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7/28/2019 Aggregation of YG3 Proteins
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A g g r e g a t i o n o f Y G 3 P r o t e i n s :R e l e v a n c
e t o t h e H y p e r v i s c o s i t y S y n d r o m e
J . D . C A P R A a n d H . G . K U N K E LFrom T h e R o c k e
f e l l e r U n i v e r s i t y , New Y o r k 1 0 0 2 1
A B S T R A C T S t u d i e s o n t h e s e r a a n d i s o l a
t e d p r o -t e i n s f r o m 1 4 p a t i e n t s w i t h 7 G 3 m
u l t i p l e m y e l o m a r e -v e a l e d a c o n c e n t r a t
i o n - a n d t e m p e r a t u r e - d e p e n d e n t a g -g r e
g a t i o n w h i c h w a s n o t e n c o u n t e r e d i n 2 6 s e
r a f r o mp a t i e n t s w i t h m u l t i p l e m y e l o m a i
n v o l v i n g o t h e r aG s u b -g r o u p s . When t h e v G 3
m y e l o m a s e r a w e r e d i l u t e d a n dc h a r a c t e r
i z e d b y a n a l y t i c a l u l t r a c e n t r i f u g a t i o
n , c o m -p l e x f o r m a t i o n w a s m i n i m a l . H o w e
v e r , when t h e s e s e r aw e r e e x a m i n e d u n d i l u t
e d , m a r k e d c o m p l e x f o r m a t i o nw a s o b s e r v
e d . S t u d i e s o n t h e i s o l a t e d p r o t e i n s , t h
e i re n z y m a t i c f r a g m e n t s , a s w e l l a s t h e i
r h e a v y a n d l i g h tp o l y p e p t i d e c h a i n s l o c
a l i z e d t h e a g g r e g a t i n g s i t e s t o t h eFd f r a
g m e n t o f t h e h e a v y c h a i n s . T h e f i n d i n g s w
e r e a l s od o c u m e n t e d b y a c r y l a m i d e - g e l e
l e c t r o p h o r e s i s a n d c a p i l -l a r y t u b e v i s
c o m e t r y .T h e h y p e r v i s c o s i t y s y n d r o m e w
a s o b s e r v e d i n s i xp a t i e n t s : t h r e e w i t h '
v G 3 m y e l o m a a n d t h r e e w i t h y G 1m y e l o m a . I
n t h e l a t t e r g r o u p e x t r e me p r o t e i n c o n c e
n -t r a t i o n s a p p e a r e d e s s e n t i a l f o r t h e d
e v e l o p m e n t o f t h ec l i n i c a l s y m p t o m s . T h
e y G 3 c a s e s , h o w e v e r , b e c a u s eo f t h e a g g r
e g a t i o n p h e n o m e n o n , s h o w e d t h e s y n d r o m
e a tr e l a t i v e l y l o w p r o t e i n c o n c e n t r a t i
o n s .
INTRODUCTIONP r e v i o u s s t u d i e s h a v e d o c u m e n
t e d t h e e x i s t e n c e o f a tl e a s t f o u r s u b g r o
u p s o f Y G g l o b u l i n b a s e d o n a n t i g e n i cd i f
f e r e n c e s i n t h e i r h e a v y p o l y p e p t i d e c h a
i n s ( 1 , 2 ) .W h i l e t h e a G 3 ( V i y 2 c ) s u b g r o u
p a c c o u n t s f o r o n l y 8%o f t h e n o r m a l aG g l o b
u l i n a n d a s i m i l a r p e r c e n t a g e o f- y G m y e l
o m a p r o t e i n s ( 3 ) , s e v e r a l l i n e s o f e v i d e
n c e s u g -g e s t t h a t t h i s s u b g r o u p p l a y s a s
i g n i f i c a n t r o l e i n h u m a ni m m u n o l o g y . I t
i s k n o w n t h a t 7 G 3 p r o t e i n s a r e c a t a b o -l i
z e d a t a f a s t e r r a t e t h a n a n y o t h e r a G g l o b
u l i n s ( 4 , 5 )a n d t h e q u a n t i t a t i v e l e v e l o
f a G 3 i n s e r u m i s i n f l u e n c e db y t h e s p e c i f
i c g e n e t i c m a k e u p o f t h e i n d i v i d u a l ( 3 )
.P a t i e n t s w i t h h y p o g a m m a g l o b u l i n e m i a
h a v e b e e n s h o w nt o h a v e a d i s p r o p o r t i o n a
t e i n c r e a s e i n 7 G 3 g l o b u l i n ( 6 ) .C r y o g l o
b u l i n s o f t h e aG t y p e w i t h r h e u m a t o i d f a c
t o r
R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 2 7 A u g u s t 1 9
6 9 .
a c t i v i t y a r e p r e d o m i n a t e l y ' G 3 p r o t e
i n s ( 7 ) a n d p r e -l i m i n a r y e v i d e n c e s u g g e
s t s t h a t Y G 3 p r o t e i n s a r e i m -p o r t a n t i n t
h e b i n d i n g o f c o m p l e m e n t . 'An i n t e r e s t i n
g p h y s i c a l p r o p e r t y o f 7 G 3 p r o t e i n s o fb o
t h n o r m a l s e r a a n d m y e l o m a s e r a h a s b e e n t
h e i r p a r -t i a l a d s o r p t i o n n e a r t h e w e l l o
f o r i g i n i n i m m u n o e l e c t r o -p h o r e s i s ( 3 )
. E v e n i s o l a t e d Y G 3 p r o t e i n s t h a t h a v e b e
e np u r i f i e d f r e q u e n t l y s h o w a c h a r a c t e r
i s t i c b i p h a s i c p a t -t e r n i n t h e a g a r s y s t
e m . I n t h e p r e s e n t s t u d y t h i s p h e -n o m e n a
h a s b e e n f u r t h e r i n v e s t i g a t e d a n d a c o n c
e n t r a -t i o n a n d t e m p e r a t u r e - d e p e n d e n t
a g g r e g a t i o n o f t h e s ep r o t e i n s h a s b e e n d
e l i n e a t e d . T h i s a g g r e g a t i o n a p p a r -e n t
l y p l a y s a m a j o r r o l e i n t h e h y p e r v i s c o s i
t y s y n d r o m ew h i c h o c c a s i o n a l l y a c c o m p a
n i e s m u l t i p l e m y e l o m a ( 8 ,9 ) a n d m ay b e t h e
e x p l a n a t i o n f o r t h e r a p i d c a t a b o l i s ma n
d s p e c i a l c o m p l e m e n t b i n d i n g o f Y G 3 p r o t
e i n s .
A g g r e g a t e s w i t h S v a l u e s o f 9 - 1 5 S a r e f
r e q u e n t l ye n c o u n t e r e d i n yA m y e l o m a a n d a
r e d u e t o S - S b r i d g e s( 1 0 ) . P r e s u m a b l y t h
e s e s t a b l e h i g h m o l e c u l a r w e i g h ta g g r e g
a t e s a r e r e s p o n s i b l e f o r t h e o c c a s i o n a l
o c c u r r e n c eo f t h e h y p e r v i s c o s i t y s y n d r
o m e i n Y A m y e l o m a ( 1 1 ) .S m i t h , K o c h w a , a n
d W a s s e r m a n ( 1 2 ) w e r e t h e f i r s t t od e m o n s
t r a t e a g g r e g a t e f o r m a t i o n i n h y p e r v i s c
o s i t y s y n -d r o m e i n ' Y G m y e l o m a . , T h e s e a
g g r e g a t e s w e r e i s o l a t e da n d f o u n d t o b e a
c i d d i s s o c i a b l e i n d i c a t i n g t h a t t h e i n t
e r -m o l e c u l a r b o n d s w e r e n o n c o v a l e n t . S
i n c e t h e i r r e p o r t ,h o w e v e r , o t h e r w o r k e
r s h a v e f a i l e d t o d o c u m e n t a g -g r e g a t e f o
r m a t i o n i n t h e h y p e r v i s c o s i t y s y n d r o m e
i n 7 Gm y e l o m a d e s p i t e a n a l y t i c a l u l t r a c
e n t r i f u g a t i o n ( 1 3 - 1 5 ) .
METHODSI s o l a t i o n , p u r i f i c a t i o n , a n d c h a
r a c t e r i z a t i o n o f m y e l o m ap r o t e i n s . M y e
l o m a p r o t e i n s w e r e i s o l a t e d b y z o n e e l e c
t r o -p h o r e s i s o n p o l y v i n y l c o p o l y m e r ( P
e v i k o n ) . F u r t h e r p u r i -f i c a t i o n w a s a c c
o m p l i s h e d b y g e l f i l t r a t i o n o n S e p h a d e
xG - 2 0 0 e q u i l i b r a t e d w i t h 0 . 1 M t r i s ( h y d
r o x y m e t h y l ) a m i n o -m e t h a n e ( T r i s ) a n d 0
. 5 M s o d i u m c h l o r i d e . T h e i s o l a t e d p r o -t
e i n s w e r e c o n c e n t r a t e d b y vacuum d i a l y s i s
o r b y d i a l y s i sa g a i n s t p o l y e t h y l e n e g l y
c o l . F o r d e t e r m i n a t i o n o f m o l e c u l a rw e i
g h t b y l o w s p e e d a n a l y t i c a l u l t r a c e n t r i
f u g a t i o n a n a d d i -' M u l l e r - E b e r h a r d . 1 9
6 8 . A d v a n . I m m u n o l . 8 : 1 .
6 1 0 T h e J o u r n a l o f C l i n i c a l I n v e s t i g a
t i o n V o l u m e 4 9 1 9 7 0
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t i o n a l p u r i f i c a t i o n s t e p w a s u t i l i z e
d . A f t e r S e p h a d e x G - 2 0 0c h r o m a t o g r a p h y
e a c h p r o t e i n w a s c o n c e n t r a t e d b y v a c u u
md i a l y s i s i n m e m b r a n e s w h i c h w i l l e x c l u
d e m a t e r i a l o f l e s st h a n 7 0 , 0 0 0 m o l e c u l a
r w e i g h t . E a c h p r e p a r a t i o n was t h e nc e n t r
i f u g e d a t 3 5 , 0 0 0 r p m i n a S p i n c o m o d e l L p r
e p a r a t i v e- u l t r a c e n t r i f u g e f o r 2 h r a t 4
V C i n a s w i n g i n g b u c k e t r o t o r .T h e t o p o n e
- t h i r d w a s a s p i r a t e d a n d u s e d f o r m o l e c u
l a rw e i g h t m e a s u r e m e n t s b y t h e f i e l d r e l
a x a t i o n t e c h n i q u e . ' y Gs u b g r o u p a n a l y s
i s a n d Gm t y p i n g w e r e d o n e a s d e s c r i b e dp r e
v i o u s l y ( 1 , 1 6 ) .E n z y m a t i c c l e a v a g e o f -
y - g l o b u l i n . F a b a n d F c f r a g m e n t so f m y e l
o m a p r o t e i n s w e r e p r e p a r e d b y p a p a i n d i g
e s t i o n ( 1 7 )u s i n g a p r o t e i n : e n z y m e r a t i
o o f 5 0 : 1 . - y G 3 p r o t e i n s w e r es u b j e c t e d t
o e n z y m a t i c d i g e s t i o n f o r 3 0 m i n a t 3 7 0 C i
n t h ep r e s e n c e o f 0 . 0 1 M c y s t e i n e a n d 0 . 0 0
2 M EDTA a t pH 7 . 4 .- y G l p r o t e i n s w e r e d i g e s t
e d f o r 1 6 h r . T h e r e a c t i o n w a ss t o p p e d b y d
i a l y s i s a g a i n s t c o l d s a l i n e , a n d F a b a n d
F c w e r es e p a r a t e d b y z o n e e l e c t r o p h o r e s
i s o n P e v i k o n . T h e y w e r et h e n c o n c e n t r a t
e d b y v a c u u m d i a l y s i s a n d f u r t h e r p u r i f i
e db y g e l f i l t r a t i o n b y S e p h a d e x G - 1 0 0 c h
r o m a t o g r a p h y . E n z y -m a t i c f r a g m e n t s w e
r e t e s t e d f o r p u r i t y b y i m m u n o e l e c t r o -p
h o r e s i s a n d O u c h t e r l o n y a n a l y s i s w i t h a
p p r o p r i a t e a n t i s e r a .P e p s i n d i g e s t i o n
w a s a c c o m p l i s h e d i n pH 4 . 0 a c e t a t eb u f f e r
w i t h a p r o t e i n : e n z y m e r a t i o o f 5 0 : 1 . D i g
e s t i o n p r o -c e e d e d a t 3 7 0 C f o r 2 4 h r a n d w a
s t e r m i n a t e d b y d i a l y s i sa t 4 V C a g a i n s t pH
7 . 2 p h o s p h a t e - b u f f e r e d s a l i n e ( P B S ) .T
h e 5 S p e p s i n ( F a b ' ) 2 f r a g m e n t w a s t h e n i s
o l a t e d b y S e p h a -d e x G - 2 0 0 c h r o m a t o g r a p
h y a n d p u r i t y w a s a s c e r t a i n e d b yu l t r a c e
n t r i f u g a t i o n , i m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s
, a n d a c r y l a m i d e -g e l e l e c t r o p h o r e s i s .P
r e p a r a t i o n o f H a n d L c h a i n s . I s o l a t e d m y
e l o m a p r o -t e i n s a t 1 0 m g / m l w e r e d i a l y z e
d i n t o 0 . 5 M T r i s b u f f e r pH8 . 6 . T h e b u f f e r w
a s t h e n m a d e 0 . 1 M i n p - m e r c a p t o e t h a n o la
n d d i a l y s i s w a s c o n t i n u e d o v e r n i g h t a t 4
C . T h e b u f f e rw a s t h e n m a d e 0 . 1 5 M i n i o d o a
c e t a m i d e a n d d i a l y s i s w a sc o n t i n u e d f o r
2 4 h r a t 4 C . C h a i n s e p a r a t i o n w a s a c c o m -p
l i s h e d b y d i a l y z i n g a g a i n s t 1 M p r o p i o n i
c a c i d a t 4 C f o r7 2 h r . S e p a r a t i o n o f H a n d L
c h a i n s w a s p e r f o r m e d b y g e lf i l t r a t i o n o
n a S e p h a d e x G - 2 0 0 c o l u m n i n 1 M p r o p i o n i c
a c i da n d 0 . 0 0 1 M i o d o a c e t a m i d e . C h a i n s w
e r e c o n c e n t r a t e d b yd i a l y s i s a g a i n s t p o
l y e t h y l e n e g l y c o l i n 0 . 5 M p r o p i o n i c a c i
d .F o r s o m e e x p e r i m e n t s u t i l i z i n g a c r y l
a m i d e - g e l e l e c t r o p h o r e -s i s w h o l e m y e b
o m a p r o t e i n s w e r e r e d u c e d a n d a l k y l a t e d
i ns m a l l v o l u m e s a n d p l a c e d d i r e c t l y o n t
h e g e l s . C h a i n s e p a r a -t i o n i n t h e s e i n s t
a n c e s w a s a c c o m p l i s h e d b y t h e g e l s t h e m
-s e l v e s . F o r a c i d - u r e a g e l s , u r e a w a s a d
d e d t o t h e r e d u c e d a n da l k y l a t e d p r o t e i n
s a s i t w a s t o a l l s a m p l e s b e f o r e p l a c i n gt
h e m o n t h e g e l s .R a d i o i o d i n a t i o n . 5 0 m g o
f i s o l a t e d m y e l o m a p r o t e i n s G . J .a n d E . T
. w e r e s e p a r a t e l y d i s s o l v e d i n 1 0 c c o f 0 .
0 5 M p h o s -p h a t e b u f f e r pH 7 . 0 . A m o d i f i c a t
i o n o f t h e c h l o r a m i n e Tm e t h o d o f M c C o n a h
e y a n d D i x o n ( 1 8 ) w a s u s e d t o l a b e lG . J . w i
t h ' I a n d E . T . w i t h ' I . 5 , u g c h l o r a m i n e T p
e rm g p r o t e i n a n d 5 , g s o d i u m m e t a b i s u l f i
t e p e r m g p r o t e i nw a s u s e d . O v e r 9 7 % o f t h e
r a d i o a c t i v i t y w a s p r e c i p i t a t e dw i t h 1 0
% o t r i c h l o r o a c e t i c a c i d . R a d i o a c t i v i t
y w a s m e a s u r e do n a d u a l c h a n n e l s c i n t i l l
a t i o n c o u n t e r ( N u c l e a r - C h i c a g oA u t o m a
t i c Gamma C o u n t e r , m o d e l 4 2 3 3 ) . A f t e r r a d i
o -i o d i n a t i o n t h e l a b e l e d p r o t e i n s w e r e
p u r i f i e d o n a S e p h a d e xG - 2 0 0 c o l u m n i n o r
d e r t o r e m o v e h i g h e r m o l e c u l a r w e i g h ta g
g r e g a t e s .R e c o m b i n a t i o n o f m y e l o m a p r o
t e i n s . R e c o m b i n a t i o n a n dr e o x i d a t i o n o
f t h e l a b e l e d m y e l o m a p r o t e i n s w a s a c c o m
-p l i s h e d b y a m o d i f i c a t i o n o f t h e m e t h o d
o f O l i n s a n d E d e l -m an ( 1 9 ) . E a c h o f t h e r a d
i o l a b e l e d a n d c o l u m n - p u r i f i e dp r o t e i n
s w a s r e d u c e d w i t h g - m e r c a p t o e t h a n o l a n
d d i a l y z e d
a g a i n s t 1 M p r o p i o n i c a c i d f o r 7 2 h r . C h
a i n s e p a r a t i o n wasa c c o m p l i s h e d o n a S e p h
a d e x G - 2 0 0 c o l u m n m a d e 1 M i np r o p i o n i c a c
i d a n d 0 . 0 1 M m e r c a p t o e t h a n o l . H y b r i d m o
l e c u l e sw e r e f o r m e d u s i n g H c h a i n s f r o m a
- y G 3 m y e l o m a p r o t e i nl a b e l e d w i t h ' I ( G .
J . ) a n d t h e l i g h t c h a i n s f r o m a - y G lm y e l o
m a p r o t e i n l a b e l e d w i t h ' I ( E . T . ) . R e c o m
b i n a t i o nw a s u s u a l l y d o n e o n a m i l l i g r a m
p e r m i l l i g r a m b a s i s o f Hc h a i n p e r L c h a i n
. S i m i l a r h y b r i d s w e r e m a d e w i t h a ' y G lh e
a v y c h a i n a n d t h e l i g h t c h a i n s d e r i v e d f r
o m a - y G 3 p r o t e i n .A f t e r p r o l o n g e d d i a l y
s i s a g a i n s t a c i d a n d t h e n n e u t r a l b u f -f e
r s c o n t a i n i n g 0 . 0 0 1 m e r c a p t o e t h a n o l , d
i a l y s i s w a s c o n -t i n u e d f o r 7 2 h r a g a i n s t
p h o s p h a t e - b u f f e r e d s a l i n e pH 7 . 2w i t h no
m e r c a p t o e t h a n o l . T h e r e c o m b i n e d m o l e c
u l e s w e r et h e n c o n c e n t r a t e d s l o w l y b y d i
a l y s i s a g a i n s t 3% p o l y e t h y l e n eg l y c o l
(PEG) i n 1 M p r o p i o n i c a c i d . T h e y w e r e t h e n p
u r i -f i e d o n S e p h a d e x G - 2 0 0 c o l u m n s m a d e
1 M i n p r o p i o n i c a c i d .T h e - y G p e a k u s u a l l
y a c c o u n t e d f o r o v e r 8 0 % o o f t h e r a d i o -a c
t i v i t y . T h i s w a s p o o l e d a n d c o n c e n t r a t e
d b y d i a l y s i sa g a i n s t 3 % o P E G a n d t h e n u t i
l i z e d i n t h e a c r y l a m i d e - g e le l e c t r o p h o
r e s i s e x p e r i m e n t s . I n m o s t e x p e r i m e n t s
r e c o m -b i n e d m ol e c u l es c o n t a i n e d f r o m 1 .
1 7 t o 1 . 2 5 m o l e s o f H c h a i np e r L c h a i n .A n a l
y t i c a l u l t r a c e n t r i f u g a t i o n . A S p i n c o m
o d e l E a n a -l y t i c a l u l t r a c e n t r i f u g e e q u
i p p e d w i t h s c h l i e r e n o p t i c s w a su s e d f o r
a l l s t u d i e s . U n l e s s o t h e r w i s e n o t e d , s t
u d i e s w e r ep e r f o r m e d i n 1 2 mm d o u b l e - s e c t
o r c e l l s a t 2 0 ' C a n d 5 2 , 6 4 0r p m . P l a t e m e a
s u r e m e n t s w e r e m a d e a c c o r d i n g t o p r o c e d
u r e sd e s c r i b e d b y T r a u t m a n ( 2 0 ) . I n c o r r
e c t i n g t h e s e d i m e n t a t i o nc o e f f i c i e n t s
t o t h e S a o , v a l u e t h e p a r t i a l s p e c i f i c v o
l u m e w a sa s s u m e d t o b e 0 . 7 3 . S t u d i e s w e r e
d o n e o n u n d i l u t e d s e r a ,s e r a d i l u t e d 1 : 1
w i t h P BS a n d w i t h p u r i f i e d m y e l o m a p r o -t e
i n s a n d t h e i r f r a g m e n t s i n P B S . S e d i m e n t
a t i o n c o n s t a n t sa t i n f i n i t e d i l u t i o n were
d e r i v e d f r o m p l o t s o f s 2 o , , 0 v s . c o n -c e n
t r a t i o n .M o l e c u l a r w e i g h t s w e r e d e t e r m
i n e d b y t h e m e t h o d o fK e g e l e s a n d S i a ( 21 ) u
si n g t h e f i e l d r e l a x a t i o n p r o c e d u r e .F l u
o r o c h e m i c a l F c 4 3 ( B e c k m a n / S p i n c o D i v i
s i o n , P a l o A l t o ,C a l i f . ) w a s u s e d i n a c a p
i l l a r y s y n t h e t i c b o u n d a r y - c e l l .M o l e c
u l a r w e i g h t s w e r e d e t e r m i n e d i n pH 7 . 2 PBS
a s w e l la s 0 . 1 M a c e t a t e b u f f e r pH 4 . 0 . I n e a
c h s t u d y t h e p r o t e i nc o n c e n t r a t i o n w a s 8
. 0 + 0 . 2 m g / c c . C o m p u t a t i o n o f t h em o l e c u
l a r w e i g h t a t t h e c e l l b o t t o m w a s m a d e f r o
m t h ef o l l o w i n g e q u a t i o n :
RT d cM = - d r b( 1 - V p ) r b ( A l + A 2 ) W 2
w h e r e M. i s t h e w e i g h t a v e r a g e m o l e c u l a
r w e i g h t a t t h ec e l l b o t t o m , d c i s t h e e x t r
a p o l a t e d d e f l e c t i o n a b o v e t h ed r be s t i m a
t e d b a s e l i n e o f t h e s c h l i e r e n d i a g r a m a t
t h e l o w e rm e n i s c u s , r b i s t h e a b s o l u t e p o
s i t i o n i n t h e c e l l a n d A 1 a n dA 2 t h e a r e a s b
e l o w t h e f r e e p e a k a n d t h e p e a k n e a r t h ec e
l l b o t t o m . T h e s e a r e a s w e r e m e a s u r e d b y t
h e t r a p a z o i dm e t h o d .A c r y l a m i d e - g e l e l e
c t r o p h o r e s i s . A c i d - a c r y l a m i d e - g e l e l
e c -t r o p h o r e s i s w a s p e r f o r m e d i n a n E - C A
p p a r a t u s C o r p .v e r t i c a l g e l e l e c t r o p h o
r e s i s c e l l . T h e b a s i c p r o c e d u r e w a s t h eC
a n a l c o m o d i f i c a t i o n o f t h e s y s t e m o f W i l
l i a ms a n d R e i s -f i e l d ( 2 2 ) . T h e a c i d g e l b u
f f e r w a s K O H - c i t r i c a c i d pH2 . 9 w h i l e t h e t
a n k b u f f e r w a s g l y c i n e - c i t r a t e pH 4 . 0 . F
o ru r e a - a c i d g e l s b o t h t h e g e l a n d t h e t a n
k b u f f e r s c o n t a i n e d8 M u r e a . 7 . 5 % o a c r y l
a m i d e g e l s w e r e c o n s t r u c t e d f r o m as t o c k
s o l u t i o n ( 5 % o b i s a c r y l a m i d e , 9 5 % o a c r y
l a m i d e ) w h i c hc o n t a i n e d a s c o r b i c a c i d ,
f e r r o u s s u l f a t e , a n d 0 . 0 0 1 M i o d o -
A g g r e g a t i o n o f -G3 P r o t e i n s 6 1 1
-
7/28/2019 Aggregation of YG3 Proteins
3/12
a c e t a m i d e . G e l s w e r e p o l y m e r i z e d b y t
h e a d d i t i o n o f 5 - 1 0/ A l o f 3 0 % c o l d h y d r o g
e n p e r o x i d e ( 2 3 ) . A c i d g e l s w e r er u n f o r 4
h r a t 3 0 0 v w h i l e a c i d - u r e a g e l s w e r e r u n f
o r8 - 1 2 h r . T h e s l a b s w e r e s t a i n e d w i t h a m
i d o b l a c k 0 . 2 5 % oi n m e t h a n o l : w a t e r g l a c
i a l a c e t i c a c i d 5 : 5 : 1 . D e s t a i n i n gw a s a c
c o m p l i s h e d i n a n e l e c t r o p h o r e t i c d e s t a
i n e r ( E - CA p p a r a t u s C o r p . ) i n a s i m i l a r s
o l u t i o n w i t h o u t a m i d o b l a c k .T e s t s f o r a
n t i - y - g l o b u l i n a c t i z i t y . T h e Rh a g g l u t
i n a t i o nt e s t w a s d o n e a c c o r d i n g t o W a l l e
r a n d V a u g h a n ( 2 4 ) .A n t i - C D s e r u m R i p l e y
( k i n d l y s u p p l i e d b y D r . M a r i o nW a l l e r , R
i c h m o n d , V a . ) w a s u s e d f o r t h e s e s t u d i e s
. T h el a t e x f i x a t i o n t e s t w a s o b t a i n e d f r
o m H y l a n d L a b o r a t o r i e s ,L o s A n g e l e s , C a
l i f . ( R A - T e s t ) . B o t h t h e Rh a g g l u t i n a t i
o nt e s t a n d t h e l a t e x f i x a t i o n t e s t w e r e p
e r f o r m e d a t 4 0a n d 2 2 0 C .I n s e p a r a t e e x p e r
i m e n t s F a b a n d ( F a b ' ) 2 f r o m e a c h p r o -t e i
n w e r e m i x e d w i t h n o r m a l y - g l o b u l i n a s w e
l l a s i s o l a t e dm y e l o m a p r o t e i n s f r o m e a c
h - y G h e a v y - c h a i n s u b c l a s s a n de x a m i n e d
i n t h e a n a l y t i c a l u l t r a c e n t r i f u g e f o r i
n t e r a c t i o n s .T h e a r e a u n d e r t h e c u r v e o f
F a b o r ( F a b ' ) 2 w a s c o m p a r e dt o t h e s a m e m a
t e r i a l i n a w e d g e c e l l w i t h o u t a d d i t i o n a
l- y - g l o b u l i n i n o r d e r t o a s s e s s f o r c o m p
l e x f o r m a t i o n .T e s t f o r c r y o g l o b u l i n s .
A t t e m p t s w e r e m a d e t o d e m o n -s t r a t e s i g n
i f i c a n t a m o u n t s o f c r y o g l o b u l i n s i n e a c
h o f t h es e r a . D e s p i t e p r o l o n g e d s t a n d i n
g i n t h e c o l d , d i l u t i o n , a n d pHc h a n g e s f r o
m 5 t o 8 . 5 n o c r y o p r o t e i n s w e r e e v i d e n t . I
n af i n a l a t t e m p t e a c h s e r u m w a s s p u n a t 3 5
, 0 0 0 r p m i n a nSW 3 9 R o t o r o f a S p i n c o m o d e l L
u l t r a c e n t r i f u g e f o r 1 8 h ra t 4 C . No c r y o p r
e c i p i t a t e w a s e v i d e n t i n t h e b o t t o m o f a n
yt u b e .V i s c o s i t y s t u d i e s . A l l s o l u t i o n s
i n t r o d u c e d i n t o t h e v i s -c o m e t e r s w e r e f
i l t e r e d r e p e a t e d l y t h r o u g h a M i l l i p o r e
f i l t e rp a d . T h e d e n s i t y o f t h e s o l u t i o n s
w a s m e a s u r e d w i t h a 5 m lc a p i l l a r y v e n t p y
k n o m e t e r . C a p i l l a r y v i s c o s i t y m e a s u r e
m e n t sw e r e d o n e i n a c o n s t a n t t e m p e r a t u r
e b a t h u t i l i z i n g a nO s t w a l d V i s c o m e t e r .
P h o s p h a t e - b u f f e r e d s a l i n e w a s t h er e f e
r e n c e s o l v e n t i n a l l s t u d i e s . M e a s u r e m e
n t s w e r e p e r -f o r m e d a t 4 0 , 2 0 0 , 2 2 0 , a n d 3
7 0 C a n d e a c h d e t e r m i n a t i o n w a st h e a v e r a
g e o f t h r e e s e p a r a t e s t u d i e s .
T h e s p e c i f i c v i s c o s i t y w a s d e r i v e d f r
o m t h e e x p r e s s i o n :V O p = X 7 r e 1 - 1 . T h e i n t
r i n s i c v i s c o s i t y w a s d e t e r m i n e d b y ap l o
t o f 1 p . / c v s . C w h e r e C r e p r e s e n t s t h e p r o
t e i n c o n c e n -t r a t i o n i n g r a m s p e r c u b i c c
e n t i m e t e r . S t u d i e s w e r e p e r -f o r m e d o v e
r a p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n r a n g e o f 0 . 0 0 1
- 0 . 0 6 7g / c c .A m o d i f i e d v e r s i o n o f t h e G . D
. M. v i s c o m e t e r w a s u s e dt o d e t e r m i n e t h e v
i s c o s i t y a t l o w s h e a r r a t e s ( 2 5 ) . T h e p r i
n -c i p l e o f t h i s v i s c o m e t e r , w h i c h c o n s i
s t s o f c o a x i a l c y l i n d e r ss e p a r a t e d b y a s
m a l l a n u l u s i n w h i c h t h e s a m p l e i s l o c a t e
dh a s b e e n d e s c r i b e d ( 2 6 , 2 7 ) . U t i l i z i n g
a w a t e r b a t h c o n -n e c t e d t o a c h a n n e l i n s i
d e t h e r o t o r a n d a t h e r m i s t o r c o n -n e c t e d
t o a t h e r m o r e g u l a t o r a t t h e e x i t f r o m t h e
c h a n n e l ,s a m p l e t e m p e r a t u r e c o u l d b e m a
i n t a i n e d a t + 0 . 1 0 C . S t u d i e sw e r e d o n e a t
4 0 , 2 0 0 , a n d 3 7 0 C . M e a s u r e m e n t s w e r e p e r
-f o r m e d a t f i v e s h e a r r a t e s ( 5 2 , 5 . 2 , 0 . 5
2 , 0 . 1 0 4 , a n d 0 . 0 5 2s e c 1 ) .
RESULTSA n a l y t i c a l u l t r a c e n t r i f u g a t i o n
o f s e r u m a n d i s o l a t e dm y e l o m a p r o t e i n s .
When aG3 m y e l o m a s e r a w e r e d i -l u t e d 1 : 1 w i t h
p h o s p h a t e - b u f f e r e d s a l i n e a n d s t u d i e d
i nt h e a n a l y t i c a l u l t r a c e n t r i f u g e t h e y
d i d n o t a p p e a r c o n -s p i c u o u s l y d i f f e r e n
t f r o m t h e s e r a f r o m p a t i e n t s w i t hm u l t i p
l e m y e l o m a i n v o l v i n g o t h e r s u b g r o u p s ( F
i g . 1 ,t o p ) . H o w e v e r , when s t u d i e d u n d i l u t
e d , m a r k e d d i f -f e r e n c e s w e r e o b v i o u s ( F
i g . 1 , b o t t o m ) . S e v e n -G3m y e l o m a s e r a w e r
e s t u d i e d a n d e a c h s h o w e d a s h e l f o f
c o m p l e x e s a r i s i n g f r o m t h e 7 S p e a k a n d
m o v i n g t o t h eb o t t o m o f t h e c e l l . T h a t t h i
s was n o t a n a r t i f a c t o f e x -a m i n i n g u n d i l u
t e d s e r a w a s s h o w n b y t h e f a c t t h a t i nt h e u
n d i l u t e d s e r a o f s e v e r a l p a t i e n t s w i t h m
u l t i p l e m y e -l o m a i n v o l v i n g o t h e r s u b g r
o u p s n o s u c h c o m p l e x e s w e r en o t e d ( F i g . 1
, E . T . ) . I n a d d i t i o n , u n d e r t h e s e c o n d i
-d i t i o n s m a r k e d c o n v e c t i v e d i s t u r b a n c
e s w e r e n o t e d o n l y
S e r u m d i l u t e dI . I w i t h p h o s p h a t e 4 ]b u f
f e r e d s a l i n e
U n d i l u t e d s e r u m
G . J . y G 3 X P W . y G 3 K A . L . y G 3 X E TlG I 1 KF I G U
R E 1 A n a l y t i c a l u l t r a c e n t r i f u g e a n a l y s
i s o f t h r e e s e r a f r o m p a t i e n t sw i t h y G 3 m u
l t i p l e m y e l o m a ( G . J . , P . W . , a n d A . L . ) a n
d s e r u m E . T .- y G 1 . E a c h p h o t o g r a p h w a s t a
k e n 6 4 m i n a f t e r r e a c h i n g s p e e d o f 5 2 , 6 4
0r p m . T h e s h e l f o f a g g r e g a t i n g m a t e r i a l
i s o n l y s e e n i n t h e u n d i l u t e ds e r a o f t h e '
y G 3 c a s e s .
6 1 2 J . D . C a p r a a n d H . G . K u n k e l
-
7/28/2019 Aggregation of YG3 Proteins
4/12
i n t h e u n d i l u t e d s e r a o f t h e p a t i e n t s w
i t h ' v G 3 m y e l o m a .T h e a m o u n t o f c o m p l e x e
s s e e n w a s c o r r e l a t e d w i t h t h ea m o u n t o f m
y e l o m a p r o t e i n i n t h e p a t i e n t ' s s e r u m a n
d' v G 3 m y e l o m a s e r a w i t h l e s s t h a n 1 5 m g / m
l o f m y e -l o m a p r o t e i n d i d n o t r e a d i l y d e m
o n s t r a t e c o m p l e xf o r m a t i o n o n a n a l y t i c
a l u l t r a c e n t r i f u g a t i o n .
I n o r d e r t o d e t e r m i n e t h e s e d i m e n t a t i
o n c o n s t a n t f o rt h e s e ' G 3 p r o t e i n s t h r e e
o f t h e i s o l a t e d m y e l o m a p r o t e i n sw e r e s e
d i m e n t e d a t v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s a n d
o n S v s .C p l o t w a s c o n s t r u c t e d ( F i g . 2 ) . P
r o t e i n G . J . h a d a ne x t r a p o l a t i n g v a l u e o
f 6 . 7 2 a t i n f i n i t e d i l u t i o n . P r o t e i nA . L
. h a d a v a l u e o f 6 . 8 1 a n d p r o t e i n P . W. w a s 6
. 7 8 .A t h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s e a c h i s o l
a t e d m y e l o m a p r o t e i nw a s s e e n t o a g g r e g a
t e a n d t h e S v a l u e r e p o r t e d i n b a s e do n t h e
a n a l y s i s o f t h e m a i n p e a k a l o n e ( F i g . 2 ) .
T h er a d i u s o f g y r a t i o n o f e a c h p r o f i l e w a
s c a l c u l a t e d w i t ht h e a i d o f a c o m p u t e r p r
o g r a m . I n e a c h c a s e , w i t h i n -c r e a s i n g p r
o t e i n c o n c e n t r a t i o n t h e r e w a s a c c e l e r a
t e ds k e w i n g o f t h e s c h l i e r e n p r o f i l e t o w
a r d s t h e b a s e o f t h ec e l l . T h u s , t h e i n c r e
a s e i n t h e r a d i u s o f g yr a t i o n s u g -g e s t s t h
a t t h e h e a v i e r c o m p o n e n t s s e e n a t h i g h e r
c o n -c e n t r a t i o n s a r e t h e p r o d u c t o f t h e h
i g h e r c o n c e n t r a t i o na n d n o t s e c o n d a r y t
o b e t t e r v i s u a l i z a t i o n o f t h e s e c o m -p o n
e n t s . E a c h o f t h e i s o l a t e d p r o t e i n s w a s d
i a l y z e da g a i n s t a c e t a t e a n d p h o s p h a t e b
u f f e r s r a n g i n g f r o m pH4 . 0 t o 8 . 0 . E a c h s o l
u t i o n w a s t h e n a d j u s t e d t o 2 0 mg/mla n d s t u d
i e d i n t h e a n a l y t i c a l u l t r a c e n t r i f u g e .
C o m p l e x
6 . 0
S 2 0 , w
f o r m a t i o n w a s m a x i m a l a t pH 6 . 8 . T h i s i s
i l l u s t r a t e d i na l a t e r s e c t i o n f o r ' v G 3 f
r a g m e n t s ( F i g . 6 ) .
L o w - s p e e d d e t e r m i n a t i o n s o f m o l e c u l
a r w e i g h t s w e r ep e r f o r m e d i n a n a t t e m p t t
o r u l e o u t a n e f f e c t o f t h ee x t r e m e p r e s s u
r e s i n t h e c e l l d u r i n g h i g h - s p e e d c e n t r i
-f u g a t i o n c o n t r i b u t i n g t o t h e c o m p l e x i
n g p h e n o m e n o n .F o r t h e s e s t u d i e s s p e c i a
l c a r e w a s t a k e n t h a t t h e i s o -l a t e d p r o t e
i n s d i d n o t c o n t a i n s t a b l e a g g r e g a t e s w h
i c hm i g h t h a v e a r i s e n f r o m t h e i s o l a t i o n
p r o c e d u r e ( s e eM e t h o d s ) . As i l l u s t r a t e d
i n F i g . 3 t h e w e i g h t a v e r a g em o l e c u l a r w e
i g h t a t t h e b o t t o m o f t h e c e l l w a s c o n -s i d
e r a b l y h i g h e r i n t h e i s o l a t e d p r o t e i n f r
o m p a t i e n tG . J . w i t h a G 3 m y e l o m a t h a n t h e
p r o t e i n i s o l a t e d f r o mE . T . who h a d Y G I m u l
t i p l e m y e l o m a . I n e a c h c a s e t h em o l e c u l a
r w e i g h t d e t e r m i n e d i n pH 4 . 0 a c e t a t e b u f
f e rc o m p a r e d f a v o r a b l y w i t h t h e a c c e p t e
d v a l u e s f o r Y Gg l o b u l i n i n t h e l i t e r a t u r
e .
A c r y l k m i d e - g e l e l e c t r o p h o r e s i s . A c
r y l a m i d e - g e l e l e c -t r o p h o r e s i s p r o v e d
t o b e a s e n s i t i v e t e c h n i q u e f o r d e m -o n s t
r a t i n g a g g r e g a t i o n p h e n o m e n a , a p p a r e n
t l y b e c a u s eo f t h e c o n c e n t r a t i n g e f f e c t
t h a t - o c c u r s b e f o r e e n t r a n c ei n t o t h e g e
l . T h e c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t a g g r e g
a t i o nw a s s e e n e v e n a t l o w p H . T h u s w h i l e a
t pH 4 . 0 n oa g g r e g a t i o n c o u l d b e d e m o n s t r a
t e d i n t h e a n a l y t i c a lu l t r a c e n t r i f u g e ,
a g g r e g a t i o n w a s c l e a r l y s e e n i n a c r y l a
-m i d e g e l s a t p H ' s a s l o w a s 2 . 9 . F i g . 4 r e p
r e s e n t s a na c i d - a c r y l a m i d e - g e l e l e c t r
o p h o r e s i s o f s e v e n s e r a f r o m
1 0 2 0 3 0m g / c c
F I G u R E 2 T h e c o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n c
e o f s e d i m e n t a t i o n o f G . J . i s o l a t e d ' y G
3p r o t e i n . The e x t r a p o l a t e d v a l u e o f s a o ,
. ( i n S v e d b e r g u n i t s ) a t i n f i n i t e d i l u t i
o nw a s 6 . 7 2 . T h e i n s e r t s h o w s a g g r e g a t i o
n a t h i g h e r c o n c e n t r a t i o n .A g g r e g a t i o n
o f y G 3 P r o t e i n s 6 1 3
-
7/28/2019 Aggregation of YG3 Proteins
5/12
pH 7 . 2 p H 4 . 0- - - - -I1_E------|-s-. . S : c . c .. J .
l=1r. . . . . .. : . . . . . B y . . - . . .. . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . m . c - : .____
_Mw 3 0 4 , 0 0 0 1 47 000.. .. .
Mw 1 5 0 , 0 0 0 1 4 5 , 0 0 0F I G u R E 3 A p p a r e n t m o
l e c u l a r w e i g h t s o f i s o l a t e d m y e l o m ap r o
t e i n s b y t h e F i e l d R e l a x a t i o n T e c h n i q u e
. I n e a c h e x p e r i -m e n t t h e s a m p l e w a s a c c e
l e r a t e d t o 2 0 , 0 0 0 r p m f o r 4 m i n a n dd e c e l e
r a t e d a t a p p r o x i m a t e l y 1 0 0 0 r p m m i n ' t o 4
0 0 0 r p m .P h o t o g r a p h s w e r e t a k e n a f t e r 2 0
m i n a t t h e l o w e r s p e e d .p a t i e n t s w i t h a G 3
m y e l o m a a n d o n e s e r u m f r o m a p a -t i e n t w i t
h y G 1 m y e l o m a , a l l w i t h l a r g e p r o t e i n p e a
k s .I t w a s c l e a r t h a t t h e Y - g l o b u l i n i n s e
r u m f r o m t h e p a -t i e n t s w i t h v G 3 m y e l o m a d
i d n o t s i g n i f i c a n t l y e n t e r t h eg e l w h i l e
t h e y G f r o m s e r u m E . T . ( Y G 1 m y e l o m a )d i d e
n t e r t h e g e l . F i g . 5 r e p r e s e n t s t h e s a m e e
x p e r i m e n te x c e p t t h e g e l c o n t a i n e d 8 M u r
e a . H e r e t h e Y - g l o b u l i nf r o m a l l p a t i e n t
s e n t e r e d t h e g e l a n d a p p e a r e d v i r t u a l l
yi d e n t i c a l . S e r a f r o m f o u r o t h e r p a t i e n
t s w i t h aG3 m y e -l o m a w e r e s t u d i e d a n d b e h a
v e d i n a n i d e n t i c a l way w i t ht h o s e s h o w n i n
F i g s . 4 a n d 5 . Gm ( b ) o r Gm ( g ) a n dk a p p a o r l a
m b d a p r o t e i n s b e h a v e d s i m i l i a r l y . 2 5 s e
r af r o m p a t i e n t s w i t h m u l t i p l e m y e l o m a o
f t h e - y G 1 , 2 , a n d 4s u b g r o u p s w e r e s i m i l a
r l y s t u d i e d a n d i n e a c h i n s t a n c et h e y G p a
r a p r o t e i n p e a k e n t e r e d b o t h a c i d - a c r y l
a m i d e -g e l s y s t e m s i n a n o r m a l f a s h i o n
.
I n o r d e r t o d e t e r m i n e w h e t h e r Y G 3 p r o t
e i n s i n n o r -m a l s e r u m a l s o d i s p l a y e d a c o
n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t a g -g r e g a t i o n ,
n o r m a l s e r u m was r u n o n a c i d - a c r y l a m i d e
-g e l e l e c t r o p h o r e s i s . W i t h o u t s t a i n i n
g , t h e o r i g i n was c u to u t a s w e l l a s t h e p o s i
t i o n w h e r e t h e jG n o r m a l l y m i -
g r a t e s . E a c h p o r t i o n o f t h e g e l was t h e n
f o r c e d t h r o u g han 1 8 - g a u g e n e e d l e a n d a g a
r p l a t e a n a l y s i s w a s p e r -f o r m e d w i t h Y G s
u b g r o u p - s p e c i f i c a n t i s e r a . O n l y Y G 3p r
o t e i n s w e r e d e t e c t e d a t t h e o r i g i n a n d n o
a G 3 wasf o u n d i n t h e m a i n Y G b a n d .M o l e c u l a r
, l o c a l i z a t i o n o f a g g r e g a t i o n s i t e . I n o
r d e rt o d e t e r m i n e w h i c h p o r t i o n o f t h e a G
3 m o l e c u l e wasr e s p o n s i b l e - f o r t h i s u n u s
u a l p r o p e r t y o f a g g r e g a t i o n ,e n z y m a t i c
f r a g m e n t s a s w e l l a s H a n d L c h a i n s w e r es t
u d i e d . F a b a n d ( F a b ' ) 2 f r o m t h e s e p r o t e i
n s f a i l e d t oe n t e r t h e a c i d - a c r y l a m i d e g
e l s w h i l e s i m i l a r f r a g m e n t sf r o m c o n t r o
l y G l p r o t e i n s e n t e r e d n o r m a l l y . S t u d i e
s i na c i d - u r e a g e l s d i d n o t d i s t i n g u i s h t
h e two g r o u p s , a g a i ni n d i c a t i n g t h e n o n c o
v a l e n t n a t u r e o f t h e f o r c e s o f a g -g r e g a t
i o n . F c f r a g m e n t s f r o m - r G 3 p r o t e i n s e n t
e r e d t h ea c i d g e l s i n a n o r m a l p o s i t i o n . A
n a l y t i c a l u l t r a c e n t r i f u -g a t i o n o f A . L
. ( F a b ' ) 2 i s d e p i c t e d i n F i g . 6 . L i k es e v e
r a l ' G 3 w h o l e p r o t e i n s , a g g r e g a t i o n was m
a x i m a la r o u n d pH 6 . 8 . F c f r a g m e n t s f r o m aG3
p r o t e i n s d i d n o ta g g r e g a t e i n t h e a n a l y t
i c a l u l t r a c e n t r i f u g e .
R e d u c t i o n a n d a l k y l a t i o n o f t h e i s o l a
t e d p r o t e i n s a n dc o n t r o l s r e v e a l e d t h a t
o n a c i d . - u r e a g e l s b o t h H a n d Lc h a i n s e n t
e r e d t h e g e l s . On a c i d g e l s a f t e r r e d u c t i
o n a n d
F I G U R E 4 A c i d - a c r y l a m n i d e - g e l e l e c t
r o p h o r e s i s o f s e v e n y G 3m y e l o m a s e r a ( 1 -
7 ) a n d a y G 1 m y e l o m a s e r u m ( s l o t 8 ) .N o n e o
f t h e y G 3 p r o t e i n s a r e v i s u a l i z e d b e c a u s
e o f f a i l u r et o e n t e r t h e g e l .6 1 4 J . D . C a p r
a a n d H . G . K u n k e l
.... . . . .: . 7 7
-
7/28/2019 Aggregation of YG3 Proteins
6/12
a l k y l a t i o n t h e L c h a i n s o f a l l 'G3 p r o t e
i n s e n t e r e dn o r m a l l y b u t t h e H c h a i n s a g g
r e g a t e d a t t h e o r i g i n . A l lc o n t r o l H c h a i
n p r e p a r a t i o n s f r o m p r o t e i n s o f y G 1 , 2 , a
n d4 s u b g r o u p s e n t e r e d t he a c i d g e l s u n d e r
t h e s e c o n d i t i o n s .W h i l e t h e s e r e s u l t s s
t r o n g l y i m p l i c a t e d t h e F d p o r -t i o n o f t h
e H c h a i n a s t h e a g g r e g a t i n g u n i t , s t u d i e
sw e r e d o n e w i t h r e c o m b i n e d a n d r e o x i di z e
d m o l e c u l e sf o r c o n f i r m a t i o n . H y b r i d m o
l e c u l e s w e r e f o r m e d b e -t w e e n G . J . H . c h a
i n s l a b e l e d w i t h ' I a n d E . T . l i g h t -c h a i n
s l a b e l e d w i t h ' I . A l s o , G . J . l i g h t - c h a i
n s l a b e l e dw i t h 1 " I w e r e r e c o m b i n e d w i t h
E . T . H c h a i n l a b e l e dw i t h ' I . As s e e n i n F i g
. 7 ( l e f t ) when t h e H c h a i n i nt h e h yb r i d m o l e
c u l e a r o s e f r o m t h e ' v G 3 p r o t e i n , t h e e n
-t i r e r e c o m b i n e d m o l e c u l e w o u l d n o t e n t
e r t he a c i d g e l .H o w e v e r , when t h e H c h a i n a r
o se f r o m a ' v G 1 p r o t e i n ,t h e e n t i r e h y b r i d
e n t e r e d t h e g e l n o r m a l l y . On a c i d - u r e ag e
l s t h e t w o h v b r i d s c o u l d n o t b e d i s t i n g u i
s h e d f r o m
pH4.0 pH 6 . 8F I G u R E 6 E f f e c t o f pH o n a g g r e g a
t i o n o f t h e p e p s i n( F a b ' ) 2 f r a g m e n t o f t h
e - y G 3 p r o t e i n A . L .
C )---- - - ...- -4 1 1 _ . - L . W I L L d e v o i d o f r h e
u m a t o i d f a c t o r a c t i v i t y b o t h a t 4 0 C a n de
a c h o t h e r a s b o t h e n t e r e d n o r m a l l y . F i n a
l l y o n r e - r e - 2 0 0 C . I n e x t e n s i v e e x p e r i m
e n t s w i t h t h e a n a l y t i c a ld u c t i o n o n l y t h
e H c h a i n s f r o m t h el i G 3 p r o t e i n a c - _ u l t r
a c e n t r i f u g e n e i t h e r p e p s i n ( F a b ' ) 2 n o r
p a p a i n F a bc u m u l a t e d a t t h e o r i g i n . T h u s
t h e l i g h t c h a i n s seem t op l a y n o r o l e i n t h e a
g g r e g a t i o n p h e n o m e n a w h e r e a s t h e r e p r a
r e d f r o m b t r e o f e t h e G p r o t e nH c h a i a n
spcfial t h e F d poto s e e m t o b c o u l d b e d e m o n s t r
a t e d t o c o m b i n e w i t h e i t h e r a u t o l o -i m p l
i c a t e d . g o u s F c o r F c p r e p a r e d f r o m p o o l e
d ' y - g l o b u l i n .T e s t s d f o r . a n t i - ' v - g l o
b u l i n a c t i v i t y . W V i s c o s i t y s t u d i e s . D u
r i n g t h e e a r l y s t a g e s o f t h e s eT e s t f o a n t
i - . . g l o b u l i n a c i i y . h l eaa s t u d i e s t w o o f
t h e p a t i e n t s ' w i t h Y G 3 m y e l o m a p r o t e i n
sw e l l a s t h e i s o l a t e d p a r a p r o t e i n s w e r e
t e s t e d f o r r h e u - d i e s o p o ft h e p a t i s c w i t
h y G d r m e m p r o t e im a t o i d f a c t o r a c t i v i t y
b y t h e Rh a g g l u t i n a t i o n t e s t a n d d e v e l o p
e d t h e h y p e r v i s c o s i t y s y n d r o m e . T h i s i n
i t i a t e dt h e l a t e x f i x a t i o n t e s t . S e r u m A
. L . h a d a t i t e r o f 1 0 0 0 i n v i s c o s i t y s t u d i
e s o f t h e i r p r o t e i n s , o t h e r G3 m y e l o m at h e
R h a g g l u t i n a t i o n t e s t b u t t h e i s o l a t e d
vG3protein p r o t e i n s , a n d m y e l o m a p r o t e i n s o
f o t h e r s u b g r o u p s .t h e Rh a g g l u t i n a t i o n t
e s t b u t t h e i s o l a t e d - Y G 3 p r o t e i n Th i n t a
. ' . mrltv isoiyi t h w aewas d e v o i d o f r h e u m a t o i d
f a c t o r a c t i v i t y . P e v i k o n b l o c k The i n i 1 0
. 0 a t 2 2 i C . The c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n
te l e c t r o p h o r e s i s s e p a r a t e d t h e r h e u m a
t o i d f a c t o r i n s e r u m w a s g 1 . 6 a t n 1. a t h e s
p t e c o n c e n t r d e p e n d e nA . L . f r o m t h e m y e l
o m a p r o t e i n . A l l o t h e r s e r a i n t h i s ageaino
hs rtiswspeetderiris t u .a s w e l a t e i o m t p r o t e i n . s
f r o m s t h w r t h e a n a l y t i c a l u l t r a c e n t r i f
u g e s t u d i e s ( F i g . 1 , G . J . a n ds t u d y a s w e l
l a s t h e i s o l a t e d p r o t e i n s f r o m m o s t were A
. L . as w e l l as P . W. w i t h o u t h y p e r v i s c o s i t
y s y n d r o m e ) .The p r o n o u n c e d e f f e c t o f t e m
p e r a t u r e o n t h e r e l a t i v e
1 2 3 4 5 6 7 8 v i s c o s i t y o f ' v G 3 p r o t e i n s i
s s h o w n i n T a b l e I . A l l s e r aw i t h v G 3 p r o t e
i n s d e m o n s t r a t e d an i n c r e a s e d r e l a t i v ev
i s c o s i t y a t l o w e r t e m p e r a t u r e s . T h i s i s
e v i d e n t w h e t h e rt h e h y p e r v i s c o s i t y s y n
d r o m e i s p r e s e n t o r n o t . No p a -t i e n t w i t h a
v G I m y e l o m a o r w i t h m a c r o g l o b u l i n e m i ad
e m o n s t r a t e d a s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n r
e l a t i v e v i s c o s i t ya t l o w e r t e m p e r a t u r e
s . I n ' G 3 m y e l o m a h y p e r v i s c o s i t yb e c o m e
s s i g n i f i c a n t a t much l o w e r c o n c e n t r a t i o
n s o f m y e -l o m a p r o t e i n . T h u s w i t h o n l y 6 .
2 g / 1 0 0 m l o f ' G 3 p r o -t e i n p a t i e n t G . J . h a
d a r e l a t i v e v i s c o s i t y a t 2 2 0 C o f1 4 . 6 . P a
t i e n t M . K . w i t h ' v G 1 m y e l o m a w i t h 1 9 . 0 g o
f_ Y G I p r o t e i n h a d a serum r e l a t i v e v i s c o s i
t y o f o n l y 6 . 0 a t2 2 0 C . T h i s d i s t i n c t i o n b
e t w e e n t h e e f f e c t o f p r o t e i n c o n -c e n t r a
t i o n on r e l a t i v e v i s c o s i t y i n ' v G 3 v s . ' Y
G l m y e l o m ai s s h o w n a g a i n i n F i g . 8 . T h e m a
r k e d l y d i f f e r e n t s l o p e s' i n d i c a t e t h a t
p e r u n i t o f c o n c e n t r a t i o n a ' v G 3 p r o t e i
nr e s u l t s i n a f a r m o r e v i s c o u s serum t h a n a '
v G l p r o t e i n .E a c h s e r u m s t u d i e d i n T a b l e
I was d i l u t e d w i t h e q u a l
F I G u R E 5 S a m e e x p e r i m e n t a s F i g . 4 e x c e
p t t h e , g e l was v o l u m e s o f P BS a n d t h e r e l a t
i v e v i s c o s i t y d e t e r m i n e d .m a d e 8 M i n u r e
a . T h e m y e l o m a c o m p o n e n t s a r e no w T a b l e I
I d e p i c t s s o m e o f t h e r e s u l t s . T h e r e l a t i
v e v i s -a p p a r e n t f o r t h e ' y G 3 p r o t e i n s . c
o s i t y o f NHS a n d t h e s e r a o f p a t i e n t s w i t h m
u l t i p l eA g g r e g a t i o n o f ' v G 3 P r o t e i n s 6 1
5
-
7/28/2019 Aggregation of YG3 Proteins
7/12
ALI G H
G . J . H 1 3 1 I-E L 1 2 5 I
CX G H L
G . J . H ' 3 1 I - E T . L I 2 5R e d u c e d0- ? I I ~ ~ ~ ~ ~
~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ I I - -rm ~~~~~BE . T . H 1 2 5 I - . . . J . L
3 1 Dt o - R e d u c e d
' 0 | ET H 5 1 - _ G . J . L 3 1 1
04 6 1 0 1 2 2 46O r i g i n 8 10 1 2 1 4
C m f r o m o r i g i nF I G U R E 7 A c i d - a c r y l a m i d
e - g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f r a d i o i o d i n a t
e d r e c o m b i n e da n d r e o x i d i z e d m o l e c u l e s
. 7 A s h o w s t h a t w h e n t h e ' y - c h a i n o f t h e h y
b r i dm o l e c u l e c o m e s f r o m t h e - y G 3 p r o t e i
n , t h e m o l e c u l e d o e s n o t e n t e r t h e g e l .7B i
n d i c a t e s t h a t w h e n t h e y - c h a i n o f t h e h y b
r i d m o l e c u l e c o m e s f r o m t h e- y G 1 p r o t e i n
, t h e m o l e c u l e e n t e r s t h e g e l n o r m a l l y . 7
C a n d 7 D s h o w t h a t onr e - r e d u c t i o n o n l y t h e
' y - c h a i n f r o m t h e ' y G 1 p r o t e i n e n t e r s t h
e g e l s . F o rf u r t h e r d e t a i l s see t e x t .
n m y e l o m a o f t h e ' v G 1 , t wo o r f o u r s u b g r o
u p s w i t h o u th y p e r v i s c o s i t y s y n d r o m e ,
was r e d u c e d l e s s t h a n 10 % b yd i l u t i o n . The
sera o f p a t i e n t s w i t h W a l d e n s t r o m ' sm a c r o
g l o b u l i n e m i a a n d h y p e r v i s c o s i t y s y n d r
o m e wasr e d u c e d l e s s t h a n 20 % a n d t h o s e f r o m
p a t i e n t s w i t h' v G 1 m y e l o m a a n d h y p e r v i s
c o s i t y s y n d r o m e was r e-d u c e d a p p r o x i m a t e
l y 5 0 % . I n c o n t r a s t , t h e se ra f r o mp a t i e n t
s w i t h ' v G 3 m y e l o m a a n d h y p e r v i s c o s i t y s
yn-d r o m e was r e d u c e d 75% o r g r e a t e r .I n t r i n s
i c v i s c o s i t y was d e t e r m i n e d on some o f t h ei s
o l a t e d p r o t e i n s a n d was f o u n d t o b e 4 . 1 c c /
g f o r G . J .a n d 4 . 6 c c / g f o r A . L . T h u s a t i n f
i n i t e d i l u t i o n t h e s ep r o t e i n s h a v e i n t r
i n s i c v i s c o s i t y v a l u e s w h i c h d o no td i f f e
r s i g n i f i c a n t l y f r o m p o o l e d gamma g l o b u l i
n .
P l a s m a v i s c o s i t y d e t e r m i n a t i o n s a t l
o w s h e a r r a t e s( T a b l e I I I ) s h o w e d no s h e a r
d e p e n d e n c e . T h u s t h e v i s -c o s i t y i n c e n t
i p o i s e s d i d n o t c h a n g e o v e r a 1 0 0 0 - f o l dc
h a n g e i n s h e a r r a t e f o r any p l a s m a . The c l e a
r t e m p e r a -t u r e d e p e n d e n c e i s a g a i n n o t e
d f o r t h e 7 G 3 p r o t e i n s b u tn o t f o r t h e ' G 1 c
o n t r o l . T h e s e s t u d i e s were p e r f o r m e do n p l
a s m a o b t a i n e d v i a p l a s m a p h e r e s i s a n d
were t h u sd i l u t e d . T h i s a c c o u n t s f o r t h e l o
w e r r e l a t i v e v i s c o s i t yv a l u e s .
DISCUSSIONThe i n i t i a l o b s e r v a t i o n s o f c o n c
e n t r a t i o n - d e p e n d e n t ag-g r e g a t i o n o f ' G
3 p r o t e i n s were made on a n a l y t i c a lu l t r a c e n t
r i f u g a t i o n o f w h o l e s e r u m . The l a r g e s h e l
f o f
c o m p l e x e s a r i s i n g f r o m t h e 7S p e a k a n d i
n a c o n t i n u u mt o t h e c e l l b o t t o m s u g g e s t e
d an u n s t a b l e a s s o c i a t i n g -d i s s o c i a t i n g
s y s t e m . The c o n v e c t i v e d i s t u r b a n c e s seeni
n F i g . 1 p r o b a b l y r e p r e s e n t d e n s i t y i n v e
r s i o n s d u e t os l o w i n t e r c o n v e r s i o n o f
monomers i n t o p o l y m e r s a n dv i c e versa. The s a w t o
o t h s p i k e s ar e i n d i c a t i v e o f c o n -v e c t i v e
d i s t u r b a n c e s w h i c h l e a d t o e x t r e m e l y s h
a r p con-c e n t r a t i o n g r a d i e n t s ( 2 8 ) . Th e e f
f e c t o f pressure o na g g r e g a t i o n p h e n o m e n a ar
e w e l l d e s c r i b e d ( 2 9 ) . Atmaximu m a n g u l a r r o
t a t i o n , pressures o f o ve r 2 5 0 a t -m o s p h e r e s o c
c u r i n u l t r a c e n t r i f u g e c e l l s ( 3 0 ) s o t h
ee x p e r i m e n t s a t l o w s p e e d s we r e d e s i g n e d
t o m i n i m i z e t h ee f f e c t o f pressure on t h e a g g r
e g a t i o n p h e n o m e n a . Th ep a r t i c u l a r m e t h o
d o f p u r i f y i n g t h e i s o l a t e d m y e l o m ap r o t
e i n s was d e s i g n e d t o r e d u c e a l l f a c t o r s w h
i c h m i g h tl e a d t o a g g r e g a t i o n t h e r e b y a l
l o w i n g t h e e f f e c t o f con-c e n t r a t i o n a t t h e
c e l l b o t t o m t o b e t h e m a j o r d e t e r m i n a n ti
n t h e m o l e c u l a r w e i g h t m e a s u r e m e n t . The v
a l u e o f3 0 5 , 0 0 0 f o r G . J r e p r e s e n t s a w e i g
h t av erage m o l e c u l a rw e i g h t n o t o f t h e o r i g i
n a l s a m p l e , b u t i n s t e a d , i s t h ea p p a r e n t
m o l e c u l a r w e i g h t o f t h e m a t e r i a l p r e s e n
t a t t h el o w e r m e n i s c u s a t a g i v e n i n s t a n t
( 2 1 ) . Thus t h e d e m -o n s t r a t i o n o f an a p p a r e
n t m o l e c u l a r w e i g h t o f o v er 3 0 0 , -0 0 0 p r o v
i d e s s t r o n g e v i d e n c e t h a t t h e a g g r e g a t i
o n p h e -nomena i s c o n c e n t r a t i o n a n d n o t
pressure d e p e n d e n t .
A g g r e g a t i o n o f v G 3 p r o t e i n s was a l s o d o
c u m e n t e d b yt h e i r f a i l u r e t o p e n e t r a t e a
c r y l a m i d e g e l s i n w h i c h p r o -t e i n s w i t h m
o l e c u l a r w e i g h t s l e s s t h a n a m i l l i o n w i l
l6 1 6 J . D . C a p r a a n d H . G . K u n k e l
c p m1 2 08040
c p l1 2
4
O r i g i n
-
7/28/2019 Aggregation of YG3 Proteins
8/12
TABLE IC o m p a r a t i v e R e s u l t s o f P r o t e i n a n
d V i s c o s i t y S t u d i e s o n t h e S e r u m o f P a t i e
n t s w i t h - y G 3 , ' y G l ,a n d M a c r o g l o b u l i n P
e a k s w i t h a n d w i t h o u t t h e H y p e r v i s c o s i t
y S y n d r o m e
Serum r e l a t i v e v i s c o s i t yH y p e r v i s c o s i t
y T o t a l
P a t i e n t Type s y n d r o m e p r o t e i n P e a k 4 0 C 2
2 0 C 3 7 0 Cg / 1 0 0 m l g / 1 0 0 m lN o r m a l - - 7 . 1 1 . 5
1 . 4 1 . 4
G . J . - y G 3 l a m b d a + 1 1 . 2 6 . 2 3 7 . 0 1 4 . 6 5 .
8A . L . - y G 3 l a m b d a + 1 1 . 0 5 . 8 1 6 . 4 1 0 . 0 4 .
0W. P . - y G 3 k a p p a + 1 0 . 5 4 . 2 1 0 . 2 6 . 4 3 . 1P . W.
- y G 3 k a p p a - 1 0 . 0 3 . 6 7 . 7 4 . 2 2 . 2C . V . - y G 3
l a m b d a - 9 . 6 2 . 8 3 . 3 2 . 0 1 . 4L . A . - y G 3 k a p p
a - 7 . 4 2 . 0 2 . 0 1 . 7 1 . 4M. K . ' y G 1 k a p p a + 2 5 . 0
1 8 . 0 5 . 2 5 . 1 5 . 0D . P . y G 1 k a p p a + 2 4 . 1 1 7 . 2
4 . 9 4 . 9 4 . 8C . F . - y G 1 k a p p a + 2 2 . 2 1 5 . 0 4 . 7
4 . 5 4 . 4N . B . - y G 1 k a p p a - 1 9 . 0 1 2 . 0 3 . 6 3 . 5
3 . 5R . B . - y G 1 k a p p a - 1 4 . 4 9 . 5 2 . 8 2 . 8 2 . 7A .
G . - y G l l a m b d a - 1 2 . 6 7 . 5 2 . 2 2 . 1 2 . 1E . T . y
G l k a p p a - 1 2 . 0 6 . 2 1 . 7 1 . 6 1 . 6S . N . - y G 1 k a
p p a - 1 1 . 9 6 . 2 1 . 6 1 . 5 1 . 5A . G . - y M l a m b d a +
1 2 . 6 6 . 2 6 . 8 6 . 5 6 . 4B . D . - y M k a p p a + 1 2 . 0 7
. 0 8 . 2 8 . 2 8 . 1S . W. - y M k a p p a + 1 1 . 4 5 . 8 5 . 8 5
. 6 5 . 5
r e a d i l y e n t e r . The s o - c a l l e d " s t a c k i n
g " e f f e c t o f t h e g e la t t h e p o i n t o f e n t r y a
p p a r e n t l y p r o d u c e s a h i g h c o n -c e n t r a t i
o n o f t h e ' G 3 p r o t e i n s t o e f f e c t t h e i r a g g
r e g a -t i o n .
1 4
0 1 2& JC Q j- 1 00I n0 800
0 )
> 6
L-4
n 2 .
S t u d i e s o n e n z y m a t i c f r a g m e n t s a n d r e
d u c t i o n p r o d -u c t s l o c a l i z e d t h e a g g r e g
a t i n g p o r t i o n o f t h e m o l e c u l e t oF a b a n d H
c h a i n . T h i s s t r o n g l y s u g g e s t s t h a t t h e y
G 3Fd f r a g m e n t i s r e s p o n s i b l e f o r t h i s p h e
n o m e n o n . T h e r e
| y G 3 m y e l o m a
x = H y p e r v i s c o s i t y s y n d r o m e
y d G I m y e l o m a0 1 - 1 0
2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 l e 2 0M y e l o m a p r o t e i n c o n
c e n t r a t i o n ( g / 1 0 0 m l )
F I G U R E 8 A g r a p h i c r e p r e s e n t a t i o n o f s
o m e o f t h e d a t a i n T a b l e I .y G 1 m y e l o m a s f a
l l o n a l i n e w i t h a m u c h l o w e r s l o p e t h a n - y
G 3 p r o t e i n s .T h e p o i n t s r e p r e s e n t t h e i n
d i v i d u a l p a t i e n t s .
A g g r e g a t i o n o f y G 3 P r o t e i n s 6 1 7
-
7/28/2019 Aggregation of YG3 Proteins
9/12
TABLE I ID i l u t i o n T e s t f o r C o n c e n t r a t i o n
- D e p e n d e n t A g g r e g a t i o n
R e l a t i v e R e l a t i v ev i s c o s i t y v i s c o s i t
y
a t 2 0 ' C o f a t 2 0 1 C o fw h o l e serum d i l u t e d R e
d u c -P a t i e n t s e r u m w i t h P BS t i o n
NHS* 1 . 5 1 1 . 4 0 7%M u l t i p l e m y e l o m a
w i t h o u t h y p e r -v i s c o s i t y s y n d r o m e : 2 .
0 6 1 . 9 0 8%W a l d e n s t r o m ' s m a c r o -g l o b u l i n
e m i a w i t hh y p e r v i s c o s i t y
s y n d r o m e 6 . 6 0 5 . 4 0 18%M. K . 6 . 0 1 3 . 1 2 52%C .
F . 5 . 0 7 2 . 6 1 51 %G . J . 1 3 . 0 0 2 . 8 1 88%A . L . 8 . 0
4 2 . 0 2 7 5 %W. P . 7 . 5 2 1 . 8 8 7 5 %
* A v e r a g e o f f i v e n o r m a l s .t S e r a f r o m 3 0
p a t i e n t s , - y G l , - y G 2 , a n d - a G 4 m u l t i p l e
m y e l o m a . S e r a f r o m t h r e e p a t i e n t s .i s a c
o n s i d e r a b l e b o d y o f d a t a w h i c h s u g g e s t s
t h a t s u b -c l a s s - s p e c i f i c a n t i g e n s r e s i
d e o n b o t h t h e F c a n d t h e F dp o r t i o n o f t h e H
c h a i n ( 1 6 , 3 1 ) . T h i s i s e s p e c i a l l y t r u ei
n t h e a G 3 s u b g r o u p w h e r e t h e F d a n t i g e n s a
r e p a r t i c u -l a r l y p o t e n t . I t i s l i k e l y t h
a t t h e s e s a m e a r e a s o f t h e
m o l e c u l e r e n d e r i t more s u s c e p t i b l e t o a
g g r e g a t i n g p o -t e n t i a l . I t m ay b e t h a t a s t
r i n g o f s t r o n g l y h y d r o p h o b i cr e s i d u e s m
u t u a l l y a t t r a c t a n d l e a d t o a g g r e g a t i o n
.F r a n g i o n e a n d M i l s t e i n ( 3 2 ) r e p o r t t h a
t t h e - i G 3 s u b -g r o u p i s u n i q u e among t h e Y G g
l o b u l i n s h a v i n g f i v ei n t e r - h e a v y - c h a i
n d i s u l p h i d e b o n d s . One a n d p e r h a p st w o o f
t h e s e i s i n t h e F d r e g i o n . The r o l e t h e a d d i
t i o n a lh a l f - c y s t e i n e s p l a y i n t h i s a g g r
e g a t i o n p h e n o m e n a i sn o t c l e a r a t t h e p r e
s e n t t i m e .
R e c e n t s t u d i e s o n t h e c a t a b o l i s m o f
human m y e l o m ap r o t e i n s ( 4 , 5 ) s h o w t h a t t h o
s e o f t h e aG3 s u b c l a s s a r ec a t a b o l i z e d much f
a s t e r t h a n a n y o t h e r s u b g r o u p .S p i e g e l b
e r g a n d F i s h k i n ( 4 ) a l s o r e p o r t t h a t t h i s
d i f -f e r e n c e i s n o t a c c o u n t e d f o r b y more r e
c e n t s t u d i e s o nt h e F c f r a g m e n t . I t i s r e a
s o n a b l e t o a s s u m e o n t h e b a s i so f t h e p r e s
e n t s t u d y t h a t t h e d i f f e r e n t c a t a b o l i c r
a t e m ayb e r e l a t e d t o i n v i v o a g g r e g a t i o n a
n d s u b s e q u e n t d e -s t r u c t i o n , w h i c h w o u l
d b e d e p e n d e n t o n t h e Fd f r a g m e n t .The h y p e r
v i s c o s i t y s y n d r o m e i s a c o n s t e l l a t i o n o
fs i g n s a n d s y m p t o m s i n c l u d i n g t i n n i t u s
, m u c o u s mem-b r a n e b l e e d i n g , s t u p o r , s t r o
k e , c o n v u l s i o n s , b l u r r e dv i s i o n , d i l a t
e d r e t i n a l v e i n s , g a s t r o i n t e s t i n a l h e m
o r r h a g e ,a n d c o n g e s t i v e h e a r t f a i l u r e (
3 3 ) . C l i n i c a l l y ' t h e m o s tco m m on d i s e a s e
a s s o c i a t e d w i t h t h i s s y n d r o m e i sW a l d e n
s t r 6 m ' s m a c r o g l o b u l i n e m i a ( 9 ) . I n m u l t
i p l em y e l o m a , h o w e v e r , t h e h y p e r v i s c o s
i t y s y n d r o m e i s r a r e .B j o r n e b o e a n d J e n s
e n ( 1 3 ) d e s c r i b e d a p a t i e n t w i t hh y p e r v i
s c o s i t y s y n d r o m e a n d Y G m u l t i p l e m y e l o m
a i nw h i c h m e a s u r e m e n t o f c o l l o i d o s m o t i
c p r e s s u r e wasn o r m a l a n d t h e p l a s m a v o l u m
e w a s o n l y s l i g h t l y i n -c r e a s e d . T h e y p o s
t u l a t e d a g g r e g a t i o n o f t h e p a r a p r o -
TABLE I I IP l a s m a V i s c o s i t y a t Lo w S h e a r R a
t e sV i s c o s i t y i n c e n t i p o i s e s R e l a t i v e v
i s c o s i t yT e r m - S h e a r
p e r a t u r e r a t e G . J . A . L . E . T . Water G . J . A
. L . E . T .0 C s e c - '3 7 5 2 2 . 4 7 2 . 9 8 1 . 8 2 0 . 6 9 4
7 3 . 5 6 4 . 2 9 2 . 6 25 . 2 2 . 4 7 2 . 9 8 1 . 8 2
0 . 5 2 2 . 4 7 2 . 9 8 1 . 8 20 . 1 0 4 2 . 4 7 2 . 9 8 1 . 8
20 . 0 5 2 2 . 4 7 2 . 9 8 1 . 9 2
2 0 5 2 5 . 1 3 5 . 0 4 2 . 6 1 1 . 0 0 5 0 5 . 1 0 5 . 0 1 2 .
6 05 . 2 5 . 1 3 5 . 0 4 2 . 6 10 . 5 2 5 . 1 3 5 . 0 4 2 . 6 10 .
1 0 4 5 . 1 3 5 . 0 4 2 . 6 10 . 0 5 2 5 . 1 3 5 . 0 4 2 . 6 1
4 5 2 1 3 . 4 1 1 . 2 3 . 9 2 1 . 5 6 7 4 8 . 5 5 7 . 1 5 2 . 5
15 . 2 1 3 . 4 1 1 . 2 3 . 9 20 . 5 2 1 3 . 4 1 1 . 2 3 . 9 20 . 1
0 4 1 3 . 4 1 1 . 2 3 . 9 20 . 0 5 2 1 3 . 4 1 1 . 2 3 . 9 2
6 1 8 J . D . C a p r a a n d H . G . K u n k e l
-
7/28/2019 Aggregation of YG3 Proteins
10/12
t e i n a s a m e c h a n i s m t o e x p l a i n t h e s e f i
n d i n g s b u t w e r eu n a b l e t o d e m o n s t r a t e a g
g r e g a t i o n d e s p i t e a n a l y t i c a lu l t r a c e n
t r i f u g a t i o n s t u d i e s . H o w e v e r , s i n c e t h
e y d i -l u t e d t h e s e r u m a b o u t 1 0 - f o l d b e f o
r e c e n t r i f u g a t i o n ,c o n c e n t r a t i o n - d e p
e n d e n t a g g r e g a t i o n w o u l d n o t h a v eb e e n d
e t e c t e d . K o p p , B e i r n e , a n d B u r n s ( 1 4 ) d e
s c r i b e da s i m i l a r p a t i e n t w i t h aG m y e l o m a
a n d h y p e r v i s c o s i t ys y n d r o m e w i t h a s e r u
m r e l a t i v e v i s c o s i t y o f 6 . 0 a n da g a i n a n a
l y t i c a l u l t r a c e n t r i f u g a t i o n d i d n o t d e
m o n s t r a t ea g g r e g a t e f o r m a t i o n . H o w e v e
r , t h e c e n t r i f u g e p h o t o -g r a p h s h o w n s u g
g e s t s t h a t t h e s e r a h a d b e e n d i l u t e d 5 -1 0
t i m e s a n d c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t a g g
r e g a t e s a s d e -s c r i b e d h e r e i n w o u l d n o t h
a v e b e e n o b s e r v e d . T h e ym e a s u r e d r e l a t i
v e v i s c o s i t y a t 3 7 0 C a n d f o u n d i t t o b e4 . 8
w h i l e a t 2 4 0 C i t w a s 7 . 0 . T h i s i n c r e a s e i n
r e l a t i v ev i s c o s i t y f r o m 3 7 0 C t o 2 4 0 C s u g
g e s t s t h a t t h e y w e r ep r o b a b l y c o n f r o n t e
d w i t h t h e s a m e p h e n o m e n o n r e p o r t e dh e r e
, i . e . , c o n c e n t r a t i o n - a n d t e m p e r a t u r e
- d e p e n d e n t a g -g r e g a t i o n . M a c K e n z i e a n
d F u d e n b e r g ( 1 5 ) r e p o r t e d o nt w o p a t i e n t
s w i t h h y p e r v i s c o s i t y s y n d r o m e s e c o n d a
r y t oa G m y e l o m a i n w h i c h n o a g g r e g a t e s c o
u l d b e d o c u -m e n t e d b y a n a l y t i c a l u l t r a c
e n t r i f u g a t i o n . T h e i n t r i n s i cv i s c o s i t
y o f t h e i s o l a t e d p r o t e i n s w a s d e t e r m i n e
d a n d i tw a s n o r m a l i n o n e p a t i e n t w h i l e i n
t h e o t h e r i t w a s r e -p o r t e d t o b e t w i c e n o r
m a l . T h e y c o n c l u d e d t h a t h y p e r -v i s c o s i
t y s y n d r o m e i n v G m y e l o m a w a s d u e t o t h e p r
i -mary s t r u c t u r e o f t h e i n d i v i d u a l p r o t e i
n s , n o t t h e i r p o -t e n t i a l f o r a g g r e g a t i o
n . I n v i e w o f t h e d a t a p r e s e n t e d i nt h i s r e
p o r t i t i s l i k e l y t h a t i n s o m e o f t h e a b o v e
p a t i e n t sc o n c e n t r a t i o n - a n d t e m p e r a t u
r e - d e p e n d e n t a g g r e g a t i o no f v G 3 p r o t e i
n s l e a d t o t h e h y p e r v i s c o s i t y s y n d r o m e
.Two p o t e n t i a l l y u s e f u l s i m p l e t e s t s f o r
u n s t a b l e a g -g r e g a t i n g Y G m y e l o m a s p r o d
u c i n g h y p e r v i s c o s i t y s y n -d r o m e a r e t h e
s e r u m r e l a t i v e v i s c o s i t y d e t e r m i n a t i o
n a tt w o d i f f e r e n t t e m p e r a t u r e s a n d t h e s
e r u m r e l a t i v e v i s -c o s i t y o n w h o l e s e r u m
a n d s e r u m d i l u t e d 1 : 1 . T h e t e m -p e r a t u r e
- v i s c o s i t y i n d e x ( T V I ) wa s i n t r o d u c e d b
yW a l d e n s t r d m . ( 3 4 ) . TVI = ( 1 0 0 X r e l . v i s c
. 1 3 ' C ) /( r e l . v i s c . 3 7 ) . V a l u e s g r e a t e r
t h a n 1 2 0 w e r e c o n -s i d e r e d s u g g e s t i v e o f
m a c r o g l o b u l i n e m i a . S o m e r ( 3 5 )i n h i s e x
t e n s i v e s t u d y o f v i s c o s i t y i n m y e l o m a a n
d m a c -r o g l o b u l i n e m i a r e e x a m i n e d t h i s t
e s t . He f o u n d t h a t o f1 6 c a s e s o f aG m y e l o m a
o n l y t h r e e h a d TVI 1 2 0 a n d i no n l y t w o was t h e
s e r u m r e l a t i v e v i s c o s i t y a t 2 0 0 C 5 . 0 .O n
l y 5 o f 1 5 s e r a f r o m p a t i e n t s w i t h W a l d e n s
t r 6 m ' sm a c r o g l o b u l i n e m i a h a d TVI v a l u e s
a b o v e 1 2 0 . He c o n -c l u d e d t h a t t h e TVI was o f s
o m e w h a t l i m i t e d u s e f u l n e s sc l i n i c a l l y
e x c e p t i n c a s e s o f c r y o g l o b u l i n e m i a . I t
s h o u l db e e m p h a s i z e d t h a t i n t h e p r e s e n t
s t u d y c r y o g l o b u l i n sw e r e n o t p r e s e n t i n
a n y o f t h e s e s e r a . T h e t e m p e r a t u r ev i s c o
s i t y i n d e x c a n o n l y b e e x t r a p o l a t e d f r o m
t h e p r e s e n ts t u d y a s m e a s u r e m e n t s w e r e n
o t d o n e a t 1 3 0 C . How-e v e r , i t i s c l e a r t h a t n
o n e o f t h e t h r e e p a t i e n t s w i t hW a l d e n s t r
o m ' s m a c r o g l o b u l i n e m i a wh o s e r v e d a s c o
n -
t r o l s h a d a TVI > 1 2 0 ( T a b l e I ) . I n a d d i t
i o n , p a t i e n t sw i t h m u l t i p l e m y e l o m a w i t
h o u t h y p e r v i s c o s i t y s y n -d r o m e h a d a TVI w
i t h i n t h e n o r m a l r a n g e . H o w e v e r ,t h e m a r
k e d e f f e c t o f t e m p e r a t u r e o n v i s c o s i t y i
s e v i -d e n t i n t h e t w o p a t i e n t s w i t h h y p e r
v i s c o s i t y s y n d r o m ew i t h Y G 3 m u l t i p l e m y
e l o m a , f o r A . L . , 2 7 6 a n d f o r G . J . ,4 6 0 . T h
e s e v a l u e s a r e h i g h e r t h a n a n y v a l u e o b t a
i n e db y S o m e r ( 3 5 ) i n h i s s t u d y o f s e r a f r o
m 1 5 p a t i e n t sw i t h m a c r o g l o b u l i n e m i a , 7
w i t h yA m y e l o m a a n d 1 6w i t h ' v G m y e l o m a . T h
e s e s t u d i e s w o u l d t h e r e f o r e s u g -g e s t t h
a t v i s c o s i t y d e t e r m i n a t i o n a t t w o d i f f e
r e n t t e m -p e r a t u r e s c a n b e u s e f u l t o d i s t
i n g u i s h t h i s f o r m o fh y p e r v i s c o s i t y s y n
d r o m e f r o m t h a t c a u s e d b y W a l d e n -s t r 6 m '
s m a c r o g l o b u l i n e m i a when a n a l y t i c a l u l t
r a c e n -t r i f u g a t i o n i s n o t r e a d i l y a v a i l
a b l e .A n o t h e r c l i n i c a l l y u s e f u l t e s t u t
i l i z i n g t h e O s t w a l dv i s c o m e t e r i s t h e d i
l u t i o n t e s t . S t e e l ( 3 6 ) i n t r o d u c e d t h e"
i n t e r p o l a t e d 7% v i s c o s i t y " b a s e d o n a f i
x e d p r o t e i nc o n c e n t r a t i o n . He n o t e d t h a t
b y d i l u t i n g t h e s e r u m w i t he l e v a t e d v i s c
o s i t y t o a p r o t e i n c o n t e n t o f 7 g /1 0 0 m l t h
er e l a t i v e v i s c o s i t y o f m y e l o m a s e r a i s r
e d u c e d t o t h en o r m a l r a n g e b u t i n c a s e s o f
m a c r o g l o b u l i n e m i a t h e"7% v i s c o s i t y " r e
m a i n s a b n o r m a l . T h e v a l u e o f t h et e s t a s r
e p o r t e d h e r e , h o w e v e r , i s t h a t p r o t e i n c
o n c e n -t r a t i o n n e e d n o t b e m e a s u r e d a s s h
o w n i n T a b l e I I . As i m p l e 1 : 1 d i l u t i o n o f t
h e s e r u m r e d u c e s t h e s e r u mr e l a t i v e v i s c
o s i t y o f t h e s e c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n
t a g -g r e g a t i n g m y e l o m a s t o c l o s e t o t h e n
o r m a l r a n g e , w h i l et h e r e l a t i v e v i s c o s i
t y o f t h e s e r a o f p a t i e n t s w i t h W a l d -e n s t
r o m ' s m a c r o g l o b u l i n e m i a i s much l e s s a f f
e c t e d .C a p i l l a r y t u b e v i s c o m e t e r s i n g e
n e r a l m e a s u r e v i s -c o s i t y a t r e l a t i v e l y
h i g h s h e a r r a t e s . M e a s u r e m e n t s o ff l o w v
e l o c i t y i n p o s t c a p i l l a r y v e n u l e s s u g g e
s t t h a t t h es h e a r r a t e i n t h i s p o r t i o n o f t
h e m i c r o c i r c u l a t i o n i s l o w( 3 7 ) . I t w a s t
h e r e f o r e d e s i r a b l e t o s t u d y t h e e f f e c t o
fl o w s h e a r r a t e s o n v i s c o s i t y i n t h i s u n i
q u e g r o u p o fp a t i e n t s . T h e r e s u l t s ( T a b l
e I I I ) i n d i c a t e t h a t t h e r e i s n os h e a r d e p
e n d e n c e a n d s u g g e s t N e w t o n i a n b e h a v i o r
o f t h ep l a s m a . H o w e v e r , i t h a s l o n g b e e n k
n o w n t h a t w h o l eb l o o d i s n o n - N e w t o n i a n (
3 8 , 3 9 ) a n d t h a t t h e r e i s at e n d e n c y f o r t h
e n o n - N e w t o n i a n b e h a v i o r t o i n c r e a s ea s
t h e v i s c o s i t y l e v e l r i s e s ( 2 7 ) . T h u s i t a
p p e a r s t h a t f o rmaximum i n f o r m a t i o n w h o l e b
l o o d i n s t e a d o f t h e d i l u t e dc i t r a t e d p l a
s m a w i l l h a v e t o b e s t u d i e d a t l o w s h e a rr a
t e s a n d s u c h s t u d i e s a r e no w u n d e r w a y .T h e
aG h e a v y - c h a i n s u b g r o u p s o f m y e l o m a p r o
t e i n sa s s o c i a t e d w i t h t h e h y p e r v i s c o s i
t y s y n d r o m e s h o w s ad i s p r o p o r t i o n a t e n u
m b e r b e l o n g i n g t o t h e Y G 3 s u b -g r o u p . T h r
e e i n t h e p r e s e n t r e p o r t a r e - y G 3 p r o t e i n
s ;h o w e v e r , t h e t w o p a t i e n t s o f M a c K e n z i
e a n d F u d e n -b e r g ( 1 5 ) w e r e o f t h e ' G I s u b g
r o u p b u t a t h i r d p a -t i e n t p r o v i d e d t o u s b
y t h e s e a u t h o r s was a a G 3 p r o t e i n .S t u d i e s
o f t h e s e r a o f p a t i e n t s w i t h h y p e r v i s c o s
i t y s y n -
A g g r e g a t i o n o f y G P 3 P r o t e i n s 6 1 9
-
7/28/2019 Aggregation of YG3 Proteins
11/12
d r o m e w i t h Y G 1 m y e l o m a i n d i c a t e t h a t :
( a ) t h e m y e -l o m a p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n
i n e a c h c a s e w a s 1 5 g o ro v e r ( s e e T a b l e I ) ;
( b ) n o a g g r e g a t e s c o u l d b e d o c u -m e n t e d b
y a n a l y t i c a l u l t r a c e n t r i f u g a t i o n ; ( c )
a l l e n -t e r e d t h e a c i d - a c r y l a m i d e g e l ; a
n d ( d ) n o n e d e m o n -s t r a t e d a s i g n i f i c a n t
i n c r e a s e i n r e l a t i v e v i s c o s i t y a t- l o w e
r t e m p e r a t u r e s . A l t h o u g h t h e s e s t u d i e s
a r e s o m e -w h a t p r e l i m i n a r y , i t w o u l d a p p
e a r t h a t t h e p h e n o m e n o no f h y p e r v i s c o s i
t y s y n d r o m e i n ' v G 1 m y e l o m a s e e m sm o r e f u
n d a m e n t a l l y r e l a t e d t o e x t r e m e l e v e l s o
f m y e -l o m a p r o t e i n i n t h e c i r c u l a t i o n .The
e x a c t p r o p o r t i o n o f h y p e r v i s c o s i t y s y n
d r o m e c a s e s- t h a t a r e d u e t o ' G 3 p r o t e i n s
r e m a i n s u n c e r t a i n b e c a u s eo f t h e l i m i t e
d n u m b e r o f c a s e s a v a i l a b l e . A t o t a l o f n i
n e
c a s e s o f Y G m y e l o m a w i t h h y p e r v i s c o s i
t y s y n d r o m eh a v e p a s s e d t h r o u g h t h e a u t h
o r s ' l a b o r a t o r y i n c l u d i n gt h o s e d e s c r i
b e d a b o v e ; f i v e o f t h e n i n e p r o v e d t o i n -v
o l v e - i G 3 p r o t e i n s . S i n c e o n l y 7-10% o f m y e
l o m a p r o -t e i n s b e l o n g t o t h e ' Y G 3 s u b g r o
u p , t h i s h i g h p r o p o r t i o na p p e a r s i m p r e s
s i v e . I t s e e m s p r o b a b l e t h a t t h e c o n c e n
-t r a t i o n - a n d t e m p e r a t u r e - d e p e n d e n t a
g g r e g a t i o n d e -s c r i b e d f o r t he se p r o t e i n
s p l a y e d - a s i g n i f i c a n t r o l e i nt h e u s u a l
i n c i d e n c e . The e v i d e n c e o b t a i n e d i n t h e p
r e s e n ts t u d y i n d i c a t e s t h a t t h e h y p e r v i
s c o s i t y s y n d r o m e d e -v e l o p s w h e n 7 G 3 p r o
t e i n s r e a c h a c o n c e n t r a t i o n o f a p -p r o x i
m a t e l y 4 g / 1 0 0 m l . O t h e r 7 G g l o b u l i n s r e q
u i r ec o n si d e r a b l y h i g h e r c o n c e n t r a t i o n
s b e f o r e h y p e r v i s c o s i t yd e v e l o p s .
T h e f i n d i n g o f m u l t i p l e m y e l o m a w i t h a
aG3 p r o t e i ns h o u l d a l e r t t h e c l i n i c i a n t o
t h e p o s s i b i l i t y o f h y p e r -v i s c o s i t y p l a
y i n g a r o l e i n t h e s y m p t o m a t o l o g y a t s o m
ep o i n t i n t h e c o u r s e o f t h e d i s e a s e p a r t i
c u l a r l y i f t h ep r o t e i n p e a k i s a b o v e 4 g / 1
0 0 m l . I n a d d i t i o n , w h e n e v e ra G 3 m y e l o m a
i s d i a g n o s e d , r e d u c t i o n o f t h e l e v e l o fm
y e l o m a p r o t e i n s h o u l d b e a d e f i n i t i v e g o
a l o f t h e r a p y .T h e p r e p o n d e r a n c e o f t h e '
v G 3 s u b g r o u p i n t h i s d i s -o r d e r r e c a l l s t
h e g r o u p o f aG c r y o g l o b u l i n s w i t h a n t i - -g
l o b u l i n a c t i v i t y r e c e n t l y r e p o r t e d b y G
r e y , K o h l e r ,T e r r y , a n d F r a n k l i n ( 7 ) . O f
t h e f i v e p r o t e i n s i n t h e i rs e r i e s w i t h a n
t i - Y G a c t i v i t y , f o u r w e r e v G 3 a n d o n ewas y
G 1 . H o w e v e r , t h e p r o t e i n s r e c o r d e d i n t h
i s p r e s -e n t s t u d y w e r e n o t c r y o g l o b u l i n
s a n d l a c k e d a n t i - y - g l o b -u l i n a c t i v i t y
b y s e v e r a l c r i t e r i a . T h u s t h e m e c h a n i s
mo f a g g r e g a t i o n o f t h e t w o g r o u p s o f p r o t
e i n s a p p e a r s t ob e f u n d a m e n t a l l y d i f f e r
e n t .I t a p p e a r s , t h e r e f o r e , t h a t t h e r e a
r e a t l e a s t t h r e em e c h a n i s m s w h e r e b y t h e
h y p e r v i s c o s i t y s y n d r o m e mayd e v e l o p i n 'G
m y e l o m a . ( a ) T h e p r o t e i n s m ay f o r mr e l a t i
v e l y s t a b l e a g g r e g a t e s o f 1 3 - 1 5 S a s i n t h
e c a s e so f S m i t h e t a l . ( 1 2 , 4 0 ) ; ( b ) e x t r e
m e l e v e l s o f m y e l o m ap r o t e i n s a s o u r c a s e
s o f y G 1 m y e l o m a w i t h h y p e r -v i s c o s i t y s y
n d r o m e ; a n d ( c ) u n s t a b l e c o m p l e x f o r m a
-t i o n o f a G 3 p r o t e i n s .
ACKNOWLEDGMENTSWe a r e p l e a s e d t o a c k n o w l e d g e
t h e a b l e t e c h n i c a l a s s i s t a n c eo f M i s s V i
c k i E i s c h w h o s e c a r e f u l w o r k h a s m a d e t h i
se n d e a v o r a p a r t i c u l a r p l e a s u r e . We t h a n
k D o c t o r s M . G r i e c oa n d T . T a m l y n o f S t . L u
k e ' s H o s p i t a l a n d D o c t o r s G . B e n -n i n g e r
a n d S . K r e p s o f L e n o x H i l l H o s p i t a l f o r t h
e i r h e l pi n t h e d i a g n o s i s a n d m a n a g e m e n t
o f s o m e o f t h e s e p a t i e n t s .We a r e a l s o g r a t
e f u l t o D o c t o r s G . P e n n , L . C a w l e y , M .M a n
n i k , a n d W. T e r r y f o r p r o v i d i n g c e r t a i n s
e r a . O u rt h a n k s a l s o t o D o c t o r s S . U s a m i a
n d S . C h i e n o f t h e D e p a r t -m e n t o f P h y s i o l
o g y , C o l l e g e o f P h y s i c i a n s & S u r g e o n s
, C o -l u m b i a U n i v e r s i t y , who p e r f o r m e d t h
e v i s c o s i t y s t u d i e s a tl o w s h e a r r a t e s .T h
i s i n v e s t i g a t i o n w a s s u p p o r t e d b y U . S . P
u b l i c H e a l t hS e r v i c e G r a n t AM 0 9 7 9 2 . D r . C
a p r a i s r e c i p i e n t o f U . S .P u b l i c H e a l t h S
e r v i c e S p e c i a l F e l l o w s h i p 1 - F 3 - C A - 3 5
,1 9 0 - 0 1 .
REFERENCES1 . G r e y , H . M . , a n d H . G . K u n k e l . 1
9 6 4 . H c h a i n s u b -g r o u p s o f m y e l o m a p r o t e
i n s a n d n o r m a l 7 S - y - g l o b u l i n .J . E x p . M e
d . 1 2 0 : 2 5 3 .2 . T e r r y , W. D . , a n d J . L . F a h e y
. 1 9 6 4 . S u b c l a s s e s o fh u m a n ' y 2 g l o b u l i n
b a s e d o n d i f f e r e n c e s i n t h e h e a v yp o l y p e
p t i d e c h a i n s . S c i e n c e ( W a s h i n g t o n ) . 1 4
6 : 4 0 0 .3 . Y o u n t , W. J . , H . G . K u n k e l , a n d S .
D . L i t w i n . 1 9 6 7 .S t u d i e s o f t h e V i ( ' y 2 , )
s u b g r o u p o f - y g l o b u l i n . J . E x p .M e d . 1 2 5
: 1 7 7 .4 . S p i e g e l b e r g , H . L . , B . G . F i s h k i
n , a n d H . M . G r e y .1 9 6 9 . C a t a b o l i s m o f h u m
a n - y G - i m m u n o g l o b u l i n s o f d i f -f e r e n t h
e a v y c h a i n s u b c l a s s e s . J . C l i n . I n v e s t .
4 7 : 2 3 2 3 .5 . M o r e l l , A . , W. D . T e r r y , a n d T .
W a l d m a n n . 1 9 6 9 . R e l a -t i o n b e t w e e n m e t a
b o l i c p r o p e r t i e s a n d s e r u m c o n c e n t r a -t
i o n o f I g G - s u b c l a s s e s i n m a n . C l i n . R e s .
1 7 : 3 5 6 .6 . Y o u n t , W. J . , R . H o n g , M . S e l i g m
a n n , a n d H . G .K u n k e l . 1 9 6 9 . S t r u c t u r a l g
e n e d e f e c t s a n d p r e p o n d e r a n c eo f ^ y G 3 s u
b g r o u p i n p a t i e n t s w i t h h y p o g a m m a g l o b u
l i n e -m i a . J . C l i n . I n v e s t . 4 8 : 9 2 a . ( A b s
t r . )7 . G r e y , H . M . , P . F . K o h l e r , W. D . T e r r
y , a n d E . C .F r a n k l i n . 1 9 6 8 . Human m o n o c l o n
a l - y G - c r y o g l o b u l i n sw i t h a n t i - - y - g l o
b u l i n a c t i v i t y . J . C l i n . I n v e s t . 4 7 : 1 8 7
5 .8 . R i t z m a n n , S . E . , R . H . T h u r m , W. E . T r u
a x , a n d W. C .L e v i n . 1 9 6 0 . T h e s y n d r o m e o f m
a c r o g l o b u l i n e m i a . A r c h .I n t e r n . M e d . 1
0 5 : 9 5 9 .9 . F a h e y , J . L . , W. F . B a r t h , a n d A .
S o l o m o n . 1 9 6 5 . S e r u mh y p e r v i s c o s i t y s y
n d r o m e . J . A m e r . M e d . A s s . 1 9 2 : 4 6 4 .1 0 . D
e u t s c h , H . F . , a n d J . I . M o r t o n . 1 9 5 8 . Human
s e r u mm a c r o g l o b u l i n s a n d d i s s o c i a t i o n
u n i t s . I . P h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e s .
J . B i o l . C h e m . 2 3 1 : 1 1 0 7 .1 1 . V a e r m a n , J .
P . , L . B . J o h n s o n , W. M a n d y , a n d H . H .F u d e n
b e r g . 1 9 6 5 . M u l t i p l e m y e l o m a w i t h t w o p a
r a p r o -t e i n p e a k s . J . L a b . C l i n . M e d . 6 5 :
1 8 .1 2 . S m i t h , E . , S . K o c h w a , a n d L . R . W a s
s e r m a n . 1 9 6 5 .
A g g r e g a t i o n o f I g G g l o b u l i n i n v i v o . A
m e r . J . M e d . 3 9 :3 5 .1 3 . B j o r n e b o e , M . , a n d
K . B . J e n s e n . 1 9 6 6 . A c a s e o f m y e l o -m a t o s
i s w i t h n o r m a l c o l l o i d o s m o t i c p r e s s u r e
i n s p i t e o fe x t r e m e l y h i g h s e r u m p r o t e i n
c o n c e n t r a t i o n . A c t a M e d .S c a n d . S u p p l .
4 4 5 : 2 1 2 .1 4 . K o p p , W. L . , G . J . B e i r n e , a n d
R . 0 . B u r n s . 1 9 6 7 .H y p e r v i s c o s i t y i n m u l
t i p l e m y e l o m a . A m e r . J . M e d . 4 3 :1 4 1 .1 5 . M
a c K e n z i e , M . R . , a n d H . H . F u d e n b e r g . 1 9 6
7 . R o l e o fi n t r i n s i c v i s c o s i t y i n m y e l o m
a h y p e r v i s c o s i t y s y n d r o m e .C l i n . R e s . 1
5 : 3 8 8 .6 2 0 J . D . C a p r a a n d H . G . K u n k e l
-
7/28/2019 Aggregation of YG3 Proteins
12/12
1 6 . N a t v i g , J . B . , a n d H . G . K u n k e l . 1 9 6
8 . G e n e t i c m a r k e r so f h u m a n i m m u n o g l o b u
l i n s . S e r . H a e m a t o l . 1 : 6 6 .1 7 . P o r t e r , R
. R . 1 9 5 9 . T h e h y d r o l y s i s o f r a b b i t y - g l o
b u l i na n d a n t i b o d i e s w i t h c r y s t a l l i n e p
a p a i n . B i o c h e m . J . 7 3 :1 1 9 .1 8 . M c C o n a h e y
, P . J . , a n d F . J . D i x o n . 1 9 6 6 . A m e t h o d o ft
r a c e i o d i n a t i o n o f p r o t e i n s f o r i m m u n o l
o g i c s t u d i e s .I n t e r n . A r c h . A l l e r g y A p p
l . I m m u n o l . 2 9 : 1 8 5 .1 9 . O l i n s , D . E . , a n d
G . M . E d e l m a n . 1 9 6 4 . R e c o n s t i t u t i o no f 7
S m o l e c u l e s f r o m l i g h t a n d h e a v y p o l y p e p
t i d e c h a i n so f a n t i b o d i e s a n d - y g l o b u l i
n s . J . E x p . M e d . 1 1 9 : 7 8 9 .2 0 . T r a u t m a n , R
. 1 9 5 6 . O p e r a t i n g a n d c o m p a r a t i n g p r o c e
-d u r e s f a c i l i t a t i n g s c h l i e r e n p a t t e r n
a n a l y s i s i n a n a l y t i c a lu l t r a c e n t r i f u g
a t i o n . J . P h y s . C h e m . 6 0 : 1 2 1 1 .2 1 . K e g e l
e s , G . , a n d C . L . S i a . 1 9 6 3 . An u l t r a c e n t r
i f u g a lf i e l d r e l a x a t i o n m e t h o d f o r m o l e
c u l a r w e i g h t s . B i o c h e m -i s t r y . 2 : 9 0 6 .2 2
. W i l l i a m s , D . E . , a n d R . A . R e i s f e l d . 1 9 6
4 . D i s c e l e c t r o -p h o r e s i s i n p o l y a c r y l a
m i d e g e l s . A n n . N . Y . A c a d . S c i .1 2 1 : 3 7 3 .2
3 . J o r d a n , E . M . , a n d S . R a y m o n d . 1 9 6 9 . G e
l e l e c t r o p h o r e -s i s : a n e w c a t a l y s t f o r a
c i d s y s t e m s . A n a l . B i o c h e m . 2 7 :2 0 5 .2 4 . W
a l l e r , M . V . , a n d J . H . V a u g h a n . 1 9 5 6 . U s e
o f a n t i Rhs e r a f o r d e m o n s t r a t i n g a g g l u t i
n a t i o n a c t i v a t i n g f a c t o r i nr h e u m a t o i d
a r t h r i t i s . P r o c . S o c . E x p . B i o l . M e d . 9 2
: 1 9 8 .2 5 . C h i e n , S . , S . U s a m i , H . M . T a y l o
r , J . L . L u n d b e r g , a n dM . I . G r e g e r s e n . 1 9
6 6 . E f f e c t s o f h e m a t o c r i t a n d p l a s m ap r o
t e i n s o n h u m a n b l o o d r h e o l o g y a t l o w s h e a
r r a t e s .J . A p p l . P h y s i o l . 2 1 : 8 1 .2 6 . M e r r
i l l , E . W . , E . R . G i l l i l a n d , G . C o k e l e t , H
. S h i n ,A . B r i t t e n , a n d R . E . W e l l s . 1 9 6 3 .
R h e o l o g y o f b l o o da n d f l o w i n t h e m i c r o c i
r c u l a t i o n . J . A p p l . P h y s i o l . 1 8 :2 5 5 .2 7 .
W h i t m o r e , R . L . 1 9 6 8 . R h e o l o g y o f t h e C i r
c u l a t i o n .P e r g a m o n P r e s s L t d . , O x f o r d .2
8 . S c h a c h m a n , H . K . 1 9 5 9 . U l t r a c e n t r i f u
g a t i o n i n B i o -c h e m i s t r y . A c a d e m i c P r e s
s I n c . , New Y o r k . 6 0 .2 9 . J o s e p h s , R . , a n d W.
F . H a r r i n g t o n . 1 9 6 8 . On t h e s t a -b i l i t y o f
m y o s i n f i l a m e n t s . B i o c h e m i s t r y . 7 : 2 8 3
4 .
3 0 . S c h a c h m a n , H . K . , 1 9 5 9 . U l t r a c e n t
r i f u g a t i o n i n B i o -c h e m i s t r y . A c a d e m i c
P r e s s I n c . , New Y o r k . 1 7 4 .3 1 . K u n k e l , H . G
. , J . B . N a tv i g , a n d F . G . J o s l i n . 1 9 6 9 .A " l
e p o r e " t y p e o f h y b r i d ' y - g l o b u l i n . P r o c
. N a t . A c a d .S c i . U . S . A . 6 2 : 1 4 4 .3 2 . F r a n g
i o n e , B . , a n d C . M i l s t e i n . 1 9 6 8 . V a r i a t i
o n i n t h eS - S b r i d g e s o f i m m u n o g l o b u l i n G
: i n t e r c h a i n d i s u l f i d eb r i d g e s o f y G 3 m y
e l o m a p r o t e i n s . J . M o l . B i o l . 3 3 : 8 9 3 .3 3
. F a h e y , J . L . 1 9 6 3 . S e r u m p r o t e i n d i s o r d
e r s c a u s i n gc l i n i c a l s y m p t o m s i n m a l i g n
a n t n e o p l a s t i c d i s e a s e . J .C h r o n i c D i s .
1 6 : 7 0 3 .3 4 . W a l d e n s t r o m , J . 1 9 5 2 . A b n o r
m a l p r o t e i n s i n m y e l o m a .I n A d v a n c e s i n I
n t e r n a l M e d i c i n e , V o l . 5 . W. D o c k a n dI . S n
a p p e r , e d i t o r s . T h e Y e a r B o o k P u b l i s h e r
s I n c . ,C h i c a g o .3 5 . S o m e r , T . 1 9 6 6 . T h e v i
s c o s i t y o f b l o o d , p l a s m a a n ds e r u m i n d y s
- a n d p a r a p r o t e i n e m i a s . A c t a M e d . S c a n d
.S u p p l . 4 5 6 : 1 .3 6 . S t e e l , A . E . 1 9 6 3 . T h e l
a b o r a t o r y d i a g n o s i s o f m a c r o -g l o b u l i n
e m i a b y v i s c o m e t r y . C l i n . C h i m . A c t a . 8 :
8 6 .3 7 . R e e s , S . B . , R . A . C a m e r i n i - C a v a l
o s , J . B . C a l u l f i e l d ,0 . L a z a n o - C a s t o n e
d a , A . C e r v a n t e s - A m e n z a , J . T a t o n ,D . P o
m e t t a , G . P . K r a u t h a m m e r , a n d A . M a r b l e .
1 9 6 3 .T h e p a r t h o l o g i c a l p h y s i o l o g y o f m
i c r o a n g i o p a t h y i n d i a -b e t e s . T h e C i b a F
o u n d . S y m p . E t i o l o g y D i a b e t e s M e l l i t u
sa n d i t s C o m p l i c a t i o n s , 3 1 5 .3 8 . C o p l e y ,
A . L . , a n d G . W. S c o t t B l a i r . 1 9 6 0 . H a e m o r
h e o -l o g i c a l m e t h o d f o r t h e s t u d y o f b l o o
d s y s t e m s a n d o fp r o c e s s e s i n b l o o d c o a g u
l a t i o n . I n F l o w P r o p e r t i e s o fB l o o d . A . L
. C o p l e y a n d 0 . S t a i n s b y , e d i t o r s . P e r g a
m o nP r e s s L t d . , O x f o r d . 4 1 2 .3 9 . C h a r m , S .
, a n d G . S . K u r l a n d . 1 9 6 2 . T u b e f l o w b e h a v
-i o r a n d s h e a r s t r e s s / s h e a r r a t e c h a r a c
t e r i s t i c s o f c a n i n eb l o o d . A m e r . J . P h y s
i o l . 2 0 3 : 4 1 7 .4 0 . K o c h w a , S . , E . S m i t h , M
. B r o w n e l l , a n d L . R . W a s s e r -m a n . 1 9 6 6 . A
g g r e g a t i o n o f I g G g l o b u l i n i n v i v o . I I .P
h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f t h e i s o l a
t e d p r o t e i n . B i o -c h e m i s t r y . 5 : 2 7 7 .
A g g r e g a t i o n o f ' v G 3 P r o t e i n s 6 2 1
![((Title)) · Web viewHowever, membrane proteins encapsulated even in these popular detergents are often prone to denaturation and aggregation.[9] Thus, it is difficult to conduct](https://img.dokumen.tips/doc/110x75/60c211dff809467b6e660a31/title-web-view-however-membrane-proteins-encapsulated-even-in-these-popular.jpg)
