ACTUALIZACIÓN

TÉCNICOS ESPECIALISTAS DE LABORATORIO

DEL SERVICIO CANARIO DE SALUD

TEMARIO

VOLUMEN I

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Tema 1

Epidemiología y método epidemiológico. Epidemiología de las enfermedades transmisibles. Infección nosocomial:

barreras higiénicas. Consecuencias de las infecciones nosocomiales. Gestión de residuos sanitarios: clasifica-

ción, transporte, eliminación y tratamiento

Se actualiza los datos del apartado 3.

3. Infecciones nosocomiales

La historia de las infecciones nosocomiales (hospitalarias) es tan antigua como la del hospital; existen infecciones hospitalarias desde el momento en que se agrupan los enfermos para su cuidado. Las infecciones nosocomiales son un importante problema de Salud Pública ya que producen una morbilidad y mortalidad destacadas, dando lu-gar a elevados costes sociales y económicos. Se estima que en nuestro medio, del 6 al 10% (prevalencia media del 6,78% en el año �006) de los enfermos ingresados en un hospital de agudos adquieren una infección nosocomial. La estimación de la mortali-dad podría situar el problema dentro de las diez primeras causas de muerte, lo que ha hecho que el conocimiento de las tasas de infección se considere necesario para las estadísticas vitales.

Por lo que respecta a los costes, la prolongación de las estancias se ha estimado en 5-7 días, lo que, unido a los costes indirectos, permite intuir la magnitud real del problema.

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Tema 2

Asepsia y esterilización. Concepto de sepsis, antisepsia, esterilización y desinfección. Manejo de materiales estériles. Riesgo en el uso de sustancias químicas.

Efectos tóxicos de los disolventes orgánicos

Se actualiza el apartado 3.1. añdiendo las siguientes tablas:

Fases de un ciclo en autoclave de prevacío

■ Es la fase de extracción de aire de la cámara y de lospaquetes, al tiempo que se va calentando al material. Seproduce mediante inyecciones de vapor (prevacío fraccio-nado) a una presión inferior a la correspondiente a la pre-sión de esterilización y se procede a la extracción median-te un eyector o bomba de vacío. Para una eliminación efi-caz del aire se necesitan como mínimo 4 pulsos de vapor.

■ Es el tiempo real de esterilización. Comienza tras la faseanterior, cuando el vapor continúa entrando en la cámaray sigue aumentando la presión hasta que alcanza lacorrespondiente a la temperatura de esterilización, mante-niéndose el tiempo necesario para eliminar incluso las for-mas de los microorganismos más resistentes (esporas deB. Stearothermophilus). En la esterilización sanitaria seañade un tiempo de seguridad.

■ Extracción del vapor por vacío que aún pueda quedar enel interior de la cámara a través del drenaje. Se produceuna caída de presión, quedando la cámara en presiónnegativa.

■ Al efecto del calor de las paredes de la cámara se une elefecto de revaporización por vacío que permite que se eli-mine el condensado del material. Posteriormente se igua-lan las presiones con aire filtrado estéril hasta alcanzar lapresión atmosférica para que pueda abrirse la puerta.

1º ACONDICIONAMIENTO DE LA CARGA

2º MESETA DEESTERILIZACIÓN

3º DESVAPORIZACIÓN

4º SECADO

Fuente: Guía para la gestión del proceso de esterilización. Comisión INOZ. Edición Febrero 2004

Ventajas y limitacionesVENTAJAS LIMITACIONES

• Compatible con la mayoría del material. • No útil para material termosensible.• Especial para material termorresistente. • Deteriora filos cortantes.• Rapidez del proceso. • Corroe el material.• Eficaz por el gran poder de penetración del vapor. • No penetra en aceite, polvo.• Bajo coste.• Controlable.• Fácil monitorización.• Respeta el medio ambiente.• Atóxico.

Fuente: Guía para la gestión del proceso de esterilización. Comisión INOZ. Edición Febrero 2004

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Tema 3

Papel del Técnico Especialista en los programas de calidad total para Servicios de Laboratorio. Evaluación

de estructura, proceso y resultado. Control de calidad de las instalaciones en laboratorios.

Se actualiza el apartado 3.5.:

3.5. Procedimientos normalizados y exigencias de la acreditación de los laboratorios

Los sistemas de calidad se implantan utilizando normas de calidad. Las normas de calidad de los laboratorios se encaminan a la certificación o a la acreditación.

La ISO en un documento normativo sobre normalización, da las definiciones si-guientes:

– Acreditación: procedimiento mediante el cual un organismo autorizado da reco-nocimiento formal que una organización o individuo es competente para llevar a término tareas específicas. El “organismo autorizado” al que hace referencia la definición, en nuestro país, es la Entidad Nacional de Acreditación (ENAC).

– Certificación: procedimiento mediante el cual una tercera parte da una garantía escrita de que un producto, proceso o servicio es conforme con unos requisitos especificados, es decir, cumple los requisitos de una norma de gestión de calidad. La “tercera parte” a la que se refiere la segunda definición es cualquiera de los organismos de certificación existentes, Asociación Española de Normalización y Certificación (AENOR), Laboratorio General d’Assaigs i Investigacions (LGAI), etc.

El contenido de las normas es también distinto:– La norma de certificación ISO 9000, describe de un modo general los requi-

sitos de un sistema de gestión de calidad para que pueda ser utilizado por cualquier tipo de empresa.

– La norma de acreditación ISO 15189, está totalmente enfocada a los requisitos específicos que debe cumplir el laboratorio, incluidos los de gestión de cali-dad, para demostrar su competencia técnica.

Dada la complejidad, el costo y la sobrecarga de trabajo que supone la introduc-ción del sistema de calidad en el laboratorio clínico, es conveniente la gradual implan-tación del mismo, manteniendo un adecuado equilibrio entre recursos y actividad.

Para ello se considera adecuado seguir el ciclo Deming, o ciclo PECA que permite lograr una mejora continua:

P - Planificar: elaborar los cambios basándose en datos actuales.E - Ejecutar: realizar el cambio.C - Controlar: evaluar los efectos y corregir los resultados.A - Actuar: estudiar los resultados, confirmar los cambios y experimentar de nuevo.

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3.5.1. Diferencias entre los procesos de certificación y de acreditación del laboratorio clínico

a) Para certificar al laboratorio clínico según la norma UNE-EN ISO 9001:�000, el equipo auditor está formado por auditores con experiencia en la evaluación de sistemas de gestión de la calidad. Los auditores han de tener la experiencia que les permita aplicar los requisitos genéricos de la norma al funcionamiento del laboratorio clínico, pero su objetivo principal es verificar el cumplimiento de los requisitos del sistema de gestión de la calidad.

b) En el caso de la acreditación, como la finalidad es reconocer la competencia técnica, el equipo auditor verificará el cumplimiento de los requisitos de la norma UNE-EN ISO 15189:�00� relacionados con el sistema de gestión de la calidad, pero los auditores verificarán principalmente la competencia técnica del personal y la disponibilidad de todos los recursos técnicos necesarios para producir datos y resultados fidedignos con los métodos especificados.

c) Otra diferencia, ya destacada en el apartado de las definiciones, es que la cer-tificación la pueden dar diversos organismos de certificación, mientras que la acreditación sólo la puede otorgar la ENAC.

3.5.2. ENAC (Entidad Nacional de Acreditación)

La Entidad Nacional de Acreditación es el organismo designado por la Adminis-tración para establecer y mantener el sistema de acreditación a nivel nacional, de acuerdo a normas internacionales, siguiendo en todo momento las políticas y reco-mendaciones establecidas por la Unión Europea.

La Acreditación es la herramienta establecida a escala internacional para generar la confianza necesaria en la actuación de tales agentes, proporcionando un valor aña-dido a las empresas usuarias de los servicios de evaluación de la conformidad, a las administraciones y al consumidor final.

Las acreditaciones de ENAC son reconocidas y utilizadas tanto por la Adminis-tración Central como por la Autonómica en sus respectivos ámbitos de competen-cia, en sectores tales como el industrial, agroalimentario, medioambiente, defensa, construcción, sanidad, telecomunicaciones, metrología, etc.

ENAC tiene como misión generar confianza en el mercado y en la sociedad en general en relación con la competencia técnica de los evaluadores de la conformi-dad acreditados, contribuyendo así a la seguridad y el bienestar de las personas, la calidad de los productos y servicios y la protección del medioambiente, y con ello al aumento de la competitividad de los productos y servicios españoles y a una dismi-nución de los costes para la sociedad debidos a estas actividades.

3.5.2.1. Principios rectores de ENAC

a) Útil a todas las partes interesadas: su servicio debe aportar valor a todas las partes interesadas, que tienen expectativas y necesidades diferentes y, en ocasiones, contrapuestas.

b) Carácter no comercial: debe actuar únicamente por razones técnicas evitando tomar decisiones por motivos comerciales.

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c) Valor añadido para la sociedad: todos los esquemas de evaluación de la con-formidad acreditados por ENAC deben añadir valor al cliente o al usuario final

d) Independencia del mercado: debe garantizar de manera estricta la indepen-dencia, evitando:

e) Carácter reactivo: la acreditación debe ser contemplada como un instrumen-to, debe aportar soluciones, no generar necesidades.

3.5.3. La acreditación conforme a la UNE-EN ISO 15189

En septiembre de �007, se aprobó la norma UNE-EN ISO 15189:�007. Esta norma anula y sustituye la misma norma de �00� y se establece un periodo de transición de � años, desde su aprobación, por lo cual todos los certificados serán actualizados antes de abril de �009.

ENAC evalúa la competencia de laboratorios clínicos comprobando el cumpli-miento de los requisitos establecidos en la norma UNE-EN ISO 15189:�007.

Requisitos particulares relativos a la “calidad y competencia”.

La UNE-EN ISO 15189 da respuesta a la demanda de los laboratorios del sector sanitario, que demandaban la existencia de una norma específica que se ajustara mejor a las particularidades del sector sanitario y que se utilizara como base para el reconocimiento de su competencia técnica.

La Norma UNE-EN ISO 15189 desarrolla los criterios de acreditación en dos gran-des apartados:

– Requisitos de gestión.

– Requisitos técnicos.

En los apartados técnicos se incluyen criterios en: fase analítica, fase preanalítica, fase postanalítica.

Al tratarse de una norma dirigida a un sector específico, establece los requisitos de forma concreta lo que facilita a los laboratorios su implantación.

3.5.3.1. Cómo acceder a la acreditación de laboratorios clínicos

a) El proceso se inicia con la solicitud de la acreditación por parte del laboratorio.

b) Esta documentación es analizada por los técnicos de ENAC y, si es completa y adecuada, se designa un equipo auditor que previamente ha sido cualificado conforme a los requisitos de ENAC.

c) El equipo auditor incluye facultativos expertos en los análisis realizados por el laboratorio solicitante y éste puede recusar a los miembros del equipo si, a su juicio, existiese un conflicto de intereses no detectado previamente.

d) El equipo auditor evalúa que el laboratorio solicitante cumple los criterios de acreditación.

e) El proceso de evaluación incluye un estudio de la documentación técnica, una auditoría, y la observación de la realización de los análisis para los que se soli-cita la acreditación.

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f) Los resultados de dicha evaluación se recogen en un informe que se envía al solicitante, donde se detalla cualquier posible desviación detectada respecto a los requisitos de acreditación.

g) El solicitante debe contestar con las acciones correctoras que considere perti-nentes.

h) Con el informe de evaluación, y a la vista de estas acciones correctoras, la Co-misión de Acreditación toma una decisión que oportunamente es comunicada al solicitante.

i) Si es positiva se emite el correspondiente certificado de acreditación; en caso contrario, se aplaza la decisión hasta que se verifique la resolución de las des-viaciones.

j) Periódicamente se realizan visitas de seguimiento para verificar que el laboratorio continúa cumpliendo los requisitos de acreditación y cada cuatro/cinco años se reevalúa la competencia del laboratorio mediante una auditoría similar a la inicial.

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Tema 8

Sangre: composición y fisiología. Fisiología y metabolismo eritrocitario: recuento hematíes,

anormalidades morfológicas eritrocitarias, metabolismo del hierro y la hemoglobina. Patologías del sistema

eritrocitario: alteraciones cuantitativas y cualitativas, pruebas analíticas para el diagnóstico y seguimiento de

estas patologías

Se actualizan los siguientes apartados:

– Apartado 1.3.; se añade lo siguiente:

1.3. Propiedades físicas de la sangre

1.3.1. Volumen

Para la determinación de los volúmenes corporales de plasma y eritrocitos se usaban antes los trazadores coloreados como el azul de Evans, aunque en la actuali-dad estos métodos han sido sustituidos por isótopos y estudios estandarizados por la ICSH (Comité Internacional de Estandarización en Hematología).

1.3.1.1. Determinación de la citemia mediante eritrocitos marcados con Cr51

El método para marcar los eritrocitos es el que sigue:1. Realizar una extracción de 10 ml de sangre periférica y tratarlos con 1,5 ml de

solución ACD-A.�. Centrifugar durante 5 minutos a 1.000 g.�. Retirar el sobrenadante, si la muestra presenta valores de plaquetas superio-

res a 500 x 109/L o de leucocitos superiores a �5 x 109/L, las capas correspon-dientes a estas células también deberán ser eliminadas.

�. Agitar de forma continua y suave mientras se vierte el cromato sódico (Na�51Cr�O�)

en una cantidad superior a 0,� e inferior a 7,� Mbq/kg del peso del paciente.5. Incubar durante 15 minutos a �7 ºC.6. Lavar las células son solución salina isotónica dos veces, en caso de fragilidad

osmótica de los eritrocitos usaremos una solución osmótica más concentrada.7. Resuspender las células resultantes en solución salina para lograr un volumen de

10 mL y separarla en dos jeringas que rotularemos como estándar e inyección. 8. La dosis estándar será diluida en una solución conocida de NH�OH para deter-

minar su actividad.

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Solución de ACD-A

Citrato sódico deshidratado �� g

Ácido cítrico 8 g

Dextrosa �5 g

Agua destilada 1.000 mL

La dosis de inyección será inoculada de forma endovenosa al paciente en un tiempo determinado, a los �0 minutos extraeremos una muestra sanguínea, lo ideal es que se haga del miembro contrario, si esto no es posible, de una vena diferente a la utilizada para la inyección. La muestra debe ser de 5-10 mL y usaremos como anticoagulante EDTA.

Colocaremos tres partes de la muestra estándar en tres tubos y tres de la muestra extraída al paciente, a estas últimas le añadiremos unas gotas de saponina al 0,1% para evitar la sedimentación de los eritrocitos. Usar un contador de centelleo para emisores de radiación y medir la radioactividad de las muestras.

Para calcular el resultado usaremos la siguiente fórmula:

Volumen eritrocitario = S x V x p/p

x Hvc

A 100

S: concentración radioactiva de la solución estándar.V: volumen de dilución del estándar.p/p: relación de volúmenes de dosis inyectada / dosis estándar.Hvc: hematocrito venoso corregido.A: concentración radiactiva de la sangre extraída.

1.3.1.2. Determinación de la citemia mediante eritrocitos marcados con 99mTc

Este estudio está indicado en determinaciones seriadas de la citemia y en las pruebas realizadas a niños.

La determinación es similar en muchos pasos al procedimiento con cromo, de forma básica es el que sigue:

1. Realizar una extracción de 7 ml de sangre periférica y tratarlos con 1 mL de solución ACD-A.

�. Centrifugar durante 5 minutos a 1.000 g.�. Retirar el sobrenadante.�. Añadir 0,1 mL de una solución preparada con 10 mL de suero fisiológico y el

vial de pirofosfato de estaño.5. Resuspender con suero fisiológico.6. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.7. Volver a centrifugar durante 5 minutos a 1.000 g.8. Resuspender en suero fisiológico y volver a centrifugar.

– Añadir � mL de suero fisiológico con 1,8 – �,� Mbq de Na 99mTcO�.– Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.

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9. Volver a centrifugar durante 5 minutos a 1.000 g.10. Resuspender en suero fisiológico y volver a centrifugar.

– Resuspender los eritrocitos marcados con suero fisiológico hasta lograr 5 mL.– La separación de las muestras, la inyección y la determinación posterior

son similares al proceso del cromo.

1.3.1.3. Determinación de la plasmemia

La plasmemia se determina mediante trazadores, en este caso seroalbúmina hu-mana marcada con 1�5I o 1�1I. El método para la determinación es el que sigue:

1. Realizar una extracción de �0 ml de sangre en un tubo con heparina.�. Centrifugar durante 10 minutos a 1.000 g.�. Pasar 7 mL de plasma a un tubo de ensayo y añadir �.7 KBq/kg de peso del

paciente y agitar con suavidad.�. Dejar a temperatura ambiente �0 minutos.5. Rotular dos jeringuillas como dosis estándar e inyección, al igual que en los

casos de la citemia deberán ser pesadas antes y después.6. Diluir el contenido de la dosis estándar en un volumen conocido de suero fi-

siológico y añadir una pequeña cantidad de alcohol etílico. Colocar la cantidad alícuota de la solución en tres tubos de recuento.

7. Proceder a la administración de la dosis y realizar la extracción por una vena di-ferente a los 10, �0 y �0 minutos. El anticoagulante de elección es la heparina.

8. Centrifugar para obtener el plasma y colocar partes alícuotas similares a los de la solución en tubos de recuento.

9. Proceder al recuento y determinación de los valores según la siguiente fórmula:

Volumen plasmático = actividad administrada/ actividad plasmática

Los valores de referencia se pueden dar en varias formas, aunque la más común es ofrecerlos en mL/kg y podemos ver los límites de normalidad en la tabla �.

Tabla 2. Valores de normalidad del volumen sanguíneo

Hombres Mujeres

Volemia 69 ± 10 mL/kg 65 ± 10 mL/kg

Plasmemia �9 ± 5 mL/kg �0 ± 5 mL/kg

Citemia �0 ± 5 mL/kg �5 ± 5 mL/kg

1.3.1.4. Principales alteraciones del volumen sanguíneo

Los valores de normalidad se verán alterados por cualquier situación, fisiológica o patológica, en la que se vean modificados de alguna forma los valores plasmáticos o celulares; las principales son:

– Causas de variación de la citemia:* Aumento: policitemia vera, eritrocitosis, producción excesiva de EPO.* Disminución: anemia, hemorragia aguda, postparto.

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– Causas de variación de la plasmemia:* Aumento: cirrosis hepática, embarazo, esplenomegalia, hemorragia, ICC,

mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenström, policitemia vera.* Disminución: altitud, anemia, deshidratación, edema intersticial, enferme-

dades carenciales o metabólicas, hipertensión esencial, insuficiencia circu-latoria, ortostatismo, Síndrome de Gaisböck.

1.3.2. Densidad

Podemos definir la densidad como una magnitud que se refiere a la cantidad de masa que se contiene en un volumen determinado; esta magnitud se puede usar en términos absolutos o relativos.

La densidad sanguínea varía con el número de cuerpos formes y composición del plasma. Su valor es de 105� – 1060 en hombres y de 1050 – 1056 en mujeres.

– En el apartado 1.3.3.; se añade el siguiente cuadro:

1.3.3. Viscosidad

Los valores de normalidad quedan expresados en mPa/se y los encontramos en la siguiente tabla:

Tabla 3. Valores de normalidad en la viscosidad sanguínea

Temperatura de 25 ºC Temperatura de 37 ºC

25-34 años < 1,8� <1,��

35-44 años <1,88 < 1,�6

45-75 años < 1,9� < 1,50

– Se añade este nuevo apartado:

1.4.3. Factores de crecimiento hematopoyético

El control de la hematopoyesis se lleva a cabo mediante factores bioquímicos solubles presentes en la sangre o en los lugares de formación. Estos factores suelen actuar a bajas concentraciones y son muy variables, a continuación comentamos los principales.

– Eritropoyetina (EPO): es una proteína que se sintetiza principalmente en las células intersticiales peritubulares y en las células tubulares renales, aunque existen indicios de su formación, en menor grado, en el hígado. Presenta un papel fundamental en las CFU – Eo, proeritroblastos y eritroblastos basófilos, aunque también actúa sobre otras células como los megacariocitos.

– Factor estimulante de de colonias de granulocitos / monocitos (FSC – GM): es una glucoproteína codificada en el brazo largo del cromosoma 5. Ejerce una importante misión en la proliferación y maduración de la práctica totalidad de las células sanguíneas mieloides usándose como tratamiento de las neutrope-nias en pacientes oncológicos sometidos a quimioterapia.

1�

– Factor estimulante de las colonias de granulocitos (FSC – G): es una proteína codi-ficada por el cromosoma 17, su acción principal es en los neutrófilos, siendo usada de forma terapéutica en pacientes con neutropenia. También actúa, aunque en me-nor medida, en la formación de macrófagos, blastos y células multipotenciales.

– Factor estimulante de las colonias de monocitos / macrófagos (FSC – M): tam-bién conocido como el factor estimulante de colonias 1, es una glucoproteína co-dificada en el brazo largo de cromosoma 5. Induce a la estimulación de colonias de células progenitoras con predilección por la maduración de los macrófagos.

– Interleucina 1 (IL – 1): es una proteína codificada por varios genes del cromo-soma �. Interviene en las reacciones inflamatorias, siendo producida por la ma-yoría de las células. A nivel hematopoyético presenta un efecto directo sobre las células madres hematopoyéticamente inmaduras, aumentando la prolifera-ción de células formadoras de colonias de alto potencial y activando otras IL.

– Interleucina 2 (IL – 2): es un producto codificado por el brazo largo del cromo-soma �. Estimula el crecimiento de los linfocitos T, B y NK; a su vez inhibe el crecimiento de colonias de granulocitos y macrófagos y la eritropoyesis.

– Interleucina 3 (IL – 3): es una proteína codificada por el cromosoma 5, siendo un factor estimulante de las colonias multipotenciales. Se produce por las cé-lulas T, células endoteliales, fibroblastos, mastocitos y macrófagos.

– Interleucina 4 (IL – 4): conocida también como factor estimulador de células B, factor de diferenciación de células B y factor de inducción de IgG, es una pro-teína que se produce por las células T y los mastocitos.

– Interleucina 5 (IL – 5): se la conoce también como factor reemplazador de lintocitos T, factor � de crecimiento de células B y factor de la diferenciación de eosinófilos. Se codifica en el brazo largo del cromosoma 5 y es producida por los LT activados.

– Interleucina 6 (IL – 6): conocido anteriormente como interferón B� se codifica en el brazo corto del cromosoma 7. Se produce por diferentes células y ejerce su acción en sinergia con otros factores, presentando un efecto proliferativo directo en las células hematopoyéticas.

– Interleucina 7(IL – 7): conocido como linfopoyetina 1, es una proteína sintetizada por las células del estroma de la médula. Estimula la producción de pre – B y pre – T.

– Interleucina 8 (IL – 8): es una proteína formada por células T activadas, macró-fagos, monocitos y fibroblastos. Al igual que la IL1 interviene en procesos infla-matorios y es un factor quimiotáctico para neutrófilos, monocitos y células T.

– Interleucina 9 (IL – 9): conocida como factor de crecimiento de células T de ratón, es una glucoproteína codificada en el cromosoma 5. Actúa activando a los mastocitos y como factor de crecimiento de las células T.

– Interleucina 10 (IL – 10): se produce por los mastocitos y las células T, intervie-ne en varios procesos como la inhibición de la activación de los macrófagos o la estimulación de mastocitos y timocitos.

– Interleucina 11 (IL – 11): es una glucoproteína que se codifica en el brazo largo del cromosoma 19, estimula a las células B, mastocitos y megacariocitos.

– Interleucina 12 (IL – 12): es una glucoproteína que se codifica en el brazo largo del cromosoma 5 y se produce por las células B. Es un factor estimulador de las NK y células T.

1�

– Interleucina 13 (IL – 13): es una proteína codificada por el brazo largo del cromosoma 1� y producida por las células T activadas. Inhibe la formación de citocinas y estimula las células B.

– Interleucina 14 (IL – 14): conocida también como factor de crecimiento de células B de alto peso molecular, es una proteína producida por células T y por algunas neoplasias de células B. Induce a la formación de células B y a expansión de algunas subpoblaciones de células B, también inhibe la formación de inmunoglobulinas.

– Interleucina 15 (IL – 15): presenta similitud en la actividad biológica con la IL – �, estimula la proliferación de células T, NK y mastocitos.

– Interleucina 16 (IL – 16): es un péptido codificado en el cromosoma 15 y sinte-tizado por células epiteliales, mastocitos, algunos tipos de células T y eosinó-filos. Actúa como factor quimiotáctico para TCD� + eosinófilos y monocitos, además de factor estimulante de crecimiento.

– Interleucina 17 (IL – 17): conocida también como antígeno 8 asociado a los linfocitos T citotóxicos, es una glucoproteína producida por las células TCD�+. Estimula la granulopoyesis e induce a la activación de otras IL.

– Interleucina 18 (IL – 18): conocida también como factor inductor de interferón , está codificada por el cromosoma 11 y presenta una actividad similar a la IL�.

– Ligando Kit: conocido como factor de la célula madre, se codifica por el cromoso-ma 1� y estimula el crecimiento, adhesión y viabilidad de las células progenitoras.

– Ligando FLT-3: estimula las células precursoras primitivas.– Trombopoyetina: regulador principal de la proliferación y diferenciación de los me-

gacariocitos. Promueve la eritropoyesis de forma sinérgica con la eritropoyetina.

– Añadir el siguiente párrafo detrás de la tabla del apartado 2.5. del tema.

Existen otros sistemas que utilizan directamente el tubo de extracción y así se evitan manipulaciones intermedias. En lugar de sangre citratada suelen usar sangre tratada con EDTA como anticoagulante.

– Se añade un nuevo apartado 2.6.

2.6. Valores de la VSG

Los resultados pueden darse en mm/hora o podemos dar el índice de Katz, que se consigue por la siguiente fórmula:

Índice de Katz = A + B/2

2

A: valor de la velocidad de sedimentación en la 1.ª hora.B: valor de la velocidad de sedimentación en la �.ª hora.

1�

Los valores de normalidad quedan reflejados en la siguiente tabla:

Edad Límite superior de normalidad en mm/h

Niños 0-15 15

Hombres

17-50 10

51-60 1�

61-70 1�

Mujeres

17-50 1�

51-60 19

61-70 �0

– Se añade este párrafo al principio del apartado 3:

3. Índices hemáticos

Los índices hematológicos son de utilidad por cuanto dan información sobre cier-tos caracteres de los eritrocitos, especialmente en el diagnóstico de casos de ane-mia. Para poder calcular los índices hematológicos, se requieren tres datos básicos: contenido hemoglobínico, recuento eritrocitario y hematocrito.

– Se actualiza el apartado 3.1.1.:

3.1.1. Determinación del hematocrito por centrifugación

3.1.1.1. Micrométodo

Es el método más utilizado, siendo el recomendado por el ICSH (International Committee for Standardization in Haematology) y el NCCLS (National Committee for Clinical and Laboratory Standards).

Este método utiliza capilares de vidrio de 1 mm de diámetro y un espesor de pared de 0,18-0,�� mm y 7-7,5 cm de longitud; estos tubos pueden estar anticoa-gulados con heparina a una concentración de � UI en su pared interna o no, y para diferenciarlos, los que tengan este anticoagulante presentarán una franja de color rojo. La técnica es la que sigue:

1. Realizar la extracción de 50 μ de sangre total con EDTA-K� como anticoagulante.

�. Llenar dos tubos hasta las �/� partes por capilaridad.

15

�. Limpiar el exterior de los tubos y sellar el extremo por el que ha entrado la sangre con plastilina.

�. Centrifugar a 10.000 – 15.000 rpm durante 5 minutos y a una temperatura infe-rior a �0 ºC.

5. Leer el resultado.

Para leer el resultado podemos utilizar una simple regla calibrada y hacer una regla de tres, o utilizar un lector de microhematocrito.

E

T

Tubo demicrohematocrito

Reglagraduadaen mm

Plasma

Eritrocitos

Tapón deplastilina

Si T 100%E HCT

HCT E x 100=T

Forma de calcular el valor hematocritomediante una regla milimetrada

Forma de calcular el valor hematocrito mediante una regla milimetrada

Para conocer el resultado con el lector, deberemos colocar el capilar en la ranura con la columna de hematíes hacia el punto rojo y haremos girar el disco central hasta que la línea más alejada del punto rojo coincida con el final de la columna de plasma y la más cercana al punto rojo con el inicio de la columna de eritrocitos. En ese mo-mento miraremos la escala inferior para determinar el valor.

Eritrocitos

Punto rojo

Plastilina

HCT

Interfase

Plasma

35 45 40

Si los resultados obtenidos en ambos tubos presentan una diferencia inferior a un �%, se realizará la media entre ambos y este será el resultado que se mandará como bueno. Si, por el contrario, la diferencia es mayor, deberemos centrifugar 5 minutos más y volver a realizar la lectura.

Si el valor obtenido es superior al 50% deberemos realizar de nuevo toda la de-terminación antes de enviar el resultado.

16

3.1.1.2. Macrométodo

En este caso emplearemos tubos de Wintrobe con un diámetro interno de � mm y una longitud de 110 mm. Estos tubos se encuentran graduados del 0 a 10 mm. La técnica es la que sigue:

1. Realizar la extracción de 0,6 mL de sangre total con EDTAK� como an-ticoagulante.

�. Llenar el tubo hasta la marca 10 evitando la formación de burbujas.

�. Centrifugar a �.000 – �.�00 rpm durante �0 minutos y a una temperatura inferior a �0 ºC.

�. Realizar una simple regla de tres para leer el resultado.

Esta determinación quedó en desuso por el tiempo necesario para su reali-zación y la falta de higiene que implica que los tubos no fueran desechables. 1

4

5

6

7

8

9

2

3

10

1

2

3

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5

6

7

8

9

0

– Se actualizan los apartados 3.2.; 3.3. y 3.4.:

3.2. Concentración corpuscular media de hemoglobina (CCMH)

La concentración corpuscular media de hemoglobina es un cálculo de la con-centración de hemoglobina dentro de los eritrocitos. Valores disminuidos de la CCMH (hipocromía) pueden observarse en condiciones donde la hemoglobina está anormalmente diluida dentro de los eritrocitos, como, por ejemplo, en la anemia ferropénica (por deficiencia de hierro) y en las talasemias. Por el contrario, valores aumentados de CCMH (hipercromía) pueden observarse en condiciones donde la hemoglobina está anormalmente concentrada dentro de los hematíes, como por ejemplo en la esferocitosis hereditaria.

Se obtiene mediante la fórmula que relaciona la hemoglobina con el hematocrito y se expresa en g/L:

HemoglobinaHematocrito

= g/dl

3.3. Hemoglobina corpuscular media (HCM)

Valor indicativo del contenido medio de hemoglobina por cada eritrocito. Se calcu-la a partir de la concentración de hemoglobina y la de eritrocitos; se expresa en pg:

HCMhemoglobina (g / L)

eritrocitos (×10 / L) 12=

17

3.4. Volumen corpuscular medio (VCM)

Expresa el valor promedio del volumen de los eritrocitos. Este aumenta cuando los eritrocitos son más grandes (macrocíticos), por ejemplo, en una anemia causada por la deficiencia de vitamina B1�. Cuando disminuye el volumen corpuscular me-dio, los eritrocitos son más pequeños (microcíticos), tal como se puede observar en la anemia por deficiencia de hierro o en las talasemias. Se calcula a partir del hema-tocrito (HTO) y la concentración de eritrocitos; se expresa en fL (femtolitros).

VCMHTO (L / L)

eritrocitos (×10 / L) 12=

– Se añade el apartado 3.5.

3.5. Amplitud de la Distribución de los Eritrocitos (ADE)

Es un cálculo de la variedad en el volumen o tamaño de los eritrocitos. Indica la amplitud de la distribución de volúmenes de los eritrocitos. El aumento de este índice indica la presencia de hematíes de muy diferentes tamaños (anisocitosis). Se expresa en %. Valores de referencia: 11,7-15,�%.

EDAD CCMH (gL) HCM (pg) VCM (fL)

1 día �60 �5 105

1 semana �50 �6 10�

1 mes ��0 �0 90

6 meses ��0 �7 78

1-� años ��0 �5 78

� años ��0 �7 80

10 años ��0 �7 8�

Adultos ��5 ± �5 �9,5 ± �,5 89 ± 9

Valores de referencia de CCHM, HCM y VCM según la edad

18

– Se añaden las siguientes imágenes al apartado 4.2.1.

4.2.1. Método del portaobjetos o de la cuña

Emplearemos dos portaobjetos limpios y de-bidamente etiquetados. Sobre uno se extiende la sangre y el otro, que será algo más estrecho, rea-lizará la extensión.

1. Depositar una gota de sangre, de unos 5 μl, en un portaobjetos; la gota no debe presen-tar un tamaño superior a los � mm y debe ser colocada a unos � cm de uno de los ex-tremos (ver ilustraciones 1, � y �).

�. Colocar el segundo portaobjeto esmerilado, sujeto por el índice y el pulgar, por delante de la gota y formando un ángulo de �0 – �5 grados (ver ilustración �).

�. Se arrastra el segundo portaobjeto hacia atrás hasta que entre en contacto con la gota de sangre (ver ilustración 5).

1

2

�. Esperar hasta que la sangre se distribuya uni-formemente por capilaridad por el borde del portaobjetos; la sangre no debe llegar hasta los bordes de los mismos.

5. Deslizar el portaobjeto hacia delante suave-mente y a velocidad moderada realizando la extensión hasta 1 cm del borde distal del portaobjeto.

Frotis sanguíneo5

3

4

6. Secar la extensión durante un mínimo de �0 minutos colocando el portaobje-tos en posición horizontal y dejando a temperatura ambiente.

7. Rotular de forma debida el portaobjeto que presenta la extensión.

Uno de los principales inconvenientes que tiene este método es el traumatismo que origina sobre los leucocitos, además de la distribución irregular de los mismos; esto origina que en algunas enfermedades que cursan con linfocitosis puedan apare-cer restos celulares que se conocen como sombras de Gumprecht.

19

– Actualizamos el apartado 4.4.1.:

4.4.1. Giemsa

Esta tinción se utiliza para la tinción de frotis sanguíneos y de médula ósea. Usare-mos como colorante una mezcla de los anteriores consistente en: Azul de metileno, Azur B y Eosina, que denominamos Giemsa.

Para realizar el colorante (solución madre):– Unir 1 g de polvo de Giemsa con 66 mL de glicerina pura y calentar durante �

horas a 56 ºC.– Añadir 66 mL de alcohol metílico absoluto y dejar durante �-� días a tempera-

tura ambiente.– Filtrar antes de emplearlo.En la actualidad podemos encontrar este reactivo ya preparado, aunque habrá

que desecharlo si presenta precipitados. Esta solución es altamente inflamable y presenta toxicidad en su inhalación, ingestión y en contacto con la piel.

Realizaremos la tinción de la siguiente forma:– Fijar el frotis con metanol y esperar � minutos (si la extensión es de médula

ósea deberá esperarse 15 minutos).– Sumergir en una solución de Giemsa, 10% de colorante Giemsa y 90% de

tampón PBS, pH 6,8, durante 10 minutos.– Lavar con agua destilada y dejar secar al aire libre.– Observar al microscopio.Aunque se pueden observar ligeras diferencias, podremos observar las siguien-

tes estructuras teñidas:– Núcleos: tonalidades púrpuras.– Citoplasma: tonalidades que irán de azul a rosa claro.– Gránulos: tonalidades que irán de rojizos a lila.– Eosinófilos: mostrarán gránulos naranjas brillantes en su citoplasma.– Basófilos: mostrarán gránulos azul oscuro en su citoplasma.– Eritrocito: tonalidades de rosa a naranja.

– Actualizamos el apartado 4.4.4.:

4.4.4. Wright

Presenta características similares a la tinción de May-Grünwald-Giemsa. El colo-rante se prepara de la siguiente forma:

1. Unir 1 g de polvo de Wright con 600 ml de alcohol metílico absoluto.

�. Calentar la mezcla a 56 ºC y remover suavemente hasta su completa disolución.

�. Dejar enfriar la mezcla.

�. Filtrar y guardar evitando el contacto con las acetonas y ácidos en general.

�0

La técnica es la que sigue:1. Sumergir el frotis en el colorante durante 1 minuto.�. Diluir el colorante con agua destilada o PBS al �0-70% y dejar 10 minutos.�. Lavar con agua destilada y secar.�. Observar al microscopio.Si la extensión está realizada de forma correcta podremos observar:– Eritrocitos: rojo-amarillentos.– Basófilos: gránulos de color azul oscuro y cromatina de color púrpura claro.– Eosinófilos: gránulos de color rojo brillante, citoplasma de color azul pálido y

cromatina de color púrpura oscuro.– Neutrófilos: gránulos de color lila, citoplasma de color rosa pálido y cromatina

de color púrpura oscuro.– Linfocitos: citoplasma de color azul cielo y cromatina de color púrpura oscuro.– Monocito: gránulos de color lila, citoplasma de color azul grisáceo y cromati-

na de color púrpura medio.– Plaquetas: hialómero de color azul claro y centrómero de color violeta o púrpura.

- Añadimos un nuevo apartado 4.4.5.

4.4.5. Tinción de Romanowsky normalizada por el ICSH

El ICSH (International Committee for Standardization in Haematology) recomien-da el empleo de un método de referencia para la tinción de un frotis basado en el empleo de soluciones puras de azur B y eosina Y.

Preparación de las diferentes soluciones:

1. Solución madre:

– Calentar �00 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) a �7 ºC, añadir � g de azur B puro y agitar vigorosamente hasta su disolución.

– Disolver 1 g de eosina Y en �50 mL de DMSO.

– Mezclar lentamente ambas disoluciones y usar un agitador magnético hasta su completa disolución.

– Conservar alejada de la luz y a temperatura ambiente.

2. Solución fijadora:

Se prepara mezclando un volumen de la solución madre con 1� de metanol.

3. Solución amortiguadora HEPES; pH 6,6:

– Disolver en 1 L de agua destilada �,�8 g de HEPES.

– Ajustar el pH a 6,6 mediante NaOH 1 mol/L.

– Añadir 50 mL de DMSO.

�1

4. Solución colorante:– Mezclar 1 volumen de la solución madre con 1� de la solución amortigua-

dora de HEPES; debe ser preparada inmediatamente antes de su uso.5. Solución amortiguadora de fosfato:

– Mezclar 7,8 mL de Na�HPO� con 9�,� mL de KH�PO�. Técnica para la tinción:

– Fijar la extensión durante � minutos en solución fijadora.– Aplicar la solución colorante durante 10 minutos.– Reemplazar la solución colorante por solución amortiguadora de fosfato y

esperar 1 minuto.– Lavar con abundante agua y secar.

– El apartado 4.4.5. pasa a ser 4.4.6. y actualizamos el contenido:

4.4.6. Gota gruesa

Se utiliza principalmente para reconocer los parásitos del paludismo en la sangre del paciente, siempre que no haya sido identificado en las extensiones normales. Consiste en concentrar una pequeña muestra de sangre con el objetivo de aglutinar la mayor cantidad de eritrocitos.

Técnica: 1. Colocar en un porta una gota gruesa de sangre.�. Imprimir movimientos circulares durante 10 minutos para desfibrinarla.�. Dejar secar �� horas a temperatura ambiente.�. Sumergir en solución de Giemsa y PBS, pH 6,8 durante �5 minutos.5. Lavar con agua destilada, preferentemente por inmersión para evitar perder el

espécimen por la falta de fijación y observar.El proceso de la tinción sin una fijación previa originará la lisis de los eritrocitos,

pudiendo observar parásitos fuera de estos.

– El apartados 4.4.6. pasa a ser 4.4.7 y actualizamos el contenido:

4.4.7. Leishman

El tinte se prepara uniendo 0,15 g de polvo de Leishman con 100 mL de metanol, uniéndolo después a la solución amortiguadora (buffer). La tinción se realiza de la siguiente forma:

1. Fijar los frotis con tinte de Leishman no diluido durante � minutos.

�. Diluir con buffer fosfato, en una proporción de �:1 y dejar durante 9 minutos.

�. Lavar con agua destilada y dejar secar.

�. Observar al microscopio.

��

Si la tinción ha sido realizada de forma correcta, podremos observar los siguien-tes resultados:

– Núcleo: rojo – violeta.

– Linfocitos: plasma azul.

– Monocitos: plasma azul grisáceo.

– Neutrófilos: gránulos violeta claro.

– Eosinófilos: gránulos rojos ladrillo.

– Basófilos: gránulos violeta oscuro.

– Trombocitos: violeta.

– Eritrocitos: rojizo.

– El apartado 4.4.7. pasa a ser 4.4.8. y el contenido es el mismo

4.4.8. Sudán negro

– El apartado 4.4.8. pasa a ser 4.4.9. y actualizamos el contenido:

4.4.9. Reacción de PAS (Periodic Acid-Schiff)

En la tinción PAS se trata el material con ácido peryódico, que oxida los 1,�-glico-les formándose grupos aldehído. Con el reactivo de Schiff, los aldehídos reaccionan dando un color rojo luminoso. La utilidad de este tipo de tinción se basa en el diag-nóstico diferencial de leucemias linfoblásticas, eritroleucemias y mielodisplasia.

Disolver 5 g de cristales de ácido peryódico en 500 ml de agua destilada en un recipiente de cristal oscuro.

Disolver 5 g de fucsina básica en 500 ml de agua destilada caliente, no filtrar hasta que la solución esté fría. Hacer burbujear la solución con SO�, para saturarla, durante una hora y mezclar la solución con carbón activado (� g) hasta que esté transparente, filtrar y guardar en un recipiente de cristal oscuro.

La tinción se realiza de la siguiente forma:

1. Fijar los frotis con una solución con 10 mL de formaldehído al �0% y 90 mL de etanol durante 10 minutos.

�. Lavar con agua del grifo.

�. Sumergir en la solución de ácido peryódico durante 10 minutos.

�. Lavar con agua destilada y secar.

��

5. Sumergir en la solución de fucsina durante �0 minutos.

6. Lavar con agua del grifo durante 5 - 10 minutos y aplicar la tinción de contraste durante 10 - 15 minutos.

– el apartado 4.4.9. pasa a ser 4.4.10. y el contenido queda igual.

4.4.10. Peroxidasa

– Se añade un nuevo apartado :

4.4.11. Rojo neutro para microscopía Certistain®

El tinte rojo neutro pertenece al grupo de los colorantes de azina y puede ser usa-do para diversas tinciones, entre otras, para la tinción supravital de los leucocitos.

Para realizar la tinción deberemos preparar las siguientes soluciones:

1. Solución rojo neutro

– Disolver en 50 mL de agua destilada 0,5 g de rojo neutro Certistain®.

– Disolver en 10 mL de agua destilada 0,�5 g de NaCl.

– Unir ambas soluciones y filtrar.

2. Solución verde Janus

– Disolver den �5 mL de agua destilada 0,�5 g de verde Janus y filtrar.

3. Técnica para la tinción

– Realizar la extracción de sangre.

– Colocar en un portaobjeto 10 μL de sangre y añadir 10 μL de la solución de tinte compuesta por �0 mL de la solución de rojo neutro y 0,�5 mL de la solución verde Janus.

– Observar de forma inmediata y tras � horas de espera.

Si la tinción está realizada de forma correcta, podremos observar los siguien-tes elementos:

– Gránulos eosinófilos: amarillo – anaranjados.

– Gránulos basófilos: rojo ladrillo.

– Gránulos neutrófilos: rosa pálido.

– Vacuolas de los monocitos: salmón.

– Mitocondrias: verde.

��

– Actualizamos el recuadro del apartado 4.5.:

4.5. Visualización del frotis

Tinción de células sanguíneas con la tinción de Romanowsky

EritrocitosNúcleo No presenta

Citoplasma Rojo pálido o rojo amarillento

Neutrófilos

Núcleo Azul oscuro

Citoplasma Rosa pálido

Gránulos Lila rojizo

Eosinófilos

Núcleo Azul

Citoplasma Azul

Gránulos Rojos o rojo anaranjados

Basófilos

Núcleo Púrpura o azul oscuro

Citoplasma Azul

Gránulos Púrpura oscuro o negro

linfocitosNúcleo Violeta

Citoplasma Azul celeste

MonocitosNúcleo Violeta

Citoplasma Escaso azul celeste

5. Características generales de los glóbulos rojos, eritrocitos o hematíes

– Al principio del primer párrafo indicamos 5.1. Introducción, no cambiamos contenido renumeramos los apartados, 5.2.Estructura; 5.3.Valores normales y 5.4.Eritropoyesis

– El apartado 5.2. pasa a ser 5.3. y actualizamos el contenido

5.3. Valores normales

En el hombre suele estar entre 5,5 - 6 millones/mm�, y en la mujer entre �,5 - 5 millones/mm�.

Estos valores varían por factores como son edad, actividad, altitud, factores am-bientales.

En la adolescencia y edades superiores a los 50 años los niveles de eritrocitos descienden de forma fisiológica.

�5

Un aumento de los niveles de eritrocitos se denomina policitemia, y un descenso de los mismos eritrocitopenia.

Los valores normales quedan reflejados en la siguiente tabla:

Hombres Mujeres

Recién nacidos �,7-6,� �,7-6,�

Niños 2-12 años �,0-5,� �,0-5,�

Jóvenes 12-18 años �,5-5,� �,1-5,1

Adultos 19-60 �,6-5,9 �,1-5,�

Valores normales de los eritrocitos (×1012/L)

– Actualizamos el apartado 5.3.4., que antes era 5.3.4. y ahora pasa a ser 5.4.3.

5.4.3. Eritroblasto policromatófilo, normoblasto policromatófilo o rubricito

– Su tamaño oscila entre los 1�-15 μm.

– Su núcleo también es algo menor.

– La cromatina aparece intensamente condensada.

– Los nucléolos han desaparecido.

– Se inicia lentamente la síntesis de hemoglobina.

– Su citoplasma continúa siendo de carácter basófilo, aunque se aprecia un cambio de tonalidad, apareciendo tonalidades grises y rosadas.

Todas estas células se dividen por mitosis, siendo esta la última que puede realizarla.

– Actualizamos el apartado 5.3.4., que antes era 5.4.3 y ahora pasa a ser 5.4.4.

5.4.4. Eritroblasto ortocromático, normoblasto o metarrubricito

– Su tamaño oscila entre los 10-15 μm.

– Su forma es redondeada.

– Su núcleo es mucho menor, y suele presentarse de forma excéntrica. A la tin-ción aparece de una tonalidad azul oscuro.

– La cromatina continúa intensamente condensada y en menor proporción.

– Su citoplasma es de carácter acidófilo debido a la presencia de altos índices de hemoglobina.

– Entre el �0 y el �5% de los eritroblastos ortocromáticos presentan hierro en su citoplasma y se denominan sideroblastos.

�6

– Añadimos este párrafo como introducción del apartado 6:

6. Recuento de hematíes

Podemos definir el recuento celular sanguíneo (RCS) como la determinación de la concentración de las diferentes células presentes en la sangre circulante del pacien-te. Aunque siempre se ha realizado mediante recuento en cámara, y este método nos permite, además, observar las células, el ICSH recomienda en la actualidad las determinaciones mediante recuento electrónico estandarizado para evitar errores.

El recuento mediante cámaras sí es recomendable en el caso de citopenias severas, donde los valores que ofrecen los métodos electrónicos no son fiables, o en el caso de que la clínica del paciente no coincida con los resultados obtenidos en el recuento.

En el caso de los eritrocitos no está nunca recomendado por el ICSH, por el alto nivel de errores que se han podido constatar.

– Se añade esta nota al final del apartado 6.1.6.

Nota: el recuento manual de hematíes ya no se utiliza.

– Se añade un nuevo apartado 6.2.1.

6.2.1. Método de la resistencia eléctrica

También conocido como método de la impedancia, se basa en la capacidad con-ductora que presenta la solución salina en la que suspendemos las células, en contra-posición con la falta de conducción que tienen las células presentes en la disolución.

El aparato consta de unos electrodos colocados en la entrada y la salida de un orificio de unas condiciones determinadas; cada vez que una célula penetre por el ori-ficio, la conducción de la electricidad quedará anulada, convirtiéndose en un impulso; el número total de impulsos equivaldrá, de esta forma, al número de células presen-tes en la disolución. Para obligar al paso de las células por el orificio, la disolución será sometida a una succión adecuada que la movilizará de un lado al otro del mismo.

En este caso existen una serie de condiciones que debemos seleccionar para evitar errores en la determinación celular, las principales son:

– Intensidad de la corriente: esta deberá ser suficiente para detectar la resis-tencia a la conducción que ofrece la célula que queremos determinar, pero no demasiado elevada para evitar el daño celular.

– Diámetro del orificio: deberá estar en concordancia con el tamaño de la célula que queramos determinar. En los aparatos modernos constan de una resis-tencia eléctrica que destruye los posibles depósitos que puedan disminuir el tamaño del orificio.

�7

– Concentración de la suspensión: la concentración debe ser la adecuada para evitar el error de coincidencia, es decir, que dos células atraviesen simultánea-mente por el orificio.

Aspiración

Mercurio

Electrodos

Partículas

Orificio

Fotomultiplicador

0089

Esquema del recuento celular en los aparatos basados en el méto-do de la resistencia eléctrica

Para evitar distorsiones por las posibles interferencias que se originan en el movi-miento normal de la disolución por el orificio, los nuevos aparatos constan de varios procedimientos como: el enfoque hidrodinámico, el barrido posterior de la cámara y la colocación de un doble transductor, que garantizan el paso de las células de forma alineada y eliminan la posibilidad de retroceso de las mismas.

– Se añade un nuevo apartado 6.2.2.

6.2.2. Método del campo oscuro

También conocido como método de la dispersión lumínica, se basa en colocar dos haces de luces, que pueden ser halógenas o de láser, en ángulos diferentes y hacer pasar a las células a lo largo de una cámara de lectura, la sombra que proyecta la célula dependerá de sus características individuales: tamaño, forma e índice de refracción.

�8

– Se añade los apartados 6.3.1., 6.3.2.

6.3.1. Recuento automático de reticulocitos

La identificación de los reticulocitos de forma visual se debe, principalmente, a características morfológicas. Por esta razón existen muchas posibilidades de error.

En el recuento automático de los mismos se eliminan estos errores por estar ba-sados en técnicas de citometría de flujo.

Existen dos tipos básicos de autoanalizadores para reticulocitos; uno semiautomá-tico donde la muestra debe ser incubada con el fluorocromo de forma previa al recuen-to, y uno automático donde este paso no es necesario. Los fluorocromos usados son auramina O y naranja de tiazol, y se fijan al ARN del reticulocito. El sistema realizará una determinación de la intensidad de la fluorescencia y el tamaño celular, ofreciendo una distribución de los reticulocitos encontrados en base a su maduración:

– HRF: células inmaduras, con una alta intensidad de fluorescencia.– MRF: células de estado e intensidad media.– LRF: células maduras o muy cercanas a esta fase con una intensidad baja de

fluorescencia.Estas subpoblaciones nos serán de gran ayuda para realizar un seguimiento de la

eritropoyesis en estados patológicos y en tratamientos con quimioterapia.

6.3.2. Principales errores en el recuento automático de reticulocitos

Dependerán del tipo de fluorocromo usado:1. Naranja de tiazol:

– Agregaciones plaquetarias.– Eritroblastosis.– Leucocitosis.

�9

– Parásitos intraeritrocitarios.– Presencia de cuerpos de Holly y de Heinz.– Plaquetas de un tamaño superior al normal.

�. Auramina O:– Eritroblastosis.– Leucocitosis.– Parásitos intraeritrocitarios.

– Al principio del apartado 7.2. se le añade lo siguiente, el resto queda igual.

7.2. Alteraciones de la forma

Aunque la forma normal del hematíes es la de disco bicóncavo, existen situacio-nes en las que esta se encuentra alterada de una u otra manera. Las causas de esta anomalía pueden ser:

– Eritropoyesis anómala (diseritropoyesis) o acción de agentes sobre los hema-tíes normales; en este caso podremos observar la presencia de poiquilocito-sis, hematíes con diversas formas en la misma muestra.

– Causas congénitas que originan una malformación mantenida del hematíe. En este caso no aparecerá la poiquilocitosis.

– Al final del recuadro del apartado 7.2., se añaden estas dos alteraciones, el resto queda igual.

Alteraciones eritrocíticas Principales enfermedades en las que aparecen

Discocito Célula normal

Leptocito Hepatopatía obstructiva y talasemia

– Se añade el siguiente texto al apartado 7.4.

7.4. Presencia de inclusiones

Normalmente lo único que presentan los hematíes en su interior es hemoglobina, apareciendo un citoplasma homogéneo. Las inclusiones pueden ser de diferente tipo y corresponden a diferentes causas. Las principales son las que siguen:

– Punteado basófilo: son restos de ADN que se tiñen de azul con la tinción de Wright, su tamaño y número es variable. En los estudios realizados con micros-copios electrónicos se ha observado que representan ribosomas agregados.

�0

– Cuerpos de Heinz: inclusiones únicas o múltiples, de color azul oscuro, cons-tituidas por precipitaciones de hemoglobina anormal en su estructura. Se ob-servan en hemoglobinopatías inestables y en enzimopatías como el déficit de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa.

– Cuerpos de Howell Jolly: son corpúsculos redondos que corresponden a res-tos nucleares. Se hallan en la esplenectomía, saturnismo y anemias severas.

– Cuerpos de Pappenheimer: son gránulos de hemosiderina asociados a mate-rial proteico. Se ven en situaciones de gran sobrecarga férrica.

– Anillos de Cabot: son restos de membrana nuclear dispuestos en forma de anillo. Su hallazgo traduce un grave trastorno de la eritropoyesis.

– Se añade el siguiente contenido al apartado 8.5.1.

– Reactivo de Drabkin, también conocido como reactivo de HiCN; este reactivo debe ser amarillo transparente y tener un pH de 7-7,�.

Reactivo de DrabkinFerricianuro potásico �00 mgCianuro potásico 50 mgFosfato monopotásico 1�0 mgDetergente no iónico 1 mlAgua destilada Hasta completar 1.000 ml

Técnica:

Inicialmente, el espectrofotómetro debe estar calibrado y conectado de forma adecuada dependiendo de sus especificaciones propias. La técnica normal para la prueba es la que sigue:

1. Rotular dos tubos de ensayo como blanco y problema.

�. Homogeneizar la muestra mediante agitación suave o inversión manual.

�. Pipetear en el tubo rotulado como blanco �,5 ml del reactivo de Drabkin.

�. Pipetear en el tubo rotulado como problema �,5 ml del reactivo de Drabkin y 0,0� ml de la muestra problema.

5. Agitar suavemente para homogeneizar el contenido de forma adecuada.

6. Eliminar los restos externos de las pipetas y dejar 5 minutos a temperatura ambiente.

7. Colocar la muestra en una cubeta espectrofotométrica.

8. Leer la absorbancia a 5�0 nm.

9. El tubo de blanco nos servirá para recalibrar la máquina y evitar posibles erro-res posteriores.

10. El color aparecido en el tubo de muestra se mantiene estable durante 8 horas.

�1

La solución se establecerá según la siguiente reacción:

A problema HiCN patrónHb(g/L) = —————— × —————— × F A patrón 1000

donde:

A: absorbancia.

F: factor de dilución de la sangre total de Drabkin.

Los valores normales dependerán de la raza y zona geográfica donde se determi-na; como valores de referencia normales podemos determinar los siguientes:

Valores de referencia

Hombres 1� – 18 g/dl

Mujeres 11 – 16 g/dl

Niños 10 – 1� g/dl

Recién nacidos 15 – �� g/dl

Se añade lo siguiente al apartado 8.5.2.

Los valores se establecerán según la siguiente fórmula:

A muestraHb = —————— × Concentración del patrón × F A patrón

donde:

A: absorbancia.

F: factor de dilución.

–Se añade lo siguiente al apartado 8.8.

8.8. Hierro

El hierro (Fe) es uno de los elementos fundamentales de los organismos vivos, y se encuentra presente en muchos componentes necesarios para la vida: hemoglo-bina, mioglobina, enzimas…

��

Las principales funciones del hierro en los seres vivos son:

– Forma parte de la hemoglobina interviniendo en el transporte y liberación del oxígeno.

– Formación de hemoproteínas esenciales: mioglobina o hemoglobina.

– Formación de sistemas enzimáticos esenciales que intervienen en el uso celu-lar del oxígeno.

– Regulación de la síntesis del grupo hemo.

En realidad, los requerimientos de hierro en el ser humano en condiciones nor-males son muy escasos, ya que casi todo el hierro liberado vuelve a ser reabsorbido para su reutilización.

Requerimientos nutricionales de hierro

Edad Necesidades de ingestión diaria en mg

Neonatos 10

Niños 5

Mujeres

Jóvenes �0

Embarazadas �0

Postmenopáusicas 10

Hombres 10

La mayor parte del hierro se encuentra formando parte de estos componentes esenciales, principalmente la hemoglobina (entre � y � g del total), el resto se en-cuentra en forma de hierro plasmático, unido a la transferrina en estado oxidado, que lo transporta por el organismo, o en los lugares de reserva: macrófagos de la médula ósea, bazo e hígado, donde lo encontramos de forma hidrosoluble (ferritina) o insoluble en agua (hemosiderina).

El estudio del metabolismo férrico se realiza mediante la determinación de la si-deremia, ferritina, índice de saturación y capacidad de saturación de transferrina.

8.8.1. Determinación de la concentración sérica de hierro (sideremia)

Aunque la sideremia se puede determinar por absorción atómica o métodos colo-rimétricos, la ICSH recomienda el método colorimétrico de la batofenantrolina como el método de elección. La prueba se realiza como sigue:

Solución precipitante

Acido tricloroacético �9 g

Acido tioglicólico 1� mL

HCl 1 mol/L Hasta completar 500 mL

��

Solución de Acetato Sódico

Ferrocín [�-(�-piridil)- 5,6-bis – (ác. Fenilsulfónico)- 1,�,� - triazina] 0.�5 g/L

Agua destilada Hasta 500 mL

Patrón de hierro

Solución madre de Fe puro en una dilución al 50% de HCl concentra-do

� mL

Agua destilada 1 L

1. Numerar seis tubos de hemólisis como 1, �, �, �, 5 y 6 añadiendo a los tres primeros:

– Tubo 1: 1 ml de suero problema.

– Tubo �: 1 ml solución de hierro.

– Tubo �: 1 ml agua bidestilada.

�. Añadir a los tres tubos 1 ml de la solución precipitante.

�. Agitar.

�. Dejar en reposo 5 minutos.

5. Centrifugar el tubo 1 hasta obtener un sobrenadante transparente.

6. Añadir en los otros tres tubos:

– Tubo �: 1 ml del sobrenadante del tubo 1.

– Tubo 5: 1 ml del líquido del tubo �.

– Tubo 6: 1 ml del líquido del tubo �.

7. Añadir a estos tres tubos 1 ml de solución cromógena.

8. Homogeneizar de forma adecuada.

9. Dejar en reposo durante 10 minutos.

10. Usar un espectrofotómetro y calcular la absorbancia (A) a 5�5 nm.

Los resultados se obtienen según la siguiente fórmula:

(A tubo � – A tubo 6)

Sideremia (µmol/L) = –————————— × 40 (A tubo 5 – A tubo 6)

��

Valores normales de sideremia en µmol/L

Recién nacido �8,6

1-19 años �.5-�1.5

Hombres

�0-�9 años 8-�1

�0-�9 años 8-�8

50-59años 7-�9

> 60 años 6-�9

Mujeres

�0-�9 años 6-�9

�0-�9 años �-�0

�0-�9 años 5-�9

50-69 años 7-�6

> 70 años 6-�6

8.8.2. Determinación de la capacidad total de saturación de la transferrina e índice de saturación

La capacidad total de saturación de la transferrina (CTST) nos ofrece, de forma indirecta, los valores de transferrina presentes en el plasma. Para su determinación debemos añadir al plasma un exceso de hierro y comprobar después qué cantidad ha sido unida a la transferrina circulante. La técnica es como sigue:

1. Tomar una muestra de � ml de suero.

�. Añadir � ml de una solución clorhídrica de cloruro férrico (cada ml de esta solución debe contener 5 mg de hierro).

�. Homogeneizar la muestra de forma correcta.

�. Dejar reposar 5 minutos.

5. Añadir 0.� g de carbonato magnésico.

6. Agitar la mezcla.

7. Dejar reposar �0 minutos.

8. Centrifugar a 1,55 g durante 15 minutos.

9. Determinar el hierro del sobrenadante.

Los valores normales para la CTST oscilan entre �50-�00 mg/100 mL y para el índice de saturación del ��%.

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8.8.3. Determinación de la ferritina sérica (ferritinemia)

Se recomienda la determinación de la ferritinemia mediante procesos de inmuno-rradiometría (IRMA) o radioinmunoanálisis (RIA).

Los valores varían con el sexo, pudiendo considerarse normal en el hombre valo-res entre �0 y �00 μg/L y para la mujer entre 10 y �00 μg/L.

8.8.4. Determinación de la presencia de hemosiderina

Si queremos poner de manifiesto la presencia de hemosiderina a un frotis sanguí-neo o de médula ósea deberemos llevar a cabo la tinción de Perls.

La técnica es como sigue:1. Realizar una extensión de la muestra.�. Fijar con alcohol metílico durante �0 minutos.�. Introducir en una solución clorhídrica de ferrocianuro potásico durante 10 mi-

nutos a temperatura ambiente.�. Lavar la extensión durante �0 minutos con agua del grifo.5. Teñir con la solución de contraste (hematoxilina de Harris) durante 5 minutos.6. Lavar abundantemente con agua del grifo.7. Colocar la extensión en alcohol etílico absoluto � minutos.8. Lavar con agua del grifo.9. Observar.La hemosiderina celular se observará como gránulos de un intenso color azul-

verdoso.

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Tema 10

Fisiología y morfología del sistema leucocitario: recuento y clasificación de los leucocitos, técnicas histoquímicas e inmunológicas de identificación leucocitaria. Patologías del sistema leucocitario:

alteraciones cuantitativas y cualitativas, pruebas analíticas para el diagnóstico y seguimiento de estas patologías

Se actualiza el apartado 4.1.:

4.1. Alteraciones en la cantidad de los leucocitos

4.1.1. Leucocitosis y leucopenia

Hablamos de leucopenia cuando el recuento total de leucocitos se encuentra por debajo de los � × 109 /L.

Hablamos de leucocitosis en un adulto cuando el recuento total de leucocitos es superior a 11 × 109 /L.

Si el recuento se sitúa por encima de estos valores, pero las células encontradas son normales, hablamos de reacción hiperleucocitósica, y si encontramos células alteradas, de reacción leucemoide.

Por supuesto, estas definiciones se establecen en cuanto al número total de leu-cocitos presentes, aunque puede que sea sólo uno de los diferentes tipos los que se encuentren elevados y no el total.

4.1.2. Linfocitosis y linfopenia

La linfocitosis es un aumento del volumen circulante de linfocitos, superior a �.5 × 109 /L. Entre sus principales causas podemos nombrar:

– Fisiológica: durante el desarrollo y crecimiento aparece una linfocitosis fisio-lógica, de manera que desde el nacimiento a los dos años existe un aumento absoluto de la cifra de linfocitos. Esta linfocitosis también aparece en la fase de convalecencia de grandes infecciones, indicando un buen pronóstico de la enfermedad.

– Infecciones: fundamentalmete víricas. Las infecciones bacterianas pueden producir linfocitosis en los niños y adultos jóvenes.

– Síndromes proliferativos: leucemia linfoide crónica.

– Otras: existen otras ocasiones en las que puede aparecer linfocitosis como una alergia a medicamentos, enfermedades hormonales o tabaquismo crónico.

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La linfopenia es una disminución del número circulante de linfocitos, inferior a 1,5 × 109 /L. Entre sus principales causas podemos encontrar: inmunodeficiencias congénitas o adquiridas, linfomas, tratamiento con inmunosupresores en el curso de una enfermedad u operación prevista o Sida.

4.1.3. Monocitosis y monocitopenia

Podemos definir la monocitosis como un aumento del recuento de monocitos en sangre periférica superior a 0,8 × 109 /L. Podemos apreciarla en: monocitosis fisiológica del recién nacido infecciones bacterianas, fundamentalmente en las de tipo crónico y granulomatoso como la tuberculosis o la endocarditis, enfermedades hematológicas que impliquen una proliferación de su serie celular, como la leucemia aguda monocítica, leucemia mielomonocítica crónica, fase de recuperación medular, neoplasias como la enfermedad de Hodgkin, enfermedades autoinmunes y reumáti-cas o necrosis de tejidos.

Podemos definir la monocitopenia como una disminución del número normal de monocitos en la sangre periférica. Puede aparecer en las siguientes circunstancias: tratamiento con esteroides, síndrome de Cushing o leucemia de células peludas.

4.1.4. Basofilia y basofilopenia

Podemos definir la basofilia como un aumento del número normal de basófilos en san-gre circulante, superior a 0,15 x 109 /L. Podemos encontrarla en las siguientes ocasiones: síndromes mieloproliferativos crónicos, anemias crónicas o reacciones de hipersen-sibilidad.

Podemos definir la basofilopenia como una disminución del número normal de basófilos en sangre circulante. Ya que de forma fisiológica el número de basófilos es bajo, su determinación es más difícil que en otros casos y se necesita un recuen-to superior al normal para detectarla. Aparece en los siguientes casos: infecciones determinadas como el exantema súbito, endocrinopatías como el hipertiroidismo o tratamientos prolongados con heparina.

4.1.5. Neutrofilia y neutropenia

Podemos definir la neutrofilia como el aumento del número normal de neutrófilos en sangre circulante en un número superior a 7,5 × 109 /L. Aparece en los siguientes casos: síndromes mieloproliferativos y leucemias agudas de neutrófilos, infecciones bacterianas, síndromes inflamatorios agudos o crónicos, infartos y necrosis de te-jidos, enfermedades metabólicas o tratamientos con algunos medicamentos como corticoides y litio.

Podemos definir la neutropenia como la disminución del nivel normal de neutró-filos en sangre circulante, con valores inferiores a �,5 × 109 /L. Aparece en: infeccio-nes, ingesta de medicamentos, enfermedades reumáticas y autoinmunes, neutro-penia crónica idiopática o enfermedades hematológicas como leucemias agudas, síndromes mielodisplásicos, aplasias medulares.

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4.1.6. Eosinofilia y eosinopenia

Podemos definir la eosinofilia como el aumento del nivel normal de eosinófilos en el torrente circulatorio, por encima de 0,5 × 109 /L. Aparece en muchas situaciones, principalmente en: enfermedades autoinmunes, enfermedades alérgicas, parasito-sis, ingesta de medicamentos como el digital o la cloxaciclina, neoplasias, endocri-nopatías como la enfermedad de Addison, hemopatías malignas, colagenosis, infec-ciones o enfermedades de la piel.

Podemos definir la eosinopenia como la disminución del nivel normal de eosinó-filos en sangre, por debajo de 0,5 × 109 /L. Debido a que su número es pequeño son difíciles de apreciar, aparece en situaciones como: infecciones, estrés, IAM (Infarto Agudo de Miocardio) o tratamiento con corticoides o adrenalina.

Medicamentos asociados a

Eosinofilia Neutrofilia

Ácido aminosalicílicoÁcido nalidíxicoAdrenalinaAmpicilinaAntimonioCefalotinaClorpromacinaCloxaciclinaDigitalEstreptocinasaFerrotiacinaIsoniacidaKanamicinaMeticilinaMetildopaNorbiocinaOcapreomicinaRistocetinaVancomicinaYoduros

AlopurinolAtropinaBarbitúricosCorticoidesDietilcarbamacinaEritromicinaEstreptomicinaLitioSulfamidas

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Tema 14

Antígenos y anticuerpos eritrocitarios, leucocitarios y plaquetarios. Sistema ABO. Sistema Rh.

Otros sistemas. Compatibilidad eritrocitaria entre donante y receptor. Técnicas de fraccionamiento, separación y con-

servación de hemoderivados

Grupo Aglutinógeno Aglutinina % en la población

Grupo A1 A1 Beta o anti B34%

Grupo A2 A2 Beta o antiB y antiA1

Grupo B B Gamma o anti A y anti A1 8.77%

Grupo A1B A1 y B ninguna3.51%

Grupo A2B A2 y B anti A1

Grupo O ninguno Anti A y anti B 53.68%

Compatibilidad de los distintos grupos sanguíneos dependientes del sistema ABO

Grupo receptor Grupo donante

Grupo A Grupos A y O

Grupo B Grupos B y O

Grupo AB Grupos A, B, AB y O

Grupo O Grupo O