 200X 5 ml Fe-EDTA 200X 5 ml Sacarosa 30 g Agar 8 g H

2O csp 1 L.

Llevar a pH 5,8 con KOH. Vitaminas MS Myo-inositol 100,0 mg/L Acido nicotínico 0,5 mg/L Piridoxina-HCl 0,5 mg/L Tiamina-HCl 0,1 mg/L Glicina 2,0 mg/L Hormonas Bencilaminopurina (BAP) cc. final. 1 mg/L Acido naftalenacético (ANA) cc. final. 0,1 mg/L Antibióticos Cefotaxime (cef) 200 mg/L Kanamicina (kan) 50 mg/L

Rifampicina (rif) 100 mg/L Estreptomicina (str) 100 mg/L Macronutrientes NH

4NO

3 33,0 g/L

KNO3 38,0 g/L

CaCl2.2H

2O 8,8 g/L

MgSO4.7H

2O 7,4 g/L

KH2PO

4 3,4 g/L

Micronutrientes KI 166 mg/L H

3BO

3 1240 mg/L

MnSO4 .4H

2O 4460 mg/L

ZnSO4 .7H

2O 1720 mg/L

Na2MoO

4 .2H

2O 50 mg/L

CuSO4 .5H

2O 5 mg/L

CoCl2.6H

2O 5 mg/L

Solución quelante de hierro FeSO

4.7H

2O 5,56 g/L

Na2EDTA.2H

2O 7,46 g/L

MÓDULO III

EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS EN PLANTAS

TP4. EXPRESIÓN TRANSITORIA DE PROTEÍNAS EN NICOTIANA BENTHAMIANA POR AGROINFILTRACIÓN

INTRODUCCIÓN

La interacción Agrobacterium-planta involucra la transferencia del Complejo-T (una copia simple hebra del T-DNA de Agrobacterium acomplejada con proteínas) al núcleo de las células vegetales. Para que la transformación sea estable, esta copia de T-DNA debe integrarse al genoma vegetal. Las copias que no se integren permanecerán transitoriamente en el núcleo, pudiendo durante este lapso ser transcriptas y resultando en la expresión transitoria de los genes del T-DNA.

Los sistemas de expresión génica transitorios son frecuentemente utilizados porque ofrecen varias ventajas sobre el análisis de la expresión estable: a) la expresión génica puede ser medida en un lapso temporal breve luego de la transferencia del ADN; b) la expresión no se ve modificada por efectos posicionales y c) la transferencia génica puede ser ensayada sin la necesidad de regenerar una planta transgénica a partir de una célula transformada, hecho especialmente ventajoso cuando se trabaja con especies recalcitrantes a la regeneración.

El método denominado de agroinfiltración consiste en la infiltración de un cultivo de Agrobacterium tumefaciens (obtenido bajo condiciones inductoras de los genes vir) en tejidos foliares completos. La bacteria entra en los espacios intercelulares permitiendo así que el T-DNA sea transferido en todas las capas celulares de la hoja. Por tal motivo, a diferencia de otros métodos de expresión génica transitoria, la agroinfiltración resulta adecuada para estudiar tanto la expresión génica tejido-específica o regulada por el desarrollo, como los procesos que involucran la pared celular o las interacciones entre células vecinas. En el presente trabajo práctico evaluaremos la expresión transitoria de 2 construcciones plasmídicas:

• GFP: el gen GFP (proteína fluorescente verde) es expresado a partir de el promotor constitutivo 35SCaMV.

• PVXESAT: el antígeno ESAT de Mycobacterium bovis es expresado a partir del

promotor subgenómico de la cápside del amplicón viral p35PVXCPd. El amplicón viral p35PVXCPd consiste en la copia infectiva de ADN del Potato virus X (PVX) cuya expresión es regulada por el promotor constitutivo 35SCaMV. A partir del promotor 35SCaMV se transcribe un ARN que es una copia exacta del ARN viral, por lo tanto una vez que ocurrió la transcripción, este ARN se comporta como un virus e inicia su ciclo de replicación amplificando su expresión y en consecuencia la expresión del transgén ESAT. De esta forma se formarán partículas virales infectivas y al cabo de 7 a 15 días podremos observar en las hojas de las plantas agroinfiltradas con p35PVXCPdESAT los síntomas típicos de la infección por PVX y la producción de ESAT fusionado a la CP del virus.

Se ha determinado que tanto la expresión de un transgén como de un amplicón viral gatillan el fenómeno de silenciamiento génico post-transcripcional (PTGS), lo que lleva a una disminución de los niveles de expresión del transgen y por ende de las proteínas que éste produce. Los virus de plantas poseen proteínas capaces de contrarrestar este efecto, dichas proteínas, denominadas proteínas supresoras del PTGS son capaces de interferir con el PTGS en distintos pasos del proceso. En el presente trabajo práctico analizaremos el efecto de distintas proteínas supresoras del PTGS sobre los niveles de expresión de GFP producido a partir de los dos tipos de vectores detallados previamente (p35GFP y p35PVXCPdESAT). Las proteínas supresoras del PTGS que utilizaremos son: P1/HC-Pro de TEV (potyvirus, ARNsc) Previamente esta proteína había sido reportada como determinante de patogenicidad, en el sinergismo y en el movimiento a larga distancia. Previene la degradación del ARN pero no elimina la señal móvil que propaga el silenciamiento. P19 de TBSV (tombusvirus, ARNsc) Previamente esta proteína había sido reportada como determinante de síntomas y de especificidad de huésped. Sólo previene el silenciamiento en hojas jóvenes y sólo en y alrededor de las venas. P25 de PVX (potexvirus, ARNsc) Es la proteína responsable del movimiento viral en las plantas infectadas. Interfiere con la señal de propagación sistémica.

OBJETIVOS • Analizar el efecto de distintos supresores del silenciamiento post-transcripcional sobre la expresión transitoria del transgén GFP por agroinfiltración. • Analizar el efecto de distintos supresores del silenciamiento post-transcripcional sobre la expresión transitoria del amplicón PVXESAT por agroinfiltración.

BIBLIOGRAFÍA • Rossi L. et al. (1993). Plant Molecular Biology Reporter, 11(3):220-229. • Kapila J. et al. (1997). Plant Science, 122:101-108. • Renier A.L. et al. (2000). Molecular Plant-Microbe Interactions, 13(4):439-446. • http://www.sainsbury-laboratory.ac.uk/david-baulcombe/slide-shows/web/INDEX.HTM

• Li WX, Ding SW. Viral suppressors of RNA silencing. Curr Opin Biotechnol. 12(2):150-4, 2001.

a) Material vegetal Se utilizarán plantas jóvenes (3-4 semanas) de Nicotiana benthamiana, crecidas en invernadero. b) Protocolo experimental El trabajo práctico se desarrollará a lo largo de 3 clases.

Día 1 b.1.) Agroinfiltración

1) Inocular a partir de estrías frescas los diferentes cultivos de Agrobacterium tumefaciens recombinantes en 3 ml de medio LB suplementado con antibióticos (6 μl rifampicina, 3 μl gentamicina y 3 μl kanamicina de los stocks descriptos más abajo) en tubos de 50 ml de capacidad. Crecer en agitación durante toda la noche a 28 °C y 200 r.p.m. Como control se inocularán 3 ml de medio LB Agrobacterium tumefaciens sin plásmido. Los diferentes cultivos de Agrobacterium tumefaciens recombinantes contienen los plásmidos que se detallan a continuación:: GFP, plásmido que expresa GFP a partir del promotor constituttivo CaMV 35S. PVXESAT , plásmido que expresa el genoma completo de PVX a partir del promotor constituttivo CaMV 35S. Este amplicón permite la expresión del antígeno ESAT de Mycobacterium bovis a partir del promotor subgenómico de la cápside viral. HC-pro, plásmido que expresa el supresor del PTGS HC-pro de TEV a partir del promotor constituttivo CaMV 35S. P19, plásmido que expresa el supresor del PTGS p19 de TEV a partir del promotor constituttivo CaMV 35S.

P25, plásmido que expresa el supresor del PTGS p25 de PVX a partir del promotor constituttivo CaMV 35S. 2) Emplear estos cultivos para inocular 100 ml de medio LB suplementado con 1 ml de MES 1 M, 5 g/L de sacarosa, 2 ml/L de MgSO

4 1 M, 2 mM de acetosiringona y

antibióticos (200 μl rifampicina, 100 μl gentamicina y 100 μl kanamicina). Incubar el cultivo durante toda la noche a 28 °C a 200 r.p.m.

3) Cuando los cultivos hayan alcanzado una OD

600 de entre 0,6 y 1,2, cosechar las

células centrifugándolas durante 10 min a 4.000 g. Resuspenderlas a una densidad final de DO

600 = 2 en agua bidestilada.

4) Infiltrar los distintos cultivos o combinaciones de ellos en hojas de plantas de Nicotiana benthamiana empleando una jeringa de 2 ml a la que se le ha retirado la aguja. Para ello se toma una hoja y se la gira exponiendo su cara abaxial (inferior) hacia arriba. Sobre esta cara apoyar la jeringa en la sección que se desea infiltrar, manteniendo por el otro lado de la hoja el dedo (el sector de la hoja a infiltrar debe quedar entre el dedo y la jeringa). Presionar suavemente la jeringa y empujar con delicadeza el émbolo, evitando perforar el tejido y producir salpicaduras indeseables. El ingreso del cultivo a la hoja es fácilmente observable (a medida que avanza va oscureciendo el tejido). Previo a la infiltración los cultivos serán combinados con el fin de evaluar el efecto de los distintos supresores del PTGS sobre la expresión del transgén GFP o del amplicón PVXESAT. A continuación se detallan los cultivos o combinaciones de cultivos que se infiltrarán:

Cultivo 1 (5 ml) Cultivo 2 (5 ml) Cultivo 3 (5 ml)

GFP GV3101 GV3101

GFP Hc-pro GV3101

GFP P19 GV3101

GFP P25 GV3101

PVXESAT GV3101 GV3101

PVXESAT HC-pro GV3101

PVXESAT P19 GV3101

PVXESAT P25 GV3101

5) Las plantas se mantienen en invernadero durante 7 días, al cabo de los cuales se evalúa la expresión del transgén.

Día 2 b.2.) Detección de la actividad de GFP por iluminación con luz UV. 6) A los 7 días de la agroinfiltración se observará la intensidad de la fluorescencia emitida por la GFP en las hojas infiltradas por iluminación de las mismas con una

lámpara de luz UV 360 nm. Se cuantificará la fluorescencia como intensidad alta (+++), mediana (++) o baja (+) para cada uno de las distintas combinaciones de cultivos.

b.4.) Detección del antígeno ESAT por Western blot. 7) La expresión del antígeno ESAT será ensayado por Western blot. Para ello 7 días después de la agroinfiltración se tomarán entre 1 y 2 discos por hoja de cada planta agroinfiltada con la tapa de un tubo Eppendorf de 1 ml. Como control negativo se tomarán muestras similares de hojas no agroinfiltradas. 8) Los discos de hojas serán homogeinizados por presión mecánica con un pequeño émbolo y el agregado de 60 ul de buffer de ruptura.

Día 3 9) Se sembrarán 10 ul de cada muestra en una membrana de nitrocelulosa, se dejará secar la muestra por 5 min y se iniciará el revelado con anticuerpos específicos (Western blot). 10) La membrana de nitrocelulosa será incubada durante 20 minutos en buffer PBST con el agregado de 5% de leche descremada a temperatura ambiente. 11) Luego se agregarán los anticuerpos específicos anti ESAT (dilución 1:2000) y anti CP de PVX (dilución 1:1000) preparados en PBST con el agregado de 5% de leche descremada y se incubará durante 45 minutos a temperatura ambiente. 12) La membrana será lavada 3 veces con sucesivos agregados de 10 ml de PBST. 13) A continuación se incubará la membrana con anti Inmunoglobulina G de conejo acoplado a fosfatasa alcalina (dilución 1:4000) preparados en PBST con el agregado de 5% de leche descremada y se incubará durante 30 minutos a temperatura ambiente. 14) La membrana será lavada 2 veces con sucesivos agregados de 10 ml de PBST y 1 vez con 10 ml de PBS. 15) Por último para el revelado de la membrana la misma será incubada en 10 ml de buffer fosfatasa con el agregado de 75 ul de NBT 40 mg/ml y 75 ul de BCIP 20mg/ml. Se cuantificará los niveles de expresióncomo intensidad alta (+++), mediana (++) o baja (+) para cada uno de las distintas combinaciones de cultivos.

c) Soluciones, medios de cultivo y suplementos: LB Extracto de levadura 5 g/L Bactotriptona 10 g/L NaCl 10 g/L H

2O csp 1 L

MMA Sales MS 5 g/L MES 1,95 g/L Sacarosa 20 g/L

Llevar a pH 5,6 con NaOH 1M Suplementos Acetosiringona (disuelta en DMSO) 100 mM Sacarosa 25 % p/v MgSO

4 1 M

Rifampicina 100 μg/ml Estreptomicina 100 μg/ml Espectinomicina 100 μg/ml Gentamicina 50 μg/ml Buffer de ruptura Tris HCL 20 mM pH 8 NaCl 10 mM

b-mercaptoetanol 1 mM PBS NaCl 8g KCl; 0,2 g Na

2 HPO

4 • 7H

2 0 1,44g

KH 2 PO 4 0,24 g

H2O csp 1 L

Llevar a pH 7,2 autoclavar y guardar a temperatura ambiente

PBST PBS 1X Tween 20 0,25%

Buffer fosfatasa alcalina Tris HCl 100 mM NaCl 100 mM MgCl 5mM Llevar a pH 9,5 con NaOH 1M

MÓDULO IV

MARCADORES MOLECULARES

TP5. MARCADORES RAPD (RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA)

INTRODUCCIÓN Los marcadores RAPD pertenecen al grupo de marcadores moleculares detectados mediante PCR (Polimerase Chain Reaction;). La detección del polimorfismo consiste en permitir la hibridación al azar de un único primer que contiene una secuencia arbitraria de 6 a 10 nucleótidos, con un contenido de al menos un 50 % de GC y sin secuencias palindrómicas (Williams et al., 1993). Si el primer hibrida en cadenas opuestas del DNA y a distancias menores a 3000 pares de bases, se producirá la amplificación de la zona del genoma involucrada entre los dos sitios de hibridación (Figura 1). Los productos de amplificación generados de esta manera, se observan mediante electroforesis en geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio o geles de poliacrilamida teñidos con plata.

Figura 1: Esquema de la amplificación mediante la técnica RAPD. Los primers (rectángulos negros) deben hibridar en la orientación y distancia adecuada para que sea posible la formación de productos de amplificación. Los polimorfismos están dados por la presencia o ausencia de bandas de amplificación y cada banda es analizada como un locus independiente. Las causas por las que se puede generar un polimorfismo son: a) mutaciones puntuales o deleciones que no permiten la hibridación del primer; b) rearreglos cromosómicos que cambian la orientación de los primers o aumentan la distancia entre los sitios de hibridación más allá del límite de amplificación de la PCR (aproximadamente 3.000 pb dependiendo de la procesividad de la polimerasa); c) cambios en el tamaño de los fragmentos amplificados debidos a pequeñas inserciones o deleciones. Esta técnica analiza varios loci a la vez distribuidos por todo el genoma y es independiente de la complejidad del mismo, soliendo presentar buen nivel de polimorfismo. Esto permite su utilización en estudios de mapeo y fingerprinting de genotipos. Cuenta con una serie de ventajas adicionales: a) no se requiere información previa sobre las secuencias del DNA a estudiar ni sobre las secuencias de los primers, b) se necesita poca cantidad de DNA para las reacciones, c) no se necesita utilizar compuestos radioactivos y requiere poco equipamiento. Entre las limitaciones de estos marcadores se cuentan: a) son de herencia dominante (no se pueden distinguir tipos alélicos); b) la comigración de bandas no implica que se trate del mismo locus o alelo; c) en muchos casos es discutible la reproducibilidad de los

patrones de bandas en experimentos independientes; d) generalmente no son apropiados para detectar diferencias entre genomas originadas en mutaciones simples o deleciones muy pequeñas. Si bien la reproducibilidad de los patrones de bandas en ensayos entre laboratorios es discutible, la técnica permite obtener excelentes resultados intra laboratorio. Es importante controlar adecuadamente todos los parámetros, en particular las concentraciones de DNA, MgCl

2 y primers, las condiciones del programa de ciclado, el

tipo y cantidad de DNA polimerasa termoestable utilizada. También debe controlarse regularmente la precisión de las pipetas. En la práctica, se analizarán los patrones de amplificación obtenidos para distintas muestras vegetales mediante electroforesis en geles de agarosa y tinción con bromuro de etidio estudiando las características, importancia y aplicación de los posibles polimorfismos detectados.

BIBLIOGRAFIA • Caetano-Anolles, G., Bassam, B.J. and Gresshoff, P. (1991). DNA amplification

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DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research, 18:6531-6535.

• Williams, J.K.G, Hanafey, M., Rafalski, J. A. and Tingey, S. V. (1993): Genetic analysis using Random Amplified Polymorphic DNA Markers. Mehods in Enzimology, 218:704-740.

Protocolo experimental para el análisis mediante marcadores moleculares RAPDs

a) Material vegetal Cada grupo recibirá DNA de distintas especies vegetales o variedades de un cultivo de importancia económica. La extracción de DNA fue llevada a cabo según la metodología apropiada para cada caso y fue cuantificado en geles de agarosa al 0,8 %.

b) Protocolo experimental

b.1.) Reacción de amplificación Cada grupo recibirá ADN de plantas individuales y llevará a cabo el siguiente procedimiento:

1) Rotular apropiadamente los tubos de PCR con marcador de alcohol, (utilizar uno

para cada DNA y uno para el control negativo).

2) Pipetear el DNA (2 μl) en los tubos correspondientes y 2 μl de H2O en el tubo

“control negativo”.

3) Realizar una mezcla de reacción (Premix) según la siguiente tabla:

Reactivos Concentración final

Volúmen x1 en μl

Volúmen total

H2O MilliQ ---- 12,05 μl

Buffer 10X 1X 2,5 μl

MgCl2 25 mM 4 mM 4 μl

dNTPs 10 mM

100 μM 0,25 μl

Primer 16 ng/μl

0,64 ng/μl 1 μl

Taq (10 U/μl) 0,08 U/μl 0,2 μl

DNA X ng/μl 25-100 ng totales 5 (por tubo)

Volúmen final 25 μl

Mantener el órden de la lista de reactivos para preparar la Premix. Una vez preparada, mezclar brevemente con Vortex, aplicar un spin de centrífuga y enfriar en hielo.

4) Agregar 20 μl de la Premix a cada tubo que ya tiene el DNA y luego una gota de

aceite mineral (si el modelo de termociclador utilizado lo requiere). Tapar bien. Dejar los tubos en hielo hasta colocarlos en el termociclador.

Advertencia: Una vez que la Taq polimerasa fue agregada a la Premix, trabajar siempre en hielo, ya que la enzima pierde irreversiblemente actividad a temperatura ambiente.

El programa de amplificación es el siguiente: 1 ciclo 94 °C, 4 min (desnaturalización inicial) 40 ciclos 94 °C, 1 min (desnaturalización) 35 °C, 1 min (hibridación) 72 °C, 2 min (extensión) 1 ciclo 72 °C, 10 min (extensión final) 10 °C, infinito (conservación de las muestras)

5) Una vez terminado el programa, agregar a la muestra 5 μl de Buffer de Carga y

guardar a –20 °C hasta el momento de la visualización de los resultados.

b.2.) Visualización de los productos de amplificación Los productos de amplificación serán resueltos por electroforesis en un gel de agarosa al 1,5%. Para ello, se procederá de la siguiente manera:

1) Mezclar en un Erlenmeyer la cantidad necesaria de agarosa en el volumen

apropiado de buffer TAE (Tris-Acetato -EDTA) 1X para obtener una concentración final de 1,5 %.

2) Colocar la mezcla de agarosa en el horno microondas y calentar a baja potencia

hasta el primer hervor.

3) Una vez fundida la mezcla, agregar el volumen necesario de una solución de

bromuro de etidio para obtener una concentración final de 0,5 μg/ml en el gel. Advertencia: El bromuro de etidio es extremadamente mutagénico. Use guantes y sea cuidadoso durante la manipulación del gel.

4) Volcar la solución en la cama electroforética (ésta debe estar apropiadamente

nivelada y tener el peine colocado). Eliminar toda burbuja. Esperar a que solidifique completamente antes de usar.

5) Sumergir la cama junto con el peine en la cuba electroforética, la cual debe poseer

buffer TAE 1X en cantidad suficiente para cubrir el gel. Retirar cuidadosamente el peine y proceder a la siembra de las muestras (20 μl por calle).

6) La corrida electroforética se llevará a cabo a voltaje constante (8 V/cm) y los

productos de amplificación se visualizarán bajo luz UV. Advertencia: la radiación UV es particularmente dañina para los ojos. Para minimizar la exposición, asegúrese de que la fuente de luz UV esté adecuadamente cubierta con un acrílico. Use anteojos o una máscara de seguridad que bloquee eficientemente la luz UV. Use guantes cuando manipula materiales sobre la fuente de luz UV. Este tipo de radiación es también mutagénica y carcinogénica. 7) Observe los patrones de amplificación obtenidos, detecte polimorfismos y analice los

resultados.

c) Soluciones empleadas TAE 10X Tris base 400 mM Na

2EDTA 7,7 mM

NaOAc 50 mM

Ajustar a pH 8,0 con ácido acético glacial Buffer de carga Azul de Bromofenol 2 mg/ml Glicerol 40% (v/v)

TP6. MARCADORES MICROSATÉLITES Y AFLP

INTRODUCCIÓN

Microsatélites Los microsatélites son regiones del genoma que contienen arreglos de secuencias simples en tandem de mono, di, tri, tetra o pentanucleótidos que se repiten entre 10 y 100 veces. Los marcadores microsatélites, también denominados Simple Sequence Lengh Polymorphism (SSLP) o Simple Sequence Repeats (SSR), se encuentran distribuidos por todo el genoma de la mayoría de las especies eucarióticas y son detectados mediante la técnica de PCR. El polimorfismo (ocurrencia de diferentes alelos en la población para el mismo locus) está dado por diferencias en el número de repeticiones. Se supone que estas diferencias son causadas por errores en la replicación del DNA debido a que las repeticiones en tandem “confunden” a la DNA polimerasa celular durante la replicación, que agrega nucleótidos extra. En el caso de que se presenten cambios en un gran número de repeticiones, se supone que la variación proviene del cruzamiento desigual entre cromosomas homólogos. Además de los SSR nucleares, se han encontrado secuencias repetidas en cloroplastos (cpSSR), que se diferencian de las primeras en que suelen repetir una sola base. Los microsatélites se detectan mediante amplificación por PCR usando primers específicos que hibridan en la región que flanquea al tandem de repeticiones (ver Figura 2). Los diferentes tipos alélicos se observan mediante electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes. También es posible analizar los patrones de microsatélites mediante el empleo secuenciadores automáticos, para lo cual uno de los primers debe estar marcado con un compuesto fluorescente.

Figura 2: Esquema de microsatélites. El tamaño de los productos de amplificación depende del número de repeticiones de la secuencia base, y es ese el principio de los polimorfismos detectados. Los microsatélites son herramientas muy útiles como marcadores genotípicos debido a que son relativamente abundantes, multialélicos (hipervariables con respecto al número

de repeticiones), heredados en forma estable, y codominantes (se distinguen los alelos de un locus), permitiendo distinguir materiales estrechamente relacionados. Desde el punto de vista metodológico, son fáciles de detectar mediante PCR, requiriendo poca cantidad de DNA para el análisis y poco equipamiento. Quizás una de las pocas desventajas que tiene esta técnica es que se requiere del desarrollo previo de los primers que flanquean las secuencias repetidas, lo cual es costoso y lleva cierto tiempo. Otras desventajas son: la existencia de alelos nulos, el bandeo generado por los errores de la Taq polimerasa y la dificultad para determinar la tasa y el modelo de mutación de estas secuencias. Estos marcadores se emplean en: mapeo de genes, mejoramiento asistido por marcadores, identificación de cultivares, cuantificación de la variabilidad genética, estimación de la relación entre individuos (parentesco), estudios de genética de poblaciones, conservación de germoplasma, etc.

Polimorfismos de Longitud de Fragmentos Amplificados (AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphisms) La técnica de AFLP es otra metodología que permite analizar la variabilidad a nivel de DNA, permitiendo obtener un gran número de marcadores moleculares distribuidos en el genoma. El ensayo de AFLP combina la especificidad, resolución y poder de muestreo de la digestión con enzimas de restricción con la velocidad y practicidad de detección de los polimorfismos vía PCR. De esta manera, esta técnica explora simultáneamente el polimorfismo debido a presencia o ausencia de un sitio de restricción, tal como ocurre con los RFLP, y la ocurrencia o no de amplificación a partir de secuencias arbitrarias, como en el caso de los RAPDs. Desde su desarrollo y divulgación, esta técnica ha sido utilizada en forma creciente con fines de fingerprinting, mapeo genético localizado y construcción de mapas genéticos, principalmente en especies de plantas cultivadas que presentan una baja tasa de polimorfismo a nivel de DNA.

El análisis mediante AFLP consiste esencialmente de cuatro etapas, representados esquemáticamente en las Figura 3 y 4

1) En la primera etapa el DNA genómico total a analizar es digerido con dos enzimas de restricción, una enzima de corte raro y otra de corte frecuente. Una enzima de corte raro reconoce de 6 a 8 pares de bases (por ejemplo, EcoRI, Not I). Por otro lado, una enzima de corte frecuente reconoce 4 pares de bases (por ejemplo, Mse I, Rsa I). De esta forma, se generarán tres clases de fragmentos que diferirán en cuanto a sus extremos según la enzima que haya cortado.

2) En la segunda etapa, se ligan adaptadores específicos a los extremos generados por la digestión del paso anterior. Estos adaptadores tienen secuencias complementarias a dichos extremos. Por ejemplo, adaptadores EcoRI específicos se ligan a los extremos resultantes luego del corte de la enzima EcoRI, en tanto que adaptadores Mse I específicos se ligan a los extremos producidos por el corte con Mse I. Estos adaptadores poseen de 20 a 30 pares de bases. Las secuencias de estas bases son diferentes para cada adaptador y no regeneran el sitio de corte de la enzima. Con este paso, un gran número de fragmentos podría ser amplificado mediante PCR dirigida con primers específicos diseñados a partir de la secuencia de los adaptadores.

El número de fragmentos generados sería excesivamente grande para poder ser observados individualmente aún en un gel de alta resolución. Por lo tanto, son necesarias algunas etapas de selección de una subpoblación de fragmentos, obteniendo un número tal que permita una adecuada resolución en un gel.

3) La tercera etapa consiste en la selección de los fragmentos a ser amplificados. Esta es realizada a través de una estrategia que se basa esencialmente en el concepto de los polimorfismos generados por la técnica de RAPD. Esto es, la utilización de primers que además de contener una secuencia específica de 20 a 25 nucleótidos complementaria a la secuencia de los adaptadores, poseen de 1 a 3 nucleótidos adicionales de secuencia arbitraria en su extremo 3′. La especificidad en esta posición es crucial ya que es justamente a partir del extremo 3′ que se inicia la polimerización. De esta manera, los primers sólo van a hibridar con aquellos fragmentos que poseen secuencia complementaria a su secuencia arbitraria adicional. Por lo tanto, cuando se realiza la PCR y solamente una subpoblación de fragmentos es amplificada ocurre una acción selectiva. Esta acción se produce en dos etapas. En la primera, preselectiva (preamplificación), los primers utilizados contienen solamente un nucleótido arbitrario adicional (primers+1). En la segunda, de mayor intensidad de selección, los primers utilizados poseen otros dos nucleótidos arbitrarios, totalizando así tres nucleótidos adicionales (primers+3).

Figura 3: Representación esquemática del proceso de análisis de marcadores AFLPs

4) En esta cuarta y última etapa, la subpoblación de fragmentos amplificados es separada mediante electroforesis de alta resolución en geles de poliacrilamida y visualizada mediante tinción con plata (o mediante autoradiografía si se utiliza en la última reacción de PCR un primer marcado radioactivamente, o mediante secuenciador automático si se utiliza un primer fluorescente). La cantidad de bandas (50-100 o más) y

el perfil de las mismas depende de las enzimas usadas y de las bases al azar agregadas. Varios loci polimórficos pueden encontrarse en un mismo gel. Una variante de la técnica de AFLP, desarrollada en la ultima década, es la marcación de los fragmentos amplificados con fluoróforos, permitiendo la visualización de los mismos mediante electroforesis capilar, utilizando secuenciadotes. Esta modificación asi como el desarrollo de software para su lectura permite realizar análisis en forma mas procesiva. La figura 4 esquematiza el proceso de detección de fragmentos marcados con fluoróforos.

Figura 4: Representación de la metodología de AFLP fluorescente. El polimorfismo entre fragmentos AFLP resulta de mutaciones de punto, inversiones, deleciones e inserciones que llevan a: a) pérdida o ganancia de un sitio de restricción reconocido por las enzimas utilizadas o b) alteración de la secuencia reconocida por los nucleótidos arbitrarios en los extremos 3′ de los primers que dirigen la PCR a partir de los adaptadores. El concepto de “dominancia” de los marcadores RAPD se aplica también a los marcadores basados en AFLP. Así, los marcadores AFLP no permiten la detección de individuos heterocigotas, o sea, no es posible distinguir si una banda en el gel es el resultado de la amplificación de uno o dos alelos. Esta técnica es sumamente usada por su versatilidad y alta reproducibilidad en estudios de fingerprinting, mapeo de genes simples y QTLs, estudios de diversidad genética, etc. En el transcurso de la práctica, se realizarán reacciones de microsatélites para una población tipo RIL de girasol (Helianthus annus) y se resolverán en geles de agarosa. Asimismo, se analizarán resultados de microsatélites para una población F2 de sorgo (Sorghum bicolor), obtenidos mediante el empleo de un secuenciador automático. Por otra parte, se observarán y discutirán muestras evaluadas mediante las técnicas de RAPD, microsatélites y AFLP provistas por el docente, resueltas en geles de poliacrilamida teñidos con nitrato de plata. A partir de los resultados obtenidos se discutirán las aplicaciones de estas metodologías y las ventajas y desventajas de su utilización como marcadores genéticos.

BIBLIOGRAFIA Microsatélites • Akkaya, M.S., Bhagwat, A.A. and Cregan, P.B. (1992). Lengh polymorphisms of simple

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Research, 23:4407-4414. • Heidi M. Meudt and Andrew C. Clarke (2007). Almost Forgotten or Latest Practice? AFLP applications, analyses and advances. TRENDS in Plant Science Vol.12 No.3

Protocolo experimental para el análisis mediante SSR

a) Material Cada grupo recibirá ADN de girasol proveniente de una población de mapeo (líneas parentales y líneas recombinantes endocriadas), a partir del cual se harán reacciones de amplificación de microsatélites. Estas muestras serán sembradas en un gel de agarosa y visualizadas mediante tinción con bromuro de etidio.

b) Procedimiento

b.1.) Reacción de amplificación Cada grupo recibirá ADN de plantas individuales y llevará a cabo el siguiente procedimiento: 1) Rotular apropiadamente los tubos de PCR con marcador de alcohol, (utilizar uno para cada ADN y uno para el control negativo).

2) Pipetear el ADN (2 μl) en los tubos correspondientes y 2 μl de H

2O en el tubo “control

negativo”.

3) Realizar una mezcla de reacción (Premix) según la siguiente tabla:

Reactivos Stock [cc] final Vol (μl)

Primers microsat [5mM] 0,25 mM 0,60 (0,3 de c/u

MgCl2 [50mM] 1,5 mM 0,35

dNTPs [10mM] 0,2 mM 0,25

Buffer 10x (10x) 1x 1,20

ddH2O 7,20

Taq 1 U 0,50

Vf: 10,00

Mantener el orden de la lista de reactivos para preparar la Premix. Una vez preparada, mezclar brevemente con Vortex, aplicar un spin de centrífuga y enfriar en hielo. PRECAUCIÓN: Una vez que la Taq polimerasa fue agregada a la Premix, trabajar siempre en hielo, ya que la enzima pierde irreversiblemente actividad a temperatura ambiente. 4) Agregar 10 μl de la Premix a cada tubo que ya tiene el ADN. Tapar bien. Dejar los

tubos en hielo hasta colocarlos en el termociclador. El programa de amplificación es el siguiente:

1 ciclo 94 °C, 4 minutos (desnaturalización inicial) 10 ciclos 94 °C, 45 segundos (desnaturalización)

64 °C, 45 segundos, descendiendo 1o

C por ciclo (hibridación con touchdown) 72 °C, 1 min (extensión)

35 ciclos 94 °C, 45 segundos (desnaturalización) 54 °C, 45 segundos (hibridación) 72 °C, 1 minuto (extensión)

1 ciclo 72 °C, 10 minutos (extensión final) 15 °C, infinito (conservación de las muestras)

5) Una vez terminado el programa, guardar en freezer a -20°C hasta el momento de la

visualización de los resultados.

b.2.) Visualización de los productos de amplificación

Se realizará en las mismas condiciones que para RAPD (ver b.2 en guía anterior de marcadores RAPD).

c) Material complementario para discutir en clase Resultados obtenidos mediante el empleo de un secuenciador automático para una población F2 de sorgo.

d) Preguntas para responder al finalizar el TP 1) Realice un cuadro comparativo para las tres metodologías discutidas en el TP: RAPDs, AFLPs y SSR, analizando las siguientes características: metodología que emplean, laboriosidad, número de loci analizados, nivel de polimorfismo, capacidad de discriminar alelos, necesidad de conocimiento previo del genoma, reproducibilidad, costo, posibilidad de automatización (y alguna otra característica que a Ud. le parezca relevante) 2) ¿Qué resultados obtuvo mediante el análisis de RAPDs para las variedades y especies estudiadas? ¿Qué le permiten concluir?

3) ¿Qué resultados obtuvo para la población analizada para un locus SSR? ¿Qué debería hacer para obtener un mapa de ligamiento de la misma? 4) Con respecto a los resultados obtenidos para sorgo con SSR de manera automatizada: ¿cuáles son las ventajas de esta metodología? 5) Enuncie al menos 3 aplicaciones de los marcadores moleculares para resolver problemas agronómicos concretos.

ALGUNAS REGLAS BÁSICAS DE HIGIENE Y SEGURIDAD EN

LABORATORIOS

Las medidas de Seguridad en Laboratorios son un conjunto de medidas

preventivas destinadas a proteger la salud de los que allí se desempeñan frente a los

riesgos propios derivados de la actividad, y a evitar accidentes y contaminaciones tanto

dentro de su ámbito de trabajo, como hacia el exterior. Las reglas básicas aquí

indicadas son un conjunto de prácticas de sentido común realizadas en forma rutinaria.

El elemento clave es la actitud proactiva hacia la seguridad y la información, que

permitan reconocer y combatir los riesgos presentes en el laboratorio. Será fundamental

la realización meticulosa de cada técnica, pues ninguna medida, ni siquiera un equipo

excelente puede sustituir el orden y el cuidado con que se trabaja.

1. Se deberá conocer la ubicación de los elementos de seguridad en el lugar de

trabajo, tales como: matafuegos, salidas de emergencia, mantas ignífugas, lavaojos,

gabinete para contener derrames, accionamiento de alarmas, etc.

2. No se permitirá comer, beber, fumar o maquillarse.

3. No se deberán guardar alimentos en el laboratorio, ni en las heladeras que

contengan drogas.

4. Se deberá utilizar vestimenta apropiada para realizar trabajos de laboratorio y

cabello recogido (guardapolvo preferentemente de algodón y de mangas largas,

zapatos cerrados, evitando el uso de accesorios colgantes).

5. Es imprescindible mantener el orden y la limpieza. Cada persona es responsable

directa de la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes.

6. Las manos deben lavarse cuidadosamente después de cualquier manipulación de

laboratorio y antes de retirarse del mismo.

7. Se deberán utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias

química o material biológico. Ninguna persona cuyos guantes se encuentren

contaminados deberá tocar objetos, ni superficies, tales como: teléfono, lapiceras,

manijas de cajones o puertas, cuadernos, etc.

8. No se permitirá pipetear con la boca.

9. No se permitirá correr en los laboratorios.

10. Siempre que sea necesario proteger los ojos y la cara de salpicaduras o impactos,

se utilizarán anteojos de seguridad, viseras o pantallas faciales u otros dispositivos

de protección. Cuando se manipulen productos químicos que emitan vapores o

puedan provocar proyecciones, se evitará el uso de lentes de contacto.

11. No se deben bloquear las rutas de escape o pasillos con equipos, máquinas u otros

elementos que entorpezcan la correcta circulación.

12. Todo material corrosivo, tóxico, inflamable, oxidante, radiactivo, explosivo o nocivo

deberá estar adecuadamente etiquetado.

13. No se permitirán instalaciones eléctricas precarias o provisorias. Se dará aviso

inmediato a la Secretaría Técnica en caso de filtraciones o goteras que puedan

afectar las instalaciones o equipos y puedan provocar incendios por cortocircuitos

(Interno 355).

14. Se requerirá el uso de mascarillas descartables cuando exista riesgo de producción

de aerosoles (mezcla de partículas en medio líquido) o polvos, durante operaciones

de pesada de sustancias tóxicas o biopatógenas, apertura de recipientes con

cultivos después de agitación, etc.

15. Las prácticas que produzcan gases, vapores, humos o partículas, y aquellas que

pueden ser riesgosas por inhalación deben llevarse a cabo bajo campana.

16. Se deberá verificar la ausencia de vapores inflamables antes de encender una

fuente de ignición. No se operará con materiales inflamables o solventes sobre llama

directa o cerca de la misma. Para calentamiento, sólo se utilizarán resistencias

eléctricas o planchas calefactoras blindadas. Se prestará especial atención al punto

de inflamación y de autoignición del producto.

17. El material de vidrio roto no se depositará con los residuos comunes. Será

conveniente ubicarlo en cajas resistentes, envuelto en papel y dentro de bolsas

plásticas. El que sea necesario reparar se entregará limpio al taller.

18. Será necesario que todo recipiente que hubiera contenido material inflamable, y

deba ser descartado, sea vaciado totalmente, escurrido, enjuagado con un solvente

apropiado y luego con H2O varias veces.

19. Está prohibido descartar líquidos inflamables, tóxicos, corrosivos o material biológico

por los desagües de las piletas, sanitarios o recipientes comunes para residuos. En

cada caso se deberán seguir los procedimientos establecidos para la gestión de

residuos. Consultar al Servicio de Higiene y Seguridad (Interno 275).

20. Cuando sea necesario manipular grandes cantidades de materiales inflamables

(más de 5 L) deberá tenerse a mano un extintor apropiado para el material en

cuestión.

21. Cuando se trasvase material combustible o inflamable de un tambor a un recipiente

más pequeño, se deberá realizar una conexión con una cadena del tambor a tierra y

con otra entre el tambor y el recipiente, de manera de igualar potenciales y eliminar

la posible carga estática.

22. Al almacenar sustancias químicas debe considerarse que hay cierto número de ellas

que son incompatibles, pues almacenadas juntas pueden dar lugar a reacciones

peligrosas. Ante dudas consultar al Servicio de Higiene y Seguridad (Interno 275).

23. No almacenar en estantes sobre mesadas sustancias corrosivas, debe hacerse en

estantes bajo mesadas y, en caso de ácidos o álcalis concentrados (mayor de 2 N),

deben ser mantenidas dentro de lo posible en bandejas de material adecuado.

24. Los cilindros de gases comprimidos y licuados deben asegurarse en posición

vertical con pinzas, grampas y correas o cadenas a la pared en sitios de poca

circulación, protegidos de la humedad y fuentes de calor, de ser posible en el

exterior.

25. Los laboratorios contarán con un botiquín de primeros auxilios con los elementos

indispensables para atender casos de emergencia.

26. Se informará al Departament de Seguridad y Control cuando se necesite dejar

equipos funcionando en ausencia del personal del laboratorio.

27. Se anotarán en un lugar visible desde el exterior los teléfonos de los responsables

de cada laboratorio para que puedan ser consultados en caso de alguna anomalía

verificada por el personal de Seguridad y Control en su recorrida fuera de los

horarios habituales de trabajo.

PROCEDMIENTOS ANTE EMERGENCIAS

Emergencias médicas:

Si ocurre una emergencia tal como: cortes o abrasiones, quemaduras o ingestión

accidental de algún producto químico, tóxico o peligroso, proceder de la siguiente

manera:

1. A los accidentados se les proveerán los primeros auxilios.

2. Simultáneamente se tomará contacto con el Servicio Médico (Interno 482), o con el

Servicio Médico de Deportes (4784-4351 / 3948)

3. Avisar al Jefe de Laboratorio o autoridad del Departamento, quienes solicitarán

asistencia de la Secretaría Técnica (interno 380) para que envíe personal del

Departamento de Mantenimiento, Seguridad y Control o Servicios Generales según

corresponda.

4. El Jefe de Departamento notificará el accidente al Servicio de Higiene y Seguridad

para su evaluación e informe, donde se determinarán las causas del incidente y se

elaborarán las propuestas para modificar dichas causas para evitar futuras

repeticiones.

Centros para requerir ayuda médica:

Asistencia general: SAME: Tel.: 107 Hospital Pirovano: Avda. Monroe 3555. Tel.: 4542-5552 / 9279

Intoxicaciones: Hospital de Niños Dr. R. Gutiérrez: Sánchez de Bustamante 1399. Tel.: 4962-6666. Hospital de Niños Dr. P. de Elizalde: Avda. Montes de Oca 40 Tel. 4307-7491. Toxicología: 4300-2115

Quemaduras: Hospital de Quemados: Avda. Pedro Goyena 369. Tel.: 4923-4082 / 3022

Oftalmología

Hospital Santa Lucía: Avda. San Juan 2021. Tel.: 4941-7077 Hospital Dr. P. Lagleyze: Avda. Juan B. Justo 4151. Tel.: 4581-0645 / 2792

Incendios:

1. Mantenga la calma. Lo más importante es ponerse a salvo y dar aviso a los demás.

2. Si hay alarma, acciónela. Si no, grite para alertar al resto.

3. Avise inmediatamente al Departamento de Seguridad y Control (Interno 311)

informando el lugar y las características del siniestro.

4. Si el fuego es pequeño, y sabe utilizar un extintor, úselo. Si el fuego es de

consideración, no se arriesgue y, manteniendo la calma, ponga en marcha el plan de

evacuación.

5. Si debe evacuar el sector, apague los equipos eléctricos y cierre las llaves de gas y

ventanas.

6. Evacue la zona por la ruta asignada.

7. No corra, camine rápido, cerrando a su paso la mayor cantidad de puertas. No utilice

ascensores. Descienda siempre que sea posible.

8. No lleve consigo objetos, pueden entorpecer su salida.

9. Si pudo salir, por ninguna causa vuelva a entrar. Deje que los equipos

especializados se encarguen.

Números telefónicos para requerir ayuda en caso de incendio:

Bomberos: Teléfono 100

División Central de Alarma: Tel.: 4381-2222 / 4383-2222 / 4304-2222.

Cuarlel V de Belgrano: Obligado 2254 Capital. Tel.: 4783-2222

Bomberos de Vicente López: Avda. Maipú 1669, Vicente López. Tel.: 4795-2222

Bomberos de San Isidro: Santa Fe 650, Martínez. Tel.: 4747-2222

Derrame de productos químicos:

1. Atender a cualquier persona que pueda haber sido afectada.

2. Notificar a las personas que se encuentren en las áreas cercanas acerca del

derrame. Colocar la cinta de demarcación para advertir el peligro.

3. Evacuar a toda persona no esencial del área del derrame.

4. Si el derrame es de material inflamable, apagar las fuentes de ignición, y las fuentes

de calor.

5. Debe evitarse la inhalación de los vapores del material derramado. Si es necesario,

utilizar una máscara respiratoria con filtros apropiados al tipo de derrame.

6. Ventilar la zona.

7. Utilizar los elementos de protección personal tales como: equipo de ropa resistente a

ácidos, bases y solventes orgánicos, y guantes.

8. Confinar o contener el derrame, evitando que se extienda. Para ello, extender los

cordones en el contorno del derrame.

9. Luego absorber con los paños sobre el derrame.

10. Dejar actuar y luego recoger con pala. Colocar el residuo en la bolsa roja y cerrarla.

11. Comunicarse con el Servicio de Higiene y Seguridad para disponer la bolsa con los

residuos.

12. Si el derrame es de algún elemento muy volátil dejar dentro de la campana hasta

que lo retire para su disposición.

13. Lavar el área del derrame con H2O y jabón. Secar bien.

14. Retirar y limpiar cuidadosamente todos los elementos que puedan haber sido

salpicados por el derrame.

15. Lavar los guantes, la máscara y ropa.

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CUPÓN PARA ENTREGAR AL DOCENTE

La/El alumna/o ............................................................................................................

de la materia Agrobiotecnología

ha leído minuciosamente la guía de Normas Mínimas de Seguridad que acompaña

esta guía.

Fecha: ...............................................

Firma: ...............................................