Key Words: Kratom drink, extract, chromatography, mitragynine *Corresponding author; e-mail address:oncb123@gmail.com 1 สถาบนวชาการและตรวจพสจนยาเสพตด สานกคณะกรรมการปองกนและปราบปรามยาเสพตด กรงเทพฯ 10210 1 Narcotic Analysis and Technical Services Institute, Office of The Narcotic Control Board, Bangkok, 10210 2 ภาคเคม คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยเทคโนโลยราชมงคลธญบร ปทมธาน 12110 2 Department of Chemistry, Faculty of Science and Technology Rajamangala University of Technology Thanyaburi, PathumThani, 12110

การตรวจพสจน Mitragynine เชงคณภาพในนาตมกระทอม ดวยเทคนคทางโครมาโตกราฟ Qualitative Analysis of Mitragynine in Kratom Drink by Chromatographic Technique

วราพงษ เสนะวระกล * กญญนนท คงภสนธโรจน จารน อรารกษ1 สภาวด บญญาพทกษ1 วธตา เฉลมกจ1

วาสนา กงเกาะยาว1 และ วณภา นาคลดา2

Warapong Saenawerakul *, Kanyanan Kongpatnitiroj1, Jarinee Urarak1, Supawadee Boonyapitak1,

Watita Chalermkit , Wassana Kingkhoyao1 and Wanipa Naklada2

บทคดยอ

การสกดใบกระทอมดวย acetic acid ความเขมขน 50 เปอรเซนตโดยปรมาตรตอปรมาตร ปรบ pH ใหอย

ในชวง 9-10 ดวยสารละลายแอมโมเนยเขมขน สกดซาดวย ethyl acetate เมอนาชนของ ethyl acetate มาวเคราะห

เชงคณภาพดวยเทคนค gas chromatography ชนด mass detector พบปรมาณสาร mitragynine ประมาณ 60

เปอรเซนต (วเคราะหพนทใตกราฟ) ซงสารสกด mitragynine ทไดมปรมาณสงพอนาไปใชเปนสารเปรยบเทยบแทน

สารมาตรฐาน mitragynine ได การสกดตวอยางนาตมกระทอมทง 12 ตวอยาง ดวยการปรบ pH และสกดดวย ethyl

acetate สามารถตรวจพบสาร mitragynine ไดในทกตวอยางททดสอบ สาหรบเทคนคทางโครมาโตกราฟทเหมาะสม

ในการตรวจพสจนสาร mitragynine คอ วธ thin layer chromatography โดยใชวฏภาคเคลอนท hexane : ethyl

acetate ในสดสวน 6:4 และการวเคราะหดวยเครอง gas chromatography ชนด FID detector ดวยวธดดแปลง

สามารถใชแทนการวเคราะหดวยเครอง gas chromatography ชนด mass detector ได

ABSTRACT Kratom leaves were extracted by 50 % (volume by volume) acetic acid, adjusted pH value to

9-10 with concentrated ammonia solution and then repeated to extract with ethyl acetate. The ethyl

acetate layer was analyzed by gas chromatography with mass detector; found that it contained the

mitragynine about 60 % (peak chromatogram analysis). This result indicated that the ethyl acetate layer

could be used for reference compound instead of using the standard compound. The extraction method

adjusting pH and repeated extraction with ethyl acetate were appropriated for the twelve Kratom drink

samples because mitragynine was found in all samples. The appropriate chromatographic techniques for

mitragynine analysis were the thin layer chromatography method using hexane: ethyl acetate (6:4) as the

mobile phase. Another one was gas chromatography with FID detector that could be used instead of gas

chromatography with mass detector by modified method.

คานา

สถาบนวชาการและตรวจพสจนยาเสพตด (สวพ.) เปนหนวยงานภายในของสานกงานคณะกรรมการปองกน

และปราบปรามยาเสพตด (ป.ป.ส.) มภารกจหลกในการตรวจพสจนของกลางคดยาเสพตด ไดดาเนนการตรวจพสจน

โดยปฏบตตามแนวทางของสานกงานปองกนยาเสพตดและปราบปรามอาชญากรรมแหงสหประชาต (UN Office on

Drugs and Crime, UNODC) เสมอมา อยางไรกตามตวอยางยาเสพตดหลายชนดยงไมมวธการเฉพาะทใชในการ

ตรวจพสจน เชน พชกระทอม (Mitragyna speciosa Korth, Kratom) จดเปนยาเสพตดใหโทษประเภทท 5 ตาม

พระราชบญญตยาเสพตดใหโทษ พ.ศ.2522 (สานกงาน ป.ป.ส. กระทรวงยตธรรม, 2556) การยนยนยาเสพตด

ประเภทนใชการตรวจพสจนเชงคณภาพ โดยทวไปแลวการตรวจพสจนพชกระทอมในกรณทตวอยางเปนลกษณะ

ดงเดม ยงไมผานการแปรรป เชน ใบ ดอก ผล กระทาไดไมยากนก อาจใชลกษณะทางสณฐานวทยารวมกบการตรวจ

พสจนทางเคม ซงการตรวจทางเคมนนจะตรวจหาสาร mitragynine ซงเปนสารเสพตดในพชกระทอม ในตวอยางทไม

ผานการแปรรปจะมสารชนดนปรมาณมาก ปญหาสาคญคอการนาพชกระทอมไปแปรรปโดยการผสมกบสารชนดอน

เชน นาตมกระทอม ทาใหไมสามารถใชลกษณะทางสณฐานวทยารวมในการตรวจพสจนได อกทงพบวาสาร

mitragynine ในนาตมกระทอมมปรมาณนอยมาก การตรวจพสจนโดยวธปกตกระทาไดยาก และไมมสารมาตรฐาน

mitragynine จงเปนอกขอจากดหนงในการตรวจพสจน โดยทวไปแลวยนยนผลการตรวจพสจนพชกระทอมดวย

เทคนคแมสสเปกโตมทร (mass spectrometry) ซงเปนการยนยนดวยนาหนกโมเลกลของสาร mitragynine ซงเปน

เทคนคทนาเชอถอและยอมรบในระดบสากล แตเครองมอชนดน (gas chromatography ชนด mass detector (GC-

MS) หรอ liquid chromatography ชนด msss detector (LC-MS)) ไมไดมครบทกสถานตรวจพสจนทกระจายอยทว

ประเทศ ประกอบกบคาบารงรกษาเครองมอ และคาใชจายตอตวอยางยงมราคาสง แนวทางการแกปญหาทงหมด

ดงกลาวขางตน คอการพฒนาวธการหรอใชเทคนคอนๆ ใหเหมาะสมกบตวอยางทใชตรวจพสจน เชน การสกดสาร

mitragynine เพอใชเปนสารมาตรฐาน (Beng et al., 2011) หรอใชเปนสารเปรยบเทยบกบตวอยางกระทอมและใช

เทคนคทางโครมาโตรกราฟรปแบบตางๆ เชน thin layer chromatography (TLC) และ gas chromatography ชนด

FID detector (GC-FID) แยกและระบตาแหนงของ mitragynine ในพชกระทอมไดเมอเทยบกบสารมาตรฐาน

mitragynine (Chan et al., 2005, Scott et al., 2014)

สถาบนวชาการและตรวจพสจนยาเสพตดไดตระหนกถงความสาคญของปญหาทเกดขน จงมแนวคดในการ

พฒนาวธการสกดสาร mitragynine ทเหมาะสม เพอใชเปนสารเปรยบเทยบในการตรวจพสจนนาตมกระทอมและ

พฒนาวธการตรวจพสจนนาตมกระทอมใหมความเหมาะสมดวยเทคนคทางโครมาโตกราฟ

อปกรณหรอวธการ

สารมาตรฐาน mitragynine (สวพ. ป.ป.ส. กรงเทพฯ) เครองปนเหวยงตกตะกอน (Clay Adams) แผน TLC

(Merck, 105554 silica gel F254) กระดาษวด pH 0-14 (Merck, 1.09535.0001) เครอง gas chromatography

ชนด FID detector (GC-FID) (Agilent 6890) เครอง gas chromatograph ชนด mass detector (GC-MS)

(Agilent 7890B with 7000c triple quadrupole GS/MS system) เครองผสมสารเคม (vortex mixer)

การสกดสารเปรยบเทยบ mitragynine จากตวอยางใบพชกระทอม

นาใบกระทอมสด อบใหแหงทอณหภมประมาณ 50-60 องศาเซลเซยส ปนใหละเอยด จากนนนาผงกระทอม

ประมาณ 250 มลลกรม สกดดวย acetic acid ความเขมขน 50 เปอรเซนตโดยปรมาตรตอปรมาตร ปรมาตร

2 มลลลตร ผสมใหเขากนนาน 1 นาท แลวปรบ pH ใหมคาอยในชวง 9-10 ดวยสารละลายแอมโมเนยเขมขน

(25% ammonium hydroxide) จากนนผสมใหเขากนนาน 1 นาท เตม ethyl acetate 2 มลลลตร ผสมสารละลายให

เขากนนาน 1 นาท แลวนาไปปนเหวยงความเรว 3000 รอบตอนาท นาน 1 นาท เกบสารละลายชนบนของ ethyl

acetate นาไปวเคราะหดวยเทคนคทางโครมาโตกราฟ

การสกดสาร mitragynine จากนาตมกระทอม

นาตวอยางยาเสพตดนากระทอมประมาณ 3 มลลลตร ปรบ pH ใหมคาประมาณ 9-10 ดวยสารละลาย

แอมโมเนยเขมขน (25% ammonium hydroxide) ถา pH เกนกวาทกาหนด ใหปรบดวย acetic acid ความเขมขน

50 เปอรเซนตโดยปรมาตรตอปรมาตร จากนนผสมใหเขากนนาน 1 นาท เตม ethyl acetate 1 มลลลตร ผสม

สารละลายใหเขากนนาน 1 นาท นาไปปนเหวยงความเรว 3000 รอบตอนาท นาน 1 นาท เกบสารละลายชนบนของ

ethyl acetate ซงเปนชนของสารสกด mitragynine นาไปวเคราะหดวยเทคนคทางโครมาโตกราฟ

วธการตรวจพสจนนาตมกระทอมทมความเหมาะสมดวยเทคนคทางโครมาโตกราฟ

1. thin layer chromatography (TLC) นาสารละลายชน ethyl acetate ซงเตรยมจากวธขางตน และสาร

มาตรฐาน mitragynine (สวพ. ป.ป.ส. กรงเทพฯ) นามาวเคราะหโดยใชวฏภาคเคลอนท 3 แบบดงน

1) วฏภาคเคลอนทอางอง (Scott et al., 2014) chloroform: methanol (9:1)

2) วฏภาคเคลอนทดดแปลง ethyl acetate: chloroform (1:1)

3) วฏภาคเคลอนทดดแปลง hexane: ethyl acetate (6:4)

กาหนดใหระยะทางทตวทาละลายเคลอนทเทากบ 7 เซนตเมตร

2. gas chromatography ชนด FID detector (GC-FID) สภาวะทใช

2.1) อณหภมของ inlet และ detector คอ 280 องศาเซลเซยส สวนชนดของ column ทใช คอ DB-5

ความยาว 30 เมตร เสนผานศนยกลาง 0.25 มลลเมตร เคลอบหนา 0.25 ไมโครเมตร

2.2) โปรแกรมอณหภมของ oven

2.2.1 วธอางอง (Chan et al., 2005) ตงอณหภมเรมตนท 200 องศาเซลเซยส ทงไว 2 นาท จากนนเพม

อณหภม 10 องศาเซลเซยสตอนาท จนกระทงถงอณหภม 300 องศาเซลเซยส ทงไว 20 นาท (เวลาทงหมด 32 นาท) ตวอยาง

ทฉด ใช splitless mode ปรมาตร 1 ไมโครลตร (Purge flow 50 ml/min, Purge time 1 min, constant flow 1.4 ml/min)

2.2.2 วธดดแปลงตงอณหภมเรมตนท 250 องศาเซลเซยส จากนนเพมอณหภม 10 องศาเซลเซยส

ตอนาท จนกระทงถงอณหภม 300 องศาเซลเซยส ทงไว 8 นาท (เวลาทงหมด 13 นาท) ตวอยางทฉดใช split mode

ปรมาตร 1 ไมโครลตร (split ratio 50:1, constant flow 1.8 ml/min)

2.3) carrier gas ใชแกสฮเลยม สวน detector ใชแกสไฮโดรเจน และ Air Zero 40 และ 400 มลลลตรตอนาท

ตามลาดบ

3. gas chromatography ชนด Mass detector (GC-MS) ตงคาตางๆ ดงน

3.1) ชนดของ column คอ HP-5MS ความยาว 30 เมตร เสนผานศนยกลาง 0.25 มลลเมตร เคลอบหนา

0.25 ไมโครเมตรโดย carrier gas ใชแกสฮเลยม

3.2) mass detector ใชการวเคราะห mass แบบ scan mode และใช ion source ชนด EI mode

อณหภมของ MS Transfer Line และ source temp. 280 และ 230 องศาเซลเซยสตามลาดบ

3.3) อณหภมของ inlet และโปรแกรมอณหภมของ oven

3.3.1 เชนเดยวกบขอ 2.2.1

3.3.2 เชนเดยวกบขอ 2.2.2

ผลและวจารณผลการทดลอง

การสกดสารเปรยบเทยบ mitragynine จากตวอยางใบพชกระทอม

สาร mitragynine จดเปนสารกลมอลคาลอยด ซงวธทใชในการทดลองนเปนวธทนยมใชสกดสารกลม

อลคาลอยด (Yubin et al., 2014) เพราะสามารถสกดสาร mitragynine ปรมาณสง มการปนเปอนสารอนนอย และ

เปนวธทไมซบซอน เมอวเคราะหดวยเครอง GC-FID และ GC-MS ดวยวธอางอง (ภาพท หมายเลข 1(A) และ 1(B))

พบสาร mitragynine ทสกดไดจากตวอยางใบกระทอมทระยะเวลา (retention time) 17.138 และ 16.113 นาท

ตามลาดบ และโครมาโตแกรมของสาร mitragynine แยกจากโครมาโตแกรมของสารชนดอนอยางชดเจน อกทงม

ความสงและพนทใตกราฟมากกวาโครมาโตแกรมอนๆ อกดวย เมอวเคราะหพนทใตกราฟของสาร mitragynine

ทสกดไดจากตวอยางใบกระทอม (ภาพท1 หมายเลข (A) เสนสนาเงน) พบสาร mitragynine ประมาณ เปอรเซนต

ของสารทงหมด แสดงใหเหนวาการสกดตวอยางใบกระทอมดวยวธนสามารถแยกสาร mitragynine ทมศกยภาพ

ทดแทนสารมาตรฐาน mitragynine ทมความบรสทธสงได อกทงยงใชเครอง GC-FID วเคราะหแทนเครอง GC-MS

ได แตอยางไรกตามควรนาสารสกดจากใบกระทอมตรวจสอบดวยเครอง GC-MS กอนทจะใชเปนสารเปรยบเทยบ

mitragynine ในการตรวจพสจนตอไป

เมอเปรยบเทยบวธอางองและวธดดแปลงทใชในการวเคราะหสาร mitragynine มาตรฐานและสารสกด

mitragynine (หรอสารเปรยบเทยบ mitragynine) เมอพจารณาภาพท 1 หมายเลข 1(A), 2(A), 1(B) และ 2(B) แสดงให

เหนวาการใชวธอางองและวธดดแปลงใหผลการวเคราะหทไมแตกตางกนนก ซงสงเกตไดจากรปแบบโครมาโตแกรม

สาร mitragynine ของทงสองวธคลายคลงกน ทงความสง พนทใตกราฟ และการแยกจากโครมาโตแกรมอนอยาง

ชดเจน แตสงทแตกตางอยางเหนไดชดคอ วธดดแปลงใชระยะเวลาในการวเคราะหทนอยกวาวธอางองประมาณ

19 นาท จงเปนวธทเหมาะสมในการวเคราะหสาร mitragynine เชงคณภาพในตวอยางได

Figure1 The analysis of Kratom leaf and Kratom drink extracts were demonstrated by GC-FID (A) and

GC-MS (B). The Kratom leaf extract (blue and black line) was compared with the mitragynine

standard (red line) by reference method (Chan et al., 2005) (1) and modified method (2). The

twelve Kratom drink extracts were compared with the Kratom leaf extract and the mitragynine

standard by modified method (3). The fragment pattern of mitragynine was indicated at the

retention time 16.113 and 8.455 minute by reference and modified method, repectively (4).

Mitragynine

Mitragynine

Mitragynine

RT = 17.138

RT = 9.267

RT = 9.267

RT = 16.113

RT = 8.455

RT = 8.455

(A) (B)

4

1

2

3

1

(A)

(A)

(B)

(B)

(B)

3

2

การวเคราะหตวอยางนาตมกระทอม ทผานการสกดดวยวธดดแปลงโดยใชเครอง GC-FID และ GC-MS

(ภาพท หมายเลข 3(A) และ 3(B) ตามลาดบ) ซงเปรยบเทยบกบสารมาตรฐานและสารเปรยบเทยบ mitragynine

พบวา โครมาโตแกรมของทกตวอยาง ตรวจพบสาร mitragynine โดยมระยะเวลาทแยกผาน detector (retention

time) ตรงกบสารมาตรฐานและสารเปรยบเทยบ mitragynine ซงแสดงใหเหนวาวธการสกดนาตมกระทอมและวธ

ดดแปลงโดยใชเครอง GC-FID มความเหมาะสมในการวเคราะหสาร mitragynine เชงคณภาพได

Figure2 The analysis of Kratom leaf and Katom drink extracts were demonstrated by thin layer

chromatography. The mobile phase of reference solvent system was chloroform/methanol (9:1)

(Scott et al., 2014) (A).The mobile phase of modified solvent system was chloroform/ethyl acetate

(1:1) (B) and hexane/ethyl acetate (6:4) (C). The reagent blank (RB), Blank (B), mitragynine

standard (S1), Kratom leaf extract (S2), twelve Kratom drink extracts (1,2,3… and 12) and the

position of mitragynine compound (red arrowhead) were observed under ultraviolet light at 254

nm (i), 366 nm (ii) and visualized after spraying with fast black k salt (iii).

เมอนาตวอยางนาตมกระทอมทผานการสกด สารมาตรฐาน และสารเปรยบเทยบ mitragynine วเคราะห

ดวยวธ thin layer chromatography (TLC) ดงภาพท พบวาวฏภาคเคลอนทอางอง (A) มคา retardation factor

(Rf) หรอแสดงดวยคา hRf (100 เทาของคา Rf) มคาประมาณ 91 ในขณะวฏภาคเคลอนทดดแปลง (ภาพท B และ C)

มคา hRf ประมาณ 67 และ 59 ตามลาดบ ซงตาแหนงของสาร mitragynine จะใหสนาตาลออกแดง และเรองแสงส

นาตาลแกมเขยว ภายใตแสงอลตราไวโอเลตทความยาวคลน 254 และ 366 นาโนเมตรตามลาดบ (ภาพท 2 i และ ii)

RB B S1 S2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 RB BS1 S2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 RBB S1 S2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112

RB B S1 S21 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 RB B S1 S21 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 RB B S1 S21 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

RB B S1 S2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 RB B S1 S2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 RB B S1 S2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A(i)

C(iii) B(iii) A(iii)

A(ii) B(ii)

B(i)

C(ii)

C(i)

(Beng et al., 2011) ในขณะทการพนดวยสารละลายเกลอของ fast black k บนแผน TLC ตาแหนงทมสาร

mitragynine จะปรากฏสสมหรอแดงออกสม (ภาพท 2 iii) เนองจากเปนสารกลม secondary amine (United Nation

Office on Drug and Crime, 2006) เมอพจารณาความเหมาะสมของวฏภาคททาการทดสอบ พบวาทง วฏภาค

เคลอนทสามารถแยกสาร mitragynine ได แตวฏภาคเคลอนททมคณภาพคอ ทาใหสารทสนใจในสารผสมเคลอนไป

ไดและมคา hRf ประมาณ 20-80 (นพมาศ, 2551) ดงนนวฏภาคเคลอนทดดแปลง (ภาพท 2 B และ C) จงมความ

เหมาะสมกวาวฏภาคเคลอนทอางอง และเมอพจารณาในดานความปลอดภยจากสารเคมพบวา วฏภาคเคลอนท

ดดแปลงทใชตวทาละลายชนด ethyl acetate: chloroform ในสดสวน 1:1 (ภาพท 2 B) มความปลอดภยจากสารเคม

นอยกวาวฏภาคเคลอนทดดแปลงทใชตวลาละลายชนด hexane: ethyl acetate ในสดสวน 6:4 (ภาพท C)

เนองจากม chloroform เปนองคประกอบ ซงสารเคมชนดนจดเปนสารกอมะเรง มความเปนพษมาก (Reuber, 1979)

จากเหตผลทกลาวมาวฏภาคเคลอนทดดแปลงทใชตวลาละลายชนด hexane: ethyl acetate ในสดสวน 6:4 มความ

เหมาะสมมากทสดในการวเคราะหดวยเทคนค thin layer chromatography (TLC)

สรป การสกดใบกระทอมดวย acetic acid แลวปรบตวอยางใหเปนดางดวยสารละลายแอมโมเนยเขมขน

แลวสกดซาดวย ethyl acetate สามารถแยกสาร mitragynine เพอใชเปนสารเปรยบเทยบได และการสกดตวอยาง

นาตมกระทอม ดวยการปรบ pH และสกดดวย ethyl acetate เปนวธการทเหมาะสมในการสกดสาร mitragynine

จากตวอยางเพอใชในการตรวจพสจน สวนเทคนคทางโครมาโตกราฟทมความเหมาะสมในการตรวจพสจนนาตม

กระทอมคอวธ thin layer chromatography (TLC) โดยใชวฏภาคเคลอนทชนด hexane: ethyl acetate ในสดสวน

6:4 และ gas chromatography ชนด FID detector สามารถใชแทน ชนด mass detector ได เมอใชวธดดแปลงซง

ลดระยะเวลาการวเคราะหลงกวา นาทเมอเทยบกบวธอางอง

เอกสารอางอง นพมาศ สนทรเจรญนนท. 2551. หลกการและเทคนคพนฐานของวธทแอลซ, น. 21-84. ใน นพมาศ สนทรเจรญนนท

อทย โสธนะพนธ และ ประไพ วงศสนคงมน, บรรณาธการ. ทแอลซ: วธอยางงายในการวเคราะห

คณภาพเครองยาไทย. ม.ป.ท.

สานกงาน ป.ป.ส. กระทรวงยตธรรม. 2556. รวมกฎหมายยาเสพตดพรอมดวยกฎกระทรวง ระเบยบ ขอบงคบ

ทเกยวของ. หางหนสวนจากดบางกอกบลอก. กรงเทพฯ.

Beng, G.T., M.R. Hamdan, M.J. Siddiqui, M.N. Mordi and S.M. Mansor. 2011. A simple and cost effective

isolation and purification protocol of mitragynine from Mitragyna speciosa Korth (ketum) leaves.

The Malaysian J. Anal. Sci. 15(1): 54-60

Chan, K.B., C. Pakiam and R.A. Rihim. 2005. Phychoactive plant abuse: the identification of mitragynine

in ketumand ketum preparations. Bull Narc. 57(1-2): 249-56.

Reuber, M.D. 1979.Carcinogenicity of chloroform. Env. Health Perspec. 31: 171-182.

Scott, T.M., J.K. Yeakel and B.K. Logan. 2014 Identification of mitragynine and O-desmethyltramadol in

Kratom and legal high product sold online. Drug Test Anal. 6: 959-963.

Yubin, J., Y. Miao, W. Bing and Z. Yao. 2014. The extraction, separation and purification of

alkaloids in the natural medicine. J. Chem. Pharm. Res. 6(1): 338-345.

United Nation Office on Drug and Crime. 2006. Recommended methods for the identification and

analysis of amphetamine, methamphetamine and their ring-substituted analogues in seized

materials. Drug Testing Laboratories. Available Source:

https://www.unodc.org/pdf/scientific/stnar34.pdf, November 1, 2014.