Acinetobacter baumannii, Acinetobacter nosocomialis y ...bdigital.unal.edu.co/49595/1/1030552502.2015.pdf · Con todo mi amor y mi cariño a quienes han hecho todo en la vida para

Caracterización de los plásmidos presentes en

tres aislamientos multirresistentes de:

Acinetobacter baumannii, Acinetobacter

nosocomialis y Acinetobacter pittii obtenidos en

hospitales colombianos.

Tatiana Rodríguez Méndez

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Postgrado Interfacultades en Microbiología

Bogotá, Colombia

2014

Caracterización de los plásmidos presentes en

tres aislamientos multirresistentes de:

Acinetobacter baumannii, Acinetobacter

nosocomialis y Acinetobacter pittii obtenidos en

hospitales colombianos.

Tatiana Rodríguez Méndez

Trabajo de investigación presentado como requisito para optar al título de:

Magister en Ciencias -Microbiología

Directora:

MSc. Químico Farmacéutico, María Teresa Jesús Reguero Reza

Codirector:

MSc. Químico Farmacéutico, José Ramón Mantilla Anaya

Línea de Investigación: Biología molecular de agentes infecciosos

Grupos de Investigación:

Grupo Interdisciplinario de Epidemiología Molecular de la Infección Intrahospitalaria y

Grupo de Bioinformática

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Postgrado Interfacultades en Microbiología

Bogotá, Colombia

2014

Con todo mi amor y mi cariño a quienes han hecho todo en la

vida para que yo pudiera lograr mis sueños, a mi familia: Mami,

hermanito, abuelos y tíos, a ustedes que son mi motor y mi razón…

A mi compañero de vida durante los últimos seis años, gracias por

tu apoyo incondicional y porque el futuro juntos es mi mayor

motivación.

Ahora me corresponde regresarles un poquito de todo lo que me

han otorgado!!!

"Si he logrado ver más lejos, ha sido porque he subido a hombros

de gigantes". Isaac Newton.

AGRADECIMIENTOS

A Dios por guiar cada uno de mis pasos de forma tal que me permitío culminar

exitosamente este camino de crecimiento profesional y personal, a mi familia por cada

uno de sus esfuerzos para que yo pudiese llegar a donde estoy, a Cris por su compañía,

apoyo y amor durante estos años.

A la Universidad Nacional de Colombia por permitirme cumplir mi sueño de formar parte

de su comunidad estudiantil, al Posgrado Interfacultades Microbiología en cabeza de la

Dra. Martha Fontanilla por brindarme un espacio de formación no solo académica sino

también personal.

Al Profesor José Ramón Mantilla Anaya, por todas y cada una de sus enseñanzas, por

poner todos sus conocimientos a mi disposición, por el tiempo y la entrega dedicados a

esta tesis, pero sobre todo por su infinita paciencia y confianza en mí.

A la Profesora María Teresa Reguero, por toda su colaboración, ayuda desinteresada y

las orientaciones recibidas durante la realización de este trabajo.

A la Profesora Emilia María Valenzuela por la confianza, por estar siempre pendiente,

dispuesta a escuchar, a ayudar, a orientar pero sobre todo a aconsejar, por abrirnos las

puertas de su casa cuando así lo requerimos, por su apoyo incondicional.

Al Profesor Emiliano Barreto por las asesorías recibidas durante la ejecución de este

proyecto.

A mis compañeros y amigos: David, Lalis, Liz, Meli, Laura, Vane, Carolina, Leo, Uriel,

Consuelo y Alexandra, por su compañía, por cada momento compartido, porque me han

dejado no solo grandes recuerdos sino también enseñanzas, porque mi mayor logro es

su amistad.

A todas aquellas personas que hacen parte del Instituto de Biotecnología, cuyo trabajo

aunque en ocasiones resulta invisible a su vez es invaluable, a Yolanda Pardo por su

colaboración y especialmente a Socorrito por ser más que una amiga, una gran

consejera y una guía durante este proceso.

Resumen y Abstract IX

Resumen

En las últimas décadas, el control de las infecciones asociadas al cuidado de la salud

causadas por bacterias del género Acinetobacter se ha convertido en un problema global,

ya que un gran porcentaje de aislamientos hospitalarios presentan resistencia a la

mayoría de antibióticos de uso común, incluyendo: Penicilinas, cefalosporinas,

aminoglicósidos, quinolonas, tetraciclinas, cloranfenicol y carbapenémicos; existen gran

cantidad de estudios a nivel mundial que relacionan la presencia de elementos genéticos

móviles con la diseminación de genes de resistencia. En este estudio se llevó a cabo la

determinación del perfil plasmídico de las cepas multirresistentes A. baumannii 107m, A.

nosocomialis 28F y A. pittii 42F aisladas en hospitales colombianos, utilizando la técnica

de termolísis alcalina, a través de la cual fue posible obtener los plásmidos de menor

tamaño presentes en estas cepas. Con el objetivo de identificar los elementos genéticos

comunes que componen la estructura basal de los plásmidos del género Acinetobacter, se

realizó una búsqueda en la base de datos GenBank; en la cual se encontraron 122

plásmidos completamente secuenciados de diferentes especies pertenecientes a este

género; en los archivos de anotación se identificaron todos aquellos elementos que

permiten la replicación y adecuada segregación del DNA plasmídico, así como aquellos

que confieren ventaja adaptativa al hospedero, entre ellos: Genes de resistencia a

antibióticos, genes de resistencia a metales pesados, compuestos aromáticos, entre otros.

Para determinar la arquitectura genética de los plásmidos presentes en las cepas objeto

de estudio, se planteó una estrategia de búsqueda que permitió reconocer dichos

elementos en los archivos de anotación. Además se realizó un análisis comparativo a

través de alineamientos de la secuencia de nucleótidos de los contigs obtenidos por

secuenciación de alto rendimiento contra la base de datos Nucleotide collection (nr/nt) de

Gen Bank utilizando la herramienta BLAST del NCBI que permitió establecer similitudes y

diferencias entre los plásmidos encontrados y las secuencias reportadas.

Palabras Clave: Acinetobacter, plásmidos, resistencia, elementos genéticos

estructurales.

Abstract

In the last decades, the control of the infections associated to the health care caused by

bacteria of the genus Acinetobacter has become in a global problem, a large percentage

of hospital isolates have presented resistance of the most antibiotics in common use,

including penicillins, cephalosporins, aminoglicocidos, tetracyclines, chloramphenicol and

carbapenems. There are global researchs that relate the presence of mobile genetics

elements in the dissemination of resistance genes. In this research it took out the

determination of the plasmid profile of multiresistant strains A. baumannii 107m, A.

nosocomialis 28F y A. pittii 42F isolated in Colombian hospitals using the alkaline

thermolysis technic through which it was possible get the smaller plasmids present in the

strains. The target is identify the genetics elements who compose the plasmids basal

structure and are common in the genus Acinetobacter a search was performed on the

database GenBank in which they found 122 plasmids fully sequenced species belonging

to this genus; in the annotation files has identify all the elements who allow replication and

proper segregation of plasmidic DNA well as those that confer adaptive advantage to the

host including antibiotics resistance genes, heavy metals resistance genes and aromatics.

To determine the genetic architecture of the plasmids present in strains under study, a

search strategy that recognized these elements in the annotation files are raised, plus a

comparative analysis was performed using alignments of the contigs obtained by

sequencing high performance against the database Nucleotide collection (nr/nt) of

GenBank using the NCBI BLAST tool that allowed us to establish similarities and

differences between plasmids and the sequences reported found.

Keywords: Acinetobacter, plasmid, resistance, structural genetics elements.

XI Caracterización de los plásmidos presentes en tres aislamientos

multirresistentes de: Acinetobacter baumannii, Acinetobacter nosocomialis y

Acinetobacter pittii obtenidos en hospitales colombianos.

Contenido Resumen ..........................................................................................................................IX

Abstract..............................................................................................................................X

Lista de figuras ..............................................................................................................XIII

Lista de Tablas...............................................................................................................XIV

Lista de Símbolos y abreviaturas ................................................................................XVI

Introducción ......................................................................................................................2

1. Marco Teórico........................................................................................................5 1.1 Generalidades de Acinetobacter spp…………………………………………….....5

1.1.1 Características microbiológicas .......................................................................... 5

1.1.2 Taxonomía ......................................................................................................... 5

1.1.3 Patogenicidad .................................................................................................... 5

1.1.4 Resistencia a Antibióticos .................................................................................. 6

1.2 Plásmidos................................................................................................................. 8 1.2.1 Generalidades de elementos genéticos móviles ................................................. 8

1.2.2 Organización Genética ....................................................................................... 9

1.2.3 Módulo de Replicación ...................................................................................... 10

1.2.4 Módulo de Estabilidad ....................................................................................... 11

1.2.5 Sistema de Resolución de Multímeros .............................................................. 13

1.2.6 Sistema de Partición ......................................................................................... 13

1.2.7 Sistema Toxina-Antitoxina ................................................................................ 14

1.2.8 Módulo de Establecimiento ............................................................................... 15

1.2.9 Módulo de Conjugación .................................................................................... 17

2. Objetivos .............................................................................................................. 18

2.1 Objetivo General ................................................................................................... 18

2.2 Objetivos Específicos ........................................................................................... 18

3. Materiales y métodos ..................................................................................... 19

3.1 Tipo de investigación ............................................................................................. 19

3.2 Material biológico y selección de los aislamientos ................................................ 19

3.3 Esquema metodológico general ........................................................................... 20

3.4 Determinación del número, tamaño y patrón de restricción de los plásmidos

presentes en cada una de las cepas de estudio (Objetivo 1). .......................................... 21

3.4.1 Obtención del DNA plasmídico .............................................................................. 21

3.4.2 Extracción de Plásmidos con los Kits de Invitrogen e Invitek. ................................ 21

3.4.3 Extracción de plásmidos por termolísis alcalina ..................................................... 22

3.4.4 Determinación de los perfiles de restricción ........................................................... 23

3.5 Recopilación y análisis de la información disponible de elementos genéticos de

plásmidos caracterizados para el género Acinetobacter (Objetivo 2). .............................. 23

XII Caracterización de los plásmidos presentes en tres aislamientos



3.6 Determinación de la arquitectura genética de los plásmidos presentes en las cepas

objeto de estudio (Objetivo 3). ......................................................................................... 25

4. Resultados ........................................................................................................... 27

4.1 Acinetobacter baumannii AB107m ................................................................. 29

4.1.1 Extracción de DNA plasmídico ........................................................................ 29

4.1.1.1 Extracción de DNA plasmídico con kits comerciales (Invitrogen® e Invitek®) ....... 29

4.1.1.2 Extracción de plásmidos por termolísis alcalina ........................................ 30

4.1.2 Determinación del tamaño del plásmido p1ABIBUN de la cepa AB107m ........ 31

4.1.2.1 Determinación del tamaño del plásmido p1ABIBUN de la cepa AB107m

mediante análisis de restricción ....................................................................................... 32

4.1.2.1.1 Análisis de restricción con las enzimas HindIII y EcoRI ........................... 33

4.1.3 Determinación de la arquitectura genética del plásmido p1ABIBUN ................ .36

4.2 Acinetobacter nosocomialis AN28F y Acinetobacter pittii AP42F ......................... 39

4.2.1 Extracción de DNA plasmídico.......................................................................... 39

4.2.2 Determinación del tamaño de los plásmidos de las cepas A. nosocomialis

AN28F y A. pittii AP42F ................................................................................................... 40

4.2.2.1 Análisis de restricción de los plásmidos encontrados en las cepas AN28F y

AP42F………… ............................................................................................................... 40

4.3 Determinación de la arquitectura genética los plásmidos presentes en la cepa A.

nosocomialis 28F ............................................................................................................ 45

4.3.1 Determinación de la arquitectura genética del plásmido p1ANIBUN28F .......... 46





4.4 Determinación de la arquitectura genética los plásmidos presentes en la cepa A.

pittii 42F………. ............................................................................................................... 55

4.4.1 Determinación de la arquitectura genética del plásmido p1APIBUN42F ........... 56

4.4.2 Determinación de la arquitectura genética del plásmido p2APIBUN42F ........... 57

4.5 Identificación y análisis de las características de los plásmidos reportados para el

género Acinetobacter. ..................................................................................................... 59

4.5.1 Características de los a aislamientos ................................................................. 59

4.5.2 Características generales de los plásmidos ....................................................... 60

4.5.3 Elementos estructurales .................................................................................... 61

5. DISCUSIÓN .......................................................................................................... 70

6. Conclusiones y Recomendaciones ......................................................... 83

6.1 Conclusiones ...................................................................................................... 83

6.2 Recomendaciones .............................................................................................. 84

Bibliografía ............................................................................................................... 99

Contenido XIII

Lista de figuras

Figura 1-1. Mecanismos de Resistencia a antibióticos en bacterias Gram Negativas…..7

Figura 1-2. Microscopía electrónica de un pequeño plásmido bacteriano…………………8

Figura 1-3. Visión esquemática de la organización genética de un plásmido……………10

Figura 3-1. Esquema Metodológico General…………………………………………………20

Figura 3-2 Búsqueda de elementos genéticos característicos de plásmidos en los

archivos de anotación…………………………………………………………………………...26

Figura 4-1. Resultados de la extracción de DNA plasmídico de las cepas AB107m y E.

coli V517 con los kits de Invitek e Invitrogen………………………………………………….29

Figura 4-2. Resultados de la extracción de DNA plasmídico de las cepas AB107m y E.

coli V517 con los kits de Invitek e Invitrogen y Termólisis Alcalina………………………..30

Figura 4-3. Mapa de restricción del plásmido p1ABIBUN…………………………………32

Figura 4-4. Resultados de la restricción con las enzimas HindIII y EcoRI. ………………34

Figura 4-5. Valores de los parámetros obtenidos por BLAST……………………………..37

Figura 4-6. Estructura del plásmido p1ABIBUN…………………………….......................38

Figura 4-7. Resultados de la extracción de DNA plasmídico de las cepas E. coli V517,

AP42F y AN28F por Termólisis Alcalina…………………………….................................39

Figura 4-8. Módulo de Replicación……………………………...........................................61

Figura 4-9. Sistema de Partición Tipo I……………………………...................................62

Figura 4-10. Sistema de Resolución de Multímeros Tipo I…………………………….......63

Figura 4-11. Sistema Toxina-Antitoxina Tipo II…………………………….........................64

Figura 4-12. Sistema de Restricción- Modificación Tipo I y II……………………………...65

Figura 4-13. Sistema de Conjugación Tipo IV (locus tra). ……………………………..67

XIV Caracterización de los plásmidos presentes en tres aislamientos



Lista de Tablas

Tabla 4-1 Plásmidos presentes en las cepas A. baumannii 107m, A. pittii 42F y A.

nosocomialis 28F…………………………….......................................................................28

Tabla 4-2. Posiciones de corte de las enzimas de restricción en la secuencia del

plásmido p1ABIBUN……………………………..................................................................32

Tabla 4-3. Posiciones de corte de la enzima de restricción HindIII...................................33

Tabla 4-4. Posiciones de corte de la enzima de restricción EcoRI...................................33

Tabla 4-5. Fragmentos generados tras restricción del plásmido p1ABIBUN con la enzima

HindIII…………………………….........................................................................................35

Tabla 4-6. Fragmentos generados tras restricción del plásmido p1ABIBUN con la enzima

EcoRI…………………………….........................................................................................35

Tabla 4-7. Comparación de las anotaciones de las secuencias codificantes...................37

Tabla 4-8. Secuencias codificantes y productos del plásmido p1ABIBUN.......................39

Tabla 4-9. Tamaño de los plásmidos de las cepas A. nosocomialis AN28F y A. pittii

42F………………………………………………………………………………………………...41

Tabla 4-10. Enzimas con secuencia de reconocimiento en la secuencia de los plásmidos

p1ANIBUN28F, p2ANIBUN28F, p3ANIBUN28F, p4ANIBUN28F, p5ANIBUN28F y

cantidad de sitios de corte ………….………………………………………………………….41

Tabla 4-11. Enzimas con secuencia de reconocimiento en la secuencia de los plásmidos

p1APIBUN42F, p2APIBUN42F y cantidad de sitios de corte………………………………42

Tabla 4-12. Arquitectura genética de los plásmidos presentes en las cepa A.

nosocomialis AN28F………….………………………….…………………………………….43

Tabla 4-13. Arquitectura genética de los plásmidos presentes en las cepa A. pittii 42F..53

Tabla 4-14 Distribución Geográfica de los asilamientos a nivel mundial……….…………58

Contenido XV

Tabla 4-15. Elementos del módulo de replicación……….………………………………….60

Tabla 4-16. Elementos del sistema de partición……….…………………………………….62

Tabla 4-17. Elementos del Sistema de Resolución de Multímeros……….……………….63

Tabla 4-18. Elementos del Sistema toxina-antitoxina……….………………………………64

Tabla 4-19. Elementos del Sistema restricción-metilación……….………………………...65

Tabla 4-20. Elementos genéticos asociados con resistencia a antibióticos……….……...68

Tabla 4-21. Elementos genéticos asociados con resistencia a compuestos químicos….71

XVI Caracterización de los plásmidos presentes en tres aislamientos



Lista de símbolos y abreviaturas

Abreviatura Término

DNA Ácido desoxirribonucleico

RNA Ácido ribonucleico

AB107m Acinetobacter baumannii 107m

AN28F Acinetobacter nosocomialis 28F

AP42F Acinetobacter pittii 42F

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

NCBI National Center for Biotechnology Information

GC Guanina, Citosina (nucleótidos)

AT Adenina-Timina (nucleótidos)

EMA Enzimas modificadoras de aminoglicósidos

RM Restricción-Modificación

PCR Reacción en cadena de la polimerasa

rpm Revoluciones por minuto

SDS Dodecilsulfato sódico

NaOH Hidróxido de sodio

TBE Buffer Tris/Borato/EDTA

Agua HPLC Agua Ultrapura

COG Clusters of Orthologous Groups of Genes

CDS Secuencias codificantes

pb/Kb Pares de base/kilo bases

°C Grados Celsius

pH Potencial de Hidrógeno

Introducción

Según reportes realizados por la Organización Mundial de la Salud, las infecciones

asociadas al cuidado de la salud constituyen una de las principales causas de muerte y

aumento de la morbilidad en pacientes hospitalizados (Ducel & Fabry, 2003); resultados

obtenidos por el programa de vigilancia epidemiológica SENTRY en América Latina,

evidencian que Acinetobacter spp. es agente etiológico de infecciones intrahospitalarias

con una frecuencia de 2 a 10 veces mayor que en Canadá o Estados Unidos (Sader et

al., 2004; Suárez et al., 2006).

Ciertas especies del género Acinetobacter han sido identificadas como patógenos

humanos oportunistas que afectan principalmente a pacientes inmunocomprometidos

causando complicaciones clínicas como neumonía, bacteremia, meningitis, infecciones

del tracto urinario, entre otras. El patógeno más prevalente es Acinetobacter baumannii,

aunque también se han informado infecciones causadas por las especies que pertenecen

al denominado complejo Acinetobacter calcoaceticus - baumannii (Fondi et al., 2010;

Adams et al., 2008; Pardesi et al. 2007).

En centros hospitalarios a nivel mundial se ha reportado que más de dos tercios de los

aislamientos de A. baumannii obtenidos, son resistentes al menos a tres clases

diferentes de antibióticos (Adams et al., 2010). Además los programas globales de

vigilancia epidemiológica que se han desarrollado en la última década, evidencian un

aumento sin precedentes en las tasas de resistencia en los aislamientos clínicos de

Acinetobacter spp. (Fondi et al., 2010; Pardesi et al. 2007, Adams et al., 2008).

Aunque los fenómenos de resistencia pueden ser producidos por mutaciones en el DNA

cromosomal, la diseminación de genes de resistencia en bacterias Gram negativas ha

sido atribuida en gran parte al intercambio de DNA, siendo el principal mecanismo la

transferencia horizontal de genes mediada por plásmidos. Los plásmidos pueden ser

portadores de genes de resistencia a diversas clases de antibióticos entre ellos: Beta-

lactámicos, aminoglicósidos, tetraciclinas, cloranfenicol, sulfonamidas, macrólidos,

2 Introducción

quinolonas y carbapenémicos (Carattoli, 2013; Adams et al., 2010; Alekshun & Levy

2007; Zarilli et al., 2008).

En el caso de Acinetobacter spp. se ha reportado un incremento en la resistencia a

antibióticos debido a la coexistencia de secuencias de inserción, islas de resistencia y

plásmidos (Zhou et al., 2011), siendo estos últimos los principales transportadores de

genes que codifican para metalo beta-lactamasas y beta-lactamasas tipo OXA las cuales

confieren resistencia a carbapenémicos (Zarilli, et al., 2008; Carattoli, 2009), además de

genes que conceden resistencia a aminoglicósidos y quinolonas (Zhou et al., 2011).

La mayoría de los plásmidos contienen un conjunto de genes que permanece

relativamente estable durante largos periodos evolutivos; la identificación y

caracterización de estos cobra gran relevancia ya que permite conocer su fisiología,

además establecer modelos y posibles rutas de transmisión de genes, entre ellos genes

de resistencia (Carattoli, 2013; Garcillán-Barcia et al., 2011; Bennettt, 2007). Por otra

parte, resulta una herramienta útil para comprender la dinámica evolutiva de este género,

debido a los frecuentes intercambios genéticos entre sus miembros (Fondi et al., 2010).

Considerando la importancia que ha adquirido Acinetobacter spp. a nivel mundial, dada

su condición multirresistente, es preocupante que en Colombia no se tenga información

suficiente respecto a la implicación de la transferencia horizontal de genes en este

fenómeno.

En investigaciones previas realizadas por el grupo de Epidemiología Molecular de la

Infección Intrahospitalaria de la Universidad Nacional de Colombia, durante el periodo de

2005 a 2009, se obtuvieron 189 aislamientos clínicos de Acinetobacter spp. en cuatro

hospitales de alta complejidad de la ciudad de Bogotá (Hernández, et al.,2011). Dadas

las características microbiológicas, fenotípicas y genéticas de los aislamientos

caracterizados se seleccionaron las cepas Acinetobacter baumannii 107m, Acinetobacter

pitti 42F y Acinetobacter nosocomialis 28F para realizar la secuenciación de sus

genomas.

En este estudio se planteó la caracterización de los plásmidos presentes en dichas

cepas, a través de análisis in vitro los cuales permitieron determinar la cantidad y tamaño

Introducción 3

de los plásmidos presentes en cada cepa y análisis in silico de las secuencias de DNA

total, que permitieron determinar la arquitectura genética de estos y su relación con los

plásmidos reportados previamente para el género Acinetobacter.

Los resultados obtenidos por medio de esta investigación aportaron información valiosa

que permitió comprender la importancia de la presencia de DNA plasmídico en estas

cepas, además constituyen una base para que en futuras investigaciones se diseñen

estrategias dirigidas a controlar la diseminación de genes de resistencia a través de este

mecanismo.

1. Marco teórico

1.1 Generalidades de Acinetobacter spp.

1.1.1 Características microbiológicas

El género Acinetobacter está conformado por un grupo de bacilos Gram negativos,

aerobios, inmóviles, no fermentadores, oxidasa negativa y catalasa positiva con un

contenido de G-C entre 39 y 47% (Pardesi et al., 2007); crecen en un amplio rango de

temperaturas y pH (Perez et al., 2007). Se caracterizan por ser microorganismos ubicuos,

ya que poseen una gran diversidad metabólica; se han recuperado de suelos, agua,

animales y del ser humano, haciendo parte de la flora normal y también como patógeno

(Fournier & Richer, 2006; Fondi et al., 2010).

1.1.2 Taxonomía

La taxonomía de este género ha sido modificada significativamente en las últimas

décadas. El género Acinetobacter pertenece a la familia Moraxellaceae, aunque

previamente fue clasificado dentro de la familia Neisseriaceae (Nemec et al., 2011;

Fournier & Richer, 2006).

Análisis basados en la hibridación de DNA han permitido la identificación de 33 especies

genómicas distintas, 17 de estas han sido validadas oficialmente: A. baumannii, A.

calcoaceticus, A. haemolyticus, A. johnsonii, A. iwoffii entre otras (Fournier & Richer,

2006). Por otra parte se encuentran 9 especies genómicas aún sin nombre, denominadas

6, 13BJ, 14BJ, 15TU, 16, 17, las genomoespecies 3 y 13TU fueron identificadas

recientemente como A. pittii y A. nosocomialis respectivamente (Nemec et al., 2011).

1.1.3 Patogenicidad

Ciertas especies del género Acinetobacter son consideradas patógenos humanos

oportunistas, que afectan principalmente a pacientes inmunocomprometidos causando

6 Caracterización de los plásmidos presentes en tres aislamientos



infecciones asociadas a procedimientos invasivos. Dentro de estas se encuentran

principalmente: Neumonía asociada a ventiladores, infecciones de tracto urinario y

bacteremia; con menor frecuencia se presentan infecciones abdominales, cutáneas, de

tejidos blandos y del sistema nervioso central (Perez et al., 2007; Fournier & Richer,

2006). La capacidad de Acinetobacter de colonizar y sobrevivir en las superficies

medioambientales, así como su resistencia a la desecación, se relacionan directamente

con la transmisión del microorganismo durante los brotes hospitalarios (Diomedi, 2005;

Fournier & Richer, 2006).

1.1.4 Resistencia a Antibióticos

Más allá de sus características de virulencia, el principal peligro asociado al género

Acinetobacter reside en su capacidad de adquirir genes de resistencia a antibióticos,

dando lugar a la aparición de cepas multirresistentes; razón por la cual las infecciones

causadas por este microorganismo se han convertido en un problema de salud pública a

nivel mundial. (Fournier & Richer, 2006). Existen reportes de cepas multirresistentes de

Acinetobacter baumannii en hospitales de Europa, Norte América, Argentina, Brasil,

China, Taiwan, Hong Kong, Japón y Korea, entre otros (Perez et al., 2007; Diomedi,

2005; Zhou et al., 2012; Towner et al., 2011; Bertini et al., 2010)

Se ha demostrado que son varios los factores implicados en el desarrollo de la

multirresistencia, incluyendo la adquisición de elementos genéticos móviles como

transposones, integrones y plásmidos, además de la capacidad de captar DNA foráneo

característica de este género, ya que se consideran transformantes naturales (Fournier &

Richer, 2006).

Los mecanismos de resistencia a antibióticos se clasifican como mecanismos no

enzimáticos y enzimáticos. Los mecanismos no enzimáticos incluyen modificaciones a la

estructura celular que impiden la unión o reconocimiento del antibiótico al sitio blanco.

Entre estas modificaciones se encuentran cambios en las proteínas de unión a

penicilinas (PBPs); alteraciones en el número y estructura de las porinas, lo cual se

traduce en una disminución de la permeabilidad de la membrana externa a los

antibióticos y la actividad de bombas de eflujo que permiten la captación del antibiótico

en el espacio periplásmico y su posterior expulsión al medio. Estos mecanismos

Capítulo 1 7

confieren resistencia principalmente a antibióticos beta-lactámicos y tetraciclinas (Pérez

et al., 2007; Tafur et al., 2008). Modificaciones en la estructura secundaria de la DNA

girasa o mutaciones en los genes gyrA y parC producen resistencia a quinolonas.

Modificaciones en el lipopolisacárido tales como acidificación, acilación o presencia de

antígenos que interfieran con la unión del antibiótico a la membrana celular generan

resistencia a polimixinas (Pérez et al., 2007; Tafur et al., 2008).

Por otra parte, se encuentran los mecanismos de resistencia enzimáticos, los cuales

radican en la degradación del antibiótico por acción de enzimas específicas. Dentro de

las enzimas producidas por Acinetobacter se encuentran principalmente las beta-

lactamasas, las cuales degradan diversos tipos de antibióticos beta-lactámicos y se han

clasificado en cuatro grupos: Beta-lactamasas de Espectro Extendido BLEE (clase A),

metalobeta-lactamasas (clase B), cefalosporinasas (clase C) y oxacilinasas (clase D)

(Pérez et al., 2007; Tafur et al., 2008). Los mecanismos implicados en la resistencia a

aminoglicósidos, están mediados por enzimas modificadoras (EMA), las cuales incluyen:

Aminoglicósido fosfotransferasas, aminoglicósido acetiltransferasas y aminoglicósido

nucleotidiltransferasas. Están principalmente codificadas en plásmidos y se asocian con

elementos transponibles (Pérez et al. 2007; Tafur et al., 2008).

En la figura 1-1, se observan algunos de los principales mecanismos de resistencia a

antibióticos presentes en bacterias Gram negativas, que incluyen: Pérdida de porinas,

presencia de beta-lactamasas, aumento en la expresión de bombas de eflujo, enzimas

modificadoras de antibióticos, modificaciones ribosomales, mecanismos metabólicos y

mutación en el lipopolisacárido (Peleg & Hooper, 2010).

Figura 1-1. Mecanismos de Resistencia a antibióticos en bacterias Gram Negativas. Tomado de: Peleg & Hooper, 2010.




1.2 Plásmidos

1.2.1 Generalidades de elementos genéticos móviles

Los plásmidos son moléculas de DNA de doble cadena, circulares o lineales (Figura 1-2);

cuyo tamaño varía desde 1000 pb hasta 500.000 pb o más, (Pinto et al., 2012; Zhou et

al., 2012). Estos existen independiemente del cromosoma bacteriano, poseen sistemas

que garantizan su replicación autónoma, controlan el número de copias y aseguran la

herencia estable durante el proceso de división celular, aunque en algunos casos las

funciones replicativas las proporciona la célula hospedera (Thomas, 2000; Bennett,

2007).

Por definición, los plásmidos no portan genes esenciales para la supervivencia de la

célula hospedera sin embargo, promueven la diversidad y adaptabilidad bacteriana;

estos han sido encontrados en todas las comunidades bacterianas estudiadas, aisladas

de suelos, aguas, ambientes marinos y hospitalarios; además generan fenotipos que

evolutivamente son seleccionados de forma positiva (Sorensen et al. 2005; Carattoli,

2011).

Estos funcionan como plataformas en las cuales los genes son ensamblados, arreglados

y redistribuidos; transportan una gran variedad de elementos: genes de resistencia a

antibióticos y a metales pesados, genes enzimáticos que incrementan las habilidades

nutricionales de la célula, determinantes de virulencia que permiten la invasión a

Figura 1-2. Microscopía electrónica de un pequeño plásmido bacteriano Tomado de: Bennett, 2007.

Capítulo 1 9

diferentes hospederos, mecanismos de reparación de DNA, secuencias de inserción,

transposones, entre otros. (Thomas, 2000; Bennett, 2007; Carattoli, 2011).

Investigaciones previas han demostrado que Acinetobacter baumannii al igual que otros

miembros de este género son portadores de una gran variedad de plásmidos, muchos de

los cuales han sido correlacionados con características de adaptación, patogenicidad y

resistencia. De hecho, se ha encontrado que aislamientos obtenidos de brotes

hospitalarios, difieren ampliamente en su contenido plasmídico, siendo esta una

característica que permite su clasificación (Fondi et al., 2010; Dorsey et al., 2006).

Estudios evolutivos han permitido concluir que una gran cantidad de plásmidos presentes

en cepas del género Acinetobacter, pertenecen a la familia pKLH2 la cual contiene genes

de resistencia a mercurio (mer) organizados como un operón. Esto sugiere un alto flujo

de estas moléculas por mecanismos de transferencia horizontal de genes; sin embargo,

el mecanismo específico se desconoce, ya que muchos de los plásmidos estudiados

carecen de genes de movilización (mob) o de transferencia (tra), lo cual indica la

participación de bacteriófagos en los procesos de transformación o transducción (Fondi

et al., 2010).

1.2.2 Organización genética

Los plásmidos se consideran un ''mosaico'' respecto a su composición genética, ya que

contienen tanto los genes que aseguran su replicación y segregación, como los genes

que confieren ventajas adaptativas al hospedero (Zhou et al., 2012).

La arquitectura genética de los plásmidos es más flexible que la arquitectura

cromosomal, incluso dentro de miembros de un mismo género bacteriano; dicha

flexibilidad se debe a la abundancia de elementos de transposición y secuencias de

inserción, los cuales facilitan los procesos de recombinación. Por otra parte, los

plásmidos son transferidos tanto vertical como horizontalmente, lo cual da lugar a que el

mismo plásmido pueda alojarse en diferentes contextos genómicos promoviendo la

reorganización de los genes y sus funciones (Fondi et al., 2010).

Los plásmidos tienen una estructura modular, lo cual implica que genes con funciones

asociadas se agrupan en segmentos específicos de la molécula de DNA; se sabe que




cada uno de estos módulos proviene de un origen filogenético diferente y se organizan

de forma aleatoria para conformar el plásmido completo (Garcillán-Barcia et al., 2011).

Dentro de los módulos que conforman la estructura basal de los plásmidos se

encuentran: módulo de replicación, módulo de estabilidad, módulo de establecimiento y

módulo de conjugación (Figura 1-3) (Thomas, 2000).

En el replicón se encuentran el origen de replicación y los genes que codifican para la replicación rep,

posteriormente los bloques de genes con funciones específicas son reclutados por el plásmido y se

organizan por recombinación, dentro de estos bloques se encuentran: Cop: control de número de copias,

mrs: sistema de resolución de multímeros, par: sistema de partición, psk: sistema muerte post-segregación,

tra: transferencia, trb: conjugación.

1.2.3 Módulo de Replicación Constituye la unidad básica de replicación de un plásmido, dentro de la cual se

encuentran el origen de replicación, genes estructurales que codifican para proteínas

iniciadoras específicas (Rep), elementos de control tanto positivos como negativos y

elementos terminadores (Carattoli, 2011).

El módulo de replicación determina los eventos replicativos, por ende el número de

copias del plásmido, su estabilidad en diferentes hospederos y condiciones de

crecimiento; la importancia del número de copias está relacionada con el mantenimiento

de los mismos, ya que a mayor número de copias, mayor probabilidad de replicación y

propagación (Garcillán-Barcia et al., 2011; Thomas, 2000).

Figura 1-3. Visión esquemática de la organización genética de un plásmido. Tomado de: Thomas, 2000.

Capítulo 1 11

Los replicones optimizan sus funciones con el fin de aumentar la estabilidad del DNA

plasmídico cuando este ingresa a nuevos hospederos. Existen tres grandes grupos de

replicones: Replicones theta (θ), replicones en círculo rodante y replicones de

desplazamiento de hebra. Según estudios epidemiológicos, en los plásmidos de

Proteobacterias son más frecuentes los replicones Theta (θ), mientras que en los

plásmidos de bacterias Gram positivas se observan principalmente replicones en círculo

rodante (Garcillán-Barcia et al., 2011; Thomas, 2000).

Análisis de las secuencias de plásmidos del género Acinetobacter disponibles en las

bases de datos públicas han demostrado que los replicones de estos difieren de todos

los descritos anteriormente para otros procariotas, lo cual permite concluir que este

género posee una clase de plásmidos característicos (Towner et al., 2011; Bertini et al.,

2010). Desde 2005, se dispone de una esquema de tipificación de replicones basado en

PCR multiplex, el cual ha sido aplicado para plásmidos presentes en diferentes cepas de

Acinetobacter spp.; a través de esta metodología se identificaron 17 genes de replicasas

completamente diferentes a los encontrados en plásmidos circulantes de la familia

Enterobacteriaceae (Carattoli, 2011).

Al realizar estudios in silico de 18 secuencias de plásmidos de A. baumannii disponibles

en GenBank, se identificaron 22 replicones, cada replicón incluye un origen de

replicación (ori) y los genes que codifican para la replicasa (rep). En 17 de los 22

replicones, los genes rep están precedidos por cuatro repeticiones directas

perfectamente conservadas, estas resultan análogas a los iterones encontrados en los

replicones básicos (Bertini et al., 2010). Se conocen como iterones a secuencias

repetitivas de aproximadamente 20 pb, estos han sido identificados no solo en plásmidos

de procariotas, sino también en cromosomas y fagos (Pinto et al. 2012; Chattoraj, 2000).

Los replicones controlados por iterones están organizados de forma similar, se

componen de dos unidades funcionales: el origen de replicación y los genes adyacentes

que codifican para las proteínas iniciadoras (proteínas Rep). Aproximadamente la mitad

de las secuencias del origen de replicación se encuentran cercanas a iterones; algunos

plásmidos de bajo número de copias poseen un segundo grupo de iterones fuera del

origen, lo cual aumenta la astringencia en el control de la replicación (Chattoraj, 2000).




En los plásmidos cuyo proceso de replicación es controlado por iterones, cada replicasa

se une a estos y promueve el proceso de la replicación reclutando a la proteína DnaA, lo

cual causa una fusión de la región rica en A-T creando la burbuja de replicación;

posteriormente se da la interacción con las proteínas DnaK, DnaJ y RNA polimerasa del

hospedero, requeridas para el inicio de la replicación (Chattoraj, 2000; Bertini et al., 2010;

Pinto et al., 2012).

La interacción iteron-iniciador es esencial tanto para la iniciación de la replicación como

para la inhibición de dicho proceso. La inhibición se da cuando se alcanza el número de

copias esperado o al culminar una ronda de replicación. El mecanismo de inhibición es el

handcuffing, esto se refiere al acoplamiento de varios orígenes de replicación por la unión

de iterones con iniciadores, lo cual impide su reconocimiento; el control también es

ejercido a nivel de síntesis de iniciadores y su activación por chaperonas (Chattoraj,

2000).

1.2.4 Módulo de Estabilidad

Para lograr la persistencia en la población de plásmidos de bajo número de copias, los

cuales pueden perderse con facilidad en el proceso de segregación los sistemas de

replicación y estabilidad actúan conjuntamente. En primer lugar, la replicación debe

suceder con la frecuencia adecuada, asegurando que se duplique el número de copias

en cada generación. Algunas de estas copias tienden a formar dímeros por procesos de

recombinación, estos se resuelven de manera eficiente a monómeros gracias al sistema

de resolución de multímeros. Cuando se va dar el proceso de división celular, dichos

monómeros se distribuyen homogéneamente hacia los polos de la célula por acción del

sistema de partición; en el caso de plásmidos de alto número de copias tienden a ser

distribuidos estocásticamente (Pinto et al., 2012; Sengupta & Austin, 2011).

Posterior a la división celular debido a errores inherentes al proceso, existe la posibilidad

de que un pequeño porcentaje de la población no contenga plásmidos, estas células

están sujetas al sistema muerte post segregación, el cual actuará como un sistema de

muerte celular programada. Los tres sistemas de estabilización del plásmido se agrupan

en este módulo y son esenciales para garantizar su persistencia sin embargo, ninguno

Capítulo 1 13

de ellos es universal (Pinto et al., 2012; Sengupta & Austin, 2011; Garcillán-Barcia et al.,

2011).

1.2.5 Sistema de Resolución de Multímeros

Este mecanismo está incluido en muchos plásmidos que utilizan la replicación theta, los

plásmidos que se replican por círculo rodante no requieren este mecanismo. La

necesidad de un sistema de resolución se debe a la existencia de muchas copias de

plásmidos por célula, ya que por efectos de recombinación estos pueden formar dímeros

o multímeros lo cual disminuye el número de copias disponibles para la segregación a

células hijas (Garcillán-Barcia et al., 2011; Sengupta & Austin, 2011).

Para que se dé una segregación adecuada, es importante que los multímeros sean

resueltos antes de la división celular, esto sucede por la acción de sistemas de

recombinasas sitio-específicas. Los plásmidos codifican su propio sistema de resolución,

este consiste en tres marcos de lectura abiertos que componen un operón, el cual

codifica para las recombinasas y los sitios de recombinación sobre los cuales actúan. Los

dímeros contienen dos sitios en los cuales son cortados, intercambiados y nuevamente

unidos para producir dos monómeros circulares independientes. Dos familias de

recombinasas están representadas en diversas especies de plásmidos: tirosina -

recombinasas y serina- recombinasas (Sengupta & Austin, 2011).

1.2.6 Sistema de Partición

La distribución al azar de los plásmidos de bajo número de copias aumenta la

probabilidad de pérdida en el proceso de segregación, sin embargo, el sistema de

partición asegura que cada célula hija reciba por lo menos una copia del mismo. El

sistema de partición dirige el posicionamiento activo de los plásmidos hacia los polos de

la célula previo a la división celular; este sistema produce la distribución ordenada y

uniforme de las copias de DNA plasmídico en un proceso análogo a la distribución de los

cromosomas de células eucariotas en mitosis, garantizando su persistencia en la

población (Sengupta & Austin, 2011; DeNap & Hergenrother 2005; Bignell & Thomas,

2001).




El sistema de partición está compuesto por una ATPasa o GTPasa que funcionan como

motor, una proteína de unión específica a DNA la cual funciona como adaptador y por

una secuencia similar al centrómero, sobre la cual actúan dichas proteínas. Las proteínas

generalmente son codificadas por un operón que es estrechamente autorregulado por

uno de sus productos. Si dos plásmidos presentes en la misma célula poseen diferentes

replicones pero el mismo sistema de partición, esto genera incompatibilidad, razón por la

cual uno de ellos se perderá en la próxima generación (Sengupta & Austin, 2011; Bignell

& Thomas, 2001).

Una anotación minuciosa de las secuencias codificantes encontradas en los plásmidos

de A. baumannii pACICU1, pACICU2, y p3ABAYE (los cuales están completamente

secuenciados) permitió la identificación de proteínas putativas del sistema de partición:

ParA y ParB (Bertini et al. 2010).

1.2.7 Sistema Toxina-Antitoxina

Los sistemas Toxina- Antitoxina son diversos, abundantes en todas las bacterias y se

han encontrado en algunas Archaeas sin embargo, su rol en la fisiología bacteriana no es

muy claro, precisamente debido a su redundancia. Este fue descubierto en plásmidos

siendo responsable de la muerte post- segregación, como sistema de estabilidad no es

usado con frecuencia ya que genera un alto costo energético para el hospedero (Kasari

et al., 2013).

Este sistema se encuentra codificado tanto a nivel plasmídico como a nivel cromosomal;

elimina las células que han perdido el plásmido por errores en la replicación o en la

segregación, su actividad ha sido descrita como muerte celular programada comparable

con la apoptosis en eucariotas. Actúa inhibiendo procesos celulares esenciales como la

replicación, traducción, biosíntesis de ATP y de la pared celular (Jurénaité et al., 2013).

Básicamente consiste en una toxina estable y una antitoxina inestable, ambos

componentes usualmente forman un complejo en el cual la antitoxina bloquea la actividad

de la toxina cuando el plásmido está presente en la célula; pero cuando este se pierde la

antitoxina es degradada rápidamente y la toxina ataca funciones vitales deteniendo el

Capítulo 1 15

crecimiento celular hasta producir un estado de latencia, bajo algunas circunstancias el

efecto puede ser irreversible y producir a la muerte celular (Kasari et al., 2013; Sengupta

& Austin, 2011; DeNap & Hergenrother, 2005).

Los sistemas toxina antitoxina son clasificados en cinco tipos de acuerdo a la interacción

entre sus componentes y la naturaleza de la antitoxina. En todos los casos las toxinas

son proteínas, las antitoxinas pueden ser RNA (Tipos I y III) o proteína (Tipos II, IV y V).

En los sistemas Tipo I la antitoxina suprime la toxina por unión a su mRNA, en los tipos II

y III la toxina es neutralizada por la unión directa de la antitoxina, en los tipo IV la

antitoxina modifica y protege el blanco de la toxina, mientras que en los tipo V la toxina

es una RNAsa que cliva el mRNA de la toxina (Sengupta & Austin, 2011; Jurénaité et al.,

2013).

La información respecto a la presencia, diversidad y rol de los sistemas Toxina-Antitoxina

en la fisiología y patogenicidad de A. baumannii es escasa; se sabe que en todos los

casos inhiben la traducción y causan la degradación de RNA en diferentes niveles. Tres

de los sistemas descritos recientemente son homólogos a los sistemas HigBA, Sp1TA y

RelBE, de E. coli (Jurénaité et al., 2013).

1.2.8 Módulo de Establecimiento

Esta región, la cual contiene el sistema restricción- modificación (RM) no resulta esencial

para el mantenimiento de los plásmidos bajo condiciones de laboratorio, pero se

considera indispensable para la supervivencia de estos en la naturaleza. En general, este

módulo se localiza en la región líder conjugativa (la primera en entrar en las células

receptoras en la conjugación), contiene genes que codifican para proteínas de unión a

DNA de cadena sencilla y sistemas antiresctricción, entre otros. Se presume que estos

genes cobran importancia cuando el plásmido entra a un nuevo hospedero (Garcillán-

Barcia et al., 2011).

Existe evidencia de que los sistemas RM han experimentado un alto grado de

transferencia horizontal entre genomas, lo cual se infiere dada su homología en las

secuencias y el contenido diferencial de GC, además han sido relacionados con

elementos genéticos móviles como plásmidos, transposones e integrones. La

comparación de genomas relacionados sugiere que los sistemas RM pueden




comportarse por sí mismos como elementos móviles, causando rearreglos en el genoma

(Kobayashi, 2001).

Muchos plásmidos son portadores del sistema RM, el cual está compuesto de genes que

codifican para enzimas de restricción las cuales clivan el DNA en una secuencia

específica y una metilasa de modificación que protege el genoma del hospedero. Los

sistemas restricción-metilación actúan degradando el DNA que no ha sido modificado

(metilado) correctamente, razón por la cual funcionan como una herramienta de defensa

para las células bacterianas impidiendo la invasión por DNA foráneo (Kobayashi, 2001).

Este sistema puede actuar como un sistema de muerte post-segregación eliminando la

población celular que ha perdido el plásmido, ya que la actividad de modificación declina

antes que la actividad de restricción y la célula muere por digestión de su DNA (Sengupta

& Austin, 2011; Kobayashi, 2001). En los plásmidos pACICU1, pACICU2, p3ABAYE,

p2ABSDF y p3ABSDF de Acinetobacter baumannii cepas ACICU, AYE y SDF se han

observado proteínas putativas del sistema restricción/antirestricción incluyendo enzimas

de restricción/modificación tipo I y tipo II (Bertini et al., 2010).

1.2.9 Módulo de Conjugación

Los plásmidos transmisibles pueden ser clasificados de acuerdo a su capacidad de

movilización: Los plásmidos conjugativos contienen un conjunto completo de genes que

les permiten transferirse a sí mismos por conjugación; los plásmidos movilizables

contienen la información genética necesaria para la formación y procesamiento del

relaxosoma, pero carecen de la información requerida para establecer un evento

conjugativo (Francia et al., 2004).

Los plásmidos movilizables solo pueden transferirse cuando coexisten en una célula

donante que contiene un plásmido conjugativo por un proceso denominado conducción;

en este mecanismo de transferencia los plásmidos forman un cointegrado el cual se

transfiere y luego se resuelve (Garcillán-Barcia et al., 2011; Francia et al., 2004).

Generalmente los plásmidos conjugativos son de bajo número de copias debido

principalmente a su tamaño, ya que replicar una secuencia extensa de DNA puede

Capítulo 1 17

generar un alto costo energético para el hospedero; mientras que los movilizables son de

alto número de copias. Ambos tienen un gran impacto en la transferencia horizontal de

genes incluyendo la diseminación de genes de resistencia a antibióticos (Garcillán-Barcia

et al., 2011; Sorensen et al., 2005; Francia et al., 2004).

La conjugación bacteriana es uno de los procesos fundamentales para que se dé la

diseminación de genes en la naturaleza; en dicho proceso los plásmidos son transferidos

de una célula donante a una receptora a través del contacto directo entre ellas. Para

establecer dicho contacto es necesario el ensamblaje del sistema conjugativo codificado

en el locus tra el cual es muy similar al sistema de secreción tipo IV codificado a nivel

cromosomal, implicado en la exportación o importación de DNA en diferentes especies

bacterianas (Carattoli 2011; Francia et al., 2004).




2. Objetivos

2.1 Objetivo general

Caracterizar los plásmidos presentes en tres aislamientos multirresistentes de

Acinetobacter baumannii, Acinetobacter nosocomialis y Acinetobacter pittii obtenidos en

hospitales colombianos

2.2 Objetivos específicos

» Determinar el número, tamaño y patrones de restricción de los plásmidos de cada

una de las cepas en estudio.

» Recopilar, sistematizar y analizar la información disponible de elementos

genéticos de plásmidos caracterizados para el género Acinetobacter.

» Determinar la arquitectura genética de los plásmidos presentes en cada una de

las cepas en estudio, partiendo de las secuencias de DNA total.

3. Materiales y métodos

3.1 Tipo de investigación

Este proyecto de investigación corresponde a un estudio de tipo descriptivo, comprende

estudios moleculares y bioinformáticos, con el fin de caracterizar los plásmidos presentes

en tres aislamientos multirresistentes de Acinetobacter baumannii, Acinetobacter

nosocomialis y Acinetobacter pittii obtenidos en hospitales colombianos.

3.2 Material biológico y selección de los aislamientos

Las cepas A. baumannii AB107m y A. nosocomialis AN28F, fueron obtenidas de

hemocultivos; mientras que la cepa A. pittii AP42F se obtuvo de una secreción oro-

traqueal, las muestras fueron tomadas de pacientes con infección nosocomial en

diferentes hospitales de la ciudad de Bogotá. Estas cepas hacen parte de una colección

de 20 aislamientos obtenidos entre los años 2004 y 2009 en estudios previos realizados

por el grupo de investigación de Epidemiología Molecular de la Infección Intrahospitalaria

del Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia en cuatro

hospitales colombianos (Hernández et al., 2011).

La identificación microbiológica de estos aislamientos como especies pertenecientes al

complejo Acinetobacter calcoaceticus-baumannii fue realizada por cada uno de los

hospitales, utilizando el sistema automatizado VITEK (BioMérieux); la identificación

molecular fue realizada por el grupo de investigación mediante el análisis de

polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP-PCR) y la región

intergénica espaciadora (ITS) de los genes 16S y 23S rRNA, además se realizó la

clasificación utilizando el método de Multilocus Sequence Typing (MLST) (Hernández et

al., 2011). Dadas las características microbiológicas, fenotípicas (entre ellas la

multirresistencia) y genéticas de estas cepas, se decidió realizar la secuenciación de sus

genomas.




La secuenciación y anotación de los genomas hace parte del proyecto: “Genómica

comparativa y funcional del resistoma y del infectoma de genomoespecies del complejo

Acinetobacter calcoaceticus - baumannii, causantes de infecciones nosocomiales en

Colombia”, financiado por Colciencias y desarrollado por los Grupos de Bioinformática y

Epidemiología Molecular de la Infección Intrahospitalaria del Instituto de Biotecnología de

la Universidad Nacional de Colombia

3.3 Esquema metodológico general

Para llevar a cabo los objetivos planteados se desarrolló la siguiente metodología general

(figura 3-1).

Figura 3-1. Esquema Metodológico General

OBJETIVO 1

OBJETIVO 2

Capítulo 3 21

3.4 Determinación del número, tamaño y patrón de

restricción de los plásmidos presentes en cada una de

las cepas de estudio (Objetivo 1).

3.4.1 Obtención del DNA plasmídico

Para obtener el DNA plasmídico de cada una de las cepas de estudio se realizaron

extracciones utilizando los kits de extracción de plásmidos Purelink Quick Plasmid DNA

Miniprep de Invitrogen® e Invisorb Spin plasmid mini Two de Invitek®, además se

realizaron extracciones de DNA plasmídico utilizando la técnica de termolísis alcalina

estandarizada en el laboratorio de Epidemiología Molecular del Instituto de Biotecnología

de la Universidad Nacional de Colombia.

En todos los casos las cepas fueron cultivadas en medio Luria Bertani (LB), el cual fue

sometido a prueba de esterilidad incubándolo a 37ºC durante 15 a 17 horas (over nigth).

3.4.2 Extracción de plásmidos con los kits de Invitrogen e Invitek.

Ambos kits se basan en el método de lísis alcalina de Birboin-Dolly (1979) y en la

purificación por retención en filtros con membranas cargadas positivamente (catiónicas).

En primer lugar se realiza la lisis celular con una solución de pH alcalino, posteriormente

se realiza la precipitación del DNA cromosomal, proteínas y otros componentes celulares,

luego se procede a la retención y purificación del DNA plasmídico a través de su unión

con las membranas presentes en las columnas, finalmente se realizan lavados, la elución

y recuperación del DNA plasmídico.

1. Análisis bioinformáticos de las secuencias de DNA

total e identificación de los contigs correspondientes a

plásmidos.

2. Búsqueda de los elementos genéticos estructurales

comunes a plásmidos del género Acinetobacter (definidos en el

objetivo 2).

3. Análisis comparativo a través de alineamiento local de las secuencias

de nucleótidos de los contigs correspondientes a plásmidos

utilizando la herramienta BLASTn contra la base de datos Nucleotide

nt/nr.

OBJETIVO 3




Además de realizar la extracción del DNA plasmídico de las cepas objeto de estudio, se

realizó también la extracción de la cepa E. coli V517, la cual es utilizada como control ya

que tiene un patrón de plásmidos estable y conocido.

Para llevar a cabo el procedimiento, se inocularon 12 ml de medio Luria Bertani estéril

con una colonia de cada una de las cepas activadas recientemente de criovial, en cada

caso. Los cultivos fueron incubados a 37ºC con agitación constante de 180 rpm, durante

un periodo de 15 a 17 horas (over nigth), igualmente se procedió con la cepa control E.

coli V517. En ambos casos se realizó la extracción según las indicaciones del fabricante.

3.4.3 Extracción de plásmidos por Termolísis Alcalina

El método de Termolísis Alcalina estandarizado en el laboratorio de Epidemiología

Molecular se basa en los métodos de lisis alcalina (Birnboim & Doly, 1979) y termolísis

(Kado & Liu, 1981).

Para realizar la extracción de plásmidos utilizando el método de Termolísis Alcalina se

inocularon 25 ml de medio Luria Bertani estéril con una única colonia de cada una de las

cepas activadas recientemente de criovial; tanto de las cepas de estudio como de la cepa

control E. coli V517. En cada caso se utilizaron dos cultivos los cuales fueron incubados

a 37ºC con agitación constante de 200 rpm durante 4 horas, hasta alcanzar una densidad

óptica aproximadamente de 0,800.

La lisis celular se produce primero utilizando una solución que contiene lisozima con el fin

de romper la pared celular, posteriormente se utiliza una solución de NaOH 0,4 N y SDS

3%, en conjunto con la incubación a 60ºC provocando tanto la lísis celular como la

desnaturalización del DNA cromosomal. El DNA plasmídico es purificado por

extracciones sucesivas con fenol y finalmente se concentra por precipitación con

isopropanol y acetato de amonio 10M.

Los resultados de las extracciones se evaluaron mediante electroforesis en geles de

agarosa al 0,8% y al 1% según el caso, con bromuro de etidio (0.5µg/mL), en buffer TBE

0.5X a 5 V/cm.

Capítulo 3 23

3.4.4 Determinación de los perfiles de restricción

Para determinar los patrones de restricción de los plásmidos presentes en cada una de

las cepas, se realizó primero una restricción in silico utilizando el software CLC

Worbrench. En el caso de los plásmidos ensamblados en contigs se utilizó la herramienta

extractseq disponible en la suite EMBOSS con el fin de obtener una sola secuencia en

formato FASTA que pudiera ser procesada en el software seleccionado.

De acuerdo a las posiciones de corte, la cantidad y tamaño de los fragmentos esperados

además de la disponibilidad en el laboratorio se seleccionaron las enzimas HindIII y

EcoRI para realizar la restricción de los plásmidos.

En todos los procedimientos se utilizó el DNA de fago lambda como control de restricción

y a su vez como marcador de peso molecular, de forma general el proceso de restricción

se llevó a cabo preparando las mezclas de cada enzima con su buffer de reacción

correspondiente (buffer React 2 o buffer React 3), las cantidades fueron calculadas de

acuerdo a la concentración de DNA plasmídico obtenido en las extracciones realizadas

con kit, se utilizó agua HPLC estéril para completar los volúmenes de reacción.

Las mezclas fueron preparadas en tubos de PCR estériles en los cuales se dispusieron

en primer lugar los volúmenes correspondientes de DNA plasmídico y posteriormente se

agregó el volumen de mezcla de reacción correspondiente en cada caso.

Para realizar el proceso de restricción se utilizó termociclador programándolo tres horas a

37°C sin pre-calentamiento y posteriormente 37°C infinito, la incubación de las

reacciones comprendió un periodo entre 15 y 17 horas (over nigth).

3.5 Recopilación y análisis de la información disponible

de elementos genéticos de plásmidos caracterizados

para el género Acinetobacter (Objetivo 2).

Con el fin de identificar las características generales, estructurales y funcionales de

plásmidos reportados para el género Acinetobacter se realizó una revisión bibliográfica

en la base de datos de literatura científica PubMed (Roberts, 2001). A través de esta, se

establecieron los elementos genéticos característicos y comunes que permiten la




replicación y adecuada segregación de las secuencias de DNA plasmídico en este

género.

Posteriormente, se realizó una consulta en la base de datos GenBank de NCBI (Benson

et al., 2012) en la cual se obtuvieron los archivos de la anotación en formato GenBank de

los plásmidos que se encuentran completamente secuenciados, reportados para el

género Acinetobacter.

Los datos obtenidos fueron sistematizados en una Tabla (Anexo 1) que incluye las

siguientes características:

Características de los aislamientos:

Especie y cepa a la que corresponden.

Fuente de aislamiento (muestra).

Ubicación geográfica.

Características de los plásmidos

Tamaño.

Porcentaje de GC.

Número de genes.

Elementos genéticos que aseguran la replicación y adecuada segregación del

plásmido (posición en la secuencia, nombre del gen o de la proteína, ID del gen,

organización genética y función asociada).

Elementos genéticos que confieren ventaja adaptativa al hospedero y resultan

comunes en plásmidos de este género (posición en la secuencia, nombre del gen o de

la proteína, tamaño, ID del gen, organización genética y función asociada).

Número de identificación de la secuencia en la base de datos GenBank

Capítulo 3 25

Una vez tabulada la información, se realizó una lista en la cual se agruparon dichos

elementos genéticos de acuerdo a su función, incluyendo las variantes encontradas de

cada uno de ellos, lo cual facilita su búsqueda en los plásmidos de cada una de las cepas

objeto de estudio.

3.6 Determinación de la arquitectura genética de los

plásmidos presentes en las cepas objeto de estudio

(Objetivo 3).

Con el fin de determinar la arquitectura genética de los plásmidos presentes en las cepas

objeto de estudio, se planteó una estrategia que permite identificar los elementos

genéticos propios de plásmidos del género Acinetobacter (resultado del objetivo 2) y

realizar un análisis comparativo con las secuencias de plásmidos previamente

reportadas.

Dicha estrategia comprende los siguientes pasos:

- Búsqueda y localización de elementos genéticos comunes de plásmidos del género

Acinetobacter.

El proceso de búsqueda de los elementos genéticos de interés (resultado del objetivo 2)

se llevó a cabo en los archivos de la anotación en formato GenBank de los contigs

correspondientes a cada uno de los plásmidos. Este se realizó a través de una búsqueda

de texto simple, utilizando como referencia el nombre o nomenclatura conocida de dichos

elementos o su función asociada.

Una vez localizados los elementos genéticos, se tiene en cuenta el contig en el cual se

encuentran ubicados, la posición dentro del mismo y el grupo ortólogo al que pertenece

(COG) (Figura 3-2). Posteriormente se agrupan de acuerdo a su función para así

determinar la distancia entre elementos genéticos asociados a un mismo grupo funcional

y por ende la presencia o ausencia de sistemas completos comparando con la

información contenida en el Anexo 1.

- Análisis comparativo con las secuencias de plásmidos previamente reportadas.

Para poder realizar un análisis comparativo con las secuencias de plásmidos que se

encuentran reportadas en las bases de datos, en primer lugar se generó un archivo




multifasta que contiene las secuencias de nucleótidos de cada uno de los contigs que

conforman los plásmidos en el orden en el cual se ensamblaron.

Posteriormente se realizó un alineamiento local de las secuencias a través la

herramienta BLASTn de NCBI, utilizando como query el archivo multifasta y como base

de datos nucleotide collection (nt/nr). Una vez obtenidos los resultados del alineamiento,

se seleccionaron para su análisis los mejores hits teniendo en cuenta principalmente

parámetros como el porcentaje de cobertura, el porcentaje de identidad y el e-value.

Figura 3-2. Búsqueda de elementos genéticos característicos de plásmidos en los archivos de

anotación.

Contig

Posición y tamaño del

gen

Elemento

genético

Posición y tamaño

del gen

Elemento

genético

4. Resultados

Las cepas Acinetobacter baumannii AB107m, Acinetobacter nosocomialis AN28F y

Acinetobacter pittii AP42F, hacen parte de una colección de veinte aislamientos

obtenidos entre los años 2004 y 2009 en estudios previos realizados por el grupo de

investigación de Epidemiología Molecular de la Infección Intrahospitalaria del Instituto de

Biotecnología de la Universidad Nacional, en cuatro hospitales colombianos.

Dadas las características genotípicas, fenotípicas, el perfil de resistencia y que estas

cepas representan las tres especies de mayor importancia clínica dentro del complejo

Acinetobacter calcoaceticus-baumannii se decidió realizar la secuenciación de sus

genomas a través de metodologías de alto rendimiento. Las secuencias obtenidas fueron

ensambladas utilizando métodos de novo y mapping; los genomas ensamblados fueron

anotados por el NCBI Prokariotyc Genomes Automatic Annotation Pipeline (PGAAP) y se

realizaron ajustes manuales mediante programas de visualización y comparación.

El genoma de la cepa A. baumannii AB107m, tiene 3.954.000 pb que se ensamblaron

incialmente en 56 contigs, consta de 4.256 genes, 3.796 CDS y 57 tRNA. Posterior al

análisis de los resultados obtenidos en la secuenciación de DNA total de esta cepa se

encontró que posee un plásmido de 8.731 pb denominado p1ABIBUN, el cual fue

ensamblado completamente, la secuencia de este plásmido se encuentra reportada en la

base de datos GenBank, ID: HG380023.1.

El genoma de A. nosocomialis AN28F se ensambló en 92 contigs con 3.833.431 pb.

Presenta 3.626 genes, 54 tRNA y 3.680 CDS. Además posee 2 plásmidos reportados en

la base de datos GenBank: p1ANIBUN28F de 80.295 pb ensamblado en 17 contigs; y

p2ANIBUN28F de 277.681 pb ensamblado en 29 contigs y tres plásmidos aún no

reportados: p3ANIBUN28F de 16319 pb el cual fue ensamblado en dos contigs,

p4ANIBUN28F y p5ANIBUN28F de un solo contig cuyos tamaños son de 7118 pb y 4793

pb respectivamente.




Por su parte, el genoma de A. pittii 42F se ensambló en 72 contigs, con 3.782.611 pb,

3.611 genes, 3.665 CDS y 54 tRNA. Posee 2 plásmidos: p1APIBUN42F de 75.447 pb

ensamblado en 7 contigs y p2APIBUN42F de 233.846 pb ensamblado en 15 contigs.

En general el contenido plasmídico en las tres cepas es variable, tanto en cantidad como

en tamaño, a nivel estructural se observa que el plásmido p1ABIBUN solo presenta

módulo de replicación y no posee sistemas que aseguren su estabilidad y adecuada

segregación; mientras que los plásmidos presentes en las cepas A. pittii 42F y A.

nosocomialis 28F poseen además del módulo de replicación, módulo de estabilidad,

establecimiento y conjugación lo cual garanzatiza una mayor estabilidad del plásmido y

por ende mayor posibilidad de persistencia en la población (Tabla 4-1).

Cepa

Contenido plasmídico

A. baumannii 107m A. pittii 42F A. nosocomialis 28F

Número de plasmídos 1 2 5

Tamaño 8731 pb

75447 pb

80295 pb

277681 pb

16319 pb

233846 pb 7118 pb

4793 pb

Arquitectura Genética

Módulo de Replicación

Módulo de Replicación Módulo de Replicación

Módulo de Estabilidad Módulo de Estabilidad

Módulo de Establecimiento


Módulo de Conjugación Módulo de Conjugación

Proteínas Hipotéticas Elementos genéticos de

resistencia a:Antibióticos

Elementos genéticos de resistencia a:

Antibióticos, mercurio, arsénico, telurio,

compuestos aromáticos.

Tabla 4-1. Plásmidos presentes en las cepas A. baumannii 107m, A. pittii 42F y A. nosocomialis 28F

Capítulo 4 29

4.1 Acinetobacter baumannii AB107m

4.1.1 Extracción de DNA plasmídico

Con el fin de determinar el tamaño y los patrones de restricción del plásmido encontrado

en la cepa AB107m; se realizaron extracciones utilizando los kits comerciales de

extracción de plásmidos Purelink Quick Plasmid DNA Minipreps de Invitrogen® e

Invisorb Spin plasmid mini Two de Invitek®, además se realizó una extracción de DNA

plasmídico utilizando la técnica de termolísis alcalina.

4.1.1.1 Extracción de DNA plasmídico con kits comerciales

(Invitrogen® e Invitek®)

En la figura 4-1 se muestran los resultados de la extracción. En los pozos 1, 5 y 7 se

puede evidenciar que la cepa control E. coli V517 presenta el patrón de bandas

esperado, se observan las bandas correspondientes a los plásmidos de 2.1 kb, 2.7 kb,

3.0 kb, 4.0 kb, 5.2 kb, 5.7 kb y 7.3 kb. No se observan las bandas correspondientes a los

plasmidos de 55 kb, 100 kb y 200 kb previamente informados para esta cepa por

Pedraza & Díaz en 2002.

Figura 4-1. Resultados de la extracción de DNA plasmídico de las cepas AB107m y E. coli V517 con los kits

de Invitek® e Invitrogen®. Pozo 1: V517 kit invitrogen, Pozo 2: AB107m kit invitrogen, Pozo 3: AB107m kit

invitrogen, Pozo 4: AB107m kit invitek, Pozo 5: V517 kit invitek, Pozo 6: AB107m kit invitek, Pozo 7: V517 kit

invitek.

1 2 3 4 5 6 7

2.1 kb

2.7 kb

3.0 kb

4.0 kb

5.2 kb

5.7 kb

7.3 kb

Tam

añ

o M

ole

cu

lar




Tanto en los pozos 2 y 3 correspondientes a la extracción con el kit de Invitrogen®, como

en los pozos 4 y 6 correspondientes a la extracción con el kit de Invitek® se observa solo

una banda correspondiente al plásmido p1ABIBUN de la cepa de estudio AB107m,

ubicada en una posición un poco superior a la del plásmido de 7.3 kb de E. coli V517.

4.1.1.2 Extracción de plásmidos por Termolísis Alcalina

En la figura 4-2 se observan los resultados obtenidos al realizar la extracción utilizando el

método de termolísis alcalina en los pozos 3, 4 ,7 y 8. En los pozos 1, 2, 5 y 6 se

observan los resultados obtenidos en las extracciones con los kits comerciales

previamente mencionados.

Los resultados obtenidos tanto en las extracciones con kit como en las extracciones

utilizando el método de Termolísis Alcalina son congruentes, aunque se presentan

pequeñas diferencias en la migración electroforética. El patrón de bandas para la cepa

Figura 4-2. Resultados de la extracción de DNA plasmídico de las cepas AB107m y E. coli V517 con los kits

de Invitek® e Invitrogen® y Termolísis alcalina. Pozo 1: V517 kit invitrogen, Pozo 2: V517 kit invitek, Pozo

3: V517 Termolísis, Pozo 4: V517 Termolísis, Pozo 5: AB107m kit invitrogen, Pozo 6: AB107m kit invitek,

Pozo 7: AB107m Termolísis, Pozo 8: AB107m Termolísis.

7.3 kb 7.3 kb 7.3 kb

1 2 3 4 5 6 7 8

2.7 kb

3.0 kb

4.0 kb

5.2 kb

5.7 kb

Tam

añ

o M

ole

cu

lar

2.1 kb

7.3 kb

4.0 kb

5.2 kb

5.7 kb

5.7

kb

3.0 kb

2.1 kb

2.7 kb Tam

añ

o M

ole

cu

lar

7.3 kb

55 kb

Capítulo 4 31

control E. coli V517 es muy similar respecto a los plásmidos de menor tamaño (2.1, 2.7 y

3.0 kb).

Sin embargo, en la extracción por termolísis alcalina el plásmido de 4.0 kb se obtiene en

muy baja concentración (pozos 3 y 4), además se presenta un cambio en el

desplazamiento electroforético. De igual manera los plásmidos un poco más grnades

muestran desplazamiento electroforético mayor (así, por ejemplo el plásmido de 5,7 kb

se localizó en una posición ligeramente inferior con respecto a la posición del plásmido

de 5,2 kb obtenido por kit). El método de termolísis alcalina, permite obtener plásmidos

de mayor tamaño como el de 55 kb observado en la figura 4.2. Adicionalmente con este

procedimiento es más evidente la presencia de DNA cromosomal y la alteración del

patrón de bandeo debido a la presencia de estados conformacionales de los plásmidos.

En el caso de AB107m, los resultados de la extracción por termolísis son reproducibles

ya que el ensayo se realizó por duplicado y en diferentes ocasiones; a su vez son

similares a los resultados de las extracciones con los kits ya que se observa una única

banda; aunque su intensidad permite concluir que el rendimiento de DNA plasmídico

obtenido es menor.

4.1.2 Determinación del tamaño del plásmido p1ABIBUN de la

cepa AB107m

Para determinar el tamaño molecular del plásmido p1ABIBUN se construyó una curva de

calibración que correlaciona el logaritmo en base 10 del tamaño molecular conocido de

los plásmidos de la cepa control E. coli V517 en el eje x con el logaritmo en base 10 de

su migración electroforética en el eje y como lo indican Pedraza & Díaz, 2002 (Anexo 2).

La ecuación que se obtiene de la curva es: y = -6,855x + 8,753 y el coeficiente de

correlación es de 0,9929 lo cual indica un alto grado de correlación entre las variables. Al

reemplazar el valor de la distancia recorrida por el plásmido p1ABIBUN de la cepa

AB107m (2,4 cm) en la ecuación, el tamaño que se calcula es de 8350 pb, este resultado

es muy cercano al esperado (8731 pb) ya que solo difiere en 381 pb.




4.1.2.1 Determinación del tamaño del plásmido p1ABIBUN de la

cepa AB107m mediante análisis de restricción

Para determinar los patrones de restricción del plásmido p1ABIBUN, se realizó primero

una restricción in silico utilizando el software CLC worbrench. En la figura 4-3 se observa

el mapa de restricción del plásmido p1ABIBUN con las enzimas HindIII, EcoRI, BgII,

EcoRV, XbaI, SalI, XhoI y PstI, se observan los sitios de corte y en la Tabla 4-2 las

posiciones.

Tabla 4-2. Posiciones de corte de las enzimas de restricción en la secuencia del plásmido

p1ABIBUN

ENZIMA HindIII EcoRI BgII EcoRV XbaI SalI XhoI PstI

Posiciones de Corte

5 707 1382 4793 6760 8591 6590 8450

1328 1621 5118 7504 7857 3980 5685 6127

4091 6515

Figura 4-3. Mapa de restricción del plásmido p1ABIBUN

Capítulo 4 33

De acuerdo a las posiciones de corte, la cantidad y tamaño de los fragmentos

generados, además de la disponibilidad en el laboratorio se seleccionaron las enzimas

HindIII y EcoRI para realizar la restricción del plásmido. En las Tablas 4-3 y 4-4 se

encuentran las posiciones de corte en el plásmido p1ABIBUN y el tamaño de los

fragmentos esperados tras la restricción con cada una de ellas:

4.1.2.1.1 Análisis de restricción con las enzimas HindIII y EcoRI

En todos los procedimientos se utilizó el DNA de fago lambda como control de restricción

y a su vez como marcador de peso molecular, el control realizado a las digestiones con

las enzimas HindIII y EcoRI, evidencia que en ambos casos estas funcionaron

correctamente y el proceso fue exitoso.

En la figura 4-4 en los pozos 1 y 2 se observa que los resultados de la digestión del DNA

de fago lambda con HindIII realizada en el laboratorio son consistentes con el marcador

de peso molecular fago Lambda digerido con la enzima HindIII de Invitrogen®, se

observan la misma cantidad de fragmentos y en la misma posición; esto indica una plena

actividad de la enzima ya que se observan la cantidad de fragmentos esperados:

23130pb, 9416pb, 6557 pb, 4361 pb, 2322 pb y 2027 pb.

HindIII

Posiciones de Corte

Tamaño de los Fragmentos

5 1323 pb

1328 2652 pb

3980 111 pb

4091 4645 pb

EcoRI

Posiciones de Corte

Tamaño de los Fragmentos

707 914 pb

1621 4064 pb

5685 830 pb

6515 2995 pb

Tabla 4-3. Posiciones de corte de la

enzima de restricción HindIII.

Tabla 4-4. Posiciones de corte de la

enzima de restricción EcoRI.




En el pozo 4 de la figura 4-4 se encuentran los resultados de la restricción del DNA de

fago lambda con la enzima EcoRI, se observan los fragmentos de 21226 pb, 7421 pb,

5804 pb, y 5643pb. Además de las restricciones individuales se realizó una restricción

combinada al DNA de fago lambda, primero se realizó la restricción con la enzima HindIII

y posteriormente con la enzima EcoRI como se observa en el pozo 5 el cambio en el

patrón de bandeo es evidente, de cinco fragmentos que se observaban en la digestión

solamente con la enzima HindIII se pasó a 10 fragmentos en la digestión HindIII + EcoRI.

Figura 4-4. Resultados de la restricción con las enzimas HindIII y EcoRI. Pozo 1: Reactivo de

DNA de fago lambda digerido con HindIII Invitrogen® Pozo 2: Control de restricción DNA de fago

lambda digerido con HindIII Pozo 3: DNA plasmídico p1ABIBUN digerido con HindIII Pozo 4:

Control de restricción DNA de fago lambda digerido con EcoRI Pozo 5: DNA de fago lambda

digerido con HindIII y EcoRI Pozo 6: DNA plasmídico p1ABIBUN digerido con EcoRI Pozo 7:

DNA plasmídico p1ABIBUN sin digerir.

Tam

añ

o M

ole

cu

lar

Tam

añ

o M

ole

cu

lar

6557 pb

21226 pb

7421 pb

5804 pb

5643 pb

23130 pb

9416 pb

1 2 3 4 5 6 7

4361 pb

2322 pb

2027 pb

Capítulo 4 35

En la figura 4-4 en el pozo 3 se presentan los resultados de la restricción del plásmido

p1ABIBUN con la enzima HindIII se observan claramente tres fragmentos y en el pozo 6

se observan los resultados de la restricción con la enzima EcoRI se observan cinco

fragmentos sin embargo, dada la cercanía de los dos fragmentos superiores estos

pueden corresponder a una digestión parcial.

Para calcular con mayor exactitud los tamaños de los fragmentos y así conocer el

tamaño total del plásmido p1ABIBUN de la cepa AB107m, se construyó una curva de

calibración tomando el logaritmo en base 10 de los tamaños conocidos de los fragmentos

generados del DNA de fago lambda con las enzimas HindIII y EcoRI en el eje x y el

logaritmo en base 10 de los valores de migración electroforética de los mismos en el eje

y (Anexo 2).

Para la construcción de esta curva no se tuvieron en cuenta los fragmentos de mayor

tamaño (21 y 23 kb), como resultado se obtiene una curva de calibración cuyo coeficiente

de correlación es de 0,9919.

Tomando la ecuación de la curva y = -2,8075x + 13,713, al reemplazar valores de la

migración electroforética de los fragmentos del plásmido p1ABIBUN se obtienen los

siguientes resultados:

Tabla 4-5. Fragmentos generados tras restricción del plásmido p1ABIBUN con la enzima HindIII

Tabla 4-6. Fragmentos generados tras restricción del plásmido p1ABIBUN con la enzima EcoRI.

Fragmento Migración (cm) Tamaño (pb) calculado

1 3,25 5330

2 3,9 3127

3 5,25 1033

Total= 9490

Fragmento Migración (cm) Tamaño (pb) calculado

1 3,35 4910

2 3,75 3537

3 6 558

4 6,2 474

Total=9479




Al comparar los resultados obtenidos en análisis in silico con los obtenidos en el análisis

in vitro se observa que en la restricción con la enzima HindIII se obtuvieron los tres

fragmentos esperados (el fragmento de 111 pb es muy pequeño para ser observado en

el gel) y al realizar la sumatoria de los tamaños calculados se obtiene un total de 9490

pb, resultado que difiere en 759 pb del esperado (Tabla 4-5). En el caso de la enzima

EcoRI se observan los cuatro fragmentos esperados y al realizar la sumatoria el tamaño

total es de 9479 pb, superando por 748 pb el resultado esperado (Tabla 4-6); en ambos

casos el resultado obtenido es concordante y además es cercano al resultado esperado.

4.1.3 Determinación de la arquitectura genética del plásmido

p1ABIBUN

Análisis comparativos realizados con la secuencia de plásmidos obtenidos de cepas

multirresistentes de Acinetobacter baumannii, permitieron evidenciar que la organización

genética del plásmido p1ABIBUN es muy similar a la de los plásmidos p1BJAB0868,

p1ABTCDC0715, pAB0057 y p2ABAYE; identificados en las cepas BJAB0868,

ABTCDC0715, AB0057 y AYE, las cuales fueron aisladas de muestras clínicas

provenientes de China, Taiwan, Estados Unidos y Francia respectivamente (Zhu, et al.

2013; Chun-Chen Chen, et al. 2011; Adams, et al. 2008; Vallenet et al., 2008).

Los tamaños de estos plásmidos son muy cercanos al de la cepa AB107m (8731 pb), el

plásmido p1BJAB0868 tiene 8721 pb, el plásmido p1ABTCDC0715 8731 pb, el plásmido

pAB0057 8729 pb y el plásmido p2ABAYE 9661 pb; en todos los casos se encuentran

completamente secuenciados (Zhu, et al. 2013; Chun-Chen Chen, et al. 2011; Adams, et

al. 2008; Vallenet et al., 2008).

Al realizar un alineamiento local de la secuencia de nucleótidos del plásmido p1ABIBUN

utilizando la herramienta BLASTn de NCBI, los resultados indicaron un 100% de

cobertura de la secuencia y un 100% de identidad con las de los plásmidos p1BJAB0868,

p1ABTCDC0715, TCDC-AB0715 y pAB0057, mientras que con el plásmido p2ABAYE

muestra un 100% de identidad y un 92% en la cobertura de la secuencia. En todos los

casos el E- value es de 0.0, lo cual indica que a nivel de secuencia de nucleótidos estos

Capítulo 4 37

plásmidos son idénticos. En la figura 4-5 se observan los valores de los parámetros

obtenidos al realizar el alineamiento.

El plásmido p1ABIBUN contiene once secuencias codificantes, cuyos productos

corresponden a cinco proteínas hipotéticas, una proteína hipotética conservada, dos

proteínas de replicación, una proteína de la familia Sel1, una proteína citoplasmática

putativa y una proteína de membrana receptora dependiente de TonB (Tabla 4-8).

Al realizar la comparación de las anotaciones de las secuencias de los plásmidos

p1BJAB0868, p1ABTCDC0715, pAB0057 y p2ABAYE, obtenidas de la base de datos

GenBank, estos contienen en promedio 10 secuencias codificantes, las cuales en su

mayoría corresponden a proteínas hipotéticas, algunas de ellas conservadas; se

encuentran proteínas de la familia Sel1 y receptores de membrana. En la Tabla 4-7 se

encuentran los productos de las secuencias codificantes de cada uno de los plásmidos

mencionados

Tabla 4-7. Comparación de las anotaciones de las secuencias codificantes

PLÁSMIDO p1BJAB0868 p1ABTCDC0715 pAB0057 p2ABAYE p1ABIBUN

Proteínas Hipotéticas

7 4 6 2 5

Proteínas Conservadas

0 1 1 4 1

Proteínas Estructurales

1 Replicasa 2 Replicasas 2 Replicasas 1 Replicasa 2 Replicasas

Otras

*Proteína de la subfamilia Sel1

*Proteína receptora de membrana externa transportadora de

hierro.

*Familia repetitiva Sel1 *Proteína citoplasmática

putativa*Proteína receptora dependiente

de TonB

*Familia repetitiva Sel1 *Proteína receptora

dependiente de TonB

*Deshidrogenasa putativa *Proteína

receptora dependiente de

TonB

*Proteína receptora dependiente de TonB

*Proteína citoplasmática putativa *Familia

repetitiva Sel1

Figura 4-5. Valores de los parámetros obtenidos por BLAST




Las replicasas de los plásmidos p1ABIBUN, p1BJAB0868, p2ABAYE y pAB0057

pertenecen a la superfamilia Rep3, el proceso de replicación de estos plásmidos está

controlado por iterones (Bertini, et al., 2010). Dada la homología existente entre las

secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de las proteínas Rep, se puede presumir

que tanto la proteína, como la regulación del proceso de replicación en el plásmido

p1ABIBUN son iguales a los anteriormente descritos.

A pesar de su conservación en cepas aisladas en lugares geográficos muy distantes, no

se conocen los mecanismos de control de la segregación y estabilidad de estos

plásmidos, ya que en sus secuencias no se encuentran elementos asociados al módulo

de estabilidad o al módulo de establecimiento, tampoco poseen sistema de movilización

o conjugación, a nivel estructural solo es posible identificar las proteínas

correspondientes al módulo de replicación.

Por otra parte, dado que estas cepas son multirresistentes, era de esperarse que en los

plásmidos se encontraran algunos genes de resistencia a antibióticos sin embargo, la

ausencia de estos sugiere que todos los mecanismos de resistencia están codificados a

nivel cromosomal o en otros plásmidos. Tampoco se encuentran genes que codifiquen

para sistemas de resistencia a mercurio, hallazgo común en los plásmidos del género

Acinetobacter.

Utilizando el software CLC worbrench se diseñó el mapa estructural del plásmido

p1ABIBUN el cual se observa en la figura 4-6. En la Tabla 4-8 se relacionan las CDS con

sus respectivos productos.

Figura 4-6. Mapa estructural del plásmido p1ABIBUN

Capítulo 4 39

Tabla 4-8. Secuencias codificantes y productos del plásmido p1ABIBUN

4.2 Acinetobacter nosocomialis AN28F y Acinetobacter

pittii AP42F

4.2.1 Extracción de DNA plasmídico

La extracción de DNA plasmídico tanto de las cepas A. nosocomialis AN28F y A. pittii

AP42F se realizó por triplicado mediante la técnica de Termolísis Alcalina previamente

descrita en la metodología. En la figura 4-7 se muestran los resultados.

Figura 4-7. Resultados de la extracción de DNA plasmídico de las cepas E. coli V517, AP42F y

AN28F por Termolísis Alcalina. Pozo 1: E. coli V517, Pozo 2: AP42F, Pozo 3: AP42F, Pozo 4:

AP42F, Pozo 5: AN28F, Pozo 6: AN28F, Pozo 7: AN28F Pozo 8: E. coli V517.

CDS PRODUCTO CDS PRODUCTO

ABIBUN_P10001 Proteína hipotética conservada ABIBUN_P10007 Familia repetitiva Sel1

ABIBUN_P10002 Proteína hipotética ABIBUN_P10008 Proteína hipotética

ABIBUN_P10003 Proteína hipotética ABIBUN_P10009 Proteína putativa citoplasmática

ABIBUN_P10004 Proteína de replicación de DNA ABIBUN_P10010 Proteína receptora dependiente de TonB

ABIBUN_P10005 Proteína de replicación de DNA ABIBUN_P10011 Proteína hipotética

ABIBUN_P10006 Proteína hipotética

1 2 3 4 5 6 7 8

2.1 kb

4.0 kb

3.0 kb

2.7 kb

5.2 kb

5.7 kb

7.3 kb

55 kb 60 kb

18 kb

7.1 kb

4.7 kb

CRO

Tam

añ

o M

ole

cu

lar

Tam

añ

o M

ole

cu

lar




En primer lugar en los carriles 1 y 8 se puede observar que la cepa control E. coli V517

presenta el patrón de bandas esperado, se observan las bandas correspondientes a los

plásmidos de 2.1 kb, 2.7 kb, 3.0 kb, 4.0 kb, 5.2 kb, 5.7 kb, 7.3 kb y en la parte superior

cercana al pozo se observa la banda de 55 kb (flechas rojas).

En los carriles 2, 3 y 4 en los cuales se encuentran los productos de las extracciones de

la cepa A. pittii AP42F se observan una banda en la parte superior del gel

correspondiente a un plásmido con un tamaño estimado de 60kb y en la parte intermedia

DNA cromosomal (flecha azul).

En los carriles 5, 6 y 7 se encuentran los productos de las extracciones de la cepa A.

nososocomialis AN28F, en la parte intermedia del gel se observa una banda amplia de

DNA cromosomal y tres bandas de DNA plasmídico con tamaños moleculares estimados

en 4.7kb, 7.1 kb y 18 kb (flechas verdes).

En el resultado obtenido es posible evidenciar la reproducibilidad de la técnica, ya que en

los tres casos las cepas fueron procesadas por triplicado y los resultados son

congruentes entre sí. De igual manera en todas las extracciones se observan bandas de

que permanecen en el pozo, las cuales pueden ser debidas a DNA plasmídico o

cromosomal de gran tamaño, que no fue posible resolverlas como bandas dentro del gel

bajo las condiciones electroforéticas utlizadas.

4.2.2 Determinación del tamaño de los plásmidos de las cepas

A. nosocomialis AN28F y A. pittii AP42F

Para realizar la determinación del tamaño de los plásmidos de las cepas objeto de

estudio, al igual que en el caso de la cepa AB107m se realizó una aproximación a través

de la construcción de una curva de calibración (Anexo 2).

La ecuación que se obtiene es y = -4,2298x + 7,4989 y el coeficiente de correlación es

de 0,9785 lo cual indica una buena correlación entre las variables. Al reemplazar los

valores de las distancias recorridas por cada uno de los plásmidos de las cepas AN28F y

AP42F se obtienen los siguientes resultados:

Capítulo 4 41

4.2.2.1 Análisis de restricción de los plásmidos encontrados en

las cepas AN28F y AP42F.

Debido a la cantidad de plásmidos encontrados en las cepas A. nosocomialis AN28F y A.

pittii AP42F, a los tamaños de los mismos y a la dificultad para individualizarlos, los

análisis de restricción de dichos plásmidos se realizaron únicamente in silico obteniendo

su secuencia en formato FASTA y procesándola a través del software CLC

workbench.En la Tabla 4-10 se observan el tamaño, el número de contigs en el que

fueron ensamblados, las enzimas que tienen sitios de reconociemiento en la secuencia

de los plásmidos p1ANIBUN28F, p2ANIBUN28F, p3ANIBUN28F, p4ANIBUN28F,

p5ANIBUN28F y la cantidad de sitios de corte de cada una de ellas. En el Anexo 3

(Figuras 1 a 5) se encuentran los mapas de restricción de cada plásmido.

Plásmido p1ANIBUN28F p2ANIBUN28F p3ANIBUN28F p4ANIBUN28F p5ANIBUN28F

Tamaño 80295 pb 277681 pb 16319 pb 7118 bp 4793 bp

N° de contigs 17 28 2 1 1

Enzima Cantidad de sitios de corte

SalI 1 18 1 0 0

BamHI 4 11 1 0 0

BgIII 19 103 0 0 0

EcoRI 23 90 8 1 1

EcoRV 20 23 3 0 0

HindIII 48 150 12 1 3

PstI 9 98 0 0 1

XbaI 17 47 5 0 1

XhoI 7 20 0 0 1

SmaI 0 7 0 0 0

A. nosocomialis AN28F A. pitii AP42F

Plásmido Distancia

(cm) Tamaño

calculado (pb) Plásmido

Distancia (cm)

Tamaño calculado (pb)

p3ANIBUN28F 2,4 18520 p 1APIBUN42F 0,3 65790

p4ANIBUN28F 3 7163

p5ANIBUN28F 4 4760

Tabla 4-9. Tamaño de los plásmidos de las cepas A. nosocomialis AN28F y A. pittii 42F

Tabla 4-10. Enzimas con secuencia de reconocimiento en la secuencia de los plásmidos p1ANIBUN28F,

p2ANIBUN28F, p3ANIBUN28F, p4ANIBUN28F, p5ANIBUN28F y cantidad de sitios de corte.




Análisis de restricción del plásmido p1APIBUN42F

En la Tabla 4-11 se observan el tamaño, el número de contigs en el que fueron

ensamblados, las enzimas que tienen sitios de reconociemiento en la secuencia de los

plásmidos p1APIBUN42F, p2APIBUN42F y la cantidad de sitios de corte de cada una de

ellas. En el Anexo 3 (Figuras 6 a 8) se encuentran los mapas de restricción de cada

plásmido.

Plásmido p1APIBUN42F p2APIBUN42F

Tamaño 75447 pb 233846 pb

N° de contigs 7 15

Enzima Cantidad de sitios de corte

SalI 7 5

BamHI 2 98

BgIII 14 0

EcoRI 19 78

EcoRV 18 15

HindIII 48 156

PstI 0 91

Tabla 4-11. Enzimas con secuencia de reconocimiento en la secuencia de los plásmidos p1APIBUN42F,

p2APIBUN42F y cantidad de sitios de corte.

Capítulo 4 43

4.3 Determinación de la arquitectura genética los

plásmidos presentes en la cepa A. nosocomialis AN28F

Plásmido Características

p1ANIBUN28F p2ANIBUN28F p3ANIBUN28F p4ANIBUN28F p5ANIBUN28F

Tamaño 80295 pb 277681 pb 16319 pb 7118 pb 4793 pb


Proteína iniciadora de la replicación


Proteína iniciadora de la

replicación


Proteína iniciadora de la replicación Proteínas de unión a

DNA

Sistema toxina-antitoxina

Antitoxina No presenta elementos

del Sistema toxina-antitoxina No presenta

elementos genéticos

pertenecientes al Módulo de

establidad

Proteína del sistema de estabilidad (Toxina)

No presenta elementos genéticos

pertenecientes al Módulo de establidad

Sistema de Resolución de

Multímeros

Recombinasa Sitio-específica

Recombinasa Sitio-específica XerC/XerD Tirosina Recombinasa

Recombinasa Sitio-específica

Sistema de partición

ATPasa ParA ATPasa ParA/Regulador

ParB

No presenta elementos del sistema

de partición


Enzima de restricción- modificación tipo II

Enzima de restricción- modificación tipo I No presentan elementos genéticos pertenecientes al Módulo

de establecimiento Metilasas especifíca

de Adenina Metilasas especifíca de

Adenina y Citosina

Módulo de Conjugación

No presenta elementos genéticos

pertenecientes al Módulo de

Conjugación

Sistema de secreción tipo IV Icm/Dot

No presentan elementos genéticos pertenecientes al Módulo de Conjugación

Elementos de Movilidad

No presentan elementos de movilidad Proteína de movilización

No presenta Proteína de movilización

Módulo Adaptativo

Resistencia a mercurio Resistencia a mercurio

No presentan elementos genéticos pertenecientes al Módulo Adaptativo

Resistencia a telurio Resistencia a telurio

Resistencia a aromáticos

Resistencia a antibióticos

Tabla 4-12. Arquitectura genética de los plásmidos presentes en las cepa A. nosocomialis AN28F




En la Tabla 4-12 se encuentran consignados los elementos genéticos estructurales de los

plásmidos presentes en la cepa A. nosocomialis AN28F, los plásmidos de mayor tamaño

poseen una estructura más compleja ya que presentan elementos de todos los sistemas,

lo cual les confiere una mayor estabilidad en la población, esto compensa con el bajo

número de copias en el que se replican dado su tamaño. Además poseen elementos de

resistencia a compuestos químicos y antibióticos los cuales le confieren ventaja

adaptativa al hospedero.

Los plásmidos de menor tamaño presentan elementos del módulo de replicación y

elementos de movilidad y no poseen elementos del módulo adaptativo. Solo el plásmido

p4ANIBUN28F posee módulo de estabilidad.


p1ANIBUN28F

El plásmido p1ANIBUN28F tiene un tamaño total de 80.295 pb ensamblado en 17

contigs, contiene 95 secuencias codificantes. Empleando la estrategia de búsqueda se

logró identificar una secuencia codificante que corresponde al módulo de replicación, tres

al módulo de estabilidad, dos al módulo de establecimiento y diez al módulo adaptativo.

Elementos estructurales

Módulo de replicación: En el nodo 149 se encuentra el gen que codifica para la

proteína de replicación de DNA RepB correspondiente al COG 5527, esta es la iniciadora

de la replicación del plásmido, tiene una función similar a la de la topoisomerasa I,

pertenece a la superfamilia Rep 3 y al dominio PFAM 01051.

Al realizar un alineamiento local de la secuencia de nucleótidos de este nodo, se

encuentra un 60% de cobertura de la secuencia desde la posición 1 hasta la posición

2060 del subject y un 99% de identidad contra la secuencia del plásmido pWA3 de A.

baumannii cepa WA3. En estas posiciones se encuentran el gen estructural que codifica

Capítulo 4 45

para la proteína de replicación del plásmido RepA; en este plásmido no se encuentran

otros elementos asociados al proceso de replicación o al control del mismo.

Módulo de estabilidad: Se encuentra un elemento correspondiente al sistema de

partición, uno al sistema muerte post-segregación y uno al sistema de resolución de

multímeros; cada elemento se encuentra ubicado en un nodo diferente.

- Sistema de resolución de multímeros: El nodo 129 contiene una recombinasa

sitio-especifica de la familia serina- recombinasa la cual funciona como

resolvasa.

- Sistema de partición: En el nodo 149 se encuentra una ATPasa COG 1192, la

cual se encuentra implicada en el proceso de partición, pertenece a la familia

ParA y a la superfamilia Fer4_NifH, esta superfamilia contiene una variedad de

proteínas que comparten un dominio común de unión a ATP.

- Sistema muerte post-segregación: En el nodo 5 se encuentra una proteína

hipotética, perteneciente al COG 2161 el cual corresponde al mismo del sistema

toxina-antitoxina tipo II RelB/RelE encontrado en el plásmido p1ACICU de A.

baumannii cepa ACICU y reportado previamente en E. coli (Bertini, et al. 2010)

Módulo de establecimiento: El nodo 18 contiene los componentes del sistema

restricción – metilación. Se encuentra una enzima putativa de restricción tipo II COG1002

e inmediatamente después su correspondiente metilasa de modificación específica de

adenina COG0827, ambos componentes son homólogos a los del sistema de restricción-

modificación Eco57I de E. coli (Bertini, et al. 2010).

No se encontraron elementos asociados al módulo de conjugación o movilidad del

plásmido. En el Anexo 4 (Tabla 1) se consignan los elementos estructurales del plásmido

p1ANIBUN28F.

Módulo adaptativo: Se encontraron elementos de resistencia a mercurio, característica

propia de los plásmidos pertenecientes a la familia pKLH2 del género Acinetobacter. En

el nodo 226 se encuentra el operón que contiene los genes que codifican para las

proteínas de unión, transporte y reducción de mercurio sin embargo, no se encuentra el

regulador principal del operón merR, se encuentra el regulador débil merD.




La secuencia de nucleótido del nodo 226 alinea con un 100% de cobertura y un 99% de

identidad con la secuencia de los plásmidos pKLH204 de Acinetobacter sp. LS56-7,

pKLH207 de Acinetobacter sp. BW3, pKLH203 de Acinetobacter junii, pKLH202 de

Acinetobacter iwoffi y pKLH201 de

Acinetobacter calcoaceticus. Este segmento de la secuencia contiene los genes

pertenecientes al operón de resistencia a mercurio: merR, merT, merP, merC, merA y

merD. La alta similitud de las secuencias de este operón en plásmidos de diferentes

especies del género Acinetobacter sugiere que estos se encuentran relacionados

evolutivamente y que posiblemente han sido adquiridos por procesos de transferencia

horizontal de genes (Fondi et al., 2010).

En el nodo 218 se encuentran genes que codifican para enzimas de degradación de

compuestos aromáticos como fenol y tolueno, lo cual podría traducirse en una resistencia

a los mismos. En los nodos 129 y 130 se encuentran dos proteínas Integrales de

membrana TerC posiblemente implicadas en la resistencia a telurio. En el Anexo 4 (Tabla

2) se relacionan las secuencias codificantes correspondientes al módulo adaptativo, el

nodo en el que se encuentra, su posición y su grupo ortólogo (COG).

Elementos no estructurales

Dentro de los elementos que no se encuentran relacionados con la replicación ni el

mantenimiento del plásmido en el hospedero se encontraron distribuidos en toda la

secuencia trece elementos asociados con eventos de transposición, dos con eventos de

integración, dieciocho con funciones de catálisis, cinco con funciones de reparación,

cuatro con factores de virulencia, nueve con regulación transcripcional, una con

señalización, dos proteínas de división celular, además se encuentran cuatro proteínas

conservadas con función desconocida y veintiún proteínas hipotéticas.

Análisis comparativo

Al realizar un alineamiento local utilizando la herramienta BLASTn se observa que en

general, todos los nodos alinean con plásmidos y en la mayoría de los casos con

plásmidos aislados de diferentes cepas de A. baumannii. Los nodos 70, 93, 47, 5, 211 y

27 alinean contra diferentes fragmentos de la secuencia del plásmido p3ABAYE de la

Capítulo 4 47

cepa A. baumannii AYE, al sumar la longitud de estos fragmentos se obtiene un total de

44095 pb lo cual corresponde al 54,48% de la longitud del plásmido, esto sugiere alguna

relación filogenética de las secuencias de DNA plasmídico o algún contacto entre las dos

cepas.

En el Anexo 5 (Tabla 1) se encuentra un resumen de los resultados obtenidos en el

BLAST, en ella se observan los nodos con su respectiva longitud, los plásmidos contra

los que alinea cada uno y los porcentajes de cobertura de la secuencia e identidad.


p2ANIBUN28F

En las 225696 pb de este plásmido se encuentran 229 secuencias codificantes, a nivel

estructural se encontró que diez de ellas pertenecen al módulo de replicación, siete al

módulo de estabilidad, cinco al módulo de establecimiento, diez al módulo adaptativo y

diez están asociadas a movilidad del plásmido.


Módulo de replicación: Los nodos 65, 14, 83, 180 y 78 contienen elementos

estructurales que corresponden al módulo de replicación. Dentro de estos se encuentran

dos proteínas directamente relacionadas con el inicio de la replicación RepB y RepC

ubicadas en los nodos 65 y 180 respectivamente.

Dos helicasas pertenecen a la Superfamilia I de helicasas de DNA y RNA, la tercera

corresponde a la Superfamilia II SNF2 y por último se encuentra una helicasa putativa,

todas ellas relacionadas con procesos de replicación, recombinación y reparación de

DNA. Se encuentran dos proteínas de unión a DNA una de ellas tipo H-NS (tipo

histonas), una topoisomerasa y una proteína SecA.

Módulo de estabilidad: Los elementos del sistema de resolución de multímeros y del

sistema de partición correspondiente al módulo de estabilidad están distribuidos en los

nodos 109, 180, 137, 96, 66 y 84.




- Sistema de resolución de multímeros: En los nodos 180, 137, 96 y 84 se

encuentran cuatro recombinasas sitio-específicas del COG 1961, estas

pertenecen a la familia serina-recombinasa. Además en el nodo 109 se encuentra

una recombinasa sitio específica tipo XerC, de la familia tirosina-recombinasa.

- Sistema de partición: En el nodo 66 está el gen que codifica tanto la ATPasa ParA

como el adaptador ParB, lo cual indica que el sistema se encuentra organizado

según lo descrito. El COG 1192 de la proteína ParA es el mismo de la proteína

Soj y el COG 1475 de la proteína ParB es el mismo de la proteína Soj0, el

sistema Soj/Soj0 de Bacillus subtilis es análogo al sistema ParA/ParB de

bacterias Gram negativas (Bignell & Thomas, 2001)

- En este plásmido hay presencia de elementos pertenecientes al sistema de

muerte post-segregación.

Módulo de establecimiento: El sistema restricción- modificación de este plásmido está

conformado por proteínas del sistema restricción - modificación tipo I y tipo III. En el nodo

14 se encuentra una endonucleasa de restricción tipo III e inmediatamente después se

encuentra una metilasa específica de adenina. El nodo 76 contiene una metilasa

específica de citosina y el nodo 46 una metilasa putativa. Mientras que en el nodo 37

está ubicada una proteína hipotética que corresponde a la metiltransferasa del sistema

restricción-modificación tipo I.

Módulo de conjugación: En el nodo 14 se encuentra una proteína de transferencia por

conjugación análoga a la proteína de transferencia TrbN; inmediatamente después se

encuentra ubicada la proteína TraX, la cual permite la acetilación de las subunidades de

pilina.

En el nodo 66 se encuentran ocho proteínas putativas del sistema de secreción tipo IV

Icm/Dot, estas se encuentran relacionadas con el ensamblaje del pili y la formación del

poro sexual. Este sistema de secreción ha sido reportado previamente en Legionella

pneumophila y Coxiella burnetii (Segal, et al. 2005).

Capítulo 4 49

En el Anexo 4 (Tabla 3) se relacionan las secuencias codificantes correspondientes a los

elementos estructurales del plásmido p2ANIBUN28F, el nodo en el que se encuentra, su

posición y su grupo ortólogo (COG).

Módulo adaptativo: El nodo 109 contiene tres proteínas continuas relacionadas con

resistencia a arsénico: el regulador del operón ArsD, una ATPasa ArsA y una proteína de

membrana la cual funciona como bomba de eflujo para el arsénico, la acción conjunta de

estas tres proteínas podría traducirse en resistencia a este compuesto. En el nodo 65 se

encuentra una proteína de resistencia a telurito.

Los nodos 186, 137 y 180 contienen tres enzimas modificadoras de aminoglicósidos EMA

(fosfotransferasas) y en el nodo 86 se encuentra el gen de resistencia a carbapenémicos

bla-oxa 23.

En el Anexo 4 (Tabla 4) se relacionan las secuencias codificantes correspondientes al

módulo adaptativo, el nodo en el que se encuentra, su posición y su grupo ortólogo

(COG).



mantenimiento del plásmido se encontraron distribuidos en toda la secuencia veinticuatro

proteínas asociadas a catálisis, diez a eventos de transposición y una a eventos de

integración, una a factores de virulencia, cuatro a reguladores transcripcionales, dos a

procesos de reparación del DNA, dos a procesos de división celular, una a señalización,

una a transporte y cuatro proteínas de membrana. Además se encuentran cinco

proteínas conservadas con función desconocida y ciento treinta y dos proteínas

hipotéticas.


El análisis comparativo realizado a través de alineamientos locales, evidenció que los

nodos 65, 94, 186, 157, 51, 59, 37, 155 y 84 son similares a secuencias de diferentes

plásmidos de A. baumannii; los nodos 14, 76, 66 tienen identidad contra el fósmido 4G5

de la cepa Acinetobacter sp. NFM2; los nodos 78 y 86, alinean contra secuencias

cromosomales de A. baumannii MDR-ZJ06 y BJAB0715 respectivamente. El nodo 109

alinea contra la secuencia cromosomal de Acidovorax ebreus TPSY y el nodo 83 con la




de Pseudomonas aeruginosa PA7 .El nodo 137 es similar a un fragmento del plásmido

pSH696_117 de Salmonella enterica. En el Anexo 5 (Tabla 2) se encuentra un resumen

de los resultados obtenidos en el BLAST.


p3ANIBUN28F

El plásmido p3ANIBUN28F tiene un tamaño total de 16319 pb; contiene 19 secuencias

codificantes, de estas 3 corresponden a elementos estructurales, 2 a enzimas y 14 a

proteínas hipotéticas.


Módulo de replicación: En ambos nodos se encuentran genes que codifican para

proteínas relacionadas con la replicación del plásmido. Tanto la proteína iniciadora RepB

como la proteína putativa pertenecen a la superfamilia Rep 3, al dominio pfam 01051. El

COG 5527 las relaciona directamente con procesos de replicación, recombinación y

reparación del DNA.

No se encontraron elementos asociados a ningún sistema del módulo de estabilidad, ni al

módulo de establecimiento. El control de la segregación de este plásmido puede ser

ejercido por los sistemas codificados en los otros dos plásmidos de esta cepa.

Movilidad: En el nodo 95 se encuentra el gen que codifica para la proteína de

movilización del plásmido correspondiente a la familia MobA-MobL, estas proteínas son

esenciales para la transferencia del plásmido, aunque no le permiten establecer un

evento conjugativo, es posible que la acción de estas proteínas le permita al plásmido

movilizarse a través del sistema de secreción tipo IV Icm/Dot codificado en el plásmido

p2ANIBUN28F.

En el Anexo 4 (Tabla 5) se relacionan las secuencias codificantes correspondientes a los

elementos estructurales del plásmido p3ANIBUN28F.

Capítulo 4 51


En el alineamiento realizado utilizando la herramienta BLAST, se encuentra que el nodo

43 alinea contra un segmento de la secuencia del plásmido pD1279779 de A. baumannii

D1279779, la identidad es del 99% y la cobertura de la secuencia es del 78%, el nodo 45

alinea contra la secuencia del plásmido p2ABSDF de la cepa A. baumannii SDF. En el

Anexo 5 (Tabla 3) se encuentra un resumen de los resultados obtenidos en el BLAST.

4.3.4 Determinación de la arquitectura genética del

plásmido p4ANIBUN28F

El plásmido 4 está formado por el nodo 23, tiene un tamaño total de 7118 pb; contiene 9

secuencias codificantes, de estas 3 corresponden a elementos estructurales, una

transposasa y 5 a proteínas hipotéticas Anexo 4 (Tabla 6).


Módulo de replicación: Respecto a los elementos del módulo de replicación se

encuentra un gen que codifica para una proteína que contiene dominio de unión a DNA la

cual funciona como replicasa, la cual está relacionada con procesos de regulación

transcripcional.

Módulo de estabilidad: En este plásmido no se encuentran elementos asociados al

sistema de partición.

- Sistema de resolución de multímeros: Se encuentra un gen que codifica para una

recombinasa sitio-específicas del COG 1961, esta pertenece a la familia serina-

recombinasa funcionan como resolvasas las cuales participan en procesos de

replicación, resolución, recombinación y reparación de DNA.

- Sistema toxina-antitoxina: Está un gen que codifica una proteína asociada a la

estabilidad del plásmido perteneciente al COG 3668, este corresponde a la

proteína ParE, identificada previamente en Agrobacterium tumefaciens,

Escherichia coli O157 y Vibrio cholerae. La proteína ParE hace parte del sistema

toxina-antitoxina ParE/RelE y actúa inhibiendo la DNA girasa convirtiendo el DNA

plasmídico superenrollado en lineal.




Al realizar el análisis comparativo de la secuencia de nucleótidos de este plásmido,

utilizando la herramienta BLASTn de NCBI no se encuentran coincidencias significativas.



El plásmido 5 está formado por el nodo 30, tiene un tamaño total 4793pb; contiene 7

secuencias codificantes, de estas 3 corresponden a elementos estructurales y 4 a

proteínas hipotéticas Anexo 4 (Tabla 7).


Módulo de replicación: En la posición 1765…2703 se encuentra un gen que codifica

para una proteína de replicación de DNA perteneciente al COG 5527.

Movilidad: En la posición 1…1088 está un gen que codifica para una proteína de

movilización del plásmido correspondiente a la familia MobA-MobL.


El análisis comparativo muestra que la secuencia de nucleótidos de este plásmido tiene

un pequeño porcentaje de identidad (19%) con las secuencias de los plásmidos

p3ABSDF y pM131-6 de las cepas SDF y M131 de A. baumannii Anexo 5 (Tabla 4).

Capítulo 4 53

4.4 Determinación de la arquitectura genética los

plásmidos presentes en la cepa A. pittii 42F

Plásmido Características

p1APIBUN42F p2APIBUN42F

Tamaño 75447 pb 233846 pb


Proteína iniciadora de la replicación Proteína iniciadora de la replicación

Proteínas asociadas al proceso de replicación

Sistema toxina-antitoxina

Represor transcripcional RelB/RelE Sistema toxina-antitoxina RelB/RelE

Sistema de Resolución de Multímeros

No presenta elementos del sistema de resolución de multímeros

Recombinasa Sitio-específica XerC/XerD Tirosina Recombinasa

Sistema de partición ATPasa ParA/Regulador ParB ATPasa ParA/Regulador ParB


Endonucleasa de restricción

Enzima de restricción- modificación tipos I y III

Metilasas especifíca de Adenina y Citosina

Módulo de Conjugación

No presenta elementos genéticos pertenecientes al Módulo de Conjugación

Sistema de secreción tipo IV Icm/Dot

Elementos de Movilidad

No presentan elemetos de movilidad

Módulo Adaptativo No presenta elementos genéticos

pertenecientes al Módulo Adaptativo Elementos genéticos de resistencia a

antibióticos

La cepa A. pittii 42F contiene dos plásmidos grandes, a nivel estructural los dos

presentan módulo de replicación y módulo de estabilidad, aunque el plásmido

p1APIBUN42F no presenta sistema de resolución de multiímeros la acción de los demás

sistemas junto con el control de copias en la replicación pueden ser suficientes para

evitar errores en el proceso de segregación. El plásmido p2APIBUN42F es portador de

genes de resistencia a antibióticos y a su vez contiene sistema de secreción tipo IV, el

cual le premite establecer eventos conjugativos, lo cual facilita la diseminación de dichos

genes (Tabla 4-13).

Tabla 4-13. Arquitectura genética de los plásmidos presentes en las cepa A. pittii 42F





p1APIBUN42F

Este plásmido contiene 81 secuencias codificantes, a nivel estructural se encontró que

dos corresponden al módulo de replicación, dos al módulo de estabilidad y una al

módulo de establecimiento Anexo 4 (Tabla 8).


Módulo de replicación: En el nodo 5 se encuentra la proteína RepB COG 5527, es la

proteína iniciadora de la replicación, pertenece a la superfamilia Rep 3 y al dominio pfam

01051. En el nodo 52 se encuentra una helicasa relacionada con procesos de

replicación, recombinación y reparación de DNA.

Módulo de estabilidad: Referente al módulo de estabilidad en los nodos 5 y 91 se

encuentran los dos elementos correspondientes al sistema de partición y uno al sistema

muerte post-segregación.

- Sistema de partición: En el nodo 5 se encuentran en primer lugar el regulador

transcripcional ParB y en la posición siguiente la ATPasa ParA, lo cual indica que

el sistema está organizado según lo descrito.

- Sistema muerte post-segregación: En el nodo 91 se encuentra una proteína que

pertenece al sistema toxina-antitoxina tipo II RelB/RelE.

Módulo de establecimiento: En el nodo 109 se encuentra la exonucleasa ABC, la cual

cumple funciones de escisión y reparación.


En cuanto a elementos no estructurales se encontraron distribuidos en toda la secuencia

once elementos asociados con eventos de transposición, tres con eventos de integración,

dieciséis con funciones de catálisis, cinco con funciones de reparación, uno con factores

de virulencia, ocho con regulación transcripcional, dos con señalización, cuatro proteínas

características de fagos, tres proteínas de división celular, además se encuentra una

proteína conservada con función desconocida y veintitrés proteínas hipotéticas

Capítulo 4 55


Al realizar un análisis comparativo a través de un alineamiento local de la secuencia de

nucleótidos de cada uno de los nodos, se observa que todos alinean contra diferentes

segmentos de la secuencia del plásmido p3ABAYE de la cepa A. baumannii AYE, el

porcentaje de cobertura del alineamiento es superior al 90% en todos los casos excepto

en el nodo 52 que es de 59%, así mismo la identidad entre las secuencias es del 99 y

100% lo cual indica que posiblemente estos dos plásmidos compartan los mecanismos

de replicación y control de la segregación, Anexo 5 (Tabla 5).


plásmido p2APIBUN42F

Este plásmido contiene 238 secuencias codificantes de las cuales 43 corresponden a

elementos estructurales, 44 a elementos no estructurales y 151 proteínas hipotéticas.

Elementos estructurales Módulo de replicación: En este plásmido se encuentran trece elementos asociados al proceso de replicación; en

el nodo 26 se encuentra el gen que codifica para la proteína iniciadora de la replicación

RepC; además en los nodos 2, 27, 10, 26 y 51 se encuentran siete helicasas

pertenecientes las superfamilias I y II, dos topoisomerasas tipos I y III, dos proteínas de

unión a DNA, este conjunto de proteínas deben hacer el proceso de replicación del

plásmido mucho más eficiente ya que se hace independiente de las proteínas codificadas

por el hospedero a nivel cromosomal.

Aunque en este caso no se encuentra la proteína iniciadora RepB, la proteína RepC es

capaz de funcionar como proteína iniciadora, tanto las helicasas como las

topoisomerasas están implicadas en procesos replicación, recombinación y reparación de

DNA.

Módulo de estabilidad: En cuanto al módulo de estabilidad se encontraron elementos

correspondientes a los tres sistemas que lo conforman: partición, resolución de

multímeros y toxina-antitoxina.




- Sistema de resolución de multímeros: En los nodos 26 y 41 se encontraron se

encontraron genes que codifican para recombinasas sitio-específicas de la familia

serina- recombinasas, las cuales funcionan como resolvasas de este sistema. En

el nodo 27 se encuentra una tirosina recombinasa tipo XerC, la cual reconoce

sitios específicos del plásmido y permite la resolución de multímeros

- Sistema de partición: En el nodo 13 se encuentra el gen que codifica para la

ATPasa ParA seguida inmediatamente por el regulador transcripcional ParB, lo

cual indica que el sistema es funcional y está organizado como se ha descrito

anteriormente.

- Sistema toxina-antitoxina: En el nodo 77 se encuentran componentes del operón

RelBE del sistema toxina-antitoxina tipo II.

Módulo de establecimiento: En los nodos 2, 27 y 26 se encuentran metil transferasas

especifícas de adenina y citosina, además en el nodo 27 se ubica una endonucleasa de

restricción tipo III.

Módulo conjugativo: En el nodo 71, 13 y 51 se encuentran genes que codifican para

ocho proteínas putativas del sistema de secreción tipo IV Icm/Dot.

En la Tabla 4-28 se encuentran los elementos estructurales del plásmido p2APIBUN42F

con su posición en la secuencia y su función asociada.

Módulo adaptativo: En el nodo 90 se encuentra el gen que codifica para una beta-

lactamasa clase C que confiere resistencia a penicilinas y en el nodo 122 una beta-

lactamasa clase D que confiere resistencia a carbapenémicos.

En los nodos 149 y 26 se encuentran enzimas modificadoras que confieren resistencia a

aminoglicósidos y gentamicina Anexo 4 (Tabla 8).



mantenimiento del plásmido en el hospedero se encontraron distribuidos en toda la

secuencia trece elementos asociados con eventos de transposición, uno con eventos de

Capítulo 4 57

integración, dieciséis con funciones de catálisis, uno con funciones de reparación, uno

con factores de virulencia, un regulador transcripcional, dos proteínas de división celular,

dos lipoproteínas putativas y tres proteínas transportadoras.


Al realizar el análisis comparativo se encontró que los seis nodos que componen este

plásmido, tienen un alto grado de identidad con diferentes secuencias de plásmidos de A.

baumannii y también con secuencias de DNA cromosomal. El nodo 122 particularmente

alinea contra la secuencia del plásmido pOXA-58 de A. pitti 44551 el cual es portador del

gen de resistencia OXA 58 Anexo 5 (Tabla 6).

4.5 Identificación y análisis de las características de los

plásmidos reportados para el género Acinetobacter.

Con el objetivo de recopilar, sistematizar y analizar la información disponible de

elementos genéticos de plásmidos caracterizados para el género Acinetobacter se realizó

una búsqueda en la base de datos GenBank del NCBI en la sección Nucleotide

utilizando las palabras claves Acinetobacter plasmid.

4.5.1 Características de los aislamientos

Dicha búsqueda permitió identificar 70 aislamientos del género Acinetobacter que

contienen plásmidos, de estos 51 corresponden a la especie A. baumannii, 4 a A. pittii, 3

a A. nosocomialis, 3 a A. calcoaceticus, 2 a A. iwoffii, 1 a A. radioresistens, 1 a A. junii, 1

a A. venetianus, 1 a A. bereziniae, 1 a A. johnsonnii y 3 cepas identificadas como

Acinetobacter sp.

En cuanto a las fuentes de aislamiento de estas cepas, la mayor parte están relacionadas

con muestras provenientes de ambientes hospitalarios e infecciones asociadas al

cuidado de la salud; 21 aislamientos fueron obtenidos de diferentes muestras en brotes

hospitalarios, 9 de hemocultivos, 7 de orina, 4 de esputo, 3 de líquido cefalorraquídeo,

además se obtuvieron aislamientos de líquido ascítico, lavado broncoalveolar, secreción

endotraqueal, secreción de herida, tracto respiratorio y catéter.




Por otra parte, cuatro aislamientos fueron obtenidos de muestras ambientales: la cepa A.

venetianus fue aislada de un lago en la ciudad de Venecia, una cepa de A. junii y una de

A. calcoaceticus fueron obtenidas de muestras de suelo y la cepa A. johnsoni proviene de

una muestra de aguas residuales hospitalarias.

Respecto a la ubicación geográfica de los aislamientos a nivel mundial, se encontró que

en Norteamérica y China se obtuvieron la mayor cantidad de cepas, seguidas por Italia y

Australia. En la Tabla 4-14 se encuentra la distribución de los aislamientos de acuerdo al

país en el que fueron encontrados y la especie a la cual pertenecen.

Tabla 4-14 Distribución Geográfica de los asilamientos a nivel mundial.

CONTINENTE PAÍS CANTIDAD /ESPECIE CONTINENTE PAÍS CANTIDAD /ESPECIE

ASIA

China

7 A. baumannii NORTEAMÉRICA

Estados Unidos 19 A. baumannii

4 A. pittii Canadá 1 A. baumannii

2 A. nosocomialis

EUROPA

Alemania 1 Acinetobacter sp.

2 A. iwoffii España

3 A. baumannii

2 A. calcoaceticus 1 A. calcoaceticus

1 A. junnii Francia 2 A. baumannii

1 A. johnsonnii Italia

5 A. baumannii

1 Acinetobacter sp. 1 A. venetianus

India 2 A. baummannii Lituania 1 A. baumannii

Japón 2 A. baummannii Reino Unido 1 A. bereziniae

Irak 2 A. baummannii AFRICA Sudáfrica 1 Acinetobacter sp.

1 A. radioresistens AUSTRALIA Australia 1 Acinetobacter sp.

Libano 1 A. baumannii Malasia 2 A. baumannii

Capítulo 4 59

4.5.2 Características generales de los plásmidos

Tanto el contenido plasmídico como el tamaño de los mismos en cada cepa es variable,

la mayoría de estas contienen de uno a tres plásmidos. Sin embargo, algunas superan

esta cantidad; entre ellas la cepa M131 de Acinetobacter sp. la cual contiene 10

plásmidos siendo el de mayor tamaño de 84995 pb y el de menor tamaño de 1735 pb; la

cepa Naval 18 de A. baumannii la cual contiene 5 plásmidos siendo el de mayor tamaño

de 130660 pb y el de menor tamaño de 6078 pb y la cepa AYE también de A. baumanni

que contiene cuatro plásmidos siendo el de mayor tamaño de 94413 pb y el de menor

tamaño de 2726 pb.

De esta forma se obtiene un total de 122 plásmidos secuenciados y reportados para

diferentes cepas del género Acinetobacter, de acuerdo a la especie están distribuidos

así: 88 plásmidos de A. baumannii, 12 de Acinetobacter sp., 4 de A. pittii, 4 de A.

radioresistens, 3 de A. nosocomialis, 3 de A. calcoaceticus, 2 de A. iwoffii, 1 de A. junii, 1

de A. bereziniae y 1 de A. johnsonii.

Los porcentajes de Guanina-Citosina %GC se encuentran en un rango del 31,6% hasta

el 47% y la cantidad de genes de cada plásmido es directamente proporcional a su

tamaño.

La revisión bibliográfica y el análisis de los datos recolectados, permitió identificar los

elementos genéticos que hacen parte de la estructura basal del plásmido, además los

elementos genéticos que le confieren ventaja adaptativa al hospedero y resultan propios

en plásmidos del género Acinetobacter.

4.5.3 Elementos estructurales

Módulo de replicación: Dentro de los elementos genéticos asociados al módulo de

replicación se encontraron cuatro categorías principales: Proteínas iniciadoras de la

replicación, proteínas asociadas al proceso de replicación, proteínas de unión a DNA y

elementos de control de la replicación. En la Tabla 4-15 se observan las variantes de

cada categoría con sus respectivas denominaciones, así como el número que fueron

encontradas.




CATEGORÍA ELEMENTO GENÉTICO CANTIDAD

Proteínas iniciadoras de la replicación del

plásmido

DNA replication protein 29

Protein involved in initiation of plasmid replication (Rep3) 37

Replicase 8

DNA replication protein (HTH) 2

plasmid replicase protein 9

putative replication protein 4

putative replication protein (Rep 1) 1

Replicase family 3

Protein involved in initiation of plasmid replication 2

replication initiation protein RepA 9

repB/ DNA replication protein B 17

putative rolling circle replication protein 2

Proteínas asociadas al proceso de replicación

DNA polymerase III 18

DNA polymerase V 6

DNA-directed DNA polymerase 7

putative DNA helicase 13

DNA primase 14

Primase C terminal 1 (PriCT-1) 9

Replicative DNA helicase 3

DNA or RNA helicases of superfamily II 2

DNA ligase 4

Proteínas de unión a DNA

DNA-binding protein 16

Putative DNA binding protein 4

DNA-binding protein H-NS 7

DNA replication protein Helix-turn-helix domain 22

Elementos de control de la replicación

iteron, control of plasmid replication 5

En la categoría que más elementos se identificaron es la de proteínas iniciadoras de la

replicación, ya que para que una secuencia de DNA sea considerada como un plásmido

debe tener como mínimo la capacidad de autoreplicarse; entre ellas las más abundantes

son las replicasas pertenecientes a la familia Rep3. En cuanto a las proteínas asociadas

al proceso se encontraron DNA polimerasas, primasas, helicasas y ligasas, la más

frecuente es la DNA polimerasa III, aunque generalmente estas proteínas son codificadas

Tabla 4-15. Elementos del módulo de replicación

Capítulo 4 61

a nivel cromosomal por el hospedero, el hecho de encontrarlas incorporadas dentro de la

secuencia de DNA plasmídico revela una mayor eficiencia del proceso de replicación a

fin de garantizar una mayor estabilidad de este en la población. Entre las proteínas de

unión a DNA las HTH (Helix-Turn-Helix) son más abundantes que las proteínas H-NS

(tipo histonas).

El análisis de los elementos encontrados y su organización genética permitió establecer

un consenso de los elementos mínimos que contiene un replicón básico de un plásmido

del género Acinetobacter, siendo estos: el origen de replicación, los iterones (tres a

cuatro secuencias repetitivas perfectas o imperfectas, conservadas de aproximadamente

20pb) los cuales funcionan como control del proceso, cajas de unión a la proteína DnaA

codificada por el hospedero y el gen estructural de la replicasa con su respectivo

promotor, estos elementos muestran proximidad en la secuencia, por lo general la

proteína iniciadora de la replicación se sitúa cerca del origen y de los elementos de

control (figura 4-8).

Otra de las características presente en los plásmidos analizados es que a mayor tamaño,

mayor complejidad tiene su replicón, incorporando dentro de él proteínas de unión a DNA

y otras que participan en el proceso haciéndolo más eficaz.

Módulo de estabilidad: En el módulo de estabilidad se identificaron elementos

pertenecientes a los tres sistemas que lo componen: Sistema de partición, sistema de

resolución de multímeros y el sistema toxina-antitoxina.

Sistema de partición: Respecto al sistema de partición se encontraron elementos que

corresponden únicamente al sistema de partición tipo I, el cual está conformado por un

gen que codifica para una ATPasa (ParA) y un gen que codifica para un adaptador de

unión a DNA específico (ParB).

Figura 4-8. Módulo de Replicación




Se identificaron 30 elementos con diferentes denominaciones correspondientes a la

ATPasa ParA y 34 a la proteína de unión específica a DNA ParB (Tabla 4-16). Como se

observa en la figura 4-9 dentro de la organización genética de este sistema también fue

común encontrar un sitio de unión para el factor de interacción con el hospedero (IHF) y

repeticiones directas o inversas dentro de la secuencia de reconocimiento parS-C, sobre

la cual actúa. Estos genes se encuentran organizados y funcionan como un operón el

cual es autorregulado a nivel transcripcional por la cantidad de uno de los productos. En

los archivos de anotación analizados no se encontraron elementos de los sistemas de

partición tipo II y III.

Sistema de resolución de multímeros: En relación al sistema de resolución de

multímeros se encontraron dos componentes principales: Resolvasas y recombinasas las

cuales pertenecen tanto a la familia serina recombinasa, como a la familia tirosina

recombinasa. En total se encontraron 32 resolvasas y 23 recombinasas de las cuales 5

corresponden a la familia serina-recombinasa y 3 pertenecen a la familia tirosina-


ATPasa

ATPases involved in chromosome partitioning (ParA) 23

putative partitioning protein (ParA) 3

CobQ/CobB/MinD/ParA nucleotide binding domain protein 2

Partitioning protein 2

Proteína de Unión a DNA

ParB-like partition protein 18

putative transcriptional regulators (ParB) 12

chromosome partitioning protein ParB 4

Tabla 4-16. Elementos del sistema de partición

Figura 4-9. Sistema de partición Tipo I

Capítulo 4 63

recombinasas (Tabla 4-17). Las recombinasas XerC/XerD se han relacionado con

diseminación de genes de resistencia a carbapenémicos en diferentes plásmidos

reportados.

En la figura 4-10 se observa la organización genética del sistema de resolución de

multímeros tipo I el cual consta de tres marcos de lectura abiertos que conforman un

operón, estos codifican para resolvasas y serina o tirosina-recombinasas. Además

contiene el sitio de resolución sobre el cual actúan dichas enzimas.

Sistema toxina-antitoxina: En total se identificaron 38 elementos genéticos

correspondientes a toxinas, de las cuales 22 proteínas pertenecen a la familia Zeta toxin

y 23 antitoxinas (Tabla 4-18). Estos representan variaciones del sistema toxina-antitoxina

tipo II, en el cual ambos componentes son proteínas. Algunas toxinas de este sistema,

entre ellas RelE, YafQ, HigB y HicA corresponden a endorribonucleasas que inhiben la

síntesis proteica a través del clivaje del mRNA libre o unido a los ribosomas, mientras

que las toxinas zeta las más prevalentes dentro de los plásmidos analizados inhiben la

síntesis de la pared celular (Kasari et al., 2013).


Resolvasas

Resolvase 18

putative resolvase 3

resolvase, N-terminal domain protein PinR 11

Recombinasas

Site-specific recombinase, DNA invertase Pin-like proteins 11

Site-specific recombinase XerD 2

putative site-specific tyrosine recombinase XerC 2

tyrosine recombinase 3

Serine recombinase - resolvase 5

Tabla 4-17. Elementos del Sistema de Resolución de Multímeros

Figura 4-10. Sistema de resolución de multímeros tipo I




En la figura 4-11 se observa un ejemplo del sistema TA tipo II, el sistema RelBE de E.

coli, el cual se ha reportado en diversos plásmidos del género Acinetobacter (Bertini, et

al., 2010). Este se encuentra organizado como un operón donde en primer lugar se

encuentra el promotor, seguido de los genes que codifican para cada componente. El

complejo toxina- antitoxina se une al promotor y autorreprime la transcripción del operón

TA. En este caso, la toxina RelB es una proteína y la antitoxina RelE un péptido pequeño

susceptible a la degradación (Kasari et al., 2013).

Figura 4-11. Sistema toxina-antitoxina RelBE de E. coli

Módulo de establecimiento: El módulo de establecimiento está compuesto por dos

elementos principales: Genes que codifican para enzimas de restricción (endonucleasas)

y genes que codifican para enzimas de modificación (DNA metilasas), ambas reconocen


Toxinas

Zeta toxin family protein 22

putative RelE toxin homolog 3

Toxin YafO, type II toxin-antitoxin system 1

putative addiction module toxin component YafQ 2

putative toxin-antitoxin system, toxin component 9

putative addiction module killer protein 1

Antitoxinas

Antitoxin Phd_YefM, type II toxin-antitoxin system 2

bifunctional antitoxin/transcriptional repressor RelB 6

translation repressor RelE/RelB/StbE 2

toxin-antitoxin system, antitoxin component 10

addiction module antitoxin RelE 3

Tabla 4-18. Elementos del Sistema toxina-antitoxina

Capítulo 4 65

secuencias específicas de DNA. En los archivos de anotación analizados fue posible

identificar elementos pertenecientes a los sistemas restricción-modificación Tipos I, II y

III, siendo más abundantes los primeros (Tabla 4-19). En general, este módulo se localiza

en la región líder conjugativa (la primera en entrar en las células receptoras en la

conjugación), contiene genes que codifican para proteínas de unión a DNA de cadena

sencilla y sistemas restricción- modificación, entre otros. (Garcillán-Barcia, et al., 2011).

Tabla 4-19. Elementos del Sistema restricción-metilación

En la figura 4-12 se observan los sistemas de restricción-modificación tipo I y II, los

cuales están compuestos por genes que codifican para las endonucleasas de restricción

y genes que codifican para las metilasas de modificación con sus respectivos

promotores. Tanto los genes que codifican para las enzimas de restricción, como para las

enzimas de modificación se encuentran en un mismo segmento de la molécula de DNA.

Figura 4-12. Sistema restricción-metilación tipos I y II


Sistema restricción-Modificación tipo I

Type I site-specific restriction-modification system 15

Type I putative restriction enzyme 3

Type I restriction-modification system methyltransferase subunit 3

Sistema restricción-Modificación tipo II

type II restriction enzyme 1

Type II restriction enzyme, methylase subunits 1

Sistema restricción-Modificación tipo III

type III restriction enzyme, res subunit 4

Endonucleasas putative restriction endonuclease 2

endonuclease 2

DNA Metilasas modification methylase (Cytosine-specific methyltransferase) 3

Site-specific DNA methylase 9




Módulo de conjugación: Se encontraron en diferentes plásmidos dos locus

completos que codifican para el sistema de secreción tipo IVA y permiten la

autotransferencia de los plásmidos a través de eventos conjugativos el locus Tra y el

locus VirB. Además se identificaron diversos plásmidos que contienen genes de

movilización mobA/mobS/mobL, los cuales les permiten movilizarse cuando se

encuentran en presencia de un plásmido conjugativo.

Se identificaron catorce plásmidos que contienen el locus Tra: pABKp1, pACICU2,

p2BJAB0868, pABTJ1, p2ABTCDC0715, p1ABST2, pNaval18-74, pNaval81-67,

pOIFC143-70, pIS123-67, pABUH1-74, pA85-3, pAb-G7-2, pWCA157-71, cuyos tamaños

oscilan entre 60000 pb y 75000 pb.

Respecto al locus VirB se encontraron siete plásmidos que lo contienen: pAbNDM-1,

pNDM-AB, pAB_D499, pNDM-BJ01, pNDM-BJ02, pWCA157-53, pNDM-40-1,una

característica común de estos es que contienen el gen que codifica para la metalo-

betalactamasa Nueva Delhi que confiere resistencia a diversos grupos de antibióticos,

además su tamaño oscila entre 45000 pb y 50000 pb.

Por otra parte se encuentran los plásmidos que contienen las proteínas de movilización

MobA/MobS/MobL/MobC. Los plásmidos p1ABAYE, p1ABSDF, p2ABSDF, p3ABSDF y

pM131-4 contienen las proteínas MobS/MobL; los plásmidos pNaval18-7.0, pABUH2a-

5.6, pABUH3b-7.8, pABUH6b-10, pABUH3a-8.2, pABUH2b-5.4 y pM131-3 contienen las

proteínas MobA/MobL; los plásmidos pNaval18-5.7, pMMCU2 y pMAC contienen la

proteína de movilización MobA y los plásmidos pNaval18-6.1, pRAY*-v1, pRAY*-v2 y

pRAY*-v3 contienen la proteína MobC. Los tamaños de estos son menores se

encuentran entre 5000 pb y 25000 pb.

El locus Tra contiene el origen de transferencia y el control positivo de transferencia TraJ,

los demás genes se encuentran agrupados de acuerdo a su función: los genes traA, traB,

traE, traC,traF, traG, traH, traK, traL, traQ, traU, traV, traW codifican para la producción

de pilina y el ensamblaje del pili; los genes traB, traE, traG, traL, traP codifican para las

proteínas de membrana interna; los genes traC, traF, traH, traK, traU, traW codifican para

las proteínas de espacio periplásmico y los genes traC, traD, traI,traM, traY codifican

Capítulo 4 67

para la transferencia de DNA. Tanto el locus Tra como el locus VirB, son homólogos y se

encuentran organizados de la misma manera (figura 4-13).

Figura 4-13. Sistema de secreción tipo IV (locus tra)

Módulo adaptativo: En el módulo adaptativo se incluyeron aquellos elementos genéticos

que confieren ventaja adaptativa al hospedero, los cuales podrían traducirse en fenotipos

resistentes, bien sea a antibióticos o a compuestos químicos.

Dentro de los 122 plásmidos encontrados en la base de datos GenBank, 52 poseen

elementos genéticos asociados con resistencia a antibióticos (Tabla 4-20), entre ellos:

aminoglicósidos, carbapenémicos, beta-lactámicos, macrólidos y tetraciclinas

principalmente, siendo los dos primeros los más prevalentes. De estos, 20 plásmidos

fueron obtenidos de aislamientos provenientes de China y 2 de Japón, 14 de

aislamientos provenientes de Italia, Francia, España, Reino Unido y Lituania, tan solo 9

de aislamientos provenientes de Estados Unidos.

La resistencia a aminoglicósidos en todos los casos está relacionada con enzimas

modificadoras (EMA), principalmente aminoglicósido fosfotransferasas. Las beta-

lactamasas OXA-10, OXA-72, OXA-58, OXA-24 y OXA-23 junto con otras beta-

lactamasas clase D son responsables de la resistencia a carbapenémicos, estas fueron

detectadas en los plásmidos pABUH3a-8.2, pAB-NCGM253, pABIR, pMMCU2, pMMA2,

pABVA01, pAB-NCGM253, pAbATCC223, pAbATCC329, pAG304, pAG13TU119,

pTVICU14 y pM131-2.

La resistencia a beta-lactámicos está dada por la presencia de la beta-lactamasa Nueva

Delhi (blaNDM-1), esta se detectó en los plásmidos pNDM-BJ01, pNDM-BJ02, pNDM-

WS2, pNDM-WS1, pNDM-40-1 y pNDM-XC1 obtenidos de aislamientos provenientes de

China, en todos los casos se presenta también el gen de resistencia a aminoglicósidos

(aminoglycoside 3'-phosphotransferase) y ambos genes se encuentran continuos en la

secuencia de DNA.




En los plásmidos pMDR-ZJ06, pABIR y pNDM-AB se identificaron sistemas de eflujo para

macrólidos así como enzimas modificadoras de los mismos. En el plásmido p2ZW85 se

encontró un gen de resistencia a tetraciclina.

Ya que la resistencia a antibióticos es un fenómeno multifactorial, la presencia de genes

de resistencia en plásmidos no garantiza que los hospederos presenten un fenotipo

resistente o multirresistente. Sin embargo, su aparición en plásmidos que codifican

sistemas conjugativos o genes de movilidad se relaciona ampliamente con su

diseminación.

Plásmido Tamaño Elemento de Resistencia Característica

pACICU1 28279 pb Beta-lactamase class D OXA-58 oxacillinase (2) Resistencia a Carbapenémicos

p3ABAYE 94413 pb putative antibiotic monooxygenase Resistencia a antibióticos

p2BJAB07104 20139 pb Aminoglycoside phosphotransferase (2) Resistencia a Aminoglicósidos

pBJAB0715 52268 pb

Aminoglycoside 3'-phosphotransferase Resistencia a Aminoglicósidos

Aminoglycoside N3'-acetyltransferase Resistencia a Aminoglicósidos

Beta-lactamase class D Resistencia a Carbapenémicos

p3BJAB0868 20139 pb Aminoglycoside phosphotransferase (2) Resistencia a Aminoglicósidos

pABTJ1 77528 pb beta-lactamase class D Resistencia a Carbapenémicos

pMDR-ZJ06 20301 pb

AphA1-IAB Resistencia a Aminoglicósidos

macrolide 2'-phosphotransferase Resistencia a Macrólidos

macrolide efflux protein Resistencia a Macrólidos

streptomycin/spectinomycin adenyltransferase Resistencia a Aminoglicósidos

gentamicin 3'-acetyltransferase Resistencia a Aminoglicósidos

pAbNDM-1 48368 pb aminoglycoside 3'-phosphotransferase type 6 Resistencia a Aminoglicósidos

blaNDM-1/ metallo-beta-lactamase Resistencia a Beta-lactámicos

p2ZW85 113866 pb tetracycline repressor protein Resistencia a Tetraciclina

p2ABST2 21846 pb penicillin-binding protein Resistencia a Beta-lactámicos

p1ABST78 26411 pb Beta-lactamase class D Resistencia a Carbapenémicos



pNaval18-131 130660 pb APH_6_hur Resistencia a Aminoglicósidos

pNaval18-5.7 5676 pb aminoglycoside 3'-phosphotransferase Resistencia a Aminoglicósidos

pOIFC032-8.6 8604 pb antibiotic biosynthesis monooxygenase Resistencia a antibióticos

pOIFC137-122 122461 pb aphE aminoglycoside phosphotransferase Resistencia a Aminoglicósidos

pOIFC109 122469 pb aphE/aminoglycoside phosphotransferase Resistencia a Aminoglicósidos

Tabla 4-20. Elementos genéticos asociados con resistencia a antibióticos

Capítulo 4 69

pOIFC143-128 127633 pb aphE_2 aminoglycoside phosphotransferase Resistencia a Aminoglicósidos

pABUH2a-5.6 5636 pb putative beta-lactamase OXA-10 Resistencia a Carbapenémicos

pABUH1-74 74089 pb penicillin-binding protein, transpeptidase domain

protein Beta-lactamase class D Resistencia a Carbapenémicos

pABUH3a-8.2 8190 pb putative beta-lactamase OXA-10 Resistencia a Carbapenémicos

pRAY*-v1 6078 pb "aadB" aminoglycoside (2') adenyltransferase AadB

orAAD(2')-1a Resistencia a Aminoglicósidos

pRAY*-v2 8433 pb aminoglycoside (2') adenyltransferase AadB or

AAD(2') Resistencia a Aminoglicósidos

pAB-NCGM253

8970 pb blaOXA-72 Resistencia a Carbapenémicos

pABIR 29823 pb

blaOXA-58 oxacillinase Resistencia a Carbapenémicos

macrolide efflux protein Resistencia a Macrólidos

mph2 macrolide 2'-phosphotransferase Resistencia a Macrólidos

pMMD 9964 pb carbapenem-hydrolyzing oxacillinase Resistencia a Carbapenémicos

pMMCU3 8964 pb carbapenem-hydrolyzing oxacillinase Resistencia a Carbapenémicos

pMMCU2 10270 pb betalactamase OXA24 Resistencia a Carbapenémicos

pMMA2 10679 pb OXA-24 class D beta-lactamase Resistencia a Carbapenémicos

pAB120 10879 pb blaOXA-72 carbapenem-hydrolyzing oxacillinase (2) Resistencia a Carbapenémicos

pABVA01 8963 pb OXA-24 class D beta-lactamase Resistencia a Carbapenémicos

pNDM-AB 47098 pb

aphA6 aminoglycoside 3'-phosphotransferase Resistencia a Aminoglicósidos

beta-lactamase NDM-1 Resistencia a Beta-lactámicos

mph2 macrolide 2'-phosphotransferase Resistencia a Aminoglicósidos

mel macrolide efflux protein Resistencia a Macrólidos

pA85-3 86335 pb class D beta-lactamase OXA-23 Resistencia a Carbapenémicos

pAB-NCGM253

8970 pb blaOXA-72 Resistencia a Carbapenémicos

pAbATCC223 8840 pb OXA24 B-lactamase Resistencia a Carbapenémicos

pAbATCC329 8842 pb OXA24 B-lactamase Resistencia a Carbapenémicos

pAG304 5763 pb carbapenem-hydrolyzing oxacillinase OXA-58 Resistencia a Carbapenémicos

pNDM-44551 9495 pb aminoglycoside 3'-phosphotransferase Resistencia a Aminoglicósidos

New Delhi metallo-beta-lactamase 1 Resistencia a Beta-lactámicos

pAB_D499 47101 pb 3'-aminoglycoside phosphotransferase Resistencia a Aminoglicósidos

metallo-beta-lactamase NDM-1 Resistencia a Beta-lactámicos

pABCA95 6544 pb aphA6 Resistencia a Aminoglicósidos

blaNDM-1 metallo-beta-lactamase Resistencia a Beta-lactámicos

pAG13TU119 8108 pb carbapenem-hydrolyzing oxacillinase OXA-58 Resistencia a Carbapenémicos

pRAY*-v3 6078 pb aminoglycoside-2''-adenylyltransferase Resistencia a Aminoglicósidos

pTVICU14 8579 pb beta-lactamase OXA-58 Resistencia a Carbapenémicos

pRAY 6076 pb adenylyltransferase AadB Resistencia a Beta-lactámicos

pM131-2 84995 pb Aminoglycoside 3'-phosphotransferase AphA1-IAB Resistencia a Aminoglicósidos

Continuación Tabla 4-20




AraC2 aminoglycoside acetyltransferase Resistencia a Aminoglicósidos

Carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase OXA-58 Resistencia a Carbapenémicos

pNDM-BJ01 47274 pb aminoglycoside 3'-phosphotransferase Resistencia a Aminoglicósidos


pNDM-BJ02 46165 pb aminoglycoside 3'-phosphotransferase Resistencia a Aminoglicósidos


pNDM-WS2 13940 pb aminoglycoside 3'-phosphotransferase Resistencia a Aminoglicósidos

blaNDM-1metallo-beta-lactamase Resistencia a Beta-lactámicos

pNDM-WS1 13940 pb aminoglycoside 3'-phosphotransferase type 6 Resistencia a Aminoglicósidos

blaNDM-1metallo-beta-lactamase Resistencia a Beta-lactámicos

pNDM-40-1 45826 pb aminoglycoside 3'-phosphotransferase Resistencia a Aminoglicósidos

New Delhi metal-beta-lactamase enzyme Resistencia a Beta-lactámicos

pNDM-XC1 12376 pb aminoglycoside 3'-phosphotransferase Resistencia a Aminoglicósidos

NDM-1 metallo-beta-lactamase Resistencia a Beta-lactámicos

Respecto a la resistencia a compuestos químicos, se encontraron principalmente

elementos genéticos de resistencia a metales pesados y a compuestos orgánicos (Tabla

4-21). En los plásmidos pABKp1, p2ABTCDC0715, pA85-3 y pAb-G7-2 se identificaron

proteínas conservadas asociadas con la resistencia a telurito. En el plásmido pM131-6 se

encontró la proteína transportadora de cromo ChrA y la proteína de resistencia a cromo

ChrB. En el plásmido pAV3 se encontró un componente del sistema de eflujo para cobre,

zinc y cadmio.

El plásmido pAV3 además contiene un operón completo de resistencia a Arsénico, al

igual que el plásmido pWCA157-71, este operón incluye el regulador ArsR, proteínas de

resistencia a arsénico y arsenato reductasas; estos operones están asociados al

regulador del operón de resistencia a mercurio MerR, el cual también se encuentra

presente en la secuencia del plásmido pWCA157-53.

Por otra parte, los plásmidos pMAC y pM131- 3 contienen proteínas que les confieren

resistencia a peróxido de hidrógeno y el plásmido pM131-2 hidroxilasas que le permiten

resistir a compuestos orgánicos como el fenol.

Continuación Tabla 4-20

Capítulo 4 71

Plásmido Tamaño Elemento de Resistencia Característica

pABKp1 74451 pb Putative tellurique resistant protein Resistencia a Telurito

p2ABTCDC0715 70894 pb Conserved protein involved in tellurite resistance Resistencia a Telurito

pMAC 9540 pb organic hydroperoxide resistance protein Resistencia a Peróxido de Hidrógeno

pA85-3 86335 pb Conserved protein involved in tellurite resistance Resistencia a Telurito

pAb-G7-2 70100 pb conserved protein involved in tellurite resistance Resistencia a Telurito

pM131-6 7610 pb Chromate transport protein ChrA

Resistencia a Cromo Chromate resistance protein ChrB

pM131-2 84995 pb Phenol hydroxylase, p1 oxygenase component DmpL

Resistencia a Fenol Phenol hydroxylase subunit

pM131-3 9541 pb Organic hydroperoxide resistance protein Resistencia a Peróxido de Hidrógeno

Organic hydroperoxide resistancetranscriptional regulator Resistencia a Peróxido de Hidrógeno

pAV3 186446 pb

MerR family transcriptional regulator Resistencia a Mercurio

Co/Zn/Cd efflux system component Resistencia a Metales Pesados

ArsR family transcriptional regulator

Resistencia a Arsénico

arsenical resistance protein ArsH

arsenical-resistance protein

arsenate reductase

arsenic resistance protein

arsenate reductase

pWCA157-71 70570 pb

arsenic resistance protein ArsB


arsenate reductase


arsenate reductase



MerR family transcriptional regulator Resistencia a Mercurio

copper resistance protein CopD

Resistencia a Cobre

copper resistance protein C

copper-exporting ATPase

copper oxidase

copper resistance protein CopB

putative arsenical resistance protein ArsH Resistencia a Arsénico

pWCA157-53 53388 pb MerR family transcriptional regulator

Resistencia a Mercurio cation transporter

Tabla 4-21. Elementos genéticos asociados con resistencia a compuestos químicos.

5. DISCUSIÓN

Los plásmidos desempeñan un papel muy importante en la evolución de los procariotas,

ya que portan genes que confieren ventaja adaptativa a su hospedero permitiéndole

sobrevivir en diversas condiciones ambientales; están presentes en los tres dominios del

árbol de la vida (Archaea, Eukarya y Bacteria) y han sido encontrados en todas las

comunidades bacterianas estudiadas (Fondi et al., 2010; Sorensen et al., 2005).

Desde 1985, estudios del género Acinetobacter han revelado que plásmidos

pertenecientes a diferentes grupos de incompatibilidad encontrados en la familia

Enterobacteriaceae son capaces de transferirse de E. coli a bacterias de este género.

Gran cantidad de aislamientos de Acinetobacter spp. recuperados de ambientes

hospitalarios y diversos nichos ecológicos son portadores de DNA plasmídico, lo cual se

correlaciona con su adaptabilidad. A pesar del papel clave que han cumplido los

plásmidos en la dinámica evolutiva de este género, la dificultad en su obtención ha sido

una limitante para su estudio (Fondi et al., 2010; Towner et al., 2011).

Por esta razón, metodologías como la secuenciación de alto rendimiento de DNA han

cobrado gran relevancia en las últimas décadas no solo en el estudio de genomas

completos, sino también en la determinación de perfiles plasmídicos, ya que dada su

precisión permite diferenciar las secuencias que hacen parte del cromosoma bacteriano y

aquellas que pueden constituir elementos genéticos móviles (Smith, et al., 2007).

En el marco del proyecto “Genómica comparativa y funcional del resistoma y del

infectoma de genomoespecies del complejo Acinetobacter calcoaceticus - baumannii,

causantes de infecciones nosocomiales en Colombia” financiado por Colciencias, se llevó

a cabo la secuenciación y anotación del genoma completo de las cepas multirresistentes

A. baumannii 107m (AB107m), A. pitti 42F (AP42F) y A. nosocomialis 28F (AN28F). El

análisis de los resultados obtenidos permitió concluir que la cepa AB107m contiene un

plásmido de 8731 pb, la cepa AP42F contiene dos plásmidos de 233.846 pb y 75.447 pb,

por último la cepa AN28F contiene cinco plásmidos de 277.681 pb, 80.295 pb, 16319 pb,

7118 pb y 4793 pb.

Aunque existen diversidad de métodos para la obtención de DNA plasmídico, algunas

bacterias pueden ser refractarias a estos; además teniendo en cuenta que el grado de




lísis celular difiere de una cepa a otra dependiendo de factores como la composición de

la pared celular, la pigmentación y la producción de polisacáridos extracelulares, es difícil

determinar el tiempo adecuado de lísis que permita obtener plásmidos de gran tamaño

sin contaminación con DNA cromosomal, haciéndose complejo establecer con exactitud

el perfil plasmídico de una cepa ya que puede variar según el método de extracción

utilizado (Pardesi, et al.2007).

Para determinar los perfiles plasmídicos de las cepas objeto de estudio se estandarizó la

técnica de Termolísis alcalina, en la cual se combinó el uso de soluciones de lisis de pH

elevado con alta temperatura para obtener un mejor resultado. Esta técnica se basó en el

fundamento de los métodos de extracción de DNA plasmídico utilizados con mayor

frecuencia: el método de lisis alcalina de Birboin-Dolly (1979) y el método de termolísis

de Kado y Liu (1981).

En el caso de la cepa AB107m el resultado obtenido en la extracción de DNA plasmídico

corresponde a los análisis in silico, ya que se encontró un único plásmido y al calcular su

tamaño tanto por comparación con los plásmidos de la cepa control E. coli V517 como

por análisis de restricción este resulta muy aproximado ya que solo difiere en 381 pb.

Respecto a la cepa AP42F solo se obtiene un plásmido, que podría corresponder al de

75.447 pb, aunque al calcular su tamaño este resulta inferior. Por último, en el caso de la

cepa AN28F a través de la técnica estandarizada no fue posible obtener los plásmidos de

mayor tamaño (277.681 pb y 80.295 pb), mientras que los plásmidos de menor tamaño

(16319 pb, 7118 pb y 4793 pb) se obtuvieron en buena concentración.

Factores como el tamaño de los plásmidos influyen en el rendimiento obtenido en el

proceso de extracción, plásmidos superiores a las 60000 pb (plásmido F) generalmente

son de copia única, ya que replicarlos en mayor cantidad generaría un alto costo

energético para el hospedero. Siendo así, su estabilidad en la población celular

disminuye ya que existe una menor probabilidad de segregación de los mismos, por ende

llegar a un rendimiento suficiente que permita obtener individualmente plásmidos de gran

tamaño para realizar los posteriores análisis de restricción, requiere la estandarización de

un proceso de extracción masivo.

Capítulo 4 73

La determinación de la estructura genética de los plásmidos encontrados se realizó

partiendo de los datos obtenidos tras el proceso de secuenciación, anotación y

ensamblaje del DNA total de las cepas objeto de estudio, ya que en este último fue

posible identificar scafolds circulares, que corresponden a DNA plasmídico. La

identificación de elementos genéticos estructurales característicos de plásmidos del

género Acinetobacter en los archivos de la anotación, permitió corroborar esta

información.

En los plásmidos p1ABIBUN, p1ANIBUN28F, p2ANIBUN28F, p3ANIBUN28F,

p5ANIBUN28F y p1APIBUN42F se encontró la replicasa RepB y replicasas

pertenecientes al COG 5527, las cuales pertenecen a la superfamilia Rep3 dominio pfam

01051, al igual que la mayoría de las replicasas identificadas en plásmidos de este

género. Estas muestran una alta similaridad en la composición de aminoácidos con

replicasas del plásmido pKPN5 de Klebsiella pneumoniae cepa MGH 78578 y con

replicasas de plásmidos presentes en Moraxella bovis, Pasteurella multocida y Neisseria

lactamica (Bertini et al., 2010).

En el caso del plásmido p3ANIBUN28F se identificaron dos replicasas pertenecientes al

COG5527 una en cada nodo, lo cual sugiere la posible existencia de dos replicones

independientes, similar a lo que se ha descrito en los plásmidos pACICU1, p2ABSDF y

p3ABSDF de A. baumannii cepas ACICU y SDF respectivamente. En este caso la

identidad entre las secuencias de los iterones y de las replicasas es menor, lo cual

reduce la competencia entre la proteína y sus respectivos sitios de unión. Los plásmidos

pABIR y pABVA01 contienen dos replicones, de los cuales solo uno es funcional, ya que

el otro se encuentra truncado por una secuencia de inserción (Bertini et al., 2010;

D´Andrea et al., 2009; Iacono et al. 2008).

En replicones que no poseen iterones asociados a los genes rep, es común encontrar

mecanismos alternos del control basados en la regulación mediante RNA antisentido

inhibitorios, los cuales se encuentran en los plásmidos de los grupos de incompatibilidad

Inc1 e IncF (Bertini et al., 2010).

En el plásmido p4ANIBUN28F la replicasa pertenece al COG2197 la cual hace parte de

un sistema de dos componentes y está relacionada con procesos de regulación




transcripcional y el plásmido p2APIBUN42F contiene la proteína RepC, la cual funciona

como iniciadora del proceso de replicación. En los replicones de los plásmidos de mayor

tamaño se encontraron también proteínas de unión a DNA principalmente proteínas H-

NS (tipo histonas), helicasas de DNA y RNA pertenecientes a las superfamilias I y II,

además de topoisomerasas, lo cual le da una mayor eficiencia a la replicación ya que se

hace completamente independiente del hospedero generando mayor estabilidad en el

plásmido.

Solo en los plásmidos p1ANIBUN28F y p2APIBUN42F se identificaron elementos

pertenecientes a los tres sistemas que componen el módulo de estabilidad: Sistema de

resolución de multímeros, sistema toxina-antitoxina y sistema de partición.

Los plásmidos p1ANIBUN28F, p2ANIBUN28F, p4ANIBUN28F y p2APIBUN42F dentro

del sistema de resolución de multímeros contienen recombinasas sitio- específicas de la

familia serina-recombinasas del COG 1961 encontradas en diversos plásmidos del

género Acinetobacter. Además los plásmidos p2ANIBUN28F y p2APIBUN42F contienen

resolvasas XerC/XerD pertenencientes a la familia tirosina-recombinasas. En los

plásmidos pMMCU1 y pMMA2 obtenidos de aislamientos clínicos de A. calcoaceticus y A.

baumannii respectivamente el gen de resistencia bla-OXA 24, se encuentra ubicado en

un módulo flanqueado por sitios XerC/XerD, lo cual sugiere que estos se encuentran

implicados en procesos de movilización de genes de resistencia por mecanismos de

recombinación sitio-específica (Merino et al., 2010).

Respecto al sistema toxina-antitoxina en los plásmidos p1ANIBUN28F, p1APIBUN42F y

p2APIBUN42F se encontraron genes que codifican para el sistema muerte-post

segregación tipo II RelE/RelB similar a lo encontrado en los plásmidos pACICU1 y

p2ABSDF. En el plásmido p4ANIBUN28F se identificó el sistema ParE/RelE reportado

previamente en Agrobacterium tumefaciens, Escherichia coli O157 y Vibrio cholerae

(Kasari et al., 2013).

El plásmido p1ABAYE contiene genes ortólogos del sistema Txe del plásmido pRUM de

Enterococcus faecium; en el plásmido pABIR se encuentran genes del sistema

HicA/HicB; en los plásmidos pAB1, pAB120, pMAC, p2ABTCDC0715 y p3ABAYE

Capítulo 4 75

contienen el sistema GP49/Cro; los plásmidos p1ABTCDCO715, p2ABAYE, pAB0057,

pAB120, pAB2, pABIR, pABVA01, pMMA2 y pMMCU33514 codifican para el sistema

DUF497, el sistema X/Zeta se encuentra en los plásmidos p2ABTCDCO715, pABTJ1 y

pACICU2 (Bertini et al., 2010; Jurénaité et al., 2013).

Las proteínas ParA y ParB, las cuales conforman el sistema de partición tipo I se

encuentran codificadas en los plásmidos p1ANIBUN28F, p2ANIBUN28F, p1APIBUN42F

y p2APIBUN42F, estos corresponden a los de mayor tamaño, mientras que los plásmidos

más pequeños no lo contienen, esto sugiere que dado el mayor número de copias que se

producen, su repartición en el momento de la segregación puede darse

estocásticamente. En los plásmidos reportados del género Acinetobacter sólo se

encuentran proteínas del sistema de partición tipo I.

El plásmido p1ABIBUN al igual que p3ANIBUN28F y p5ANIBUN28F, no contienen

ningún elemento asociado al módulo de estabilidad. Sin embargo, dado su tamaño lo

más probable es que se repliquen en alto número de copias, lo cual aumenta la tasa de

segregación; otra opción es que estén acoplados a los sistemas de estabilidad del DNA

cromosomal y por esta razón se mantengan persistentes en la población.

En cuanto al módulo de establecimiento, el cual es propio de plásmidos conjugativos ya

que se encarga de proteger el DNA cuando ingresa a nuevos hospederos se encontraron

elementos de los sistemas restricción-modificación tipo II y III en los plásmidos

p1ANIBUN28F y p1ANIBUN28F respectivamente; el plásmido p2APIBUN42F contiene

elementos tanto del sistema restricción-modificación tipo I como del tipo III. En los

plásmidos pACICU1, pACICU2, p3ABAYE, p2ABSDF y p3ABSDF de Acinetobacter

baumannii cepas ACICU, AYE y SDF se han observado proteínas putativas del sistema

restricción/antirestricción incluyendo enzimas de restricción/modificación tipo I y tipo II

(Bertini et al., 2010).

En los plásmidos p3ANIBUN28F y p5ANIBUN28F se identificaron las proteínas de

movilización MobA/MobL las cuales se encuentran también en los plásmidos p1ABAYE,

p1ABSDF, p2ABSDF, p3ABSDF pMMCU1, pMMCU2, pMAC02, pMMD, pNaval18-7.0,

pABUH2a-5.6, pABUH3b-7.8, pABUH6b-10, pABUH3a-8.2, pABUH2b-5.4 y pM131-3,

aunque estas no permiten establecer eventos conjugativos, son requeridas para

reconocer el sitio nic y clivarlo, dirigiendo el complejo del transferosoma determinado por




el elemento conjugativo (Bertini et al., 2010; Garcillán-Barcia et al., 2011; Francia et al.,

2004).

Por su parte, los plásmidos de mayor tamaño p2ANIBUN28F y p2APIBUN42F (225 kb y

233 kb) respectivamente contienen los locus que codifican para el sistema de secreción

tipo IV Icm/Dot, el cual ha sido reportado en Legionella pneumohila y Coexiella Burnetti

(Segal, et al. 2005). De las 25 proteínas encontradas en el sistema Icm/Dot, 17 de ellas

resultan homológas a las del locus Tra. En una isla genómica de virulencia encontrada en

el genoma de la cepa A. baumannii ATCC 17978 se encontraron ocho genes homólogos

al sistema tipo IV Icm/Dot los cuales se relacionaron también con la codificación de

factores de virulencia (Segal, et al. 2005; Smith, et al. 2007; Liu, et al., 2014).

En el plásmido pACICU2 obtenido de la cepa ACICU de A. baumannii fue identificado un

sistema conjugativo putativo, este sistema es homólogo a sistemas conjugativos

identificados en plásmidos de Burkholderia cenocepacia y Burkholderia thailandensis. Así

mismo en los plásmidos pABKp1, pABTJ1, p1ABJAB0714, p2BJAB0868 y

p2ABTCDC0715 se encontraron regiones que codifican para sistema de secreción tipo IV

en los cuales se observa un alto grado de conservación (Bertini et al., 2010; Liu, et al.,

2014).

Se ha reportado que gran cantidad de las cepas de Acinetobacter spp. aisladas hasta el

momento contienen plásmidos cuyo contenido genético se ha correlacionado con

degradación de hidrocarburos, patogenicidad, resistencia a metales pesados y a

antibióticos (Fondi et al., 2010).

Es el caso de los plásmidos pertenecientes a la familia pKLH2, los cuales contienen un

operón completo de resistencia a mercurio, al igual que el plásmido p1ANIBUN28F, dicho

operón se encuentra ubicado en el nodo 226, este presenta una alta similaridad con la

secuencia de los plásmidos pKLH204 de Acinetobacter sp. LS56-7, pKLH207 de

Acinetobacter sp. BW3, pKLH203 de Acinetobacter junii, pKLH202 de Acinetobacter iwoffi

y pKLH201 de Acinetobacter calcoaceticus. En este mismo plásmido encontramos

elementos de resistencia a telurio y a fenol; mientras que en el plásmido p2ANIBUN28F

se encuentran elementos de resistencia a arsénico. Dadas estas condiciones la cepa A.

Capítulo 4 77

nosocomialis 28F podría ser potencialmente usada en estudios de biorremediación, ya

que en el operón de resistencia a mercurio no se encuentran solamente los elementos

reguladores, sino también enzimas que permiten la reducción de estos compuestos.

Tanto el plásmido p2ANIBUN28F como el plásmido p2APIBUN42F, contienen genes de

resistencia que codifican para enzimas modificadoras de aminoglicósidos. Además el

plásmido p2ANIBUN28F contiene la beta-lactamasa OXA23 y p2APIBUN42F contiene

beta-lactamasas clase C y clase D. Existe amplia evidencia que apoya la participación de

plásmidos en la transferencia de genes de resistencia a antibióticos; este evento se ha

observado tanto en bacterias Gram negativas como en Gram positivas, de hecho se han

identificado determinantes de resistencia a varias clases de antibióticos en un mismo

plásmido, estos generalmente tienen un tamaño superior a los 50 kb y poseen

sofisticados mecanismos de regulación y estabilidad (Carattoli, 2013; Alekshun & Levy

2007; DeNap & Hergenrother, 2005; Adams et al., 2010; Zarilli et al., 2008).

En contraste con la diversidad de características que se observan entre las especies de

este género, la capacidad de integrar material genético foráneo es quizás uno de los

rasgos más importantes que se presentan con frecuencia en la mayoría de ellas (Barbe

et al., 2004). El hallazgo de plásmidos que comparten el mismo contenido genético en

cepas de diferentes especies sugiere la existencia de un flujo de estas moléculas intra e

inter-específico a través de mecanismos de transferencia horizontal de genes (Fondi et

al., 2010).

Dado el grado de conservación que se presenta en la estructura basal de los plásmidos

del género Acinetobacter tanto en contenido como en organización genética, ya que

plásmidos idénticos han sido identificados en cepas que no se encuentran relacionadas

epidemiológicamente y fueron aisladas de áreas geográficas muy distantes; la

caracterización de estos representa un gran desafío para generar estrategias que

permitan contrarrestar la diseminación de genes de resistencia a través de la

transferencia horizontal de genes mediada por plásmidos.

6. Conclusiones y Recomendaciones

6.1 Conclusiones

Se determinó el perfil plásmidico de tres aislamientos multirresistenes de A. baumanni

107m, A. nosocomialis 28F y A. pitti 42F obtenidos en hospitales colombianos, donde se

encontró un plásmido en la cepa AB107m, cinco plásmidos en la cepa AN28F y dos

plásmidos en la cepa AP42F.

Se estandarizó la técnica de termolísis alcalina, la cual permitió identificar los

plásmidos de menor tamaño presentes en las tres cepas; al realizar la determinación del

tamaño molecular por comparación con los plásmidos presentes en la cepa E. coli V517,

la cual fue utilizada como control y referencia estos resultados son concordantes con los

obtenidos en los análisis in silico. Sin embargo, no fue posible realizar la extracción de

plásmidos superiores a 60 kb.

A través de la identificación de elementos genéticos estructurales en plásmidos

reportados del género Acinetobacter, se planteó una estrategia que permite determinar la

arquitectura genética analizando secuencias de DNA total.

Al realizar una comparación entre los plásmidos presentes en los aislamientos

colombianos A. baumanni 107m, A. nosocomialis 28F y A. pitti 42F, con los plásmidos

obtenidos a nivel mundial se observa un alto grado de conservación a nivel estructural y

organizacional en los plásmidos reportados del género Acinetobacter, tanto en los genes

que premiten el proceso de replicación y su regulación, como en los sistemas de

estabilidad, establecimiento y movilización del DNA plasmídico.




En el plásmido presente en la cepa A. baumannii 107m solo se encontraron genes

asociados al proceso de replicación y proteínas hipotéticas, mientras que en los

plásmidos de las cepas A. nosocomialis 28F y A. pittii 42F, se encontraron elementos

pertenecientes a todos los módulos estructurales así como genes de resistencia a

antibióticos, metales pesados y compuestos aromáticos.

6.2 Recomendaciones

Estandarizar una técnica que permita la extracción de megaplásmidos.

Realizar la separación de los plásmidos presentes en las cepas A. nosocomialis

28F y A. pittii 42F, para poder realizar los análisis de restricción in vitro.

Realizar la finalización de los plásmidos encopntrados en las cepas A.

nosocomialis 28F y A. pittii 42F.

Anexo1: Base de datos de plásmidos reportados

para el género Acinetobacter.

El Anexo 1 es una base de datos que contiene los elementos estructurales que aseguran

la replicación y adecuada segregación del plásmido, así como aquellos que confieren

ventaja adaptativa al hospedero y son comunes en plásmidos del género Acinetobacter.

Se encuentra en el archivo adjunto en el programa Excel.




Anexo 2 Curvas de calibración

Curva de calibración para el cálculo del tamaño del plásmido p1ABIBUN por

comparación con el perfil plasmídico de la cepa control E. coli V517.

Tabla 1. Peso molecular, Log en base 10 Peso Molecular y Distancia de los plásmidos de

la cepa control E. coli V517

Peso molecular (kb) Log 10 Peso Molecular Distancia (cm)

2,1 0,322219295 6,7

2,7 0,431363764 5,7

3 0,477121255 5,4

4 0,602059991 4,5

5,2 0,716003344 3,9

5,7 0,755874856 3,7

7,3 0,86332286 2,8

Curva de calibración para el cálculo del tamaño del plásmido p1ABIBUN

mediante análisis de restricción con las enzimas HindIII y EcoRI.

Tabla 2. Peso molecular, Log en base 10 Peso Molecular y Distancia de los fragmentos

generados tras la restricción de DNA de Fago lambda con las enzimas HindIII y EcoRI.

Fragmentos generados tras restricción de fago lambda con HindIII y EcoRI

Enzima Tamaño del Fragmento Log 10 Tamaño

Distancia (cm)

HindIII 9416 3,97386645 2,65

EcoRI 7421 3,870462432 2,8

HindIII 6557 3,816705184 3

EcoRI 5804 3,763727404 3,15

EcoRI 5643 3,75151005 3,17

EcoRI 4878 3,688241796 3,35

HindIII 4361 3,639586087 3,4

HindIII 2322 3,365862215 4,25

HindIII 2027 3,306853749 4,5




Curva de calibración para el cálculo del tamaño de los plásmidos presentes

en las cepas A. nosocomialis 28F y A. pittii 42F por comparación con el

perfil plasmídico de la cepa control E. coli V517

Tabla 3. Peso molecular, Log en base 10 Peso Molecular y Distancia de los plásmidos de

la cepa control E. coli V517

Peso molecular (kb) Log 10 Peso

Molecular Distancia (cm)

2,1 0,322219295 6,6

2,7 0,431363764 5,8

3 0,477121255 5,5

4 0,602059991 4,8

5,2 0,716003344 4,4

5,7 0,755874856 4

7,3 0,86332286 3,5

55 1,740362689 0,4

Anexo 3 Mapas de restricción de los plásmidos

presentes en las cepas A. nosocomialis AN28F y A. pittii

42F

Figura 1. Mapa de restricción del plásmido p1ANIBUN28F con la enzima EcoRI.

Figura 2. Mapa de restricción del plásmido p2ANIBUN28F con la enzima EcoRI.

Figura 3. Mapa de restricción del





Figura 4. Mapa de restricción del plásmido p4ANIBUN28F

Figura 5. Mapa de restricción del plásmido p5ANIBUN28F

Figura 6. Mapa de restricción del plásmido p1APIBUN42F con la enzima EcoRI.

Figura 7. Mapa de restricción del plásmido p2APIBUN42F con la enzima EcoRI.




Anexo 4. Elementos estructurales de los plásmidos

presentes en las cepas A. nosocomialis AN28F y A. pittii

42F

Tabla 1. Elementos estructurales del plásmido p1ANIBUN28F

Tabla 2. Elementos del módulo adaptativo del plásmido p1ANIBUN28F

NODO POSICIÓN COG / PRODUCTO FUNCIÓN

226

1..264 C COG0789 Predicted transcriptional regulators/

product="transcriptional regulator MerD"

Resistencia a Mercurio

282..1967 C COG2608 Copper chaperone/ product="mercuric

reductase"

2006..2431 C product="mercury transport protein MerC"

2459..2734 C COG2608 Copper chaperone/ product="P-type HAD

superfamily ATPase"

2748..3098 C product="mercuric transport protein"

218 616..864 product="phenol hydrolase assembly protein" Resistencia a

aromáticos 902..>1347 product="Methane/phenol/toluene hydroxylase"

129 9..350 C COG0861 Membrane protein TerC, possibly involved in tellurium resistance/ product="Integral membrane

protein TerC family protein"

Resistencia a Telurio


149 313..1251 C COG5527 Protein involved in initiation of plasmid replication

/ product="DNA replication protein B" Replicación

149 1655..2293 COG1192 ATPases involved in chromosome partitioning/

product="ParA family protein" Sistema de partición

129 5948..6514 COG1961 Site-specific recombinases, DNA invertase Pin

homologs/ product="resolvase domain-containing protein" Resolución de

multímeros

5 10176..10496 COG2161 Antitoxin of toxin-antitoxin stability

system/product="hypothetical protein" Sistema toxina-

antitoxina

18

1..2747 COG1002 Type II restriction enzyme, methylase subunits/

product="putative type II restriction enzyme" Restricción

2848..4473 C COG0827 Adenine-specific DNA methylase"/ product="putative modification methylase"

Modificación

130 315..830 COG0861 Membrane protein TerC, possibly involved

in tellurium resistanceproduct="hypothetical protein"

Tabla 3. Elementos estructurales del plásmido p2ANIBUN28F


65 2960..3346 COG5527 Protein involved in initiation of plasmid replication/ product="DNA replication

protein B"

Replicación

14

1327..1845 COG1112 Superfamily I DNA and RNA helicases and helicase subunits/ product="hypothetical

protein"

6536..9199 C COG0550 Topoisomerase IA/ product="topoisomerase I"

31374..33041 C COG0553 Superfamily II DNA/RNA helicases, SNF2 family"/ product="SNF2 family DNA/RNA

helicase"

38013..38339 COG2916 DNA-binding protein H-NS/ product="putative DNA binding protein" Unión a DNA

40941..41366 COG0653 Preprotein translocase subunit SecA (ATPase, RNA helicase)/ product="hypothetical

protein" Replicación

49992..50489 C COG1278 Cold shock proteins/ product="cold-shock DNA-binding protein family protein" Unión a DNA

83 887..1051 product="putative DNA helicase"

Replicación 180 4034..>4389 product="replication protein C"

78 4395..5951 C COG0210 Superfamily I DNA and RNA helicases/ product="superfamily I DNA/RNA helicase"

109 9760..10692 COG4973 Site-specific recombinase XerC product="Site-specific tyrosine recombinase" Resolución de

multímeros

137 7100..7714 COG1961 Site-specific recombinases, DNA invertase Pin homologs/ product="helix-turn-helix,

Fis-type"

Resolución de multímeros

180 2034..2582 COG1961 Site-specific recombinases, DNA invertase Pin homologs/ product="resolvase-like

protein"

96 2288..3025 COG1961 Site-specific recombinases, DNA invertase Pin homologs/ product="resolvase protein

ParA"

66 382..1218

COG1192 ATPases involved in chromosome partitioning/ product="Chromosome partitioning protein ParA"

Sistema de partición

1228..2289 COG1475 Predicted transcriptional regulators/ product="ParB family protein"

84 3359..3970 C COG1961 Site-specific recombinases, DNA invertase Pin homologs/ product="resolvase" Resolución de

multímeros

14 18981..21668

COG3587 Restriction endonuclease /product="type III restriction protein res subunit" Restricción

21684..23219 C 14

COG2189 Adenine specific DNA methylase Mod/ DNA methylase N-4/N-6 domain-containing protein

Modificación

76 1915..3240 COG0270 Site-specific DNA methylase/ product="C-5 cytosine-specific DNA methylase"

Modificación 46 368..1171 product="DNA restriction methylase"

37 31814..38446 C COG0286 Type I restriction-modification system methyltransferase subunit/

product="hypothetical protein"

14 24297..25151 C

COG0741 Soluble lytic murein transglycosylase and related regulatory proteins (some contain LysM/invasin domains)"/ product="conjugal transfer protein" Conjugación

28770..29561 C product="TraX family protein"

66

4571..5866 C COG2805 Tfp pilus assembly protein, pilus retraction ATPase PilT/ product="Type IV secretion

system protein DotB"

Conjugación – Virulencia

5894..6703 C product="putative type IV secretion system protein DotC"

9794..10477 product="Putative type IV secretion system protein IcmL/DotI"

11460..12971 product="Putative type IV secretion system protein IcmE/DotG"

15136..16023 product="putative type IV secretion system protein IcmJ/DotN"

17298..20480 product="Putative type IV secretion system protein IcmB/DotO"

20603..23395 COG3200 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate (DAHP) synthase/ product="putative

type IV secretion system protein IcmO/DotL"




78 8809..10338 C Type IV secretion system protein IcmP/DotM"

Tabla 4. Elementos del módulo adaptativo del plásmido p2ANIBUN28F

Tabla 5. Elementos Estructurales del plásmido p3ANIBUN28F



109

791..1153 product="arsenic resistance operón trans-acting repressor ArsD"


1175..2935 COG0003 Oxyanion-translocating ATPase/ product="arsenite-

activated ATPase (arsA)

3421..4707 COG1055 Na+/H+ antiporter NhaD and related arsenite permeases/

product="arsenical pump membrane protein"

65 749..1855 C COG1275 Tellurite resistance protein and related permeases/

product="tellurite resistance protein" Resistencia a

Telurio

186 93..872 COG3231 Aminoglycoside phosphotransferase/

product="aminoglycoside 3'-phosphotransferase"

Resistencia a Antibióticos 137

200..1003 COG3231 Aminoglycoside phosphotransferase/product="StrA"

2175..2990 COG3231 Aminoglycoside phosphotransferase/ aminoglycoside 3'-

phosphotransferase

180 247..1107 COG2746 Aminoglycoside N3'-acetyltransferase/ product="gentamicin-(3)-N-acetylTransferase"

86 174..995 C COG2602 Beta-lactamase class D/ product=" beta-lactamase OXA-23"

NODO POSICIÓN PRODUCTO FUNCIÓN

43 122..1045 COG5527 Protein involved in initiation of plasmid replication/ product="DNA replication protein B"

Replicación

95 849..1778 c COG5527 Protein involved in initiation of plasmid

replication"/ product="putative replication protein"

95 2278..3438 c product="plasmid mobilization protein" Movilización

NODO POSICION COG/PROTEÍNA FUNCIÓN

23

173..481c COG3668 Plasmid stabilization system protein Sistema toxina-

antitoxina

2630..3223c COG1961 Site-specific recombinases, DNA

invertasePin homologs/Resolvase Resolución de

multímeros

6042..6983c COG2197 Response regulator containing a CheY-like receiver domain and an HTH DNA-binding domain/

plasmid replicase protein Replicación


Tabla 8. Elementos Estructurales del plásmido p1APIBUN42F

Tabla 9. Elementos Estructurales del plásmido p2APIBUN42F


2 <1..394 COG0210 Superfamily I DNA and RNA helicases"/ putative DNA helicase

Replicación

27

22469..27442 COG0515 Serine/threonine protein kinase/ superfamily I DNA/RNA helicase

52..423 COG0553 Superfamily II DNA/RNA helicases, SNF2 family/ SNF2 family DNA/RNA helicase

22964..25627 COG0550 Topoisomerase IA/ topoisomerase I

30316..30837 c COG1112 Superfamily I DNA and RNA helicases and helicase subunits

10

66..1394 c COG0553 Superfamily II DNA/RNA helicases, SNF2 family/ SNF2 family DNA/RNA helicase

6366..6692 c COG2916 DNA-binding protein H-NS/ putative DNA binding protein

18345..18842 c COG1278 Cold shock proteins/ cold-shock DNA-binding protein family protein

26

10409..10969 COG1974 SOS-response transcriptional repressors (RecA-mediated autopeptidases)/ DNA

polymerase V component

64..390 c COG0550 Topoisomerase IA/ DNA topoisomerase III

2486..2881 c replication protein C

51 4992..6260 COG0210 Superfamily I DNA and RNA helicases/ superfamily I DNA/RNA helicase

77 3133..3300 COG2026 Cytotoxic translational repressor of toxin-antitoxin stability system/ reversible

inhibitor of translation, co-repressor of relB operón transcription (RelE-like) protein Sistema Toxina-

Antitoxina

27 36789..37721 COG4973 Site-specific recombinase XerC/ Site-specific tyrosine recombinasa Resolución de Multímeros 26 4333..4881 COG1961 Site-specific recombinases, DNA invertase Pin homologs/ resolvase-like protein

13 386..1222 COG1192 ATPases involved in chromosome partitioning/ Chromosome partitioning ParA Sistema de

Partición 1232..2293 COG1475 Predicted transcriptional regulators/ ParB family protein

2 40402..47034 c COG0286 Type I restriction-modification system methyltransferase subunit Restricción

27

8879..10414 COG2189 Adenine specific DNA methylase Mod"/ DNA methylase N-4/N-6 Modificación

10430..13117 COG3587 Restriction endonuclease/ type III restriction protein res subunit Restricción

6292..7617 COG0270 Site-specific DNA methylase/ C-5 cytosine-specific DNA methylase Modificación

26 16218..17015 DNA restriction methylase Modificación


30

1..1088 putative plasmid mobilisation protein Movilización

1765..2703 COG5527 Protein involved in initiation of plasmid

replication/DNA replication protein Replicación


5 17649..18821 COG5527 Protein involved in initiation of plasmid replication/ replication protein Replicación

52 12962..17974 C COG4889 Predicted helicase/ helicase domain-containing protein Replicación

5 15041..15940 C COG1475 Predicted transcriptional regulators/putative partitioning protein Sistema de

partición 15959..16735 C COG1192 ATPases involved in chromosome partitioning

91 69..311 C COG3077 DNA-damage-inducible protein J/ bifunctional antitoxin/transcriptional

repressor RelB" Sistema toxina-

antitoxina

109 73..2778 COG0178 Excinuclease ATPase subunit/ excinuclease ABC subunit A Restricción




71 2839..5631 c

COG3200 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate (DAHP) synthase/ putative type IV secretion system protein IcmO/DotL

Conjugación- Virulencia

5754..>8305 IcmB protein

13

4575..5870 c COG2805 Tfp pilus assembly protein, pilus retraction ATPase PilT/ Type IV secretion

system protein DotB

5898..6707 c putative type IV secretion system protein DotC

9798..10481 Putative type IV secretion system protein IcmL/DotI

11464..12975 Putative type IV secretion system protein IcmE/DotG

15140..16027 putative type IV secretion system protein IcmJ/DotN

17298..18065 putative type IV secretion system protein IcmB/DotO

51 605..2134 Type IV secretion system protein IcmP/DotM

Tabla 10. Elementos del módulo adaptativo del plásmido p2APIBUN42F


90 <1..1288 COG1680 Beta-lactamase class C and other penicillin binding

proteins/ beta-lactamase

Resistencia a Antibióticos

122 100..>1031 c COG2602 Beta-lactamase class D/ carbapenem-hydrolyzing

oxacillinase

149 164..943 COG3231 Aminoglycoside phosphotransferase/ aminoglycoside 3'-

phosphotransferase

26 5743..6666 c COG2746 Aminoglycoside N3'-acetyltransferase/ gentamicin-(3)-N-

acetylTransferase

Bibliografía

Adams, MD., Chan, E R., Molyneaux, N., Bonomo, RA. (2010). Genowide Análisis

of Divergente of Antibiotic Resistance Determinats in Closely Related Isolates of

Acinetobacter baumannii. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 54(9): 3569-

77.

Adams, MD., Goglin, K., Molyneaux, N., Hujer, KM., Heather, L., Jaminson, JJ.,

MacDonald, IJ., Martin, KM., Russo, T., Campagnari, AA., Hujer, AM., Bonomo,

RA., Gill, SR. (2008). Comparative Genome Sequence Analysis of Multidrug-

Resistant Acinetobacter baumannii. Journal of Bacteriology. 190(24): 8053-8064.

Alekshun, MN., Levy, SB. (2007) Molecular Mechanisms of Antibacterial Multidrug

Resistance. Cell 128: 1037-1050.

Barbe, V., Vallenet, D., Fonknechten, N., Kreimeyer, A., Oztas, S., Labarre, L.,

Cruveiller, S., Robert, C., Duprat, S., Wincker, P., Ornston LN., Weissenbach J.,

Marliere, P., Cohen, GN., Medigue, C. (2004) Unique features revealed by the

genome sequence of Acinetobacter sp. ADPQ, a versatile and naturally

transformation competent bacterium. Nucleic Acid Research 32 (19): 5766-5779.

Bennett, PM. (2007) Plasmid encoded antibiotic resistance: acquisition and

transfer of antibiotic resistance genes in bacteria. British Journal of Pharmacology.

153: S347-S357.

Benson, D. a, Karsch-Mizrachi, I., Clark, K., Lipman, D. J., Ostell, J., & Sayers, W.

(2012).GenBank. Nucleic Acids Research, 40 (Database issue), D48–53.




Bertini, A., Poirel, L., Mugnier, P.D., Villa, L., Nordmann, P., Carattoli, A. (2010)

Characterization and PCR-Based Replicon Typing of Resistance Plasmids in

Acinetobacter baumannii. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54(10): 4168-

4177.

Bignell, C., Thomas, C., (2001) The bacterial ParA-ParB partitioning proteins.

Journal of Biotechnology. (91):1-34.

Birnboim, H.C., Doly, J. (1979) A rapid alkaline extraction procedure for screening

recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Research. 7(6): 1513- 1523.

Calderon-Copete, S.P., Wigger, G., Wunderlin, C., Schmidheini, T., Frey, J., Quail,

M.A., and Falquet, L. (2009). The Mycoplasma conjunctivae genome sequencing,

annotation and analysis. BMC Bioinformatics, 10 Suppl 6: S7.

Carattoli, A. (2009). Resistance Plasmid Families in Enterobacteriaceae.

Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (6): 2227-2238.

Carattoli, A. (2011) Plasmids in Gram negatives: Molecular typing of resistance

plasmids. International Journal of Medical Microbiology. (301): 654-658.

Carattoli, A. (2013). Plasmids and the spread of resistance. International Journal

of Medical Microbiology. (303) : 298-304.

Chattoraj, D. (2000). Control of plasmid DNA replication by iterones: no longer

paradoxical. Molecular Microbiology. 37 (3): 467-476.

Chen, C.-C., Lin, Y.-C., Sheng, W.-H., Chen, Y.-C., Chang, S.-C., Hsia, K.-C.

(2011). Genome sequence of a dominant, multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strain, TCDCAB0715. Journal of Bacteriology, 193(9), 2361–2.

D'Andrea, MM., Giani, T., D'Arezzo, S., Capone, A., Petrosillo, N., Visca, P.,

Luzzaro, F., Rossolini, GM. (2009). Characterization of pABVA01, a plasmid

encoding the OXA-24 carbapenemase from Italian isolates of Acinetobacter

baumannii. Antimicrobial Agents Chemotherapy, 53(8):3528-33.

DeNap, JC.,Hergenrother, PJ., (2005) Bacterial death comes full circle: targeting

plasmid replication in drug-resistant bacteria. Organic & of Biomolecular &

Chemistry . 3(6): 959-966.

Diomedi, A. (2005). Infecciones por Acinetobacter baumannii pan-resistente.

Consideraciones epidemiológicas y de manejo antimicrobiano actualizado.

Revista Chilena de Infectología. 22 (4):298-320.

Dorsey, CW., Tomaras, AP., Actis LA., (2006) Sequence and organization of

pMAC, an Acinetobacter baumannii plasmid harboring genes involved in organic

peroxidase resistance. Plasmid. 56 (2): 112-123.

Ducel, J. Fabry, J. (2003). OMS: Prevención de las infecciones infecciones nosocomiales. Guía Práctica. 2ª Ed. En http://www.who.int/csr/resources/publications/drugresist/en/PISpanish3.pdf

Fondi, M., Bacci, G., Brilli, M., Papaleo, MC., Mengoni, A., Vaneechoutte, M.,

Dijkshoorn, L., Fani, R. (2010). Exploring the evolutionary dynamics of plasmids:

the Acinetobacter pan-plasmidome. BMC Evolutionary Biology. 10 (59): 1- 15.

Fournier, P., Richer, H. (2006). The Epidemiology and control of Acinetobacter

baumanii in Health Care Facilities. Clinical Infectious Diseases, 42 (5):692-699.

Francia, MV., Varsaki, A., Garcillán-Barcia, MP., Latorre, A., Drainas, C., De la

Cruz, F., (2004) A classification scheme for mobilization regions of bacterial

plasmids. FEMS Microbiology Reviews. (28):79-100.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=D'Andrea%20MM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19487447

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Giani%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19487447

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=D'Arezzo%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19487447

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Capone%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19487447

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Petrosillo%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19487447

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Visca%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19487447

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Luzzaro%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19487447

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Rossolini%20GM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19487447

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19487447




Garcillán-Barcia, MP., Alvarado, A., de la Cruz, F. (2011) Identification of bacterial

plasmids based on mobility and plasmid population biology. FEMS Microbiological

Reviews. 35: 936-956.

Hernández, MA., Valenzuela, EM., Pulido, IY., Reguero, MT., Restrepo, S.,

Gualtero, S., Santofimio, D., Ramirez, M., Quintero, E., Mantilla, JR. (2011).

Identificación a nivel de genomoespecie de aislamientos clínicos del complejo

Acinetobacter baumannii-Acinetobacter calcoaceticus, mediante RFLP-PCR de la

región intergénica espaciadora de los genes 16S y 23S rRNA. Revista

Colombiana de Biotecnología. XIII (1):110-114.

Iacono, M. Villa, L. Fortin, D. Bardoni, R. Imperi, F. (2008).Whole-Genome

Pyrosequencing of an Epidemic Multidrug-Resistant Acinetobacter baumannii

Strain Belonging to the European Clone II Group. Antimicrobial Agents and

Chemotherapy, 52 (7): 2616–2625

Jurénaité, M., Markuckas, A., Suziedeliene, E., (2013) Identification and

characterization of type II Toxin-Antitoxin systems in the opportunistic pathogen

Acinetobacter baumannii. Journal of Bacteriology. 195 (14):3165- 3172.

Kado, CI., Liu, ST. (1981). Rapid procedure for detection and isolation of large and

small plasmids. Journal of Bacteriology. 145(3): 1365-1373.

Kasari, V., Mets, T., Kaldalu, N., (2013) Transcriptional cross-activation between

toxin-antitoxin systems of Escherichia coli. BioMed Central Microbiolgy. 13(45):1-

13.

Kobayashi, I. (2001). Behavior of restriction- modification systems as selfish

mobile elements and their impact on genome evolution. Nucleic Acid Research. 29

(18):3742-3756.

Liu, CC., Kuo, HY., Tang, CY., Chang, KC., Liou, ML., (2014) Prevalence and

mapping of a plasmid encoding a type IV secretion system in Acinetobacter

baumannii. Genomics. 104:215-223.

Merino, M., Acosta, J., Poza, M., Sanz, F., Beceiro, A., Chaves, F., Bou, G.,

(2010) OXA-24 Carbapenemase gene flanked by XerC/XerD –like recombination

sites in different plasmids from different Acinetobacter species isolated during

nosocomial outbreak. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54(6): 2724-2727.

Nemec, A., Lenka, Krizova, L., Maixnerova, M., van der Reijden, TJK., Deschagth,

P., Passet, V., Vaneechoutte, M., Brisse, S., Dijkshoorn, L. (2011) Genotypic and

phenotypic characterization of the Acinetobacter calcoaceticus- Acinetobacter

baumannii complex with the proposal Acinetobacter pittii sp. nov. (formerly

Acinetobacter genomic species 3) and Acinetobacter nosocomialis sp. nov.

(formerly Acinetobacter genomic species 13TU). Research in Microbiology .162:

393-404.

Park, YK., Jung, S-I., Park, K-H., Cheong, HS., Peck, KR., Song, J-H., Ko, KS.

(2009). Independent emergence of colistin-resistant Acinetobacter spp. isolates

from Korea. Diagnostic Microbiology Infection Disease. 64:43–51.

Pardesi, KR., Yavankar, SP., Chopade, BA. (2007) Plasmid distribution &

antimicrobial susceptibility patterns of Acinetobacter genospecies from healthy

skin of a tribal population in western India. Indian Journal Medical Research, 125:

79-88.

Pedraza, RO., Díaz-Ricci, JC. (2002) In-well lysis technique reveals two new

megaplasmids of 103.0 and 216.6 MDa in the multiple plasmid-containing strain

V57 of Esherichia coli. Letters in Applied Microbiology, 34: 130-133.

Peleg, A., Hooper, D. (2010). Hospital-Acquired Infections Due to Gram-Negative

Bacteria. N Engl J Med. 362 (19): 1804-1813.




Perez, F. Hujer, AM., Hujer, KM., Derek, BK., Rather, PN., Bonomo, RA. (2007).

Global challenge of multidrug resistant Acinetobacter baumannii. Antimicrobial

Agents and Chemotherapy, 51(10):3471-3484.

Pinto, UM., Pappas, KM., Winans, SC., (2012) The ABCs of plasmid replication

and segregation. Nature Reviews. 10: 755 – 765.

Roberts, RJ. (2001). PubMed Central: The GenBank of the published literature.

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of

America, 98(2): 381–382.

Sader, H S., Fedler, K A., Biedenbach, D J., Fritsche, T R., Jones, R N. (2004)

Antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa and Acinetobacter spp. from

bloodstream infections (BSI): Comparison of SENTRY Program results from North

America, Latin America and Europe. 42nd Annual Meeting of IDSA, September 30

October 3, Boston, USA.

Segal, G., Feldman M., Zusman, T. (2005). The Icm/Dot type IV secretion systems

of Legionella pneumphila and Coexiella burnetii. FEMS Microbiology Reviews. 29

(1):65-81.

Sengupta, M., Austin, S. (2011) Prevalence and Significance of Plasmid

Maintenance Functions in the Virulence Plasmids of Pathogenic Bacteria. Infection

and Inmmunity 79 (7): 2502-2509.

Smith, MG., Gianoulis, TA., Pukatzki, S., Mekalanos, JJ., Ornston, LN., Gerstein,

M., Snyder, M. (2007). New insights into Acinetobacter baumannii pathogenesis

revealed by high-density pyrosequencing and transposon mutagenesis. Genes &

Development, 21(5),601–14.

Sorensen, SJ., Bailey, M., Hansen, LH., Kroer, N., Wuertz, S. (2005). Studying

plasmid horizontal transfer in situ: a critical review. Nature Reviews. 3: 700- 710.

Suarez, CJ., Katan, JN., Guzman, AM., Villegas, MV. (2006). Mecanismos de

resistencia a carbapenems en P. aeruginosa, Acinetobacter y Enterobacteriaceae

y estrategias para su prevención y control. Infection. 10 (2): 85-93.

Tafur, JD., Torres, JA., Villegas, MV. (2008). Mecanismos de resistencia a los

antibióticos en bacterias Gram negativas. Infection 12 (3): 227-232

Thomas, MC. (2000) Paradigms of plasmid organization. Molecular Microbiology.

37(3): 485-491.

Towner, KJ., Evans, B., Villa, L., Levi, K., Hamouda, A., Amyes, SB., Carattoli A.

(2011) Distribution of Intrinsic Plasmid Replicase Genes and Their Association

with Carbapenem- Hydrolizyng Class D β- Lactamase Genes in European Clinical

Isolates of Acinetobacter baumannii. Antimicrobial Agents and Chemotherapy.

55(5): 2154-2159.

Vallenet, D., Nordmann, P., Barbe, V., Poirel, L., Mangenot, S. (2008).

Comparative analysis of Acinetobacters: three genomes for three lifestyle. Plos

one, 3 (3): 1-10

Zarrilli, R., Vitale, D., Di Popolo, A., Bagattini, M., Daoud, Z., Khan, AU., Afif, C.,

Triassi, M. (2008). A plasmid-borne blaOXA-58 gene confers imipenem resistance

to Acinetobacter baumannii isolates from a Lebanese hospital. Antimicrobial

Agents Chemotherapy 52(11):4115-20.

Zhou, H., Zhang, T., Yu, D., Pi, B., Yang, Q., Zhou, J., Hu, S., Yu, Y. (2011)

Genomic Analysis of the Multidrug-Resistant Acinetobacter baumannii Strain

MDR-ZJ06 Widely Spread in China. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 55

(10): 4506-4512.

Zhou, Y., Call, DR., Broschat, SL., (2012) Genetic relationship among 527 Gram

negative bacterial plasmids. Plasmid. 68(2): 133-141.

Zhu, L., Yan, Z., Zhang, Z., Zhou, Q., Zhou, J., Wakeland, EK. (2013). Complete

Genome Analysis of Three Acinetobacter baumannii Clinical Isolates in China for

Insight into the Diversification of Drug Resistance Elements. PloS One, 8(6).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Zarrilli%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18725447

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Vitale%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18725447

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Di%20Popolo%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18725447

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bagattini%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18725447

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Daoud%20Z%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18725447

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Khan%20AU%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18725447

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Afif%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18725447

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Triassi%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18725447



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