ฤทธตานอนมลอสระของผกพนบาน

นางสาว บงอร วงศรกษ นางสาว ศศลกษณ ปยะสวรรณ

โครงการพเศษนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตร ปรญญาเภสชศาสตรบณฑต

คณะเภสชศาสตร มหาวทยาลยมหดล พ.ศ. 2549

FREE RADICAL SCAVENGER OF THAI VEGETABLES

MISS BUNGON WANGRUG MISS SASILAK PIYASUWAN

A SPECIAL PROJECT SUBMITTED IN PARTIAL FULFILMENT OF THE REQUIREMENT FOR

THE BACHELOR DEGREE OF SCIENCE IN PHARMACY FACULTY OF PHARMACY

MAHIDOL UNIVERSITY

โครงการพเศษ เรอง ฤทธตานอนมลอสระของผกพนบาน

………………………………………………… (นางสาวบงอร วงศรกษ)

…………………………………………………

(นางสาวศศลกษณ ปยะสวรรณ)

………………………………………………… (รองศาสตราจารยยวด วงษกระจาง)

อาจารยทปรกษา

………………………………………………… (รองศาสตราจารยรงระว เตมศรฤกษกล)

อาจารยทปรกษารวม

………………………………………………… (รองศาสตราจารยสมใจ นครชย)

อาจารยทปรกษารวม

………………………………………………… (รองศาสตราจารยเพญโฉม พงวชา)

อาจารยทปรกษารวม

ก

บทคดยอ ฤทธตานอนมลอสระของผกพนบาน

บงอร วงศรกษ, ศศลกษณ ปยะสวรรณ อาจารยทปรกษา: ยวด วงษกระจาง*, รงระว เตมศรฤกษกล**, สมใจ นครชย***, เพญโฉม พงวชา* * ภาควชาสรรวทยา คณะเภสชศาสตร มหาวทยาลยมหดล ** ภาควชาเภสชพฤกษศาสตร คณะเภสชศาสตร มหาวทยาลยมหดล *** ภาควชาเภสชวทยา คณะเภสชศาสตร มหาวทยาลยมหดล คาสาคญ: ฤทธตานอนมลอสระ, ผกพนบาน, ผกกด, ผกตว, ผกปลงขาว, ยานาง, ผกเหมยง, ผกหวานบาน

การทดสอบฤทธตานอนมลอสระของผกพนบาน จานวน 6 ชนด ไดแก ผกกด, ผกตว, ผกปลงขาว, ยานาง, ผกเหมยง และผกหวานบาน สกดสารสาคญจากผกแตละชนดโดยการหมกดวย methanol นาน 3 วน แลวนาไประเหยแหงดวยความรอนท 60 องศาเซลเซยส นาสารสกดทไดมาแยกเปน 2 สวน คอ สวนทละลายในนา และสวนทไมละลายในนาซงนามาละลายกลบดวย methanol ทดสอบฤทธตานอนมลอสระของสารสกดจากผกทง 6 ชนดดวยวธ DPPH assay โดยผสมตวอยางททดสอบกบสารละลาย 2,2–diphenyl–1–picrylhydrazyl (DPPH) แลววดการเปลยนแปลงคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 515 nm เปรยบเทยบกบ control, วตามนซ และ วตามนอ (Trolox) ซงเปนสารมาตรฐาน ผลการศกษาพบวา สารสกดจากผกตวแสดงฤทธตานอนมลอสระมากทสด โดยสารสกดสวนทละลายในนาและสวนทไมละลายในนาใหคา IC50 เทากบ 205.96 µg/ml และ 101.79 µg/ml ตามลาดบ รองลงมาคอ สารสกดจากยานาง ใหคา IC50 499.24 µg/ml (สวนทละลายในนา) และ 772.63 µg/ml (สวนทไมละลายในนา) สาหรบวตามนซและวตามนอ ใหคา IC50 9.34 µg/ml และ 15.91 µg/ml ตามลาดบ สวนสารสกดจากผกอก 4 ชนดมคา IC50 มากกวา 1,000 µg/ml การตรวจสอบทางเคมเบองตนพบวาสารสกดผกตวม hydrolysable tannin สวนสารสกดยานางม phenolic compounds และไดจดทา TLC fingerprints เพอเปรยบเทยบสาหรบการศกษาครงตอไป

ข

Abstract Free radical scavenger of Thai vegetables

Bungon Wangrug, Sasilak Piyasuwan Project advisor: Yuwadee Wongkrajang*, Rungravi Temsiririrkkul**, Somjai Nakornchai***, Penchom Peungvicha* *Department of Physiology, Faculty of Pharmacy, Mahidol University **Department of Pharmaceutical Botany, Faculty of Pharmacy, Mahidol University ***Department of Pharmacology, Faculty of Pharmacy, Mahidol University Keyword: free radical scavenger, Diplazium esculentum (Retz.) Swartz, Cratoxylum formosum (Jack) Dyer ssp.pruniflorum (Kurz.) Gogelin, Basella alba L., Tiliacora triandra Diels., Gnetum gnemon L. , Sauropus androgynus Merr.

The radical scavenging activity of Thai vegetables were determined by DPPH assay. Six kinds of vegetables including Diplazium esculentum (Retz.) Swartz, Cratoxylum formosum (Jack) Dyer ssp.Pruniflorum (Kurz.)Gogelin, Basella alba L., Tiliacora triandra Diels., Gnetum gnemon L. and Sauropus androgynus Merr. were selected. These vegetables were extracted by maceration in methanol for 3 days and then filtered. The filtrates were evaporated on water bath at 60 degree Celsius until dry. The dry extracts were dissolved in water, the soluble part (water soluble fraction) was separated, and the residue was redissolved in methanol (methanol fraction).Various concentrations of the extracts were mixed with 2, 2–diphenyl–1– picrylhydrazyl (DPPH), absorbance at 515 nm were measured by Novaspec II. Vitamin C and Trolox were used as reference standard. The results showed that Cratoxylum formosum (Jack) Dyer ssp.Pruniflorum (Kurz.) Gogelin extract possess the most potent properties, IC50 of water soluble fraction and water insoluble fraction were 205.96 µg/ml and 101.79 µg/ml, respectively. While IC50 of Tiliacora triandra Diels. water soluble fraction and water insoluble fraction were 499.79 µg/ml and 772.63 µg/ml, respectively. IC50 of vitamin C were 9.34 µg/ml whereas IC50 of Trolox 15.91 µg/ml. The chemical identification and TLC fingerprints of Cratoxylum formosum (Jack) Dyer ssp.Pruniflorum (Kurz.) Gogelin and Tiliacora triandra Diels. extracts were also performed.

ค

กตตกรรมประกาศ โครงการพเศษนสาเรจลลวงตามความมงหมายไดดวยความชวยเหลอจาก รศ.ยวด วงษกระจาง ภาควชาสรรวทยา รศ.รงระว เตมศรฤกษกล ภาควชาเภสชพฤกษศาสตร รศ.สมใจ นครชย ภาควชาเภสชวทยา รศ.เพญโฉม พงวชา ภาควชาสรรวทยา คณะเภสชศาสตร มหาวทยาลยมหดล ซงไดใหคาปรกษา คาแนะนาในการคนควาขอมล การทาการทดลอง และรวบรวมขอมลตลอดจนการเรยบเรยงขอมลในการทารายงาน ผวจยจงขอกราบขอบพระคณอาจารยเปนอยางสง

นอกจากนทางผวจยยงไดรบความชวยเหลอจาก คณรตนา นาคสงา เจาหนาทภาควชาสรรวทยา คณอบลวรรณ บญเปลง เจาหนาทภาควชาเภสชพฤกษศาสตร คณดษณ ธนฐตพงศ เจาหนาทภาควชาเภสชวนจฉย และนกศกษาปรญญาโทและปรญญาเอก ภาควชาเภสชพฤกษศาสตร คณะเภสชศาสตร มหาวทยาลยมหดล ทกรณาใหคาแนะนาในการใชเครองมอและอานวยความสะดวกตางๆ ในระหวางการทาการทดลอง ทาใหการวจยสาเรจลลวงไปไดดวยด ผวจยจงขอขอบพระคณทกทานมา ณ ทนดวย

บงอร วงศรกษ

ศศลกษณ ปยะสวรรณ

ง

สารบญ หนา

บทคดยอ ก Abstract ข กตตกรรมประกาศ ค สารบญ ง สารบญตาราง จ สารบญรป ฉ สญลกษณและคายอ ช บทนา 1 ทบทวนวรรณกรรม 3 วธดาเนนการวจย 16 ผลการวจย 21 สรปและวจารณผลการวจย 33 ขอเสนอแนะ 34 ประโยชนทไดรบ 34 เอกสารอางอง 35 ภาคผนวก 37

จ

สารบญตาราง

ตารางท หนา 1 ปรมาณสารสกดและ% yield ของผกพนบานแตละชนด 21 2 คาการดดกลนแสงของสารมาตรฐาน Vitamin C 22 3 คาการดดกลนแสงของสารมาตรฐาน Trolox 22 4 คา % Inhibition ของสารสกดแยกทละลายในนา และไมละลายในนา ทความเขมขน 1000 µg/ml วด absorbance 515 nm ท 30 นาท 24 5 คาการดดกลนแสงของสารสกดผกกดทละลายในนา 24 6 คาการดดกลนแสงของสารสกดผกกดทไมละลายในนา 25 7 คาการดดกลนแสงของสารสกดผกตวทละลายในนา 25 8 คาการดดกลนแสงของสารสกดผกตวทไมละลายในนา 26 9 คาการดดกลนแสงของสารสกดผกปลงทละลายในนา 26 10 คาการดดกลนแสงของสารสกดผกปลงทไมละลายในนา 26 11 คาการดดกลนแสงของสารสกดยานางทละลายในนา 27 12 คาการดดกลนแสงของสารสกดยานางทไมละลายในนา 27 13 คาการดดกลนแสงของสารสกดผกเหมยงทละลายในนา 27 14 คาการดดกลนแสงของสารสกดผกเหมยงทไมละลายในนา 28 15 คาการดดกลนแสงของสารสกดผกหวานบานทละลายในนา 28 16 คาการดดกลนแสงของสารสกดผกหวานบานทไมละลายในนา 28 17 คา % Inhibition ของสารสกดแยกทละลายในนาและไมละลายในนา ทความเขมขน 1000 µg /ml วด absorbance 515 nmท 30 นาท 30 18 ผลการตรวจสอบองคประกอบทางเคมเบองตนของ Phenolic compounds 31

ฉ

สารบญรป

รปท หนา 1 สมการการเกดปฏกรยา หลงจากการเตมสารตานอนมลอสระ 7 2 ผกกด 8 3 ผกตว 9 4 ผกปลงขาว 11 5 ยานาง 12 6 ผกเหมยง 13 7 ผกหวานบาน 14 8 กราฟความสมพนธทเปนเสนตรงของสารมาตรฐาน Vitamin C

และ Trolox กบ % Inhibition 23 9 กราฟความสมพนธทเปนเสนตรงของสารสกดผกตวทละลายในนา และไมละลายนากบ % Inhibition 29 10 กราฟความสมพนธทเปนเสนตรงของสารสกดยานางทละลายในนา และไมละลายนากบ % Inhibition 30

11 fingerprints ของสารสกดผกตวหลงสเปรยดวย 1 % methanolic ferric chloride 32 12 fingerprints ของสารสกดยานางหลงสเปรยดวย 1 % methanolic ferric chloride 32

ช

สญลกษณและคายอ

Conc. = ความเขมขน g = กรม mg = มลลกรม ml = มลลลตร M = โมลาร µg, mcg = ไมโครกรม µl = ไมโครลตร M.W. = นาหนกโมเลกล TLC = Thin Layer Chromatography mM = มลลโมลาร V = ปรมาตร IC50 = คาความเขมขนทยบยงการดดกลนแสงของ สาร DPPH radical ได 50 เปอรเซนต UV = รงสอลตราไวโอเลต

1

บทนา อนมลอสระ เปนสารไมเสถยร มชวงครงชวตสน โดยทวไปอนมลอสระจะทาปฏกรยากบสารอน ใน 2 รปแบบ คอ โดยการดงเอาอะตอมไฮโดรเจนมาจากสารโมเลกลอนทอยขางเคยง และโดยการเพมโมเลกลของออกซเจนเขาไป เพอใหเกดเปนอนมลเปอรออกซล (Peroxyl radical) เนองจากอนมลมอเลคตรอนทไมไดจบคอยในโมเลกล จงมความไวสงในการเขาทาปฏกรยากบสารชวโมเลกลในรางกาย ทาลายสมดลของระบบตางๆในรางกาย โดยการทาลายองคประกอบหลกของเซลล สามารถแตกพนธะเปปไทดของโปรตน ทาใหโปรตนไมสามารถทางานไดตามปกต นอกจากนในปจจบนเปนทยอมรบทวไปในวงการแพทยวา โรคหลายชนด เชน โรคในระบบหวใจและหลอดเลอด หรอโรคมะเรง เปนตน มความสมพนธกบการเกดอนมลอสระในรางกาย ดงนน การทาลายหรอควบคมปรมาณอนมลอสระดงกลาว อาจชวยในการปองกนการเกดโรคตางๆได สารทนามาใชตอตานหรอยบยงการเกดอนมลอสระ เรยกวา สารตานอนมลอสระ เปนสารททาหนาทตอตานหรอยบยงการเกดปฏกรยาออกซเดชน จงชวยยบยงอนมลอสระไมใหทาลายองคประกอบของเซลล โดยสารตานอนมลอสระทรางกายตองการและใชเปนประจา ไดแก วตามนซ วตามนอ (1) จากการศกษาทางระบาดวทยาจานวนมาก ยนยนถงการลดอตราเสยง และเพมอตราการปองกนการเกดโรคมะเรง โรคเกยวกบหลอดเลอดและหวใจ รวมถงโรคอนๆทมความสมพนธกบอนมลอสระ จากการบรโภคผก และผลไม ซงจดเปนสารตานอนมลอสระทไดรบจากภายนอก โดยผลดงกลาวมาจาก ความเกยวของกบฤทธตานอนมลอสระของสารประเภทวตามนซ เบตาแคโรทน แคโรทนอยด รวมถงสารกลมโพลฟนอลก โดยวธทจะไดรบสารตานอนมลอสระ คอ การรบประทานเขาไปเปนอาหารประจาวน (2) แตพบวา การปลกผกแบบเกษตรอตสาหกรรม โดยเฉพาะอยางยงกบผกทไมใชผกพนบาน มกมโรคและแมลงรบกวน เกษตรกรจงแกปญหาโดยการใชยาฆาแมลง สงผลใหเกดอนตรายตอสขภาพผบรโภคได การรณรงคใหบรโภคผกพนบาน ซงมงานวจยหลายชนทสรปวา ผกพนบานเปนผกทมความแขงแรงทนทานตอโรคและแมลง เหมาะสมกบภมอากาศและภมประเทศของประเทศไทย ทาใหไมมความจาเปนในการใชสารเคมเพอดแลพช จงชวยใหผบรโภคลดโอกาสทจะสมผสกบสารเคมลงได นอกจากนยงพบวา ผกพนบานมคณคาทางโภชนาการสง มสรรพคณทางยาสมนไพรอยมาก หากบรโภคเปนประจาอาจสามารถปองกน บารง และรกษาความเจบปวยได ประกอบกบสภาพเศรษฐกจและสงคมในปจจบนทผบรโภคตองการความปลอดภยจากการ

2

บรโภคและความมนคงทางสขภาพ ไมตองการใหตนเจบปวย และกระแสสงคมทยอนกลบมาสนใจยาสมนไพรเพมมากขน (3) ดวยเหตผลดงกลาว จงเลงเหนความสาคญทตองมการศกษาฤทธตานอนมลอสระของผกพนบาน เพอประโยชนในการสนบสนนและสงเสรมใหผกพนบานไดเปนทรจก รวมถงเพอการวจยในขนสงตอไป

3

ทบทวนวรรณกรรม อนมลอสระ (Free Radical)

อนมลอสระ คอ อะตอม โมเลกล หรอสารประกอบทมอเลคตรอนเดยวอยในออรบทลวงนอกสดทมระดบพลงงานสง คาจากดความนหมายรวมถงอะตอมของไฮโดรเจนและอออนของโลหะทรานซชนสวนใหญ นอกจากนยงรวมถงโมเลกลของออกซเจนซงนบวาเปนอนมลเพราะม อเลคตรอนจานวน 2 อเลคตรอน แตละอเลคตรอนจะแยกกนอยเปนอเลคตรอนเดยวในแตละออรบทล อนมลอสระมทงทอยในสภาวะเปนกลางทางไฟฟา และอนมลในสภาวะทมประจไฟฟา โดยมทงประจบวกและประจลบ สญลกษณทางเคมของอนมล หรออนมลอสระ คออเลคตรอนเดยวของอนมลซงจะแสดงดวยจดในตาแหนงขางบนของสญลกษณทางเคม เชน อนมล A• อนมล A–– • และอนมล A+• โดยเฉพาะอนมลทมนาหนกโมเลกลตา จะไวตอการเกดปฏกรยามากกวาทมนาหนกโมเลกลสง เนองจากอเลคตรอนเดยวจะไมเสถยรและพยายามจบคกบอเลคตรอนเดยวอน ดงนนอนมลอสระจงมคณสมบตเฉพาะ คอ มความไวสงในการเกดปฏกรยากบโมเลกลอนๆ อยางไรกตามยงคงมอนมลอสระบางชนดทมความเสถยร ไมไวในการเกดปฏกรยา สามารถคงอยในสภาพอนมลไดนาน อนมลอสระทมความเสถยรมจานวนนอยชนดมาก ตวอยาง อนมลอสระทมความสาคญในทางชวภาพ ไดแก อนมลซปเปอรออกไซดแอนอออน (O2

–– •) อนมลไฮดรอกซ(•OH) อนมลอลคอกซ(RO•) และอนมลเปอรไฮดรอกซ (HO2

•) อนมลอสระเหลานจดเปนอนมลทไวในการเกดปฏกรยาสงมาก (4)

อนมลอสระกบการเกดโรค

เนองจากอนมลอสระมอเลคตรอนทไมไดจบคอยในโมเลกล จงมความไวสงในการเขาทาปฏกรยากบสารชวโมเลกลในรางกาย ทาลายสมดลของระบบตางๆในรางกาย โดยการทาลายองคประกอบหลกของเซลล เชน ทาลายหนาทของเซลลเมมเบรนอนนาไปสการตายของเซลล ทาลายดเอนเอโดยไปจบกบหมฟอสเฟตและนาตาลดออกซไรโบส อนมลอสระยงสามารถแตกพนธะเปปไทดของโปรตน ทาใหโปรตนไมสามารถทางานไดตามปกต ซงสงเหลานเปนสาเหตของการเกดการกลายพนธและการเกดมะเรง นอกจากนยงกอใหเกดสภาวะทางพยาธสภาพในโรคสาคญบางโรค ไดแก โรคหวใจ ไขมนอดตนในเสนเลอด ไขขออกเสบ ตอกระจก เปนตน อนมลอสระมทมาทงแหลงภายนอกรางกาย ไดแก มลพษในอากาศ โอโซน ไนตรสออกไซด ไนโตรเจนได

4

ออกไซด ฝน ควนบหร อาหารทมกรดไขมนอมตวหรอธาตเหลกมากกวาปกต แสงแดด ความรอน รงสแกมมา ยาบางชนด เปนตน และแหลงภายในรางกาย ไดแก ออกซเจน เปนตน (5)

ปฏกรยาการเกดอนมลอสระ ปฏกรยาการเกดอนมลอสระจดเปนปฏกรยาลกโซ (Free radical chain reaction) ซงมกลไกในการเกดปฏกรยา 3 ขนตอน คอ

1. Initiation step ปฏกรยากรยาการเกดอนมลอสระในเซลล มกเกดขนจากปฏกรยา

การสลายพนธะดวยนา (Hydrolysis) แสง (Photolysis) รงส (Radiolysis) หรอปฏกรยารดอกซ (Redox reaction) นอกจากนยงมเอนไซมอนๆ อกหลายชนดททาใหเกดอนมลอสระขนในเซลล รวมถงโมเลกลทมความไวสงในการทาปฏกรยา เชน nitric oxide (NO) และ singlet oxygen (1O2) ซงหมายถงออกซเจนในสถานะทถกกระตน (Excited state) สงเหลานลวนทาใหเกด ขนตอนอนนทเอชนของปฏกรยาการเกดอนมลอสระ ดงเชนสมการท 1

RH R• สมการ 1 2. Propagation step

อนมลอสระทเกดขนในขนตอนอนนทเอชนจะดาเนนปฏกรยาตอไปใน ขนตอนพรอพาเกชน โดยเกดปฏกรยาขน 2 ทาง คอ โดยการดงเอาอะตอมไฮโดรเจนจากโมเลกลขางเคยง หรอโดยการทาปฏกรยากบโมเลกลออกซเจนทอยในสถานะ ground state ทาใหไดอนมลอสระตวใหม ดงสมการท 2 – 4

RH + R 1• R• + R1H สมการ 2 R• + 3O2 ROO• สมการ 3 ROO• + RH ROOH + R• สมการ 4 3. Termination step

ขนตอนนเปนขนตอนทอนมลอสระทเกดขน 2 อนมลมารวมกนไดเปน สารทมความเสถยร จงเปนการหยดปฏกรยาลกโซของการเกดอนมลอสระ ดงสมการท 5 และ 6

ROO• + ROO• ROOR + O2 สมการ 5 ROO• + R• ROOR สมการ 6

(1,4)

5

การปองกนอนตรายและความเสยหายทเกดจากอนมลอสระ โดยธรรมชาตแลวจะมอนมลอสระเกดขนในเซลลและรางกายหลายชนด มทงทเปนประโยชนและใหโทษอนประกอบดวย อนมลอสระทหลดรอดออกมาจากการเผาผลาญออกซเจนเปนพลงงาน อนมลอสระททาหนาทเปนตวสงสญญาณตอเซลล และอนมลอสระทมฤทธตอการทางานของเซลลหรออวยวะ ในกรณหลงจะมประโยชนแตออกฤทธในปรมาณทตามากไมเกดอนตรายตอเซลล เซลลและรางกายจะเปนอนตรายและเสยหาย หากมอนมลอสระในปรมาณมากเกนสมดล ดงนนเซลลและรางกายจงมกลไกเพอควบคมปรมาณอนมลอสระไมใหสงจนเกดอนตราย กลไกสาคญททาหนาทควบคมปรมาณอนมลอสระมกลไกหลกอยสามกลไก ทาหนาทลดผลกระทบทเปนอนตรายของอนมลตอเซลล ในสภาวะปกตกลไกเหลานถอวาเพยงพอ ตอการรกษาปรมาณอนมลอสระใหอยในสมดลได กลาวคอสามารถควบคมไดแมวาจะมอนมลอสระเกดขน อยางไรกตามหากเกดภาวะผดปกตททาใหกลไกการปองกนเหลานบกพรองไมสามารถทจะควบคมภาวะสมดลได จะนาไปสการเกดภาวะทอนมลและสารออกซแดนทมมากเกนสมดล (Oxidative stress) และเกดโรคตางๆขนในรางกายได (5)

สารตานอนมลอสระ

สารตานอนมลอสระ คอสารทมหนาทตอตานหรอยบยงการเกดปฏกรยาออกซเดชน ในทนรวมถงสารทสามารถยบยงและควบคมอนมลอสระไมใหไปกระตนการเกดปฏกรยาออกซเดชน จงชวยยบยงอนมลอสระไมใหทาลายองคประกอบของเซลล สารตานอนมลอสระมทงทเปนสารจากธรรมชาต เชน Amino acid, Ascorbic acid, Carotenoids, Flavonoids, Tannins, Tocopherols เปนตน โดยทวไปสารตานอนมลอสระ แบงเปน 5 ประเภทใหญๆ ดงน

1. Primary antioxidant สารในกลมนสวนใหญไดแก สารประกอบฟนอลค(Phenolic compounds) ทาหนาทหยดปฏกรยาลกโซของการเกดอนมลอสระในปฏกรยาออกซเดชนของไขมน นอกจากนยงรวมถงสารโทโคฟรอลธรรมชาตและสงเคราะห (Natural and synthetic tocopherol) alkyl gallate BHA BHT TBHQ และอนๆ ซงสารในกลมดงกลาว ทาหนาทเปนตวใหอเลคตรอน 2. Oxygen scavenger สารในกลมนไดแก กรดแอสคอรบค หรอวตามนซ เปนตน สารในกลมนจะเขาทาปฏกรยากบออกซเจน จงเปนการชวยกาจดออกซเจนในระบบปดได

6

3. Secondary antioxidant สารในกลมนไดแก dilauryl thiopropionate และ thiopropionic acid ทาหนาทสลายโมเลกลของ lipid hydroperoxide ใหเปนสารทมความเสถยร 4. Enzymic antioxidant สารในกลมนไดแก เอนไซมตางๆ ซงแบงเปน primary antioxidant enzyme และ auxiliary antioxidant enzyme สารในกลมนทาหนาทกาจดออกซเจนหรออนพนธของออกซเจน โดยเฉพาะไฮโดรเจนเปอรออกไซด (H2O2) 5. Chelating agent หรอ sequestrant สารในกลมน เชน กรดซตรค กรดอะมโน เปนตน สารในกลมนทาหนาทไปจบกบไอออนของโลหะ เชน เหลก และทองแดง ซงไอออนเหลานเปนไอออนทสงเสรมและเรงปฏกรยาออกซเดชนของไขมน ทาใหเกดเปนสารประกอบเชงซอนทเสถยร (1) การวเคราะหหาความสามารถรวมในการตานออกซเดชน (Total Antioxidant Capacity, TAC)

การวเคราะหหาความสามารถรวมในการตานออกซเดชน มหลายวธ ไดแก 1. การวเคราะหจากการสงผานอะตอมไฮโดรเจน (Hydrogen atom transfer, HAT)

เชน - วธ Oxygen radical absorbance capacity assay (ORAC) และ - วธ Total radical – trapping antioxidant parameter (TRAP)

2. การวเคราะหจากการสงผานอเลคตรอนเดยว (Electron transfer, ET หรอ SET) เชน - วธ Diphenyl – 1 – picrylhydrazyl assay (DPPH) - วธ The ferric reducing ability of plasma assay (FRAP) - วธ Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC) (6) ในการศกษานจะใชวธ DPPH โดยอนมล DPPH• เปนอนมลไนโตรเจนทคงตว มสมวงอยในรปอนมลอยแลว โดยไมตองทาปฏกรยาเพอใหเกดอนมล การวเคราะหเปนการวดความสามารถในการรดวซ การวดทาโดยใชเครองสเปคโตรวดการลดลงของส เมอเตมสารตานอนมลลงไป โดยวดการดดกลนแสงทความยาวคลน 515 นาโนเมตร (7) ดงรป

7

DPPH• (สมวง) สารตานอนมลอสระ DPPH• (สเหลอง)

รปท 1 สมการการเกดปฏกรยา หลงจากการเตมสารตานอนมล (8)

ขอด ของวธนมขอด คอ งาย ใชเครองมอสามญทมทวไป นยมใชเปนวธเบองตน ในการทดสอบฤทธตานอนมลของสารตานอนมลจากธรรมชาต ยกเวนสารกลมแคโรตนอยดทมการดดกลนแสงในยานเดยวกน ขอดอย ของวธนคอ อนมล DPPH• มความคงตวไมไวตอปฏกรยาเหมอนอนมลทเกดในเซลลหรอรางกาย ดงนนวธนจงไมสามารถแยกแยะจดอนดบอนมลทมความไวสงได นอกจากน โครงสรางทางเคมของ DPPH• ทแสดงจะเหนวาอเลคตรอนเดยวของอนมลอสระจะถกบดบงดวยวงเบนซน 3 วง และหมไนโตร ทาใหสารตานอนมลทมฤทธแรงแตมขนาดใหญบางสารไมสามารถเขาไปทาปฏกรยาขจดอนมลหรอเกดปฏกรยาชากวาความเปนจรง ทงๆท สารตานอนมลนนมฤทธดในการขจดอนมลเปอรออกซ นอกจากนสารรดวซสามารถทาใหส DPPH• จางลงไดอกดวย (6) ผกทนามาศกษา

1.ผกกด 2.ผกตว 3.ผกปลงขาว 4.ยานาง 5.ผกเหมยง 6.ผกหวานบาน

8

1.ผกกด

รปท 2 ผกกด วงศ : ATHYRIACEAE ชอวทยาศาสตร : Diplazium esculentum (Retz.) Swartz ชอพนเมอง : ผกกดขาว (เชยงใหม) ผกกด (กลาง) ลกษณะทางพฤกษศาสตร :

ผกกดเปนผกจาพวกเฟรน มเหงาตงตรง สงมากกวา 1 เมตร มเกลดสนาตาลเขม ขอบดาขอบเกลดหยกซฟน ลกษณะของใบเปนใบประกอบแบบขนนกสองชน แผนใบมขนาดตางกน มกยาวกวา 1 เมตร กานใบยาว 70 เซนตเมตร กลมใบยอยคลาง มกลดขนาด ปลายเรยวแหลม โคนรปกงหวใจหรอรปตงห ขอบหยกเวาลกเปนแฉกเกอบถงเสนกลาง ใบยอย แฉกปลายมน ขอบหยกซฟน แผนใบบาง กลมอบสปอร อยตามความยาวของเสนใบยอย มกเชอมกบกลมอบสปอรทอยในแฉกตดกนซงมเสนใบมาสานกน การขยายพนธ : สปอรและเหงา การใชประโยชน : ทางอาหาร : ใบออนและชอออน แกงผกกด แกงกบปลาสด และนามาลวกหรอสดรบประทานเปนผกจมรวมกบนาพรกแดง นาพรกปลารา หรอนามาแกงแครวมกบผกชนดอนๆ

ทางยา : ใบ แกไขตวรอน แกพษอกเสบ บารงสายตา บารงโลหต แกโลหตจาง ปองกนเลอดออกตามไรฟน ขบปสสาวะ ฤดทใชประโยชน : ฤดฝน (9)

9

2. ผกตว

รปท 3 ผกตว

วงศ : GUTTIFERAE ชอวทยาศาสตร : Cratoxylum formosum (Jack) Dyer ssp. Pruniflorum(Kurz.) Gogelin ชอพนเมอง : แตว (ไทย) , ตวขน (กลางและนครราชสมา), ตวขาว (กรงเทพฯ) , ตวสม(นครราชสมา), เตา (เลย), ขตว ตวเหลอง (ไทย), ผกตว( อบลราชธาน มหาสารคาม-อสาน), ตวแดง ตวยาง ตวเลอด (เหนอ), แตวหน(ลาปาง), กยฉองเซา (กระเหรยง ลาปาง), กวยโซง (กระเหรยง-กาญจนบร), ตาว(สตล), มโตะ(มาเลเซย-นราธวาส),เนคเครแย(ละวา-เชยงใหม), ราเงง(เขมร-สรนทร) ผกตวหรอผกแตว เปนไมปาทขนประปราย ในปาเบญจพรรณแลง ในภาคเหนอ ภาคตะวนออกเฉยงเหนอและทางตอนเหนอของภาคใต ในทสงจากระดบนาทะเลตงแต 200 – 1,000 เมตร ลกษณะทางพฤกษศาสตร : ผกตวเปนไมยนตนขนาดเลกถงขนาดกลางสง 8 – 15 เมตร เรอนยอดเปนพมกลม กงออนมขนนมทวไป เปลอกสนาตาลไหม แตกเปนสะเกด เปลอกในสนาตาลแกมเหลอง และมนายางสเหลองปนแดงซมออกมา ใบมนแกมรปไขกลบ และรปขอบขนาน กวาง 2 – 4 เซนตเมตร ยาว 3 – 13 เซนตเมตร ออกเปนคๆตรงขามกน โคนสอบเรยวสวนทคอนไปทางปลายใบโตออก ปลายสดสอบเขา เนอบางหลงใบมขนสากทองใบมขนนมหนาแนน ดอกสชมพออนถงสแดง กลนหอมออนๆ ออกเปนดอก ผลรปรางรขนาดกวาง 1 เซนตเมตร ยาว 2 เซนตเมตร หรอยอมกวาเลกนอย มนวลขาวตดตามผว เมอแกจดแตกออกเปน 3 แฉก เมลดสนาตาล การขยายพนธ: เมลด ปกชา การใชประโยชน : ทางอาหาร : ดอกออน ใบออนและชอดอกออนรบประทานเปนผกได การปรงอาหาร ชาวไทยภาคกลางและชาวอสานรบประทานตนตวเปนผก โดยทชาวไทยภาคกลางรบประทานยอดตว

10

ออน เปนผกจมกบนาพรกและรบประทานดอกตวสดกบนาพรกปลารา ดอกตวมรสเปรยวนดๆ จมกบนาพรกปลารามรสอรอยมาก สวนชาวอสานรบประทานยอดออน ใบออนและชอดอกเปนผกสดแกลมลาบ กอย นาพรก ซป หมกะท หรอนาไปแกง เพอใหอาหารออกรสเปรยว สวนดอกนาไปตม แกง บางครงแกงรวมกนทงยอดออนและดอกออนเปนผกทอสานนยมรบประทานมากอกชนดหนงและมจาหนายในทองตลาดของทองถนอสาน ทางยา : - ฤดทใชประโยชน : ยอดออนและใบออนผลในฤดฝนและฤดหนาว (2)

11

3. ผกปลงขาว

รปท 4 ผกปลงขาว วงศ : BASELLACEAE ชอวทยาศาสตร : Basella Alba L., Basella rubra L. ชอพนเมอง : ผกปลงขาว (ภาคกลาง), ผกปง (เหนอ) ลกษณะทางพฤกษศาสตร :

ลกษณะของลาตนเปนไมเลอยพนตนไมอน ลาตนอวบนาสเขยวออน ผวเรยบเปนมน มใบเดยวเรยงสลบ รปหวใจขอบใบเรยบ แผนใบเปนมนวาว สเขยวออน ความกวางและความยาวประมาณ 5 – 8 เซนตเมตร อวบนา มดอกชอออกตามซอกใบ ดอกตดทกานออกสขาวหรอสชมพออน ลกษณะผลทรงกลมสเขยวขนาด 0.3 – 0.5 เซนตเมตร เมอสกจะมสนาตาลเขมหรอดา ภายในผลมเมลดทรงกลม มสนาตาล เปลอกแขง การขยายพนธ : เมลด หรอ ปกชาเถา การใชประโยชน : ทางอาหาร : ยอดและดอกออนนาไปตม ลวก หรอนงใหสก รบประทานเปนผกจมนาพรก แกงสม แกงแค ผดกบแหนมหรอแกงใสออมหอย ทางยา : กาน แกพษฝ แกขดเบา แกพรรดก แกทองผก ลดไข ลดอาการแนนทอง ใบ ขบปสสาวะ แกอาการอกเสบ แกกลาก บรรเทาอาการผนคน นาคนจากใบเปนเมอกใชทาชองคลอดชวยชวยใหหญงมครรภคลอดงายขน ดอก ทาแกกลากเกลอน ราก แกมอเทาดาง แกรงแค แกพรรดก ใชเปนยาถนวดใหรอน ฤดทใชประโยชน : ตลอดป (10)

12

4. ยานาง

รปท 5 ยานาง

วงศ : MENISPERMACEAE ชอวทยาศาสตร : Tiliacora triandra Diels. ชอพนเมอง : เถาวลยเขยว เถายานาง ผกจอยนาง จอยนาง (เชยงใหม) เครอยานาง ปเจาเขาเขยว ขนยอ แฮนกม ลกษณะทางพฤกษศาสตร : เปนไมเลอย กงออนมขนออนปกคลม เมอแกแลวผวคอนขางเรยบ รากมขนาดใหญ ใบเดยวออกตดกบลาตนแบสลบ รปรางใบคลายรปไขหรอรปไขขอบขนาน ปลายในเรยว ฐานใบมน ขนาดใบยาว 5 – 10 เซนตเมตร กวาง 2 – 4 เซนตเมตร กานใบยาว 1 เซนตเมตร ดอกออกตามซอกโคนเปนชอยาว 2 – 5 เซนตเมตร ชอหนงๆมดอกขนาดเลกสเหลอง 3-5 ดอก ดอกแยกเพศอยคนละตนไมมกลบดอก ผลรปรางกลมร ขนาดเลก สเขยว เมอแกกลายเปนสเหลองอมแดง และกลายเปนสดา การขยายพนธ : เมลด หว การใชประโยชน : ทางอาหาร : เถาใบออน และใบแก นามาตาคนเอานาสเขยวไปทาแกงหนอไม ใสในแกงขนน แกงอรอก ออม หอหมก ซปหนอไม แกงตมเปรอะ แกงยอดหวาย ทางยา : ทงตน ปรงเปนยาแกไขกลบ ใบ เปนยาถอนพษ ราก เปนยากระทงเปนพษไข แกไข แกเมาสรา ถอนพษสาแดง แกไมผกถาย ฤดกาลทใชประโยชน : ตลอดป(10)

13

5. ผกเหมยง

รปท 6 ผกเหมยง วงศ : GNETACEAE ชอวทยาศาสตร : Gnetum gnemon L. Var. tenerum Markgr. ชอพนเมอง: เหลยง (ชมพร ระนอง ประจวบครขนธ-ใต), เหมยง (พงงา ภเกต กระบ –ใต), เขลยง เรยนแก (นครศรธรรมราช), เหรยง (สราษฎรธาน), ผกกะเหรยง (ชมพร), ผกเมยง (พงงา) ลกษณะทางพฤกษศาสตร :

ผกเหมยงเปนไมพมสงประมาณ 3 – 4 เมตร เปนพชทเจรญทางใบมากกวาลาตนรากแกวของเหมยงใหญ แขงแรงหยงลกลงในดน สามารถทนแลงไดดรากแขนงนอยในรปรางกลมร คลายหอกใบงอกมาจากปลายยอดของตนและกงเปนคๆใบยาว 10 – 20 เซนตเมตร กวาง 10 เซนตเมตร ปลายใบเรยวแหลมและปลายใบมนแหลม ใบสเขยวเปนมนสดใสเมออยในรมเงา แตถาอยในทโลงใบจะสจางหรอขาวทงใบ เหมยงจะออกดอกตดผลเมออาย 5 – 6 ป ออกดอกในเดอนพฤศจกายน – ธนวาคม ดอกขนาดเลก สขาว ชอยาว 3 – 4 เซนตเมตร ผลแกจดชวงเดอนมนาคม-เมษายน ผลกลมยาวคลายไข ผลแกจะมสเหลองเปลอกบาง ผลหนงชอม 10 – 20 ผล การขยายพนธ : เมลด ตอนกง ปกชาหรอใชตนจากรากแขนง การใชประโยชน :

ผกเหมยงมคณคาทางอาหารสงทาใหรางกายแขงแรง ใชยอดออนใสเขาปากเคยว ไปเรอยๆลดความกระหายนาได ทางอาหาร : ยอดออน ใบออน ดอกของผกเหมยงใชเปนผกไดยอดออนและใบออนจะเกบรบประทานไดตลอดปสวนดอกออกในฤดหนาว ฤดกาลทใชประโยชน : ฤดฝน(11)

14

6. ผกหวานบาน

รปท 7 ผกหวานบาน

วงศ : EUPHORBIACEAE ชอวทยาศาสตร : Sauropus androgynus Merr. ชอพนเมอง : ผกหวาน ผกหวานบาน (กลาง อสาน), จาผกหวาน กานตง (เหนอ), มะยมปา (ประจวบครขนธ), ผกหวานใตใบ (สตล-ใต), โกหลยกะนเดาะ (เขมร-แมฮองสอน), นานาเซยม (มาเลย-สตล) ลกษณะทางพฤกษศาสตร :

ผกหวานบานเปนไมพมขนาดเลก สงประมาณ 0.8 – 2 เมตร กงกานสเขยวปนเทา คอนขางเลก ใบเปนใบเดยว กานใบสน ออกแบบสลบ ใบรปรางกลม หรอคอนขางเปนสเหลยมขนมเปยกปนกม ใบกวาง 2 – 3.2 เซนตเมตร ยาว 3.2 – 6 เซนตเมตรปลายใบแหลม โคนใบมน ขอบใบเรยบ มลกษณะคลายใบมะยม มสนวลขาวๆบนหนาใบ ดอกเปนดอกเดยวหรอออกเปนกลม กลมละ 2 – 4 ดอก สมวงแดงหรอสแดงเขม ออกตามซอกใบ มผล 3 พสขาวนวล และออกสชมพเลกนอย รปคลายลกมะยมเรยงตวกนอยใตใบ แตมขนาดเลกกวา คอมเสนผานศนยกลางผลประมาณ 1.0 – 1.5 เซนตเมตร เมลดเปนรปสามเหลยมขนาดเลก การขยายพนธ :

ผกหวานบานเปนพชทชอบทลมตา มความชนพอเหมาะ มกพบในปา ทงปาผสมผลดใบ ปาแดง และตามบรเวณทงนา ปลกงาย ขยายพนธโดยการเพาะเมลด มกพบวาชาวบานภาคกลาง และภาคอสานนามาปลกไวในสวนหรอใกลบาน เพอเกบยอดมารบประทาน การใชประโยชน : ทางอาหาร : ยอดออนใบออน ลกออน รสเยน ใชรบประทานเปนผก โดยยอดออนและใบออนนามาตม ลวก นงหรอผดนามนใหสก นามารบประทานแกลมกบนาพรกรสจด หรออาจนาผกหวานบานมาปรงเปนอาหาร เชน แกงกบหม แกงกบปลา แกงเลยง แกงออม มรสหวาน อรอยนารบประทาน

15

ทางยา : ใชรากฝนทาแกคางทม สรรพคณระงบความรอน ถอนพษไขซา ไขกลบ เนองจากรบประทานของแสลง ฤดทใชประโยชน : ฤดฝน (9)

16

วธดาเนนการวจย

วตถประสงค 1.เพอศกษาและเปรยบเทยบคณสมบตการเปนสารตานอนมลอสระของผกพนบาน 2.เพอตรวจสอบองคประกอบทางเคมทางเคมเบองตนและThin Layer Chromatography

(TLC) วสดและอปกรณ

สารเคม 1. Methanol 2. 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 3. Ascorbic acid (vitamin C) 4. Trolox 5. n-butanol 6. Acetic acid 7. Ferric chloride 8. Tannic acid 9. Catechol

เครองมอและอปกรณ

1. Water bath 2. TLC developing tank 3. TLC silica GF254 4. UV-spectrophotometer 5. Micropipette ขนาด 100 ไมโครลตร 6. Beaker ขนาด 50 มลลลตร 7. Beaker ขนาด 100 มลลลตร 8. Beaker ขนาด 250 มลลลตร 9. Beaker ขนาด 400 มลลลตร

17

10. Beaker ขนาด 600 มลลลตร 11. Cylinder ขนาด 5 มลลลตร 12. Volumetric flask ขนาด 25 มลลลตร 13. Volumetric flask ขนาด 50 มลลลตร 14. Volumetric flask ขนาด 100 มลลลตร 15. Pipet ขนาด 1 มลลลตร 16. Pipet ขนาด 2 มลลลตร 17. Pipet ขนาด 5 มลลลตร 18. Pipet ขนาด 10 มลลลตร 19. Test tube ขนาด 5 มลลลตร 20. เครองปนแยกกาก 21. มด, เขยง 22. ผาขาวบาง 23. ผกพนบานทง 6 ชนด คอ ผกกด ผกตว ผกปลงขาว ยานาง ผกเหมยง

ผกหวานบาน

วธการวจย 1.การเตรยมสารสกดจากผกพนบานและสารละลายของสารสกดแยกทละลายใน

นาและไมละลายในนา 1.1 การเตรยมสารสกดจากผกพนบาน - นาผกพนบานทง 6 ชนด คอ ผกกด ผกตว ผกปลง ยานาง ผกเหมยง ผกหวานบาน ลางใหสะอาดและหนเปนชนเลกๆ

- ชงมาประมาณ 200 กรม ใสในโหลแกว - จากนนนามาสกดดวยเมทานอล 99.8 % พอทวม ปดดวย paraffin,

foil และปดฝาใหสนท ตามลาดบ - นาไปไวในทมดเปนเวลา 3 วน โดยมการเขยาทกวน - เมอครบกาหนดตามเวลา จงนามากรองดวยผาขาวบาง - นากากมาทาการสะบดแยก ลางดวย methanol - จากนนนาสารทสกดได ไประเหยแหงบนเครององไอนาทอณหภม 60

องศาเซลเซยล จนแหง จนไดสารสกดแหง แลวชงนาหนกสารสกดแหงทไดพรอมจดบนทก

18

1.2 การเตรยมสารละลายของสารสกดแยกทละลายในนาและไมละลาย ในนา

- นาสารสกดแหงจากขอ1.1 ไปละลายนาแลวนามากรองจะไดสารสกดแยกทละลายในนา สวนสารสกดทตดบนกระดาษกรองนามาละลายกลบดวย Methanol จะไดสารสกดแยกทไมละลายในนา (5, 7)

- เตรยมสารสกดแยกทละลายในนา โดยใชนาเปนตวทาละลายในความ เขมขนตางๆกน (50 – 1,000 µg/ml)

- เตรยมสารสกดแยกทไมละลายในนา โดยใช Methanol เปนตวทา ละลายในความเขมขนตางๆกน (50 – 1,000 µg/ml)

2. Spectrophotometric assay 2.1 การเตรยมสารละลายมาตรฐาน

- เตรยมสารละลายมาตรฐาน Vitamin C โดยใชนาเปนตวทาละลาย เตรยม 4 ความเขมขน (5 – 20 µg/ml)

- เตรยมสารละลายมาตรฐาน Trolox โดยใช Methanol เปนตวทา ละลาย เตรยม 4 ความเขมขน (5 – 25 µg/ml)

2.2 การเตรยมสารละลาย Methanolic DPPH radical ใหมความเขมขน 2.0 mM

- วธเตรยมสารละลาย DPPH คานวณ : ความเขมขน ของ DPPH ทตองการ คอ 2.0 mM จากสตร M1V2 = g (DPPH ม M.W. = 394.4)

1000 M.W. g = M1V2 x M.W.

100 = 2.0 x 10-3 x 100 x 394.4

1000 = 0.00789 g

ชง DPPH 7.9 mg ใสลงใน volumetric flask ขนาด 100 ml เตม methanol analytical grade ประมาณครงหนง ของ volumetric flask เขยาใหเขากน และปรบปรมาตรจนถงขดทกาหนด (8)

19

2.3 การตรวจวดคณสมบตการเปนสารตานอนมลอสระของสารมาตรฐาน และสารสกดแยกผกพนบาน

- เตมสารละลาย Methanolic DPPH radical จากขอ 2.2 ลงใน test tube จานวน 200 µl

- เตมตวทาละลายนาหรอ Methanol จนครบ 3 ml - เตมสารละลายมาตรฐาน หรอสารสกดแยกผกพนบานทละลายในนา

หรอไมละลายในนาทเตรยมไวจากขอ 1.2 ในแตละความเขมขน จานวน 100 µl - เขยาใหเขากน ตงทงไวในทมด 30 นาท - วดคาการดดกลนแสงดวยเครอง UV spectrophotometer ทความยาว

คลน 515 nm -นาคาทวดไดในแตละความเขมขนหาคาเฉลย แลวนามาคานวณ

% inhibition จากสมการ % Inhibition = 1 - A sample x 100

A control เมอ A sample = absorbance ทวดไดของสารสกดตวอยางทผสมกบ Methanolic DPPH radical A control = absorbance ทวดจาก Methanolic DPPH radical ผสม กบ ตวทาละลายทใช (8)

3. Phytochemical screening เปนการตรวจสอบองคประกอบทางเคมเบองตนของสารสกดจากผกพนบาน เพอ

ตองการทราบวาผกพนบานทแสดงฤทธตานอนมลอสระนน มองคประกอบทางเคมเปนกลมใดโดยใชปฏกรยาเคมงายๆ ซงจะใหผลเปนสหรอการเกดตะกอน ในการวจยนจะตรวจสอบสารกลม Flavonoids และ Phenolic compounds and Tannins โดยองคประกอบเคมเหลานสามารถแสดงฤทธตานอนมลอสระได (12) มการใชสารตรวจสอบดงน - การตรวจสอบสารกลม Flavonoids ใช Shinoda test - การตรวจสอบสารกลม Phenolic compounds and Tannins ใช - 1% Ferric chloride solution ทดสอบ Phenolic compound - Gelatin solution ทดสอบ Tannin - Gelatin salt solution ทดสอบ Tannin - Bromine water ทดสอบ Condense tannins - Vanillin – HCL test ทดสอบ Condense tannins

- Lime water ทดสอบ Hydrolysable tannins

20

4. Thin Layer Chromatography (TLC) Fingerprints เปนการจดทา TLC Fingerprints เพอใชเปรยบเทยบในการศกษาครงตอไป

ซงตรวจสอบโดยอาศยการแยกของสารดวยวธ Thin Layer Chromatography - โดย Adsorbent ทใชเปนชนด silica gel GF254 - นาไป development ใน Solvent system ทเหมาะสม ซงทาในระบบปด โดย

ระบบทใชแยกสารสกด คอ n – Butanol: Acetic acid: Water ในอตราสวน 4: 3: 1 - จากนนนาแผน TLC ออกจากTank ทใชเปนระบบปด แลวทาใหแหง - พนดวย 1 % Methanolic ferric chloride สารมาตรฐานทใชในการเปรยบเทยบ

คอ Tannic acid, Catechol (13)

21

ผลการวจย 1.การเตรยมสารสกดจากผกพนบานและสารละลายของสารสกดแยกทละลายในนาและไมละลายในนา

จากการนาผกพนบานทง 6 ชนดมา 200 กรม หมกดวย methanol 99.8 % และนาไประเหยแหงจะไดนาหนกสารสกดและ % yield ดงตารางท 1 โดยผกตวไดนาหนกสารสกด และม % yield มากทสด คอ 23.81 กรม และ 11.91 % ตามลาดบ ขณะทผกเหมยงไดนาหนกสารสกดและม % yield นอยทสด คอ 9.38 กรม และ 4.69 % ตามลาดบ เมอเทยบกบผกทเหลออก 4 ชนด ททาการทดลอง

ตารางท 1 ปรมาณสารสกดและ% yield ของผกพนบานแตละชนด

ตวอยางพช นาหนกผกสด (กรม)

นาหนกสารสกด(กรม) % yield

ผกกด 200 10.05 5.03 ผกตว 200 23.81 11.91

ผกปลงขาว 200 14.85 7.43 ยานาง 200 15.40 7.70 ผกเหมยง 200 9.38 4.69

ผกหวานบาน 200 11.47 5.74

22

2. Spectrophotometric assay

เมอวดการดดกลนแสงของสารมาตรฐาน Vitamin C และ Trolox ทความยาวคลน 515 nm โดยวด absorbance 2 ครง ทความเขมขนตางๆกน จากนนนามาหาคาเฉลย และนาไปคานวณ % inhibition ไดคาดงตารางท 2 และ 3 ตามลาดบ ตารางท 2 คาการดดกลนแสงของสารมาตรฐาน Vitamin C

Methanol Absorbance

Conc. (µg/ml)

วดครงท 1 วดครงท 2 Average %inhibition

1 0.198 0.200 0.199 16.03 5 0.166 0.163 0.165 30.59

10 0.110 0.111 0.111 53.38 20 0.014 0.013 0.014 94.30

ตารางท 3 คาการดดกลนแสงของสารมาตรฐาน Trolox

Methanol Absorbance

Conc. (µg/ml)

วดครงท 1 วดครงท 2 Average %Inhibition

1 0.236 0.245 0.241 7.50 5 0.218 0.223 0.221 15.19

10 0.190 0.189 0.190 27.12 15 0.140 0.123 0.132 49.42 20 0.090 0.102 0.096 63.08 25 0.056 0.058 0.057 78.08

23

เมอนาขอมลจากตารางท 2 และ 3 ของสารมาตรฐาน Vitamin C และ Trolox มาจดทากราฟเสนตรง ระหวาง % inhibition กบความเขมขนตางๆ เพอหา IC50 พบวา สารมาตรฐาน vitamin C และ Trolox ม IC50 เทากบ 9.34 µg/ml, 15.91 µg/ml ตามลาดบ ดงรปท 8 รปท 8 กราฟความสมพนธทเปนเสนตรงของสารมาตรฐาน Vitamin C และ Trolox กบ % inhibition

020406080

100

0 5 10 15 20 25 30concentration (mcg/ml)

% inh

ibition

vitamin C

trolox

ตารางท 4 แสดงคา % inhibition ของสารสกดผกพนบาน 6 ชนดทนามาทดลอง ทงสารสกดแยกทละลายในนาและสารสกดแยกทไมละลายในนาทความเขมขน 1,000 µg/ml ความยาวคลน 515 nm จากคาทแสดงดงตารางจะเหนวา สารสกดผกตวทงสวนทละลายในนาและไมละลายในนาม % inhibition เทากบ 61.90 % และ 97.00% ตามลาดบ และสารสกดยานางทงสวนทละลายในนาและไมละลายในนาม % inhibition เทากบ 59.84% และ 66.30% ตามลาดบ มคามากกวา 50 % ซงสามารถนามาหา IC50 ได สวนสารสกดผกกด ผกปลงขาว ผกเหมยง ผกหวานบาน ทงสวนทละลายในนาและไมละลายในนาม % inhibition นอยกวา 50 %

24

ตารางท 4 คา % Inhibition ของสารสกดแยกทละลายในนาและไมละลายในนาทความเขมขน 1000 µg/ml วด absorbance 515 nmท 30 นาท

% Inhibition สารสกดผก

สารสกดแยกทละลายในนา สารสกดแยก ทไมละลายในนา

ผกกด 37.56 26.16

ผกตว 61.90 97.00

ผกปลงขาว 25.41 11.73

ยานาง 59.84 66.30

ผกเหมยง 23.99 7.04

ผกหวานบาน 36.78 17.67 จากการวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 515 nm เพอทดสอบฤทธตานอนมลอสระ

ของสารสกดผกพนบานทง 6 ชนด คอ ผกกด ผกตว ผกปลงขาว ยานาง ผกเหมยง และผกหวานบาน ทงสารสกดแยกทละลายในนาและไมละลายในนาโดยวดทความเขมขนตางๆกน และนามาหา % inhibition ไดคาดงตารางท 5-16 ตามลาดบ ตารางท 5 คาการดดกลนแสงของสารสกดผกกดทละลายในนา

Absorbance Conc. (µg/ml) วดครงท 1 วดครงท 2 Average

% Inhibition

50 0.170 0.179 0.175 16.51 150 0.157 0.155 0.156 25.36 250 0.147 0.143 0.145 30.62 500 0.133 0.130 0.132 37.08 1000 0.132 0.129 0.131 37.56

25

ตารางท 6 คาการดดกลนแสงของสารสกดผกกดทไมละลายในนา Absorbance Conc.

(µg/ml) วดครงท 1 วดครงท 2 Average % Inhibition

50 0.232 0.247 0.116 7.17 150 0.218 0.242 0.109 10.85 250 0.215 0.229 0.108 13.95 500 0.206 0.225 0.103 16.47 1000 0.179 0.202 0.090 26.16

ตารางท 7 คาการดดกลนแสงของสารสกดผกตวทละลายในนา

Absorbance Conc. (µg/ml) วดครงท 1 วดครงท 2 Average

% Inhibition

50 0.133 0.130 0.132 30.42 100 0.125 0.123 0.124 34.39 150 0.105 0.106 0.106 44.18 200 0.087 0.104 0.096 49.47 250 0.086 0.083 0.085 55.29 500 0.084 0.078 0.081 57.14 1000 0.075 0.069 0.072 61.90

26

ตารางท 8 คาการดดกลนแสงของสารสกดผกตวทไมละลายในนา Absorbance Conc.

(µg/ml) วดครงท 1 วดครงท 2 Average % Inhibition

50 0.115 0.111 0.113 43.78 100 0.106 0.101 0.104 48.51 150 0.085 0.079 0.082 59.20 200 0.081 0.070 0.076 62.44 250 0.033 0.040 0.037 81.84 500 0.019 0.013 0.016 92.04 1000 0.007 0.005 0.006 97.01

ตารางท 9 คาการดดกลนแสงของสารสกดผกปลงทละลายในนา

Absorbance Conc. (µg/ml) วดครงท 1 วดครงท 2 Average

% Inhibition

250 0.169 0.168 0.169 6.91 500 0.161 0.164 0.163 10.22 750 0.139 0.136 0.138 24.03

1000 0.136 0.134 0.135 25.41 ตารางท 10 คาการดดกลนแสงของสารสกดผกปลงทไมละลายในนา

Absorbance Conc. (µg/ml) วดครงท 1 วดครงท 2 Average

% Inhibition

250 0.210 0.208 0.209 7.52 500 0.208 0.205 0.207 8.63 750 0.206 0.204 0.205 9.29

1000 0.201 0.198 0.200 11.73

27

ตารางท 11 คาการดดกลนแสงของสารสกดยานางทละลายในนา Absorbance Conc.

(µg/ml) วดครงท 1 วดครงท 2 Average % Inhibition

250 0.108 0.104 0.106 42.08 500 0.092 0.088 0.090 50.82 750 0.081 0.076 0.079 57.10 1000 0.073 0.074 0.074 59.84

ตารางท 12 คาการดดกลนแสงของสารสกดยานางทไมละลายในนา

Absorbance Conc. (µg/ml) วดครงท 1 วดครงท 2 Average

% Inhibition

250 0.166 0.165 0.166 27.09 500 0.149 0.148 0.149 34.58 750 0.102 0.105 0.104 54.41 1000 0.078 0.075 0.077 66.30

ตารางท 13 คาการดดกลนแสงของสารสกดผกเหมยงทละลายในนา

Absorbance Conc. (µg/ml) วดครงท 1 วดครงท 2 Average

% Inhibition

250 0.166 0.174 0.170 1.73 500 0.154 0.152 0.153 11.56 750 0.153 0.149 0.151 12.72 1000 0.132 0.131 0.132 23.99

28

ตารางท 14 คาการดดกลนแสงของสารสกดผกเหมยงทไมละลายในนา Absorbance Conc.

(µg/ml) วดครงท 1 วดครงท 2 Average % Inhibition

250 0.262 0.264 0.263 2.59 500 0.260 0.261 0.261 3.52 750 0.248 0.255 0.252 6.85 1000 0.250 0.252 0.251 7.04

ตารางท 15 คาการดดกลนแสงของสารสกดผกหวานบานทละลายในนา

Absorbance Conc. (µg/ml) วดครงท 1 วดครงท 2 Average

% Inhibition

250 0.143 0.174 0.149 14.37 500 0.131 0.152 0.128 26.44 750 0.120 0.149 0.118 32.18 1000 0.111 0.131 0.110 36.78

ตารางท 16 คาการดดกลนแสงของสารสกดผกหวานบานทไมละลายในนา

Absorbance Conc. (µg/ml) วดครงท 1 วดครงท 1 Average

%inhibition

250 0.193 0.192 0.193 10.47 500 0.181 0.194 0.188 12.79 750 0.180 0.181 0.181 16.05 1000 0.177 0.177 0.177 17.67

29

จากสารสกดผกตวและยานางทละลายในนาและไมละลายในนา ม % inhibition มากกวา 50% จงนามาจดทากราฟเสนตรงระหวาง % inhibition กบความเขมขนตางๆ สามารถหา IC50 ไดจากกราฟ พบวา สารสกดผกตวแสดงฤทธตานอนมลอสระมากทสด โดยสารสกดสวนทละลายไดในนาและสวนทไมละลายในนาใหคา IC50 เทากบ 205.96 µg/ml และ 101.79 µg/ml ตามลาดบ ดงรปท 9 รองลงมาคอ สารสกดยานาง ใหคา IC50 499.24 µg/ml (สวนทละลายไดในนา) และ 772.63 µg/ml (สวนทไมละลายในนา) ดงรปท 10 สวนสารสกดจากผกอก 4 ชนดมคา IC50

มากกวา 1,000 µg/ml รปท 9 กราฟความสมพนธทเปนเสนตรงของสารสกดผกตวทละลายในนาและไมละลายในนากบ % inhibition

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 100 200 300 400

Concentration (mcg/ml)

% inh

ibition

สารสกดแยกทละลายในนา

สารสกดแยกทไมละลายในนา

30

รปท 10 กราฟความสมพนธทเปนเสนตรงของสารสกดยานางทละลายในนาและไมละลายในนากบ % inhibition

01020

3040506070

8090

100

0 200 400 600 800 1000Concentration (mcg/ml)

% inh

ibition

สารสกดแยกทละลายในนา

สารสกดแยกทไมละลายในนา

ตารางท 17 การหาคา % inhibition ของสารมาตรฐาน vitamin C , Trolox และสารสกดผกพนบานทง 6 ชนดทละลายในนาและไมละลายในนา โดยนา vitamin C มาเปรยบเทยบกบสารสกดแยกทละลายในนา ขณะท Trolox เปรยบเทยบกบสารสกดแยกทไมละลายในนาและ ม IC50 เทากบ 9.34 µg/ml, 15.91 µg/ml ตามลาดบ สารสกดผกตวทละลายในนาและไมละลายในนาม IC50 เทากบ 205.96 µg/ml, 101.79 µg/ml ตามลาดบ สวนสารสกดยานางทละลายในนาและไมละลายในนา ม IC50 เทากบ 499.24 µg/ml, 772.63 µg/ml ตามลาดบ สวนสารสกดผกกด ผกปลงขาว ผกเหมยง ผกหวานบาน ม IC50 มากกวา 1,000 µg/ml

ตารางท 17 คา % Inhibition ของสารสกดแยกทละลายในนาและไมละลายในนาทความเขมขน 1000 µg/ml วด absorbance 515 nmท 30 นาท

สารมาตรฐาน / สารสกดตวอยาง ละลายในนา (µg/ml) ไมละลายในนา (µg/ml)

Vitamin C 9.34 - Trolox - 15.91 ผกตว 205.96 101.79 ยานาง 499.24 772.63

31

ผกกด >1000 >1000 ผกปลงขาว >1000 >1000 ผกเหมยง >1000 >1000

ผกหวานบาน >1000 >1000 3. Phytochemical screening

จากการหาองคประกอบทางเคมเบองตนของ Flavonoids และ Phenolic compounds and Tannins ของสารสกดผกตวและยานาง พบวา ยานางไมม Flavonoids เปนองคประกอบเนองจากใหผลลบกบ Shinoda test แตม Phenolic compounds จากการทใหผลบวกกบ1% ferric chloride solution สวนสารสกดผกตวไมม Flavonoids เปนองคประกอบเชนกน แตผกตวม tannin เปนองคประกอบทางเคมทใหผลบวกกบ Gelatin solution และ Gelatin salt solution และเปน tannin ชนด Hydrolysable tannin จากการใหผลบวกกบ Lime water ดงตารางท 18

ตารางท 18 ผลการตรวจสอบองคประกอบทางเคมเบองตนของ Phenolic compounds

Result สารทดสอบ

ผกตว ยานาง 1. Shinoda test - - 2. 1%Ferric Chloride solution + (นาเงนเขยว) + 3. Gelatin solution + (ตะกอนขนขาว) - 4. Gelatin salt solution + (ตะกอนขนขาว) - 5. Bromine water - - 6. Vanillin- HCl test - -

7. Lime water + (ตะกอนเหลอบนาเงนเทา)

-

32

4. Thin Layer Chromatography (TLC) Fingerprints

จากการทา Thin Layer Chromatography เปนการตรวจสอบโดยอาศยการแยกของสารโดยระบบทใช คอ n- butanol : acetic acid : water ในอตราสวน 4 : 3 : 1 โดย fingerprints ทได เปนผลจากการตรวจสอบของสารสกดผกตวและยานาง หลงจากพนดวย 1 % methanolic ferric chloride และสารมาตรฐานทใชคอ Tannic acid , Catechol แสดงดงรปท 11 และ 12 ตามลาดบ รปท 11 Fingerprints ของสารสกดผกตวหลงสเปรยดวย 1 % methanolic ferric chloride

รปท 12 Fingerprints ของสารสกดยานางหลงสเปรยดวย 1 % methanolic ferric chloride

A = catechol B = tannic acid C = ผกตว Rf1B tannic acid = 0.73 Rf2B tannic acid = 0.57 Rf1C ผกตว = 0.73 Rf2C ผกตว = 0.63

C B A

1B

2B

1C 2C

A = catechol B = tannic acid C = ยานาง Rf1A catechol = 0.79 Rf1C ยานาง = 0.80 Rf2C ยานาง = 0.62

A B C

1A 1C

2C

33

สรปและวจารณผลการวจย จากการศกษาสามารถสรปและวจารณผลการทดลองไดดงน

1. การทดสอบฤทธตานอนมลอสระโดยวธ DPPH ของผกพนบานทง 6 ชนด ไดแก ผกกด, ผกตว, ผกปลงขาว, ยานาง, ผกเหมยง และผกหวานบาน พบวา สารสกดจากผกตวแสดงฤทธตานอนมลอสระมากทสด โดยสารสกดสวนทละลายในนาและสวนทไมละลายในนาใหคา IC50 เทากบ 205.96 µg/ml และ 101.79 µg/ml ตามลาดบ รองลงมาคอ สารสกดจากยานาง ใหคา IC50 499.24 µg/ml (สวนทละลายในนา) และ 772.63 µg/ml (สวนทไมละลายในนา) สาหรบวตามนซและวตามนอ ใหคา IC50 9.34 µg/ml และ 15.91 µg/ml ตามลาดบ สวนสารสกดจากผกอก 4 ชนด ไดแก ผกกด, ผกปลงขาว, ผกเหมยง และผกหวานบาน มคา IC50 มากกวา 1,000 µg/ml จากการตรวจสอบองคประกอบทางเคมเบองตนพบวา ผกตวม Hydrolysable tannin สวนยานางม Phenolic compounds และมรายงานการวจยอนๆซงสนบสนนการทดลองรายงานวาสารกลม Phenolic compounds และ Hydrolysable tannin มกแสดงฤทธตานอนมลอสระ นอกจากนมการศกษาผกพนบานและสมนไพรไทยทมฤทธตานอนมลอสระ พบสาร Phenolic compounds และ / หรอ Hydrolysable tannin ดวย (1,5)

2. เมอเปรยบเทยบความแรงของการแสดงฤทธตานอนมลอสระสารสกดแยกสวนทละลายในนา กบสารมาตรฐานวตามนซ พบวาสารสกดผกตวและยานาง มความแรงนอยกวาวตามนซ 20 เทา และ 50 เทา ตามลาดบ และการเปรยบเทยบความแรงของการแสดงฤทธตานอนมลอสระสารสกดแยกสวนทไมละลายในนา กบสารมาตรฐาน Trolox พบวา สารสกดผกตวและยานาง มความแรงนอยกวา Trolox 6 เทา และ 50 เทา ตามลาดบ สวนสารสกดผกอก 4 ชนด ไดแก ผกกด, ผกปลงขาว, ผกเหมยง และผกหวานบาน มคา IC 50 มากกวา 1000 µg/ml

3. การทา Thin Layer Chromatography ระบบทใชแยกสารสกดคอ n – butanol : acetic acid : water ในอตราสวน 4 : 3 : 1 จาก fingerprints ของสารสกดผกตว จะเหนวาม 2 จด โดยม 1 จด ทตรงกบ tannic acid จงอาจสรปไดวาสารสกดผกตวม tannic acid เปนองคประกอบ สวน tannic acid ทเกดขน 2 จด นนอาจมาจากการเกด degradation ของสารทมการใชงานมานานแลว สวน fingerprints ของสารสกดยานาง พบวาม 2 จด และม 1 จด ทตรงกบ catechol จงสรปวา ยานางม catechol เปนองคประกอบ

34

ขอเสนอแนะ

1. ควรทาการทดสอบฤทธตานอนมลอสระโดยวธ DPPH ของผกพนบานแตละชนดจาก

หลายๆแหลง 2. ตรวจสอบฤทธตานอนมลอสระควรใชวธอนรวมดวย เชน FRAP, ORAC, TRAP, Lipid

peroxidation เปนตน 3. ควรทาการทดสอบฤทธตานอนมลอสระโดยวธ DPPH ของผกพนบานชนดอนๆเพมขน 4. วธการสกดอาจเปลยนไปใชวธอนได

ประโยชนทไดรบ

1. เรยนรเทคนคและเพมทกษะในการดาเนนการวจย 2. มขอมลสนบสนนการเลอกบรโภคผกพนบานและสงเสรมใหเปนทรจกมากขน

35

เอกสารอางอง

1. อญชนา เจนวถ. การตรวจหาและบงชชนดสารตานอนมลอสระจากผกพนบานและสมนไพร ไทย. [วทยานพนธหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชา เทคโนโลยชวภาพ]. เชยงใหม: บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยเชยงใหม; 2544. 2. เพญนภา ทรพยเจรญ, บรรณาธการ. ผกพนบานและอาหารพนบาน 4 ภาค. กรงเทพฯ: องคการ สงเคราะหทหารผานศก, 2542. 3. มาโนช วามานนท, บรรณาธการ. ผกพนบาน: ความหมายและภมปญญาของสามญชนไทย. ครงท 2. กรงเทพฯ: องคการสงเคราะหทหารผานศก, 2540. 4. โอภา วชระคปต, บรรณาธการ. สารตานอนมลอสระในธรรมชาต. ครงท 1. กรงเทพฯ: พ. เอส.พรนท, 2549. 5. Surveswan S., Cai Y. Systematic evaluation of natural phenolic antioxidants from 133

Indian medicinal plants. Food Chemistry[Online]2006. Available from: http://www.sciencedirect.com/locate/ foodchem.html[Accessed 2006 August 15]

6. Dejian H., Boxin O. The Chemistry behind Antioxidant Capacity Assays. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2005 ; 53 : 1841-1856. 7. Dasgupta N., De B. Antioxidant activity of some leafy vegetables of India: A

Comparative study.Food Chemistry[Online]2005 .Available from: http:// www.sciencedirect.com/locate/ foodchem.html [Accessed 2006 July 3]

8. Brand-Williams N., Cuvelier M.E. Use of a Free Radical Method to Evaluate Antioxidant Activity. Academic Press Limited 1995; 28: 25-30

9. เพญนภา ทรพยเจรญ, บรรณาธการ. ผกพนบานภาคกลาง. กรงเทพฯ: องคการสงเคราะหทหาร ผานศก, 2542. 10. เพญนภา ทรพยเจรญ, บรรณาธการ. ผกพนบานภาคเหนอ. กรงเทพฯ: องคการสงเคราะห

ทหารผานศก, 2542. 11. ลนทม จอนจวบทรง, บรรณาธการ. ผกพนบาน(ภาคใต)ทางเลอกในการผลตและการบรโภค. ครงท 1. กรงเทพฯ: องคการสงเคราะหทหารผานศก, 2537.

36

12. นนทวน บณยะประภศร. การสกดแยกและพสจนเอกลกษณของสารสาคญจากสมนไพร. ใน: นพมาศ สนทรเจรญนนท, บรรณาธการ. ยาและผลตภณฑธรรมชาต เลมท 1. ครงท 3: กรงเทพฯ; หจก. แสงเทยนการพมพ, 2544: 129 – 68. 13. นพมาศ สนทรเจรญนนท. การตรวจสอบคณภาพและมาตรฐานของสมนไพรโดยใชวธ Thin- layer chromatography. เอกสารประกอบการสอนวชาการผลตภณฑธรรมชาตระดบนา รอง ภาคการศกษา 2548; คณะเภสชศาสตร มหาวทยาลยมหดล.

37

ภาคผนวก

การเตรยมสารละลายทดสอบ

1. Bromine water Potassium Bromate 3 g Potassium Bromide 15 g Distilled Water q.s. 1,000 ml เวลาทจะทดสอบใชสารละลายทเตรยมไว 5 สวน ผสมกบ Conc. HCl

1 สวนเตรยมแลวใชทนท 2. 1%Ferric chloride solution

ละลาย 1 กรม Ferric chloride ในเมทานอลเตมใหเปน 100 ml กรอง ถามตะกอน 3. Gelatin solution

Gelatin 1 g Distilled Water q.s. 100 ml

4. Gelatin salt solution Gelatin solution 1% 50 ml Sodium chloride solution 50 ml

5. Lime water (Calcium Hydroxide solution) Calcium Hydroxide 3 g Potassium iodide 5 g

Distilled Water q.s. 1,000 ml 6. Vanillin reagent

Vanillin 10 g Ethyl Alcohol q.s. 100 ml

38

การตรวจสอบ Flavonoids

วธท 1 การตรวจสอบ Flavonoids (Shinoda test) 1. บดผงยา 3 กรม ในโกรงกบ petroleum 15 ml บดซาจนไมมสออกมาในชน

ของ petroleum ether 2. บดกากทไดกบ 80 % Ethanol 30 ml กรองเกบ filtrate ทไดไปทดสอบ

ถายสารสกด 1 ml ลงในหลอดทดลอง

ใส Mg ribbon 3-4 อน

เตม Conc. HCL 10 หยด

สงเกต สสมถงสแดง

วธท 2 (Pew test)

ถายสารสกด 1 ml ลงหลอดทดลอง

เตม Zn-dust 0.5 g + 2N HCL 2หยด

เขยา 1 นาท

39

เตม Conc. HCl 10 หยด

สงเกตสแดงเขม ภายใน 2-5 นาท แสดงวาม flavonoid หรอ flavonol-3-glycoside สวน flavanone และ flavonol จะใหสจางๆ

การตรวจสอบ Phenolic compounds and Tannins

การเตรยมสารสกด

ละลายสารสกด ดวยนาใหเจอจางพอเพอใหสงเกตสได

(125 mg + นา 50 ml)

กรอง

เตม 10% NaCl 1 ml

กรอง (เกบ filtrate)

วธการตรวจสอบ แบงสารสกดใสหลอดทดลอง หลอดละ 2 ml จานวน 9 หลอด

หลอดท 1 Control หลอดท 2 เตม gelatin solution 2-3 หยด

40

Positive: ตะกอนขนขาว หลอดท 3 เตม gelatin salt solution 2-3 หยด

Positive: ตะกอนขนขาว หลอดท 4 เตม 1% ferric chloride 2-3 หยด

Positive: สนาเงนเขยว หลอดท 5 เตม bromine water 5-6 หยด

Positive: ตะกอนเบาสออน (buff- coloured) หลอดท 6 Formalin –HCl test

เตม 40% formalin 3 หยด ตามดวย10 % HCl 6 หยด จากนน ตมในอาง องไอนา 1-2 นาท Positive: ตะกอนสแดง (phlobaphene) ไมละลายในนารอน ethanol หรอ 5 % KOH

หลอดท 7 Vanillin – HCl test ถายสารสกดลงใน evaporating dish ระเหยจนแหงบนอางองไอนา เตม vanillin reagent 1 ml + conc. HCl 1 หยด Positive: สแดง (crimson colour)

หลอดท 8 เตม Lime – Water 5 ml Positive: ตะกอนสเหลอบนาเงนเทา

(blue-gray colour)

การสรปผลการทดลอง 1.ใหผลลบ (-) กบ gelatin และ gelatin salt solution ไมใหสกบ ferric chloride

สรป : ไมม tannins ไมม polyphenol 2.ใหผลบวก (+) กบ gelatin และ gelatin salt solution ใหสออกเขยวกบ ferric

Chloride, ใหผลบวก (+) กบ bromine water, Formalin – HCl test และ Vanillin – HCl test, lignin test, ใหผลลบกบ Lime – Water

สรป : ม condensed tannin 3.ใหผลบวก (+) กบ gelatin และ gelatin salt solution ใหสออกนาเงนดา

41

นาเงนดา กบ ferric chloride, ใหผลลบ (-) กบ bromine water, Formalin – HCl test และ Vanillin – HCl test , lignin test ใหผลบวกกบ Lime – Water

สรป : ม hydrolysable tannin 4.ใหผลบวกกบทก test ใหสนาเงนอมเขยวกบ ferric chloride

สรป : ม tannins ทง สองประเภท 5.ใหผลลบ (-) กบ gelatin และ gelatin salt solution ใหสนาเงน หรอสเขยว หรอ

สผสมของทง สองสกบ Ferric chloride, ใหผลบวกกบ lignin test สรป: ไมม tannins ม phenolic compounds