UNTERSUCHUNG ENZYMATISCHER PROZESSE IN DER LEBENDEN PFLANZE

VON A. L. KURSSANOV

Moskau

INHALT

I. Allgemeine Vorstellungen iiber die Wirkung der Enzyme in lebenden Zellen 329 11. Bestimmung der Aktivitat von Enzymen in lebenden pflanzlichen Geweben 334

111. Bedingungen,, von denen die reversible Wirkung der Enzyme in lebenden Xsllen abhlingt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 343

1. Die enzymatischen Prozesse in den Zellen in ihren Beziehungen zu den Art-und Sortenverschiedenheiten der Pflanzen . . . . . . . . . 348

2. Speicherung von Vorratsstoff en m d allgemeine Ertragsffihigkeit der Pflanzen als Resultat reversibler enzymatischer Reaktionen . . . . . 348

3. Die vorherrschende Richtung der enzymatischen Prozesse im Zusam- menhang mit der Entwicklung der Pflnnze . . . . . . . . . . . 352

4. Einfluss der Aschenelemente auf die enzymatischen Prozesse in Pflanzen. ; . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 356

5. Einfluss der Temperatur auf die ,Wirkung der Enzyme in lebenden Z e l I e n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 361

6. Wasserhaushalt und Diirre-Resistenz . . . . . . . . . . . . . . 364 V. Zusammenfassung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 366

Literaturverzeichnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 367

PAGE

IV. Die physiologische Rolle der Enzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . 347

I. Allgemeine Vorstellungen iiber die Wirkung der Enzyme in lebenden Zellen

Die Lehre von den Enzymen entwickelte sich anfanglich unter dem Ein- fluss von Anregungen, die biologischen Fragestellungen entstammten, welche den Stoffumsatz in Organismen betrafen. In Anbetracht der gros- sen Empfindlichkeit der Enzyme gegenuber verschiedenen Einwirkungen chemischer, physikalischer und physikalisch-chemischer Art bot indessen das Studium der Enzyme in den Geweben und besonders im intakten Organismus erhebliche Schwierigkeiten die in Zusammenhang standen mit der kompliderten und unbestimmten Zusammensetzung des naturlichen Mediums, in dem die Enzyme ihre biologischen Funktionen verrichten.

329

Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology, Volume 1 Edited by F. F. Nord, C. H. Werkman

Copyright © 1941 by Interscience Publishers, Inc.

330 A. KURSSANOV

Dies gab den Anlass zur Entwicklung zahlreicher Methoden fur die priG parative Darstellung der Enzyme und fur ihre Reinigung von Begleitstof- fen. Die Anwendung solcher gereinigter Praparate ermoglichte es den Forschern, ihre Experimente unter ubcrsichtlicheren Bedingungen durch- zufuhren und auf diese Weise den Ablauf enzymatischer Reaktionen und ihre Beeinflussung durch verschiedene Faktoren zu verfolgen. Auf diesem Wege gelang es nicht nur uber viele wichtige Besonderheiten enzymatischer Reaktionen Aufschluss zu gewinnen, sondern auch die chemische Natur einer Reihe von Enzymen zu ergrunden.

Gerade die Erfolge der Arbeit mit isolierten Enzympraparaten haben indessen dazu gefuhrt, dass sich die Enzymforschung weiter und weiter von den Fragen der Biologie entfernte und zu einem selbststandigen wissen- schaftlichen Fach wurde.

Man rechnete anfanglich darauf, dass das Studium der Enzyme in1 kiinstlichen, vereinfachtem Milieu es gestatten wiirde, die erzielten Re- sultate fur die Klarstellung der physiologischen Rolle der Enzyme bei den Lebensausserungen der Organismen zu verwerten. Diese Hoff nung ist aber in manchen Fallen nicht in Erfullung gegangen. Zwischen dem Verhalten der Enzyme in kunstlichen Gemischen und in lebenden Organis- men besteht ein wesentlicher Unterschied, der die Auswertung des “rein enzymologischen” Versuchs zur Losung physiologischer Probleme er- schwert. In kiinstlichen Systemen ist namlich die Wirkung der Enzyme fast immer einseitig (z.B. hydrolytisch), wahrend die enzymatischen Vorgange in lebenden Zellen in der Regel Zeicht reversibel sind. Daher sind auch die Gesichtspunkte bei der Beurteilung der Enzymwirkungen grundsatzlich verschiedene, je nachdem ob es sich um Wirkungen in vitro oder in vivo handelt. Wahrend namlich die Wirkung eines Enzympraparats an der Geschwindigkeit des Substratumsatzes (z.B. der Hydrolyse) gemessen wird, und die Einflusse verschiedener Agenzien auf das Enzym eben von diesem Standpunkt aus beurteilt werden, ist fur das Verhalten eines En- zyms in der lebenden Zelle weniger seine Gesamtquantitat kennzeichnend als das Verhaltnis der Geschwindigkeiten seiner synthetisierenden und hydrolysierenden Wirkungen, welches die Richtung des enzymatischen Pro- zesses im Organismus bestimmt, und eben dieser Gesichtspunkt ist fiir die Beurteilung verschiedener Wirkungen auf die Enzyme in der Zelle mass- gebend.

Die Bedingungen, von denen die Geschwindigkeit und die Richtung enzymatischer Reaktionen in den Zellen abhangen, fesselt schon seit langem die Aufmerksamkeit der Forscher. Es tauchte vor Allem die Frage nach den Ursachen auf, denen zufolge in der Zelle Enzyme und ihre nicht abge-

t N L \ J I I T l s C I I E PROZESSE IN DEB LEUENDEh 1 ’ 1 1, \\Lh s3 1

bauteii Substrate ncbeneinnnder bestehen koiiiieri, z.B. Amylase und Stiirke, protcolytische Enzyme und Eiweisskorper, U.S.W.

Da bei Bcruhruiig roii Etizymcn init dtw cntsprcc.henden Substraten in homogciier wHsserigcr Losung praktisrh rollstiindige Spaltung der Sub- st.rate erfolgt, mirdc atig(!tioiiimt~n, dass die Etizyine uiid die Substrate in dcr lebetidcn Zelle rBuriilicli \.onc4rin,iidrr getrennt sind. Hieraus erwuchs die Vorstcllurig von der Uiiglc~irlimdseigkrit oder Hct erogeneitat des natur- lichrn Mediunw, in dcrii die, Ilnzytii(b ilirc \Virkungcn ausuhcn. Iliese bcreits WII F. Hofnwistclr (1) gc%uw~rtc~ .inschnuung nwdc spiiter durch W. Palladin (2) iuid :tiidcrcti A\utorcvi nusgc4):tut. Dckutlicher und exakter konntc die Frnge auf grund dcr Xrlxit8cn voii A. 0p:trin und seinen Mit- arbeiterii (3) forniulicrt \wrdcn , dic in zahlreichen Modellversuchen zcigen konnten, dass dic hdsorptiotl ti 1Stizytncn ail F:i\\.rissniederschlageti in tnanchen Fallen dict hydrolytisclic \\’irkung dcr Enzymi~ aufheht. A-h~s diesen Befundeli zog Ll. Opariii d ~ t i Schliiss, dass die Rcgulierung der hydrolytischen Wirlwig d t ~ r 1S1izy11ic i n dcli Zcllcn ii icht allcin durch r8umlicIic Trtiiiiiuig voti Sitl,st,ratcw iind Enzynic:n zustandekoninit, son- dcrii a u r h durcli innktivicrc~tidc =\dsorption der Eiizynie auf dcn Stniktur- gclddrn dcs Plasrius. Es ist, abcr einleuclitcnd, dass die reguliercnden Kinflusw in l(4)cndcn Zcllcn niclit iiur in einer Tt:rstMrkung oder Schwa- rliutig dw Hydrolysc I)cst,clicti, sondcrii anch die syntlictiscliim Fiinkt,ioiien der Ehzymct Ix,ruhrcn.

In Ubereinstiminung mit der v6n’t Hoff’schcn Glcichuiig verliuft die Hydrolyse der Substrate enzymatischer Reaktioiien desto vollstiindigrr, je IiZiIier der Wasser- gehslt des Rcnktionsgemisches ist; durch Ausschaltung xori Wnsser aus dem Syateni muss unigekehrt dic Syntliese begiinstigt welden (4). In eirier lieihe voii Arbeitsui i r i i t Enzyinpriipamteii gclang es t:itaiichlich, durch Anirentluiig wnsserfreier Medien die synthetisierende Wirkung der Enzyme zur .&ussenma xu bringen. 1Ss unterliegt keinem Zireifel, ditss diese C;esetzriiiissigkeiten aucli die I~iclitntig tier enzyrnstischen Rcaktionen in dcr lebenden Zelle bis zu cinern geirissen Gra t ie bceinflussen.

\Venn iiian aber die lebctidc Zdlc , die 70-805; W a r enthiilt, als ein hoinogcitcs Medium betrachtet, so c~gcthcn sich von voriilwrcin Busserst ungunstige Bedingungen fur ~~nzyni:tt~iscIic Syntlicscii. Man ist, dahcr zu der Annahme genotigt, dass in dt:r Zcllc trotz ihrcs Wasserreichtuins bestiinintc “trocknerc” Bcziriici i*orlicgcw, it1 deiicn die Bcdingmigcn fur enzymatische Synt,liesm geeignctcr licgcn. \ \ lr gelangcn auf dime Weise wiederuin zur Vorstellung voti d(Sr Hctcrogtwitat, dcr Zelle und ciner hiermit rcrltriupftcn Iicgulic~rut ig dw iiit razc4luliircn ISiizyiii\~irk~mgcn.

Xllc dicse Erwagungen v w d w voti .L 0p:uiii i n scincr in den Jahreti 1935-37 aufgestellteri l’heorie in Betraclit gczogcn ( 5 ) . Dieseri Vorstel-

332 A. EURSSANOV

lungen gemass, ist ein Teil des Enzyms in der lebenden Zelle in Losung vorhanden und ubt in diesein Zustand einseitige hydrolysierende Wirkung aus. Der andere Teil ist dagegen an wasserarmen plasmatischen Struktur- gebilden adsorbiert und ist nur in synthetischer Richtung wirksam. Dem- gemass wird die Synthese und die Hydrolyse des Substrats in der lebenden Zelle durch ein und dasselbe Enzym vollzogen, obgleich beider Prozesse voneinander raumlich getrennt sind.

Die Strukturgebilde des Prot.oplasmas miissen auch dadurch die eneymatischen Synthesen hegiinstigen, dass die Ausgangsprodukte der Synthese in hohen Konzentra- tionen an ihnen angereichert werden konnen. Verschiedenartige Modellversuche des Autors dieser Theorie, sowie anderer Forscher (vgl. z.B. H. Marston (6), A. Kusin und 0. Bogdaschevskaya (7) u.a.) bestatigen die Annahme, dass heterogene Beschaffen- heit des Mediums und die hiermit verbundene Konzentrierung und Adsorption der Substanzen tatsiichlich die hydrolytische Wirkung von Enzymen vermindert und das Zustandekommen von Synthesen begiinstigt. Indirekt wird diese Theorie auch durch die Tatsache gestiitzt, dass in Geweben mit hoher synthetischen Enzymaktivitat, z.B. in reifenden Samen, Zuckerriibenaurzeln, Kartoffelknollen und vielen anderen, der ubewiegende Anteil der Enzyme in adsorbiertem Zustand vorliegt.

Zu ahnlichen Vorstellungen gelangen auf anderem Wege die Cytologen, die durch direkte Beobachtung der Bildung und des Abbaus der Zellsub- stanzen feststellen konnten, dass die synthetischen Funktionen nicht diffus uber die ganze Zelle verstreut, sondern vielmehr an bestimmte Zentren gebunden sind, und zwar an die Mitochondrien, Chondriosomen und dereri Abarten-die Plastiden (vgl. E. Horning (€9, A. Kurssanov (9)). Schliess- lich berechtigt auch die chemische Analyse der Plastiden, die einen erhohten Gehalt an wasserfreier lipoider Phase aufweisen (s. z.B. W. Menke (10)) und bedeutende Enzymmengen (I(. Linderstrglm-Lang und H. Holter (11)) enthalten, diese Gebilde als geeignete Zentren fur enzymatische Synthesen in der Zelle zu betrachten. Ebenso geeignet fur die enzymatischen Syn- thesen, kann auch die an Lipoiden reiche Oberschichte des Protoplasmas betrachtet werden (A. Kurssanov (9)).

Neben der Erforschung der Adsorption als eines regulierenden Prinzips der Enzymwirkungen in der Zelle, wurde das Problem auch vom Stand- punkt der Energiebilanz aus bearbeitet. Aus dem Vergleich der Verbren- nungswarmen geht hervor, dass die synthetisierten Produkte in der Regel energiereicher sind als die Ausgangsstoffe. Allerdings sind die Differenzeii im Falle hydrolytischer Enzyme gewohnlich nicht gross, aber dennocll hinreichend um die Frage nach dem Ursprung der Energie fur die enzymati- schen Synthesen zu rechtfertigen. Es haben daher manche Forscher dieser Seite des Problems ernstliche Beachtung gewidmet (vgl. z.B. H. Borsook

ENZYhUTISCHB PROZESSE IN DER LEBENDEN PFLANZE 333

(12), A. Blagowestschenski (13)). Der Grundgedanke dieser Forschungs- richtung ist der, dass die Energie gleichzeitig ablaufender exothermer Reaktionen, z.B. Oxydationen, auf die enzymatischen Synthesen uber- tragen wird. In manchen Versuchen, die mit gelosten Enzympraparaten oder Gewebsbreien angestellt wurden, konnten enzymatische Synthesen tatsachlich durch dss Ablaufen einer exothermen Reaktion im Medium begiingstigt werden (J. Abelous und H. Ribaut (14), A. Blagowestschenskf und K. Nikolaev (15) u.a.). Diese Vorstellungen lassen sich auch gut auf die lebende Zelle anwenden, in der einzelne enzymatische Oxydationsreak- tionen oder der Atmungsprozess in1 Ganzen als Energiequellen dienen konnen.

Ohne die Moglichkeit der Beteiligung von Oxydationsvorgangen an der Steuerung reversibler Enzymwirkungen in Abrede zu stellen, konnen wir jedoch vermuten, dass diese Vorgange nicht die einzigen Energiequellen in den Zellen darstellen.

Als weitere, sehr wesentliche Energiequelle fur enzymatische Synthesen kommen verschiedene zusatzlichen Energieformen in Betracht, z.B. Ad- sorptionen, osmotische Druckdifferenzen u.dgl. die im lebenden Proto- plasma durch stetigen Energieaufwand bei anderen Prozessen erzeugt und unterha’ten werden.

Es kann zurzeit knum bezweifelt werden, dass die Struktur des lebenden l’rotoplasmas keine passive Zustandsform der Zellsubstaiiz ist, sondern ein aktiv ablaufender Prozess, fur den ununterbrochene Energiezufuhr erfor- derlich ist (vgl. E. Bunning (16), W. Stiles (17) ma.). W. Lepeschkin weist darauf tiin, dass im lebenden Protoplasma die wichtigsten Substanzen -Proteine und Lipoide-zu labilen chemischen Verbindungen zusammen- gefugt sind (Vitnide), die beim Absterben der Zelle unter Abgabe von Warme iind strahlender Energie verfallen (18). Die eigenartige chemische Zusam- niensetziing des lebenden Protoplasmas geht auch aus einer Arbeit von F. Vles und PI. Gex (19) hervor, in der die Verschiedenheit der Absorptions- spektra des lebenden und des toten Zellinhalts nachgewiesen wurde.

Schliesslich aussert sich der energetische Zustand des lebenden Proto- plasmas in ununterbrochener Zirkulationsbewegung und in der Bildung zahlreicher flussiger Strukturen, deren Existenz nur bei stetigem Bnergie- aufwand nioglich ist. Die Besonderheit der Struktur des lebenden Proto- plasmas sind in den cytologischen Untersuchungen von A. Guilliermond (20) deutlich zutage gebracht. Besonderer Beachtung verdieiit auch die Tatsache, dass die Eiweissmolekule, die normalerweise globularen Aufbau haben (D. Talmud (21) in der lebenden Zelle in gestreckter Form vorliegen (W. Lepeschkin (18), J. Lengmur (22)) und sich folglich in Beaug auf ihren

331 A. KURSSANOV

Energieinhalt von dem zustand des inerten Eiweisses sehr stark unter- scheiden.

Es folgt, hieraus, dass der reine Vergleich der Verbrennungswarmen einzelner Substanzen noch lange nicht a.usreichend ist zur Beurteilung der Energiebilanz yon Reakt,ionen, die sich in derart komplizierter Umge- bung abspielen, wie sic das lcbende Protoplasma darstellt, denn die Ener- gieniveaus der Reaktionstcilnehmer konnen durch die vitale Sbruktur des Protoplasmas t,iefgrcifend geandert werden. Infolgedessen konnen uiiter den betreffenden Verhaltnissen nicht nur die Hydrolyscn, sondern auch die Synt,hesen exotherme Vorgange darstellen.

Es l a s t sich zurzcit schwerlich entscheiden, ob die intravitale Struktur des Plasmas unmittrlbar durch die Energie der At.mung aufrecht crhalten wird, wie W. Lepthschkiii (23), Ii. Paech (24), W. Stiles (17) und anderc annehmcn, odcr ob dies auf den1 Wege mehr oder weniger komplizierter Energieumwaridlungeii in irgendwelchen Oxydations-Reduktions-Syste- men erfolgt.

Es erscheint jcdoch jetzt schon der Schluss berechtigt, dass Struktur und Energie iiibezug auf enzymntische Synt,heseri in den Zellen z w i Aspekte ein und dersclben Erschcinung darstellen (A. Kurssanqv (25)).

Es folgt hieraus, dass die thcoretischen Vorst,ellungen A. Oparin (5) , denenzufolge die Reversibilitat enzymatischer Reaktionen auf Phanomenen der Adsorption vori Substraten und Enzymen im heterogenen Medium beruhen, eigcntlich auch den Bcgriff der Energie umfassen, die fur die Bildung und Aufr.echtc~rtialtung der Strukturgebilde im lebenden Proto- plasnia erforderlich ist.

11. Bestimmung der Aktivitat von Enzymen in lebenden pflanzlichen Geweben

Die Verfahren zur Bestiminriiig von Enzynien in den Geweben von Tieren oder Pflanzen beruhtcn bis in die letzte Zeit hauptsachlich auf der Rlethode autolytischer Gmische.

Das Prinzip dieser Methode besteht in der Freilegung der Zellfermente durch mog- lichst vollstiindige mectianische Zerstorungen der Gewebe, wonach in der zerriebenen Masse die Geschwindigkeit der enzyrnatischen Spaltung verschiedener Substanzen gemessen wird. Da hierbei die Struktur des lebenden Protoplasmas und damit auch die Reversibilitst der Enzyrnwirkungen gewohnlich vollstiindig verloren geht, sind die autolytischen Gernische eher stark verunrcinigten Enzyrnpriiparatoren als lebenden Zellen gleichzusetzen. Es nirnrnt deshalb nicht Wunder, dass es bei weitem nicht immer gelingt, auf diese Weise erhaltene Resultate mit der Richtung und dem all- gemeinen Charakter der physiologischen Tatigkeit lebender Organismen in Einklang zu bringen.

ENZYMATISCHE PROZESSE IN DER LEBENDEN PFLANZE 335

Noch bcdcnklicher sind die Yerhaltnisse, die inan beim Arbeiten mit autolytischen Gemischen schafft, indem man durch spezielle Massnahmen “optimale” Bedingungen fur die Wirkung der Enzyme zu sichern bestrebt ist. Der Zusatz von Wasser zu dem zerriebenen Material, die Einstellung des pH und der Teniperatur auf Werte, die fur das betreffende Enzym optimal sind, dcr Ziisatz von Antiscptica u.s.w., stellen Bedingungen her, die sogar in Bezug auf vinscitige Enzymwirkung vollstandig von den in der lebendcn Zcllc vorhcrrschenden ahweichcn. Die Kompliziertheit des Bildes wird noch dadurch gestcigert, dass die Enzyme infolge des Zerreibens der Gewebe mit manchcn Substanzcn in Beriihrung kommen, die in der lebenden Zelle von den Enzymcn raumlich getrennt warcn und die ihre Wirkung auf diese oder jene Weisc zu beeinflussen vermogcn. Hierher gehiiren ziim Beispiel die Gerbstoffe, deren Anwesenheit in pflanzlichen Geweben mituntcr das Arbciten mit autolytischen Gemischen infolge voll- standiger Inaktivierung der Enzyme ganzlich vereitelt. Die nach der Methode dPr autolytischen Gemische ermittdten Enzymaktivitaten sind dem- zujolge in hohem Massp kqnventionell.

Obige Betrachtungen fuhrcn zwar zu dem Schluss, dass die Methode der autolytischen Geniische fur Beobachtungen iibrr die physiologischen Vorgange in Zcllen wenig grcignet iqt ; cs ware indessen falsch, diesem Ver- fahren jegliche Bedcutung absprcbchen z u wollen, dcnn in manchen Fallen, zum Beispiel wenn es lediglich gilt, dbs Vorhandensein cines gewissen Enzyms im untersuchtcn Objckt fcstzustellen, kann die Methode der autolytischen Gcmische gutc Dienste leisten. \-on Bedeutung ist die Methode auch zur Priifung der eneymatischen Aktivitat industriell ver- arbeiteter illaterialien, zum Beispiel bei der Beiirtdung der Backfahigkeit von Mehl, des Verzuckerungsvermogcns von Malz, der Enzymaktivitat in gerollten Teeblattern u.dgl. In allcri ditscn Fallen wirken die Enzyme linter annahernd denselhcn Bedingungen wie in autolytischen Gemischen. In ahnlicher Weise sind schliesslich Bestimmungen der Enzymaktivitat in den Verdauunghsaften von Tieren und insektenfres- senden Pflanzen auszufuhren, insofern die physiologische Rolle der von den Zellen sezernierten Enzyme in einseitiger hydrolytischer Wirkung besteht.

Was die intrazellularen Enzyme bttrifft, so lasst sich das Studium ihrer physiologischen Rolle im Organismus nur d a m mit Erfolg betreiben, wenn die Intaktheit der Zellen gesichert ist.

In dem Bestreben, die Lucken in unserer Kenntnis der intrazellularen enzymatischen Prozesse bis zu einem gewissen Grad auszufullen, wurden von mir seit 1934 Studien uber die Wirkung der Enzyme in lebenden Pflan- zenzellen durchgefuhrt.

336 A. KURSSANOV

Die erste Aufgabe, deren Losung zur Verwirklichung dieser Absicht erfor- derlich war, betraf die Ausgestaltung von Methoden zur quantitativen Bestimmuiig der Aktivitiit voii Enzymen in lebenden Geweben.

Zu diesem Zwecke machten wir von der Methode der Vakuuminfiltration Gebrauch, die fruher von A. Virtnnen, J. Bjorksten (26), und 1C. Mothes (27), zur Unterrsuchung des Eiweissstoffwechsels der hoheren Pflanzen angewendet worden ist. Der Vorteil dieser Methode gegenuber anderen Methoden zur Einfuhrung verschiedener Sub- stanzen in das pflanzliche Objekt besteht in der Geschwindigkeit und Gleichmassigkeit, mit der es gelingt, in den Chveben der Pflanze Losungen jener Substanz anzureichern, deren Umwandlung untersucht nerden soll. Darum wird in Vakuuminfiltrationsver- suchen die Geschwindigkeit der eneymatischen Reaktionen nicht durch Mange1 an Substrat verzogert.

Eine andere Bedingung, die zu beachten ist, wenn man den Messungen der Geschwindigkeit enzymatischer Prozesse in der Zelle quantitativen Wert verleihen will, besteht darin, die Dauer der Versuche SO kurz abzu- messen, dass die Umwandlungen dzr eingefuhrten Substanzen wahrend der Versuchszeit nicht zum Abschluss kommen. Diese letztere Bedingung wurde in fruheren Untersuchungen ofters vernachlbsigt ; infolgedessen erhielt man fur die Geschwindigkeiten enzymatischer Prozesse beim Um- rechnen pro Zeiteinheit Werte, die so gering waren, dass sie auf keinen Fall mit der tatsachlichen -Geschwindigkeit des Ab- und Aufbaus der Sub- stanzen in der lebenden Pflanze in Vergleich gesetzt werden konnten.

Unter Beriicksichtigung dieser Anforderungen gelang es uns, quantitative Messungen der Enzymaktivitiiten in lebenden Pflanzen durchzufuhren.

Zu diesem Zweck wurden Methoden entwickelt fur die BeFtimniung der hydrolysierenden und synthetisierenden Wirkung der Invertase (Sac- charase) (A. Kurssanov (28)), der synthetisierenden Wirkung der Proteasen (A. Kurssanov und K. Bryuschkova (29)), solvie der phosphorylierenden und dephosphorylierenden Wirkung der Phosphatasen (A. Kurssanov und N. Kryukova (30), A. Kurssanov (31)). Femer haben B. Rubin und K. Syssakyan (32) von denselbcn Prinzipien ausgehend, cine Methode zur Mes- sung des Oxydations- und Reduktionsvermogens lebender Pflanzengewebe ausgearbei te t .

Die hydrolysierende Wirkung der Invertase wird gemessen an der Geschwindigkeit der Spaltung von ins lebende Gewebe infiltrierter Sac- charose, die synthetisiereiide Wirkung nach der Geschwindigkeit der Synthese dieses Disaccharids aus einem Gemisch voii Fructose und Glu- kose.

Zahlreiche nach dieser klethode ausgefuhrte Versuche ergaben, dass fiir Invertase in Pflanzen ein best'immtcs, mehr oder weniger konstantm Ver-

ENZWTISCHE PROZESSE I N DER LEBENDEN PFLANZE 337

haltnis zwischen den Geschwindigkeiten der synthetisierenden und hydro- lysierenden Wirkung besteht, solange die ausseren Bedingungen und der Innenzustand der Zellen konstant gehalten werden. Dieses Verhaltnis, nach dem wir die vorherrschende Richtung des enzymatischen Prozesses beur- teilen, kennzeichnet die Einstellung der Pflanze oder ihrer einzelnen Organe auf vorzugsweise Speichcrung von Sxcharose oder von Monosen.

Bci kunstlicher Versehiehung des normalen Verhaltnisses zwischen Monosen und Saccharose durch Infiltration von Bliittern mit einer Losung der betreffenden Zucker setzt sofort, in Ubereinstinimung mit dem Massen- wirkungsgesetz eine einseitige Invertasewirkung ein, die auf Wiederher- stellung des gestorten Gleich- gewichts gerichtet ist. Diese Wirkung dauert so lange an, bis die urspriingliche Gleich- gewichtshge wiederhergestellt ist. (A. Kurssanov (281, s. Abb.1.)

Folglich ist das hierbeschrie- bene Verfahren zur quan- titativen Bestimmung der synthetisierenden und hydro- lysierenden Enzymwirkungen in 1ebendt.n Geweben eigent- lich ein Verfahren zur Mes- sung der Geschwindigkeit, mit der der Enzymapparat der betreffenden Pflanze inistande ist, das gestorte Gleichgewicht wieder herzustellen.

In Tabelle I sind einige Befunde angefuhrt, die die

0’ 22 28 45 50

ZElT I IN STUNDEN 1 VOM BEGINN DER INFILTRATION

Fig. 1.-Restitution des gestorten Zucker- gleichgewichts in Bliittern von Cyclamen persicurn. 1. Nach Infiltration mit Saccharose; 2. Nach Infiltration mit Monosen; 3. Kontrollproben ohne Infiltration.

Aktivitat und die Wirkungsrichtung der Invertase in verschiedenen Pflanzen veranschaulichen.

Wie aus diesen Beispielen ersichtlich ist, sind sowoh) die absolute Ak- tivitiit der Invertase wie die Richtung ihrer Wirkung bei einzelnen Pflanzen sehr verschieden. Es ist ferner zu beachten, dass die hier mit- geteilten Werte, besonders fur Blatter, nur fur einen gewissen durchschnitt- lichen Zustand der Gewebe typisch sind. Im folgenden sol1 gezeigt werden, dass das Verhaltnis zwischen Synthese und Hydrolyse in den Zellen unter gewissen Bedingungen starke hderungen erfahren kann, die mit bestimm-

338 A. KURSSANOV

T.4BELLE I

SYNTHETISIERENDE UND HYDROLYSIERENDE WIRKUNG DER INVERTASE IN LEBENDEN

GEWEBEN EINIGER PFLANZEX

(In mg. Invertzucker pro 1 Stunde und 1 g r . Trockensuhstanz)

I,f d . nr.

~

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

Erbsensnmen (milch-reif)

Zuckerriibe (Hrln vulgaris)

Zichorie (Zychoritrm inti-

Tee, jungc I%liitter

Zuckerriibe (Rrtu tvclgaris)

h n a n e , Bliitter ( M trsa

Farn (Scolopendriirm

Zitrone, Bliitter (C?/trtrs

Chinabaum, Bliitter ({'yn-

Wurzel

bus) Bliitter

(Camellia then)

BIAtter

japonica)

vulg.)

limoniuni)

chona Ledgetiann)

Mandarine Blatter (Cytius unschiu)

Weizen R1:itter (Horclei- forme 7431) urn die Zeit des Staudens

Zyklamen Bliitter (Cyclamen persacurn)

Apfelsine (Schale tier reifen Frucht)

Tomate (Solanwm lico- persicurn) iinreife Frucht

Kohl, Sorte Nr. 1 Zwei- Blilttchen Stadium

Yyntheae

7s 4

133 5

9 7

l f i 1

12 6

23 3

9 2

3 2

7 2

4 2

11 4

5 8

1 0

2 2

0 0

4 2

3 7

R n

8 4

16 1

7 9

3 .0

9 3

5 . 6

20.4

15 2

5 0

63.3

4 . 0

31.4

2.62

1.79

1.50

1.44

1.16

1.07

0.77

0.75

0.56

0.38

0.20

0.03

0.00

Literaturungabe

B. Rubin und 0. Lutikova (33)

A. Oparin (5)

A. Kurssanov (28)

A. Kiirssanov (81)

A. Kurssanov (28)

A. Kurssanov (28)

A. Iiurasanov (25)

A. Kurssanov (25)

A. Kurssanov und N. Kryukova (35)

A. Kurssanov (25)

N. Syssakyan (85)

A. Kurssanov (28)

A. Kurssanov und N. Kfyukova (37)

A. Kurssanov und N. Kryukova (37)

B. Rubin und E. Arzichovskaya (38)

ten Phasen der physiologischen Tatigkeit des Organs in Zusammenhang stehen.

Wenn man beriicksichtigt, dass es beim Arbeiten mit 0.1-0.2 mol Zucker-

ENZYMATISCHE PROZESSE IN DER LEBENDEN PFLANZE 338

losungen gelingt, etwa 50 bis 150 mg. Zucker pro 1 gr. Trockengewicht in die lebenden Gewcbc zu infiltrieren, so Iasst sich bei annahernd bekannter Gesrhwindigkeit des enzymatischen Prozesses die richtige Expositionsdauer leicht feststellen. Gewohnlich betragt sie in unseren Versuchen nicht mehr a’s 2-3 Stunden. In den Fallen wo die Wirkung der Invertase besonders intcnsiv ist, muss die Versuchsdauer his auf 30 oder sogar 15 Minuten gekiirz t werden.

Die hohe Geschwindigkeit, mit dcr die Umwandlungen der infiltrierten Zucker im lebenden Gewebe erfolgen, lasst vermutkn, dass die enzymati- schen Prozrssc in diesen Vcrsuchen nicht von dcr Permeabilitat des Plasmas ahhangen, sondcrn sich vielmehr bereits an der ausseren, der Zellulose- mcmbran zugewandtcn Oberflache des Protoplasten abspielen. In einer Rcihc yon Vrrsuchcn (A. Kurssanov und N. Kryukova (39), A. Kurssanov (25)), wurdc gezcigt, dass die Geschwindigkeit des Eindringens der infil- trierten Saccharose durch die Zellulosemembranen die Geschwindigkeit der Hydrolyst dieses Zuckers in den Zellen der betreffenden Pflanze urn das Mehrfache ubcrtrifft. So wirde, zum Beispiel, in Versuchen an Biattern von Cyclamen persicum gefunden, dass die Geschwindigkeit des Eindrin- gens von Saccharose aus dem Intercellularraum in die Zellen 29 mg. in 1 Stunde pro 1 gr. Trockengewicht der Blatter entspricht, wahrend die Gcschn-indigkcit der Hydrolyse des Disaccharids 12-15 rng. betragt. Diese und einige andere Versuche fuhren zu dem Schluss, dass die Permea- bi1itii.t der Zellulosemembranen fur die Zuckcr die Geschwindigkeit ihrer enzymatische Umwandlung in den Zellen nicht einschrankt. Was das weitere Eindringen der Zucker ins Innere des Protoplasten anbelangt, so ist die Gcschwiridigkeit dieses Prozesses eine viel geringere; in den Blattern von Hydrangea hortensis belauft sip sich beispielsweise auf Werte von etwa 4-5 mg. Glukose pro Stunde.

Die synthctisierende Wirkung der Proteasen wird quantitativ gemessen rlurch die Gcschwindigkeit, mit der Eiweisskorper und Peptone aus einem in die Iebende Pflanze infiltriertem Aminosauregemisch gebildet werden. *

In Tabelle I1 sind Werte angefuhrt, die die Geschwindigkeit der Synthese von Eiweiss aus A4minosauren in einigen Pflanzen kennzeichnen.

Aus der Tebelle ersieht man, dass das Hauptprodukt der Synthese Eiweiss ist, wahrend Peptone in viel geringerer Menge gebildet werden.

Beschrankt man die Versuchsdauer derart, dass die Umwandlung der

* Zu diesem Zweck dienen gereinigte Hydrolysate, die durch Siiurehydrolyse von tierischen oder pflanzlichen Proteinen bereitet werden.

340 A. KURSSANOV

TABELLE I1

SYNTHETIBIERENDE WIRKUNG DER PROTEASEN IN DEN GEWEBEN VERSCHIEDENER

PFLANZEN

(In mg. N pro 1 g. Trockengewebe)

Lfd. nr.

- 1

2

3

4 5

6

Pflanzliches Objekt

Erbse (12-tagige Keim-

Hafer (12-teige Keim-

Weizen (1 I-tiigige Keim-

Zichorie (Blatter) Cyclamen persicum

Champignon (Frucht-

linge)

linge)

lineel

(Blatter)

korper)

Einge- fiihrter Amino- tickstoff (N mg.

ubstanr) F;:c:&-

10.9

9 . 2

9 . 7 11.2

16.0

31.1

Proteinasen (Eiweisssynthese)

in.15 mm. -

8 . 0

5.0

4 . 7 4 . 3

2 . 8

6 . 4

umge- rrchn.

f . 1 Stunde

32.0

20.0

18.8 17.2

11.2

25.6

Pol ypeptitlasen Peptonsynthese)

__ in.l.5 mill.

- 0 . 6

0 .4

0 . 8 0 . 2

0 .6

...

- umge- rechn.

f . 1 Stunde __

2.4

1.6

3 . 2 0 . 8

2 .4

. I .

Gesnmt- wnthese

pro 1 Stunde

34.4

21.6

22 .0 , 18.0

13.6

...

infiltrierten Aminosauren nicht bis m Ende vorschreitet (gewohnlich 15-20 Minuten), so ist die Geschwindigkeit der beobachteten Eiweisssynthese sehr hoch, vie1 grosser als die Synthesegeschwindigkeiten, die sich auf Grund von langdauernden Versuchen errechnen lassen. Wenn mann z.B. die Werte der Eiweisssynthese in Blattern in den Versuchen von W. Pearsall und &I. Billimoria (40), die 72 Stunden oder Ianger dauerten, auf 1 Stunde und 1 g. Trockengewicht umrechnet, so entspricht die Synthese Werten von 0.002 bis 0.065 mg. Stickstoff, d.h., sie ist um ein Vielfaches geringer als die Geschwindigkeit des innerhalb kurzer Zeitspannen gemessenen synthe- tischen Prozesses.

Was die hydrolytische Wirkung der Proteasen betrifft, so ist es uns bisher noch nicht gelungen, dieselbe in lebenden Zellen zu messen. Die hydroly- tische Aktivitat der Proteasen ist indessen sogar im zerriebenen Gewebe ausserst schwach, wo doch die synthetisierende Enzymwirkung praktisch ausgeschaltet ist.

So, sum Beispiel, betragt nach den Befunden mehrerer Autoren (41, 42, 25) die durchschnittliche Geschwindigkeit der Eiweisshydroiyse in vege- tativen Pflanzenorganen nur 0.1-0.3 mg. N pro 1 Stunde und 1 g. Trocken- gewicht.

ENZYMATISCHE PROZPSSE IN DER LEBENDEN PFLANZE 341

Es durfte daher auch in den normal funktionierenden Organen hoherer Pfianzen die hydrolytische Aktivitat der Proteasen um das Vielfache geringer sein als die synthetische Aktivitat. Diese Annahme ist desto wahrscheinlicher, als sie in Einltlang steht mit dem bedeutenden ober- wiegen von Eiweissstoffen gegenuber deren Abbauprodukten in lebenden Zellen (A. Kurssanov (25)).

Die Bestimniung der Phosphorylierungsgeschwindigkeit beruht auf der Infiltration der lebenden Pflanzengewebe mit 0.58 mol. Losung von anorg. Phosphat (NaH2P04). Die durchschnittliche Versuchsdauer betragt 30 Min. Im Laufe dieser Zeit wird ein Teil des eingefuhrten Phosphats bereits an organische Substanzen gebunden, wobei hauptsachlich Zucker- phosphate gebildet werden. Die Dephosphorylierungsaktivitat wird bestimmt auf Grund der Geschwindigkeit der Abspaltung von Phosphat aus organischen Phosphorsaureestern, mit denen man das Gewebe infiltriert hat (s. Tabelle 111).

Phos- phory- ierung

TABELLE I11 SYNTHETISIERIENDE WD HYDROLYSIERENDE WIRKUNG DER PHOSPHATASEN IN EINIGEN

PFLANZEN

(Umgerechnet in mg. Phosphor pro 1 g. Trockengewicht der Pflanze in 1 Stunde)

I - Phytin

Lfd. 1 Pflanzlichea Objekt nr.

Glycerin- phorphor-

s&ure

Glucose- monophos

phat

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Zichorie (Blatter) Zichorie (Wureeln) Hafer (10-tiigige Keimlinge) Weizen (12tiigige Keimlinge) Erbse (lbtagige Keimlinge) Hanf (16-tagige Keimlunge) Cyclamen repsicum (Blatter) Crinum sp. (Blatter) Pappel (junge Blatter)

4.36 1.25 2.26 2.18 2.16 0.96 0.60 2.30 8.40

0.70 0.12 1.56 1.08 1.41 1.20 ... 0.80 ...

Fructose-

phat diphos-

0.98 0.22

'0.60 0.75 0.58 0.84 0.50 1.24 3.21

0.50 0.14 0.21 0.27 1 .oo 0.90 0.22 0.82 ...

0.55 0.22 0.80 0.52 0.60 0.60 0.37 0.76 ...

Ausser dern Summenwert fur die Gesamtsynthese kann man durch getrennte Bestimmung der Phosphorsaureester nach einem zu diesem Zweck ausgebauten Schema (31) die synthetisierende Wirkung der einzelnen Phosphatasen messen. Die Versuche ergaben, dass in den Pflansen bei Infiltration mit anorganischem Phosphat gleichaeitig verschiedene Phos- phorsaureester gebildet werden, unter denen gewohnlich die Hexosemono- phosphate an erster Stelle stehen (A. Kurssanov und N. Kryukova (43)).

342 A. KURSSANOY

Die Messung des Oxydations- und Reduktionsvermogens lebender pflanzlicher Gewcbc nach B. Rubin und N. Syssakyan (32) beruht auf der Geschwindigkcit der Oxydation von Ascorbinsaure bzw. dcr Reduktion ihrer rcversihel oxydierten Form bei Infiltration des lebenden Pflanzen- gewebes mit den betreffenden Substanzen. In Tabel!e'IV geben wir einige auf dieseni Wege ermittelten Werte wieder.

TABELLE IV

ASCORBINSAURE

(In mm.3 0.001 mol2,6-DichlorphenolindophenolIosung, umgerechnet pro 24 Stunden und 10 g. frischer Bliitter)

(Nach B. Rubin und N. Syssakyan)

OXYDATIONS- UND REDUKTIONSFAHIGKEIT EINIGER PFLANZEN, GEMESSEN A N

Pflanzlichea bbjekt I Lfd. nr.

1 Kohl (Sorte Amager)

3 Hydrangea Hortensin 4 i ZeaMais

Cyclamen persicum

(Ixydations- verrnogen

19.2 8.0 36.2 2.6

Rnduktions- vermogen

9.6 1.6 12.8 2.0

Verhaltnis Oxydation/ Reduktion

2.0 5.0 2.8 1.3

Fur die Bestimmung der Wirkung anderer Fermente in der lebenden Pflanze stehen uns gegenwartig noch keine vollendete Methoden zur Ver- fugung. Es ist aber ohne Weiteres einleuchtend, dass das Prinzip, das die Grundlage der ohen beschriebenen Methoden bildet, auch in Bezug auf andere enzymatische Prozesse angewendet werden kann.

Obwohl die mannigfache Enzymausrustung der lebenden Zelle mit deli oben besprochencn Enzymen keineswegs erschopft ist, ermoglichcn cs bereits diese Beispicle der Erforschung, eincr Reihe von allgemeinen Frageri naherzutreten.

Eine der \Richtungen, deneti die xeiteren Untersuchungen folgten, bc- stand im experimentellen Studium der Bedingungen und Gesetzmassig- keiten, die die Reversibilitat der enzymatischen Reaktionen in den Zellen beherrschen ; eine andere Richtung hatte die eingehendere Erforschung der physiologischen Rolle der Enzyme zum Ziel.

Die bisher erzieltcn Erkenntnissc sirid noch weit davon entfernt, alle mfgeworfenen Fragen zu entscheideii. Dennoch konnen bereits auf Grund der zurzeit vorliegenden Befunde, unseres Erachtens, die gegen- wartig vorherrschenden Anschauungen bis zu einem gewissen Grade ver- tieft und in einigen Fallen revidiert werden.

ENZYMATISCnE PROZESSE IN DER LEBENDEN PFLANZE 343

111. Bedingungen, von denen die reversible Wirkung der Enzyme in lebenden Zellen abhangt

Die theoretischen Vorstellungen uber die Faktoren, die die reversible Wirkung der Enzyme in der Zelle bcdingen, sind, wie ohen bemerkt, haupt- sachlich auf Grund voii Modellversudhen und von gewissen allgemeinen Beobachtungen aus entwickelt worden. Die direkte experinientelle Prufung der einzelnen Leitsatze diescr Theorie wirde durch deli IMangel an geeig- neten Methoden erschwert. Indem wir von der Bestimmung der syn- thetisierenden und hydrolysierendcii Invertasemirkung in lebenden Geweben Gebrauch inachten, konnten wir eine Reihe von iieueii Tatsachen feststellen, durch die die Bedeutung der Strukturgebilde und die Adsorp- tionserscheinungen iiii Protoplasma fur eiizyniatische Syiithesen belegt wird. Andererseits wurde festgestellt, dass Oxydationsprozesse in den Zellen das Zustandekoininen enzyiiiatischer Synthesen fordern.

Es wurde vor hllem nachgewiesen, dass Invertase, die in der Form von Fermentpraparateii das typische Beispiel eines einseitig hydrolytisch wir- kendeii Enzyms darstellt, in den Geweben hohercr Pflanzen tatsachlich sowohl die Hydrolyse wie die Synthese der Saccharose bewerkstelligt (A. Kurssanov (44)). Dieser Schluss ergab sich aus Versuchen, in denen sich nicht allein die Hydrolyse, sondern aucli die Synthese von Saccharose in Blattern durch infiltrierte Hefeinvertase verstarken liess (TabelIe V). Diese Ergebnisse sind ein entscheiridender Beweis gegen die Vorstel- lungen mancher Forscher uber die Verschiedenheit der synthetisierenden und hydrolysierenden Enzyme-Vorstellungen , die auch inbezug auf Invertase verfochten worden sind (vgl. z.B. H. Collin (45), L. Berczeller (46) u.a.).

Menge d. infiltrierten Invertaseaktivitat

in den Blattern :::' Pflanzliches Objekt ($vzfy& (in mg. Invertzucker) Trocken- pewicht) Synthese Hydrolyse

13" sicum 2 . 4 9 .7 49.8

3.5 . . . 6 . 1 2 . 0 8 .3 5 . 3

1 Cyclamen per- . . . 3 . 3

2 Primala sp.

TABELLE V

BESCHLE~NIGUND DER SYNTHESE UND HYDROLYSE DER SACCHAROSE IN DEN BLATTERN

EINIGER PFLANZEN UNTER DEM EINFLUSS VON HEFEINVERTASE

Zunahme der Aktivitat auf Kosten der Hefeinvertase

Synthese Hydrolyse

6 . 4 35.9

2 . 2 1 .8

344 A. KUR6SANOV

Es wurde ferner nachgewiesen, dass die infiltrierte Hefeinvertase in verschiedenen Pflanzen in sehr ungleichem Masse synthetische Wirksamkeit erlangt. Wahrend namlich gewisse Pflanzen 8-9 ma1 soviel Hefeinvertsse in synthetisierenden Zustand versetzen konnen als ihr Eigengehalt an dem Enzym betragt (Crjnum sp.), besitzen andere Pflanzen diese Fahigkeit in vie1 geringerem Ausmass. Schliesslich gibt es, wie B. Rubin zeigen konnte, auch solche Pflanzen, die garnicht imstande sind infiltrierte Invertase in den synthetisierenden Zustand zu versetzen (Kohl, Sorte Nr. 1). Charak- teristisch ist indessen, dass in solchen Pflanzen auch die eigene Invertase keine synthetische Wirkung ausubt. Man kann daher annehmen, dass die Zahl der Stellen, an denen dieses oder jenes Enzym in den Zellen adsorbiert werden kann, oder auch die Adsorptionskraft selbst, von Pflanze zu Pflanze in ziemlich weiten Grenzen variiert. Es sei ferner hervorgehoben, dass die Fahigkeit oder Unfahigkeit der Zelle, infiltrierter Invertase synthetisie- rende Wirkung zu verleihen, noch gar nichts uber das Verhalten der Zelle gegenuber anderen Enzymen besagt, denn es konnen in den betreffenden Zellen bei vollstandig fehlender synthetisierender Invertasewirkung syn- thetisehe Prozesse anderer Art vor sich gehen. Wir miissen daher anneh- men, dass die Adsorption der Enzyme an den Strukturgebilden der Zelle eine selektive Adsorption ist.

Falls die Synthese tatsachlich durch Enzyme bewirkt wird, die an1 Proto- plasma adsorbiert sind, so muss die Zerstorung der adsorbierenden Struk- turen oder die Verminderung ihrer Oberflachenwirkung den Ubergang der Enzyme in Losung zur Folge haben und dementsprechend zu Verstarkung der Hydrolyse fuhren. Andererseits muss eine Steigerung der Adsorptions- krafte in der Zelle eine Verschiebung in umgekehrter Richtung herbei- fuhren. Diese Folgerungen wurden einer experimenteller Prufung unter- zogen. Vor Allem wurde versucht, die Gebilde, an denen die Invertase ihre synthetische Funktion verrichtet, zu zerstoren, ohne die Zellen abzu- toten (A. Kurssanov (44)).

Da die Plastiden und Chondriosomen,--die vermutlichen Zentren enzymatischer Synthesen,--ein Eiweisstroma besitaen wurde auf ver- I schiedene Weise versucht, den proteolytischen Abbau in den Blattern ver- schiedener Pflanzen zu steigern. Einerseits wurden die Blatter zu diesem Zweck in einer Stickstoffatmosphare gehalten. Dies verursachte einen Abbau der Blattproteine und gleichzeitig eine starke Verschiebung des urspriinglichen Gleichgewichts zwischen synthetischer und hydrolytischer Invertasewirkung zugunsten der Hydrolyse. In anderen Versuchen wurde proteolytischer Abbau in den Blattern durch Infiltration der Zellen mit Papain und Cystein erzielt. Hierbei wurde ebenfalls neben gesteigerter

ENZYMATISCHE PROZESSE IN DER LEBENDEN PFLANZE 345

Proteolyse und Anhaufung von Eiweissabbauprodukten eine Hemmung der synthetischen Invertaseaktivitat beobachtet.

Tabelle V I enthalt die Ergebnisse einiger Versuche, die den besprochenen Zusammenhang veranschaulichen.

1

2

TABELLE VI

VERSCHIEBUNGEN DER REVERSIBLEN INVERTASEWIRKUNQ IN BLATPERN VON CYCLAMEN PERSICUM IM ZUSAMMENHANG MIT PROTEOLYTISCHEM ABBAU

Kontrollpflanzen Pflanzen nach 48 St.

Aufenthalt in Stick- stoffatmosphiire

Kontrollpflanzen Mit 0.05% Papain und

0.1% Cystein ins- trierte Pflnnzen

Lfd. nr.

1.8

3 . 4 1 . 5

.lrt der Einwirkung

4.6 18.1

1 . 2 22.3 6 . 1 19.2

Invertaseaktivitat i Synthese 1 Hydrolyse

Amino N in mu. pro 1 g.

Trocken- gewicht der

Blatter

I I 3.1* I 1.0 1 27.7

Diese Resultate bestatigen die Vorstellung von der Bedeutung der Ad- sorption fur die enzynintische Synthese und verleihen zugleich der Annahme Wahrscheinlichkeit, dass die Adsorption der Invertase in den Zellen an Korpern von Eiweissnatur erfolgt.

In letzterer Zeit erschien eine Arbeit von S. Raabe (47), welche tierische Esterasen zum Objekt hatte. Unter Anwendung des gleichen Prinzips wie in unseren Experi- menten, hat Raabe tierische Gewebe mit Glutathion injiziert und auf diese Weise den proteolytischen Abbau gesteigert. Dies hatte einen starken Anstieg der hydrolytischen Esteraseaktivitiit in allen Organen des Tieres zur Folge. xhnlich wie wir, erklart der Verfasser dieses Ergebniss durch den Abbau von Eiaeisskorpern und den Ubergang adsorbierter Esterase aus dem synthetisierenden Zustand in den hydrolysierenden.

.\us diescn Versuchen kann gefolgert werden, dass in den Zellen nicht nur Invertase, sondern auch Esterase an Proteingebilden adsorb:ert ist.

Ein anderer Tl'eg zur Klarstellung der Rolle von Adsorptionserschei- nungen bei der reversiblen Enzymwirkung in lebenden Zellen besteht in Beeinflussung der Oberflacheneigenqchaften des Protoplasmas und der darin enthaltenen Gebilde. Derartige Einflusse mussen naturgemass die Verteilung der Enzyme zwischen Losung und adsorbierenden Oberflachen vcriindern. Vorausgeset zt, dass die angewendeten Agenzien keine direkte Wirkung nuf die Aktivitat des Enzyms ausiiben, wird diese Neuverteilung

346 A. KURSSANOV

spieyelbildliche Veranderungen der reversiblen Enzymwirkung herbei- fuhren. Als Mittel ’zur Veranderung der Oberflachenaktivitat der Zell- strukturen wurden Narcotica verwendet (A. Kurssanov und N. Kryukova (48)). Die Versuche ergaben, dass die Einwirkung voii Aetherdanipfen oder Aethylen in verschiedenen Konzentrationen auf die lebendeii Zellen zu starken Verschiebungen spiegelhildlicher Art in der reversiblen Wirkung der Invertase fuhrt (s. Fig. 2).

Stellt man diese Verschiebungen in Vergleich mit dcn durch verschie- denen Dosen der Narcotica ausgelosten Veranderungen des physiknlisch- chemischen Zustands der Zclle, so drangt sich die Folgerung auf, dass die

XTHER I IN ML. PER L. LUFT I

Fig. 2.-Einfluss ‘von Aethernarkose auf die reversible Invertasewirkung von BIM- tern von Cpdumen persicurn.

spiegelbildliche Verschicbung des enzymatischen Gleiehgcwichts nach seiten der Synthesc bei schwacher Narkose deni Sta- dium entspricht, bei dem die oberflachenaktiven Eigenschaf- ten des Plasmas gestcigert sind.

Die zweite Verschiebung, in der hydrolytischen Richtung, entspricht dem Stadium tiefer Narkose, bei der das Cytoplasma verflussigt wird und seine ober- flachen-aktiven Eigenschaften weitgehend einbusst. Eine Ver- schiebung der reversiblcn Inver- tasewirkung vcranlnsst auch die Infiltration von Phcwylurethan (0.003-0.006 niol) in das lrbende Pflanzengewebe. Durch dieses

Narcoticum werden, nach 0. Warburgs (49) Angabe, die Zentrcn von Ober- flaichenreaktionen besonders stark ,,blockiert” ; wie unsere Versuche zeigen, hemmt es zugleich die synthetisierende Wirkung der Invertasc.

Beim Vergleich der vorherrschenden Richtung der Enzymnirkung mit der Intensitat der Zellatmung lasst sich in manchen Fallen rine Pnrnllelitat zwischcn dcr Abmessungsenergie und der Geschwindigkeit dcr enzyina- tischen Synthese verzeichnen. Jedoch kommen auch Abweichungen von diesem Zusammenhang vor und sogar antiparallele Beziehungcn, so z.B. beini Abkuhlen der Pflanzen auf -5”, wo trotz starker Abnahme der At- mung die synthetisierende Wirkung der Enzyme bedeutend gesteigert is (s. A. Kurssanov, N. Kryukova, und A. Morosov (50) u.a.). Es darf daher wohl

ENZYMATISCHE PROZESSE IN DER LEBENDEN PF%ANZE 347

nicht angenomnien werden, dass die Energie der Atmung unmittelbar die Geschwindigkeit der enzymatischen Synthesen begrenzt. Eine gewisse Kopplung dieser Prozesse erscheint indessen sehr wahrscheinlich. Ein konstantes Verhaltnis besteht, wie die Untersuchungen von B. Rubin (51) gezeigt haben, zwischen der Aktivitat der Peroxydase und der synthetisie- renden Invertasewirkung in den Zellen. Vor kurzem konnte N. Djatsch- kov in unserem Laboratorium dies durch direkte Versuche belegen, indem er zeigte, dass Infiltration von Blattern mit einer Peroxydnsc- Losung das Verhaltnis zwischen Saccharose-Synthese und -Hydrolyse stark zugunsten der Synthese verschiebt. Dabei wird das Auftreten des synthctischen Prozesscs durch Peroxydase stimuliert sogar in :enen BIat- tern, welche nornialerwcise nur hydrolytische Wirkung zeigen. Hierher gehoren auch die Beobachtungen von A. Kurssanov und N. Kryukova (25), denzufolge die Infiltration des pflanzlichen Gewebes mit kleinen Dosen von HZOZ die synthetisierende Wirkung der Invertase bedeutend steigert. Schliesslich haben B. Rubin uiid E. Arzichovskaya (38), sowie N. Syssakyan und A. Kobyakova (52) cine Parallelitat zwischen der Richtung der Invertnsewirkung und dem Oxydations-Reduktions-Vermo- gen des Gewebes festgestellt.

Alle diese Ergebnisse sprechen dafur, dass die Oxydationsreaktionen einen gunstigen Einfluss auf die synthetisierende Wirkung der Enzyme in der Zellc ausuben. Xndererseits stehen sie in gutem Einklang mit den Vorstellungen I I ber den innigen Zusanimenhang zwischen Energie und Protoplasma-Struktur.

IV. Die physiologische Rolle der Enzyme Die Lehre von den Enzymen entwickelte sich, wie envahnt, haupt-

sachlich in der Richtung der Erforschung der Natur dieser Substanzen und des Mechanismus ihrer Wirkung. Die Untersuchungen der letzten Jahre iiber die reversihlc Wirkung der Enzyme haben es indrssen ermoglichst, auch die physiologische Rolle der enzymatischen Prozesse im Organismus naher kenneri zu lrrnen. Diese Moglichkeiten sind noch lange nicht erschopft aber die Ergebnisse, die auf einigen Gebieten bereits erzielt wurden, lassen erhoffen, dass es gelingen wird, ‘auf diesem,Wege manche biologische Probleme zu losen, die mit der Entwicklung der Pflanzen und ihrem Verhalten gegetiuber exogenen Einfliissen zusammenhangen.

Nachstehend wird ein allgemeiner Uberblick uber die Arbeiten in dieser Richtung gegeben urn die Wege der praktischen Anwendung der Lehre von den eiizymatischen Prozessen in der lebenden Zelle auf die Losung biologischer Probleme naher zu kennzeichnen.

348 A. KURSSANOV

1. Die enzymatischen Prozesse in den Zellen in ihren Beziehungen zu den

Die moderne Pflanzensystematik beruht hauptsachlich auf ausseren morphologischen Merknialen. Die chemische und besonders die bio- chemische Systematik ist noch ganz mangelhaft ausgebaut, obmohl schon mehrmsls versucht wurde, cheniische Merkmale der Pflanzen zur Aufstel- lung von Verwnndschaftsbeziehungen zwischen einzelnen Gruppen heranzuziehen.

Da die cheniische Tatigkeit der Zellen in mancher Hinsicht von der Geschwindigkeit und Richtung enaymatischer Prozesse abhangig ist, steht zu erwarten, dnss auch die enzymatischen Reaktionen charakteris- tische Artmerkmale der Pflanzen darstellen.

Art- und Sortenuerschiedenheiten der Pflanzen

Arbeiten in dieser Richtung, die im Laufe einer Reihe von Jahren von B. Rubin (53) durchgefiihrt wurden, haben’ gexcigt, dass das Verhiiltnis der synthetischen zur hy- drolytischen Invcrtasewirkung, d. h. die vorlierrschende Richtung der Enzyrnwirkung ein Merkmal darstellt, das fur die betreffende Sorte oder Varietiit einer Pflanze charak- teristisch ist ffestgestellt an Zwiebeln, Kohlsorteri und anderen Gemiisearten). Beson- dere Beachtung verdient hierbei die Tatsnche, dass ein hohes Verhiiltnis von Synthese zu Hydrolyse zugleich ein Merkmal bqter Lagerfiihigkeit der betreffenden Sorte und ihrer Resistenz gegen Mikroorganismen ist. Niedrige Werte dieses Verhiiltnisses sind hingegen charakteristisch fiir schlecht haltbare, zu Pilzerkrankungen neigende Gemuse- sorten.

Auch fur die Beurteilung der Friih- oder Spiitreife einiger Sorten stellt das Ver- hiiltnis Synthese: Hydrolyse ein ebenso stabiles Merkmd dar. Dabei entspricht in der Regel dm Vorherrschen der synthetischen Wirkung in den Zellen den spiitreifen Sorten, wiihrend starkere Hydrolyse stets fiir fruhreife Sorten charakteristisch ist (fest- gestellt an Gemiisen und Obstbaumen). Demnach kann die Untersuchung der Enzym- prozesse in den Zellen auch der Diagnose wirtschaftlich wichtiger Eigenschaften der Pflanzen dienlich sein.

Dabei ist jedoch zu beachten, dass die Konstanz des Verhiiltnisses Synthese:Hy- drolyse, die diesen Arbeiten zu Grunde gelegt wurde, nur bei Priifung der Pflanzen unter gnnz bestimmten Bedingungen giiltig ist. Dieses Verhhltnis ist bestiindiger in Organen mit verlangsamter Lebensttitigkeit, zum Beispiel, in ruhenden Fruchten, Wurzeln, Knollen U.S.W.

Dagegen weisen aktiv vegetierende Pflanzen, hiiufige und ziemlich starke Verschie- bungen des enzymatischen Gleichgcwichts auf, die sowohl durch Umweltfaktoren wie durch endogene Ursachen bedingt sind.

2. Spticherung von Vorratsstojen und allgemeine Ertragsj’ahigkeit der Pjlanzen als Resultat reversibler enzymatischer Reaktionen

Die Arbeiten zahlreicher Autoren hnben gezeigt, dass die Intensitat der Photosynthese, und mithin die allgemeine Ertragsfahigkeit der Pflanzen, in starkem Masse abhangig Bind von der Geschwindigkeit, mit der

ENZYMATISCHE PROZESSE IN DER LEBENDEN PFLANZE 349

di6 primaren Assimilationsprodukte aus den assimilierenden Organen fortgeschafft werden (s. z.B. A. Kurssanov (54)). Dies kann nicht nur durch Abtransport zu anderen Organen erfolgen, sondern auch an Ort und Stelle, infolge der enzymatischen Umwandlung einfacher Zucker in komplizierte Produkte, zum Beispiel in Starke oder Rohrzucker.

Untersuchungen uber die reversible Invertasewirkung in lebenden Blattern haben gezeigt, dass die synthetisierende Wirkung bei manchen Pflanzen so stark ist, dass sie sogar in Perioden ziemlich intensiver COr Assimilation ausreicht, um die rasche Umwandlung der Monosen in Sac-. charose zu besorgen.

Ahnlich wie Invertase uben wahrscheinlich auch Amylase und einige andere Enzyme ebenso intensive synthetische Wirkungen aus, so dass die Beseitigung der primaren Assimilationsprodukte aus dem Bereich des As- similationsprozesses leicht in dieser Weise erfolgen kann. Immerhin sind die assimilierenden Organe meist ungeeignet fur die Ablagerung grosser Mengen von Vorratsstoffen; deshalb ist das Hauptmittel der Entfernung von Assimilaten aus den Blattern doch der Abtransport, dessen Ge- schwindigkeit weitgehend von der Konzentration der einfachen Zucker in den Blattern abhangt.

Von diesem Standpunkt aus miissen die Verhaltnisse fur den Abtrans- port besonders gunstig sein, wenn in den assimilierenden Zellen der hydrolytische Prozess den synthetischen uberwiegt und wenn in den Speicherungsorganen das entgegengesetzte Verhaltnis besteht. Es wirkt aber, wie gesagt, die -Anhaufung der primaren Produkte in den Blattern stark hemmend auf die Photosynthese und damit naturlich auch auf den Gesamtprozess der Zuckerspeicherung. Daher kann ein statisches Uber- gewicht der hydrolytischen Enzymwirkung in den Blattern schwerlich die Erhohung des Gesamtertrags der Pflanzen fordern.

Es erscheint eher wahrscheinlich, dass die Tatigkeit des Blatts im Laufe des Tags mit periodischen Anderungen der Richtung enzymatischer Re- aktionen einhergeht, so dass bald die hydrolytischen, bald die synthetischen Reaktionen das Ubergewicht haben.

Diese Annahme fand ihre Bestatigung in direkten Bestimmungen der reversiblen Invertasewirkung in den Blattern der Zuckerriibe im Laufe von 24 Studen (B. Rubin und 0. Cutikova (55) (vgl. Fig. 3, S. 351)). Es ergab sich, dass die synthetisierende Wirkung der Invertase im Laufe

des Tages bedeutende Anderungen erfahrt, indem sie zwischen 12 und 18 Uhr maximale Werte erreicht und wahrend der Nacht bedeutend schwacher wird. Daneben nimmt wahrend der Tagesstunden die hydrolytische Wirkung merklich ab, so dass in dieser Periode die Synthese uberwiegt;

350 A. KURSSANOV

Nachts ist dagegen der hydrolytische Prozess vorherrschend. In einer andercn Arbeit zeigten B. Rubin und N. Syssnkyan (56) , dass das Y w haltcn der Invertase in den Blattern von Raumpflanzen pin(. ahnliche Periodizitat aufweist.

Schliesslich ist es N. Syssakyan und A. Kohyakova (57) gelungen in einer kurzlich wroffentlichten Arbeit cincn direkten Zusaniinenhang nachzu- weisen zwischen der Intensitat der Photosynthese und dem rclativrn Ubcrgewicht der synthetisicrenden Invertasewirkung in Tahakblattcrn.

Aus allen dicqen Befundrn geht deutlich hervor, dass der cnzymatische Apparat der Blatter aktiven Anteil am gesaniten Prozess der Zuckerspei- cherung nimnit, indem er wahrend der Stundcn maximaler Photoqynthese die Assimilate in Reserveforin uherfuhrt und hri Dunkelheit Rcdingungen fur dcn raschen Abtransport schafft.

Zweifellos sind die Rcizr, dir dicse \'er%nderungen bedingen, liis zu cineni gewissen Grad durch den periodischcn Wechsel von Tag und Nacht verursacht; jedoch besteht auch unabhangig hiervon in den Zellen der Blatter cine eigene Periodizitat. Dies beweisen die Versuche von B. Rubin, E. Arzichowskaya, N. Spiridonova, und 0. Lvtikova (58) an tagsuber verdunkelten und die Nacht hindurch kunstlicli beliclitcten Zuckerruhen. Diese Versuche ergaben, dass der ruzymatische Apparat der Blatter bei solchen Pflanzen, wenigstens in den crstcn Tngen, seinen kprunglichen Rhythmus heibchalt, d.h. am Tage energischcr synthetisiert und liei Nacht hydrolysiert, obwohl diese Veranderungen mit den ini Versuch geschaffe- lien Belichtungsverhaltnissen nicht in Einklang stehen.

O } 6

12} 18

In Tahelle VII sind diese Beziehungen durch das Verhdtnis Synthese/Hydrolyse veranschaulicht, dessen Werte urn SO geringer sind, je aeiter die vorherrschende Rich- tung des enzymatischen Prozesses zugunsten der Hydrolyse verschoben ist.

0.26 0 . 5 8 0.72 0.94

0'24 1 Licht 0 .13

0'44 Dunkelheit 0.70

Dunkelheit

Licht

TABELLE VII

ANDERUNGEN DER RICHTUNG DEH INVERTASEWIRKUNG IN ZUCKERRUBENBLATTER

IM LAUFE DES TAGES BEI NORMALER UND UMGEKEHRTER FOLGE DER TAGESZEITEN

Beobachtungs; Beliclituugs- limgekcrter Tag Synthese/ Hydrolyse

stunden verhiiltnisae

24 1 Dunkelheit I 0.08 ' 1 Licht 1 0.35

ENZYMATISCHE PROZESSE IN DER LEBENDEN PFLANZE 35 1

Die Ursachen, auf denen diese innere Periodizitat beruht, wurden bis zu einem gewissen Grad durch die Versuche von N. Syssakyan und A. Kobyakova (59) klnrgestellt. Dicsc Aytoren konnten zeigen dass einc Storung der nornialen Gross,n,.erll8ltnisse zwischen der C 0 2 assiniiliercll- den Oberflache und den Organen, die dic Assiniilationsproduktc verbrau- chen, weitgehcndc l’erschiebungen il l dcr bevorzugten I l ichtu~~g der enzy- niatischen Prozesse in den Blattern I~crbcifullrt~. Insl~esoiidere verursach t Entferriung der Blutcn und Fruchte eine Stiniulierung der synthetischen Wirkung der Inverttlse in den Blattern, wiihrend Einschrankung dcr Blat,t- oberflache bei verschonten Bluten und Fruchten eine Steigerung des hydrolytischen Prozesses zur Folge hat, infolge dcren ununter- brochener Alotransport aus den ,

Blattern einsetzt. 0

Es kann daher angenonimen werden, dass die Reize fur die periodische Verschiebung von Synthese und Hydrolyse in deli

Perioden ihrer photosyntheti- schell Tgtigkeitausgeilen, sondern auch im innigsten Zusammen- hang stehen mit dem Bedarf der anderen Organe an plastischem Material.

Sollte die Existcnz einer endogenen Periodizitat bei den Pflanzen in weiteren Untersuchungen Bestatigung finden, so ware es nioglich von die- sem St,andpunkt aus Untersuchungen uber den Photoperiodismus z u unter- nehmen, indern nian Unterschiede zwischeri Pflanzen langen rind kurzen Tags auf zustellen versuchte auf Grund der tagsuber erfolgenden Anderun- gen der Enzynireaktionen und ihrer Ubereinstimniung oder Nicht-Uberein- stimmung mit den Tag- und Nachtperioden.

Was die Bahnen betriff t, auf welcheii die Fortbewegung plasniatischer Materialien in der Pflanae erfolgt, so findct nach den Befunden von N. Syssakyan in deli Siebrohren und in deni dieselben umgebenden Paren- chym nur hydrolytiscfie Enzymwirkung statt ; dies bestatigt die Anschau- ung, dass die plasmatischen Substariaen in der Form einfacher Verbindungen transportiert werden.

Schliesslich ist fur die Ablagerurig der Vorratsprodukte, die gewohnlich

l5

10

a

Blattern nicht nur von den 0 6 12 18 24 STUNOEN

Fig. 3.-Anderungen der reversihlen In- vertmewirkung in den Bliittern der Zucker-

-Synthese, . . . . . . . . . .-Hydrolyse mit der Tngeszeit,

(Nach B. Ruhin und 0. Lutikovn).

352 A. KURSSANOV

in speziellen Organen der Pflanze erfolgt, ein starkes und bestandiges Ubergewicht synthetisierender Wirkung der betreffenden Enzyme erforder- lich. In Bezug auf die Zuckerrube wurde dies von B. Rubin und 0. Lutikova (61) bestatigt. Diese Autoren konnten fesjtstcllen, dass die synthetisierende Wirkung der Invertase in Rubenwurzeln desto starker ist, je hoheres Zuckerspeicherungsverrnogeii die bctrcffetide Sorte auf- weist. Gesteigerte hydrolytische Invcrtaseaktivitat in den Wurzeln steht, wie A. Oparin (62) gezeigt hat, in umgekehrtein Verhaltnis zum Zuckergehalt und ist eher ein typisches Merkmal der durch starkes Wachs- tum gekennzeichnete Wurzeln der Futterrube.

3. Die vorherrschende Richtung der enzymatischen Prozesse im Zusanunen- hang mit der Entwicklung der Pflanze

Der Ablauf des Lebenszyklus der Pflanze steht in Zusammenhang rnit einer Reihe aufeinanderfolgender Veranderungen ihrer biochemischen und physiologischen Tatigkeit. In dieser Beziehung stellen die Samenkeimung und die erste Entwicklungsperiode der neugebildeten 'Keimlinge ein be- sonders intensives Entwicklungsstadium der Phanerogamen dar.

Es ist deswegen begreiflich, dass die Untersuchung der Enzyme in kei- menden Samen schon lange eifrig bctrieben wird. Die Bestimmung der Aktivitat der Enzyme in autolytischen Gemischen konnte indessen kein allseitiges Bild ihrer Tatigkeit vermitteln und zeigte nur eine Steigerung der hydrolytischen Prozesse wahrend der Keimungsperiode an.

A. Kurssanov und K. Bryuschkova (68) unternahmen Bestimmungen der synthetisierenden und hydrolysierenden Invertasewirkung in lebenden Samen des Weizens und einiger anderer Pflanzen und zeigten, dass die Invertase in noch nicht gekeimten Samen sehr starke synthetisiercnde Wirkung aussert, wahrend die Hydrolyse so gut wie vollstandig ausbleibt . Die Keimung geht mit einer spiegelbildlichen Yerschiebung dieses Gleich- gewichts einher, infolge deren nach 5-6 Tagen in allen Teilen des Samens die hydrolytische Reaktion entschieden vorzuherrschen beginnt. Be- sonders stark ausgepragt ist diese Verschiebung im Endosperm, in welchem die Invertase um diese Zeit ihre synthetisierende Funktion vollstandig einbiisst. Das Ergriinen der Keimlinge und das hiermit verbundene Einsetzen der Photosynthese fuhrt sogleich zu einer Verstarkung der syn- thetischen Invertasewirkung in den grunen Zellen-ein Hinweis auf dell innigen Zusammenhang zwischen diesem Enzyni und der Speicherung und Wanderung der Assimilate. Es ist ferner sehr charakteristisch, dass die Proteinasen in etiolierten Keimlingen rasch ihre synthetisierende Wir- kung einbiissen und sie beim Ergriinen wieder erlangen. Man kann daher

ENZYMATISCHE PROZESSE I N DER LEBENDICN PFLANZE 353

vermuten, dass der Enzymapparat in den Keimlingen beim Ubergang der- selben von der heterotrophen zur autotrophen Entwicklung in manchen Beziehungen eine wesentliche Umgestaltung erfahrt.

Ahnlich verhalten sich die Enzyme bei der Offnung von Blattknospen. Durch Versuche von A. Kurssanov und K. Bryuschkova (64) wurde ge- zeigt, dass die Invertase ruhender Fliederknospen wahrend der Winterzeit gar nicht hydrolysiert und eine ziemlich starke Synthese auszuiiben ver- mag. Ferner wurde nachgewiesen, dass die Wirkung der Invertase noch vor Beginii der Fruhjahrs-Vegetation eine starke Verschiebung nach Seiten der Hydrolyse erfahrt. Die Entwicklung der Knospen zu jungen Sprossen und ihr Ergrunen geht, ebenso wie bei den Samenkeimlingen, mit Auftre- ten der synthetisierenden Invertasewirkung einher, die funktionell mit dem Einsetzen dcr Photosynthese verknupft ist. Was die Proteinase anbelfingt, so verhiilt sic sich ebenfalls in den aufbrechenden Knospen annahernd ebenso wic in Samenkeimlingen. Die grosse Ahnlichkeit im Verhalten der Enzyme in aufbrechenden Knospen und in keimenden Samen berech- tigt zu der Folgerung, dass der Ubergang der Enzyme aus dem nahezu einseitig synthetisierenden Zustand in den hydrolysierenden fur pflanz- liche Gcwebe charakteristisch ist, die von der Ruhe zu aktiver Vegetation ubergehen.

Erscheinungen, die den bei der Samenkeiniung stattfindcnden ent- gegengesetzt sind, kann man wiihrend der Sanienreifung erwarten.

Die Untersuchungen von A. Kurscanov und K. Bryuschkova (65) uber das Verhalten der Enzyme in lebendcii Weizensamen wahrend dcr Reifung zeigten, dass bereits wenige Tage nach der Befruchtung ein Zustrom von Invertase und Proteinase zum Fruchtkiioten zu beobachten ist. Da die hinzustromenden Enzyme in gelostem Zustand vorliegen, aussern sie zunachst nur eine einseitige, sehr aktive hydrolytische Wirkung. Mit dem Ubergang von der Milch- zur Wachsreife beginnt eine Adsorption der aufgenommenen Fermente an den Strukturgebilden der Zellen. Infol- gedessen kommt die hydrolytische Wirkung fast vollstandig zum Still- stand und die Synthesereaktionen gelangen zu besonders starker Entfaltung. Diese Periode entspricht der intensiven Speicherung von Vorratsstoff en in den reifenden Samen. Das letztc Stadium der Reifung ist schliesslich gekennzeichnet durch AbsiDken der synthetisierenden Enzymaktivitat ohne Zunalime der hydrolytischen Wirkung. Die Ursache dieses Phano- mens kann entweder die starke Entwkserung der Gewebe sein, oder ein Ubergang der Enzyme in den inaktiven Zymogenzustand.

Hohe synthetische Enzymaktivitat in der Periode der Samenreifung

354 A. KURSSANOV

beobachteten auch B. Rubin und 0. Lutikova (33), die mit, verschiedenen Erbsensorten arbeiteten.

Vergleicht man alle diese Ergebnisse mit den Befunden, die bei Ver- suchen niit zerriebcnen Samen erhoben wurden, so stellt sich heraus, dass dem sogenannten Zyniogenziistand der Enzymc, niit dem in alteren Ar- beiten die inaktivc Form genieiiit wurdc, Iwi Vcrsuchcn iflit intakten Samen eine itit,cnsivc syiitlietisierende \Virkung dcr Enzynie entspriclit. Wcnn nian bcachtet, dass die Bildung dcr sogenanntcn Zyniogenc in den Samen nlit der Adsorpt,ion der Enzymc an Eiweisskorpern zusaninienhangt (vgl. z.B. T. Chrzaszcz und J. Janicki (66 ) ) , so kann man annehmen, dass zwischen der inaktivicrenden Adsorption dcr Enzyme in den Zellen und jener Adsorption, infolge deren die Enzyme synthetisicrcnde Aktivit.at erlangeii, d i e Beziehungen bestehen.

Die Anderungen der vorherrschenden Richtung. dcr c~iizymatischcn Prozesse in dcn Zellen horen nicht nacli der lieimuiig d(1r Samen a d , sondern sie dauern ini Laufe der ganzeti spateren Entwicklung der Pflanze fort. Durch die Arbeiten von N. Syssakyan (67) und besonders von B. Rubin und 0. Lutikova (55) an Zuckerrubcn wurdc nachgewiesen dass die reversible Invertasewirkung in den Bllttctrn, abgescheti von dem Tages- rhythmus, niit dem Alter eine Vcrschicbung zugunstcn der hydrolyt,ischen Prozessc crfalirt. In einer soeben in unsercni Laboratoriuni abgesclilos- senen Untersuehung von G. Harebawa uhcr die Enzyme der Tecblatter wurde gczeigt, dasa die Richtung der Invcrtase\\lirkiing auch bei dieser Pflanze in alteren Blattern nielir Iiydrolytisch wird als in jiingeren.

In den Versuchen von Pearsall und Billinioria (40) an lcbenden Blattern wurde ferner der Nachweis erbracht, dass auch die synthctisierende Wir- kung der Proteinase mit fortschreitendem Alter der Blatter abnimmt. Die Untersuchungen von A. Kurssanov ilnd K. Bryuechkova (68) :in Blat- t.ern versehiedenen Alters beim Hafrr licsecn glcichfalls cine Abnahnie dcr synthetischcn Aktivitat der Enzyme von den hiihcr gelegcnen Blat,tcrn zu den ticferen erkennen. 111 der erwalinten Arhcit wurdc ferner nachge- wiesen, dass die Tatigkeit der Enzyme in jedeni Blatt in desacii indivi- duellem Lebenslauf bestimmtc Verandcrungen durchmacht. Fur Pro- teinase z.B. aussern sich diese Vcranderungen in einer eingipfcligen l iurve mit maximnlcr synthetischcr Xktivitiit, um die Mitte dcr Lebenszcit, des Blattes (vgl. Fig. 4).

Aus der Abbildung ist ersichtlich, dass die Bkitter, je nach der Zeit ihres Auftretcns an der Pflanze ihren individuellen Entwicklungslauf in verschiedenen Fristen durch- machen. Trotzdem sind die in jedcm Blatt, betrachtet aus seiner Hiihenlage, fort- schreitenden Veranderungen ahnlicher Art. Dies dauert solange, bis die Entwicklung der

ENZTMATISCHE PROZESSE IN DEB LEBENDEN PFLANZE 35.5

1~ortR:inzungsorgnne dcr Pfl:uize einsetzt. Zu dieser Periode (Fig. 4, 25 Juni) geht die synthctisierentle Wirkung der Proteinase sowie der Invertnse vollsttindig verloren, und die hydrolgtischcn Vorgingc erlnngen das Ubergewicht. Die Analyse dieser Erschei- nung f<ihrt zu tlem tinheliegenden Schluss, dass die physiologische Bedeutung einer solchen Verscliiebung dnrin tmteht, die Vorratsstoffe zu mobilisieren und den Repro- duktionsorganrn zuzuleiten. Die um diese Zeit zu beobnchtende Erschopfung der Blatt- vorriite libst diese Ansclinuung plnusibel erscheinen. Gleichzeitig verschwindet ein betrfichtlicher Anteil der Enzyme : u s den Blti t tern-4n Hinweis darnuf, dnss die Enzyme zummnien mit den VorrntsstoKen num in Entwicklung begriffenen Bliiten- stand \vnndern. Der Zustrom hydrolytisch aktiver Enzyme zu den Fruchtknoten nach der Befruchtung steht gleiclifalls in Elinklang mit diesem Enzymschwund in den Blat-

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tern. Nncli Abschluss dcr Bliite (Fig. .1. 5 . Juli) geht der gesniiite Enzgmgehnlt in den Bliittern nieder steil in die Hdie, wobci insbesondere die synthetischen Prozesse zunchnien. Dimer Anstieg entspriclit der allge- meinen Versthrkung der NRhrfunk- tion der Bltitter in der Periode der Samenreifung.

Das Endc des Ldwnszyklus der Pflanze cder ilircr einzeliicn Organc is4 gckennzcichnet durcti cinc Vcrstarkung dcr hydroly- tischcti Prozcsse in den Zcllen. So vcdicrcn bci Pfirsichbaumcii im Hrrbst, nach drn Befundcn voii 1'. Nilov und 0. Pavlcnko (69), die Enzyme in den vrr- gilbenden Blattcrn ganzlich ihre syn t he t i s c h en Funktionen. Nach unscren Bcobachtungen erfolgt, diesc Verschicbung noch

-

10 12[

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Fig. 4.4ynthetisierende Wirkung der Proteinnsen in HxferblAttern verschiedenen Alters. Abszisse-Daten der Probeentnahme; Ordinate -Werte der Synthesewirkung. Die Zahlen an den Kurven hezeichnen die Reihen- folge der 13l:'itter von den untersten zu den obersten.

langc vor dem Laubfall. Dahcr errcichen in den Blattern jene Prozcsse rechtzeitig ihr Endc, die mit dem Abbau und Abtransport gcwisser Pro- d u k e ails dcin abfallendcn Lsub zu den uberwinternden Orgarien zusam- menhangen.

Das Stiidium der rcversiblcn Enzyniwirkungell in reifenden flcischigen Friichtcu lehrte, dnss dcr 1'erlailf dcr Itcifung auch hier witgchend von der Lagc der cnzymatischcn Gleictigcwiclitc abhiirigig ist.

Uhcr diese Frage ist bisher nur eine einzige Untersuchung von A. Kurssanov und N. Kryukovn veroffentlicht worden (37). Die Autoren bestimmten die reversible Wirkung der Invertase in den Fruchten von Tomnten, Gurken, Mandnrinen, Apfelsinen und

356 A. KURSSANOV

Zitronen wiihrcnd der letzten Iteifungsstadien. Die hauptsiichlichen und besonders fypischen Veriinderungen, die sich hierbei ergaben, waren folgende: ein Anstieg des Verhiiltnisses Synthese:Hydrolyse am Anfsng des Gelbwerdens der Fruchte und eine starke Verschiebung des enzymatischen Gleichgewichts nach Seiten dcr Hydrolyse urn die Zeit des Erweichens des Fruchtfleisches. Wenn man annimmt, dass letztere Verschie- bung in den rcifenden Fruchten nicht die Invertase allein betrifft, sondern auch fur andere Enzymgruppen gilt, so kann man den Schluss ziehen, dsss das Erweichen des Fruchtfleisches, sowie dessen vollstiindige Mazerietung auf spiiteren Stufen der Reife, mit einseitig bydrolytischen Enzymwirkungen zusammenhiingt, die eine eigenartige intravitale Autolyse der Gcwebe verursachen.

In derselben Arlwit wurde gezeigt, dass dcr Zusatz von Aetliyleii zwcks Beschleunigung dcs Hrranrcifens gruner Fruchte die Ausbildung dcr hydro- lytischen Prozcsse hedeutcnd verst,iirkt und beschleunigt. Wir kiinnen folglich den Schluss zichen, dass dic Rolle dcs Aet'hylens bei dcr kunst- lichen Fruchtrcifung zuin Teil auf das Verschieben dcr eiizymatischen Gleichgewichte bcruht, dic das Aethyleii d s oberflachenaktive Substanz herbeifuhrt, indeni es den adsort)iertcn Anteil der Enzyme von den Struk- turgeLddc~i-1 der Zcllrn verdrangt (vgl. A. Kurssanov und N. Kryukova

Dicser Gesichtspunkt Iasst sich offcnbar auch auf andere Einwirkungen ubert,ragen, durch die die Rcifung voii Frucht,en beschleunigt werden kann. Dies gilt. insbcsondcre fur Aether und Chloroform (H. Gore (70)), sowie fur Aethylalkoliol (S. Soldatrnkov (71), G. Rakitiii (72)) als oherfliichen- aktive Substanzen.

(48)).

4. Einjluss der Aschenelemerilc auj die enzyinalischen Prozrsse in Pjlanzen Der eingreifeiide Einfluss, dcii die Mineralstoffertiahruiig a.uf die ge-

samtc Entwicklung und dic physiologisclien Funktionen der Pflanzen ausu- ben, veranlhsst uns maiiclic Asrlientlmiic~ite als wichtige Tciliichmer des St,offwcchscls ZU brtrachtcn. Indesscn siiid iinserc IG.nntnisse ubcr die biochrmische Rolle der einzclncii Elcment,c, t.rotz der Fortschritt,c aid dcm Gebietc der praktischcn A4n~cndriiig mineralischer Dungrniittcl, in ninncher Beziehung schr niangclhaft. Inshsondtw~ ist dic Fmgc dcs Rinfliisses der Asclmclcnientc auf dic Gesrh\vindigkcit und die Rich timg enzyinati- schcr Rcakt,ionciI i i i dcn Zcilcn nocli fast uncrforsclit.

Dic Anwendung der hfethoden zur Bcstiiiimung dcr ~:iizyiiin.irkiirigcn in dcr lelxndcn Pflatizr erniijglictitc es, die Rollc der Phosphorsiiurc h i der Saccharosc~-Syntliesr cingchcnder klarziwtcllen. Es gelttng feriier, uber den Einfluss des Kaliunis arif die reversible Wirkung der Invcrtnse in den Zellen Aufsdiluss zii gcwinneii. Zwifellos konrien auch nndere fur das Leben der Pflanze unent behrliche Aschcnrlemeiitc die Gcbschwindigkeit

ENZYMATISCHE PROZESSE IN DER LEBENDEN PFLANZE 357

und die Richtung enzymatischer Reaktionen auf diese oder jene Weise beeinflussen. Es ist d.tbei sowohl eine direkte Beteiligung des betreffenden Aschenelements an der enzymatischen Reaktion denkbar (wie im Fall des Phosphors bei der Saccharose-Synthese) a19 auch eine indirekte Einwirkung auf das Enzymsystem uber Anderungen, die das Aschenelement (2.B. Kalium) in anderen Prozessen und speziell im physikalisch-chemischen Zustand der Plasmakolloide veranlassen kann.

In dieser Ubersicht werden nur jene Arbeiten besprochen, die den Phos- phor und das Kalium betreffen; von den ubrigen Elementen, deren Einfluss auf die Reversibilitat der Enzymreaktionen noch ungenugend erforscht ist, sol1 hier nicht die Rede sein.

Der Gedanke, dass Phosphorylierungsreaktionen beim Aufbau der Sac- charose beteiligt sind, wurde erstmalig von A. Oparin und A. Kurssanov (73) geaussert. Nach diesen Vorstellungen wird durch die Anlagerung eines Phosphorsaurerests an die Alkoholgruppe am sechsten Kohlenstoff- atom des Fructosemolekuls die Furanoseform dieses Zuckers stabilisiert, d.h. jene Form, die unmittelbar an der Saccharose-Synthese beteiligt ist. Die Frage der Bedeutung der Phosphorylierung fur die Saccharose- Synthese wurde spater auch von anderen Forschern diskutiert, so z.B. von Burkard und C. Neuberg (74) und W. Hassid (75), die Hexosephos- phorsaureester aus pflanzlichen Geweben isoliert haben. Die Begun- stigung der Zuckerspeicherung in den Pflanzen durch Phosphatdungung ist ferner schori langst aus der agronomischen Literatur bekannt. Eine direktere Bestatigung fand diese Auffassung jedoch erst in den Versuchen von N. Syssakyan (67, 76). Dieser Autor unternahm vergleichende Bestimmungen der Geschwindigkeit dcr Saccharose-Synthese in den Blat- tern von Zuckerrube und Zichorie bei Aufzucht der Pflanzen mit verschie- dentlich dosierter Phosphaternahrung. Unter Anwendung der Vakuum- infiltrations-Methode zur Bestimmung der synthetisierenden und hydro- lysierenden Invertasewirkung konnte er nachweisen, dass die Synthese von Saccharose aus Monosacchariden bei Mange1 an Phosphorsaure stark herahgesetzt ist,. Sehr wahrscheinlich ist, dass in allen Teilen der Rubenpflanzen bei Phosphatmangel anstelle von Saccharose ein anderes Disaccharid gebildet wird, das der Maltose ahnlich, aber mit ihr nicht identisch ist (W. Syssakyan (76)). Die relative Resistenz dieses Zuckers gegenuber Saurehydrolyse ist ein Anzeichen der Abwesenheit von Furano- seringen im Molekul und ein indirekter Beweis fur die Beteiligung der Phos- phorsaure bei der Stabilisierung der Furanoseform. In einer Arbeit von A. Kurssanov und N. Kryukova (43) wurde diese Frage eingehender unter- sucht. In einer Reihe von Versuchen konnte gezeigt werden, dass eine

358 A. KURSSANOV

bestinimte Beziehung zwischen der Phosphorsaure und den Zuckern in den Zellen besteht. Dies ergab sich aus dcr Tatsache, dass die durch Infiltrierung von Monosen in den Blattern hcrvorgerufene Saccharose- Synthese stets von der Bildung einer gewissen Menge von Hexosemono- phosphaten in den Zellen begleitet ist.

Andererseits veranlasst auch die Infiltrierung mit NaH2P04, die zur Phosphorylierung eines Tcils der Zucker fuhrt, die Synthese einer ge- wisseii Menge von Saccharose aus dem in den Zellen vorgebildeten Vorrat an Monosaccharidm. Diese Verhaltnisse veranschaulicht der in Tabelle VIII wiedergegebene Versuch.

Glucose + Fructose NaHlPO, Glucose + Fructose

+ NaHIPOl

TABELLE VIII

ZUBAMMENH ANC ZWIBCHEN DER SYNTHEBE ORGANISCHER PHOBPHORVERBINDUNQEN UND

DER SACCHAROSE-SYNTHESE IN ZICHORIE-BLK'ITERN

~

464 18.3 743 4 . 4

836 25.7

Synthese (pro 1 Stunde und 1 g. Trockeogewicht) I Organiacher P (in mg.) I Saccharoae. mg. Infiltricrte Substane

Vergleichende Bestimmungeri dcr Phosphorsaiireester in Blattern von Zuckerruben, die auf normalem Nahrboden, bzw. bei Phosphatmangel gezuchtet worden waren, zeigten, dass es die Bildung von Hexosemono- phosphaten ist, die bei Phosphatmangel die starkste Verminderung auf- weist. Infiltrierung von NaH2P04 in solcben Pflanzen fuhrt zu gestei- gerter Hexosemonophosphatbildung und stellt daneben sofort die normale synthetische Aktivitat der Invertase in den Zellen wieder her. Diese Versuchc berechtigten zu der Annahme, dass die Schwachung der synthe- tisierenden Wirkung der Invertase bei Phosphathungcr unmittelbar mit dem Mange1 an Hexosemonophosphat in Zusammenhang steht. Geht man davon aus, dass im Saccharosemolekul die Fructose in Furanoseform vorliegt, so kann man vermuten, dass es die Phosphorylierung gerade dieses Zuckers ist, die fur die Saccharose-Synthese notwendig ist. Neue Be- weise dafur, dass die Phosphorylierung cine der Stufen des Saccharoseauf- baus darstellt, bringen die Versuche von N. Kryukova (77), in denen die Phosphorylierung in lebenden Zellen mittels Monojodacetat (0.005 M) oder Natriumfluorid ( * / t M) gehemmt wurde. Durch Infiltration der Blatter verschiedener Pflanzen mit Losungen dieser Gifte konnte N. Kryukova eine vollstandige Hemmung der Phosphorylierungsreaktionen

ENZYMATISCHE PROZESSE I N DER LEBENDEN PFLANZE 359

ohne sichtbare Schadigung der Zellen erzielen. Es ergab sich, dass die Saccharose-Synthese in den Pflanzen hierhci stark vcrmindert ist, wahrend die hydrolytische Wirkung dcr Invertase keinc Vcranderung aufweist (vgl. Tabelle IX). Es sei dabei hcrvorgchoben, dass die Atrnungsintensi- tat und des R. Q. in dcn ersten Stunden nach Einfuhrmig der Gifte keine wcsentlichen Anderungen aufwicsen.

TABELLE IX

DER I’HOSPHORYLIERUNCSREAKTIONES (Nnch N. Kryukova)

SYXTHESE CND H Y D R ~ L Y S E DER SACCHAltOSE I S \~EIZEXBLATTEHS BE1 AUSSCHALTUNG

Phosphory~ierung in mg. P pro 1 Stunde und 18. Tiockengewicht

Invertaaenktivitiit in mu. Invertaucker pro 1 Stunde und 1 g. Trockengewicht

Syntheso Hydrolyse ~ ___ Kontrollen

Kontrolle 1 CHdCOOH Kotitrolle I CH2JCOOH

2 I 1.46 I 0.00 I 14.1 1 0.0 I 34.0 1 33.0

Wichtig fur die Beurteilung dcr Rolle der Phosphorylierung heim Kohlen- hydratstoffwechsel der Pflanzen, und speziell bei der Saccharose-Synthese, sind Befunde uber den Gehalt an Phosphatsaurecstcrn in aktiv vegetieren- den Geweben. Die von uns durchgefuhrten Bcstimrnungen und Berech- nungen crgaben z.B., dass das Gehalt an Hexosernonophosphaten in Hafer- und Weizen-Keimlingen 18-19 mg. pro 1 gr. Trockensubstanz der Pflanze betragt, in Lupinenkeimlingen-25 mg., in Hanfkeimlingen-11 mg., in Zuckerrubenblattern-9.7 mg. i1.s.w. Demzufolge machen die phos- phorylierten Zucker cinen reeht ansehnlichen Prozentsatz aus, und zwar etwa 15-25% vom gesamten Monosengehalt. Davon ist ungefahr die Halfte auf Rechnung von Fructosemonophosphat zu setzen. Nach den in unserem Laboratorium crzielten Befunden von A. Nijeradse ist der Gehalt an phosphoryliertrn Zuckern in jungeri Blattern besonders hoch und nimmt in alten Blattern betrachtlich ah. So z.B. entfallrn in jungen Teeblattern fast 35% des gesamten Monosengehalts auf Hexoscrnono- phosphate, wahrend diescr Anteil in alten Blattern 3.5% nicht iibersteigt. Daneben sinkt auch die Fahigkeit zur Syrithese von Saccharose, wie G. Harebava zeigte, von den jungen zu den alten Teeblattcrn.

Unter Berucksichtigung der Gcsamtheit der fruher erhobenen experi- mentellen Befunde Ibisst sich die Bildung und der Abbau der Saccharose in den Zellen durch folgendes Schema veranschaulichen :

360 A. KURSSANOV

Schema des enzymatischen Aufbaus und Abbaus der Saccharose nach A. Kurssanov und N. Kyukova (43)

Aus diesem Schema folgt, dass drei verschiedene Enzyme an der Syn- these der Saccharose beteiligt sind: (1) Hexosemonophosphatase, (2) In- vertase und (3) Phosphosaccharase. Das Schema beruht auf der Reversi- bili tat der enzymatischen Reaktionen, deren Richtung durch das Massen- verhaltniss der Reaktionsteilnehmer gesteuert wird. Naturgemhs gestal- ten sich diese einfachen Beziehungen in den Zellen vie1 komplizierter in- folge der Heterogenitat des Plasmas und der damit zusammenhangenden raumlichen Lokalisation der Substanzen. Trotzdem wird, wie experi- mentell nachgewiesen, durch die zusatzliehe Einfuhrung eines der Kom- ponenten dieses Systems (z.B. eines der Zucker) in das lebende Gewebe, ein Prozess in letzterem ausgelost, der auf die Restitution des gestorten Gleichgewichts gerichtet ist (vgl. Fig. 1). Obigem Schema gemiiss, muss auch die Einfuhrung von zusatzlichem anorganischem Phosphat in das System zur Phosphorylierung einer gewissen Menge von Fructose (2, 5 ) fuhren. Hierdurch wird das zweite, durch Invertase katalysierte Gleichge- wicht gestort, und es muss auch in diesem Fall eine Umkehr einsetzen, die auf die Restitution des Gleichgewichts, d.h. auf die Synthese von Sac- charose (iiber Phosphorsaccharose) gerichtet ist.

In unseren Versuchen (s. Tabelle VIII) konnte derartiges Verhalten tatsachlich nachgewiesen werden.

Als irreversibel erscheint in diesem Schema die durch die Invertase bewirkte Hydrolyse der Saccharose. Da aber die Produkte der Hydro- lyse dieses Disaccharids mit Phosphorsiiure ein System beweglicher Gleich-

ENZYMATISCHE PROZEYBE IN DER LEBENDEK PFTANZE 361

gewichtsreaktionen bildet, die wieder zur Bildung von Saccharose fuhren, ist die gesamte Kette von Umwandlungen eine geschlossene. Obwohl die Synthese und die Hydrolyse der Saccharose nach diesem Schema auf ver- schiedenen Wegcn erfolgen, ist der Prozess infolgedessen im Ganzen re- versibt 1.

Writere Untersuchungen in dieser Richtung werden wahrscheinlich dazu verhclfrn, die raumliche Anordnung der Einzelreaktionen dieses Schemaa in der Zelle ngher zu definieren, und ihren Zusammenhang mit dem struk- turell-energetischen Zustand dcs Plasmas zu ergrunden.

Was die Rolle des Kaliums anbelangt, so wird nach den Befunden von A. Kurssanov und N. Kryukova (39) durch Infiltration dieses Elements in der Form von KCl die synthetisierende Wirkung der Invertase in den Blattern von Cyclamen persicuni merklich angeregt und die hydrolysie- rende Wirkung geschwacht. Eine recht starke Verschiebung der reversi- blen Invertasewirkung nach der synthetischen Seite beobachtete auch A. Scherbakov (78), der Erbsenblatter mit Losung von KC1 und K,SO, in- filtrierte.

Vor Kurzem wurdeii diese Befunde in einer Arbeit von N. Syssakyan und B. Rubin wiedcr bestatigt, die an Blattern des Apfelbaums und der Erdbeere durchgefuhrt wurde. Diese Autoren haben ferner nachgewiesen, dass KCl auch die synthetisierende Wirkung der Proteinase steigert.

Bcsonderer Beachtung verdient in den Versuchen von N. Syssakyan und B. Rubin die Tatsache, dass die Verstarkung der synthetischen Tatig- keit der Enzyme untcr dern Einfluss von KC1 besonders deutlich zutage tritt bei Temperaturen, die unterhalb 0" liegen. Da die Abkuhlung des Plasmas gewohnlich mit bedeutenden Veranderungen seines physikalisch- chemischen Zustands einhergeht, kann angenommen werden, dass der Einfluss des Kaliums nicht unmittelbar die Wirkung der Enzyme betrifft, sondern mit den Veriinderungen in Zusammenhang steht, die dieses Ele- ment in den kolloidalen Eigenschaften des Plasmaa auslost, vor Allem mit der Steigemng der Fahigkeit, Wasser zu binden.

5. Einjluss der Temperalur auf die Wirkung der Enzyme in leberaden Zellen

Im obigen wurde gezeigt, dass die vorherrschende Richtung der enzy- matischen Reaktionen in den Zellen, sowohl irn Verlauf des Lebenszyklus der Pflanze, wie im Zusammenhang mit den Bedingungen ihrer Luft- und Mineralstofferniihmng bedeutende Veranderungen aufweist. Noch stlir- kere Verschiebungen erleiden die enzymatischen Reaktionen bei Uber- schreitung der normalen Existens-Bedingungen, z.B. bei starken Tempera- tumchwankungen oder bei Storung des Wasserhaushalts der Zellen. In:

362 A. KURSSANOV

gewissen Fallen sind diese Verschiehungen in physiologischer Beziehung als Anpassungsreaktioneii zu hewerten, in anderen Fallen erfolgcn sie als Resultat der Unfiihigkeit des Organismus, seine enzyinatische Tatigkeit in Ubereinst,immung niit d ~ n ver~nder tm Dcdingungen zu verrichten. Die Schadiguiig und sogar der Untergang dcr Pflanze, die unter diesen oder jenen ungunstigen Bedingungen stattfindeii konnen, sihd in Wirklichkeit ofters nicht, durch die unniittclbare Einwirkung cines gewissen Uniwclt- faktors :tuf die Pflnnze verursacht, sondcrn (lurch die untcr solclicii Vcr- halttiissrn erfolgeiitle Dckonipensation des Ehzyninpparat.;.

Stutlien von A. Kurssanov, N. Kryiikov:t, r ind A . Alorosov (50) uber

IGp. 5.-k:i1ifluss clrr Tcinper:rtur auf dic reversible Wirkung der 1nvert;tse in den Bliittern von C~yclnwcv~ prrsiciott: ( -Syn the,se, . . . . . . . . . . -Hydrolyse.)

den Einfliiss dcr Ttnipcmtiir nuf die rcversilde In\..crt:iscwirkiing in dcn Uliittern verschiedener Pfl:inzcii halmi gezrigt, dass die Ahhiingigkrit tlrs c~nzynintischen I’rozcsscs voii dcr Tclnperatur i i ) don Icl)cwlcti Zc4len i n gnnz ntitlcrw \I’cise ziini Ausdriick konimt nls i n \JersucIicti niit 1511zynipraiparaten (s. Fig. 5 ) .

AUS d m Kiirvcn auf Fig. 5 ist crsichtlich, dnss die Bezirhung zwischen Tcnipersturerhiiliiing untl Invcrtnseaktivitat nur in dcrii Intervsll zwischen - 10 und +35” C. ini Allgenieincn den1 entspricht, wns iiian an Enzyni- priipiaratcn zu heohschten pflegt. Allcrdings sintl auch in diesmi Interval1 die Tcmpcraturqiioticn-- trn (QIo) andcre als die fiir rcine Priipnratc ernlittelten, doch

bleibt die allgenieiiic, der Invertase \vie aiidcrcn Enzyiiien zukonimende Teiidcnz zum Absinken der Qlo-Werte bcini Ubergang voii tieferen zu hoheren Temperaturen auch in der lebeiiden Pflanze erhalten.

Setzt man die Pflanzen niedrigeren Tempcrsturen aus (- 10 bis - 5 O ) ,

YO steigt in ihnen die Aktivitat der Invertase sowohl in Bezug auf Hydro- lyse wie auf Synthest! wieder an. Diese Besonderheit, die als Kultemari- mum bezeichnet wird, erwies sich als ein sehr konstantes Phanomen, das nicht nur dem Zyklamen, sondern auch anderen Pflanzen eigen ist.

ENZYMATISCSIE PROZESSE I N DER LEBENDEN PFLANZE 363

Eine weitere Eigcntunilichkeit des Vcrhaltens der Invertase in lebenden Zellen ist die Depression ihrer hytlrolytischen Wirkung, die bei +40 bis + 4 5 O (bei Cyklamen persicirm) einset zt,. Die Ursache dieser Anonlalien beruhen darauf, dass die Tcmperntur i n d m %ellen nicht allein auf die Aktivitat der einzelnen Enzyme einwirkt, sortderii auch auf vide andcren Ausserungen der Zelltatigkcit. Wohlbcknnnt ist spezicll, dnss der physikalischchemische Zustand der Kolloide bei cstrenicn Temperaturcn starken Veranderungen unterlicgt H (F. F. Nord, vgl. z.13. L. Xolzapfel und F. F. Nord (80)).

Deswegen likst sich z.B. das Kalteniaximum vielleicht mit der Abnahme der Viskositat der Plasmakolloide in Zusammenhang tiringen die in den Zellen nach Angabe von I>. Ru- binstein (86) gewohnlich 5-10' oberhalb des Auftretens von Eiskristallen irn Plasma zrr bc- obachten ist. Was die voruher- gehende Abnahme der hydroly- t,ischen Wirkung bei 40-45' betrifft, so hangt sie vielleicht zusammen mit beginnender Ko- agulation der thermolabilsten Kolloide und niit Adsorpt,ion eines Teils der hydrolytisch wir- ' kenden Invertase an denselben. Starkeres Anwarnicp dkr Zykla- menbliiitter (bis auf $-5O") hat ihr Al)sterbcn zur Folge. Bei der Zerstorung der vitslen Struk- turen hijrt dabei die syntheti- sierende Wirkung cler Invertase in den Zellen auf, und cs stellt sich einseitige hydrolyt.ische Wir- kung en.

Zweifellos haben alle diesc:

Fig. 6.-Einfluss der TemImtLtur auf die reversible Wirkung der Invertase in Bliit- tern von Fragaris vesca, die unter Schnee gefliickt wvden waren.

I'eriinderungen aiich eine bestinimte physiologische Bedeutung. Besonders das Aufleben cler enzymatischen Tatigkeit in den Zellen bei Temperaturen, die nahe dem Nullpunkt gelegrn sind, steht offenbar in Reziehung mit der Uberwinterungs-Resisteriz der Pflanzen. Es konnte tatsiichlich ex- perimentell nachgewiesen werden, dass das Kaltemaximum vie1 starker bei wnterfesten Exemplaren ausgcpriigt ist als z.B. bei Treibhauskulturen (vgl. Fig. 5 und Fig. 6).

364 A. KURSSANOV

Nach den an Blattern von Obstpflanzen durchgefuhrten Untersuchungen von N. Syssakyan und B. Rubin (79) ist das Weiterbestehen hoher Enzym- aktivitat bei niedrigen Temperaturen ein Kennzeichen kaltefester Sorten. Dabei konnten die genannten Autoren zeigen dass die Aktivi- tatssteigerung beim Abkuhlen auch der Proteinase eigen ist.

Ausserdem zeigten A. Kurssanov und pu'. Kryukova an verschiedenen, fur niedrige Temperaturen sehr empfindlichen Varietaten des Chinabaums, dass Abkuhlung von deren Blattern auf t 2 bis 0" zur irreversibler Verschie-

PROZENT DES WASSERVERLUSTES

Fig. 7.-Verschiebung der reversiblen In- vertasewirkung in jungen Theesprossen beim Darren. ( -Syn t hese, . . . . . . . . . . -Hydrolyse.)

bung des enzymatischen Gleich- gewichts nach seiten der Hydro- lyse fuhrt, als Folge deren weit- gehende Destruktion des Zellin- halts einsetzt.

Diese Befunde berechtigten uns zu der Folgerung, dass die Schadigung und der Untergang der Pflanzen unter dem Einfluss verschiedener Temperatureinwir- kungen nicht nur durch direkte Zerstorung des Protoplasmas in- folge seiner thermischen Koagu- lation oder der Bildung von Eis verschuldet sind, sondern dass sie in erheblichem Masse bestimmt werden durch Verschiebungen der enzymatischen Prozesse, die Veranderungen der Temperatur- beciingungen in der Pflanze her- vorrufen.

6. Wasserhaushalt und Diirre-Resi'stenz Bestimmungen der reversiblen Invertasewirkung in der welkenden

Pflanze wurden erstmals von A. Kurssanov (81) vorgenommen, der an jungen Teesprossen (Camelia Thea) arbeitete. Die Versuche hatten den Zweck, die biochemische Bedeutung der Operation 'des Darrens von Teeblattern klarzustellen, die in den Fabriken bei der Teebear- beitung angewendet wird. Es wurde festgestellt, dass das Verwelken mit einer Abschwachung der synthetisierenden Wirkung der Invertaae und einer nahezu spiegelbildlichen Zunahme der hydrolytischen Wirkung ein- hergeht (a. Fig. 7).

ENZYMATISCHE PROZESSE I N DER LEBENDEN PFLANZE 365

Eingehendere Heleuchtung fand diese Fragc in den Arbeiten von N. Syssakyan und seinen Mitarbeitern (36, 82, 83, 81, 85), die dem Studium der inneren Ursachen gewidmet waren, von denen das verschiedene Ver- halten der Pflanzen gegenuber Wassermangel abhangt.

Die Resultate der hauptsachlich an verschiedenen Weizensorten durchge- fuhrten Untersuchungen zeigten, dass allen Pflanzen, bei einem bestimmten Grad des Verwelkens, eine starke Verschiebung der reversiblen Enzym- wirkungen nach seiten der Hydrolyse eigen ist. Warend jedoch diese Verschiebung bei durrefesten Weizensorten erst nach Verlust von 45-50% des Wasservorrats eintritt, verlieren die Sorten, die gegen Durre nicht re- sistent sind, bereits bei einem Wasserdefizit von 20-30% ihre Synthese- fahigkeit. Beachtet man dabei, dass diese Gesetzmbsigkeit nicht nur fur die Carbohydrasen gilt, sondern auch fur Proteinasen (N. Syssakyan und A. Kobyakova (82)) und wahrscheinlich fur andere Enzyme, so liegt die Folgervng nahe, dass der Untergang der Pflanze beim Verdorren durch eine allgemeine Dekompensierung der biochemischen Tatigkeit verschuldet wird, infolge deren die hydrolytischen Reaktionen starkes Ubergewicht im Vergleich zu den Synthesen erlangen.

In diesen Zustand versetzt, sind die Pflanzen naturgemiias nicht mehr zu weitcrem Wnchstum und Stoffspeicherung befahigt, sondern sie unter- liegen einer Art von intravitaler Autolyse, bei der nieht bloss die Vorrats- stoffe, sondern auch konstitutive Substanzen zerstort werden. Sehr wich- tig ist der Umstand, dass die Verschiebungen der enzymatischen Gleich- gewichte beini Einwelken anfanglich reversibler Art sind; beim Erreichen eines bestimniten Entwasserungsgrades aber, der als kritische Grenze bezeichnet wird (N. Syssakyan und A. Kobyakova) busst der Enzymap parat die Fahigkeit zur Restitution des normalen Verhaltnisses zwischen Synthese und Hydrolyse ein. Infolgedessen schreiten sogar bei Wieder- herstellung drr Wasserversorgung in der Pflanze einseitige hydrolytische Prozesse fort, die nach einiger Zeit zum Untergang der Pflanze fuhren.

Interessante Feststellungen uber den inneren Zustand der Pflanze beim Einwelken ergaben sich in den Versuchen derselben Verfasser uber die Wirkung der Phosphatasen in welkenden Blattern (84). Nach diesen Befunden komrnt es bei starkem Einwelken in den Blattern zu einer erneu- ten Verstarkung der Phosphorylierungsreaktionen. Wahrend aber nor- male Blatter durch die vorwiegende Bildung von Hexosemonophosphaten gekennzeichnet sind, findet in dem gewelkten Blatt ausschliesslich die Syn- these von Hexosediphosphat statt; dies ist allem Anschein nach ein An- zeichen der Abnahme des Oxydationspotentials in den gewelkten Blattern und der Ausbildung von anaeroben Abbauprozessen.

366 A. KURSSANOV

V. Zusammenfassung

Obwohl in der Frage der Rrguliening enzymatischer Prozesse in der lehenden Zclle noch keinc hinrcichende Klarheit erzielt ist, halten wir es fur moglich, einige allgcincine Grundsatze auszusprechen, die wir als gut begrundet bctrachtcn :

Die Synthcse und Hydrolyse einer Substanz in der lebenden Zelle wird durch ein und dasselbe Enzym bewerkstelligt.

Je nach dem physikalisch-chemischen und energetischen Zustand des PlaFmw und drr in diesem eingcschlosseneii Gebilde (Kerne, Plastiden, Mitochondricn u.s.w.), vcrtcilrn sich die Enzyme in den Zellen zwischen mikroheterogmw wlsscriger Losung und den Strukturgebilden, an denen die Enzyme adsorbiert wcrden.

In wassrigcr Losung ul~e11 die Enzyme hydrolysierende und in ad- sorbirrtem Zustand synthrtisicrcnde Wirkung aus. Obwohl bride Wirk- ungsrichtiingcn niit demselbcii Iihzyni zusanimenhangen, sind sie demnach in der Zelle rkunilich voneinander getrennt.

Das Verhaltniss dcr (iewchwindigkeiten der synthetisierendcn und der hydrolysirrendrn Wirkung, oder die vorherrschende Rzchtung des enzy- matischen Prozesses in der Zclle, hangt ab von dem quantitativen Verhalt- niss zwischen strukturgebundenem und gelostem Enzym, sowie von dem Angebot adaquater Energie fur die Synthese.

Konstante physikalisch-chemische und energetische Verhaltnisse in der Zelle vorausgesetzt, verteilen sich die Ausgangs- und Endprodukte der enzymatischen Reaktion in der Zelle entsprechend dem Verhaltnis zwischen den Geschwindigkeiten der synthetisierenden und hydrolysieren- den Enzymwirkungen. Jede Storung des erreichten Gleichgewichts zwi- schen den Rcaktionsteilnehniern (z.B. durch Neubildung oder Fortschaf- fung eines dicser Produkte)’ fuhrt unter diesen Bedingungen, in Uberein- stimmung mit dem Massenwirkungsgesetz, zur Ausbildung eines eiriseitigen enzymatischen Prozesses, der auf die Restitution des gestorten Gleichge- wichts gerichtet ist, d.h. auf die Umwandlung des uberschussigen Re- aktionsteilnehmers in den im Unterschuss vorliegenden.

(f) Bei Anderung der physikalisch-chemischen und energetischen Bedingungen in der Zelle kann das Verhaltnis zwischen den Geschwindig- keiten der synthetischen und hydrolytischen Enzymwirkungen Verschie- bungen in der einen oder der anderen Richtung erfahren. Dementspre- chend andert sich auch die Verteilung der reagierenden Substanzen. Des- wegen sind Anderungen des inneren Zustands der Zelle immer mit mehr oder weniger regen Urnwandlungen der Inhaltsstoffe der Zelle verbunden.

(a)

( b )

(c )

(d)

(e )

ENZYMATISCHE PROZESSE I N DER LEBENDEN PFLANZE 367

Verschiebungen in der vorherrschenden Richtungder Enzymwirkung in den Zellen konnen sowohl durch innere Ursachen, wie durch den Ein- fluss von Umweltfaktoren auf den inneren Zustand der Zellen veranlasst sein. Dabei sind die Veranderungen in den einen Fallen solcher Art, dass sie zu gleichsinnig gerichteter Verschiebung aller oder der meisten enzy- matischen Prozesse fiihren (z.R. beim Welken u.dg1.); in anderen Fallen sind die Veranderungen mehr spezifisch und betreffen nur irgend einen be- stimmten Enzymprozess.

Der Stoffwechscl im Organismus beruht in der Hauptsache auf der individuellen Regulierung der enzymatischen Reaktionen, bei der die einzelnen enzymatischen Prozesse in den Zellen inbezug auf Geschwindig- keit und Richtung verschicdcne Veranderungen erfahren konnen. Die Voraussetzung fur die individuelle Reglierung der enzymatischen Prozesse sind einerseits in der salektiven Adsorption von Substraten und Enzymen an den Strukturgebilden der Zellen zu suchen, andererseits in besonderen Energieubertragungen.

Jeder Pflanzenart und -Sorte ist bei gleichbleibenden inneren und ausseren Bedingungen ein konstantes Verhaltnis zwischen Synthese und Hydrolyse eigcn, welches demnach ein Artmerkmal der Pflanze darstellt.

Die Entwicklung der Pflanze, die Bedingungen ihrer Ernahrung und ihre Wcchselbeziehungen mit der Umwelt verursachen in ihren einzel- nen Organen wesentliche Anderungen der vorherrschenden Richtung der Enzymreaktionen. Zuin Teil stcllen diese Anderungen die direkten phy- siologischen Funktionen der Enzyme im Organismus dar und sind reversi- bler Art, indem sie unter dem Einfluss ausserer Einwirkungen oder perio- discher Anderungen des inneren Zustands der Zellen wiederkehren. Eine andere Gruppe von Veranderungen bilden die irreversiblen Verschie- bungen nach seiten der Hydrolyse, die mit fortschreitendem Alter der Pflanze, sowie unter drm Einfluss ungunstiger Existenzbedingungen ein- treten (z.B. bei weitgehendem Verwelken, bei tiefen Temperaturen u.s.w.) ; solche Verschiebungm fiihren zum Untergang der Pflanze.

(9)

(h)

(i)

(k)

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