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1
Actualidades en Enfermedades Tumorales y su efecto en la Producción de Huevo ComercialTaylor BarbosaDVM, MS, PhD, Dipl. ACPV Sr. Manager, Tech Services Bio-Devices Latin America
2
Enfermedades Tumorales en Avicultura
• Formación genética
– Edad
• Origen infeccioso
– Enfermedad de Marek
– Leucosis Aviar
– Reticuloendoteliosis
3
• Enfermedad altamente infecciosa– Inmunodepresión– Signos nervosos: Parálisis– Lesiones cutáneas– Problemas locomotores – Tumores en vísceras
• Impacto económico: – La enfermedad avícola más
importante en el mundo– Pérdidas económicas anuales
estimadas en 1.5 M Millones de Euros (1% de la producción)
Enfermedad de Marek
4
El virus
• Herpesviridae• Alphaherpesvirus
• Cadena doble de DNA• 140Kb• 90 genes
• Asociado a células • Latencia en linfocitos• Gene oncogénico: meq
• Capacidad neoplásica
• Ubicuo• Infecta primariamente a las gallinas
5
Virus libre
Folículo da pluma
Citólisis
Inmunosupresión
BT ViremiaLatencia
Bursa de Fabrícios
ViremiaMacrófagos del
Pulmón
Patogenia de la Enfermedad de Marek
6
Curso de la infección
1. Infección Citolítica (Síndrome Linfodegenerativa)• Destrucción de células B• Intensidad dependiente de la genética del ave/ virulencia de la cepa• Parálisis temporaria (vasculitis y edema cerebral)• Inmunodepresión transitoria2. Latencia • Ocurre simultáneamente a la segunda ola de infección citolítica• Inmunodepresión permanente3. Fase de Transformación • MDV transforma principalmente células T CD4+• Linfomas pueden ocurrir en cualquier tejido, observados
macroscópicamente a partir de 3 semanas• Signos clínicos variables o inespecíficos (correspondiendo a
los órganos y sistemas afectados
7
Objetivos de la vacunación
• Brindar una respuesta inmune activasólida a partir de los primeros días deedad
• Disminuir la intensidad de la fase citolitica(3-6 días después de la infección por víarespiratoria) y por consecuencia losefectos de la inmunodepresión
• Limitar la viremia del vMDV asociado a loslinfocitos CD4+
• Prevenir la formación de tumores
8
Tipos de Vacunas
• Serotipo 1 CVI-988 Rispens (bajo pasage)• Serotipo 1 CVI-988 Rispens (alto pasaje)• Bivalente (Serotipos 2+3)• Vacunas con cepas de campo atenuadas (productos
experimentales/ no disponibles comercialmente) – Ejemplo: Md11/75C/R2
• Serotipo 1 Clonado con pasaje reversa en aves– Clone C/R6: 6 “back passages”
• Serotipo 3 monovalente (HVT) • Serotipo 2 monovalente (SB1 o 301 B/1)• Serotipo 1 Clone C (no disponible)
Eficacia
9R.L.Witter
?
1940 1960 1980 2000 2020
M
V
VV
VV+HVT
Bivalente
Rispens
Virulencia Relativa
Vacunas x Virus de Campo
10
Eficacia de las vacunas:% Protection contra 5 cepas vvMDV
0
102030405060708090
100
% P
rote
ctio
n
CVI-988 HVT/301B/1 HVT Clone C
R.L. Witter et al. 1992
Reto: 5 días de edad
11
Cambios en la vacuna asociados con el aumento del nivel de pasaje del virus semilla (MSV)
Requerimientos para
Dosis Minima
Tamaño del PFU
Titulo de la vacuna
(facilidad del conteo)
Proporción de Virus
libre de celula
Que es lo que AUMENTA?
12
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
SB-1 (11) SB-1 (23) SB-1 (64) SB-1 (98) Control (HVT)
(mm
2)
(PASAJE)Witter, Avian Diseases 31: 752-765
Eficacia de las vacunas:Número de Pasajes MSV x Tamaño del PFU
13
Cambios en la vacuna asociados con el aumento del nivel de pasaje del virus semilla
Transmisión lateral
Inmunogenicidad
Capacidad de Replicación “in vivo”
Tiempo para
formación de placas
Que es lo que DISMINUYE?
14
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
JM/102W MD5
%P
rote
ctio
n
Virus de Desafío
SB-1 (23)
SB-1 (64)
SB-1 (98)
Witter, Avian Diseases 31: 752-765
Eficacia de las vacunas:Número de Pasajes MSV x %Protección
15
Diagnostico y monitoria de la enfermedad
• Procedimientos de vacunación
• PCR de pluma
• Necropsias de rutina
16
Feather PCR
Prueba Cuantitativa
– Real Time PCR amplifica una secuencia blanco en el genoma viral:
• Meq gene: especifico de los MDV-1
• sORF1: especifico del HVT
– Reacción PCR duplex: concentración del DNA del ave x DNA viral
Prueba Cualitativa
– Diferencia entre cepas vacúnales (Rispens) vs cepas de campo
MDV-1 Virus de campo: 1 o 2 “repeats”, 1 banda
MDV-1 vacuna RISPENS: •3 a 8 repeats, “Ladder” patrón
17
• Bazo: sitio predominante de replicación del MDV
• La carga de genoma viral en las plumas presenta correlación directa con la del bazo*
• Método de muestreo conveniente y no invasivo
– Aves con 2 a 4 semanas
– 10 plumas de tracto axilar
– Seleccionar plumas en crecimiento que llevan pulpa
– Colocar las muestras en tubos individuales
– 20- 50 aves por lote
Feather PCR: Procedimiento de toma de muestras
* Baigent SJ, Smith LP, Currie RJ, Nair VK : “Replication kinetics of Marek's disease vaccine virus in feathers and lymphoid tissues using PCR and virus isolation.” J Gen Virol. 86(11):2989-2998
18
• Estudios Inmunológicos:– Intensidad de la respuesta inmune
– Efecto de una misma vacuna en distintas líneas genéticas
– Efecto de distintas vacunas en una misma línea genética
– Eficacia de distintos planes vacúnales
• Estudios epidemiológicos
• Estudios comparativos:– Incrementos en la dosis
– Revacunación
– Doble vacunación
Feather PCR:Ejemplos de aplicación práctica
19
Fort Dodge vaccine
0500 000
1 000 0001 500 0002 000 000
2 500 0003 000 000
3 500 0004 000 000
0 10 20 30 40 50
Mea
n M
DV
cop
y no
/mill
ion
cells
Broiler breed 1 Broiler breed 2
Layer breed 1 Layer breed 2
4 GENETICAS x 1 VACUNA
Feather PCR:Ejemplos de aplicación práctica
20
1 GENETICA PONEDORAS x 3 VACUNAs
Feather PCR:Ejemplos de aplicación práctica
0500.000
1.000.0001.500.0002.000.0002.500.0003.000.0003.500.0004.000.000
0 10 20 30 40 50Mea
n M
DV
cop
y no
/milli
on c
ells
Vacc 1 Vacc 2 Vacc 3
21
Diagnostico
• Diferenciar enfermedad vs Infección
• MDV causa varías síndromes
- No neoplásica (Síndrome linfodegenerativa - Inmunosupresión)
- Neoplásica
• Edad del ave
- clásico hasta las 18 sem, pero hay caso en ponedoras viejas
(>80sem)
• Histórico del lote y de la raza
22
Enfermedad de Marek: Comentarios finales
• La incidencia de la enfermedad en pollos de engorde en general hadisminuido en muchos países (hay excepciones !)
• Brotes en ponedoras comerciales siguen siendo frecuentes
• La casuística de la forma clásica con formación tumoral ha sidorelativamente bien controlada por los planes de vacunación actuales:
– Movimientos de regreso al uso de dosis completa
– Tendencia de reducción en la dilución de las vacunas
– Equipos de vacunación SC más calibrados (SOP’s)
– Avanzo en la adopción de la tecnología IN-OVO
– Elección de cepas con bajo pasaje
• La presión por la selección de nuevos patotipos del MDV en campo esun riesgo siempre presente en la avicultura moderna
23
Retrovírus
� Leucosis Aviar
� Reticuloendoteliosis
24
Retroviroses
• Grande familia de virus cubiertos
• Dos copias de ssRNA
– 7 kb a 12kb
– Linear, no-segmentado
• 80 – 120 nm de diámetro
• Transcriptasa reversa
– De ssRNA para dsDNA
• Integración del dsDNA en el genoma celular “pro-vírus”
25
Classificacion de los Retrovírus
Retroviridae
Alpharetrovirus Leucosis Aviar
Exogenous
Endogenous
BetaretrovirusVirus Tumor Mamario
del ratón
GammaretrovirusReticuloendoteliosis
virus
Deltaretrovirus Virus Leucemia Bovinos
EpsilonretrovirusSarcoma de los peces
Walleye
Lentivirus HIV
SpumavirusVirus esponjoso del
Chimpance (foamy virus)
26
Leucosis Aviar
27
Clasificación
� Exógenos◦ Mayoría es competente para replicación ◦ Subgrupos
� Basado en la proteína del cubiertos y en la capacidad de reconocimiento del receptor celular
� A� B� C� D� J
� Endógenos◦ Secuencias virales integradas en el cromosoma de la mayoría de las
aves (gallinas)◦ Antes de la domesticación de la especie
� Subgrupo E
28
Clasificación
Sub-grupo Tipo Espécie Obs
A Exogenos Pollos Mas comunes en Leghorns
B Exogenos Pollos Segundo mas comun
C Exogenos Pollos Raro
D Exogenos Pollos Raro
E Endogenos Pollos Herencia Mendeliana
F Endogenos Faisões
G Endogenos Faisões
H Endogenos Perdiz
I Endogenos Codonices
J Exogenos Pollos Lineas pesadas
29
Impacto económico
• Mortalidad asociada con presencia de tumores
• Mortalidad en Machos con o sin tumores
• Aves adultas
– Diminución del tamaño de producción de huevos
• Pollitos
– Desuniformidad
– Mortalidad
– Inmunosupresión
30
Transmisión
• Vertical
– Genética
• Endógenos
• Cromosoma
– Congénita
• Exógenos
• Albumina
• Horizontal
– Contacto con animales infectados o secreciones
31
Patogénesis
• Tipo de virus
• Dosis
• Rota de infección
• Edad de exposición
• Forma de transmisión
• Infección doble
• Estado inmune de la ave
• Sexo de la ave
32
Patogénesis
� Leucosis linfoide (Células B)
� Eritroblastosis (eritrocitos inmaturos)
� Mieloblastosis (macrófagos inmaturos)
� Mielocitomatosis (macrófagos inmaturos)
� Nefroma (células renales inmaduras)� Tumores de tejido conjuntivo
� Fibrosarcomas y Mixosarcomas
� Tumores epiteliales
� Osteopetrosis
� Endoteliomas
33
Lesiones ALV - Linfóide
® G. Zavala
Hígado
Bursa
34
Lesiones – ALV-J
® G. Zavala
Riñon
Hígado
35
Diagnóstico
• Lesiones macroscópicas
• Histopatología
• Aislamiento viral– Plasma, suero, meconio, hisopos, tumores
• Fibroblastos de linajes susceptibles
• 7-9 días de incubación
• ELISA de captura
• Neutralización viral
• Detección de RNA/DNA
• Serología
36
Control
� Definición de los objetivos◦ Controlar, Reducir o Erradicar
� Valor económico◦ Elevado número de muestras, diversas etapas da crianza◦ Disminución del estoque genético
� Principal punto es romper el ciclo de transmisión congénita◦ Muestras siempre individuales◦ Eliminación de aves positivas◦ Mantener aves en grupos pequeños
� Evitar transmisión horizontal
37
Reticuloendoteliosis
38
REV - Clasificación
� Gamaretrovírus◦ Retrovirus simples
� Origen desconocida, mas probablemente adaptación de retrovirus endógenos de mamíferos
� Ausencia de formas endógenas
� Único serogrupo◦ Pequeña variación entre aislados
� Antígeno específico◦ p30
39
REV – Importancia económica
• Alta mortalidad – Tumores
• Retraso en crecimiento– Enanismo
• Problemas de emplume– Síndrome Nakanuke
• Barreras internacionales– Todas aves destinadas a exportación deben ser libres de
REV• Pruebas para producción de vacunas y lotes SPF
– Contaminación relacionada en algunas ocasiones
40
M
M
M
= Brote natural M = MDV+REV
20022006
1994
20022004
2006
2004
2006
M
J = ALV-J+REV
J
= Contaminación vacuna
M
REV - Epidemiologia
® Dr. Zavala
1980´s
41
Síndromes
1. Neoplasia reticular aguda
2. Enanismo
3. Síndrome neoplásico (tumores)
– Linfocitos B e T
42
1. Neoplasia reticular aguda
• Cepa T
– Aislada de pavos
• Histórico de linfomas
– Defectuosa
• Necesita de un virus auxiliar para replicar
– Induce alta mortalidad (>6 días)
• Probablemente o mas patogénicos de todos los retrovirus
– Aumento en hígado y riñón
LTR LTR
DNA Pro-viral de cepa defectiva (REV-T)
gag pol/env envv-rel
43
2. Enanismo
• Inducido por varias cepas de REV
• Cepas no defectuosas
• Disminución del crecimiento
• Problemas de emplume
• Puede causar linfomas en las aves sobrevivientes
• Inmunosupresión
• Proventriculitis
® Dr. Zavala® T.Barbosa
44
3. Síndrome neoplásico
• Inducido por varias cepas de REV
• Cepas no defectuosas
• Linfomas de células B – Bursa involucrada
– Linfomas en vísceras
• Linfomas de células T– Descrito en experimentos
– Normalmente por activación c-myc
• Virus de Marek serotipo 2 puede potencializar la formación de linfomas
Bazo- pollo
® Dr. Zavala
45
Lesiones Macroscopicas – Experimental
® T.Barbosa
Infectado
Normal
Codornices 17 semanas
46
Lesiones microscópicas
Bursa- Pavo
Rinon-APC
Pâncreas-
Codornices
® Dr. Zavala
47
Inmunosupresión
� REV causa:
◦ Disminución de blastogénesis linfocitaria
◦ Interferencia con el sistema inmune
� Desregulación de citokinas
◦ Disminución de la respuesta humoral
48
Genoma REV APC-566
Barbosa, et al. 2007
49
Secuencia del peptídeo de inmunosupresión
10 20
L Q N R R G L D L L T A E Q G G I C L A L Q E K C C F 1 apc-566.pro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 APC-745-ISP.seq. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 APC-793.pro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 APC-782-ISP.seq. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 APC-853-ISP.seq. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 APC-854-ISP.seq. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 APC-947-ISP.seq. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 APC-951-ISP.seq. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 APC-976.pro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 APC-1006.pro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 APC-1011.pro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 GPC-G99-ISP.seq. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 PMX-16-ISP.seq. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 PMX-19-ISP.seq. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 REV 397 A.pro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 REV-A.pro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 SNV.pro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 AF246698 REV in Pox.pro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 REV China.pro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 MPMV.pro. . . . . . . . . . F L K E . . L . A . . K . E . . . 1 AKV-murine endogenous.pro. . . . . . . . . . F L K E . . L . A . . K . E . . . 1 MMCF.pro. . . . . . . . . . F L K E . . L . A . . K . E . . . 1 AMCF.pro. . . . . . . . . . F L K E . . L . A . . K . E . . . 1 FriendLV.pro. . . . . . . . . . F L K E . . L . A . . K . E . . . 1 Gross LV.pro. . . . . . . . . . F L Q E . . L . A . . K . E . . . 1 FeLV.pro. . . . . . . . . . F L K E . . L . A . . K . E . . . 1 MoLV.proA . . . . . . . . . F W . . . . L . K . I . . Q . . . 1 HTLV-II.proA . . . . . . . . . F W . . . . L . K . . . . Q . R . 1 HTLV-I.pro. . . . . . . . . . F L K E . . L 1 CKS-17.pro
LTR gag pol env LTR
Barbosa, et al., 2007.
APC/GPC
Pollo /broiler
PAVOS
Pollos/Viruela
RetrovírusMamíferos
50
REV APC-566 Inmunosupresión
Vacunacion y desafio PM Respuesta vacuna inactivada
0
20
40
60
80
100
120
Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5
PM
REV+PM
REV+Vacina+PM
Vacina+PM
Anticuerpos (GMT)
ELISA NDV
HIIBD NDV REV
Sin Vac 5c 1b 1b 5c
REV 5c 1b 6034a 5c
REV+Vac 175b 112b 3949ª 54b
Vac 683a 867a 1b 149a
51
Diagnostico
• Similar a Leucosis• Lesiones macroscópicas
– Involucra a la bursa o no– Involucra dos nervios o no– Linfomas de células B o T
• Aislamiento viral e identificación– Fibroblastos– Cultivar mínimo por 7 días– IF, PCR, IHC
• RT-PCR o PCR de los tumores
® T.Barbosa
52
Control
• Muestrear los animales varias veces
• Infecciones en los primeros días
– Puede causar tolerancia
– Desarrollo de tumores
• Infecciones tardías
– Producción de anticuerpos
– Sin transmisión del virus
• Vacunar para Viruela
• Controlar insectos
53
Como saber cual enfermedad?
54
Diagnóstico diferencial
REV Leucosis
Enfermedad de Marek
55
Diagnóstico diferencial
REVLeucose Enfermedad de Marek
56
Diagnóstico diferencial
REV ALV-A ALV-C ALV-J
REV
ALV-A ALV-C
ALV-J
ALV-B ALV-C ALV-D
57
Diagnóstico diferencial
� Histórico
� Lesiones macroscópicas
�Ojos y niervos
� Histopatología
�Población heteróloga (MD, REV no bursal)
�Pobación homogénea (LL, REV bursal)
� Imunohistoquímica
� Técnicas Moleculares
�Mas seguras y definitivas