)

Determination of Methamphetamine and Amphetamine in Plasma by

Gas Chromatography Technique with Flame Ionization Detector

Kesirinporn Kulkue

A Thesis Submitted in Partial Fullfillment of the Requirements

for the Degree of Master of Science in Forensic Science

Prince of Songkla University

2553

)

( )

( ) ( )

( )

( )

( )

)

2553

(GC-FID)

3.62 3.34 - 0.00

0.10 - 2.00

r2 = LOD

23 0.0264

LOQ 09

0.0882 %recovery

0.10, 0.50, 2.50, 10.00 50.00

0.10, 0.25, 0.50, 1.00 2.00

1 - 109% 93 - 104%

(intraday interday %RSD

- % 3.91 - 8.68% 0.82 - 4.34% 3.44

- 8.11%

6

0.24 - 1.31 0.23 - 0.32

overdose

)

Thesis title Determination of Methamphetamine and Amphetamine in Plasma by

Gas Chromatography Technique with Flame Ionization Detector Author Miss Kesirinporn Kulkue

Major Program Forensic Science

Academic Year 2010

Abstract

Determination of methamphetamine and amphetamine in plasma was

performed by gas chromatography with flame ionization detector GC-FID). Plasma

sample was prepared by protein precipitation with methanol. The results showed the

retention time of methamphetamine and amphetamine peak were at 3.62 and 3.34 min,

respectively. The calibration curves were all linear in the concentration range of 0.10 -

50.00 µg/mL for methamphetamine and 0.10 - 2.00 g/mL for amphetamine with good

correlation coefficient (r2 = 0.9999) The limit of detection (LOD) of methamphetamine

and amphetamine were 0.0123 and 0.0264 µg/mL, respectively, and limit of

quantification (LOQ) of methamphetamine and amphetamine were 0.0409 and 0.0882

µg/mL, respectively. The percentage recoveries in plasma were 81 - 109% for

methamphetamine at concentrations of 0.10, 0.50, 2.50, 10.00 and 50.00 µg/mL and 93

- 104% for amphetamine at concentrations of 0.10, 0.25, 0.50, 1.00 and 2.00 g/mL.

The intra and inter day precisions of the developed method were 1.66 - 8.95% and 3.91

- 8.68% for methamphetamine, 0.82 - 4.34% and 3.44 - 8.11% for amphetamine. The

application of determination of methamphetamine and amphetamine in human plasma

of 6 cases of dead bodies revealed variable concentrations of methamphetamine and

amphetamine, ranging from 0.24 to 1.31 g/mL and 0.23 to 0.32 g/mL, respectively.

Overall, this gas chromatography with flame ionization detector

technique developed can be applied for the determination of methamphetamine and

amphetamine in blood from drug addicts and dead bodies as a consequence of drug

overdose. Furthermore, it is low cost and provides effective, sensitive and accurate

detection of low concentrations of methamphetamine in human plasma, and thus, is the

good option for forensic toxicological application.

)

)

(3)

Abstract (4)

(5)

(6)

(8)

(10)

(12)

1. 1

1.1 1

1.2 4

1.2.1 4

1.2.2 9

1.2.3 17

1.2.4 (Sample preparation) 24

1.2.5 33 1.3 36

2. 37

2.1 37

2.2 38 2.3 38

2.3.1 38

2.3.2 38

2.3.3 39

specificity/selectivity

2.3.4 39

2.4 method validation) 39 2.5 43

2.6 44

)

( )

2.7 44

3. 45

3.1 45

3.2 47 specificity/selectivity

3 method validation 53

3.3.1 53

3.3.2 62

3.4 70

4. 77

80

87

97

)

1.1 9

1.2 10

1.3 GC 20

1.4 32

2.1 41

2.2 42

2.3 GC-FID 44

3.1 4 45

3.2

4

3.3 47

3.4 55

blank

.5 57

3.6 57

3.7 58

Freeze-thaw stability

3.8 59

Long-term stability

3.9 60

Short-term stability

3.10 61

Post-preparative stability

3.11 64

blank

3.12 66

)

3.13 66

3.14 67

Freeze-thaw stability

3.15 68

Long-term stability

3.16 69

Short-term stability

3.17 70

Post-preparative stability

3.18 71

1 91

2 92

)

1.1 2550 - 2553 6

1.2 9

1.3 10 1.4 12

1.5 Metabolism) 14

1.6 18

1.7 Split / Splitless 19

1.8 22

1.9 26

1.10 27

1.11 29

1.12 3.1 blank 47

3.2 blank 3.3

20.00

3.4

20.00

3.5 20.00

3.6 20.00

3.7 overlay ; A 50

B 20.00

3.8 3,4-methylenedioxymethamphetamine

20.00

3.9 1.00

3.10 53

3.11 blank 54

)

3.12 54

0.50

3.13 55

0.50

3.14 62

3.15 blank 63

3.16 63

1.00

3.17 64

1.00

3.18 case A1 72

3.19 case A2 72

3.20 case A3 73

3.21 case A4 73

3.22 case A5 74

3.23 case A6 74

)

1.1 7

1.2 2548 - 8

2553

3.1 4 46

3

1 93

Freeze-thaw stability

2 93

Long-term stability

3 94

Short-term stability

4 94

Post-preparative stability

4

1 95

Freeze-thaw stability

2 95

Long-term stability

3 96

Short-term stability

4 96

Post-preparative stability

1

บทท 1

บทน า

1.1 บทน าตนเรอง เมทแอมเฟตามน (methamphetamine, MA) จดอยในกลมอนพนธของสารกลมแอมเฟตามน (amphetamine, AM) และเปนสวนประกอบหลกของยาบาในประเทศไทย สารกลมนแพรระบาดอย 3 รปแบบ คอ แอมเฟตามนซลเฟต (amphetamine sulfate) เมทแอมเฟตามน (methamphetamine) และเมทแอมเฟตามนไฮโดรคลอไรด (methamphetmine hydrochloride) ซงจากการตรวจพสจนเมดยาในประเทศไทย พบวา เกอบทงหมดมเมทแอมเฟตามนไฮโดรคลอไรดผสมอย (ส านกงาน ป.ป.ส., 2545) ในอดตแอมเฟตามนใชเปนยารกษาโรค ทนยมคอเปนยาแกหวด เนองจากมฤทธในการกระตนระบบประสาทสวนกลาง ท าใหเกดความรสกตนตว กระปรกระเปรา ระยะหลงจงมผน ามาใชเปนสารเสพตดเพอเพมความสามารถในการท างาน โดยเฉพาะกลมผท างานหนก เชน กรรมกร คนขบรถบรรทก นกศกษาในชวงอานหนงสอสอบ โดยการรบประทาน ปจจบนเมทแอมเฟตามนเปนสารทแพรระบาดเขาไปสทกกลมอาชพ โดยเฉพาะกลมเยาวชน นกเรยน นกศกษาและนกเทยวกลางคน มกเสพเพอความบนเทง ความสนกสนาน ท าใหมนใจ และเปลยนวธใชเปนแบบสบเอาควน ท าใหรสกเคลมสข (euphoria) ไดรวดเรวกวาการรบประทาน ท าใหมการลกลอบผลตและจ าหนายอยางผดกฎหมายเพมขนจนกอใหเกดปญหาตอสงคม เนองจากพฤตกรรมของผเสพทตองเพมขนาดยาขนเรอยๆ จนท าใหเกดอาการของประสาทหลอน วตกกงวล หวาดระแวงเหมอนคนบาจนตองเปลยนชอเรยกเปนยาบา (สมศร ไชยภารมณ, 2549) เมทแอมเฟตามนมลกษณะเปนเมดกลมแบนขนาดเลก เสนผานศนยกลางประมาณ 6 - 8 มลลเมตร ความหนาประมาณ 3 มลลเมตร น าหนกเมดยาประมาณ 80 - 100 มลลกรม สวนใหญมสญลกษณ WY หรอ Wy พบเปนสญลกษณ R หรอ SY ไดบาง ในถงบรรจขนาด 200 เมด จะพบเมดยาสสม สแดง สมวงและจะมเมดสเขยวจ านวน 2 เมด ในเมทแอมเฟตามน 1 เมดจะประกอบดวยเมทแอมเฟตามนไฮโดรคลอไรด (20 - 30 เปอรเซนต) คาเฟอน (60 – 70 เปอรเซนต) และสารอนๆ พวกแปงและส จากปรมาณของสารบรสทธเมทแอมเฟตามนไฮโดรคลอไรดทมปรมาณนอยมากหรอบางเมดอาจไมมเลย ในกลมผเสพจงเรยกวา ยาบาเทยม (Puthaviriyakorn et al., 2002) การแพรระบาดอยางรนแรงของเมทแอมเฟตามน ท าใหกระทรวงสาธารณสขไดประกาศใหสารกลมแอมเฟตามนรวมทงอนพนธของแอมเฟตามนเปนสารเสพตดใหโทษรายแรงประเภทท 1 ตามพระราชบญญตยาเสพตดใหโทษป พ.ศ. 2522 (วโรจน สมใหญ, 2543) และม

2

การก าหนดโทษผคาสารเสพตดกลมแอมเฟตามนตามพระราชบญญตยาเสพตดใหโทษป พ.ศ. 2522 แกไขเพมเตม (ฉบบท 5) พ.ศ. 2545 เกยวกบบทลงโทษตามมาตรา 15 วรรค 3 สรปไดคอ การผลต น าเขา สงออก หรอมไวในครอบครองซงแอมเฟตามนหรออนพนธของแอมเฟตามน มปรมาณค านวณเปนสารบรสทธตงแต 375 มลลกรมขนไปหรอมยาเสพตดทมสารดงกลาวน าหนกสทธ 1.5 กรมขนไปใหถอวาเปนการผลต น าเขา สงออก หรอมในครอบครองเพอจ าหนาย มบทลงโทษตามปรมาณทมอย แตถามปรมาณค านวณเปนสารบรสทธตงแต 375 มลลกรมถง 20 กรมหรอมากกวาตองระวางโทษสงสดถงประหารชวต (สมศร ไชยภารมณ, 2549) แตเมทแอมเฟตามนยงคงแพรระบาดอยางตอเนอง หลงจากรฐบาลสามารถประกาศชยชนะตอปญหายาเสพตดได เมอวนท 3 ธนวาคม พ.ศ. 2547 ท าใหปญหายาเสพตดลดความรนแรงลง (เพมพงษ เชาวลต, 2550) แตกไมสามารถก าจดเมทแอมเฟตามนใหหมดไปได หลงจากทมการเปลยนแปลงทางการเมองกมการแพรระบาดของเมทแอมเฟตามนอยางตอเนองเพมมากขนในปจจบน เมทแอมเฟตามนเมอเขาสรางกายจะถกดดซมไดดในทางเดนอาหารและเขาสกระแสเลอด ออกฤทธทสมองและขบออกจากรางกายไดทางลมหายใจ เหงอและปสสาวะ การตรวจวดเมทแอมเฟตามนมความส าคญในการยนยนวา ผตองสงสยหรอผเสยชวตมการเสพเมทแอมเฟตามนหรอไม ซงเมทแอมเฟตามนสามารถตรวจพบไดในตวอยางปสสาวะ เลอด น าจากกระเพาะ เหงอ เสนผมและเลบของผเสพ (Jirovsky et al., 1998) ในปจจบนการตรวจวดเมทแอมเฟตามนจะท าการตรวจสอบเบองตนโดยใช “ปสสาวะ” เนองจากเมทแอมเฟตามนคงอยในปสสาวะไดนานกวาตวอยางอน ปรมาณเมทแอมเฟตามนในปสสาวะมมากกวาในเลอดและการตรวจจากปสสาวะท าไดงายกวาตวอยางอน การตรวจเมทแอมเฟตามนท าได 2 ขนตอน คอ การตรวจพสจนขนตน (screening test) และ การตรวจยนยนผล (confirmation test) ซงทง 2 วธจะตองตรวจเมอผเสพเมทแอมเฟตามนครงสดทายไมเกน 12 - 72 ชวโมง (Kraemer and Maurer, 1998) การตรวจพสจนขนตนม 2 วธ คอ color test และ immunoassay test kit ส าหรบวธการตรวจยนยนผล นยมใชเทคนคทางโครมาโทกราฟทมความไว(sensitivity) และความจ าเพาะสง (specificity) ซงในประเทศไทยสวนใหญจะใชเทคนคทนเลเยอรโครมาโทกราฟ (thin-layer chromatography, TLC) เพราะเปนวธการตรวจยนยนขนพนฐานและไมสนเปลองคาใชจาย แตขอดอยของการใชเทคนค TLC คอ ใชเวลาในการทดสอบนาน มความไว และความจ าเพาะทต ากวาวธอน (Scott, 2008) เชน ไฮเปอรฟอรแมนซลควด โครมาโทกราฟ (high performance liquid chromatography, HPLC) และ แกสโครมาโทกราฟแมสสเปกโทรเมทร (gas chromatography/mass spectrometry, GC/MS) ซงเปนวธการตรวจยนยนผลทดทสด แตคาใชจายสง ตองใชผมประสบการณและความช านาญสงในการทดสอบ ในทางการแพทยจะใชวธตรวจพสจนขนตน แตในทางกฎหมายหรอเพอพสจนวาไมมเมทแอมเฟตามนในรางกายจ าเปนตองตรวจเพอยนยน แตบางครงปสสาวะมกจะถกปนเปอนจากสารอน

3

การตรวจขนตนอาจพบ “ผลบวกเทจ” ไดจากการใชยาบางชนด โดยเฉพาะยาในกลม symphathomimetic amine เชน อฟดรน (ephedrine), ซโดอฟดรน (pseudoephedrine), ไดเฟนไฮดรามน (diphenhydramine) และยาลดความอวน เชน เฟนเทอรมน (phentermine) รวมทงยาอกหลายชนด เชน เคตามน (ketamine), เฮโรอน (heroin), โคดอน (codeine) และเอมเนปทน (amineptine) เปนตน (Moffat et al., 1986; ศภรตน ธรรมพทกษ, 2550) ท าใหไมสามารถตรวจสอบได หรอในกรณทไมสามารถเกบตวอยางได เชน จากศพทเสยชวตจากการเสพยาเกนขนาด (overdose) หรอกรณทเปนการตรวจทางคลนกเพอหาระดบการออกฤทธหรอระดบของสารเสพตดทท าใหเสยชวต วธการตรวจวดทดทสดคอ การตรวจหาปรมาณจากเลอด (Levine, 2003) การตรวจวดเมทแอมเฟตามนในเลอดนยมใชเทคนคทางโครมาโทกราฟ เชน แกสโครมาโทกราฟ (gas chromatography, GC), แกสโครมาโทกราฟแมสสเปกโทรเมทร (gas chromatography - mass spectrometry, GC-MS), ไฮเปอรฟอรแมนซลควดโครมาโท กราฟ (high performance liquid chromatography, HPLC) และ ลควดโครมาโทกราฟ - แทนเดมแมสสเปกโทรเมทร (liquid chromatography - tandem mass spectrometry, LC-MS/ MS) (Kikura and Nakahara, 1995 ; Sato and Mitsui, 1997 ; Okajima et al., 2001 ; Nishida et al., 2002 ; Martinis et al., 2007) แตเทคนคดงกลาวมขอจ ากด คอ คาใชจายในการวเคราะหสง อกทงเครองมอและผช านาญการมนอยจะมเฉพาะในหนวยงานขนาดใหญ จงจ าเปนตองประยกตใชเครองมอพนฐานทมในหนวยงานดานวทยาศาสตร อยางเชน แกสโครมาโทกราฟเฟลมไอออไนเซชน (gas chromatography - flame ionization detector, GC-FID) มาใชในการตรวจวดเมทแอมเฟตามนในเลอด โดยผลทไดมความถกตองแมนย าและคาใชจายในการวเคราะหต า ดงนนในการศกษานตองการประยกตใชเทคนคแกสโครมาโทกราฟตวตรวจวดชนดเฟลมไอออไนเซชน (GC-FID) ในการตรวจวดเมทแอมเฟตามนในพลาสมา เพอลดขอจ ากดในการตรวจวดระดบเมทแอมเฟตามนในเลอด ซงผลการตรวจวดใหคาทถกตองแมนย าและเชอถอได เพอใชประโยชนในทางการแพทยและงานดานนตวทยาศาสตรตอไป

4

1.2 บทตรวจเอกสาร 1.2.1 สถานการณเมทแอมเฟตามนในประเทศไทย ยาเสพตดทแพรระบาดในประเทศไทยมหลายชนด แตในปจจบน "ยาบา" หรอ "เมทแอมเฟตามน" เปนยาเสพตดทเปนปญหามากทสด การแพรระบาดของเมทแอมเฟตามนมความรนแรง ซงสวนใหญมการน าเขาจากแหลงผลตในประเทศเพอนบาน แมจะมการกวดขนจากเจาหนาทของรฐอยางเขมงวด แตไมสามารถกวาดลางเมทแอมเฟตามนใหหมดลงได สถานการณการแพรระบาดของเมทแอมเฟตามนทส าคญม 3 ลกษณะ คอ การผลต การคา/ล าเลยง และการแพรระบาด การผลต จากการรายงานของส านกงานยาเสพตดและอาชญากรรมแหงสหประชาชาต (UNODC) กลาววา เมทแอมเฟตามนทระบาดอยทวโลกมฐานการผลตอยบรเวณชายแดนแมโขงและพนทรฐฉานของประเทศพมา ซงมพนทตดกบประเทศลาว ไทย กมพชาและระบาดเขาสประเทศไทยผานบรเวณสามเหลยมทองทองค าโดยชนกลมนอยตามชายแดนไทย-พมา (UNODC, 2008) ส าหรบการผลตในประเทศไทยอยในพนทชายแดนภาคเหนอเปนหลก โดยมฐานการผลตอยไมนอยกวา 15 จงหวดเปนแหลงอดเมดขนาดใหญ การผลตเปนไปในลกษณะอตสาหกรรมในครวเรอน (Home Lab) ทมอปกรณตอกเมดขนาดเลก โดยตอกเมดยาทผสมเมทแอมเฟตามนกบสารประกอบอนๆ เชน คาเฟอน อฟดรน และแปง กระจายอยทวประเทศ (ปญญา อนทรอดม, 2551) ส าหรบในป พ.ศ. 2553 เรมพบวามการจบกมแหลงผลตอดเมดเมทแอมเฟตามนในพนทกรงเทพฯ และปรมณฑล เนองจากมการด าเนนการปราบปรามอยางเขมงวดของเจาหนาท ท าใหการจดหายาเสพตดจากพนทชายแดนของกลมนกคาท าไดยากล าบากยงขน อกทงยงใชตนทนสงกวาการน าหวเชอมาผลตอดเมดในพนทตอนใน อาจท าใหมนกคาบางกลมเรมหนมาผลตอดเมดยาบาเพมขน โดยมนกโทษในเรอนจ าเปนผบงการ หรอตดตอสงการ นอกจากนยงพบวามการผลตเมทแอมเฟตามนในรปแบบไอซ จากการจบกมพบการลกลอบผลตไอซในลกษณะของ Kitchen Lap เพมขน ซงผตองหารวธการผลต และสงซอสารเคมทางอนเตอรเนต (ส านกยทธศาสตร, 2553) การคาและการล าเลยง กลมเครอขายนกคาส าคญและรปแบบการคา ไดแก 1) นกคานอกประเทศ - กลมคนจน ซงประกอบดวยนกคาจนแผนดนใหญ นกคาจนไตหวน จน ฮองกง จนสงคโปร และจนมาเลเซย สวนใหญจะมความสมพนธกนเปนเครอขาย สามารถเดนทางเคลอนไหวไปไดในทกประเทศ (ส านกยทธศาสตร, 2552)

5

- กลมชาวแอฟรกน เคลอนไหวในหลายพนทและในหลายประเทศ นยมใชผหญงในการล าเลยง - กลมชนกลมนอยในพนทประเทศพมา หรอกลมนกคาชายแดน สวนใหญเปนชนกลมนอยทอาศยอยตามบรเวณชายแดนและสามารถเคลอนไหวขามไปมาไดทงสองประเทศ เชน กลมจนฮอ มเซอ ลซอ เยา และมง (ส านกยทธศาสตร, 2552) 2) นกคาในประเทศ - นกคาสญชาตลาว ซงอาศยอยบรเวณชายแดนไทยประเทศลาว สวนใหญจะเปนชาวบานทอาศยอยในประเทศลาว เขามารบจางล าเลยงเมทแอมเฟตามนเขามาสประเทศไทย เนองจากไดผลตอบแทนสงมากกวาท าอาชพอนๆ หากสามารถน าเมทแอมเฟตามนมาสพนทตอนในได จะไดคาจางหรอผลตอบแทนจ านวนมาก (ส านกยทธศาสตร, 2552) - นกคาในเรอนจ า สวนใหญคอนกคาระดบรายส าคญทถกจบกมตงแตการประกาศสงครามยาเสพตดเมอป พ.ศ. 2546 และถกศาลตดสนลงโทษขนสง เชน ประหารชวต จ าคกตลอดชวต หรอจ าคกตงแต 20 ป ขนไป ใชวธคาโดยการใชโทรศพท มอถอสอสารกบกลมบคคลภายนอก หรอบางคนใชวธตดตอผตองขงในคดอนๆ ทไดรบโทษจ าคกไมนานนก เมอออกจากเรอนจ าไปแลวใหมาท าหนาทประสานงานในการคายาเสพตดแทนตวเอง (ส านกยทธศาสตร, 2552) บคคลเหลานมความสามารถในการลกลอบล าเลยงน าเขาเมทแอมเฟตามนไดในบางพนทตลอดแนวชายแดนไทยและประเทศเพอนบาน ดงแสดงในภาพท 1.1 - พนทน าเขายาเสพตดทางภาคเหนอรอยละ 60 มาทางจงหวดเชยงใหมและเชยงราย รอยละ 30 น าเขาทางจงหวดตากและแมฮองสอน รอยละ 10 น าเขามาทางจงหวดพะเยา นาน และอตรดตถ แตจากมาตรการสกดกนทเขมแขงท าใหกลมผลกลอบปรบเปลยนเสนทางน าเขาไปใชเสนทางผานประเทศลาวเขาภาคอสาน ผานทางจงหวดอบลราชธาน หนองคาย เลย นครพนม และมกดาหาร ซงมปรมาณการน าเขาเมทแอมเฟตามนถงรอยละ 80 ของการน าเขาทงประเทศ และสวนใหญเปนพนททมปรมาณการน าเขาตอครงสง ครงปแรก พ.ศ. 2553 มการจบกมการน าเขายาบา 100,000 เมดขนไป เปนการน าเขาดานจงหวดเชยงราย เชยงใหม หนองคาย อ านาจเจรญ และอบลราชธาน ซงสวนใหญรอยละ 70 จะสงไปยงภมภาคอนของประเทศ (ส านกยทธศาสตร, 2552)

- ในพนทภาคกลางพบการน าเขาเมทแอมเฟตามนจากประเทศพมาดานจงหวดกาญจนบรและประจวบครขนธ จากกมพชาเขามาทางดานจงหวดสระแกว จนทบร และตราด

- ทางภาคใต มการน าเขาเมทแอมเฟตามนทางดานจงหวดระนอง โดยจดลกลอบน าเขาทส าคญ ไดแกจงหวดสราษฎรธาน สงขลา นราธวาส ยะลา และสตล (ส านกยทธศาสตร, 2552; 2553)

6

นอกจากนนยงพบการน าเขาเมทแอมเฟตามนรปแบบไอซ ทางทาอากาศยานสวรรณภม จงหวดสมทรปราการ โดยมแนวโนมเพมมากขน สวนใหญเปนการน าเขาโดยชาวอหราน ซงจะซกซอนโดยการกลนเขาไปในรางกาย (ส านกยทธศาสตร, 2553) (1) (2)

ภาพท 1.1 แสดงพนทน าเขาเมทแอมเฟตามนในป พ.ศ. 2550 - 2553 ทมา: (1) http://www.nccd.go.th/upload/content/situation%281%29.pdf (2) http://www.nccd.go.th/upload/content/suj.pdf วธการส าคญในการลกลอบล าเลยงเมทแอมเฟตามน กลมผลกลอบไดน ากระดาษคารบอนมาใชเพอปองกนการตรวจเอกซเรย จากนนจะใชน ายาดบกลนทาทบหอยาเสพตด เพอปองกนกลนและบรรจลงในกลองพสด พรอมระบชอผ สง-ผรบทไมสามารถตรวจสอบไดและการล าเลยงอกรปแบบหนงคอ การซกซอนมาในรางกายโดยเฉพาะทางทวารหนกและชองคลอด ท าใหยากล าบากตอการตรวจคนของเจาหนาท (ส านกงาน ป.ป.ส., 2550) สถตรปแบบการลกลอบน าเขาเมทแอมเฟตามนในชวงป พ.ศ. 2549 - มถนายน พ.ศ. 2552 แสดงในแผนภมแทงท 1.1

7

แผนภมแทงท 1.1 แสดงสถตรปแบบการลกลอบน าเขาเมทแอมเฟตามนในปตางๆ ทมา: http://www.nccd.go.th/upload/content/situationtrendin2009%28published%29.pdf จากสถตพบวารปแบบวธการซกซอนล าเลยงเมทแอมเฟตามน จะซกซอนล าเลยงในยานพาหนะมสดสวนเพมขน เนองจากระยะหลงผคามระดบการคาทใหญขน โดยท าการดดแปลงท าเปนชองลบไวทพนกระบะดานหลงรถบรรทกของ เพอหลกเลยงการตรวจจบของเจาหนาท (ส านกยทธศาสตร, 2552) เชนเดยวกบการซกซอนยาเสพตดในสมภาระในป พ.ศ. 2552 - 2553 มสดสวนสงทสดถงรอยละ 31.2 อกรปแบบทนาสนใจ คอ การซกซอนในรางกายทมแนวโนมเพมมากขน (ส านกยทธศาสตร, 2553)

เมทแอมเฟตามนมการจบกมไดในทกพนททวประเทศในสดสวนทเกนกวารอยละ 80 ยกเวนภาคใต ปรากฏเพยงรอยละ 40 สถตการจบกมเมทแอมเฟตามนสถานการณความรนแรงคอยๆ ลดนอยลง ในชวงทรฐบาลมนโยบายส าคญเรงดวนในการแกปญหาดานยาเสพตดในชวงป พ.ศ. 2546 - พ.ศ. 2549 และเรมมแนวโนมเพมขน ในป พ.ศ. 2551 ซงสามารถจบกมเมทแอมเฟตามนไดจ านวน 20.7 ลานเมด (ส านกยทธศาสตร, 2552) ในป พ.ศ. 2552 จบกมได 24.9 ลานเมดและชวงเดอนมกราคม - มถนายน พ.ศ. 2553 จบกมไดประมาณ 26.2 ลานเมด แสดงดงแผนภมแทงท 1.2 โดยพนทน าเขาส าคญสวนใหญยงคงอยทางชายแดนภาคเหนอ (ส านกยทธศาสตร, 2553)

8

16.00

12.50 13.00

20.70

24.9026.20

0

5

10

15

20

25

30

2548 2549 2550 2551 2552 ม.ค.-ม.ย.

2553

ป

จ านว

น MA

(ลาน

เมด)

แผนภมแทงท 1.2 แสดงสถตจ านวนเมทแอมเฟตามนทจบกมไดตงแตป พ.ศ. 2548 - มถนายน พ.ศ. 2553 (ส านกยทธศาสตร, 2553) การแพรระบาด พนทแพรระบาดเมทแอมเฟตามนทพบมาก คอ ภาคกลาง ภาคตะวนออก เฉยงเหนอ ภาคเหนอ กรงเทพมหานคร และภาคใต (ส านกยทธศาสตร, 2552) ชวงแรกทมการระบาดจะพบมากในกลมกรรมกรผใชแรงงาน คนขบรถบรรทก แตปจจบนเมทแอมเฟตามนแพรระบาดสกลมคนท างาน กลมนกเรยน นกศกษาและกลมผวางงานทวประเทศ จากสถตของผเขารบการบ าบดเมทแอมเฟตามนในสถานบ าบดชวงป พ.ศ. 2549 - 2552 มจ านวนเพมขน โดยเฉพาะกลมเยาวชนอาย 15 - 19 ป ซงในป พ.ศ. 2552 มสดสวนมากเปนอนดบหนงแทนทกลมอาย 20 - 24 ป โดยทกลมรบจางและเกษตรกรมสดสวนแนวโนมเพมขนรองลงมา(ส านกยทธศาสตร, 2553)

9

1.2.2 เมทแอมเฟตามน/แอมเฟตามน ประวตและสมบตของเมทแอมเฟตามน สารกลมแอมเฟตามนเปนสารทถกสงเคราะหขนมาครงแรกในป พ.ศ. 2430 โดยนกวทยาศาสตรชาวเยอรมน ชอ เอเดเลยโน (L. Edeleano) ในรปของแอมเฟตามนซลเฟต (amphetamine Sulfate) ตอมาในป ค.ศ.1888 นกวทยาศาสตรชาวญปนสามารถสงเคราะหอนพนธของแอมเฟตามนไดอกตวหนง คอ เมทแอมเฟตามน (methamphetamine) โดยการน าอะตอมของเมทล (-CH3) มาแทนทไฮโดรเจน (-H) ในโครงสรางแอมเฟตามน ท าใหเมทแอมเฟตามนมผลตอระบบประสาทสวนกลางไดรนแรงกวาแอมเฟตามน (Chiang, 2006) สตรโครงสรางของแอมเฟตามนและเมทแอมเฟตามนแสดงดงภาพท 1.2 แอมเฟตามน เมทแอมเฟตามน

ภาพท 1.2 แสดงโครงสรางของแอมเฟตามนและเมทแอมเฟตามน (Saito et al., 2000) สมบตทางกายภาพของเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนแสดงในตารางท 1.1และ 1.2 ตามล าดบ ตารางท 1.1 แสดงสมบตทางกายภาพของเมทแอมเฟตามน

สมบต เมทแอมเฟตามน ชอวทยาศาสตร 1-phenyl-2-methylaminopropane สตรเคม C10H15N มวลโมเลกล 149.23 กรมตอโมล จดเดอด 214°C จดหลอมเหลว 172-174°C ลกษณะ เปนเมดกลมแบนขนาดเลก สแดงอมชมพ สสม สเขยว สมวง

การละลาย ละลายรวดเรวในกรด ละลายไดดในน าและเมทานอล ละลายไดเลกนอยในอเทอรและคลอโรฟอรม

10

ตารางท 1.2 แสดงสมบตทางกายภาพของแอมเฟตามน สมบต แอมเฟตามน

ชอวทยาศาสตร 1-phenyl-2-aminopropane สตรเคม C9H13N มวลโมเลกล 135.21 กรมตอโมล จดเดอด 200 - 203°C จดหลอมเหลว 281 - 285°C

ลกษณะของเมดยาเมทแอมเฟตามนทแพรระบาดในปจจบนแสดงดงภาพท 1.3

ภาพท 1.3 แสดงลกษณะของเมดยาเมทแอมเฟตามน การสงเคราะหเมทแอมเฟตามนในปจจบน มหลายวธ เชน Nagai method, Moscow method, Rosenmund method และ Emde method โดยมวธการดงน 1) Nagai method ใชสารตงตน (precursor) คอ อฟดรน หรอ ซโดอฟดรน ตวท าละลาย คอ กรดไฮดรโอดรก และ ตวเรงปฏกรยาเคม คอ ฟอสฟอรสแดง ปฏกรยาทได คอ

11

2) Moscow method ใชสารตงตน คอ อฟดรน หรอ ซโดอฟดรน ตวท าละลาย คอ กรดเพอรคลอรก และ ตวเรงปฏกรยาเคม คอ พลานาเดยมและแบเรยมซลเฟต ปฏกรยาทได คอ 3) Rosenmund method ใชสารตงตน คอ อฟดรน หรอ ซโดอฟดรน ตวท าละลาย คอ กรดไฮเพอรคลอรก และ ตวเรงปฏกรยาเคม คอ พลานาเดยม และแบเรยมซลเฟต ปฏกรยาทได คอ 4) Emde method ใชสารตงตน คอ อฟดรน หรอ ซโดอฟดรน ตวท าละลาย คอ ไทโอนลคลอไรด และ ตวเรงปฏกรยาเคม คอ พลานาเดยม และแบเรยมซลเฟต ปฏกรยาทได คอ สารตงตนทใชในการสงเคราะหเมทแอมเฟตามน คอ อฟดรนและซโดอฟดรน ซงเปนสารทมสตรโมเลกลเหมอนกน แตมโครงสรางทางเคมตางกน (diastereomer) จงมการน ามาใชแทนทกนในปฏกรยาทางเคมทใชในการสงเคราะหเมทแอมเฟตามน (ชวนและคณะ, 2548)

12

วธเสพเมทแอมเฟตามน แบงตามลกษณะรปพรรณ คอ 1) แบบเมดหรอแคปซล มชอเรยกตางๆ เชน ยามา เนองจากระยะแรกทสารเสพตดกลมแอมเฟตามนถกน าเขามาขายในประเทศไทย โดยบรษท WELLCOME ซงมเครอง หมายการคาเปนรปหวมา (ทรงเกยรต ปยะกะ, 2544) ตอมากระทรวงสาธารณสขเปลยนชอเปน ยาบา และชอเรยกอนๆ เชน สปด (speed) เมท (met) ชอลก (chalk) เปนตน การเสพทวไปมกจะกลนเมดหรอแคปซลลงกระเพาะอาหาร ในประเทศไทยพบการน าเมทแอมเฟตามนแบบเมดหอฟอยลเผาไฟใหเกดควนแลวสบเขาปอด 2) แบบเปนผงปน หรอเรยกวา เมทแอมเฟตามนไฮโดรคลอไรด ในกลมผเสพจะเรยกวา ครสตล (crystal) แครงค (crank) เนองจากมลกษณะเปนผงละเอยดสขาว เสพโดยวธสดผงยาเขาโพรงจมก หรอการน าไปละลายน าแลวกรอง หลงจากนนใชหลอดหรอเขมฉดยาดดสารละลายทกรองไดฉดเขาหลอดเลอดด า เมทแอมเฟตามนลกษณะดงกลาวทมอยในประเทศไทยจะใชเปนสารส าหรบเตรยมผลตเมทแอมเฟตามนแบบเมด 3) แบบสารละลายใส บรรจในหลอดแกวใสหรอสชา โดยจะน าไปฉดเขาหลอดเลอดด า ซงจะออกฤทธทนทและรนแรง ยงไมพบในประเทศไทย 4) แบบผลกใส เมทแอมเฟตามนชนดนระบาดเขาสประเทศไทย โดยชาวตาง ชาตเปนสวนใหญ ผเสพจะเรยกวา ไอซ ( ice) หรอ กลาสส (glass) เพราะมลกษณะเหมอนน าแขงหรอแกว ดงแสดงในภาพท 1.4 ไอซเปนเมทแอมเฟตามนทบรสทธเกอบ 100 เปอรเซนต มวธเสพโดยการน าผลกลนไฟใหระเหดแลวสดไอระเหยเขาปอด ภาพท 1.4 แสดงลกษณะของไอซ

ทมา: http://www.thaidrugpolice.com/drug/ice.html วธการสบเอาควนของเมทแอมเฟตามนจะเปนอนตรายแกผเสพมากกวาการสดเอาไอระเหย เนองจากควนเกดจากการเผาไหม ท าใหมสวนประกอบทางเคมทเปนพษมากมาย

13

เชน dimethylamphetamine, furfurylmethamphetamine, formylmethamphetamine เปนตน แตไอระเหยจะมเฉพาะสารเมทแอมเฟตามนเพยงอยางเดยว (วโรจน สมใหญ, 2543) เภสชวทยาของเมทแอมเฟตามน เมทแอมเฟตามนมคณสมบตเปนดางออนละลายไดดมากในไขมน ( lipid solubility) ท าใหถกดดซมไดดทงทางการรบประทาน สดดมและโดยเฉพาะการฉดเขาเสนเลอดด า ซงพบวาระยะเวลาในการดดซมเขาสกระแสเลอดและเรมออกฤทธหลงจากเสพดวยวธตางๆคอ 30 นาท, 1 - 2 นาทและ 8 วนาท ตามล าดบ ออกฤทธเตมทในเวลา 2 - 3 ชวโมง, 30 นาท และ 1 - 2 นาท ตามล าดบ (ไพฑรยและสรพนธ, 2548) เมอดดซมจากทางเดนอาหาร หรอทางเดนหายใจเขาสกระแสเลอดแลว สารจะกระจายตวไปตามสวนตางๆ ของรางกาย และจะมความเขมขนมากทสดทสมองและน าไขสนหลง รองลงมา คอ ตบ มามและไต (พงษรกษและศภ-รตน, 2552) เมทแอมเฟตามนมคาประโยชนเชงชวภาพ (bioavailability) ประมาณ 67 เปอรเซนตและปรมาตรการกระจาย (volume of distribution) 3 - 7 ลตรตอกโลกรม จากการทดลองใหอาสาสมครเพศชายรบประทานเมทแอมเฟตามนขนาด 0.125 มลลกรมตอกโลกรม พบวาปรมาณเมทแอมเฟตามนสงสดในเลอดเทากบ 0.020 มลลกรมตอลตร ทเวลา 3.6 ชวโมงและมคาครงชวต (half life) เทากบ 10 ชวโมง และยงมการทดลองใหอาสาสมครทดลองสบพบวาเมทแอมเฟตามนจะดดซมไดดทปอด โดยมคาประโยชนเชงชวภาพของเมทแอมเฟตามนขนาด 21.8 มลลกรม เทากบ 90 เปอรเซนต ปรมาตรการกระจายของการสบเทากบ 3.24 ลตรตอกโลกรม มคาครงชวตเทากบ 11.1 ชวโมง เมอเปรยบเทยบกบการฉดเมทแอมเฟตามนขนาด 15.5 มลลกรม มปรมาตรการกระจายจากการฉดเทากบ 3.73 ลตรตอกโลกรม มคาครงชวตเทากบ 12.2 ชวโมง ระยะเวลาของเมทแอมเฟตามนทสามารถเหลออยในรางกายครงหนงของจ านวนทไดรบทงหมด มคาเทากบ 12 ชวโมง สวนแอมเฟตามนมคา 8 ชวโมง ซงระยะเวลาดงกลาวยงขนกบความเปนกรด เปนดางของรางกายและปสสาวะ (Moore, 2003) เมทแอมเฟตามนเมอกระจายเขาสรางกายแลวจะถกเมเทบอไลตทตบ และขบออกทางปสสาวะ การก าจดเมทแอมเฟตามนออกจากรางกาย จะถกขบออกทางปสสาวะมากทสดในเวลา 24 ชวโมง ประมาณ 45 เปอรเซนต ถกขบออกมาในรปเดม และเปลยนแปลงโดยปฏก รยา N-demethylation เปนแอมเฟตามนประมาณ 7 เปอร เซนต และ 4 -hydroxymethamphetamine ประมาณ 15 เปอรเซนต แอมเฟตามนจะถกเปลยนรปโดยกระบวนการ deamination ไดเปน p-hydroxy amphetamine และ phenylacetone หลงจากนน phenylacetone จะถกออกซไดสเปน benzoic acid ซงจะไปจบตวกบ glycine เปน hippuric acid conjugate และถกไตขบออกทางปสสาวะ มแอมเฟตามนบางสวนจะถกเปลยนรปโดยกระบวนการออกซเดชนเปน norephredine และบางสวนเปลยนรปโดยกระบวนการ hydroxylation ไดเปน hydroxynorephedrine ดงแสดงในภาพท 1.5 การก าจดเมทแอมเฟตามนออกจากรางกายในรปปสสาวะทมความเปนกรดแอมเฟตามนจะถกขบออกเพมขนถง 76

14

เปอรเซนต จะท าใหตรวจพบในรางกายไดเพยง 2 - 3 วน ในกรณทปสสาวะมความเปนดาง แอมเฟตามนจะถกขบออกนอยลงและตรวจพบในรางกายไดนาน 5 - 7 วน (Moore, 2003; Karch, 2008)

ภาพท 1.5 แสดงกระบวนการเมเทบอลสม (Metabolism) ของเมทแอมเฟตามน (Moore, 2003)

15

กลไกการออกฤทธของเมทแอมเฟตามน เมทแอมเฟตามนเมอเขาสสมองและไขสนหลง จะกระตนการหลงอะดรนาลน (adrenaline) และนอรอะดรนาลน (noradrenaline) ออกจากเซลลประสาทในปรมาณมากกวาปกต ท าใหมผลกระทบตอหวใจและหลอดเลอด คอ ท าใหอตราการเตนของหวใจเรวขน หลอดเลอดทวรางกายเกดการหดตว ความดนโลหตสงกวาปกต กลไกการออกฤทธดงกลาวจะท าใหผเสพเมทแอมเฟตามนรสกกระปรกระเปลา มก าลงวงชา สามารถท างานไดนานกวาปกต นอกจากนเมทแอมเฟตามนยงออกฤทธท าให vesicle ซงเปนทกกเกบโดปามน (dopamine) ในเซลลประสาทแตก ซงโดปามนเปนสารทรางกายสงเคราะหขนมาและจะหลงเมอเซลลประสาทในสมองถกกระตน กลมเซลลประสาทในสมองทท าหนาทสรางและหลงโดปามนเรยกวา ระบบประสาทโดปามเนอรจก (dopaminergic nerve system) โดยระบบประสาทโดปามเนอรจกจะเปนหนวยควบคมอารมณทกขสขของมนษย หากโดปามนหลงนอยกวาปกต อารมณเปนทกขหรอซมเศราจะปรากฏออกมา แตถามการหลงโดปามนสงเกนกวาระดบปกตมากๆ จะท าใหเกดอารมณเคลมสข (euphoria) รสกสบายใจจนลมตวไปชวขณะหนง ซงเปนสาเหตใหเกดการเสพตด (Logan, 2002) เมอมการเสพตดเมทแอมเฟตามนจะท าใหเกดอาการชพจรเตนเรว ใจสน นอนไมหลบและอาจเกดอาการคลมคลง หากไดรบยาในปรมาณมาก จะไปกดระบบประสาทและระบบหายใจท าใหหมดสตและถงแกความตายได (ณฐและศรนนท, 2550) จากการรายงานของ Drummer (2004) กลาววา การรบประทานเมทแอมเฟตามนสามารถตรวจพบความเขมขนในเลอดหลงจากเสยชวตมคาสงกวา 0.2 มลลกรมตอลตร และในอดตตรวจพบระดบยาในเลอดของผทเสพจนเสยชวตมความเขมขนสงถง 500 ไมโครกรมตอมลลลตร (United Nations, 1995) อาการทเกดจากการเสพเมทแอมเฟตามน 1) อาการเฉยบพลน เปนอาการพษทเกดจากการเสพเมทแอมเฟตามนอยางเฉยบพลนท าใหมอาการอยไมนง (restlessness) หงดหงด (irritability) มอเทาสน (tremor) สบสน (confusion) พดมาก วตกและอารมณแปรปรวน (lability of mood) และอาการทเกดกบระบบประสาทสวนปลายคอ ปวดศรษะ หนาวสน อาเจยน ปากแหง เปนตน (กตและวนดา , 2542) 2) อาการเรอรง เกดจากการใชยาตดตอกนเปนเวลานาน กรณใชยาขนาดไมมากจะมผลกระทบตออารมณและพฤตกรรมทสามารถควบคมได จะท าใหเกดผลกระทบตอรางกายไดมาก โดยจะท าใหไมรสกหว ท าใหขาดอาหาร ขาดวตามน การกระตนประสาทใหนอนไมหลบ จะท าใหรางกายไมไดพกผอน สขภาพจงทรดโทรม ซงกอใหเกดโรคไดงาย การใชยาเปนประจ าท าใหเกดการดอยาซงตองเพมขนาดของยาทใชขนเรอย ๆ ถาใชไปนาน ๆ ท าใหเกดการตดเขาทงทางจตและทางกาย การตดยาทางจตเกยวกบความคด อารมณและสมรรถภาพตองการยาอยเรอย ๆ เมอหยดใชยาทนท จะมอาการขาดยาเกดขน อาการขาดยาท

16

เกดขนในผทใชยาในขนาดสง ไดแก ออนเพลย ท าใหประสทธภาพในการท างานถดถอย นอนหลบคลายคนหมดสต เกดโรคจตชนดหวาดระแวง (paranoid delusions) ประสาทหลอนทางจต หแววและกระวนกระวายหวอาหารอยางรนแรง ในระยะ 3 - 4 วน หลงจากหยดยาจะเกดอาการสะทอนกลบของอารมณ (rebound phenomena) จากอารมณตนตว ราเรง เปนอารมณซมเศราจนอาจถงคลมคลงท ารายผอนหรอฆาตวตายได อาการถอนยา (withdrawal symptoms) มกเกดกบผทเสพเมทแอมเฟตามนในขนาดทสงเปนเวลานาน จะท าใหหลบนาน (hypersomnia) มอาการซมเศรา โดยอาการจะรนแรงสดในชวง 48 - 72 ชวโมงหลงหยดยาและคงอยไดนานเปนเดอน บางรายอาจถงขนท ารายตวเองหรอฆาตวตาย (กตและวนดา, 2542) 3) พษจากการไดรบยาเกนขนาด จะเกดการกระตนอะดรเนอรจกท าใหมานตาขยาย หวใจเตนเรว ความดนโลหตสง และมกพบอาการทางจตรวมดวย เชน หวาดระแวง วตก เพอคลง หากใชยาในขนาดทสงจะท าใหชกกระตก หลอดเลอดหวใจตบ ผลการออกฤทธทางเภสชวทยา 1) ผลตอระบบประสาทสวนกลาง เมทแอมเฟตามนออกฤทธกระตนประสาทสวนกลาง ลดความงวงซม ท าใหนอนไมหลบ มการเปลยนแปลงทางอารมณใหครกครน รนเรง เปนสข ไมรสกเหนอย เมอใชในขนาดทสงจะท าใหเกดอาการมนงงและเกดสภาวะตนกลว 2) ผลตอจตใจ เมอเสพเปนระยะเวลานานหรอใชเปนจ านวนมาก จะท าใหผเสพมความผดปกตทางดานจตใจ กลายเปนโรคจตชนดหวาดระแวง สงผลใหมพฤตกรรมเปลยนแปลงไป เชน เกดอาการหวาดหวน หวาดกลว ประสาทหลอน ซงโรคนหากเกดขนแลว อาการจะคงอยตลอดไป แมในชวงเวลาทไมไดเสพยากตาม 3) ผลตอระบบหวใจและหลอดเลอด เรงอตราการเตนของหวใจ ท าใหเกดอาการใจสนและจงหวะการเตนของหวใจผดปกต ปวดศรษะ 4) ผลตอระบบทางเดนหายใจ ท าใหอตราการหายใจเรวขนและจงหวะหายใจไมปกต 5) ผลตอระบบทางเดนอาหาร ปากแหง เบออาหาร ไมรสกหว 6) ผลตอพฤตกรรม จะท าใหเกดอาการพดมาก กาวราว ย าคดย าท า ปสสาวะบอย เมอรางกายถกระตนใหใชพลงงานมากจะรสกไมงวงและตนตวตลอดเวลา เมอยาหมดฤทธ จะท าใหรสกเหนอย ออนเพลย เมอใชเปนเวลานานท าใหรางกายทรดโทรมและเปนโรคไดง าย (Logan, 2002; ไพฑรยและธนะรชต, 2550)

17

1.2.3 แกสโครมาโทกราฟ แกสโครมาโทกราฟ (Gas Chromatography, GC) เปนรปแบบหนงของกระบวนการแยกสารทางโครมาโทกราฟ โดยทโครมาโทกราฟทกรปแบบเกยวของกบ distribution หรอ partition ของสารประกอบใดๆ ระหวางเฟสทแตกตางกน 2 เฟส ซงเปน เฟสเคลอนท (mobile phase) และเฟสอยกบท (stationary phase) ในการแยกสารขนอยกบความสามารถในการละลาย (relative solubility) เมอสารในของผสมเคลอนทผานเฟสอยกบท โดยมเฟสเคลอนทน าไป สารแตละตวจะถกเหนยวรงมากนอยตางกน เนองจากความสามารถในการละลายทแตกตางกน สารจงถกแยกออกจากกนได สารใดมความสามารถในการละลายใน เฟสอยกบทมากกวากจะใชเวลามากกวา ในการเคลอนทออกมาจากคอลมน ( column) นยมใชแกสเฉอยเปนเฟสเคลอนท หรอเรยกวา แกสพา (carrier gas) โดยปกตมกจะใชแกสฮเลยม (He) ไฮโดรเจน (H2) หรอไนโตรเจน (N2) เปนแกสพา (มงคล รายะนาคร, 2537) แกสโครมาโทกราฟแบงเปน 2 ประเภท คอ 1) แกสโครมาโทกราฟแบบของแขง (Gas-solid chromatography, GSC) โครมาโทกราฟชนดนจะใชของแขง เชน ซลกาเจลเปนเฟสอยกบท กลไกการแยกสารทเกดขนเปนแบบการดดซบ ดงนนการแยกสารจะดหรอไมขนกบคณสมบตการดดซบของสารทบรรจในคอลมน แตโดยทวไปโครมาโทกราฟชนดนไมเปนทนยมมากนก 2) แกสโครมาโทกราฟแบบของเหลว (Gas-liquid chromatography, GLC) โครมาโทกราฟชนดนจะใชของเหลวเปนเฟสอยกบท จงตองท าการเคลอบของเหลวใหเปนชนบางๆ บนของแขงเฉอยทเรยกวา solid support กลไกการแยกสารทเกดขนเปนแบบ partition ซงสามารถใชไดในชวงอณหภมทกวางมากและใหผลการทดลองทดกวา GSC จงท าให GLC เปนทนยมใชในปจจบน องคประกอบของแกสโครมาโทกราฟ ประกอบดวย 1) แกสพา (Carier gas) 2) สารตวอยาง (Sample introduction) 3) สวนฉดสาร (Injection system) 4) คอลมน (Column) 5) ตอบใหความรอน (Oven) 6) ตวตรวจวด (Detector) 7) สวนประมวลผลและบนทกขอมล (Data processing and Recorder)

18

ภาพท 1.6 แสดงสวนประกอบพนฐานของเครองแกสโครมาโทกราฟ (Dawling et al., 2008) 1) แกสพา (Carier gas) แกสทใชเปนเฟสเคลอนทจะตองเปนแกสเฉอย โดยปกตจะใชแกสไนโตรเจน ฮเลยม อารกอนหรอคารบอนไดออกไซด ซงการเลอกชนดของแกสจะขนกบชนดของตวตรวจวด เฟสเคลอนทจะถกน าเขาสเครองแกสโครมาโทกราฟผานทางตวควบคมอตราการไหลเพอรกษาอตราการไหลใหคงท ถาอตราการไหลเปลยนแปลงไปเพยง 1 เปอรเซนต จะท าใหเวลาในการหนวงเหนยวเปลยนไป 1 เปอรเซนต เชนกน 2) สารตวอยาง (Sample introduction) สารตวอยางทจะถกน าเขาไปในเครองแกสโครมาโทกราฟ ได 2 สถานะ คอ - สถานะทเปนไอหรอแกส (gaseous samples) - สถานะทเปนของเหลว (liquid sample) ตวอยางทเปนของเหลวสามารถน าเขาเครอง GC ไดโดยใช micro syringe ดดสารตวอยางของเหลวใหไดปรมาตรตามทตองการแลวฉดผาน silicone rubber septum ซงสามารถท าได 2 วธ คอ (1) การฉดดวยมอ (manual) การฉดแบบนผทดลองตองมความช านาญ จงจะท าใหการวเคราะหมความเทยงตรงสง ขอเสยของวธนคอ สนเปลอง septum เพราะการฉดแต

19

ละครงผทดลองไมสามารถฉดเขาทจดเดมได ท าให septum เกดการฉกขาด และแกสรวไดงาย ตองมการเปลยน septum บอย ๆ (2) การฉดดวยเครอง auto injector จะใหผลทเทยงตรงกวาการฉดดวยมอและสามารถใชไดกบปรมาตรของตวอยางทมจ านวนนอยกวา 1 ไมโครลตร ไดดวย 3) สวนฉดสาร (Injection system) เมอตวอยางเขาเครอง GC ลงสบรเวณ Inlet ทมความรอนสงพอทจะท าใหตวอยางกลายเปนไอแลวถกพาเขาสคอลมนดวยแกสพา อณหภมทเหมาะสมของ injector ควรเปนอณหภมทสงพอทจะท าใหตวอยางระเหยไดแตตองไมท าใหสารสลายตว ซงเรยกระบบของการพาวา sample inlet system ระบบของการพาตวอยางเขาคอลมนมหลายแบบ คอ (1) Split / Splitless Inlet - Split injection mode เหมาะกบสารตวอยางทฉดเขาคอลมนมปรมาณมาก หรอความเขมขนสง ซงตวอยางชนดนอาจท าใหคอลมนเกดการ overload ท าใหการแยกไมด พคซอนทบกนและรปรางของพคไมสมมาตรจงมการปรบปรงการวเคราะหไดโดยการเลอก split mode - Splitless injection mode เหมาะกบสารทตองการวเคราะหมปรมาณนอยๆ หรอความเขมขนนอยๆ (trace analysis) ภาพท 1.7 แสดงภาพตดขวางสวนฉดสารแบบ Split / Splitless (Dawling et al., 2008)

20

(2) Purged packed inlet การฉดสารตวอยางดวยระบบ purged packed ใชกบ packed column และสามารถใชกบ wide - bore capillary column ไดเมออตราการไหลของแกสพามากกวา 10 มลลลตรตอนาท (3) Cool on - column inlet เปนวธการฉดตวอยางทเปนของเหลวตรงเขาส คาพลลารคอลมน ซงวธการนสวนของ inlet และ oven ตองมอณหภมต ากวาจดเดอดของตวท าละลายเมอท าการฉดสารตวอยาง (4) Programmable Temperature Vaporisation Inlet (PTV) เนองจากวธการฉดตวอยางทเปนของเหลวเขาคอลมนโดยตรงพบวา สารทไมระเหย (non - volatile) ทตดมากบตวอยาง สามารถเขาไปตดแนนในคอลมน วธการของ PTV จงไดพฒนาขนมาเพอใหสามารถท างานไดหลาย ๆ mode เมอใชอณหภมคงทสามารถเลอกระบบเปนแบบ split/splitless ถาใชการท าโปรแกรมอณหภมใหมอณหภมเรมตนต าและใชกบ wide - bore capillary column จะสามารถเลอกใช on - column injection ได นอกจากนยงสามารถใชกบการฉดสารตวอยางทมตวท าละลายมากๆ ซงเรยกวา Solvent vent mode โดยใชการฉดแบบปรมาตรมาก (large volume injection) (Agilent Technologies, 2006) 4) คอลมน (Column) คอลมนทใชกนในเครอง GC โดยทวไป จดไดเปน 2 ประเภทคอ แพคคอลมน (pack column) และ WCOT (wall-coated open tubular column) หรอ คาพลลารคอลมน (capillary column) ทงนไดมการพฒนาแพคคอลมนมากอน สวนคาพลลารคอลมนมการพฒนามาตงแต พ.ศ. 2523 ลกษณะส าคญของคอลมนแสดงดงตารางท 1.3 ตารางท 1.3 แสดงลกษณะทส าคญของคอลมนในเครอง GC

Parameter Pack column Capillary column ความยาว (เมตร) 1 - 6 10 - 100 เสนผาศนยกลางภายใน (มลลเมตร) 2 - 4 0.20 - 0.53

ความจ (Capacity) 10 ไมโครกรม/พค 50 นาโนกรม/พค ความหนาของเฟสอยกบท (ไมโครเมตร) 1 - 10 0.05 - 0.5 อตราการไหลของแกสพา (มลลลตร/นาท) 10 - 60 0.5 - 10

ความดนตกของคอลมน (Column pressure drop; psi) 10 - 40 3 - 40 ทมา: มงคล รายะนาคร, 2537; Agilent Technologies, 2006 (1) แพคคอลมน (pack column) แพคคอลมนมประสทธภาพและขดความสามารถในการแยกต ากวาคาพลลารคอลมน (capillary column) แตเปนคอลมนทมความจ

21

มากกวา ซงท าใหการน าสารเขาสคอลมนงายขน และยงมองคประกอบของสารตวอยางในปรมาณมากขนส าหรบการน าเขาสตวตรวจวด แพคคอลมนส าหรบการวเคราะหทวไปมความยาว 2 - 5 เมตร และเสนผานศนยกลางภายใน 2 มลลเมตร เปนคอลมนทใชอตราการไหลของแกสพาประมาณ 20 - 50 มลลลตรตอนาท ส าหรบคอลมนทใหญกวาน สามารถทจะออกแบบใหเปนการเฉพาะทจะใชงานส าหรบ GC ชนดทใชเตรยมสาร (preparative - scale GC) (2) คาพลลารคอลมน (capillary column) คาพลลารคอลมนท าจาก SiO2 ทบรสทธและแขงแรงทนทานเปนพเศษ โดยเคลอบฉาบผวดานนอกดวย polyimide polymer ปจจบนคาพลลารคอลมนมการใชเทคโนโลยการผลตทมคณภาพสง ควบคมเสนผานศนยกลางภายใน และความหนาของฟลมทเคลอบไดซงมทงแบบเฟสทมขวและไมมขว คอลมนทผลตลกษณะนมความยาว 10 - 100 เมตร เสนผานศนยกลางภายใน 0.20 - 0.53 มลลเมตร และใชอตราการไหลของแกสพา 2 - 5 มลลลตรตอนาท คาพลลารคอลมนเหมาะกบการวเคราะหสารปรมาณนอยๆ ของสารประกอบอนทรยทเฉพาะเจาะจงในของผสมทซบซอน (มงคล รายะนาคร, 2537) 5) ตอบใหความรอน (Oven) ตอบใหความรอน เปนสวนทใชส าหรบบรรจคอลมนและเปนสวนทควบคมอณหภมของคอลมนใหเปลยนไปตามความเหมาะสมกบวธการทตองการวเคราะหสารผสม การควบคมอณหภมของตอบใหความรอนนนม 2 แบบ คอ แบบ Isothermal จะใชอณหภมเดยวตลอดการวเคราะห และแบบ temperature program จะสามารถเปลยนอณหภมไดในระหวางการวเคราะห ซงนยมใชกบสารผสมท มชวงของจดเดอดกวาง ท าให โครมาโทแกรม (chromatogram) ทได มลกษณะของพคทไมกวางและชวยลดเวลาในการวเคราะห (Agilent Technologies, 2006) 6) ตวตรวจวด (Detector) ตวตรวจวด เปนสวนทอยตอจากทางออกของคอลมน ท าหนาทตรวจวดองคประกอบตางๆ ของสารตวอยาง ในขณะทสารเคลอนทผานออกมาจากคอลมน โดยทตวตรวจวดจะตองไมวองไวตอแกสพา เมอตวตรวจวดท าการตรวจวดองคประกอบของสารจะท าการบนทกผลเทยบกบเวลา ท าใหไดโครมาโทแกรม (chromatogram) ตวตรวจวดทใชในปจจบน ไดแก เฟลมไอออไนเซชน (flame ionization detector, FID) ไนโตรเจนฟอสฟอรส (nitrogen phosphorous detector, NPD) อเลกตรอนแคพเจอร (electron capture detector, ECD) เทอรมอลคอนดกทวต (thermal conductivity detector, TCD) เฟลมโฟโต (flame photo detector, FPD) และแมสสเปกโทรเมตร (mass spectrometry, MS)

22

ตวตรวจวดแบบเฟลมไอออไนเซชน (Flame ionization detector, FID) ตวตรวจวดแบบเฟลมไอออไนเซชน เปนตวตรวจวดมาตรฐานทใชงานกนอยางแพรหลายในแกสโครมาโทกราฟ เนองจากสารโดยเฉพาะสารประกอบอนทรยทกๆ ชนดสามารถเกดการไอออไนซ (ionize) ไดในเปลวไฟ ท าใหเกดกระแสของไอออนทสามารถสะสมอยระหวางขวทมประจตรงขาม 2 ขว ไดตามปรมาณของไอออน ลกษณะตวตรวจวดแบบเฟลมไอออไนเซชน แสดงในภาพท 1.8

ภาพท 1.8 แสดงลกษณะตวตรวจวดแบบเฟลมไอออไนเซชน ทมา: http://chemwiki.ucdavis.edu/Analytical_Chemistry/Instrumental_Analysis/ Chromatography/Gas_Chromatography ในระบบของ FID ประกอบดวยแกส 3 ชนด คอ แกสพารวมกบไฮโดรเจนและอากาศ โดยแกสไฮโดรเจนจะท าหนาทเปนเชอเพลงในการจดเปลวไฟดวย heater อากาศเปนตวชวยท าใหเกดการสนดาป (combustion) และชวยพาใหแกสทเผาไหมแลวออกไป อตราการไหลของแกสไฮโดรเจนและอากาศตองปรบใหเปนสดสวนทเหมาะสมกบแกสพา ถาสดสวนไมเหมาะสม การจดเปลวไฟทตวตรวจวดจะจดตดยาก เปลวไฟของแกสไฮโดรเจนและอากาศจะถกจดทหว jet โดยมต าแหนงของขว (electrode) วางอยเหนอเปลวไฟเพอเปนทสะสมของ

23

ไอออนสารตวอยาง (analyte ion) แกสพาและไอของสารตวอยางจะเขาสเปลวไฟแลวท าใหสารตวอยางเกดการไอออไนซไดอเลกตรอนและไอออนบวก (Agilent Technologies, 2006) หลงจากนนอเลกตรอนจะเคลอนทไปยง flame jet ไอออนบวกจะเคลอนทไปยงอเลกโทรด สญญาณทเกดขนจะถกบนทกดวยเครองบนทกสญญาณไดเปนโครมาโทแกรม (แมน และ อมร, 2539 ) ขอมลเชงคณภาพวเคราะหแสดงอยในรปของ retention time ซงคอนขางเฉพาะส าหรบแตละสาร สวนขอมลเชงปรมาณวเคราะหแสดงอยในรปของพนทพค (peak area) หรอความสงของพค (peak height) โดยโครมาโทแกรมมผลจากตวแปรตางๆ เชน อณหภม อตราการไหลของแกสพา และชนดของคอลมน เปนตน ตวแปรเหลานสามารถค านวณหาคาทเหมาะสมได เพอท าใหการวเคราะหมประสทธภาพมากขน การตอบสนองของตวตรวจวดชนดนเรวมากและใหคาของกราฟมาตรฐานทมชวงความเขมขนทกวาง เปลวไฟไฮโดรเจนผลตไอออนไดไมมากนก คดเปนกระแสประมาณ 10 - 14 แอมแปร แตเมอมสารประกอบอนทรยจะท าใหมไอออนเกดขนปรมาณมากมาย การตอบสนองของ FID ขนกบจ านวนไอออนทเกดขนจากแตละสารประกอบ ขนกบจ านวนคารบอนในโมเลกลของสารตวอยางและปรมาณของสารการตอบสนองนแตกตางกนไประหวางสารประกอบแตละกลม (มงคล รายะนาคร, 2537) ส าหรบตวตรวจวดแบบแมสสเปกโทรเมทร (mass spectrometry, MS) เปนเทคนคทอาศยหลกการทาง spectroscopy ในการวเคราะหโครงสรางและมวลโมเลกลของสาร โดยใหพลงงานแกโมเลกลของสารมากพอทจะท าใหโมเลกลเหลานนเกดการแตกตวเปนไอออนแลวท าการแยกและตรวจสอบไอออนทเกดขน โดยทแหลงก าเนดไอออน (ion source) เปนสวนประกอบส าคญทท าใหโมเลกลของสารตวอยางเกดเปนไอออนและเกดการแตกตว โดยวธทนยมกนมากทสด คอ วธอเลกตรอนอมแพค (electron - impact, EI) ซงเปนวธทท าใหโมเลกลของสารตวอยาง (M) เกดการแตกตวเปนไอออนและมประจบวก (molecular ion, M+) ดวยการชนกบอเลกตรอนทมพลงงานสง เชน M + e- M + 2e- โดยโมเลกลทมประจบวกน ถามพลงงานมากพอ จะเกดการแตกตวออกเปนไอออนยอยและจะแตกตวตอไปเรอยๆ จนเหลอพลงงานนอยลงและไมพอทจะแตกตวตอไปไดอก M

1M

2M

2M

4M กระบวนการในแมสสเปกโทรเมทร สามารถแบงออกไดเปน 2 กระบวนการคอ ไอออไนเซชน (ionization) และการแยกมวล (mass separation) วธการไอออไนซ (ionize) เปน

24

การท าใหเกดไอออน เมอโมเลกลถกไอออไนซในสญญากาศ กลมทมลกษณะเฉพาะของไอออนของมวลตางๆ กนกจะเกดขน แมสสเปกโทรมเตอรเปนเครองมอทใชแยกและวดมวลของไอออนดวยการใชอตราสวนของมวลตอประจ (m/Z) โดยทวไปแลวไอออนมกมประจ +1 (z = 1) ดงนนคา m/Z จงมคาเทากบมวลของไอออนโดยตรง เมอแยกไอออนเหลาน หาความสมพนธระหวางปรมาณสมพทธ (relative abundance) เทยบกบมวลจะไดแมสสเปกตรม (Mass spectrum) สเปกตรมเหลานสามารถใชในการบงบอกเอกลกษณของโมเลกลไดหรอรวมรปแบบของการแตกตวของแตละไอออนทงหมดเขาดวยกนแลวกจะไดรปแบบการแตกตว ( fragmentation pattern) ของโมเลกล ซงเปนลกษณะเฉพาะของสารประกอบแตละชนด (มงคล รายะนาคร, 2537; แมนและอมร, 2539 ) 1.2.4 การเตรยมตวอยาง (Sample preparation) พลาสมา (plasma) เปนสวนประกอบสวนใหญมอยรอยละ 55 ของเลอดทงหมดมสภาวะเปนดาง ม pH เทากบ 7.4 ประกอบดวยน า 91 เปอรเซนตและสารอนๆ เชน โปรตน 7 เปอรเซนต วตามน เกลอแร เอนไซม ฮอรโมน และแกส 2 เปอรเซนต พลาสมาไดจากการเตมสารกนเลอดแขง (anti coagulation) ลงไป เชน heparin หรอ EDTA และน าไปปนเหวยงจนเมดเลอดตกตะกอนจะไดพลาสมาสเหลองใส (Wikipedia, 2009) การเตรยมตวอยางพลาสมาเพอวเคราะหเมทแอมเฟตามนโดยทวไป ไดแก การตกตะกอนโปรตน (protein precipitation) เปนวธการพนฐานในการแยกสารทรวดเรวกวาวธการอน โปรตนสามารถละลายน าไดขนกบหลก 2 ประการ คอ โมเลกลของโปรตนมสวนทชอบน า สามารถเกดแรงกรยากบน าได เรยกสวนนวา hydrophobic patches สามารถเกดแรงดงดดทางไฟฟาเอาโมเลกลของน ามาลอมรอบโมเลกลของโปรตนได และบนโมเลกลของโปรตนอยหางกน จงไมสามารถรวมตวเขามาอยใกลกนแลวตกตะกอนลงมาได ดงนนปจจยใดทเพมแรงปฏกรยาระหวางโมเลกลของโปรตนดวยกนเอง (protein-protein interaction) หรอการลดปฏกรยาระหวางโมเลกลของโปรตนและน า (protein-water interaction) ท าใหความสามารถในการละลายน าของโปรตนลดลง ท าใหโปรตนเกดการตกตะกอนลงมา (Polson et al., 2003) ส าหรบการตกตะกอนโปรตนม 3 วธ คอ 1) การตกตะกอนทคาจดไอโซอเลคตรก (isoelectric pH) เรยกวธนวา isoelectric precipitation เนองจากโปรตนแตละชนดมคา pH ทท าใหสมดลของประจสทธบนโมเลกลเทากบศนย เรยกคานวา จดไอโซอเลคตรก ( isoelectric point, pl) คานเปนจดทโปรตนละลายไดนอยทสด ดงนนโปรตนจงเคลอนทเขาหากน เนองจากไมมแรงผลกดนไฟฟาสถตระหวางโมเลกลของโปรตนเองท าใหเกดการรวมตวแลวตกตะกอนลงมาได

25

2) การตกตะกอนโปรตนโดยการเพมความแรงอออนดวยวธการตกตะกอนแบบล าดบสวนดวยเกลอ (ionic strength หรอ salt fraction precipitation) เปนการตกตะกอนโปรตนโดยใชเกลอทมความเขมขนสง เพอเพมความแรงอออน (ionic strength) ของสารละลายใหสงขน จนกระทงอออนของเกลอไปแยงโมเลกลของน าทลอมรอบโมเลกลของโปรตน ใหออกมาลอมรอบโมกลของเกลอเอง ท าใหโปรตนละลายไดนอยลง เกดการจบตวของโปรตนจนเกดการตกตะกอนลงมา 3) การตกตะกอนดวยตวท าละลายอนทรยทอณหภมต า (organic solvent precipitation) ตวท าละลายอนทรยทใช ไดแก เมทานอล อะซโตน โดยตวท าละลายเหลานจะไปลดคาคงทไดอเลคตรก (dielectric constant) ของโปรตนซงมน าเปนตวท าละลาย เมอเพมความเขมขนของตวท าละลายอนทรยมากขนเรอยๆ จนถงจดทพลงงานไฟฟาสถตยของแรงกระท าระหวางโมเลกลของโปรตนสงกวาแรงกระท าระหวางโมเลกลของโปรตนกบน า ท าใหเกดการรวมตวของโปรตนแลวตกตะกอนลงมา ตะกอนโปรตนจะถกแยกดวยวธการกรองหรอการปนเหวยง เทคนคในการตกตะกอนโปรตนเพอใหไดรอยละการคนกลบทด ควรมการตกตะกอนตวอยางซ า 2 ครง (Siek, 2003)

26

การสกดดวยตวท าละลาย (solvent extraction) การสกดดวยตวท าละลายเปนการแยกสารทตองการออกจากของผสมดวยตวท าละลายทเหมาะสมซงมหลายวธ ทนยมใชคอ การสกดของเหลวดวยของเหลว (liquid-liquid extraction, LLE) แสดงดงภาพท 1.9 เปนวธการเตรยมตวอยางโดยอาศยหลกการแยกสารระหวางของเหลวกบของเหลว โดยจะแยกสารอนนทรยออกจากสารอนทรย ซงนยมใหของผสมละลายหรอแขวนลอยในน า เรยกวา ชนน า (aqueous layer) และสกดดวยตวท าละลายอนทรยทไมละลายน าแยกชนอยเรยกวา ชนสารอนทรย (organic layer) ตวท าละลายทใช ไดแก อเทอร (ether) คลอโรฟอรม (chloroform) คารบอนเตตราคลอไรด (carbon tetrachloride) เบนซน (benzene) และเฮกเซน (n–hexane) ขนตอนการสกดนยมท าในกรวยแยก (separatory funnel) โดยของผสมจะแยกชนอยตามความสามารถในการละลาย คอ สารอนนทรยหรอเกลอทละลายน าจะแตกตวเปนไอออนอยในชนน า ในขณะทสารอนทรยจะละลายอยในชนสารอนทรย ขอเสยของวธน คอ ใชเวลาในการเตรยมตวอยางนาน สนเปลองตวท าละลาย และสารสกดทไดเสยงตอการปนเปอนสง อกทงสามารถเกด emulsion ทไปรบกวนการวเคราะหได (Thurman and Mills, 1998)

ภาพท 1.9 แสดงการสกดดวยวธการสกดดวยตวท าละลาย ทมา: http://www.tutorbene.com/index.aspx?PageID=92

27

การสกดดวยตวดดซบของแขง (solid phase extraction, SPE) การสกดดวย SPE เปนวธการเตรยมตวอยางโดยอาศยหลกการแยกสารระหวางของแขง (absorbent) กบของเหลว (solvent) ขนตอนการใช SPE ม 4 ขนตอนแสดงดงภาพท 1.10 ดงน

ภาพท 1.10 แสดงขนตอนการสกดดวยตวดดซบของแขง ทมา: www.biotage.com/DynPage.aspx%3Fi...%3D35833 1. การปรบสภาพ (condition) ตวดดซบ (absorbent) ทบรรจในคอลมนจะตองถกปรบสภาพใหพรอมใชงาน โดยการเตมตวท าละลายทเหมาะสมเขาไปในคอลมน ซงมหลกเกณฑการเลอกดงน 1.1 ตวท าละลายแบบมขว เชน เมทานอล ส าหรบตวดดซบทเปนแบบไมมขว ไดแก C18, C8, polymeric 1.2 ตวท าละลายไมมขว เชน เฮกเซน ส าหรบตวดดซบแบบทเปนแบบมขว ไดแก NH2, CN, silica, florisil 1.3 น า ส าหรบตวดดซบทเปนแบบแลกเปลยนประจ ไดแก SCX, SAX

28

2. การเตมสารตวอยาง (loading) สารตวอยางทมสารแปลกปลอมจะถกเตมลงในคอลมน โดยสารทสนใจจะถกจบโดยตวดดซบ ในขณะทสารแปลกปลอมจะไมถกจบและปลอยออกจากคอลมน กระบวนการมดงน 2.1 Reversed phase chromatography ตวดดซบแบบไมมขวจะจบสารตวอยางแบบไมมขวหรอมขวเลกนอย เชน ยาปฏชวนะ ยาฆาแมลง เปนตน 2.2 Normal phase chromatography ตวดดซบแบบมขวจะจบสารตวอยางแบบมขว เชน nitrosamine ยาฆาแมลง เปนตน 2.3 Ion exchange chromatography ตวดดซบแบบแลกเปลยนประจจะจบสารตวอยางแบบมขวทสามารถแลกเปลยนประจ เชน ไอออนตางๆ เปนตน 3. การลาง (washing) สารแปลกปลอมทอาจถกจบโดยตวดดซบในคอลมน จะถกลางออกไปดวยตวท าละลายทเหมาะสม โดยขนตอนนตองระวงในการเลอกตวท าละลายหรอความเขมขนและอตราการไหลทเหมาะสม เพอไมใหสารทสนใจถกลางออกไปดวยหรอใหสญเสยสารทสนใจนอยทสด (highest recovery) 4. การชะสาร (elution) สารทสนใจจะถกชะออกจากคอลมนดวยตวท าละลายทเหมาะสม เพอน าไปวเคราะห (Thurman and Mills, 1998; Supelco, 1998) เทคนคเฮดสเปซ (Headspace) เปนเทคนคทใชไดกบตวอยางทมคณสมบตระเหยได (volatile compounds) ทอยในรปของแกส ของแขงและของเหลว โดยน าตวอยางทตองการวเคราะหไปบรรจในภาชนะปดสนท การบรรจสารตวอยางในภาชนะ จะตองมชองวางอยเหนอสาร โดยปรมาตรของชองวางจะตองไมนอยกวาปรมาตรของสารตวอยางในภาชนะ เพอใหไอของสารระเหยทตองการวเคราะหในสารตวอยางนนระเหยขนมา ซงอาจมการใหความรอนหรอไมกได เมอความดนไอของตวอยางและบรรยากาศรอบๆ ถงจดสมดล เกบไอระเหยทระเหยออกมาจากตวอยางโดยใชเขมส าหรบเกบตวอยางกาซ (gas tight syringe) แลวน าไปฉดในเครอง GC เพอวเคราะหหาองคประกอบทระเหยได (Mitra, 2001) ลกษณะของเทคนคนแสดงดงภาพท 1.11

29

ภาพท 1.11 แสดงขนตอนของเทคนคเฮดสเปซ

ทมา: http://www.labhut.com/education/headspace/introduction01.php นอกจากนยงมการใชเทคนคเฮดสเปซรวมกบการสกดดวยตวดดซบของแขงปรมาณนอย (solid phase microextraction, SPME) ซงมลกษณะเปนแทงแกวกลวงท าจากซลกาและถกเคลอบดวยตวดดซบทเปนสารพอลเมอรทเหมาะสม เรยกวา fiber จะท าหนาทดดซบสารตวอยางทเปนสารประกอบทระเหยไดในขวดเกบตวอยาง แลวน า fiber ทดดซบสารตวอยางแลวมาฉดใน injector port ของ GC หรอ GC-MS ทรอน เพอท าการคายการดดซบสารตวอยาง (Wercinski, 1999) ขนตอนของเทคนค SPME แสดงดงภาพท 1.12

30

ภาพท 1.12 แสดงขนตอนของเทคนคการสกดดวยตวดดซบของแขงปรมาณนอย

ทมา: http://www.sigmaaldrich.com/Graphics/Supelco/objects/4600/4547.pdf การท าอนพนธ (derivatization) การวเคราะหดวยเครอง GC มขอจ ากดในการวเคราะห คอ ไมสามารถวเคราะหสารทมสมบตความเปนขวหรอมน าหนกโมเลกลสงได เนองจากสารเหลานไมสามารถถกท าใหระเหยเปนไอไดหมดหรอในกรณทอณหภมท าใหสารเกดการสลายตว (degradable) จงตองใชวธการท าอนพนธเพอเพมคณสมบตของสารใหเหมาะสมตอการวเคราะห เชน เพมการกลายเปนไอ ลดความเปนขวของสาร ลดการเกดการสลายตวจากความรอน เพมประสทธภาพ

31

การแยกและลดการเกด tailing เปนตน ขอเสยของการท าอนพนธ คอ หากก าจดสารหลงท าอนพนธออกไปไมหมดจะกลายเปนสารรบกวนตอการวเคราะห และยงเปนการเพมเวลาในการเตรยมตวอยางอกดวย (Balu and Halket, 1993 ) ชนดของปฏกรยาอนพนธแบงเปน 4 แบบ คอ 1) แบบ Silylation เปนเทคนคทนยมใชกนมากทสดในการแยกหมฟงกชนนลทมปญหาในการแยกดวยวธทาง GC เชน หมไฮดรอกซล เอมน ไธอลฟอสเฟต โดยใชหม alkylsilyl เชน –SiMe3 มาแทนทไฮโดรเจนแสดงความเปนกรด โดยลกษณะของปฏกรยา Silylation แสดงดงน R1OH + (CH3)3SiX R1-O-Si(CH3)3 + HX อนพนธทไดนมกมความเปนขวต า ระเหยงาย และมคาความรอนเสถยร สารกออนพนธทใชกน คอ TMS (trimethylsilyl) 2) แบบ Acylation เปนปฏกรยาทลดความเปนขวของกรดอะมโน ไฮดรอกซล และไธอล ท าใหเปนการเพมคณสมบตทางโครมาโทกราฟและยงชวยใหสารประกอบมความเสถยร เนองจากไปปองกนหมฟงกชนนลทไมเสถยร โดยลกษณะของปฏกรยา Acylation แสดงดงน O R-NH2 + R’CCl R-NH-CO-R’ + HCl นอกจากนปฏกรยา Acylation ยงเพมการระเหยของสารประกอบ เชน คารโบไฮเดรต หรอกลมอะมโนทมหมฟงกชนนลเปนขวมากๆ ทสามารถสลายไดดวยความรอนขณะวเคราะหดวย GC สารกออนพนธทนยมใชในปฏกรยาน คอ acetic anhydride 3) แบบ Alkylation เปนปฏกรยาแทนทไฮโดรเจนใน R-COOH, R-OH, R-SH และ R-NH2 ดวยหมอลคล หรอบางครงเปนกลมเอรล ท าใหสารประกอบมคณสมบตทางโครมาโทกราฟเพมขน เนองจากความเปนขวของอนพนธเมอเทยบกบสารประกอบเดมลดลง โดยลกษณะของปฏกรยา Alkylation เชน R1OH + R2X R1-O-R2 + HX ปฏกรยาชนดนมกใชกบสารพวกคารโบไฮเดรต สารอนพนธทน ามาใช เชน diazomethane, pentafluorobenzyl bromide เปนตน

32

4) แบบ Esterification ปฏกรยานเปนตวเลอกอนดบแรกในการท าอนพนธกบกรด กรดเปนสารประกอบทแตกตวไดงายและมความเปนขวสง จงไมสามารถน ามาแยกดวย GC ไดด กรดทไมท าอนพนธจงมแนวโนมทจะใหพคทม tail เนองจากเกดการดดกลนและไมเกด interaction เฉพาะกบคอลมนในการแยกเอสเทอรฟเคชนจงถกน ามาใชในการท าอนพนธกบกรดคารบอกซลกและหมฟงกชนนลของกรด ชนดของปฏกรยาเปนการรวมตวของหมคารบอกซลกของกรดและหมไฮดรอกซลของแอลกอออลดวยการก าจดน าออก ปฏกรยาเอสเทอรฟเคชนมกเกดชาและตองใชอณหภมสงขน ดงนนเมอปฏกรยาถงจดสมมล จงตองขจดน าออกระหวางเกดปฏกรยา ลกษณะของปฏกรยาแสดงดงน O R-COOH + HO-R’ R’-CO-R’ + HOH ชนดของปฏกรยาการเกดอนพนธกบหมฟงกชนนลสรปไดดงตารางท 1.4 ตารางท 1.4 แสดงปฏกรยาอนพนธกบหมฟงกชนนล

หมฟงกชนนล ปฏกรยาอนพนธ หมไฮดรอกซล เชน 1° 2° 3° ของแอลกอฮอล, ฟนอล, คารโบไฮเดรต

Silylation, Acylation, Alkylation

หมคารบอกซลก (-COOH) Esterification, Silylation หมคารบอนล (-C=O) ในอลดไฮนคโตน Silylation หมอะมโน (-NH2) ใน 1°เอมน กรดอะมโน น าตาลอะมโน

Alkylation

หมอะมโน (-NH-R) ใน 2°เอมน Acylation, Silylation หม -NH2 และ –COOH ในกรดอะมโน Silylation, Esterification, Acylation สารประกอบไนโตร (-NO2) ไมตองท าอนพนธ สงส าคญของการท าปฏกรยาอนพนธ คอ ปฏกรยาตองเกดอยางสมบรณและจ าเปนตองใชวธ internal standard (IS) ในการหาคาเชงปรมาณ การใช internal standard จะเปนการชดเชยตวคะตาไลตทสญเสยไประหวางการท าอนพนธ (Balu and Halket, 1993)

33

1.2.5 ผลงานวจยทเกยวของ จากรายงานการวจยทผานมา ตวอยางทน ามาวเคราะหหาเมทแอมเฟตามนจะเปนพลาสมา ซรม หรอเลอดครบสวน (whole blood) ท าการเตรยมตวอยางโดยการตกตะกอนโปรตน หรอสกดดวยวธการตางๆ เชน การสกดดวยตวท าละลาย สกดดวย SPE หรอใชเทคนค headspace แลวมการตรวจวดโดยใชเครอง GC-MS เปนสวนใหญ Chen และคณะ (1992) ศกษาการตรวจวดสารเสพตดชนดตางๆ ในพลาสมาและปสสาวะ โดยท าการสกดดวย SPE และตรวจวดโดยใช GC-FID พบวา เปนวธทเหมาะสมในการใชตรวจปสสาวะมากกวาเลอด เนองจากระดบในปสสาวะมมากกวาในระดบทสามารถตรวจวดได Kikura และ Nakahara (1995) ท าการตรวจวดเมทแอมเฟตามนในเสนผมและพลาสมาโดยใชวธสกดดวย SPE หลงจากนนท าอนพนธดวย TFA:ethylacetate (1:1) และท าการตรวจวดดวยเครอง GC-MS โดยการหาความสมพนธของเลอดกบเสนขนของหน ตรวจวดเมทแอมเฟตามนในเลอดไดระดบต ากวา 10 นาโนกรมตอมลลลตร ไดมการประยกตใชในการตรวจวด 6-monoacetyl morphine จากซรม (Moeller and Mueller, 1995) Sato และ Mitsui (1997) ไดศกษาวธการตรวจวดเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนในเลอดโดยใช whole blood 1 มลลลตร ปรบ pH ใหเทากบ 9.0 โดยใช boric acid-sodium hydroxide buffer แลวน าไปสกดดวยตวท าละลาย พรอมท าอนพนธดวย pentafluorobenzyl และตรวจวดโดยใชเครอง GC-MS ใหคาความเทยงของเมทแอมเฟตามนในชวง 1.3 - 2.6 เปอรเซนต และแอมเฟตามนในชวง 1.6 - 3.0 เปอรเซนต Saito และคณะ (2000) ศกษาการสะสมเมทแอมเฟตามนในเสนผมของผเสยชวต โดยท าการตรวจวดเมทแอมเฟตามนในเลอดและเนอเยอตางๆ เพอดการกระจายของยา โดยใชวธสกดดวยตวท าละลาย น าไปวเคราะหดวย GC-MS ตรวจพบเมทแอมเฟตามนในเลอดของผเสยชวต 0.375 ไมโครกรมตอมลลลตร จากการศกษากอนหนานตรวจพบเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามน 4.92 และ 0.15 ไมโครกรมตอกรม ตามล าดบ Mills และ Walker (2000) พฒนาวธการสกดและแยกสารทระเหยงาย และระเหยยากในตวอยางพลาสมา ซรม เสนผม ลมหายใจ น านม น าลาย ดวยวธ SPME พบวาเทคนคนเหมาะส าหรบการตรวจสารปรมาณนอย ซงจะชวยเพมความเขมขนของสาร และขจดสงรบกวนในการวเคราะหดวย GC และพฒนาเทคนคนประยกตใชกบ HPLC ไดอกดวย Martinis และคณะ (2007) ตรวจวดเมทแอมเฟตามนและสารในกลมแอมเฟตามนในเหงอ ท าการสกดโดยใช SPE และวเคราะหดวย GC-MS-EI ใหขดจ ากดต าสดของการตรวจวดอยในชวง 2.5 - 5 ng/patch การวเคราะหสารโดยใชเหงอเปนตวอยางทท าใหมการพฒนาเครองมอทใชในการตรวจวดใหหลากหลายขน

34

Pujadas และคณะ (2007) ตรวจวดเมทแอมเฟตามนรวมกบสารกลมอนพนธแอมเฟตามนในน าลาย เมอสกดโดยใช SPE แลวท าอนพนธโดยใช trimethylsilyl น าไปวเคราะหกบเครอง GC-MS ใหขดจ ากดต าสดของการตรวจวดและขดจ ากดต าสดของการหาปรมาณเมทแอมเฟตามน 6.9 และ 20.9 นาโนกรมตอมลลลตรและแอมเฟตามน 6.8 และ 20.6 นาโนกรมตอมลลลตร วธนสามารถตรวจวดสารอนจากน าลายไดและเหมาะเปนงานประจ าทประยกตใชในหองปฏบตการหรอในโรงพยาบาลได นอกจากนยงมการพฒนาวธตรวจวดโดย Okajima และคณะ (2001) ศกษาการตรวจวดเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนใน whole blood ดวยวธ headspace SPME โดยใช pentafluorobenzyl bromide (PFBBr) เปนสารท าอนพนธ ใหขดต าสดทเครองตรวจวดไดของแอมเฟตามนและเมทแอมเฟตามนเทากบ 0.5 นาโนกรมตอกรม ในการทดลองยงพบวาการใส บฟเฟอรในขนตอนสกด ซง buffer บางตวจะท าใหเกดพครบกวนพคของสารทเราตองการ การทดลองยงมการพฒนาวธการตรวจวดเมทแอมเฟตามนดวยวธอนๆ เชน Ortuño แ ล ะ ค ณ ะ (1999) ศ ก ษ า ป ร ม า ณ ข อ ง 3,4-methlenedioxy methamphetamine และสารเมทาบอไลทในพลาสมาและปสสาวะ ท าการสกดพลาสมาดวย SPE โดยไมท าอนพนธ และตรวจวดโดยใช GC-NPD ใหขดจ ากดต าสดของการตรวจวดในพลาสมาและปสสาวะนอยกวา 1.6 ไมโครกรมตอลตร และ 47 ไมโครกรมตอลตร ตามล าดบ ใหรอยละการคนกลบในพลาสมาอยในชวง 81 – 92 เปอรเซนต การตรวจวดสารกลมแอมเฟตามนโดยใช GC-NPD ใหผลเรวและเปนเทคนคทใหความไว (sensitivity) ทด โดยไมตองท าอนพนธซง Jiménez และคณะ (2006) ไดน าวธการนไปศกษาหาแอมเฟตามนและสารอนพนธในปสสาวะไดอกดวย Wood และคณะ (2000) ไดศกษาการตรวจวดปรมาณสารกลมแอมเฟตามน โดยการใชเมทานอลเปนสารในการสกดดวยวธตกตะกอนโปรตน ในอตราสวน 1 : 4 แลวน าสารสกดสวนทแยกดวยวธปนเหวยงดวยแรงสศนยกลาง 13000 รอบตอนาท น าไปวเคราะหหาปรมาณโดยใช LC-ESI-MS/MS ใหคาต าสดทเครองสามารถตรวจวดไดอยท 1 นาโนกรมตอมลลลตร ซงเปนวธการทรวดเรวและไมตองท าอนพนธ ท าใหประหยดเวลาในการวเคราะห Nishida และคณะ (2002) ไดพฒนาการตรวจวดเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนในเลอดโดยวธฉดแบบ On-column โดยใช propylchloroformate เปนสารท าอนพนธ ตรวจวดโดยใช GC-MS ปรมาณของแอมเฟตามนและเมทแอมเฟตามนเทากบ 0.10 และ 2.53 ไมโครกรมตอกรม ตามล าดบ Chou และ Lee (2005) พฒนาการตรวจวดแอมเฟตามนและเมทแอมเฟตามนใน serum โดยสกดดวย SPME ตรวจวดโดยใช LC-ESI-MS/MS ใหคาขดจ ากดต าสดทเครองตรวจวดไดของแอมเฟตามนและเมทแอมเฟตามนเทากบ 0.3 และ 0.04 ไมโครกรมตอลตร ตามล าดบ ใหคาความเทยงนอยกวา 8 เปอรเซนต

35

วธการสกดโดยใช SPE และ SPME เปนการ clean up ตวอยางทใหผลดและเกดพครบกวนนอย ท าใหเปนวธทนกวจยสวนใหญนยมใช ถงแมจะมคาใชจายในการวเคราะหสงแตเพอผลการสกดทดจงเปนทางเลอกหลกของนกวจยทวไป ส าหรบการตรวจวดโดยใช GC-FID สวนใหญใชตรวจวดเมทแอมเฟตามนในเมดยา เนองจากตรวจพบเมทแอมเฟตามนไดในปรมาณทสงกวาตวอยางชววตถ เชน Puthaviriyakorn และคณะ (2002) ศกษาความบรสทธและจ าแนกสถตของเมดยาเมทแอมเฟตามนในประเทศไทย โดยบดใหละเอยดแลวใช ethylacetate เปนสารสกดเมดยาในสภาวะเปนดาง ตรวจวดโดยใช GC-FID ตรวจพบสารในกลมแอมเฟตามนและสารชนดอนในเมดยาโดยเฉพาะ caffeine และ ethylvanilin หากใช GC-MS จะสามารถตรวจวดสารอนทมในเมดยาไดมากขน เชน อฟดรน ซโดอฟดรน เปนตน Dayrit และ Dumlao (2004) ศกษาหาความบรสทธของเมทแอมเฟตามนไฮโดรคลอไรดในเมดยาทพบในประเทศฟลปปนส โดยละลายเมดยาในบฟเฟอรท pH เทากบ 10.5 สกดโดยใช ethylacetate วเคราะหคณภาพโดยใช GC-FID และหาปรมาณโดยใช GC-MS ผลทไดท าใหตรวจวดสารไดหลายตว เนองจากใช GC-MS เปรยบเทยบมวลอกทางหนง Mitrevski และ Zdravkovski (2005) วเคราะหหาปรมาณแอมเฟตามนและสารอนพนธแอมเฟตามนในตวอยางเมดยาโดยใช GC-FID ตรวจวดในครงเดยวสามารถตรวจวดแอมเฟตามนและสารอนพนธทงหมดไดในเวลาเพยง 6 นาท ซงในการวเคราะหบางครงสงทพบในการตรวจวดสารกลมแอมเฟตามนคอพคจะเกด tailing เนองจากตวเครองมอทเกยวกบการแยกหรอปฏกรยาเกยวกบ retention time พนทใตพค หรอพค overlap ในการทดลองนใหผลการแยกทด เปนแนวทางในการเลอกเครองมอในการตรวจวดได Inoue และคณะ (2003) ไดศกษาหาความบรสทธของเมทแอมเฟตามนในเมดยาโดยใช GC-FID ไดใหค าแนะน าในการตรวจวดเกยวกบเครองมอในการแยกวาคาพลลารคอลมนชนดไมมขวทมขนาดเสนผานศนยกลาง 0.32 ใหผลการแยกเมทแอมเฟตามนออกมาด และสามารถใชประยกตในการตรวจวดเมทแอมเฟตามนในตวอยางอนได เครองมอและวธการสกดเมทแอมเฟตามนในตวอยางเลอดมมากมาย แตขนกบวตถประสงคของการวจย การสกดโดยใช SPE และ SPME พบวา พครบกวนในการวเคราะหนอยกวาวธสกดอน แตขอเสยคอ มราคาคอนขางแพงและใชไดครงเดยวอยางเชน SPE ส าหรบเครองมอในการตรวจวดพบวา GC-MS เปนเครองมอหลกในการตรวจวดเมทแอมเฟตามนในตวอยางไมวาจะเปนเลอด เสนผม เหงอ น าลาย แตไดมการพฒนาใหตรวจวดดวยเครองมออนเชน GC-NPD HPLC และ LC-ESI-MS/MS ซงเปนเครองมอทมคาใชจายคอนขางสง ดงงนนในการศกษานตองการประยกตใช GC-FID เพอตรวจวดเมทแอมเฟตามนในพลาสมาได เพอลดขอจ ากดในการตรวจวดระดบเมทแอมเฟตามนในเลอด อกทงตนทนในการวเคราะหต า การเตรยมตวอยางไมยงยาก ผลทไดมความถกตองนาเชอถอ

36

1.3 วตถประสงค 1.3.1 ศกษาตวท าละลายทเหมาะสมในการเตรยมตวอยางดวยวธการตกตะกอนโปรตนเพอหาเมทแอมเฟตามนในพลาสมา 1.3.2 ศกษาการตรวจวดเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนในพลาสมาโดยใชเทคนคแกสโครมาโทกราฟชนดเฟลมไอออไนเซชน

37

บทท 2

วธด าเนนการวจย 2.1 วสดและสารเคม

2.1.1 สารมาตรฐานเมทแอมเฟตามนเตรยมในเมทานอลความเขมขน 3 มลลกรมตอ มลลลตร, กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข Lot. No. PT- U52MO1 2.1.2 สารมาตรฐานแอมเฟตามนซลเฟตเตรยมในเมทานอลความเขมขน 3 มลลกรมตอ มลลลตร, กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข Lot. No. PT- U52AO1 2.1.3 สารมาตรฐานอฟดรนไฮโดรคลอไรดเตรยมในเมทานอลความเขมขน 3 มลลกรม ตอมลลลตร, กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข Lot. No. PT- U52EP01 2.1.4 สารมาตรฐานซโดอฟดรนไฮโดรคลอไรดเตรยมในเมทานอลความเขมขน 3 มลลกรมตอมลลลตร, กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข Lot. No. PT- U52PE01 2.1.5 สารมาตรฐานเฟนฟลรามนไฮโดรคลอไรดเตรยมในเมทานอลความเขมขน 3 มลลกรมตอมลลลตร, กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข Lot. No. PT-U52F01

2.1.6 สารมาตรฐานเฟนเทอรมนไฮโดรคลอไรดเตรยมในเมทานอลความเขมขน 3 มลลกรมตอมลลลตร, กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข Lot. No. PT-U52PT01

2.1.7 สารมาตรฐาน 3,4-methylenedioxymethamphetamine ไดรบความอนเคราะห จาก รองศาสตราจารย ดร.นายแพทยพงษรกษ ศรบณฑตมงคล ภาควชานต- เวชศาสตร คณะแพทยศาสตร มหาวทยาลยเชยงใหม

2.1.8 เมทานอล (Methanol HPLC grade), J.T.Beaker, USA 2.1.9 2-โพรพานอล (2-propanol HPLC grade), J.T.Beaker, USA 2.1.10 อะซโตน (Acetone HPLC grade), J.T.Beaker, USA 2.1.11 อะซโตไนไตรล (Acetonitrile HPLC grade), J.T.Beaker, USA 2.1.12 น าปราศจากไอออน (Deionize water), Millipore, USA

38

2.2 เครองมอและอปกรณ 2.2.1 เครองแกสโครมาโทกราฟทมตวตรวจวดชนดเฟลมไอออไนเซชน (Gas Chromatography-Flame Ionization ; GC-FID) รน 6890N และ Autosampler รน 7683 Agilent, USA 2.2.2 คอลมน HP-5 (30 m 0.32 mm 0.25 µm) Agilent, USA

2.2.3 เครองปนเหวยงตกตะกอน (microcentrifuge), Eppendolf, Germany 2.2.4 เครองผสมสาร (vortex mixer) รน Genie 2, USA 2.2.5 เครองอลตราโซนค (ultrasonication), Elma, Germany

2.2.6 Microcentrifuge tube ขนาด 2 ไมโครลตร, eppendolf, Germany 2.2.7 ไมโครปเปต, Gilson, USA 2.2.8 เครองชงสาร, Sartorius, Germany 2.2.9 แกสฮเลยม (He) 99.999%, Ultra High Pure grade, TIG, Thailand 2.2.10 แกสไฮโดรเจน (H2) 99.999%, High Pure grade, TIG, Thailand 2.2.11 แอรซโร (Air Zero) TIG, Thailand 2.3 วธด าเนนการ 2.3.1 การเตรยมสารละลาย

2.3.1.1 การเตรยม stock standard solution stock solution ของเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามน ใชสารละลายมาตรฐาน

เมทแอมเฟตามนไฮโดรคลอไรดและสารละลายมาตรฐานแอมเฟตามนซลเฟตทเตรยมในเมทานอลความเขมขน 3 มลลกรมตอมลลลตร ไดรบความอนเคราะหจากกรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข 2.3.1.2 การเตรยม working standard solution เตรยมโดยการเจอจาง stock solution ของสารมาตรฐานเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนดวยเมทานอลใหมความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร 2.3.2 ศกษาหาตวท าละลายทเหมาะสมส าหรบการสกดดวยวธการตกตะกอนโปรตน เตรยมโดยเตมสารละลายมาตรฐานเมทแอมเฟตามนลงในพลาสมาทความเขมขน 0.10, 0.25 และ 0.50 ไมโครกรมตอมลลลตร โดยท าการเตรยมตวอยางความเขมขนละ

39

5 ซ า และใชตวท าละลายโดยพจารณาจากความสามารถในการละลายไดดของเมทแอมเฟตามนในตวท าละลายตางๆ ไดแก เมทานอล, 2-โพรพานอล, อะซโตไนไตรลและอะซโตน 2.3.3 ศกษาความจ าเพาะเจาะจงและความสามารถในการเลอก (specificity/ selectivity) วธตรวจวเคราะหทใชในการตรวจวดเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามน ตองไมมผลรบกวนจากสารอนๆ ทมในตวอยาง หรอสามารถตรวจวดสารหลายชนดไดโดยไมมผลรบกวนตอกน (Taverniers et al., 2004) ท าการเตรยมสารมาตรฐานในกลมอนพนธของแอมเฟตามน ไดแก อฟดรน (ephedrine), ซโดอฟดรน (pseudoephedrine), เฟนเทอรมน (phentermine), เฟนฟลรามน (fenfluramine) และ 3,4-methylenedioxymethamphetamine (ยาอ) ส าหรบการศกษาความจ าเพาะเจาะจงของสาร ท าโดยเตรยมสารมาตรฐานชนดตางๆ ในเมทานอลทความเขมขน 20.00 ไมโครกรมตอมลลลตรและการศกษาความสามารถในการตรวจวดสารไดหลายชนด ท าโดยเตรยมสารมาตรฐานชนดตางๆ มาผสมในเมทานอลใหมความเขมขน 1.00 ไมโครกรมตอมลลลตร น าไปวเคราะหแลวท าการเปรยบเทยบสญญาณกบตวอยาง blank ของเมทานอลและพลาสมาตวอยางละ 10 ซ า ผลการทดสอบจะตองไมพบสญญาณของสารอนขนทเวลาของสญญาณเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามน 2.3.4 วธเตรยมตวอยาง วธการเตรยมตวอยางดดแปลงมาจากวธของ Wood และคณะ (2000) ดงน - ท าการตกตะกอนพลาสมา 200 ไมโครลตร ดวยตวท าละลายทเหมาะสม 800 ไมโครลตร แลวน าไป sonicate 15 นาท หลงจากนนน าไปปนเหวยงดวยแรงสศนยกลาง 10,000 g จนตะกอนแยกชน เปนเวลา 10 นาท ดดสารละลายสวนใสแลวน าไปวเคราะหดวยเครอง GC-FID 2.4 ศกษาความถกตองของวธวเคราะห (method validation) วธการทใชในการศกษาความถกตองของวธวเคราะหคอ specificity/selectivity, linearity และ calibration curve, LOD, LOQ, recovery, precision (Taverniers et al., 2004), stability (ส านกงานคณะกรรมการอาหารและยา, 2547)

40

2.4.1 Linearity และ calibration curve โดยการเตมสารละลายมาตรฐานเมทแอมเฟตามนลงในพลาสมาทความเขมขน 0.10, 0.50, 2.50, 10.00 และ 50.00 ไมโครกรมตอมลลลตร และแอมเฟตามนทความเขมขน 0.10, 0.25, 0.50, 1.00 และ 2.00 ไมโครกรมตอมลลลตร แลวท าการเตรยมตวอยางความเขมขนละ 5 ซ า โดยในชวงความเขมขนดงกลาวของเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามน จะตองใหสมการเสนตรงทมคาสมประสทธสหสมพนธ (Correlation Coefficient, r) ไมนอยกวา 0.99

2.4.2 ขดจ ากดต าสดของการตรวจวด (limit of detection, LOD) และขดจ ากดต าสดของการหาปรมาณ (limit of quantification, LOQ) พจารณาจากการวเคราะหตวอยาง blank 10 ครง จากนนน าคาสญญาณการตอบสนองทไดมาค านวณหาคาเฉลย (Average, ) และคาเบยงเบนมาตรฐาน (Standard Deviation, S.D.) ของสญญาณจากตวอยาง blank โดยขดจ ากดต าสดของการตรวจวด หมายถง ความเขมขนต าทสด ( LC ) ของสารทสามารถตรวจวดได ค านวณไดจากสญญาณตอบสนองทนอยทสด ( LX ) แสดงดงสมการ LX BB kSX (1) เมอ BX คอคาเฉลยของสญญาณจากตวอยาง blank BS คอคาเบยงเบนมาตรฐานของสญญาณจากตวอยาง blank k คอสมประสทธทแสดงถงระดบความเชอมน (Confidence Level) โดย LOD จะค านวณโดยแทนคา 3k ซงหมายถงทระดบความเชอมน 99.86% ดงนน จงค านวณคา LC แสดงดงสมการ

m

XXC BL

L

)( (2)

เมอ m คอความไววเคราะหหรอคาความชนของกราฟมาตรฐาน และแทนคา

LX ลงในสมการ (2) จะสามารถค านวณคา LOD ไดดงสมการ

m

kSC B

L (3)

ส าหรบการค านวณคา LOQ จะใชวธการค านวณเชนกน แตแทนคา 10k

41

2.4.3 รอยละการคนกลบ (%recovery) การหารอยละการคนกลบ เพอตรวจสอบการไดคนกลบของการตรวจวดเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนในพลาสมา และเปนการทดสอบผลการรบกวนของพลาสมา เตรยมโดยการเตมสารละลายมาตรฐานเมทแอมเฟตามนลงในพลาสมาทความเขมขน 0.10, 0.50, 2.50, 10.00 และ 50.00 ไมโครกรมตอมลลลตรและแอมเฟตามนทความเขมขน 0.10, 0.25, 0.50, 1.00 และ 2.00 ไมโครกรมตอมลลลตร โดยเตรยมความเขมขนละ 5 ซ า ท าการค านวณ %Recovery ไดจากสมการ

%Recovery = 100injectiondirect after response

extractionafter response

โดยคารอยละการคนกลบทยอมรบไดในชวงความเขมขนตางๆ ดงแสดงในตารางท 2.1 ตารางท 2.1 แสดงรอยละการคนกลบทยอมรบไดในชวงความเขมขนตางๆ

ความเขมขน (µg/mL) คาเฉลยการคนกลบ (%) 100 90-107 10 80-110 1 80-110

0.1 80-110 0.01 60-115 0.001 40-120

ทมา: Taverniers et al., 2004 2.4.4 ความเทยง (precision) เปนคาความใกลเคยงของปรมาณสารทตรวจวดไดจากการตรวจวดซ าหลายๆครง คาความเทยงของการวเคราะหภายในวนเดยวกน (intraday) และระหวางวน (interday) เตรยมโดยการเตมสารละลายมาตรฐานเมทแอมเฟตามนลงในพลาสมาทความเขมขน คอ 0.10, 0.50, 2.50, 10.00 และ 50.00 ไมโครกรมตอมลลลตร และแอมเฟตามนทความเขมขน 0.10, 0.25, 0.50, 1.00 และ 2.00 ไมโครกรมตอมลลลตร โดยเตรยมความเขมขนละ 5 ซ า ใหผลแสดงในรปรอยละของคาเบยงเบนมาตรฐานสมพทธ หรอ %RSD ซงค านวณไดดงสมการ

RSD% = 100S.D.

X

42

โดยรอยละของคาเบยงเบนมาตรฐานสมพทธทยอมรบไดในชวงความเขมขนตางๆ ดงแสดงในตารางท 2.2 ตารางท 2.2 แสดงรอยละของคาเบยงเบนมาตรฐานสมพทธทยอมรบไดในชวงความเขมขน ตางๆ

ความเขมขน (µg/ml) Horwitz %RSD AOAC %RSD 100 8 5.3 10 11.3 7.3 1 16 11

0.1 22.6 15 0.01 32 21 0.001 45.3 30

ทมา: Taverniers et al., 2004 2.4.5 เสถยรภาพ (stability) ท าการศกษาเสถยรภาพของตวอยาง 4 แบบ ไดแก 1) Freeze-thaw stability ท าการเตรยมตวอยางและวเคราะหเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนในพลาสมาทความเขมขน 0.50 และ 1.00 ไมโครกรมตอมลลลตร โดยเตรยมความเขมขนละ 5 ซ า หลงจากเกบตวอยางแบบ freeze-thaw ครบ 3 รอบ (1 รอบ คอ การเกบตวอยางทอณหภมทใชในการเกบรกษาตวอยางเปนเวลา 24 ชม. แลวน าออกมาละลายทอณหภมหอง) เปรยบเทยบความเขมขนทตรวจวดไดหลงจากเกบตวอยางครบ 3 รอบ กบความเขมขนของตวอยางทเตรยมขนใหม ผลการเปรยบเทยบตองไมพบการสลายตวของเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนในพลาสมาหลงจากเกบตวอยางครบ 3 รอบ 2) Long-term stability ท าการเตรยมตวอยางและวเคราะหเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนในพลาสมาทความเขมขน 0.50 และ 1.00 ไมโครกรมตอมลลลตร โดยเตรยมความเขมขนละ 5 ซ า หลงจากเกบตวอยางทอณหภมทใชในการเกบรกษา คอ -20°C โดยเกบตวอยางทระยะเวลา 15 วน และ 30 วน ซงเปนชวงเวลาในการเกบรกษาตวอยางจรง เปรยบเทยบความเขมขนทตรวจวดไดหลงจากเกบตวอยางตามระยะเวลาทก าหนดไวกบความเขมขนของตวอยางทเตรยมขนใหม ผลการเปรยบเทยบตองไมพบการสลายตวของเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนในตวอยางพลาสมาภายในระยะเวลา 15 วน และ 30 วน 3) Short-term stability ท าการเตรยมตวอยางและวเคราะหเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนในพลาสมาทความเขมขน 0.50 และ 1.00 ไมโครกรมตอมลลลตร โดยเตรยมความเขมขนละ 5 ซ า หลงจากเกบตวอยางทอณหภมทใชในการเกบรกษา คอ -20°C แลวน า

43

ตวอยางมาละลายทอณหภมหองเปนเวลา 3 และ 6 ชวโมง เปรยบเทยบความเขมขนทตรวจวดไดหลงจากละลายตวอยางทอณหภมหองตามระยะเวลาทก าหนดกบความเขมขนของตวอยางทเตรยมขนใหม ผลการเปรยบเทยบตองไมพบการสลายตวของเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนในตวอยางพลาสมาภายในระยะเวลาทคาดวาจะตองเกบตวอยางไวทอณหภมหองเมอท าการวเคราะหจรง 4) Post-preparative stability ท าการเตรยมตวอยางและวเคราะหเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนในพลาสมาทความเขมขน 0.50 และ 1.00 ไมโครกรมตอมลลลตร โดยเตรยมความเขมขนละ 5 ซ า หลงจากน าตวอยางยาทผานกระบวนการเตรยมตวอยางหรอสกดสาร (extracted sample) ตงไวใน autosampler (autosampler stability) หรอตงทงไวทอณหภมหอง (bench-top stability) เปนระยะเวลา 5 และ 10 ชวโมง ซงเวลาดงกลาวเปนเวลาทใชในการวเคราะหตวอยางในแตละ batch size ทเตรยมส าหรบวเคราะหในแตละครง เปรยบเทยบความเขมขนทตรวจวดไดหลงจากน าตวอยางทผานการเตรยมตวอยางหรอสกดสารแลวตงไวใน autosampler หรอทอณหภมหองตามระยะเวลาทก าหนดกบความเขมขนของตวอยางทเตรยมขนใหมและท าการวเคราะหทนท ผลการเปรยบเทยบตองไมพบการสลายของเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนในพลาสมาภายในระยะเวลาทคาดวาจะใชในการวเคราะหตวอยางในแตละ batch size (ส านกงานคณะกรรมการอาหารและยา, 2547) 2.5 การตรวจวดเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนในพลาสมาคน (determination of methamphetamine and amphetamine in human plasma) เกบตวอยางทใชในการวเคราะหจากพลาสมาผเสยชวตทถกสงมาชนสตรเพอหาสาเหตการเสยชวต ณ หนวยนตเวชศาสตรและพษวทยา โรงพยาบาลสงขลานครนทร ระหวางเดอนธนวาคม พ.ศ. 2552 – กมภาพนธ พ.ศ. 2553 โดยมการตรวจสอบประวตการใชสารเสพตดกลมแอมเฟตามนอยางละเอยด โดยแพทยผเชยวชาญทางนตเวชศาสตร ระยะเวลาในการเกบตวอยางกอนท าการวเคราะหหาเมทแอมเฟตามนอยในชวง 0-3 วน หลงจากไดรบตวอยาง โดยตวอยางจะถกเกบไวในตท าความเยนของหนวยนตเวชศาสตรและพษวทยาทอณหภม -20°C

44

2.6 การตงคาเครองมอ GC-FID ตงสภาวะของเครองดงแสดงในตารางท 2.3 ท าการวเคราะหขอมลเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนโดยใชโปรแกรม Chem Station Version A ตารางท 2.3 แสดงสภาวะของเครอง GC-FID ในการวเคราะหเมทแอมเฟตามนและแอมเฟ - ตามน Column HP5 (30.00 m x 0.32 mm x 0.25 µm) Injector 290oC Detecter 300oC Oven 80oC (1 min) , 30oC/min , 200oC (0 min) Injection volumn 1 µl, splitless Gas flow rate Carrier gas (He) 2.60 ml/min

Make up gas (He) 35.00 ml/min Fuel gas (H2 ) 25.00 ml/min Oxidant gas (O2) 400.00 ml/min

2.7 การวเคราะหขอมลทางสถต ขอมลความเขมขนของเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนน าเสนอในรปคาเฉลยและ ±S.D. วเคราะหหาความแตกตางของคาเฉลยแบบจบค (Pair Sample T-test) ทระดบความเชอมน 95% โดยใชโปรแกรม SPSS

45

บทท 3

ผลและบทวจารณ 3.1 ศกษาหาตวท าละลายทเหมาะสมส าหรบการเตรยมตวอยางเมทแอมเฟตามนใน พลาสมาดวยวธการตกตะกอนโปรตน ตวท าละลายทใชเตรยมตวอยางเมทแอมเฟตามนในพลาสมาดวยวธการตกตะกอนโปรตน ไดแก เมทานอล, 2-โพรพานอล, อะซโตไนไตรลและอะซโตน เมอท าการวดพนทพคของเมทแอมเฟตามนทเตมลงในพลาสมาทความเขมขน 0.10, 0.25 และ 0.50 ไมโครกรมตอมลลลตร ท าการตกตะกอนพลาสมาดวยตวท าละลายทง 4 ชนด ความเขมขนละ 5 ซ า โดยท าการเลอกจากความสามารถในการละลายของเมทแอมเฟตามน ซงสารแตละชนดมความเปนขวดงแสดงในตารางท 3.1 ตารางท 3.1 แสดงความเปนขวของตวท าละลายทง 4 ชนด ตวท าละลาย เมทานอล 2-โพรพานอล อะซโตไนไตรล อะซโตน น า ความเปนขว 5.1 3.9 5.8 5.1 10.2 ทมา: Syndex, 1997 เมอท าการตกตะกอนพลาสมาดวยตวท าละลายทง 4 ชนด ผลการตรวจวดเมทแอมเฟตามนใหผลดงแสดงในตารางท 3.2 ตารางท 3.2 แสดงพนทพคของเมทแอมเฟตามนหลงจากตกตะกอนโปรตนดวยตวท าละลายทง 4 ชนด

ความเขมขน (µg/mL)

เวลา MA (นาท)

คาเฉลยพนทพคของ MA ทตกตะกอนดวยตวท าละลาย (pA*s) (%RSD)

เมทานอล 2-โพรพานอล อะซโตไนไตรล อะซโตน 0.10 3.62 0.44 (9.07) ND (-) ND (-) ND (-) 0.25 3.62 0.50 (5.00) ND (-) 0.32 (11.71) 0.34 (12.36) 0.50 3.63 1.13 (4.68) 1.40 (7.14) 0.97 (3.63) 1.37 (11.18)

* ND = ไมสามารถตรวจวดได (Not Detectable)

46

0.34

0.000.0

00.0

0

0.50 0.5

7

0.32

0.34

1.23

1.40

0.97

1.37

0.00

0.50

1.00

1.50คา

เฉลย

พนทพ

ค (p

A*s)

0.10 0.25 0.50ความเขมขน (ไมโครกรมตอมลลลตร)

เมทานอล

2-โพรพานอล

อะซโตไนไตรล

อะซโตน

แผนภมแทงท 3.1 แสดงการเปรยบเทยบพนทพคของเมทแอมเฟตามนในตวท าละลายทง 4 ชนด ทใชในการตกตะกอนโปรตน

จากผลการทดลอง พคของเมทแอมเฟตามนในตวท าละลายทง 4 ชนด เกดทเวลาเดยวกน คอทเวลาประมาณ 3.62 นาท และพบวาเมอใชเมทานอลเปนตวท าละลายในการตกตะกอนโปรตน จะใหพนทพคของเมทแอมเฟตามนสงในทกความเขมขน ซงแสดงวาเมทานอลสามารถแยกเมทแอมเฟตามนออกจากโปรตนในพลาสมาได อกทงเมทานอลเปนตวท าละลายทใหผลการตรวจวดเมทแอมเฟตามนในระดบความเขมขนต าได เนองจากเมทแอมเฟตามนเปนสารทมขวและเมทแอมเฟตามนสามารถละลายในเมทานอลไดด (Logan, 2002) เมอเปรยบเทยบความเปนขวของตวท าละลายทง 4 ชนด ดงแสดงในตารางท 3.1 พบวา อะซโตไนไตรลเปนตวท าละลายทมความเปนขวสงมากกวาเมทานอล และเมทานอลเปนตวท าละลายทมความเปนขวสงใกลเคยงกบอะซโตน โดยท 2-โพรพานอลมความเปนขวนอยทสด (Syndex, 1997) แตจากการทดลองเมอพจารณาคาความเทยงของเมทแอมเฟตามนทใชเมทานอลเปนตวท าละลาย มคาอยในชวง 4.68 - 9.07% ซงในแตละความเขมขนผลของคาความเทยงมความแปรปรวนนอย แสดงวาคาความใกลเคยงของพนทพคเมทแอมเฟตามนทไดจากการตรวจวดซ าหลายๆ ครง อยในเกณฑทยอมรบได (Taverniers et al., 2004) เมอเปรยบเทยบกบ 2-โพรพานอล, อะซโตไนไตรลและอะซโตน ซงไมสามารถตรวจวดเมทแอมเฟตามนทความเขมขนต าได และความเขมขนทสามารถตกตะกอนโปรตนไดใหผลของคาความเทยงมความแปรปรวนสง ดงนนเมทานอลจงเปนตวท าละลายทเหมาะสมในการเตรยมตวอยางเพอตรวจหาเมทแอมเฟตามนในพลาสมาดวยวธการตกตะกอนโปรตน

47

3.2 ศกษาความจ าเพาะเจาะจงและความสามารถในการเลอก (specificity/selectivity) ท าการวเคราะหสารมาตรฐานเมทแอมเฟตามน แอมเฟตามนและสารในกลมอนพนธของแอมเฟตามน ไดแก อฟดรน (ephedrine), ซโดอฟดรน (pseudoephedrine), เฟนเทอรมน (phentermine), เฟนฟลรามน (fenfluramine) และ 3,4-methylenedioxymethamphe tamine (ยาอ) โดยเตรยมสารมาตรฐานในเมทานอลทความเขมขน 1.00 และ 20.0 ไมโครกรมตอมลลลตร น าไปวเคราะหแลวท าการเปรยบเทยบสญญาณกบตวอยาง blank ของเมทานอลและพลาสมา ตวอยางละ 10 ซ า ความจ าเพาะเจาะจงของสารแตละชนดแสดงพคออกมาทเวลาตางๆ ดงแสดงในตารางท 3.3 และ ลกษณะโครมาโทแกรมแสดงดงภาพท 3.1 - 3.9 ตามล าดบ ตารางท 3.3 แสดงเวลาทเกดพคของสารแตละชนด

ภาพท 3.1 แสดงโครมาโทแกรมของ blank เมทานอล

ชอสาร เวลาเฉลยทเกดพค (นาท)

แอมเฟตามน 3.33 เมทแอมเฟตามน 3.62 เฟนเทอรมน 3.51 เฟนฟลรามน 3.86 อฟดรน 4.50 ซโดอฟดรน 4.51 3,4-methylenedioxymethamphetamine 5.18

Blank Methanol

48

ภาพท 3.2 แสดงโครมาโทแกรมของ blank พลาสมา ภาพท 3.3 แสดงโครมาโทแกรมของสารมาตรฐานแอมเฟตามนในเมทานอล ทความเขมขน 20.00 ไมโครกรมตอมลลลตร

Blank plasma

49

ภาพท 3.4 แสดงโครมาโทแกรมของสารมาตรฐานเมทแอมเฟตามนในเมทานอล ทความ เขมขน 20.00 ไมโครกรมตอมลลลตร ภาพท 3.5 แสดงโครมาโทแกรมของสารมาตรฐานเฟนเทอรมนในเมทานอล ทความเขมขน 20.00 ไมโครกรมตอมลลลตร

50

ภาพท 3.6 แสดงโครมาโทแกรมของสารมาตรฐานเฟนฟลรามนในเมทานอล ทความเขมขน 20.00 ไมโครกรมตอมลลลตร ภาพท 3.7 แสดงโครมาโทแกรมแบบซอนทบ (overlay) ของสารมาตรฐาน; (A) ซโดอฟดรน และ (B) อฟดรนในเมทานอลทความเขมขน 20.00 ไมโครกรมตอมลลลตร

A

B

51

ภาพท 3.8 แสดงโครมาโทแกรมของสารมาตรฐาน 3,4-methylenedioxymethamphetamine ในเมทานอลทความเขมขน 20.00 ไมโครกรมตอมลลลตร จากภาพท 3.3 - 3.8 แสดงพคของสารชนดตางๆ ไดแก แอมเฟตามน เมทแอมเฟตามน เฟนเทอรมน เฟนฟลรามน ซโดอฟดรน อฟดรน และ 3,4-methylenedioxymetham phetamine ใหพคทเวลาตางกน แสดงถงความจ าเพาะของวธวเคราะหในการตรวจวดเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามน ซงเปนสารทตองการไดอยางถกตอง โดยไมมผลการรบกวนจากสารอน เมอท าการตรวจวดสารพรอมกนจะแสดงพคแยกออกจากกนอยางชดเจน ยกเวนซโดอฟ ดรนและอฟดรน พคทไดแสดงดงภาพท 3.9

52

ภาพท 3.9 แสดงโครมาโทแกรมของสารมาตรฐานผสมในเมทานอล ทความเขมขน 1.00 ไมโครกรมตอมลลลตร ผลการศกษาความจ าเพาะเจาะจงและความสามารถในการเลอกวดเฉพาะเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามน ซงเปนสารทตองการ จากภาพท 3.1 - 3.2 แสดงใหเหนวาพคของ blank เมทานอลและพลาสมา ไมมพครบกวนตอการตรวจวดเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามน และจากภาพ 3.9 วธการวเคราะหสามารถแยกเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนออกจากสารอนไดอยางชดเจน รวมทงสามารถตรวจวดสารไดหลายชนด โดยไมมผลการรบกวนตอกน ยกเวนซโดอฟดรนและอฟดรน ทพคไมสามารถแยกออกจากกนไดชดเจน แตพคของซโดอฟดรนและอฟดรนไมเปนพครบกวนในการตรวจวดเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามน ดงนนวธการวเคราะหน จงมความเหมาะสมในการตรวจวดเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามน

53

y = 2.1669x - 0.2951

R2 = 0.9999

-50.00

0.00

50.00

100.00

150.00

0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00

ความเขมขน (ไมโครกรมตอมลลลตร)

พนทพ

ค (p

A*s)

3.3 ศกษาความถกตองของวธวเคราะห (method validation) 3.3.1 ศกษาความถกตองของวธวเคราะหเมทแอมเฟตามน 3.3.1.1 Linearity และ calibration curve ของเมทแอมเฟตามนในพลาสมา ท าการสรางกราฟมาตรฐานของเมทแอมเฟตามนในพลาสมาทความเขมขน 0.10, 0.50, 2.50,10.00 และ 50.00 ไมโครกรมตอมลลลตร โดยเตรยมความเขมขนละ 5 ซ า จากชวงความเปนเสนตรงไดคาสมประสทธสหสมพนธ (r2) เทากบ 0.9999 ดงแสดงในภาพท 3.10 และลกษณะโครมาโทแกรมแสดงในภาพท 3.11 - 3.13

ภาพท 3.10 แสดงชวงความเปนเสนตรงของเมทแอมเฟตามนในพลาสมา

54

ภาพท 3.11 แสดงโครมาโทแกรมของ blank พลาสมาเมทแอมเฟตามน

ภาพท 3.12 แสดงโครมาโทแกรมของสารมาตรฐานเมทแอมเฟตามนในเมทานอล ทความ เขมขน 0.50 ไมโครกรมตอมลลลตร

Blank plasma

55

ภาพท 3.13 แสดงโครมาโทแกรมของสารมาตรฐานเมทแอมเฟตามนในพลาสมา ทความ เขมขน 0.50 ไมโครกรมตอมลลลตร 3.3.1.2 ขดจ ากดต าสดของการตรวจวด (limit of detection: LOD) และ ขดจ ากดต าสดของการหาปรมาณ (limit of quantification: LOQ) ของเมทแอมเฟตามนในพลาสมา จากการสรางกราฟมาตรฐานโดยเปรยบเทยบกบพนทพคของเมทแอมเฟตามนในพลาสมาในชวงความเขมขน 0.10, 0.50, 2.50, 10.00 และ 50.00 ไมโครกรมตอมลลลตร โดยเตรยมความเขมขนละ 5 ซ า จากชวงความเปนเสนตรงใหสมการ y = 2.1669x - 0.2951 ความชนของกราฟมคาเทากบ 2.1669 น าไปค านวณหา LOD และ LOQ โดยใชคาเฉลยของ blank พลาสมา 10 ซ า ดงแสดงในตารางท 3.4 ตารางท 3.4 แสดงคาเฉลยพนทพคและคาเบยงเบนมาตรฐานของเมทแอมเฟตามนใน blank พลาสมา

Blank plasma Mean S.D. MA 0.0910 0.0088

56

ขดจ ากดต าสดของการตรวจวดเมทแอมเฟตามน ค านวณไดจาก

สตร m

kSC B

L

แทนคา CL = 1669.2

0088.03x

CL = 0.0123 ไมโครกรมตอมลลลตร ขดจ ากดต าสดของการหาปรมาณเมทแอมเฟตามน ค านวณไดจาก

สตร m

kSC B

L

แทนคา CL = 1669.2

0088.010x

CL = 0.0409 ไมโครกรมตอมลลลตร

ดงนน ขดจ ากดต าสดของการตรวจวดและขดจ ากดต าสดของการหาปรมาณของเมทแอมเฟตามนมคาเทากบ 0.0123 และ 0.0409 ไมโครกรมตอมลลลตร ตามล าดบ 3.3.1.3 รอยละการคนกลบ (%recovery) ของเมทแอมเฟตามนในพลาสมา เมอค านวณหาความเขมขนของสารละลายเมทแอมเฟตามนในพลาสมาทผานการเตรยมตวอยางทความเขมขน 0.10, 0.50, 2.50, 10.00 และ 50.00 ไมโครกรมตอมลลลตร โดยเตรยมความเขมขนละ 5 ซ า ท าการเปรยบเทยบกบสารละลายเมทแอมเฟตามนทไมผานการเตรยมตวอยาง ใหผลแสดงดงตารางท 3.5

57

ตารางท 3.5 แสดงคารอยละการคนกลบของเมทแอมเฟตามน

ความเขมขน (µg/mL)

พนทพค MA ในเมทานอล (Mean ± S.D.)

พนทพค MA ในพลาสมา

(Mean ± S.D.) %Recovery %RSD

0.10 0.32 ± 0.03 0.35 ± 0.03 108.75 8.95 0.50 1.20 ± 0.00 0.99 ± 0.02 82.33 1.66 2.50 6.20 ± 0.25 5.00 ± 0.07 80.65 1.68 10.00 22.34 ± 0.11 20.74 ± 0.57 92.84 2.74 50.00 126.58 ± 0.84 108.18 ± 4.36 85.48 4.03

จากตารางการเตรยมตวอยางเมทแอมเฟตามนในพลาสมาใหการคนกลบของเมทแอมเฟตามนแสดงอยในชวง 80.65 - 108.95% ซงเปนคาทอยในชวงของเกณฑทยอมรบได คอ 80 - 120 % (Taverniers et al., 2004) ใหรอยละของคาเบยงเบนมาตรฐานสมพทธ (%RSD) อยในชวง 1.66 - 8.95% 3.3.1.4 ความเทยง (precision) ของเมทแอมเฟตามนในพลาสมา จากการค านวณหาความเขมขนของสารละลายเมทแอมเฟตามนในพลาสมาทผานการเตรยมตวอยางทความเขมขน คอ 0.10, 0.50, 2.50, 10.00 และ 50.00 ไมโครกรมตอมลลลตร โดยเตรยมความเขมขนละ 5 ซ า เปรยบเทยบการวเคราะหภายในวนเดยวกน (intraday, n=5) และระหวางวน (interday, n=10) ใหผลดงแสดงในตารางท 3.6 ตารางท 3.6 แสดงคาความเทยงของการวเคราะหเมทแอมเฟตามนในพลาสมาภายใน วนเดยวกนและระหวางวน

ความเขมขน (µg/mL)

%RSD

Intraday (n=5) Interday (n=10) 0.10 8.95 8.68

0.50 1.66 5.23

2.50 1.68 3.91

10.00 2.74 4.49

50.00 4.03 5.22

58

จากตารางการศกษาความเทยงของการวเคราะหภายในวนเดยวกน และระหวางวน แสดงผลเปนคาเบยงเบนมาตรฐานสมพทธ (%RSD) มคาอยในชวง 1.66 - 8.95% และ 3.91 - 8.68% ตามล าดบและเปนคาทยอมรบได ซงคาทยอมรบไดของคาเบยงเบนมาตรฐานสมพทธ คอ ไมเกน 15% (Taverniers et al., 2004) 3.3.1.5 เสถยรภาพ (stability) ของเมทแอมเฟตามนในพลาสมา เสถยรภาพของเมทแอมเฟตามน แสดงผลจากการค านวณหารอยละของความเขมขนของเมทแอมเฟตามนในพลาสมาทผานการเตรยมตวอยางจากเงอนไขของเสถยรภาพแตละแบบ ทความเขมขนต าและสงคอ 0.50 และ 1.00 ไมโครกรมตอมลลลตร ท าการเปรยบเทยบกบรอยละของความเขมขนทเตรยมขนใหม การทดลองใหผลของเสถยรภาพของเมทแอมเฟตามนดงตอไปน 1) Freeze-thaw stability ท าการเตรยมตวอยางและวเคราะหตวอยางเมทแอมเฟตามนทความเขมขน 0.50 และ 1.00 ไมโครกรมตอมลลลตร โดยเตรยมความเขมขนละ 5 ซ า หลงจากเกบตวอยางยาแบบ freeze-thaw ครบ 3 รอบ เปรยบเทยบความเขมขนในรปคารอยละของความเขมขนของตวอยางทตรวจวดไดหลงจากเกบตวอยางครบ 3 รอบกบความเขมขนของตวอยางทเตรยมขนใหม (0 รอบ) ใหผลดงแสดงในตารางท 3.7 ตารางท 3.7 แสดงรอยละความเขมขนของเมทแอมเฟตามนเมอท าการศกษาเสถยรภาพแบบ Freeze-thaw stability

Stability

ความเขมขนของ MA (µg/mL)

0.50 1.00

(Mean ± S.D.) (Mean ± S.D.)

Freeze-thaw (รอบ) 0 100 100

3 102.56 ± 3.00 98.59 ± 4.98 จากผลการทดลองเมอน าขอมลมาวเคราะหทางสถตโดยเปรยบเทยบรอยละความเขมขนของตวอยางทตรวจวดไดหลงจากเกบตวอยางครบ 3 รอบกบรอยละความเขมขนของตวอยางทเตรยมขนใหม พบวา ไมมความแตกตางอยางมนยส าคญ (p>0.05) แสดงวาเมทแอมเฟตามนในพลาสมา ไมมการสลายตวหลงจากเกบตวอยางแบบ Freeze-thaw stability ครบ 3 รอบ

59

2) Long-term stability ท าการเตรยมตวอยางและวเคราะหเมทแอมเฟตามนในพลาสมาทความเขมขน 0.50 และ 1.00 ไมโครกรมตอมลลลตร โดยเตรยมความเขมขนละ 5 ซ า หลงจากเกบตวอยางทอณหภมทใชในการเกบรกษา คอ -20°C โดยเกบตวอยางทระยะเวลา 15 วน และ 30 วน ซงเปนชวงเวลาในการเกบรกษาตวอยางจรง เปรยบเทยบความเขมขนในรปคารอยละของความเขมขนของตวอยางทตรวจวดไดหลงจากเกบตวอยางตามระยะเวลาทก าหนดไวกบความเขมขนของตวอยางทเตรยมขนใหม ใหผลดงแสดงในตารางท 3.8 ตารางท 3.8 แสดงรอยละความเขมขนของเมทแอมเฟตามนเมอท าการศกษาเสถยรภาพแบบ Long-term stability

Stability

ความเขมขนของ MA (µg/mL)

0.50 1.00

(Mean ± S.D.) (Mean ± S.D.)

Long-term (วน) 0 100 100

15 97.36 ± 2.02 98.41 ± 4.35 30 97.35 ± 1.81 100.00 ± 0.00

จากผลการทดลองเมอน าขอมลมาวเคราะหทางสถตโดยเปรยบเทยบรอยละความเขมขนของตวอยางทตรวจวดไดหลงจากเกบตวอยางตามระยะเวลาทก าหนดไวกบรอยละความเขมขนของตวอยางทเตรยมขนใหม พบวา ไมมความแตกตางอยางมนยส าคญ (p>0.05) แสดงวาเมทแอมเฟตามนในพลาสมา ไมมการสลายตวหลงจากเกบตวอยางแบบ Long-term stability ครบ 15 วน และ 30 วน 3) Short-term stability ท าการเตรยมตวอยางและวเคราะหเมทแอมเฟตามนในพลาสมาทความเขมขน 0.50 และ 1.00 ไมโครกรมตอมลลลตร โดยเตรยมความเขมขนละ 5 ซ า หลงจากเกบตวอยางทอณหภมทใชในการเกบรกษา คอ -20°C แลวน าตวอยางมาละลายทอณหภมหองเปนเวลา 3 และ 6 ชวโมง เปรยบเทยบความเขมขนในรปคารอยละของความเขมขนทตรวจวดไดหลงจากละลายตวอยางทอณหภมหองตามระยะเวลาทก าหนดกบความเขมขนของตวอยางทเตรยมขนใหม ใหผลดงแสดงในตารางท 3.9

60

ตารางท 3.9 แสดงรอยละความเขมขนของเมทแอมเฟตามนเมอท าการศกษาเสถยรภาพแบบ Short-term stability

Stability

ความเขมขนของ MA (µg/mL)

0.50 1.00

(Mean ± S.D.) (Mean ± S.D.)

Short-term (ชม.) 0 100 100

3 102.24 ± 4.86 102.82 ± 3.86 6 101.60 ± 2.43 100.00 ± 3.15

จากผลการทดลองเมอน าขอมลมาวเคราะหทางสถตโดยเปรยบเทยบรอยละความเขมขนของตวอยางทตรวจวดไดหลงจากเกบตวอยางตามระยะเวลาทก าหนดไวกบรอยละความเขมขนของตวอยางทเตรยมขนใหม พบวา ไมมความแตกตางอยางมนยส าคญ (p>0.05) แสดงวาเมทแอมเฟตามนในพลาสมา ไมมการสลายตวหลงจากเกบตวอยางแบบ Short-term stability ครบ 3 ชวโมง และ 6 ชวโมง 4) Post-preparative stability ท าการเตรยมตวอยางและวเคราะหเมทแอมเฟตามนในพลาสมาทความเขมขน 0.50 และ 1.00 ไมโครกรมตอมลลลตร โดยเตรยมความเขมขนละ 5 ซ า หลงจากน าตวอยางยาทผานกระบวนการเตรยมตวอยางหรอสกดสาร (extracted sample) ตงไวใน autosampler (autosampler stability) หรอตงทงไวทอณหภมหอง (bench-top stability) เปนระยะเวลา 5 และ 10 ชวโมง ซงเวลาดงกลาวเปนเวลาทใชในการวเคราะหตวอยางในแตละ batch size ทเตรยมส าหรบวเคราะหในแตละครง เปรยบเทยบความเขมขนในรปคารอยละของความเขมขนทตรวจวดไดหลงจากน าตวอยางทผานการเตรยมตวอยางหรอสกดสารแลวตงไวใน autosampler หรอทอณหภมหองตามระยะเวลาทก าหนดกบความเขมขนของตวอยางทเตรยมขนใหมและท าการวเคราะหทนท ใหผลดงแสดงในตารางท 3.10

61

ตารางท 3.10 แสดงรอยละความเขมขนของเมทแอมเฟตามนเมอท าการศกษาเสถยรภาพแบบ Post-preparative stability

Stability

ความเขมขนของ MA (µg/mL)

0.50 1.00

(Mean ± S.D.) (Mean ± S.D.)

Post-preparative (ชม.) 0 100 100

5 102.88 ± 1.34 102.82 ± 3.86 10 102.56 ± 3.76 98.59 ± 0.00

จากผลการทดลองเมอน าขอมลมาวเคราะหทางสถตโดยเปรยบเทยบรอยละความเขมขนของตวอยางทตรวจวดไดหลงจากน าตวอยางทผานการเตรยมตวอยางแลวตงไวใน autosampler หรอทอณหภมหองตามระยะเวลาทก าหนดกบรอยละความเขมขนของตวอยางทเตรยมขนใหม พบวา ไมมความแตกตางอยางมนยส าคญ (p>0.05) แสดงวาเมทแอมเฟตามนในพลาสมา ไมมการสลายตวหลงจากเกบตวอยางแบบ Post-preparative stability ครบ 5 ชวโมง และ 10 ชวโมง

62

y = 1.003x + 0.0929

R2 = 0.9999

0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50

ความเขมขน (ไมโครกรมตอมลลลตร)

พนทพ

ค (p

A*s)

3.3.2 ศกษาความถกตองของวธวเคราะหแอมเฟตามน 3.3.2.1 Linearity และ calibration curve ของแอมเฟตามนในพลาสมา ท าการสรางกราฟมาตรฐานของแอมเฟตามนในพลาสมาทความเขมขน 0.10, 0.25, 0.50, 1.00 และ 2.00 ไมโครกรมตอมลลลตร โดยเตรยมความเขมขนละ 5 ซ า จากชวงความเปนเสนตรงไดคาสมประสทธสหสมพนธ (r2) เทากบ 0.9999 แสดงในภาพท 3.14 และลกษณะโครมาโทแกรมแสดงในภาพท 3.15 - 3.17

ภาพท 3.14 แสดงชวงความเปนเสนตรงของแอมเฟตามนในพลาสมา

63

ภาพท 3.15 แสดงโครมาโทแกรมของ blank พลาสมาแอมเฟตามน

ภาพท 3.16 แสดงโครมาโทแกรมของสารมาตรฐานแอมเฟตามนในเมทานอล ทความเขมขน 1.00 ไมโครกรมตอมลลลตร

AM

Blank plasma

64

ภาพท 3.17 แสดงโครมาโทแกรมของสารมาตรฐานแอมเฟตามนในพลาสมา ทความเขมขน 1.00 ไมโครกรมตอมลลลตร

3.3.2.2 ขดจ ากดต าสดของการตรวจวด (limit of detection: LOD) และขดจ ากดต าสดของการหาปรมาณ (limit of quantification: LOQ) ของแอมเฟตามนในพลาสมา จากการสรางกราฟมาตรฐานโดยเปรยบเทยบกบพนทพคของแอมเฟตามนในพลาสมาทความเขมขน 0.10, 0.25, 0.50, 1.00 และ 2.00 ไมโครกรมตอมลลลตร โดยเตรยมความเขมขนละ 5 ซ า จากชวงความเปนเสนตรงใหสมการ y = 1.003x - 0.0929 ความชนของกราฟมคาเทากบ 1.003 น าไปค านวณหา LOD และ LOQ โดยคาเฉลยของ blank พลาสมา 10 ซ า แสดงในตารางท 3.11 ตารางท 3.11 แสดงคาเฉลยพนทพคและคาเบยงเบนมาตรฐานของแอมเฟตามนใน blank พลาสมา

Blank plasma Mean S.D. AM 0.1007 0.0088

AM

65

ขดจ ากดต าสดของการตรวจวดแอมเฟตามน ค านวณไดจาก

สตร m

kSC B

L

แทนคา CL = 003.1

0088.03x

CL = 0.0264 ไมโครกรมตอมลลลตร ขดจ ากดต าสดของการหาปรมาณแอมเฟตามน ค านวณไดจาก

สตร m

kSC B

L

แทนคา CL = 003.1

0088.010x

CL = 0.0882 ไมโครกรมตอมลลลตร

ดงนน ขดจ ากดต าสดของการตรวจวดและขดจ ากดต าสดของการหาปรมาณของแอมเฟตามนมคาเทากบ 0.0264 และ 0.0882 ไมโครกรมตอมลลลตร ตามล าดบ 3.3.2.3 รอยละการคนกลบ (%recovery) ของแอมเฟตามนในพลาสมา เมอค านวณหาความเขมขนของสารละลายแอมเฟตามนในพลาสมาทผานการเตรยมตวอยางทความเขมขน 0.10, 0.25, 0.50, 1.00 และ 2.00 ไมโครกรมตอมลลลตร โดยเตรยมความเขมขนละ 5 ซ า ท าการเปรยบเทยบกบสารละลายแอมเฟตามนทไมผานการเตรยมตวอยาง ใหผลแสดงดงตารางท 3.12

66

ตารางท 3.12 แสดงคารอยละการคนกลบของแอมเฟตามน

ความเขมขน (µg/mL)

พนทพค AM ในเมทานอล (Mean ± S.D.)

พนทพค AM ในพลาสมา

(Mean ± S.D.) %Recovery %RSD

0.10 0.22 ± 0.02 0.21 ± 0.01 92.79 4.34 0.25 0.34 ± 0.22 0.33 ± 0.01 97.63 4.28 0.50 0.63 ± 0.03 0.59 ± 0.02 94.28 3.28 1.00 1.12 ± 0.08 1.10 ± 0.01 97.86 0.82 2.00 2.02 ± 0.04 2.10 ± 0.07 103.96 3.37

จากตารางการสกดแอมเฟตามนในพลาสมาใหการคนกลบของแอมเฟตามนแสดงอยในชวง 92.79 - 103.96% เปนคาทอยในชวงของเกณฑทยอมรบได คอ 80 - 120 % (Taverniers et al., 2004) ใหรอยละของคาเบยงเบนมาตรฐานสมพทธ (%RSD) อยในชวง 0.82 - 4.34% 3.3.2.4 ความเทยง (precision) ของแอมเฟตามนในพลาสมา จากการค านวณหาความเขมขนของสารละลายแอมเฟตามนในพลาสมาทผานการเตรยมตวอยางทความเขมขน 0.10, 0.25, 0.50, 1.00 และ 2.00 ไมโครกรมตอมลลลตร โดยเตรยมความเขมขนละ 5 ซ า เปรยบเทยบการวเคราะหภายในวนเดยวกน (intraday, n=5) และระหวางวน (interday, n=12) ใหผลดงแสดงในตารางท 3.13 ตารางท 3.13 แสดงคาความเทยงของการวเคราะหแอมเฟตามนในพลาสมาภายในวนเดยวกน และระหวางวน

ความเขมขน (µg/mL)

%RSD

Intraday (n=5) Interday (n=12) 0.10 4.34 8.11

0.25 4.28 6.07

0.50 3.28 4.86

1.00 0.82 4.61

2.00 3.37 3.44

67

จากตารางการศกษาความเทยงของการวเคราะหภายในวนเดยวกน และระหวางวน แสดงผลเปนคาเบยงเบนมาตรฐานสมพทธ (%RSD) มคาอยในชวง 0.82 - 4.34% และ 3.44 - 8.11% ตามล าดบและเปนคาทยอมรบได ซงคาทยอมรบไดของคาเบยงเบนมาตรฐานสมพทธ คอ ไมเกน 15% (Taverniers et al., 2004) 3.3.2.5 เสถยรภาพ (stability) ของแอมเฟตามนในพลาสมา เสถยรภาพของแอมเฟตามน แสดงผลจากการค านวณหารอยละของความเขมขนของแอมเฟตามนในพลาสมาทผานการเตรยมตวอยางจากเงอนไขของเสถยรภาพแตละแบบ ทความเขมขนต าและสงคอ 0.5 และ 1.0 ไมโครกรมตอมลลลตร ท าการเปรยบเทยบกบรอยละของความเขมขนทเตรยมขนใหม การทดลองใหผลของเสถยรภาพของแอมเฟตามนดงตอไปน 1) Freeze-thaw stability ท าการเตรยมตวอยางและวเคราะหตวอยางแอมเฟตามนทความเขมขน 0.50 และ 1.00 ไมโครกรมตอมลลลตร โดยเตรยมความเขมขนละ 5 ซ า หลงจากเกบตวอยางยาแบบ freeze-thaw ครบ 3 รอบ เปรยบเทยบความเขมขนในรปคารอยละของความเขมขนของตวอยางทตรวจวดไดหลงจากเกบตวอยางครบ 3 รอบกบความเขมขนของตวอยางทเตรยมขนใหม (0 รอบ) ใหผลดงแสดงในตารางท 3.14 ตารางท 3.14 แสดงรอยละความเขมขนของแอมเฟตามนเมอท าการศกษาเสถยรภาพแบบ Freeze-thaw stability

Stability

ความเขมขนของ AM (µg/mL)

0.50 1.00

(Mean ± S.D.) (Mean ± S.D.)

Freeze-thaw (รอบ) 0 100 100

3 103.15 ± 4.54 100.00 ± 3.15 จากผลการทดลองเมอน าขอมลมาวเคราะหทางสถตโดยเปรยบเทยบรอยละความเขมขนของตวอยางทตรวจวดไดหลงจากเกบตวอยางครบ 3 รอบกบรอยละความเขมขนของตวอยางทเตรยมขนใหม พบวา ไมมความแตกตางอยางมนยส าคญ (p>0.05) แสดงวาแอมเฟตามนในพลาสมา ไมมการสลายตวหลงจากเกบตวอยางแบบ Freeze-thaw stability ครบ 3 รอบ

68

2) Long-term stability ท าการเตรยมตวอยางและวเคราะหแอมเฟตามนในพลาสมาทความเขมขน 0.50 และ 1.00 ไมโครกรมตอมลลลตร โดยเตรยมความเขมขนละ 5 ซ า หลงจากเกบตวอยางทอณหภมทใชในการเกบรกษา คอ -20°C โดยเกบตวอยางทระยะเวลา 15 วน และ 30 วน ซงเปนชวงเวลาในการเกบรกษาตวอยางจรง เปรยบเทยบความเขมขนในรปคารอยละของความเขมขนของตวอยางทตรวจวดไดหลงจากเกบตวอยางตามระยะเวลาทก าหนดไวกบความเขมขนของตวอยางทเตรยมขนใหม ใหผลดงแสดงในตารางท 3.15 ตารางท 3.15 แสดงรอยละความเขมขนของแอมเฟตามนเมอท าการศกษาเสถยรภาพแบบ Long-term stability

Stability

ความเขมขนของ AM (µg/mL)

0.50 1.00

(Mean ± S.D.) (Mean ± S.D.)

Long-term (วน) 0 100 100

15 98.41 ± 1.59 100.00 ± 5.89

30 100.33 ± 3.13 98.55 ± 3.97 จากผลการทดลองเมอน าขอมลมาวเคราะหทางสถตโดยเปรยบเทยบรอยละความเขมขนของตวอยางทตรวจวดไดหลงจากเกบตวอยางตามระยะเวลาทก าหนดไวกบรอยละความเขมขนของตวอยางทเตรยมขนใหม พบวา ไมมความแตกตางอยางมนยส าคญ (p>0.05) แสดงวาเมทแอมเฟตามนในพลาสมา ไมมการสลายตวหลงจากเกบตวอยางแบบ Long-term stability ครบ 15 วน และ 30 วน 3) Short-term stability ท าการเตรยมตวอยางและวเคราะหแอมเฟตามนในพลาสมาทความเขมขน 0.50 และ 1.00 ไมโครกรมตอมลลลตร โดยเตรยมความเขมขนละ 5 ซ า หลงจากเกบตวอยางทอณหภมทใชในการเกบรกษา คอ -20°C แลวน าตวอยางมาละลายทอณหภมหองเปนเวลา 3 และ 6 ชวโมง เปรยบเทยบความเขมขนในรปคารอยละของความเขมขนทตรวจวดไดหลงจากละลายตวอยางทอณหภมหองตามระยะเวลาทก าหนดกบความเขมขนของตวอยางทเตรยมขนใหม ใหผลดงแสดงในตารางท 3.16

69

ตารางท 3.16 แสดงรอยละความเขมขนของแอมเฟตามนเมอท าการศกษาเสถยรภาพแบบ Short-term stability

Stability

ความเขมขนของ AM (µg/mL)

0.50 1.00

(Mean ± S.D.) (Mean ± S.D.)

Short-term (ชม.)

0 100 100 3 102.52 ± 2.95 102.82 ± 3.86

6 101.58 ± 3.96 102.82 ± 3.86 จากผลการทดลองเมอน าขอมลมาวเคราะหทางสถตโดยเปรยบเทยบรอยละความเขมขนของตวอยางทตรวจวดไดหลงจากละลายตวอยางทอณหภมหองตามระยะเวลาทก าหนดกบรอยละความเขมขนของตวอยางทเตรยมขนใหม พบวา ไมมความแตกตางอยางมนยส าคญ (p>0.05) แสดงวาเมทแอมเฟตามนในพลาสมา ไมมการสลายตวหลงจากเกบตวอยางแบบ Short-term stability ครบ 3 ชวโมง และ 6 ชวโมง 4) Post-preparative stability ท าการเตรยมตวอยางและวเคราะหแอมเฟตามนในพลาสมาทความเขมขน 0.50 และ 1.00 ไมโครกรมตอมลลลตร โดยเตรยมความเขมขนละ 5 ซ า หลงจากน าตวอยางยาทผานกระบวนการเตรยมตวอยางหรอสกดสาร (extracted sample) ตงไวใน autosampler (autosampler stability) หรอตงทงไวทอณหภมหอง (bench-top stability) เปนระยะเวลา 5 และ 10 ชวโมง ซงเวลาดงกลาวเปนเวลาทใชในการวเคราะหตวอยางในแตละ batch size ทเตรยมส าหรบวเคราะหในแตละครง เปรยบเทยบความเขมขนในรปคารอยละของความเขมขนทตรวจวดไดหลงจากน าตวอยางทผานการเตรยมตวอยางหรอสกดสารแลวตงไวใน autosampler หรอทอณหภมหองตามระยะเวลาทก าหนดกบความเขมขนของตวอยางทเตรยมขนใหมและท าการวเคราะหทนท ใหผลดงแสดงในตารางท 3.17

70

ตารางท 3.17 แสดงรอยละความเขมขนของแอมเฟตามนเมอท าการศกษาเสถยรภาพแบบ Post-preparative stability

Stability

ความเขมขนของ AM (µg/mL)

0.50 1.00

(Mean ± S.D.) (Mean ± S.D.)

Post-preparative (ชม.)

0 100 100 5 102.84 ± 2.06 101.41 ± 3.86

10 102.21 ± 4.38 98.59 ± 4.98 จากผลการทดลองเมอน าขอมลมาวเคราะหทางสถตโดยเปรยบเทยบรอยละความเขมขนของตวอยางทตรวจวดไดหลงจากน าตวอยางทผานการเตรยมตวอยางแลวตงไวใน autosampler หรอทอณหภมหองตามระยะเวลาทก าหนดกบรอยละความเขมขนของตวอยางทเตรยมขนใหม พบวา ไมมความแตกตางอยางมนยส าคญ (p>0.05) แสดงวาเมทแอมเฟตามนในพลาสมา ไมมการสลายตวหลงจากเกบตวอยางแบบ Post-preparative stability ครบ 5 ชวโมง และ 10 ชวโมง 3.4 การตรวจวดเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนในพลาสมาคน (determination of methamphetamine and amphetamine in human plasma) ศกษาหาปรมาณเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนในพลาสมาคน ในกรณเกบตวอยางจากผเสยชวตจ านวน 6 ราย โดยมการสบประวตการใชเมทแอมเฟตามน สาเหตการเสยชวตและท าการเกบตวอยางพลาสมา โดยแพทยนตเวชศาสตร โรงพยาบาลสงขลานครนทร ระหวางเดอนธนวาคม พ.ศ. 2552 - กมภาพนธ พ.ศ. 2553 จากการสบประวตผเสยชวตทง 6 ราย โดยแพทยนตเวชศาสตร พบวา มประวตการเสพเมทแอมเฟตามน ส าหรบตวอยางพลาสมาจะท าการวเคราะหหาปรมาณเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนทนทหรอเกบตวอยางเพอรอวเคราะหไวทอณหภม -20°C การตรวจวดปรมาณเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนจากตวอยางพลาสมาผเสยชวตไดผล ดงแสดงในตารางท 3.18

71

ตารางท 3.18 แสดงปรมาณเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนในพลาสมาทเกบจากผเสยชวต

Case TLC ปรมาณเมทแอมเฟตามน

(µg/mL) ปรมาณแอมเฟตามน

(µg/mL) A1 negative 0.24 ND A2 negative 0.68 0.26 A3 positive 1.31 0.24 A4 negative 0.60 0.32 A5 positive 1.00 0.31 A6 negative 0.87 0.23

* ND = ไมสามารถตรวจวดได (Not Detectable) positive = พบเมทแอมเฟตามน, negative = ไมพบเมทแอมเฟตามน จากตารางท 3.18 ผลการตรวจเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนในพลาสมาทเกบจากผเสยชวต ไดท าการตรวจวดทางดานคณภาพวเคราะห (qualitative) ดวยวธ TLC โดยเจาหนาทหองปฏบตการพษวทยา หนวยนตเวชศาสตรและพษวทยา โรงพยาบาลสงขลานครนทร พบวา ใหผลเปน positive 2 ราย คอ case A3 และ case A5 แสดงวา ตรวจพบเมทแอมเฟตามนในรางกาย และใหผลเปน negative 4 ราย แสดงวา ตรวจไมพบเมทแอมเฟตามนในรางกาย เมอน าตวอยางมาท าการตรวจวดทางดานปรมาณวเคราะห (quantitative) ดวยวธ GC-FID พบวา ในพลาสมาผเสยชวตทง 6 ราย ตรวจพบเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามน มปรมาณอยในชวงความเขมขน 0.24 - 1.31 ไมโครกรมตอมลลลตร และ 0.23 - 0.32 ไมโครกรมตอมลลลตร ตามล าดบ โดยท case A1 ตรวจไมพบแอมเฟตามนในพลาสมา ลกษณะพคของ case A1 - A6 แสดงดงภาพท 3.18 - 3.23

72

ภาพท 3.18 แสดงพคของ case A1

ภาพท 3.19 แสดงพคของ case A2

MA

MA

73

ภาพท 3.20 แสดงพคของ case A3

ภาพท 3.21 แสดงพคของ case A4

MA

MA AM

74

ภาพท 3.22 แสดงพคของ case A5

ภาพท 3.23 แสดงพคของ case A6

AM MA

MA

75

จากการทดลอง เมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนทตรวจพบในตวอยางพลาสมา สามารถยนยนไดวาผเสยชวตมการเสพเมทแอมเฟตามนมากอน ในกรณทตรวจพบเมทแอมเฟตามน แตไมพบแอมเฟตามนดงเชนใน case A1 อาจเนองมาจากแอมเฟตามนถกขบออกจากรางกายจนอยในระดบทไมสามารถตรวจวดได หรอผเสยชวตไดเสพเมทแอมเฟตามนในปรมาณนอย จงท าใหสารเมเทบอไลตแอมเฟตามนมนอยลงไปดวย หรอผเสยชวตเพงมการเสพเมทแอมเฟตามน ท าใหกระบวนการเมเทบอลสมมการเปลยนรปเปนสารเมเทบอไลตไมสมบรณ จงตรวจไมพบแอมเฟตามนหรอพบแตมปรมาณนอยมาก ดงนนจงตองทราบประวตการใชเมทแอมเฟตามนของผเสยชวตหรอผปวยกอนท าการตรวจวดทกครง จากบทสรปดงกลาวการตรวจพบหรอไมพบเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนในพลาสมา ยงขนกบคา LOD และ LOQ ของวธการตรวจวด หากระดบยามระดบต ากวา LOD วธการวเคราะหจะไมสามารถตรวจวดสารได แตหากระดบยาต ากวา LOQ วธการวเคราะหจะไมสามารถตรวจหาปรมาณได ดงนนหากแอมเฟตามนใน case A1 มปรมาณยาทพบวาต ากวาระดบของ LOD จงท าใหตรวจวดไดเฉพาะเมทแอมเฟตามนเพยงอยางเดยว การใชเมทแอมเฟตามนในขนาด overdose ในกรณทท าใหเสยชวตเกดจาก arrhythmia หรอมเลอดออกภายในรางกาย โดยขนาดยาต าสดทท าใหเสยชวตในคนทไมตดยา คอ 200 มลลกรม (พงษรกษและศภรตน, 2552) Inoue และคณะ (2006) ศกษาปรมาณเมทแอมเฟตามนในเลอดผเสยชวต 32 ราย ตรวจวดระดบยาทท าใหเกดพษ พบเมทแอมเฟตามนมความเขมขนอยในชวง 0.06 - 50.5 ไมโครกรมตอมลลลตร และแอมเฟตามนมความเขมขนอยในชวง 0.03 - 4.90 ไมโครกรมตอมลลลตร จากการรายงานในอดตตรวจพบระดบเมทแอมเฟตามนในเลอดของผเสยชวตมความเขมขนสงถง 500 ไมโครกรมตอมลลลตร (United Nations, 1995) และระดบแอมเฟตามนทพบในผเสยชวต รายงานอยทความเขมขน 0.80 ไมโครกรมตอมลลลตร (Fenton, 2003) การศกษาของ Drummer (2004) สามารถตรวจพบเมทแอมเฟตามนในเลอดผเสยชวตจากการรบประทาน พบความเขมขนของเมทแอมเฟตามนสงกวา 0.20 มลลกรมตอลตร ส าหรบการตรวจเมทแอมเฟตามน โดยทวไปจะใช TLC ในการยนยนการตรวจวดแบบคณภาพวเคราะห ซงเปนเทคนคทใชมานานในหองปฏบตการทวไปและยงสามารถน ามาใชไดจนถงปจจบน แตขอเสยของเทคนค TLC คอ การตรวจสารประกอบหลายชนด เทคนค TLC ใหคา LOD สง (Fenton, 2003) จากรายงานการตรวจวดเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนในปสสาวะ โดยเทคนค TLC มคา LOD ทระดบความเขมขน 1 ไมโครกรมตอมลลลตร และการตรวจดวย GC-FID มคา LOD ของเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนทระดบความเขมขน 0.3890 และ 0.3490 ไมโครกรมตอมลลลตร ตามล าดบ (ก าพลและวชาญ, 2551) แตจากการทดลอง เมอท าการตรวจวดเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนในพลาสมาโดยใช GC-FID พบวา เมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนมคา LOD อยทความเขมขน 0.0123 และ

76

0.0264 ไมโครกรมตอมลลลตร และ LOQ อยทความเขมขน 0.0409 และ 0.0882 ไมโครกรมตอมลลลตร ตามล าดบ ซงเปนความเขมขนทต ากวาระดบทเคยมการรายงานไวโดยใชตวตรวจวดชนดเดยวกน ท าใหสามารถใชในการตรวจวดเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนในตวอยางเลอดได เนองจากปรมาณเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนในเลอดจะมนอยกวาในปสสาวะ เทคนคนจงเปนวธการทสามารถใชยนยนผลได โดยใหคาความถกตองอยในเกณฑทยอมรบได และ GC-FID ถอเปนเครองมอพนฐานทมใชอยในหนวยงานทวไป ปจจบนหนวยนตเวชศาสตรและพษวทยา โรงพยาบาลสงขลานครนทร ไดน าวธการตรวจวดโดยใช GC-FID มาใชในการตรวจยนยนเมทแอมเฟตามนและอนพนธของแอมเฟตามนในตวอยางเลอดและปสสาวะควบคกบการตรวจวดโดยใชเทคนค TLC ซงท าใหประหยดเวลาในการเตรยมตวอยาง และผลทไดมความถกตองแมนย ามากขน อกทงยงเหมาะส าหรบท าเปนงานประจ า นอกจากนยงเปนประโยชนในการพฒนาการตรวจวดเมทแอมเฟตามนจากตวอยางสงสงตรวจอนๆ ไมวาจะเปนการตรวจวดเมทแอมเฟตามนในผปวย ผตองหาหรอผเสยชวต

77

บทท 4

บทสรปและขอเสนอแนะ

การศกษาหาตวท าละลายทเหมาะสม ส าหรบการเตรยมตวอยางเมทแอมเฟตามนดวยวธการตกตะกอนโปรตน พบวา เมทานอลเปนตวท าละลายทใชในการตกตะกอนโปรตนเมทแอมเฟตามนในพลาสมาไดดทสด โดยคาความเทยงของเมทแอมเฟตามนทใชเมทานอลเปนตวท าละลาย มคาอยในชวง 4.68 - 9.07% ซงมคาความใกลเคยงของพนทพคเมทแอมเฟตามนทไดจากการตรวจวดซ าหลายๆ ครงอยในเกณฑทด (Taverniers et al., 2004) ดงนนเมทานอลจงเปนตวท าละลายทเหมาะสมในการเตรยมตวอยางเพอหาเมทแอมเฟตามนในพลาสมาดวยวธการตกตะกอนโปรตนและเปนตวท าละลายทใชในการเตรยมตวอยางทงเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนในพลาสมาได จากการทดลองของ Wood และคณะ (2000) ไดใชเมทานอลเปนตวท าละลายในการตกตะกอนโปรตน เพอตรวจหาสารกลมแอมเฟตามนในเลอด อยางไรกตามการตกตะกอนโปรตนโดยทวไป อาจมพครบกวนการวเคราะหได (Gergov, 2004) แตทงนขนกบสารทตองการและตวท าละลายทใชในการตกตะกอนโปรตนดวย นอกจากนพบวาน ายงเปนตวท าละลายทสามารถใชในการตกตะกอนโปรตนไดดเชนกน เพราะมสภาพความเปนขวสง (Syndex, 1997) แตน าไมเหมาะสมทจะใชในการวเคราะหกบ GC เพราะจะท าใหเกดออกไซดของสนมเหลก(Agilent Technologies, 2006) ท าใหเครองมอเกดการช ารดเสยหายได กา ร ศ ก ษ าค ว ามจ า เ พ า ะ เ จ า ะ จ ง แ ล ะค ว ามส ามา ร ถ ใ นก า ร เ ล อ ก (specificity/selectivity) ของวธการวเคราะห ในการตรวจวดเฉพาะเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามน พบวา วธการวเคราะหสามารถแยกเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนออกจากสารอนไดอยางชดเจน โดยเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนแสดงพคออกมาทเวลา 3.62 และ 3.34 นาท ตามล าดบ รวมทงสามารถตรวจวดสารไดหลายชนด โดยไมมผลการรบกวนตอกน แสดงวาวธการวเคราะหน มความเหมาะสมในการตรวจวดเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามน การศกษาความถกตองของวธวเคราะห พบวา กราฟมาตรฐานมความเปนเสนตรงทความเขมขน 0.10 - 50.00 ไมโครกรมตอมลลลตรของเมทแอมเฟตามนและ 0.10 - 2.00 ไมโครกรมตอมลลลตรของแอมเฟตามน ใหคาสมประสทธสหสมพนธ (r2) เทากบ 0.9999 ขดจ ากดต าสดของการตรวจวด (LOD) เมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนมคา 0.0123 และ 0.0264 ไมโครกรมตอมลลลตร ตามล าดบ ขดจ ากดต าสดของการหาปรมาณ (LOQ) เมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนมคา 0.0409 และ 0.0882 ไมโครกรมตอมลลลตร ตามล าดบ คารอยละของการคนกลบ (%recovery) ของเมทแอมเฟตามนทความเขมขน 0.10, 0.50, 2.50, 10.00 และ 50.00 ไมโครกรมตอมลลลตรและแอมเฟตามนทความเขมขน 0.10, 0.25, 0.50, 1.00

78

และ 2.00 ไมโครกรมตอมลลลตร มคาอยในชวง 81 - 109% และ 93 - 104% ตามล าดบ ซงคาทอยในชวงทยอมรบได คอ 80 - 120 % (Taverniers et al., 2004) คาความเทยง (%RSD) ของการวเคราะหภายในวนเดยวกน (intraday) และระหวางวน (interday) มคาอยในชวง 1.66 - 8.95% และ 3.91 - 8.68% ส าหรบเมทแอมเฟตามน 0.82 - 4.34% และ 3.44 - 8.11% ส าหรบแอมเฟตามน โดยคาทยอมรบไดตองไมเกน 15% (Taverniers et al., 2004) ผลการศกษาเสถยรภาพของเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนในพลาสมา ซงเสถยรภาพทง 4 แบบ ไดแก Freeze-thaw stability, Long-them stability, Short-term stability และ Post-preparative stability ทความเขมขน 0.50 และ 1.00 ไมโครกรมตอมลลลตร พบวา เมอน าขอมลมาวเคราะหทางสถตโดยเปรยบเทยบรอยละความเขมขนของตวอยางทตรวจวดไดหลงจากเกบตวอยางตามระยะเวลาทก าหนดไว กบรอยละความเขมขนของตวอยางทเตรยมขนใหม พบวา ไมมความแตกตางอยางมนยส าคญ (p>0.05) แสดงวาเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนในพลาสมา ไมมการสลายตว (ส านกงานคณะกรรมการอาหารและยา, 2547) เมอมการเกบตวอยางทระยะเวลาตางๆ กน

การตรวจวดเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนในตวอยางพลาสมาคนทไดจากกรณเสยชวต 6 ตวอยาง ซงพบวา มปรมาณเมทแอมเฟตามนอยในชวง 0.24 - 1.31 ไมโครกรมตอมลลลตรและแอมเฟตามนอยในชวง 0.23 - 0.32 ไมโครกรมตอมลลลตร ในการศกษานแสดงใหเหนถงขนตอนในการตรวจวดเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนในพลาสมาโดยใช GC-FID ซงวธการทงายและรวดเรว โดยไมตองท าอนพนธเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนสามารถแยกออกจากกนภายในเวลา 5 นาท ขดจ ากดต าสดของการหาปรมาณอยในระดบต ากวา 100 นาโนกรมตอมลลลตร โดยไมมการเพมความเขมขน (pre-concentration) ของสาร แสดงใหเหนถงความสามารถในการวเคราะหเมทแอมเฟตามนและแอมเฟตามนดวย GC-FID อกทงสามารถน าไปประยกตใชในการตรวจวดสารกลมแอมเฟตามนในปสสาวะ เสนผมหรอตวอยางชววตถอน โดยเลอกวธการสกดทเหมาะสมส าหรบแตละตวอยาง การตรวจวดโดยใช GC-FID เปนเครองมอทใชกนแพรหลายในหองปฏบตการทวไป เหมาะทจะใชเปนงานประจ า ซงมขนตอนการเตรยมตวอยางทไมยงยาก แตขอจ ากดของเทคนค GC-FID คอ สารตวอยางตองเปนสารทระเหยงาย เมอฉดเขาเครอง GC-FID แลวตองมความเสถยร ไมเกดการสลายตวเมอถงอณหภมทท าการระเหย นอกจากนในการวเคราะหสารโมเลกลไมมขวหรอสารโมเลกลทมขวเพยงเลกนอย ระบบตรวจวดสามารถแยกแยะโมเลกลของสารไดเพยง 20 เปอรเซนต แตสามารถท าการวเคราะหสารไดเพมขนดวยวธการท าอนพนธ (พรรณทพย หอศรสมพนธ, 2549) และสงส าคญส าหรบการวเคราะหดวย GC-FID คอ การตรวจวดตองไมมพคอนอยตรงต าแหนงหรอใกลเคยงกบเวลา (retention time) ของสารทวเคราะห หากมจ าเปนตองใชเทคนค GC-MS ในการยนยนผลแทน

79

GC-FID เปนเครองมอทมใชแพรหลาย เนองจากมความไวตอสารประกอบทกชนดโดยเฉพาะสารอนทรย และคาใชจายในการวเคราะหไมสงมาก ส าหรบแนวทางการพฒนาเกยวกบ GC-FID ในงานทางดานนตพษวทยา ในปจจบนควรค านงถงความสามารถในการน าไปใชงานไดจรง และคาใชจายทสามารถยอมรบได เพอใหเกดประโยชนสงสดตองานทางดานนตวทยาศาสตรตอไป

80

บรรณานกรม กองควบคมยา ส านกงานคณะกรรมการอาหารและยา. 2547. หลกการและแนวปฏบตใน การศกษาชวสมมลของยาสามญ (Criteria and Guideline for the Bioequivalence Study of Genetic Drug). ISBN # 974-8071-64-2. หนา 1-46. ก าพล เครอค าขาวและวชาญ เกยวการคา. 2551. ผลบวกลวงของการใชชดทดสอบเมทแอมเฟ ตามนในปสสาวะ โดยวธเทยบส และวธภมคมกน. ล าปางเวชสาร. 29, 1 (มกราคม -

มถนายน): 1-10. กต ฉายศรกลและวนดา พมไพศาลชย. 2542. สารกระตนประสาทยาบา. พมพครงท 1. โรงพยาบาลสวนปรง. เชยงใหม. ชวน ทองโรจน, วระศกด สามและนรศา ค าแกน. 2548. การจดท าสารมาตรฐานแหงชาตของตว ยาเมทแอมเฟตามน. ศรนครนทรวโรฒเภสชสาร. 10, 1 (พฤษภาคม): 1-9. ณฐ ตนศรสวสดและศรนนท เอยมภกด. 2550. นตพษวทยา. พมพครงท 1. จฬาลงกรณ มหาวทยาลย: กรงเทพฯ. ทรงเกยรต ปยะกะ. 2544. ยมสเรยนรยาเสพตด. พมพครงท 7. ส านกพมพมตชน: กรงเทพฯ. ปญญา อนทรอดม. 2551. ลดเลาะชายแดนภาคเหนอ ดสถานการณยาเสพตด สกดกน-อด ชองทางน าเขา. [ออนไลน] เขาถงไดจาก: http://www.navy.mi.th/intel/news/in_news/IN7_250308.doc (วนทสบคน 20 พฤษภาคม 2552) พงษรกษ ศรบณฑตมงคลและศภรตน ธรรมพทกษ. 2552. สารเสพตด. ใน: นตเวชศาสตร. คณาจารยภาควชานตเวชศาสตร คณะแพทยศาสตร. มหาวทยาลยเชยงใหม: เชยงใหม. 223-231. พรรณทพย หอศรสมพนธ. 2549. แยกและวเคราะหสารดวย GC. LAB TODAY. 5, 34: 21-26.

81

เพมพงษ เชาวลต. 2550. “การเชอมโยงขอมลยาเสพตดและการใชประโยชน” รายงานสรป การประชมวชาการสารเสพตดระดบชาต ครงท 4 3-5 กรกฎาคม 2550. ชานเมอง การพมพ: สงขลา. 178-181.

ไพฑรย ณรงคชยและสรพนธ ณรงคชย. 2548. นตพษวทยา. ภาควชานตเวชศาสตร คณะ แพทยศาสตร มหาวทยาลยเชยงใหม: เชยงใหม. 232-245. ไพฑรย แสงพม และธนะรชต นามผลด. 2550. “ปกณกะสาระ เสนทางชวตผตดยาเสพตด” เอกสารเผยแพร. ISBN: 978-974-9867-57-0. รงศลปการพมพ: กรงเทพมหานคร. มงคล รายะนาคร. 2537. แกสโครมาโทกราฟ-แมสสเปกโทรเมตร. ภาควชาเคม คณะ วทยาศาสตร มหาวทยาลยเชยงใหม: จงหวดเชยงใหม. 1-50. แมน อมรสทธและอมร เพชรสม. 2539. หลกการและเทคนควเคราะหเชงเครองมอ. ชวนชม: กรงเทพฯ. 632-713. วโรจน สมใหญ. 2543. ยาบามหนตภยขามสหสวรรษ. ธระการพมพ: กรงเทพฯ. 1-115. ศภรตน ธรรมพทกษ. 2550. สารเสพตดกลมแอมเฟตามนและอนๆ ใน: นตเวชศาสตรและ นตเวชปฏบต. คณาจารยภาควชานตเวชศาสตร คณะแพทยศาสตร. มหาวทยาลย เชยงใหม: เชยงใหม. 363-374. ส านกงานคณะกรรมการปองกนและปราบปรามยาเสพตด. 2545. เรยนรเรองยาเสพตดชวต ปลอดภย. พมพครงท 3. สวนพฒนาสอและเทคโนโลย: กรงเทพฯ. ส านกงานคณะกรรมการปองกนและปราบปรามยาเสพตด. 2550. สรปสถานการณยาเสพตดป 2549 และแนวโนวของปญหา. 23 , 1 (ธนวาคม 2549 - 31 มนาคม 2550): 9-14. สมศร ไชยภารมณ. 2549. ปจจยทเกยวของกบการตดแอมเฟตามนของผปวยยาเสพตด

ศนยบ าบดรกษายาเสพตดแมฮองสอน. รายงานการวจยศนยบ าบดรกษายาเสพตดแมฮองสอน. กรมการแพทย กระทรวงสาธารณสข.

82

ส านกยทธศาสตร. 2552. สถานการณปญหายาเสพตดป 2552 และแนวโนมของปญหา ประกอบการจดท าแผนปองกนและแกไขปญหายาเสพตด ป 2553. [ออนไลน] เขาถงไดจาก:

http://www.nccd.go.th/upload/content/situationtrendin2009%28published%29.pdf (วนทสบคน 15 มนาคม 2553) ส านกยทธศาสตร. 2553. สถานการณปญหายาเสพตดป 2553 และแนวโนมของปญหา. [ออนไลน] เขาถงไดจาก: http://www.nccd.go.th/upload/content/suj.pdf (วนทสบคน 1 ตลาคม 2553) Agilent Technologies. 2006. คมอการใชงาน GC รน GC 6890. กรงเทพฯ. Balu, K. and Halket, J. M. 1993. Handbook of Derivatives For Chromatography, 2nd Ed. USA: John Wiley & Sons. pp 4-8. Chiang, W. K. 2006. Amphetamine. In: Goldfrank’s Toxicologic Emergencies, 8th Ed. USA: The McGraw-Hill Companies. pp 1118-1132. Chou, L. and Lee, M. 2005. Solid phase microextraction with liquid chromatography– electrospray ionization–tandem mass spectrometry for analysis of amphetamine and methamphetamine in serum. Analytica Chimica Acta 538: 49-56. Dawling, S., Jickells, S. and Negrusz, A. 2008. Gas chromatography. In: Clarke’s Analytical of Forensic Toxicology. London: The Pharmaceutical Press. 469-512. Dayrit, F.M. and Dumlao, M.C. 2004. Impurity profiling of methamphetamine hydrochloride drugs seized in the Philippines. Forensic Science International

144: 29-36. Drummer, O. H. 2004. Postmortem toxicology of drugs of abuse. Forensic Science International 142: 101-113.

83

Fenton, J.J. 2003. Forensic Toxicology. In: Forensic Science An Introduction to Scientific and Investigative Techniques. USA: CRC Press. pp 45-60. Gergov, M. 2004. Library search-based drug analysis in forensic toxicology by liquid

chromatography-mass spectrometry. Ph.D. Thesis, Department of Forensic Medicine, University of Helsinki, Finland.

Inoue, H., Ikeda, N., Kudo, K., Ishida, T., Terada, M. and Matoba, R. 2006. Methamphetamine-related sudden death with a concentration which was of a

“toxic level”. Legal Medicine. 8: 150-155.

Jiménez, C., Torre, R., Ventura, M., Segura, J. and Ventura, R. 2006. Stability studies of amphetamine and ephedrine derivatives in urine. Journal of Chromatography B 843: 84-93.

Jirovsky D., Lemra K., Sevcıka J., Smyslc B., Stransky Z. 1998. Methamphetamine - properties and analytical methods of enantiomer determination. Forensic

Science International 96: 61-70. Kraemer T. and Maurer HH. 1998. Determination of amphetamine, methamphetamine

and amphetamine derived designer drugs or medicaments in blood and urine. Journal of Chromatography B, Biomedical sciences and applications 713: 163-87.

Karch, S.B. 2008. Pharmacokinetic and Pharmacodynamic of Abused Drugs. UK: CRC. 25-64.

Kikura, R. and Nakahara, Y. 1995. Hair analysis for dugs of abuse. XI. Disposition of benzphetamine and its methabolites into hair and comparison of benzphetamine use and methamphetamine use by hair analysis. Biological & Pharmaceutical Bulletin 18: 1694-1699.

84

Levine, B. 2003. Postmortem Forensic Toxicology. In: Principles of Forensic Toxicology 2nd Ed. Washington D.C.: AACC. pp 3-14.

Logan, B.K. 2002. Mathamphetamine-Effect on human performance and behavior. Forensic Science Review 14: 134-151. Mills, G.A. and Walker, V. 2000. Headspace solid phase microexraction procedures for gas chromatographic analysis of biological fluid and materials. Journal of

Chromatography A 902: 267-287. Mitra, S. 2001. Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry. USA: John Wiley & Sons. Mitrevski, B. and Zdravkovski, Z. 2005. Rapid and simple method for direct

determination of several amphetamine in seized tablets by GC-FID. Forensic Science International 152: 199-203.

Moffat, A.C., Jackson, J.V., Moss, M.S. and Widdop, B. 1986. Clarke’s isolation and identification of drugs in pharmaceuticals, body fluid and post-mortem material. 2nd Ed. London: The Pharmaceutical Press. pp 287-763. Moore, K. A. 2003. Amphetamine/Sympathomimetic Amine. In: Principles of Forensic

Toxicology 2nd Ed. Washington D.C.: AACC. pp 245-264. Nishida, M., Namera, A., Yashiki, M. and Kojima. T. 2002. On-column derivatization for determination of amphetamine and methamphetamine in human blood by gas chromatography–mass spectrometry. Forensic Science International 125: 156-

162.

Okajima, K., Namera, A., Yashiki, M., Tsukue, I. and Kojima, T. 2001. Highly sensitive analysis of methamphetamine and amphetamine in human whole blood using headspace solid phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry. Forensic Science International 116: 15-22.

85

Ortuño, J., Pizarro, N., Ferré, M., Segura, J., Camí, J., Brenneisen, R. and Torre, R. 1999. Quantification of 3,4-methlenedioxymethamphetamine in plasma and urine by gas chromatography with nitrogen-phosphorus detection. Journal of Chromatography B 723: 221-232. Polson, C., Sarkar, P., Incledon, B., Raguvaran, V., and Grant, R. 2003. Optimization of

protein precipitation based upon effectiveness of protein removal and ionization effect in liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B 785: 263-275.

Pujadas, M., Pichini, S., Civit, E., Santamarina, E., Perez, M. and Torre, R. 2007. A

simple and reliable procedure for the determination of psychoactive drugs in oral fluid by gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 44: 594-601.

Puthaviriyakorn, V., Siriviriyasomboon, N., Phorachata, J., Pen-ox, W., Sasaki, T. And

Tanaka, K. 2002. Identification of impurities and statistical classification of methamphetamine tablets (Ya-Ba) seized in Thailand. Forensic Science International 126: 105-113.

Sato, M. and Mitsui, T. 1997. Rapid and simple determination of methamphetamine

and amphetamine in blood by simultaneousextraction- derivatization. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 16: 139-145. Saito, T., Yamamotob, I., Kusakabe, T., Huang, X. L., Yukawa, N. and Takeichi, S.

2000. Determination of chronic methamphetamine abuse by hair analysis. Forensic Science International 112: 65-71.

Scott, R. 2008. Thin- layer chromatography. [ออนไลน] เขาถงไดจาก:

http://www.chromatography-online.org/TLC/Introduction.html (วนทสบคน 20 สงหาคม 2552)

86

Siek, T.J. 2003. Specimen Preparation. In: Principles of Forensic Toxicology 2nd Ed. Washington D.C.: AACC. pp 67-78. Supelco. 1998. Solid Phase Microextraction:Theory and Optimization of Conditions. [ออนไลน] เขาถงไดจาก: http://www.sigmaaldrich.com/Graphics/Supelco/objects/4600/4547.pdf (วนทสบคน 20 มนาคม 2553) Syndex, L.R. 1997. Prectical HPLC Method Development. 2nd Ed. 722-723. Taverniers, I., Loose, M.D. and Bockstaele, E.V. 2004. Trends in quality in the analytical

laboratory II. Analytical method validation and quality assurance. Trends in

Analytical Chemistry 23: 535-552.

Thurman, E. M. and Mills, M. S. 1998. Solid Phase Extraction: Principles and Practice.

USA: John Wiley & Sons. pp 243-272. United Nations Office on Drugs and Crime(UNODC). 2008. Amphetamines and Ecstacy [ออนไลน] เขาถงไดจาก: http://www.unodc.un.or.th/publications/Global-ATS-Assessment-2008.pdf

(วนทสบคน 6 มถนายน 2552) Wercinski, S.A.S. 1999. Ed.Solid Phase Microextraction: A Practical Guide. New York: Mercel Decker. Wood, M., Morris, M., Cooper, D., Claereboudt, J., Samyn, N. and Boeck, G. D. 2000. Development of a rapid and sensitive method for the quantitation of amphetamine in human plasma. 17th Montreux Symposium. 8-10th November. Switzerland. Wikipedia. 2009. Blood Plasma. [ออนไลน] เขาถงไดจาก: http://en.wikipedia.org/wiki/Blood_plasma (วนทสบคน 9 กนยายน 2552)

87

ภาคผนวก

88

ภาคผนวก 1 สมบตของสารกลมอนพนธแอมเฟตามน 1. Amphetamine

ชอวทยาศาสตร: 1-phenyl-2-aminopropane สตรโครงสราง :

สตรโมเลกล : C9H13N มวลโมเลกล : 135.21 กรมตอโมล จดหลอมเหลว : 281-285°C , (กลายเปนไอชาๆ ทอณหภมหอง)

2. Methamphetamine ชอวทยาศาสตร: 1-phenyl-2-methylaminopropane

สตรโครงสราง : สตรโมเลกล : C10H15N

มวลโมเลกล : 149.23 กรมตอโมล

จดหลอมเหลว : 172-174°C

89

3. Phentermine

ชอวทยาศาสตร: 2-methyl-1-phenylpropan-2-amine

สตรโครงสราง : สตรโมเลกล : C10H15N มวลโมเลกล : 149.233 กรมตอโมล

จดหลอมเหลว : 205°C 4. Fenfluramine

ชอวทยาศาสตร: N-ethyl- 1-[3-(trifluoromethyl)phenyl]propan- 2-amine สตรโครงสราง : สตรโมเลกล : C12H16F3N มวลโมเลกล : 231.26 กรมตอโมล

จดหลอมเหลว : 108-112°C 5. Ephedrine

ชอวทยาศาสตร: (1R,2S)-2-methylamino-1-phenylpropan-1-ol สตรโครงสราง : สตรโมเลกล : C10H15NO

มวลโมเลกล : 165.23 กรมตอโมล

จดหลอมเหลว : 34°C

90

6. Pseudoephedrine

ชอวทยาศาสตร: (1S,2S)-2-methylamino-1-phenylpropan-1-ol สตรโครงสราง : สตรโมเลกล : C10H15NO มวลโมเลกล : 165.23 กรมตอโมล

จดหลอมเหลว : 117-118°C

7. 3,4-methylenedioxymethamphetamine

ชอวทยาศาสตร: 1-(1,3-benzodioxol-5-yl)-N-methylpropan-2-amine สตรโครงสราง : สตรโมเลกล : C11H15NO2 มวลโมเลกล : 193.24 กรมตอโมล จดหลอมเหลว : 148-149°C

91

ภาคผนวก 2 ตารางท 1 แสดงขอมลของกราฟมาตรฐานเมทแอมเฟตามนในพลาสมา

ความเขมขน (µg/mL)

พนทพค คาเฉลยพนทพค

S.D. %RSD

0.10 0.38 0.35 0.03 8.95 0.37 0.34 0.35 0.30

0.50 0.96 0.99 0.02 1.66 1.00 0.99 0.99 1.00

2.50 4.90 5.00 0.07 1.41 5.10 5.00 5.00 5.00

10.00 20.30 20.74 0.57 2.74 20.40 21.70 20.50 20.80

50.00 113.70 108.18 4.36 4.03 111.50 107.10 103.00 105.60

92

ตารางท 2 แสดงขอมลของกราฟมาตรฐานแอมเฟตามนในพลาสมา ความเขมขน (µg/mL)

พนทพค คาเฉลย พนทพค

S.D. %RSD

0.10 0.20 0.21 0.01 4.34 0.22 0.21 0.20 0.20

0.25 0.32 0.33 0.01 4.29 0.35 0.32 0.32 0.34

0.50 0.60 0.59 0.02 3.28 0.62 0.57 0.60 0.58

1.00 1.10 1.10 0.01 0.82 1.10 1.10 1.08 1.10

2.00 2.10 2.10 0.07 3.37 2.10 2.20 2.10 2.00

93

100.00 102

.56

100.00 98.

59

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

รอยล

ะควา

มเขม

ขน

0.50 1.00ความเขมขน (ไมโครกรมตอมลลลตร)

0 รอบ

3 รอบ

100.00

97.36

97.35

100.00

98.41 100

.00

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

รอยล

ะควา

มเขม

ขน

0.50 1.00ความเขมขน (ไมโครกรมตอมลลลตร)

0 วน

15 วน

30 วน

ภาคผนวก 3 แผนภมแทงท 1 แสดงรอยละความเขมขนของเมทแอมเฟตามนเมอท าการศกษาเสถยรภาพ แบบ Freeze-thaw stability แผนภมแทงท 2 แสดงรอยละความเขมขนของเมทแอมเฟตามนเมอท าการศกษาเสถยรภาพ แบบ Long-term stability

94

100.00 102

.24101

.60

100.00 102

.82100

.00

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

รอยล

ะควา

มเขม

ขน

0.50 1.00ความเขมขน (ไมโครกรมตอมลลลตร)

0 ชวโมง

3 ชวโมง

6 ชวโมง

100.00 102

.88102

.56

100.00 102

.8298.

59

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

รอยล

ะควา

มเขม

ขน

0.50 1.00ความเขมขน (ไมโครกรมตอมลลลตร)

0 ชวโมง

5 ชวโมง

10 ชวโมง

แผนภมแทงท 3 แสดงรอยละความเขมขนของเมทแอมเฟตามนเมอท าการศกษาเสถยรภาพ แบบ Short-term stability แผนภมแทงท 4 แสดงรอยละความเขมขนของเมทแอมเฟตามนเมอท าการศกษาเสถยรภาพ แบบ Post-preparative stability

95

100.00 103

.15

100.00 100

.00

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

รอยล

ะควา

มเขม

ขน

0.50 1.00ความเขมขน (ไมโครกรมตอมลลลตร)

0 รอบ

3 รอบ

100.00 98.

41100

.33

100.00

100.00

98.55

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

รอยล

ะควา

มเขม

ขน

0.50 1.00ความเขมขน (ไมโครกรมตอมลลลตร)

0 วน

15 วน

30 วน

ภาคผนวก 4

แผนภมแทงท 1 แสดงรอยละความเขมขนของแอมเฟตามนเมอท าการศกษาเสถยรภาพ แบบ Freeze-thaw stability แผนภมแทงท 2 แสดงรอยละความเขมขนของแอมเฟตามนเมอท าการศกษาเสถยรภาพ แบบ Long-term stability

96

100.00 102

.52101

.58

100.00 102

.82102

.82

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

รอยล

ะควา

มเขม

ขน

0.50 1.00ความเขมขน (ไมโครกรมตอมลลลตร)

0 ชวโมง

3 ชวโมง

6 ชวโมง

100.00 102

.84102

.21

100.00 101

.4198.

59

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

รอยล

ะควา

มเขม

ขน

0.50 1.00ความเขมขน (ไมโครกรมตอมลลลตร)

0 ชวโมง

5 ชวโมง

10 ชวโมง

แผนภมแทงท 3 แสดงรอยละความเขมขนของแอมเฟตามนเมอท าการศกษาเสถยรภาพ แบบ Short-term stability แผนภมแทงท 4 แสดงรอยละความเขมขนของแอมเฟตามนเมอท าการศกษาเสถยรภาพ แบบ Post-preparative stability

97

ประวตผเขยน

ชอ สกล นางสาวเกษศรนทรพร กลเกอ รหสประจ าตวนกศกษา 4822149 วฒการศกษา วฒ ชอสถาบน ปทส าเรจการศกษา วทยาศาสตรบณฑต (ศกษาศาสตร) มหาวทยาลยสงขลานครนทร 2547 การตพมพเผยแพรผลงาน เกษศรนทรพร กลเกอและวระชย สมย. การตรวจวดเมทแอมเฟตามนในพลาสมาคนโดยใชแกส

โครมาโทกราฟตวตรวจวดชนดเฟรมไอออไนเซชน. การประชมเสนอผลงานวจยระดบบณฑตศกษา มหาวทยาลยเชยงใหมครงท 1. 26 – 27 พฤศจกายน พ.ศ. 2552.