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j, ‘1 c64 E:,:, / 2:. *j-. ‘;?- ,.~ ;,”
f’ : ,,,., ; ;;; ” UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
Facultad de Veterinaria
Departamento de Microbiologia
c 6 4 E:,:, / 2:. *j-. ‘;r~~
i’ : _, UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
Facultad de Veterinaria
Departamento de Microbiologia
BIBLIOTECA UCM
5300899719 5300899719
ADAPTACION DE NUEVOS METODOS DE ADAPTACION DE NUEVOS METODOS DE
DIAGNOSTICO PARA RINONEUMONITIS DIAGNOSTICO PARA RINONEUMONITIS
EQUINA Y SU VALORACION EQUINA Y SU VALORACION
EPIZOOTIOLOGICA EN ESPAÑA EPIZOOTIOLOGICA EN ESPAÑA
Luis Enrique Martin Oler0 Luis Enrique Martin Oler0
Madrid, 1992 Madrid, 1992
La Tesis Doctoral de O.&-.k&?&&........
. .l.-Mfmr/.. ..4crv-~
Titulada ikk&I
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
~~.b~.O~~~-C~r,~.~...
&.qm .poI9.
ulrcctor Dr.
fue leida en la Facultad de . . . . . . . . .
de 1
d<? .&
UNIVERSIDAU COWLUTENSE DE WIDRID, el dfa .??y.
tb.k.q,-:. . . . . . . de 1961I(,.. ante el tribunal
por105 siguientes Profesares:
wUcl~SAd~~..~.FR~~qnFX,......
. ..~?oac6~lie,l,..I$-rr~,~eZ,.. ..*.
VOCAL .kr.'IQ&?.. .b.L.P.%169@L,. . .i?%t!. . . . . . . . . .
VOCAL .%aFJ . . )42lA~C f-f-G&.wk.. ..*. . -... r;' . . . . . . . . . . . l........
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..*..............................
habiendo rccibldo la calificación do .itx::.iJ ..........
i' "1 .. . .. ..:!!'!!l:...rl!i.:Ir~.~~~~.~?i!~ 0.. ................
mpreso mi mAxlmo sgradecinimto, al Dr. Jos6 Hanuel Sãncher
~ircalno Rcdriguez, por la direcciõn, íntores y b”enos conssjo~
gue me ha dada pcrs realizar oste trabajo, aal como por haber
C?...dC B” Ial, constancia 0 ilusidn B” EiI tomaci6n proíesiona1.
I\ !di amiga y conpanera mm1n1a Aguinaga “aluca”, par 0”
gran a,‘“da, ya que sin alla ne hubiera sido diflcll da llevar a
cabo esta tesis.
A los “~t~?in.rics ,,ilitsree, daatinados en las ““idades donde
se ha realizado la tom da muastras para este estudio, por 8”
gran ayuda y colsbracibn.
A todos los soldados, que durante el periodo s” el gua ne ha
dasarrollado este trabajo, han colaborado de una íorna mtusiast.
y eficaz, poro euy especialmente a mi amigo Javier EwA.5”.
?.l Dr. Jos* MwIl Escribano, a la Diva. mrisa arias y a todo
el grupo de Virolcqla del Depaìtmmto de sanidad Animal del
centro de Invaetigacidn y Tecnolcgla del Instituto Nacional da
Investlgacicnae Agrarias, por BU inastiaable colaboracid” B” la
puesta a punta da dichas t6c”lcas.
Deseo dar las gracias a todos míe compaf,eroa del Departamsnto
de Microbiologia y hnãlisls Cllnicoa del Csntro Hilitsr de
Vaterinarla (Madrid), por 8” apoyo B” el danarrollo del mismo.
A la Diraccibn del &ntro Militar de Veterinaria, en cuyas
laborstorios 86 ha desarrollado princlpalnente esta trabajo, por
la gran colaboracidn y ayuda prestada en tcdo momento.
,............................................61
111 - I ESTUDIO RELACIOH~INW LAS DISTINTAS
C)rRAcTERISTICAS OBSM¿“*D*S EN MS ANInALzs Y su
LUC)LR DE PROCEDENCI* . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...61
III.1.1. RESPECTO A‘CLIH.4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...62
III.1.2. RESPErnO A Lh EDAD . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..s.
III.1.3. RESPECTO AL PESO-SEXO-IUW. . . . . . . . . . . ..s.
111.1.1. RESPECTO A Lu CoNoICIOH*S DE
~ITABILIDAD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..6~
III. - 2 ESTUDIO LASORAMRIAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..ss
I11.2.1. RESULTIIWS OsTENIcoS POR ELISA
IWDIRECTO.............................S5
II1.Z.l.a. POTROS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..ss
III.2.1.h. YEG”*S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...71
III.2.l.C. SEMENTALES . < < . . . . . . . . . . . . . . . . . .75
TII.2.1.d. COHPARACIOH DE “AUIRES POR ELISA
ENTRE ms S”WOS FQSITI”OS
NEGATIVOS Y “ACUNMOS < . . . . . . . . . .s2
TII.2.2. EVAL”ACION DEL ELISh INDIrlEcm CON LI\
TECWICA DE SEROHmwIZACIOH . . . . . . ...83
~1 herpewirus agulno tipo-1, BS la myof causa vira1 ds las
anfarmB*sdoa reap1ratorLxl a9ue.s sn cabn11os durante Pi primer
y segundo a,,o ds vida, siendo ceneidearado corso enddmicd en 1a
mayorla de las po,blacIones equinas (Bryans 1.9691 Bt”dderf 1.97,;
POVSll y col. 1.W8).
En E~tadoe Unidos II<) hizo un estudio co” aata virus,
sisldndosa en 21 de 21 potroa que aurlaron en una granja durante
una *pLiesia, pua lle carsctsriz6 por un cuadra abortivo y muertes
psrinatalae, esto les hiz.o pensar gue las epidemias de enfermedad
r.spirstoria antr. caballo, jóvenes, proviana de gran,a.s
infcctaaa* OO” ysquaa prefmíos (Hartley y DíYOIl 1.979). El aborto
“0 ocurrib. aunque 1aa **guaa pranallas estaban aupuestaa àurant.3
el curso da la epidemia. Mn tarda. hubo un n”mero da casos ds
íntscclón de EH”-1 amolados a un slndroma dc patAlisia. Este
dltimo aLndroao era qm~ralmmta esporhdlco, pero las $pldaalas
ha” eid reconooLdas (*iaxeg*?.r* 1.966; Oìee”YOcd y 5imeon 1.980;
Cro~h”rst y col. 1.9811 Thai,, 1.9811.
con la prmlncls d. lOS alndrolno* respiratorios, sbortl”o*
y nerviosos, la apidemlologla da Is infeccI6n co” EH”-1, BS algo
mãs complLcada de detectar.
, - Citoaegalovirua aurino. I
AQ
- Virus Epstein-mrr (tipo 4).
- virus Herpes Cercopithacine 12
(*abcm, * - virus "erpes pongine(chimpance)
- virus de la mfermedad de Mare&
(gallid 2).
- virus Herpes del pavo (neleagrid
1)
- Virus Herpes saimirii z(mo"os).
- virus Herpes Ateline 2 (clase
am,.
- Virus Herpes Atelina 3 (clase
73) *
- wnbi6n en esta subfamilia se
puede asociar con el carCinm"a
renal B" rana*.
Estos virus animalea tienen muy poca ralacibn inmnolbgica
con los herpesvirus hunanoa, II excepcibn del virus B de los monos
(&lphaherpes"irinae) que puede produoir reacciones cruzadse CO"
el virus del Herpes Simple (Alphaherpesvirinae).
Estb constituido por un virus ADN, de simetrla de chpside
fcw.&drica, co" un tanafm entre 120-200 nm. y cuya estructura
posee de fuera a dentro, una doble envoltura originada en la
menbrana n"cleõr de la c6lula huesped, teniendo portanto "na
envoltura lipldica sensible aleter y al cloroformo, con pequonae
2.6
~eneralaente la Rínoneumonitie equina ee manifieste CO" ""
C"?.dìO respiratorio similar el de otrss eneermedades
respiratoriae d$ 10s Squidos. lvmllien * veces aparecen
poeteriormente cuadroe abortivos y nervíosos, que el ganadero
,,o relaciona con loe posibles cuadros respiratorios que tUYo
anteriamente. ES asl, como segdn evenze le enfermedad s"
patologIa se monifiesta y mediante obaervaciõn cllnica de este,
ee como ee realiza el diagnbetico, equivocando en la mayoria de
los cb.60~ la Rinoneumonitis equina, con otìas de similar
caracterfstica como la T"fl"e"Z* 0 Arteritis virica.
la enfermedad tiene los siguientes cuadros olInicos:
1) Infaccidn respiratoria en caballos suceptibles.
2) kho?Ao en yeguas preliadaa.
3) Enfermedad perinatal.
4) Enfermedad del Sistema Nervioso Central (Mieloencefelitis).
l 1, wded Resdratori*: aunque el virus puede infectar
el tracto respiratorio de cualquier caballo, loe animales mas
viejoe que han tenido ""a expansiõn repetida, presentan cierta
resistencia contra la enfermedad. Estoe animales sufren una
infecci6n libre de elntomae. Sn los animales mbs jóvenes sin
eupensibn previa, como los potros deetetados y loe ysarlings,
EUeStrW elntomas respiratorios de do8 e diez dlas despues de
le infeccibn. Como slntomas m6s sobresalientes, se observan:
descarq?. serosa por.faaas nasales, siendo más tarde este
laucopurulenta, fiebre (hasta Il,leC), ligera anorexia (tocos
"ecrõti~o. e" faringe) y deprasiõn con UD periodo de duracibn
de haata siete dfaa. Tmbi.Zn, eparece una necrosis extensiva de
CSlUlae epítelielee del trasto respiratoria superior, ecompafmdo
por una acusada reepueeta inflanatoria. ~ambi&, en eeta zona
puede aparecer una hiperplasia linfonodular con infartación de
los follculos linfoides, que al contaninarse con germenes,
son caractsr1stioaa sprsciv.las, una vasculítís, CO” una
dsganeraclbn ssoundarlahip6wloa (disminuolbn de la concsatracIbn
de cxlgmo an aangra) en al tejido mural bdyacenta, apareciendo
impartsntas cambIoa hístopatol~lcos a” aabos casQ(1 de
39
mieloenoefalitis, tanto natura1 como experimenta1 (Platt y col.
19sa,. E" particular Jackson y COl.(1977, fuero" cspsoes de
reproduoir un eLitedo parautioo, 00" une gran vascu1itis por
i"yecol6" suh~utanea del EH"-1, en yaguas prefmdas del EjBrcito
Australiano. cambios vasculares, ere" nSs predominantes en la
m6dula que en el cerebro y el poco tiempo, les lesiones de le
materia blanca de le medula eran ~6s manifiestas que las lesionea
de la materia gris (Jackson y Kendrick 1971). Evidencias como
i"ClUSiO"eS i"tra"ucleares en "e"ro"a*, en infecciones M
"eurotróficas no son apreciadas en los caeos producidos por *
Ex"-1 (Thomson y CC.1 1979).
En les encefalitis asociadas co" herpesvirus en otra8
especies, por ejemplo, el virus herpes simple en el hombre, el
herpesvirus en el ganado bovino y el virus de Is enfermedad de
Aujeszky en cerdos, hay una clara evidencia de "eurotrofismo
primario con nultiplicaci6n del virus en neuronae y "eurofagia
(Paltt y col. 1980). En contraate, el UN-1 apreciado e" el
Ejercito Australianrr, no hay neurotrofiamo en cerebro equino,
apareciendo nas tarde en le inoculaci6" intracerebral directa
(Prickett y Bryana 1970; Jackson y col. 1977).
Experimentalmente, la mieloencefalitis producida por E"V-l ee
caracteriza por una difusa vasculitie, mds prominente en el
tejido nervioso, afectando tambi6" al endotelio y pulmones (Platt
y col. 1980). Se propuso por parte de Jackson y col. 1977, que
durante la viremia aparecen altoe niveles de anticuerpos en 18
clrculaoi6n, propagbndose el virus directamente por la circulación e las c6lules infectadas ye les o6l"l.s endotelialee
y de estm, a las cB1ul.e endotelialee contigua sin una fase
extracelular.
Una vez que la ínfecciõ" sndotelial es iniciada, el virus tiende e propagarse centrlfugamente e infecta las c6lulas
pare"quimalea adyacentes. Esto, responde a una severe y
generalizada vasculitis sin destruooibn neurona1 primaria,
aroclada co" EHV-1. Focos malbceos (blandos), presumiblemente
w
Concentración de scrílamida ----- - ----- Jp( ---- m
,o, acrllamida , -_-_________ 2.5 ------- ,,, ---- 1
0.8, bisadlamí+ '
1.88 M RIS-CLH p" .3,B ---------- 1,2 ------- 1,2 ---- 1,2 O,B* sO8 __-_____--------__------ 1,2 ------- 1,z ---- 1.2 AgUa ---_------------------------ l,, ------- (J,2 ---- 1.6
Tam& _-___----_--_---_--________ 5 pl ------ 5 pl ____ lj p1
10) de persu1rsto an6nico ------- 30 ill ----- 30 p1 --- 30 p1
E) va acrílalnída , --------------------____ IJ,,, m1
0,8, bisacrilarids 1 l),62$M wi*-Cm p" 6.8 ---- - ------ - ---------- o,, m1
0,5t 806 ---------__--_--_------------------- 0.4 m1
Irgua ----------_--__-________________________ o,a, al
*el& --_---__-___________------------------- 2 IrI
Lo* da porsulfata amó”&co ------------------- 10 pl
Hegro -idO ____--_-_----__-_--_---------------- 0.5 g
UW,WIOl ______________---___-------------------- 45 ml
WJ,M daetllada ---_--_“------------------------- 4s nl
AcIdo *Artico _----_------_---_----------------- 10 nl
el Gel
nat.nol ____-__-----------_--------------------- 40 cc
*cido &$c~t~c#j ---------------------------------- 10 cc
Apa (hasta) ___-________-___-_-_--------------- 100 cc
netano1 _________--___--____-------------------- 10 cc
ACl& Ac‘tico _----_-_---__,-__-_________________ ej cc
Agua (hasta) -_--_------------------------------ 10,) cc
u&,a ec~lia,, dasnata&, ------------------------- 1,, g
*B* (hasta) ------------------------------------ 1 1i-o
F
Clc,ro”aftol --------_--------------------------- 30 mg
)JlJta”ol _-------------__--__-------------------- 10 00
Tng (haata) ------------------------------------ 50 00
Agua dsatilada sl JOI ----------------_-_------- 6<) 111
W,s Clorldrico -----_-----__ ,,8, g _--_-____-_ z‘, m
Cloruro a&$i,Jo -------------- 58,1(1 g --------_- 500 u
,.g”a dantilsda (hasta). ------------------------- 7 litr~os
Ajustar pH a 7.5 CO” cw
a-Ea-
AErilaida ------------------------------------- 30 g
Blsacrllaaida -----______--_-___________________ 0,s g
Agw, daatilnda (,,.uta) ------------------------- 100 cc
Guardar sn frIgorliioa
Ba,uci6n de 1a”adtJ ------_--------------------- 1 sitr,J
@ercsl~Ins 8oYs”a (asA) --------------------- 10 <J
l8BQS.W
ki?dlsa- “M _____-__----------------------------------- 900 00.
*stwsto BodiCO (100 EL!4 _------_--_----_------ 10 nl
wn+u~c~na (50 q,m, ---____---.____---__----- 1 111
,ua,nor(c,dcs no ~WancIalae --------------------- 10 n1
*"arO <rea1 de Ca-nersl ca1 10 t, __-__--____ *_- 1‘g* m
j$gw ____--__------------____________________--- 900 cc
P,PJ"rlto .%dsco (100 on, ---------------------- so n1
centanIoln4 (50 mq/ml) _______--_*_________---- 1 .1
msnobcsdcs no msnoial~s --------------------- so m1
.w~rO rci.1 *s t*rn*ra (tal 2 I, --------------- 10 co
*yero fotal *e tclr‘3101‘11 ---------.-------------- 9 cc f)imetil s"lf*.#idr, ---------_----__------------- 1 EO
- Acido Acbtico. Probus.
- Acido Cltrioo. Probus.
- Ahcido Etilen Diamino ‘Petra AcOtico. Marck.
- ACid SUlfIlrIco. Prohe.
- Aceilamida. Bio-Rad.
- Aminoboidos no esenciales 100x. Plow.
- Anti-IgG ds mballc mm-cada con peroridasa RAH,PO. Nordic.
- Azul brillante de Coomaasle R-250. Sio-Rad.
- Azul da Bromofenol. Merck.
- Blcaebamto Sbdico. Panreac.
- Bisaerilanida. Sic-Rad.
- Carbonato Sbdico. Probus.
- Cloronsetol. Sio-Rad.
- Cloruro Sbdicc. Probus.
- Dinetil Sulibxido. Fluka.
- Dodecil’ Sulfato Sbdico. Sia-Rad.
- Etanol. Probus.
- Fosfato Disbdico. Nerck.
- Fosfato MonopotSsico. Mero)<.
- Gentamiclna song,rd. Flov.
- Clicerol. Slo-Rad.
- Glicina. Sio-Rad.
- lecha dematada Wolioo. Nestle.
- Medio Eagle Modificado de Dulbecoo, sin Clutamina y sin
Bicarbonato Sfdico (MEM). Flov.
- “er~aptoeta”01. Mo-bd.
- Hata”c.1. Prabus.
- Negro Anido, Merck,
- Nonidat-PIO. Marok.
- Orto Fenilen Dianina. Dakopatts.
- Perbrido de Hidr6geno 3Ok. Pa”reao,
- Parsulfato Sbdico. Bio-Rad.
- Piruvato Sl>dico. Plow.
- Sacarosa, “ere)<.
- Seroalbdmina Bovina (ESA). Sigma chemical corp,
3.4
11-I ANI B
Distribuci6n geogrãfica:
realizamos un estudio epide&,lbgícode la enfermedad, tomando
muestras de diferentes regiones de Espana para ver la incidencia
ds las misma y recogiendo a SU vez informaoibn de las
caracterieticas más importantes de estos animales, como so"8
edad, paso, raza, actitud, vacunacionas y clima, para su posible
relaci6n con los resultados.
MB lugares de toma de m"estra fueron:
*Yeguada Militar de Cordovilla la Real (Palencia).
R?&l:TirO.
*Yeguada Militar de Lora - Toki (san Sebastian).
RaZa:P"ra sangre Ingles (P.S.I.).
*Yeguada Hilítar da JBT‘~E de la Frontera (Cadiz).
Raza:P"ra Raza Espflola (PAL) y Pura Raza Arabe (P.R.A.).
*DepõSito Militar da Sementales WI Alcalã de Henares
(Madrid).
RaEa:Pum RaZa Fx.pafio1a (P.R.E.).
l Depdsito Militar de Sementales Nn5 (Zaragoza).
R?LSa:TitO.
Estos animales los agrupamos dependiendo de su funcidn en los
grupos siguientes:
- SMENTAL.ES
- YEGUAS
- P0TRD.s
Esta clasificacibn se realiza para ver a la hora de valorar los
resultados, ai hay alguna caracterlstica c.,m‘,n an cada grupo o
por el contrario no existe ninguna.
/ .,b
Ip
i
l
E,, eete trabajo se ha utilizado la cepa Xentucky del virus
E"", adaptada e c6lulae BHK-11 en eu pese 21, facilitado por el l
Laboratorio de Sanidad Animal de Algete (Madrid).
I
El oultivo, lo raalizamoe en frascoa Palcon de 75 cm' de
*Up*l-fiCi*. una vez que el tapiz celular ee enC"ectre
subconsluente, sfiadlmoe 1,s ml. del virue, mhs 4,s ml. del medio
de mantenimiento. Transcurrido una hora e. 37*C y ""e atmosfera
del 5% de COZ, de cc,,tectc del virus con lee cdlulas, anadinos
15 ml. del medio de mantenimiento y lo incubamos con las mismas
csracterfstioas anteriormente citadas.
A lee 24 horas, apreciamos. un efecto citopático clero,
manífeatandcee cdlulas aincitiales y c6lulas individuales
desgrendidas en un 80%. Hde tarde, realizamos le obtenoibn del
antlgenc eoluble citoplasmdtico, como ee indica en el apartado
n-7.
Esta antLgen0, lo fijamos en los pooillos de lee placas
microtiter e le dilución bptíma, utilizbndolas inmedistamente 0
bien congelándolas a -2O*C, tapadas con papel parafilm, no
perdiendo actividdd durante 12 meeee.
Tanbi6n este antfgen0, lo utilisamos para realizar la
electroforesis e inmunotransferencia del Immunoblottíng.
de linea celular utilizada fu.3 la BHK-21 (chlulas de ri¡Ibn
de hamster joven), que eataba congelada en nitrbgeno liquido y
tretade con cuero fetal de ternera al 101 y dímetil sulfbrido
en pr,,pc,rcibn de 9:1 con reepecto al cuero fetal de ternera.
Foto nQ3. Cdlulaa BHR 21,infectade.s co" Virus EH"-1.
Realizado en nuestro laboratorio. x 2.00.
EFECTO CrmPAmcc
sa
EI sntIgeno 88 ohtuvo siguiendo le .etodolcqla.descrita por
esorlbano y Tabe~6s (198,), para el virus de la Peste porcina
afrleana. Cblulas inieotadss, se recogieron e les 24 horas con
un efecto citopático aproximademente de un 801, sin haberse
desprendido lee cLlule8. Estes, lae lavamos primeramente dos
"eces con PBS pH 7,2 y una OO" sacaroB& 0,34 n 4" Tris ClH 5mN
de pH 8. De.epu.3~ de este tercer lavado y msnteníendo le seEeP=Qe,
retiremos lee c6lulae infectadae oon una eapbtula articulada,
quedando estas suependidas en la solucibn del tercer levedo. PeXe ssdimentarlae, centrifugamos esta aoluoibn a 650 g durante cinco
minutos II 4PC. beguldemente las oblulas se resuspendieron e" Un
tampbn hipotbnico de sacarosa 0,067 M e” Tris Cl" 5 104 de pH 8,
se inoubaron duranta 10 minutos en un bafio de hielo y se lisaron
por adiclbn de& detergente Nonidet P-40 (Merck), LI una
concentracibn final del 1\, que ee de,6 ectuet durante 10 minutos
a OPC. Pere recuperar le isotonicidad del medio, se afíadio 117
del "cl"me" total de eeoeroee 64t en Tris ClH 0,4H de pH 8. LOS
nboleos celulares se eliminaron por centrifugacibn a 1000 g
durante 10 minutos, tras lo cual el sobrenadante (fraccibn
citoplasmática) Be tretb con EDTA Iwl4, 2-narcaptcetanol o,05n y
ClNa 6,51[.
Tree IS minutos de inoubecibn e temperstura ambiente, la
mezcla II. o.ntrifugb a 100.000 g durante una hora e 4QC sobre
un colahbn de sacarosa el 20% en Tris CIR 5Om!! de pH 8. La
fraocibn cbtenida por encima de le eecerose, se utilirb como antígeno positivo pare la t6anica.(Poto nn 5)
A la. 'vez y en le.8 mismas oondioiones~ gue preparamos el
ant1gano positivo, realiramos Ie pleparación del antlgeno
negativo, utilizando la misma linea celular, pero sin infectar.
El tratamiento utilizado con estae oálules, es idbntico el
realizado co" le, oblulaa infectada&, reco+ndo en la bltima
fase el mobranadsnte del colchón de sa.carosa el 701 y
utilizhndolo como antigeno negativo.
"na n"ltiplicIdad de infecciõn (m.d.i.) de 10. TZXS dos horas de
absorci6" del VirUS a 37QC Y "na atn6sfera de 5k de Co,, S=
m,adisro" ~OO,‘l/po~ill~ de medio HM s"plamentado con 2% de BYBTO
fetal de ternera.
Tras dos horas de incubacibn õ 37PC y una atmbstera de 5% de
co,, so rstir6 el medio de marcaje, lavando a continuacifin c"atro
WCBS PO,' pOCill0 COI, íO!~l,pWillo de PBS-esteril. ""a YBZ
realizado Bato, afmdimos 4O,‘l/pocillo de solucibn de rotUI?, y
ho,ac.qeniZmos recogiendo todo el volumsn sn un tubo apFadort.
Por dltlmo SO cargo "" gel al 17% de acrilanida con el fin de
estudiar 1s cin4tica de apsricibn de las protsinas vlricas. El
marcaje y procesamiento de las o¡Slules sin infectar (controles),
se rsalir6 de forma similar a la utilizada en c4lulas infectadas.
II.9.I CON
El contaje de la radiactividad existente en las diferentes
wsstras marcadas con'%-metionina, SB datamin6, afiadiendo a un
"clusen conocido de la m"Bstra deseada. 2,s ml del lfymido de
oentellso. Las ri"estrrm asi preparadas on vlalari da centelleo.
BB introdujeron an un contador de csntslleo de radiaciones 6 para
0" 1actura.
(~m?mmlA), CC" las siguientes caracteriaricaal
l ce1 - hpelmzsdor ----- 20 mA,PO ” ( 1 hora l ce.1 - separador ------- ,o M,lrJcl ” ,
,
bsapuds de la transferencia, loa filtros fueron cortados an
tiras da 0,s cm y mantenidas a tsnpsratura ambiente, hasta
r.aliaar las lnmuncrreaccícnoe con los dlfsrsntea sueros.
~1 ndnero total de s~srcs utlliaados para (IBte estudio, fu6
de 101. Zstw suarcs fueron truwpoìtadoa desde BU lugar de
criganal laboratorio, B” contenedores refrigerados yhenóticcs,
en un medio de trsnsporte rhpido, recepcionbndolos LI las 21
horas.
las BUBTCI~ controles positivos, los obtuvimos de un brota de
Rlnoneu0onitia equina, producido en Hospitallet da
Llohregat(Barcelona) en al ano 1987, de animales con slndrome
respiratorio y cuadro paralitico, en au fase aguda.
§.l
ELISA INDIRECT’O
ELISA INDIRECTO JEREZ DE LA FRONT. (CADIZ)
$0 ‘a’rn /
c RACtON DE VALORES POR ELISA IF(DIRECTO SEGUN ACTITUD
ELISA INDIRECTO Gxx?Dovn.LA REAL-PALENCIA
ELISA INDIRECTO JEtw DE LA FRONT. (CADIU
boN 0s w.u?REs POFI ELISA tF4?MKTO SEGUN ACTITUD
” 1,
(9
ELISA INDIRECTO LORE-TOKI (SSESASTIAN)
~+--- f- . ..-j
/ l
ELISA INDIRECTO ZARAGOZA
,z I aii n ” ._,-.__.,,,,.,. ----- ---,.,--. --.-
TO (GAtw
COMPARACION DE VALORES POR ELISA INDIRECTO SEQUN ACTITUD
; t L..-- __..__.II_.._. - --‘7
:’
,., ,.,
CONTROL POSITIVO
0.2
/ .-
--nu /
--ll*
IV — DXBCUBION
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IV—l SITUACION DE LA RINONEtJI4ONITIS EqUINA EN }2SPAIIA
La Rinoneunonitis equina es una enfermedad extendida por todo
el inundo, pero controlada en la mayoría de los países, sobre todo
de la CE. En España, debido a la falta de buenas técnicas de
diagnóstico que nos pudieran ofrecer una situación
epizcotiológica de la enfermedad, así como la falta de estudio
de factores que pudieran tener ralación con ella, hace que se
desconozca su incidencia y localización, apareciendo
esporádicamente brotes en sus distintas manifestaciones.
En este trabajo, hemos tratado de cubrir este espacio vacio
anteriormente citado, estudiando los posibles factores que
pudieran influir en el desarrollo de la enfermedad, así cono
poniendo a punto, un Elisa indirecto y un Inunoblotting, que
fueran lo suficientemente rápidos y sensibles como para poder
llevar a cabo estudios serológicos masivos.
Hemos estudiado animales de diferentes regiones de Espafla y
de diversas características, las cuales hemos tenido en cuenta
a la hora de valorar el trabajo. Estas características, son: el
clima, la edad, el peso, el sexo, la raza y las condiciones de
habitabilidad y que al igual que Campbell y Stiaddert(1983),
creemos que pueden tener gran importancia en el desarrollo de la
enfermedad.
Los resultados serológicos obtenidos en este trabajo, nos han
llevado a pensar, que la incidencia de la enfermedad en nuestro
país es muy alta, ya que en la mayoría de los estudios
serológicos realizados han sido positivos, observando anticuerpos
frente a la enfermedad.
El hecho de haber realizado tres períodos de muestreo, en
tiempos diferentes, nos ha permitido conocer la posible evolución
de los anticuerpos y de las distintas formas clLnicas. Durantetodo el trabajo, no se presentó ninguna manifestación clínica,
pero se mantuvieron los niveles de anticuerpos detectados por
uElisa indirecto e Imnunoblotting, indicAndonOs que la mayoría de
los animales estudiados, ha tenido contacto con el virus.
Esto pone de manlf testo, el riesgo que potencialmente eyiste
en nuestro país, de que se produzca una reactivacién de la
enfermedad,ya que el número tan elevadode casos asintomtticos
crónicos. hace que en cuanto se modifiquen algunas de lascaracteristicasespecíficas y ambientalesestudiadasen estosanimales, pueda desencadenarse,algunas de las distintasmanifestacionespatológicasde esta enfermedad.
¡frs ~.nMOnfInICA5 ESTUDIADAS
* l&especto a las característicasdel CLIMA,RAZA,SEXO Y PESO, no
hemos apreciado ninguna variación significativa, que pudiera
relacionarse con el desarrollo de la enfermedad. Ya que animales
con diferencias en estas características, mantienen valores
similares de niveles de anticuerpos, tanto por Elisa como por
Imnunoblotting.
* No ocurre lo mismo con la EDAD, ya que hemos apreciado
variabilidad en los resultados serológicos, ausentandoel nivel
de positividad por le general, con la misma. Lo que nos sugiere,que al ausentar la edad, aumenta la posibilidad de contagio. Un
hecho que nos llama la atención en algunos sementalesadultos,en la disminución de los indices de anticuerpos.
* Normalmente en los potros, los valores que hemos obtenido en
los sueros de la tercera muestra, suelen ser los sim elevados,como me aprecia en las gráficas n’l y n
13, de las localidades de
Cordovilla la leal <Palencia> y Jerez de la Frontera <Cadiz). No
obstante, de estas dos localidades, los potros de Cordivilla la
Real (Palencia),tienen valoressuperioresa los de Jerez. Esto
puede ser debido, a que las yeguasde cordovilla la Real, estinvacunfls de Rir.oneumonitis equina.
99
También se aprecia que el potro ntZ de cordovilla la Real.
presenta un valor en Su tercera muestra de 1,316, próximo al dado
al control positivo (1,587>. Esto puede ser debido a que es unode los de mayor edad estudiados en esa zona <2 años).
Otro aspecto significativo, es lo que ocurre con los potros
de Lore — Toki (San sebastian), debido a que su tercera muestraes la que presenta los valores más bajos, como se demuestra en
el gráfico n92, pudiendo esto deberse a una ligera infección con
cuadro clínico poco manifiesto.
* En las yeguas. los valores obtenidos en Cordovilla la Real
<Palencia>, 505 muy altos e incluso algunocomo el n99, está porencima al dado para el control positivo. Esto es debido a que
estos animales han sido vacunados en fechas próximas a la
recogida de muestras. No obstante, apreciamos en el gráfico fl04,que los valores de las tres muestrasde esta localidad, están
bastantepróximos, a excepciónde las yeguas nTMB y nOé, cuyosvalores en suS primeras muestras, fué inferior a los valoree delas otras dos. También observamoscome las yeguasn*lO Y fl0 11tienen unos valores muy bajos, a pesar de estar vacunadas deRinoneusonitis equina. Esto creemos que puede ser debido, a quela vacunano les hayaproducido una buenarespuesta.
En las yeguasde Jerez de la Frontera (Cadiz>, vemos en lagráfica nOS, come los valores obtenidosse manifiestanen formade dientes de sierra, entre los valores dadosa los controlespositivo y negativo. Esta variabilidad, puede ser debida a las
distintas formas de respuestade anticuerpos observadaen lavacunación, frente a esta enfermedad(Dutta y Sbipley 1975>.
Nt~ obstante, en la figura ~O3, se aprecia que hay pocadiferencia de valores en las yeguas. enús las localidadesestudiadas,apesarde estar las yeguas de Cordivilla la Real(Palencia) vacunadasde Rinoneumonitisequina. La explicación aesto, debe ser relacionadacon una respuestainmune pobre a ¡avacuna de estos animales.
loo
• En los sementales, los valores de Elisa obtenidos según las
gráficas nO6, 7, 8 y 9. manifiestan que la tercera muestra por
1* general, alcanza valores intermedios o bajos, respecto a las
otras dos muestras tesadas. Quitas esto pudiera ser comoconsecuenciaa qn tuvieran un cuadroclínico no muy manifiestoy estánen procesode recuperación.
Les sementalesde Alcala de Henares (Hadrid>, son los quetienen valoresmás elevados,ya que sus tomasde muestra fueronrealizadasen fechaspróximasa la vacunaciónde Rinoneumoflitilequina. Los sementales de las otras regiones, presentan valores
en dientes de sierra, entre los valores dados a los controles
positivo y negativo, creyendo que es por el mismo motivo que en
las yeguas.
* RespectO al suero de los animales vacunados, no hemosapreciado ninguna reacción cruzada con nuestro antígeno, a
excepción lógica de los vacunados da Rinoneumonitis equina, que
evidentemente aumentan sus valores de anticuerpos, en eldesarrollo de las mismas. Lo cual demuestra, que tanto elantígeno utilizado, como los métodos puestos a punto, son lo
suficientemente específicos como para no presentar reaccionescruzadas con el antígeno de Tétanos e Influenza equina.
* Por último, las CONDICIONES DEHIGIENE y HABITABILIDAD,nO han
influido en nuestro caso, ya que los locales en donde seencontraban los animales estudiados, estaban en buenascondisienes.
Ente punto es Importante, ya que una de las vías de contagiode la enfermedad, es por contacto, bien directo o ambiental.pudiendo influir en su desarrollo,
101
Tv—a vlLoRAOTOfl DE LAS TECHICAS DE TRABAJO
La puesta a punto de las técnicas de Elisa indirecto e
~5~unoblottiflq, ha sido otro de los objetivos de estetrabajo ynos ha permitido realizar el seguimientode la enfermedad,ennuestro país.
Una cosa a tener ancuenta,es el control positivo utilizadoen el estudio, ya que se obtuvo de animales que presentaban un
cuadro clínico respiratorio y nervioso, en fase aguda. Por lotanto, se podría decir que no es válido como control paraanimales, que padecierano hubieran padecido, Rinoneumoflitisequina con síndrome abortivo. No obstante, al igual que Alíen(1983>, creemos,que si hubieramosestadoanteun casode cuadroclínico abortivo,lO hubieramos detectado igualmente, ya quecompartimoscon los anteriores autores citados, la idea de quela variación existenteentre los subtipos 1 y 4, esaparentementefuncional. También, compartimos la opinión de Alíen (1983) y
Studdret (1984>, de que el virus productorde todos los cuadrosclínicos es el mismo, pero, dependiendode donde evolucione,presentará un cuadro clínico diferente.
* La técnica de ELISA flWTkECTO, la evaluamosrespecto a laseroneutralitaclóui, que es la técnica de referencia utilizada en
la actualidad para el diagnóstico de esta enfermedad. Laseroneutralización, es una técnica de facil manejo, pero deprocesamiento muy largo y no de muy alta sensibilidad, ya que
nos valora solamentela aparición de anticuerposneutralizantes<Vulcano y col 1988). No obstante, debido a la cinética deaparición de los anticuerposneutralizantes, algo tardía en estaenfermedad, normalmente es necesario realizar pruebas deseroconversión,para ser mucho más objetivo a la hora de valorar
un análisis.
La técnica del Elisa indirecto es más sensible y rápida quela seroneutralización (Vulcano y col. 1958>, pero quizás la
especificidad de Elisa esté ligada al nodo de preparar el.
102
antígeno (Seula y col. 1982>, aunqueen nuestro caso, no hemosencontradorecciones cruzadas contra la vacuna de Tétanos eini luenza.
No podemosdiferenciar por Elisa, los anticuerposvacunales,de los producidos por la enfermedad, ya que la vacuna utilizadase realiza con vtrus vivo atenuado.Así, valores superiores al
control del positivo, tendríamos que ver si el animal está o novacunado de Rinoneumonitis equina, y si está, cuando se realizó.
En esteultimo case, es oportuno repetir la prueba con 25 díasde intsrnlo.
El amplio abanico de valores obtenidos en los resultados,todos comprendidosen el rango marcado por los valores delcontrol negativo y positivo, son debidos, a las diversassituaciones que el animal se ha encontrado a lo largo de su vida,entre las que se encuentran, lugares de estancia, proximidad a
animalesafectadospor la enfermedad o vacunados y condiciones
de higiene y habitabilidad.
* 51 TMl(flOELOflING, presenta la gran ventaja de su altaespecificidad, al definirnos de una manera clara la situación delas proteínas inmunoreactivas, así como de localizar sus pesos
moleculares, para poderlos comparar con otras proteínasde pesos
moleculares conocidos.
En maestro trabajo besos distingudo 12 proteínas antiqénicas
del EUV—l, las cuales tienen pesos moleculares parecidos a los
descritos por Shlmizu y col.(1989>, aunque este autor hace&lmsión solanenta a .11 proteínas antigénicas, dejando la
pasibilidad que hubiera alguna más.
Minales vacunados con la misma vacuna de Rinoneumonitis
equina en Diciembre de 1985, presentan dos proteínasimmu*wrsactivas más (18,8 1<4 y 23 lCd), que los vacunados en
flvi,abre de 1988. Esto nos hace pensar, que esas dos proteínasantiglalcas, son ee las primerasen ser bloqueadaspor el sistema
103
inmune,
sin embargo la diferencia que apreciamos entre las proteimasde inmunoreacción de un animal enfermo y un animal vacunado, se
encuentraen la aparición en el enfermode las proteínascuyospesos moleculares son: ll,SKd, 14,SICd, 33Kd y aveces la de 230¡cd.
Estas proteínas, son unas excelentes candidatas, como indicativas
para dar un diagnóstico, diferenciando vacunación de enfermedad,
aunque un mayor numero de pruebasse deberían realizar, parapoder comprobarestehecho.
Todas las proteínas inmunoreactivas,son de aparición tardíaen la infección, siendo la primera de ellas, la de 23OKd a las
12 horas post—infección (h.p.i.>, la de 53Xd a las 20 h.p.i. ylas de il,8K~i y 14,8Kd a las 28 h.p.i..
En los animales que no padecen cuadro clínico, pero tienenanticuerpos frente al virus, aparecen menos proteínas
inaunoreactivasqueen los vacunados• Otra de las diferenciasquehemos visto, son las proteínas iiuáunoteactivasque no aparecenen los animales sin cuadro clínico y si en los animalesvacunados, Estas son las de pesos moleculares de l8,ECd y 79,53<4.
El Zmmunoblotting, es una excelente técnica para estudiar loscasos dudosos que por la técnica Elisa puedan surjir, ya que dada
su enorme especifIcidad resuelve las dudas. No es sin embargo una
técnica recomendada para utilizarla a gran escala, debido a loengorroso de su elaboración, aunque no complicado. Por esoparael estudio de grandespoblaciones,recomendamoslas técnicas deprocesamientorápido y sensibles, como es el Elisa, quedando el
Immunoblotting para casos de comprobación dudosa, como se ha
recomendadoo para el estudio de pocosanimales.
Es también importante destacar que el suero control positivoutilizado en este trabajo, procedede animalescon enfermedadaguda, presentandovalores por encima de los valores positivos
medios, obtenidos en nuestro estudio serológico, ya que lospositivos encontrados por Elisa indirecto e Imsunoblettinq.
104
procedan de anisales asintosáticos. Quino, para realizarestudios serológicos masivos, y ante la experiencia de estetrabajo, seria recomendableincorporar como control positivo,valores de estos últimos animales, ya que se daría, una imagenmás real de la situación epizootioloqia.
Finalmente resaltar que en el estudio realizado, hemos podido
conprobar que la incidencia de la enfermedad en su manifeetaci¿n
clínica, es practicaisente inexistente, no así ocurre en su forma
serológica, ya que en anisales adultos es bastante manifiesta,
entontrandonos un gran número de animales, seropositivos por
Elisa indirecto e Imzunoblotting.
Ante estos resultados, seria recomendable hacer controles
periódicos de estos animales, por ser posibles fuentes de
infección y transmisiónde la enfermedad,ya que la falta de estacontrol, pueda llevar a la aparición exporádicamenteen nuestropaís de algún caso, con las consiguientespórdidas económicasysanitArias. Por eso. recomendamosrealizar campaft.sde vacunaciónen les animales de mayor riesgo, como son los animales jóvenes
y yeguas, puesto que hemos comprobado que la mayoría de lapoblaoión equina española, está sin vacunar.
los
Y - CORCLU8XOIIU
106
1, No se han encontrado diferencias significativas, respecto al
clima, sexo, rata y habitabilidad, en cuanto a la distribuciónserológica y/o clínica de la Rinoneumonitis equina en España.
2. Respecto a la edad, se ha observado que los animales adultos
no vacunados de Rinoneumonitis equina, presentan anticuerposespecíficos frenta al ElfV—l, detectados por las distintas
técnicas empleadas en el estudio ( SN., ELISA INDIRECTO e
II4IIJNOBWTTING)
3. Se ha puesto a punto, la técnica de Elisa indirecto, para la
detección de anticuerpos de Rinoneumonitis equina, presentando
unos resultados de sensibilidad y especificidad con relación a
la Saroneutralización del 100% y 97,9%, respectivamente.
4. Se ha puesto a punto, la técnica de Iwmunoblotting, para ladetección de anticuerpos de Rinoneumonitis equina, presentando
unos indices de sensibilidad y especificidad, comparables a los
obtenidos por El¿n indirecto,
5. En el Imsunoblotting, las proteínas de peso molecular de
11.8 lCd, 14,8 lCd y 33 lCd, se presentan como las más
representativas, para establecer un diagnóstico de Rinoneumonitis
equina por estemétodo.
6. El estudio serolóqico realizado, demuestra que laseropositividadfrente al virus EHV—l en animalesno vacunados,está muy extendida en nuestro país.
107
VI — DIBLIOGRAPIL
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