Upload
others
View
8
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
คมอปฏบตงาน
การตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium spp.
ดวยวธดสด (Wet smear) และยอมสพเศษ
(Rapid DMSO modified acid fast)
กณฐนษฐ ทมา
ภาควชาพยาธโปรโตซว คณะเวชศาสตรเขตรอน
มหาวทยาลยมหดล
คานา
เชอ Cryptosporidium spp. ระยะ oocyst จะมคณสมบตของการตดสทนกรด (acid fast) ดงนนการ
ตรวจอจจาระเพอการตรวจวนจฉย จงยอมดวยสพเศษคอ Rapid DMSO modified acid fast ดวยวธยอมนจะทาให
การอานผลงายขน และใชเวลา ในการ ยอมนอยกวาการยอมดวยวธอน ภาควชาพยาธโปรโตซว คณะ
เวชศาสตรเขตรอน มหาวทยาลยมหดล ไดใชวธยอมสพเศษนกบเชอ Cryptosporidium spp. มานานกวา 17 ป
คมอปฏบตงานการตรวจ วนจฉยเชอ Cryptosporidium spp. เลมนเปนการรวบรวม ความรและ
ประสบการณ ของผเขยนท ไดให บรการตรวจวนจฉย เชอดงกลา วดวยวธดสดและยอมสพเศษ ดงกลาว ใน
หองปฏบตการ ในคมอเลมนจะกลาวถงรายละเอยดทกขนตอนของการเกบตวอยางสงตรวจ การเตรยมสไลดเพอด
เชอแบบสด การเตรยมสไลดสาหรบยอมสพเศษ การ mount สไลด ตลอดจนเทคนคการตรวจเช อดวยการดสด
และการยอมสพเศษ การรายงานผล ตวอยางกรณศกษาจากหนวยงานภาครฐหรอโรงพยาบาลตางๆ รวมถง
ปญหาและอปสรรคตางๆของวธการตรวจ พรอมทงขอเสนอแนะแนวทางในการแกไขเพอพฒนาวธการตรวจใหด
ขน เทคนคเฉพาะทสาคญในการปฏบตงานไดรวบรวมและเนนไวในกรอบสเหลยมแลว ผเขยนหวงวาคมอเลมน
จะเปนขอมลความรทกอใหเกดประโยชนตอนกวจยและผปฏบตงานในหองปฏบตการตางๆ ทวประเทศทมการ
ตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium spp. เพอเออประโยชนตอแพทยในการวนจฉยผปวยและการทานายโรค เพอเปน
แนวทางในการรกษาผปวยตอไป
กณฐนษฐ ทมา
9 กรกฎาคม 2558
กตตกรรมประกาศ
ผเขยนขอขอบคณ รองศาสตราจารย ดร. พรทพย เพชรมตร หวหนาภาควชาพยาธโปรโตซว สาหรบ
ตรวจสอบความถกตองของเนอหาและคาแนะนาตางๆ ทเปนประโยชนอยางยงเกยวกบการตรวจวนจฉยเชอ
Cryptosporidium spp. รวมทงขอขอบคณรองศาสตราจารยพเศษวรรณา ไมพานช สงกดภาควชา ปรสต
หนอนพยาธ ซงเปนผ กลนกรอง ตรวจสอบความถกตองของเนอหา รวมทงแนะนาใหคาปรกษา ตางๆทเปน
ประโยชนในการเขยนคมอเลมนไดอยางดยง
ขอขอบคณ ผชวยศาสตราจารยพเศษ เบญจน พนธภวงศ และคณจารฉตต บญนะโชต สงกดภาควชา
พยาธวทยา เขตรอน ผสอนเทคนคการเตรยมส ขนตอนตางๆเกยวกบการยอมสพเศษ และดวยความระลกถงเปน
อยางยงแก ผชวยศาสตราจารยจฑาทพ ศรพนธ อาจารย ผลวงลบ สงกดภาควชาพยาธโปรโตซว ซงเปนผสอน
เทคนคการตรวจวนจฉยเชอดวยวธดสดและวธยอมสพเศษ และสดทายนขอขอบคณเจาหนาททกทานในภาควชาฯ
ทชวยเหลอและใหกาลงใจในการเขยนคมอเลมน
กณฐนษฐ ทมา
9 กรกฎาคม 2558
สารบญ
หนา
บทท 1 บทนา
ความเปนมา 1
วตถประสงค 5
ขอบเขต 5
นยามศพทเฉพาะ 6
บทท 2 บทบาทหนาทความรบผดชอบ 8
บทบาทหนาทความรบผดชอบของตาแหนง 8
ลกษณะงานทปฏบต 10
โครงสรางการบรหารจดการ 12
บทท 3 หลกเกณฑวธการปฏบตงาน 13
หลกเกณฑการปฏบตงาน 13
วธการปฏบตงาน 15
ขอควรระวงในการปฏบตงานในหองปฏบตการ 18
งานวจยทเกยวของ 19
บทท 4 เทคนคในการปฏบตงาน 21
แผนปฏบตงาน 21
ขนตอนการตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium spp. 22
วธตดตามและประเมนผลการปฏบตงาน 35
จรรยาบรรณในการการปฏบตงาน 35
ตวอยางกรณศกษาจากหนวยงานภาครฐหรอจากโรงพยาบาลตางๆ 36
บทท 5 ปญหา อปสรรค และแนวทางในการพฒนางาน 44
บรรณานกรม 51
ภาคผนวก
สารบญรปภาพ
รปท หนา
1. ลกษณะผนงซสต 2 ชนของเชอ C. parvum ดวยกลองจลทรรศนแบบ TEM 2
2. ลกษณะ oocyst ของเชอ C. parvum ทม sporozoite อยภายในจานวน 4 sporozoites 2
3. ลกษณะภาชนะและปรมาณการเกบอจจาระ 16
4. แบบฟอรมการรบสงสงตรวจและรายงานผลการตรวจทภาควชาพยาธโปรโตซว 23
5. การตรวจวนจฉยเชอภายใตกลองจลทรรศนธรรมดา อยางเปนระบบ 25
6. ลกษณะ oocyst ของเชอ Cryptosporidium spp. ดวยวธการดสดเปรยบเทยบกบ 25
ลกษณะของเชอราดวยกลองจลทรรศนธรรมดาดวยกาลงขยายสง 40X
7. ขนตอนการยอมสพเศษ Rapid DMSO modified acid fast เพอตรวจวนจฉยเชอ 28
Cryptosporidium spp.
8. ขนตอนการ mount สไลดดวยนายา permount 30
9. ลกษณะ oocyst ของเชอ Cryptosporidium spp. ดวยการยอมสพเศษ 32
Rapid DMSO modified acid fast ดดวยกลองจลทรรศนธรรมดากาลงขยายสงสด 100X
10. ใบสงตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium spp. ดวยการยอมสพเศษทสงมาจาก 34
หนวยงานตางๆและบนทกผลการตรวจหาเชอจากภาควชาพยาธโปรโตซว
11. สไลดสเมยรอจจาระทหนาเกนไปและสไลดทบางเกนไปตรวจดวยกลองจลทรรศน 46
ธรรมดากาลงขยายสง 40X
12. Background ของสเมยรอจจาระทยอมไดดจะตดสเขยวและยอมไมดจะตดสมวงแดง 47
13. Oocyst ของเชอ Cryptosporidium spp. ทไมชดเจนในสไลดยอมสทไมได mount 48
ตรวจดวยกลองจลทรรศนธรรมดาดวยกาลงขยายสงสด 100X
14. ความชดเจนของ oocyst ในสไลดทผานการ mount และไมผานการ mount 49
ตรวจดวยกลองจลทรรศนธรรมดาดวยกาลงขยายสง 40X
15. ลกษณะ oocyst ของเชอ Cryptosporidium spp. และ artifact ทยอมตดสคลาย oocyst 49
ของเชอตรวจดวยกลองจลทรรศนธรรมดาดวยกาลงขยายสงสด 100X
1
บทท 1
บทนา
1.1 ความเปนมา
เชอ Cryptosporidium spp. เปนเชอโปรโตซวทอยในกลมคอกซเดย (coccidia) เปนสาเหตกอโรค
Cryptosporidiosis ซงเปนโรคตดตอระหวางสตวและคน (zoonosis) และเปนโรคตดเชอฉวยโอกาสในผปวย
เอดส ถอเปนปญหาสาธารณสขของประเทศ ทาใหผปวยมอาการทองเสยและลาไสอกเสบ โดย Tyzzer เปนผ
คนพบเชอ Cryptosporidium ครงแรกในป ค.ศ. 1907 จาก gastric gland ของหนทดลองในหองปฏบตการ
และตงชอวา Cryptosporidium หลงจากนนมรายงานมากมายทพบวาเชอ Cryptosporidium ทาใหเกดพยาธ
สภาพอยางเฉยบพลนและเรอรง ไดทงในสตวปาและสตวเลยง โดยเฉพาะลกสตวเคยวเอองทเกดใหม โดยม
Cryptosporidium parvum เปนสาเหตสาคญททาใหเกดอาการทองเสยในโค ลกแพะ และแ กะ ซงกอใหเกด
ความสญเสยทางเศรษฐกจอยางมาก ทงทางตรงและทางออม นอกจากนในสตวปก พบวาเชอนทาใหไกบาน
เกดโรคทางระบบหายใจ และทาใหเกดโรคทางเดนอาหารในไกงวงและไกนกกระทา
รายงานพบเชอในคนเปนครงแรกโดย Nime และคณะในป ค.ศ. 1976 ในผปวยเดกอาย 3 ป ตอมา
รายงานการตดเช อโปรโตซวชนดนไดเพมมากขน ในบรเวณตางๆ ทวโลก จากการศกษาของ Ryan และ
Hijjawi ในป ค.ศ. 2015 พบวามเชอ Cryptosporidium จานวน 27 species ทตรวจพบไดทงในสตวและคน
พบในสตวปกม 3 species ไดแก C. meleagridis, C. baileyi และ C. galli พบในสตวเลยงลกดวยนม
จานวน 19 species ไดแก C. muris, C. parvum, C. wrairi, C. felis, C. andersoni, C. canis, C. hominis, C.
suis, C. bovis, C. fayeri, C. macropodum, C. ryanae, C. xiaoi, C. ubiquitum, C. cuniculus, C. tyzzeri, C.
viatorum, C. scrofarum และ C. erinacei พบในสตวครงบกครงนา เพยง 1 species คอ C. fragile สวนทพบ
ในสตวเลอยคลานม 2 species ไดแก C. serpentis และ C. varanii พบในปลาม 2 species ไดแก C. molnari
และ C. huwi มการายงานมากกวา 40 จโนไทปทมการเปลยนแปลงทางชววทยาและอณวทยา ซง
Cryptosporidium spp.ในคนมมากเกอบ 20 species และมการรายงานจโนไทปดวย species ทมความสาคญ
และตรวจพบในคนมากทสด คอ C. hominis และ C. parvum ซงเชอ Cryptosporidium spp. ตางๆนนแยกจาก
กนไดยากดวยการดลกษณะ รปรางของเชอภายใตกลองจลทรรศน ในปจจบนการแยก species ของเชอน
จาเปนอยางยงตองใชเทคนคทางอณชววทยา
ปจจบนพบวาเชอทกอโรคในคน ชนด C. parvum นาจะเปนสาเหตหนงของโรคอจจาระรวงในคน
ทเพมมากขน ทงในคนทมรางกายสมบรณแขงแรง (Healthy individuals) และคนทมภาวะภมคมกนบกพรอง
เชนคนไขเอดส หรอผปวยทไดรบยากดภมคมกน
รายงานสวนใหญพบเชอในเดกมากกวาผใหญ โดยเฉพาะอยางยงในสถานรบเลยงเดก โดยผปวยท
มภมคมกนปกตอาการทองเสยมกจะหายเอง แตผปวยทมภมคมกนตา ผปวยทมภมคมกนบกพรองหรอผปวย
2
เอดสมกจะมอาการทองเสยถายเปนนาเรอรงและอาจทาใหเสยชวตได ซงปจจบนนมผปวยเอดสทมการต ด
เชอนเพมมากขน จากการศกษาโครงสราง oocyst ของเชอภายใตกลองจลทรรศนอเลคตรอนแบบสองผาน
(Transmission Electron Microscopy) ของ Nanduri ในป ค.ศ. 1999 พบวาเชอดงกลาว มผนงซสตหนา 2 ชน
เปนสาร glycocalyx ทอยบรเวณพนผวของ oocyst (รปท 1) ซงทาใหยาดดซมไดยาก ปจจบนจงยงไมมยา
ชนดใดทใหผลดในการรกษาโรคจากเชอนได
รปท 1 ลกษณะผนงซสตหนา 2 ชน ของเชอ C. parvum ดวยกลองจลทรรศนแบบ TEM (Nanduri J, 1999)
รปท 2 ลกษณะ oocyst ทม sporozoite อยภายในจานวน 4 sporozoites ของเชอ C. parvum (ศาสตราจารย
ประยงค ระดมยศและคณะ 2556)
เปลอกชนนอก เปลอกชนใน
3
การตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium spp. มหลายวธ ไดแก วธการตรวจอยางงายหรอดสด (wet
smear) ซงเปนการตรวจหา oocyst ของเชอจากอจจาระดวยกลองจลทรรศน เนองจาก oocyst ของเชอมขนาด
ใกลเคยงกบระยะยสตของเชอรา คอประมาณ 5 ไมโครเมตร (Jokipii, 1983) จงตองอาศยทกษะและความ
ชานาญในการตรวจของผปฏบตงาน และ ทาใหวธนไมคอยเหมาะสมสาหรบการตรวจวนจฉยใน
หองปฏบตการของโรงพยาบาลทวไป จากการศกษาของ Casemore และคณะ ในปค.ศ. 1985 เกยวกบการ
ตรวจอจจาระดวยวธการยอมสพเศษตางๆ พบวา oocyst ของเชอ Cryptosporidium มคณสมบตในการตดส
ทนกรด (acid-fast) ดงนนการยอมดวยสทนกรด จงเปนวธทเหมาะสมในการตรวจวนจฉยมากทสด การยอม
ดวยวธน oocyst จะตดสแดงสด ทาใหแยกจากระยะยสตของเชอราและสงปนเปอนอนๆ ไดงาย และสามารถ
ทาการตรวจดดวยกลองจลทรรศนธรรมดา ทขนาดกาลงขยาย 400 เทา (40X) การยอมสทนกรดมหลายวธ
ไดแก modified Ziehl-Neelsen, modified dimethylsulfoxide (DMSO), safraninmethylene blue และ
modified Koster จากการศกษาเปรยบเทยบ การยอมดวย วธดงกลาวน พบวาทกวธสามารถตรวจวนจฉย
oocyst ของเชอ Cryptosporidium spp.ไดผลด รวดเรว แมนยา และเหมาะสมในการใช งานในหองปฏบตการ
ทวไปใหผลดใกลเคยงกน นอกจากนยงสามารถยอม oocyst ของเชอดวยสอนๆ เชน ส Giemsa และสฟลออ
เรสเซนต แตใหผลการตรวจไมดเทาการยอมส acid-fast ปจจบนการตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium spp.
ดวยการยอมวธ modified Ziehl-Neelsen เปนทนยมใชในหองปฏบตการทวไปมากทสด โดยทวไป oocyst
ของเชอจะมรปรางกลมและมขนาดเสนผานศนยกลางประมาณ 4-6 ไมโครเมตร (รปท 2) เมอยอมสแลว จะม
สแดง แตการตดสแดงนมลกษณะไมสมาเสมอ จงอาจพบทง oocyst ทมสซดและสเขม ผนง oocyst หนา อาจ
พบชองวางระหวางผนงของ oocyst ทไมคอยตดส sporozoite ทอยภายในสามารถพบไดตงแต 1-4 ตว ทงน
ขนอยกบระยะและการเรยงตวของ sporozoite และอาจพบ residuum body ได จากการศกษาของ Bronsdon
ในปค.ศ. 1984 พบวาการยอมสดวยวธ DMSO modified acid fast เปนวธการททาใหการอานผลไดงายขน
กวาการยอมดวยสวธอนๆ โดย oocyst จะตดสสชมพหรอแดง สวนสพนหรอ background จะตดสเขยว
นอกจากการยอมสเชอจากอจจาระโดยตรงเพอตรวจวนจฉยเชอดวยกลองจลทรรศนแลว เรา
สามารถทาให oocyst ของเชอในอจจาระแยกตวออกมาจากเนออจจาระ โดยวธการลอยตว (Flotation)
วธการนเปนการตรวจแบบเขมขน ทาใหเราตรวจพบ oocyst ไดในปรมาณทเพมขนกวาการยอมส หรออาจ
ใชวธการตกตะกอน (Sedimentation) กได วธทใหไดผลดคอ Sheather’s sucrose floatation หรอ formalin
ether sedimentation (Current and Garcia 1991) แตมขนตอนทยงยาก การตรวจวนจฉยยงสามารถใชวธทาง
ภมคมกนวทยาหรอวธทางนาเหลองวทยา เชน อมมวโนฟลออเรสเซนต และวธทางอณชววทยา เชน
Polymerase Chain Reaction หรอ PCR ซงการตรวจดวยวธ PCR นมความถกตอง ความไวและความจาเพาะ
เจาะจงในการ ตรวจวนจฉยสง และยงมคาใชจายสง ขนตอนการตรวจทซบซอน อกทงตองอาศยเครองมอ
และผเชยวชาญเฉพาะทางในการวเคราะหผล จงไมเหมาะสาหรบงานตรวจวนจฉยประจาในหองปฏบตการ
ของโรงพยาบาลทวไป (Vejdani et al., 2014)
4
การตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium spp จะตองอาศยประสบการณและความชานาญของผตรวจ
เปนอยางมาก เนองจากขนาด oocyst ของเชอนมขนาดเลก ทาใหตรวจวนจฉยไดยากมาก โดยเฉพาะอยางยง
การตรวจเชอดวยการดสด ในหองปฏบตการ หลายแหงยงไมสามารถทจะตรวจวนจฉยเชอดงกลาวไดอยาง
แมนยา แมแตผ ทผานการฝกอบรมเกยวกบการตรวจวนจฉยเชอดงกลาวทภาควชาฯ จดอบรม กยงไมคอย
มนใจในการตรวจหาเชอน
ภาควชาพยาธโปร โตซว เปนหนวยงานทมชอเสยง ในดานการตรวจเชอ Cryptosporidium spp.
บคลากรมความเชยวชาญและชานาญในการตรวจวนจฉยเชอดวยวธการยอมสพเศษ ภาควชาฯไดใหบรการ
ตรวจวนจฉยเชอดงกลาวแกผปวยจากหนวยงานตางๆ มาเปนเวลานาน อกทงยงได จดใหมการอบรมเชง
ปฏบตการเพอใหความรเกยวกบการตรวจวนจฉยเชอ opportunistic protozoa ดวยการยอม สพเศษใหแก
บคลากรทางการแพทยเปนประจาทกป ภาควชาพยาธโปรโตซวไดรบการยอมรบให เปนแหลงอางองในการ
ตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium spp. จากหนวยงานอนๆตลอดมา
ผเขยนดารงตาแหนงนกวทยาศาสตร รบผดชอบงานการตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium spp.
ดวยการยอมสพเศษ Rapid DMSO modified acid fast มาเปนเวลานาน 17 ป โดยเรมเรยนรเทคนคการตรวจ
วนจฉยเชอนจากผชวยศาสตราจารยจฑาทพ ศรพนธ ภาควชาพยาธโปรโตซว และฝกฝนวธยอมสพเศษจาก
ผชวยศาสตราจารยพเศษ เบญจน พนธภวงศและคณจารฉตต บญนะโชต สงกดภาควชาพยาธวทยา เขตรอน
จากนนผเขยนไดศกษาเพมเตมและฝกทกษะในการตรวจวนจฉยเชอดงกลาวดวยตนเอง จากประสบการณใน
การตรวจวนจฉย จงไดรบมอบหมายใหเปนผรบผดชอบในการตรวจวนจฉยเชอฉวยโอกาส (opportunistic
protozoa) ชนดตางๆดวย เชน เชอ Cyclospora cayetanensis, Cystoisospora belli ในผปวยเอดส โดยการยอม
สพเศษ Rapid DMSO modified acid fast และการตรวจวนจฉยเชอ Microsporidium spp. ดวยการยอมส
พเศษ Gram chromotrope
ดงนนผเขยนหวงวา คมอเลมนนาจะมประโยชนอยางยงแกผปฏบตงาน เกยวกบการตรวจวนจฉย
เชอ Cryptosporidium spp. ในหองปฏบตการของโรงพยาบาลตางๆทวประเทศ
5
1.2 วตถประสงค
1. เพอเปนคมอในตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium spp. จากสงสงตรวจทเปนอจจาระของผปวย
เอดสทมอาการทองเสย
2. เพอถายทอดความรและประสบการณในการ ตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium spp. ใหแก
บคลากรทางการแพทย/นกเทคนคการแพทยทปฏบตงานในหนวยชนสตรโรค
3. เพอใชเปนเอกสารอางองสาหรบวธการตรวจวเคราะหเชอ opportunistic protozoa ใหม
ประสทธภาพในหองปฏบตการ
1.3 ขอบเขต
คมอการปฏบตงานฉบบน เปนคมอเกยวกบการการตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium spp. ดวย
วธดสดและการยอมสพเศษ Rapid DMSO modified acid fast ซงเนอหาครอบคลมรายละเอยดตางๆ ดงน
- ลกษณะของอจจาระทมเชอ Cryptosporidium spp.
- การเตรยมสเมยรสไลดทด
- การตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium spp. ดวยการดสดซงเปรยบเทยบกบลกษณะของเชอรา
- ขนตอนการเตรยมสและการยอมสพเศษ
- เทคนคตางๆในการตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium spp. ดวยการเปรยบเทยบสไลดทผาน
การ mount และสไลดทไมผานการ mount การตรวจวนจฉยเชอดวยกาลงขยายสง 40X และการ
ตรวจวนจฉยเชอดวยกาลงขยายสงสด 100X
- ตวอยางกรณศกษาเกยวกบปญหา และประสบการณเกยวกบ การตรวจวนจฉยเช อ
Cryptosporidium spp. จากโรงพยาบาลและหนวยงานอนๆ รวมถงการเสนอแนวทางใน การ
แกไขปญหาดวย
6
1.4 นยามศพทเฉพาะ
Cryptosporidium spp. เชอโปรโตซวซงจดเปนเชอฉวยโอกาสทมกกอโรคในผปวยเอดส
Zoonosis โรคตดตอระหวางคนและสตวทมกระดกสนหลงอนๆ ทงสตว
เลยงและสตวปา การตดตออาจตดตอจากสตวมายงคน หรอจาก
คนไปยงสตวกได
Coccidia เชอโปรโตซวกลมคอกซเดยทมสาเหตกอใหเกดโรคอจจาระรวง
Oocyst ระยะหนงของเชอโปรโตซวในกลมค อกซเดย มกม รปรางกลม
หรอร มขนาดประมาณ 4-6 ไมครอน ผนงเรยบ บางครงอาจเหน
รปรางคลายพระจนทรเสยวจานวน 1-4 ตวบรรจอยภายใน
Gastric กระเพาะอาหาร
Formalin ether sedimentation การตกตะกอนอจจาระดวยการใชฟอรมาลนและอเทอร
Polymerase chain reaction เปนเทคนคทใชในการตรวจวนจฉยเชอทางอณวทยาเรยกวา
ปฏกรยาลกโซเพอลเมอเรส
Opportunistic เชอฉวยโอกาสทมกเกดกบผปวยทมภมคมกนบกพรองหรอผปวย
เอดส
Species สปชส
Fix เปนการทาใหเชอตดสไลด การตดส oocyst ของเชอไดดขน และ
ทาใหรปรางของเชอยงคงสภาพเดม
Mount การหยดนายา permount ลงบนสไลด แลวปดทบดวย กระจกปด
สไลด
Coverslip แผนกระจกปดวตถบนสไลดโดยมหลายรปราง และมหลายขนาด
เชนขนาด 22x22 มลลลตร
Hospital number เปนหมายเลขของผ ปวยนอก ซงจะออกหมายเลขให ในการ
ลงทะเบยนเปนผปวยทจะตรวจในโรงพยาบาล ซงออกโดยหนวย
เวชระเบยนของโรงพยาบาล
Laboratory center หองปฏบตการกลาง ซงจะมผกรอกรายละเอยดตางๆในการสงสง
สงตรวจ
Residuum สงทเหนใน oocyst ของเชอ Cryptosporidium spp. ซงจะเปน
ลกษณะทเปนรปรางคลายพระจนทเสยว
Decolourize การลางสสวนเกนออกจากสสเมยร
7
Counterstain การยอมทบดวยสอก 1 ชนดลงบนสเมยรเพอชวยใหเหน รปราง
ของเชอชดเจนขน
Background สพนสเมยรของสไลด ซงจะเหนเปนสเขยว
Artifact ลกษณะอนๆทมรปรางกลมคลาย oocyst ของเชอ
Cryptosporidium spp.
Positive control การควบคมผลการยอมส ดวยการมสไลดทมเชอ
Cryptosporidium spp. ยอมควบคกบสไลดของผปวยดวยทกครง
Forcep คมหรอปากคบ สาหรบใชจบสไลดในการยอมส
Nested PCR-RFLP เปนเทคนคการทาปฏกรยาลกโซ เพอลเมอเรส 2 ครงโดยใช ไพร
เมอร 2 ค เพอทาใหปฏกรยามความไวและความจาเพาะมากขน
จากนนจงนาผลผลตทไดจากปฏกรยาไปตดดวยเอนไซม ตด
จาเพาะ เพอดขนาดของผลผลตทถกตดออกไป
False positive ไมมการตดเชอ แตผลการตรวจเปนบวก
8
บทท 2
บทบาทหนาทความรบผดชอบ
2.1 บทบาทหนาทความรบผดชอบของตาแหนง
นกวทยาศาสตร เปนสายสนบสนนวชาการทมความสาคญทจะชวยตอบสนองภารกจหลกดานงาน
บรการวชาการ งานวจยและงานดานการเรยนการสอน ชวยอานวยความสะดวกใหกบสายวชาการใหมความ
คลองตวและเกดประสทธภาพในการปฏบตงาน
นกวทยาศาสตร มบทบาทสาคญในการปฏบตงานดานวทยาศาสตร จะตองมความชานาญการใน
ดานวทยาศาสตรและเทคโนโลย มความรความสามารถและประสบการณสง มความคดรเรมสรางสรรค และ
สามารถพฒนาแนวทางการปฏบตงานทเหมาะสม เพอหา วธการใหมๆและนามาประยกตใชกบงานทปฏบต
ได ตลอดจนแกไขปญหาตางๆ และ ตดสนใจในงานทรบผดชอบใหสาเรจ ลลวง ตามวตถประสงค และ
ปฏบตงานอนๆ ตามทไดรบมอบหมายไดอยางมประสทธภาพ โดยผเขยนคมอเลมนเปนน กวทยาศาสตรทม
หนาทความรบผดชอบในดานตางๆ ดงน
2.1.1 งานบรการวชาการ
- ใหบรการวชาการในการตรวจวนจฉยเชอพยาธโปรโตซวฉวยโอกาส (opportunistic protozoa) ดวยวธ
ยอมสพเศษ Rapid DMSO modified acid fast เพอตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium spp., C. cayetanensis,
C. belli และการตรวจวนจฉยเชอ Microsporidia spp. ดวยวธยอมสพเศษ Gram chromotrope
- ใหความอนเคราะหตวอยางเชอสดของเชอ Giardia duodenalis ดวยการเพาะเลยงเชอ เพอใช
ในการประกอบการเรยนการสอนของนกศกษาหลกสตรตางๆและผสนใจมาศกษาดงานจากหนวยงานตางๆ
ทงภายในและภายนอกคณะฯ
- ใหความอนเคราะหตวอยางเชอสดของเชอ Trichomonas vaginalis ดวยการเพาะเลยงเชอ เพอ
ใชในการประกอบการเรยนการสอนของนกศกษา หลกสตรตางๆ และผสนใจมาศกษาดงานจาก หนวยงาน
ตางๆ ทงภายในและภายนอกคณะฯ
- ทาการตรวจทางหองปฏบตการในการตรวจประเม นคณภาพของตวอยางเชอพยาธโปรโตซว
ดวยวธ direct smear การตรวจหาเชอ Cryptosporidium spp. และเชอ Microsporidia spp. ดวยการยอมส
พเศษ ซงตวอยางอจจาระทสงมา จากหองปฏบตการปรสตวทยาของหนวยงานจานวน 5 หนวยงาน ตองทา
การสเมยรและยอมสพเศษเองทงหมด
- ทาการตรวจทางหองปฏบตการในการตรวจประเม นคณภาพของตวอยางเชอพยาธโปรโตซว
จากกรมวทยาศาสตรการแพทยดวยวธ direct smear การตรวจหาเชอมาลาเรยชนดตางๆ และการตรวจหาเชอ
โปรโตซวกลม opportunistic ในผปวยเอดส (ซงตวอยางสงตรวจจะเปนตะกอนขอ งอจจาระและสไลดทยอม
สเปนทเรยบรอยแลว
9
2.1.2 งานวจย
ขณะนผเขยนคมอเปนผรวมทาวจยอย จานวน 2 โครงการในหวขอเรอง ดงน
- การศกษาเชอโปรโตซวและปรสตกอโรคสตวตดคนในลาไสของสตวตระกลลง สตวสะเทนนา
สะเทนบกและสตวเลอยคลานทเปนสตวเลยงและในกรงเลยง ซงเปนโครงการวจยททาวจยรวมกบอาจารยจาก
คณะสตวแพทย ม.มหดล
- เปนผรวมวจยในการศกษาฤทธของนามนหอมระเหย จากสมนไพรไทยตอการตานเชอ G.
duodenalis ซงเปนโครงการวจยททาวจยรวมกบอาจารยในภาควชาฯ
โดยทาหนาทดาเนนการวจยบางสวน มสวนรวมในการแสดงความคดเหนตางๆและ การแกไข
ปญหาตางๆทเกดขนในขณะดาเนนการวจยดวย
2.1.3 งานการเรยนการสอน
- ใหความอนเคราะหสไลดแบบถาวรของเชอ Cryptosporidium spp. C. cayetanensis, C. belli
และเชอ Microsporidia spp. ดวยการยอมสพเศษ สาหรบใชเปนสอประกอบการเรยนการสอน นกศกษา
หลกสตรตางๆจาก สถาบน อนๆทงภายในและภายนอกคณะฯ รวมถง ผสนใจมาศกษาดงานจากหนวยงาน
ตางๆ
- ชวยสอนภาคปฏบตการเกยวกบการเพาะเล ยงเชอ G. duodenalis และเชอ Plasmodium
falciparum แกนกศกษาหลกสตร D.T.M. & H. ของคณะฯ และผสนใจมาศกษาดงานจากหนวยงานตางๆทง
ภายในและภายนอกคณะฯ
- ชวยสอนภาคปฏบตการเกยวกบการตรวจวนจฉยเชอกลม คอกซเดย ดวยการยอมสพเศษ และ
การ สาธตการดเชอพยาธโปรโตซว ตางๆแกนกศกษาจากสถาบนตางๆ และผสนใจมาศกษาดงานจาก
หนวยงานตางๆทงภายในและภายนอกคณะฯ
2.1.4 งานอนๆ ตามทไดรบมอบหมาย
เปนกรรมการ วทยากรพเศษในการสอนภาคปฏบตการ เกยวกบการดเชอโปรโตซวตางๆให กบ
นกศกษาของสถาบนตางๆ ภายนอกคณะฯ รวมทงการจดกจกรรมตางๆของภาควชาฯ และคณะฯ
10
2.2 ลกษณะงานทปฏบต
2.2.1 ลกษณะงานทปฏบตทสอดคลองกบตาแหนง
นกวทยาศาสตรเปนผทตองปฏบตงานดานตางๆในหองปฏบตการ ดงนนจะตองมความรบผดชอบ
ตองานสงมาก มขนตอนในการวางแผนงานทดและมความชานาญในการปฏบตงาน จงจะสามารถทางานได
เสรจทนเวลาและมผลงานทมประสทธภาพสงสด ซงลกษณะงานทผเขยนคมอปฏบต มดงน
- การบรหารจดการดวยการวางแผนในการเพาะเลยงเชอตางๆ เชน เตรยมสารเคม อาหารเลยง
เชอ รวมทงลาง ทาความสะอาด อปกรณ เครองแกวตางๆใหสะอาดและ ทาใหปราศจากเชอ เพอใชในงาน
เพาะเลยงเชอ G. duodenalis, T. vaginalis และ เชอ P. falciparum รวมทงมการปรบเปลยนวธการเลยงเชอ
ตางๆ เพอใหมการใชทรพยากรของรฐและภาควชาฯอยางคมคา เชน การเพาะเลยงเชอ P. falciparum ในจาน
เพาะเลยงขนาดเลกจะตองมการเปลยนอาหารเลยงเชอทกวน แตเพอประหยดเวลา และอาหารเลยงเชอ จงได
ทาการเลยงเชอในจานเพาะเลยงขนาดใหญ ซงใชเวลาในการเปลยนอาหารเลยงเชอทก 3 วน
- ทาการ เตรยมสเมยรตวอยางสไลดแบบถาวรของเชอโปรโตซว จากสงสงตรวจตางๆ เชน
ตวอยางอจจาระ ตวอยางเลอด เตรยมสตางๆทใชในการยอมสไลดของเชอแตละชนด ตลอดจนยอมสของ
เชอแตละชนดเพอเกบไวเปนสไลดอางองของภาควชาฯ โดยมการบรหารจดการเกยวกบการเตรยมสในแต
ละครง จะมการเตรยมสในปรมาณ 500 - 1,000 มลลลตร และเกบในขวดสชา เพอสามารถใชในการยอมสได
เปนเวลาหลายเดอน และชวยประหยดเวลาในเตรยมสดวย
- ทาการสงซอวสดวทยาศาสตรและสารเคมตางๆทใชในหองปฏบตการของภาควชาฯ โดยมการ
บรหารจดการกบวสดวทยาศาสตรตางๆ ดวยการจดใหม stock กลาง เพอเจาหนาทสามารถเบก ใชวสดตางๆ
ไดอยางทนทวงท ซงจะมสมดสาหรบใหลงบนทกรายละเอยดตางๆในการเบกวสดของภาควชาฯดวย
- ดแลเครองมอบางอยางในหองปฏบตการใหพรอมใชงาน เชน ต บมสาหรบเพาะเลยงเชอ ชนด
ทควบคมอณหภมท 37 องศาเซลเซยส และม 5% คารบอนไดออกไซดดวย หาก พบวาตมปญหาเกยวการ
ปนเปอนเชอแบคทเรยหรอเ ชอราเกดขน จะทาการอบตบมสาหรบเพาะเลยงเชอ เพอฆาเชอและทดสอบการ
เจรญเตบโตของเชอดงกลาว ดวย blood agar หลงจากนนตดตอประสานงานกบบรษทเพอตรวจสอบความ
ผดปกตของตบมสาหรบเพาะเลยงเชอดวย และตรวจรบเมอซอมเสรจเรยบรอยแลว
- ตดตอประสานงานกบบรษทเกยวกบการ สงซอไนโตรเจนเหลว เพอใชในการเกบรกษาเชอ
พยาธโปรโตซวตางๆใหคงสภาพอยไดนาน โดยมการบรหารจดการดวยการตงงบประมาณรายปในการสง
ซอสารเคมดงกลาว และตดตามใหบรษททาการเตมสารเคมใหทกๆเดอน
- ตดตอประสานงานกบบรษทเกยวกบการ สงซอแกสคารบอนไดออกไซด สาหรบ ใชในการ
เพาะเลยงเชอตางๆ ของภาควชาฯ โดยการตรวจเชคและดาเนนการสงซอแกสทกๆ 4 เดอน
-
11
2.2.2 ลกษณะงานทปฏบตทสอดคลองกบคมอปฏบตงาน
- เปนผตรวจหลกในการตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium spp. โดยวธดสดและตรวจยนยนดวย
การยอมสพเศษ เพอใหบรการแกผปวยในของ โรงพยาบาลเวชศาสตรเขตรอน ม. มหดล และจากหนวยงาน
ตางๆ ทวประเทศทสงตรวจ โดยจะทาการสเมยรสไลดจากตวอยางอจจาระ ตรวจหาเชอดวยการดสด การยอมส
พเศษ และมการรายงานผลการตรวจเชอดงกลาวในวนจนทร วนพธ และวนศกรของทกสปดาห
- เปนผรายงานผลการตรวจวนจฉย เชอ Cryptosporidium spp. โดยมอาจารยผรบผดชอบใน
ภาควชาฯ เปนผเซนตรบรองผลการตรวจ และลงวน เดอน ปทรายงานผลการตรวจกากบทกครง หลงจากนนจะ
มการถายเอกสารผลการตรวจไวเปนหลกฐานจานวน 1 ฉบบ และผตรวจจะประสานงานกบเจาหนาทของ
Laboratory Center ของโรงพยาบาลเวชศาสตรเขตรอนใหมารบผล และจดสงผลการตรวจไปยงหนวยงานท
เกยวของตามลาดบ
- เตรยมตวอยางอจจาระตรวจดวยการทา สเมยรสไลดและยอมสพเศษ เพอ ตรวจยนยนเชอ
Cryptosporidium spp. สาหรบงานประเมนคณภาพของหองปฏบตการปรสตวทยาจานวน 5 หนวยงาน ไดแก 1.
ภาควชาปรสตวทยา คณะแพทยศาสตรศรราชพยาบาล ม. มหดล 2. ภาควชาปรสตวทยา คณะเทคนคการแพทย ม.
มหดล 3. งานหองปฏบตการเวชศาสตรชนสตร คณะเวชศาสตรเขตรอน ม. มหดล 4. สาขาวชาโรคตดเชอและ
อายรศาสตรเขตรอน ภาควชาอายรศาสตร คณะแพทยศาสตรศรราชพยาบาล ม. มหดล 5. หองปฏบตการจลทรรศน
ศาสตรคลนกภาควชาพยาธวทยา คณะแพทยศาสตรโรงพยาบาลรามาธบด ม. มหดล
- ตรวจยนยนเชอ Cryptosporidium spp. เพองานประเมนคณภาพของหองปฏบตการ จากตวอยาง
สงสงตรวจทเปนสไลดทยอมสเปนทเรยบรอยแลว จากกรมวทยาศาสตรการแพทย
- งานชวยสอนภาคปฏบตการเกยวกบการตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium spp. ดวยการยอมส
พเศษใหแกนกศกษาหลกสต รตางๆ ทงภายในและภายนอกคณะฯ ตลอดจน ผสนใจศกษาดงานจากสถาบน
ตางๆ
- เปนผเตรยมสพเศษ Rapid DMSO modified acid fast และเตรยมสเมยรสไลดจากตวอยางอจจาระ
ทใชในการยอมเชอ Cryptosporidium spp. เพอใชในการจดอบรมเชงปฏบตการของภาควชาฯ ซงมการจด
อบรมเปนประจาทกป
12
2.3 โครงสรางการบรหารจดการ
ภาควชาพยาธโปรโตซวเปนหนงใน 11 ภาควชาของคณะเวชศาสตรเขตรอน ม . มหดล และยงเปน
1 ใน 5 ภาควชา ฯ ทเรมมการกอตงคณะ ฯ ในป พ .ศ.2503 โดยมหนาทหลก ไดแก การเรยนการสอน การ
ฝกอบรม การวจย และการใหบรการตรวจ รวมทงใหคาแนะนาเกยวกบเชอพยาธโปรโตซว สวนงานวจยของ
ภาควชาฯ มความหลากหลายตงแตระดบชวโมเลกลของเชอไปจนถงการศกษาในระดบชมชน และม
โครงสรางการบรหารจดการตามแผนผง ดงตอไปน
13
บทท 3
หลกเกณฑวธการปฏบตงานและเงอนไข
3.1 หลกเกณฑการปฏบตงาน
3.1.1 หลกเกณฑการเกบตวอยางสงตรวจ
การทผลการตรวจทางหองปฏบตการจะถกตองแมนยาได การเกบตวอยางสงสงตรวจทถกตองกม
จาเปนและมความสาคญอยางยง การเกบตวอยางทถกตอง ควรใชหลกเกณฑ 9 ความถกตอง (“9” The right)
ซงมดงน
1. The right patient คอ ถกผปวย หมายความวา การเกบตวอยางสงตรวจควรเกบใหถกคน เชน
แพทยสงใหเกบอจจาระนาย ก. สงตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium spp. พยาบาลกตองเกบอจจาระของ
นาย ก. สงตรวจหาเชอดงกลาว
2. The right specimen คอ ตวอยางถกตอง หมายความวา การเกบตวอยางสงตรวจควรเกบให
ถกตองตามแผนการรกษาของแพทย เชน ถาตองการตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium spp. ควรเกบอจจาระ
ของผปวยสงตรวจ
3. The right requisition คอ คาสงถกตอง หมายความวา การลงมอปฏบตการตรงตามหลกเกณฑ
ของหองปฏบตการ เชน การเขยนใบนาสงสงสงตรวจ ควรตองเขยนใหถกตองและตรงกบชนดของสงทจะ
ตรวจ ควรระบชอ - นามสกลผปวย เลขประจาตวผปวย หอผปวย การวนจฉยโรค วนเวลาททาการเก บ ชนด
ของสงสงตรวจ การเกบ แพทยผรกษา เปนตน
4. The right method คอ วธการถกตอง หมายความวา การเกบสงสงตรวจควรใหถกวธตาม
หลกเกณฑของปฏบตการ เชน การเกบอจจาระเพอสงตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium spp. ควรแนะนาให
ผปวยเกบอจจาระตอนเชาหลงตนนอน ถายปสสาวะทงกอนเพอลดการปนเปอนของอจจาระทสงตรวจ และ
ไมควรเปนอจจาระทถายลงบนดน การถายอจจาระควรถายลงภาชนะรองรบขนาดใหญทแหงและสะอาด
แลวจงตกอจจาระใสภาชนะทมฝาปดมดชด
5. The right amount คอ จานวนถกตอง หมายความวา การเกบสงสงตรวจ ตามจานวนท
หองปฏบตการกาหนด เชน การเกบอจจาระเพอสงตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium spp. ควรเกบอจจาระ
ปรมาณ 5 กรมหรอใหเกนครงของกระบอกพลาสตกเบอร 1 หรอเบอร 2
6. The right container คอ ใสภาชนะถกตอง หมายความวา การเกบสงสงตรวจใสภาชนะตามท
หองปฏบตการกาหนด เชน การเกบอจจาระ ควรเกบในภาชนะทมฝาปดมดชด ไมควรใชภาชนะทมรอยรว
หรอแตกราว
14
7. The right label คอ ฉลากถกตอง หมายความวา ควรตดฉลากสงสงตรวจใหถกตอง และตรงกบ
ใบนาสงตรวจ เชน ตองระบชอ-นามสกลผปวยใหชดเจน หมายเลขประจาตวผปวย หอผปวย วนเวลาทเกบ
ตวอยางสงสงตรวจ
8. The right time คอ เวลาถกตอง หมายความวา การเกบสงสงตรวจใหถกเวลา เชน การเกบ
อจจาระเพอสงตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium spp. ควรแนะนาใหผปวยเกบอจจาระตอนเชาหลงตนนอน
และควรเกบอจจาระสงตรวจตดตอกนเปนเวลา 3 วน เนองจากเชอนจะออกมาในอจจาระไมสมาเสมอคลาย
กบอจจาระของผปวยโรคบดมตวจากเชอะมบา
9. The right attitude คอ เขาใจถกตอง หมายความวา เปนการเตรยมผปวยใหพรอมทงดานรางกาย
จตใจและจตวญญาณ เปนหวใจสาคญของพยาบาลในการทจะประเม นความร ความเขาใจ เจตคตและ
ความสามารถของผปวยตอสถานการณทผปวยกาลงเผชญอย เชนการเกบอจจาระตรวจ วนจฉย เชอ
Cryptosporidium spp. พยาบาลควรแนะนาใหผปวยเขาใจถงเหตผลทตองเกบอจจาระสงตรวจตดตอกนเปน
เวลา 3 วน
ทมา : http://www.gotoknow.org
3.1.2 การปฏบตงานเกยวกบตวอยางสงสงตรวจของผปวยโดยอาศยหลก Universal precaution
Universal precaution เปนการระมดระวงปองกนตนเองของบคคลากรทางการแพทยใหปลอดภย
จากการตดเชอในการปฏบตงาน โดยถอวาผปวยทกรายมเชอเอชไอว เชอไวรสตบอกเสบบหรอเชออนๆทอย
ในเลอด และอยในรางกาย และเชอสามารถแพรกระจายสบคคลากรไดหากบคคลากรขาดความระมดระวง
ดงนนบคลากรทางการแพทยตองใชความระมดระวงเพอใหปลอดภยจากการตดเชอ ซงมหลกในการปองกน
การตดเชอดงน
- การปฏบตงานกบตวอยาง สงสงตรวจตางๆ พงตระหนกเสมอวา ตวอยางสงสงตรวจทกชนอาจ
มเชอโรค โดยเฉพาะอยางยง เลอด สารคดหลงตางๆ และเชอโรคตางๆในอจจาร ะของผปวย ควรลางมอให
สะอาดดวยนายาลางมอหรอนาสบหลงปฏบตงาน
- ตวอยางสงสงตรวจททาการตรวจเปนทเรยบรอยแลว ควรมการฆาเชอกอนนาไปทงในภาชนะ
ทเตรยมไว
- ขณะปฏบตงานควรสวมเสอกาวน ถงมอและผาปดจมกหรออาจมการสวมแวนตาดวย
- ควรปกระดาษซบรองบรเวณผวหนาโตะปฏบตงาน เมอเลกใชงานควรฆาเชอ กอนนาไปทงใน
ภาชนะทเตรยมไว
- ขณะปฏบตงานหากมสารเคมหกหรอหยดบนโตะปฏบตงาน ควรหยดนายาฆาเชอลงไปทนท
- ไมรบประทานอาหารหรอเครองดมในหองปฏบตการ
- ไมควรหยอกลอกนขณะปฏบตงาน
15
- ขณะปฏบตงานไมนาสงของ เชน ดนสอ ปากกาหรอนวเขาปาก
- ทงของตางๆในหองปฏบตการใหถกท เชน แกวแตกหรอของมคม ควรใสภาชนะรองรบหรอ
หมดวยถงพลาสตกทหนากอนทงในถงหรอภาชนะทหนวยงานจดเตรยมไวให
- สารเคมทมการตดไฟ สารกดกรอน ตางๆ ควรมการแยกไวเปนสดสวนและ ควรมการตดฉลาก
ใหชดเจน แลวแจงใหกรรมการหรอผทรบผดชอบทราบเพอดาเนนการในการกาจดตอไป
- ควรมการรายงานอบตเหตทเกดขนทกครง ใหผบงคบบญชาไดรบทราบ
การฆาเชอโรค
ฆาเชอดวยความรอน
- อบแหง 171 องศาเซลเซยส นาน 1 ชวโมงหรอ 160 องศาเซลเซยส นาน 2 ชวโมงหรอ 121
องศาเซลเซยส นาน 16 ชวโมง
- นง อดความรอนท 121 องศาเซลเซยส นาน 15 นาท หรอ 132 องศาเซลเซยส นาน 3 นาท
- ตมเดอด 100 องศาเซลเซยส นาน 10 นาท ฆาเชอแบคทเรยไดแตไมสามารถฆาสปอรของเชอ
ราไดหมด
- นารอน 80 องศาเซลเซยส นาน 10 นาท ฆาเชอ Staphylococcus aureus ได
- นารอน 60 องศาเซลเซยส นาน 20 นาท สวนมากฆาเชอไวรสได
- รงส Ultra violet (190-300 นาโนมเตอร) สามารถฆาเชอในอากาศและพนผว (ในตหรอหอง)
ยาฆาเชอในหองปฏบตการ
- Chlorox หรอนายาซกผาขาว สามารถใชฆาเชอบนวสด
- Virgon สามารถใชฆาเชออปกรณ เครองใชตางๆได
- Ethyl alcohol สามารถใชฆาเชอตางๆได
- Formalin สามารถใชฆาเชอบนวสดและอบหองได
ทมา: ภาควชาพยาธโปรซว หนงสอการตรวจทางหองปฏบตการเพอ ตรวจหาเชอโปรโตซวในโรคเอดส ,
2542
3.2 วธการปฏบตงาน
การตรวจ วนจฉยเชอ Cryptosporidium spp.โดยวธดสดและ ตรวจ ดวยการยอมสพเศษ
ประกอบดวยวธการปฏบตงาน ดงน
3.2.1 การเกบตวอยางสงสงตรวจ สวนใหญจะเปนอจจาระของผปวยเอดสทมอาการทองเสย
ในการเกบตวอยางอจจาระ ควรเกบจากอจจาระตอนเชาหลงตนนอน แนะนาใหผปวยถายปสสาวะ
ทงกอนเพอลดการปนเปอนของอจจาระทสงตรวจ และไมควรเปนอจจาระทถายลงบนดน (เพราะสงตางๆ
16
และเชอโรคในดนอาจปนเปอนในอจจาระ ทาใหผลการตรวจวนจฉยผดพลาดได) การถายอจจาระจงควรถาย
ลงภาชนะรองรบขนาดใหญทแหงและสะอาด แลวจงตกอจจาระใสภาชนะทมฝาปดมดชด อจจาระทสง
ตรวจควรมปรมาณ 5 กรมหรอใหเกนครงของกระบอกพลาสตกขนาดเบอร 1 หรอเบอร 2 (รปท 3) และควร
นาสงอจจาระภายใน 4 - 6 ชวโมงหลงการเกบ หากสงไมไดตามเวลาใหเกบอจจาระไวทอณหภม 4 องศา
เซลเซยส ไดนาน 24 ชวโมง และตองระบชอ - นามสกลผปวย และรายละเอยดอนๆ บนภาชนะนาสงพรอม
ใบสงตรวจ (Request form) จากแพทย
รปท 3 ลกษณะกระบอกพลาสตกทใชเกบอจจาระและระดบปรมาณของอจจาระท 2, 4, 6 และ 8 กรม
3.2.2 การทาความสะอาดสไลด
สไลดทซอมาจากบรษท ตางๆนนจะสกปรกและมคราบไขมนตดอย ดงนนกอนทจะนามาใชใน
การสเมยรตวอยางอจจาระ ควรมการทาความสะอาดสไลดกอน ดวย การแชส ไลดใน 70% แอลกอฮอล
ประมาณ 10 นาท ไมควรแชสไลดไวขามคน เพราะจะทาใหสไลดกรอบได หลงจากนน ใชผาทสะอาดเชด
ทาความสะอาด ทวสไลดใหแหง พยายามหลกเลยงการสมผสบรเวณทตรงกลางสไลด ใหจบตรงขอบของ
สไลด แลวเกบเรยงใสกลอง ปดฝาใหมดชด จงจะสามารถนามาใชงานได
ตวอยางสงสงตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium spp. สวนใหญจะเปนอจจาระ หากไม
สามารถนาสงเปนอจจาระสดได ควรจะรกษาสภาพของ oocyst ในอจจาระดวย 10% formalin โดย
การผสมอจจาระ 1 สวน ลงใน 10% formalin 3 สวน ผสมใหเปนเนอเดยวกน
ตวอยางสงสงตรวจอนๆ เชน เสมหะกสามารถสงตรวจเพอหาเชอดงกลาวได ซงผเขยนไดเคย
ตรวจพบเชอดงกลาวจากเสมหะผปวยดวย จานวน 2 ราย ซงสามารถตรวจดวยการยอมสพเศษชนด
เดยวกบวธทยอมในอจจาระ
17
หมายเหต กรณตวอยางสงตรวจเปนอจจาระ อาจจะไมมปญหาในการ ทาสเมยรมากนก หากเปน
กรณตวอยางสงตรวจเปนเลอดสาหรบการตรวจหาเชอมาลาเรย ถาสไลด มไขมน จะทาใหการทาสเมยรเลอด
แบบบางไมด จะมเลอดบนสเมยรบางสวนทขาดหายไป
3.2.3 การเตรยมสารเคม เพอใชในการดเชอดวยวธดสด ซงประกอบดวยสารเคมตางๆดงน
3.2.3.1 0.85% Normal saline solution (NSS)
NaCL 0.85 กรม
นากลน 100 มลลลตร
ละลายสารเคมในนากลนใหเขากนด กรองผานกระดาษกรอง Whatman เบอร 4 เพอกรองเอาเศษผงตางๆ
ออก เกบในขวดสขาวทมฝาปดมดชด เกบไวทอณหภมหอง
3.2.3.2 1% ไอโอดน
Iodine crystal 1 กรม
Potassium iodide crystal 2 กรม
นากลน 100 มลลลตร
ละลายสารในนากลนใหเขากนด กรองผานกระดาษกรอง Whatman เบอร 4 เพอกรองเอาเศษผงตางๆ ออก
เกบในขวดสชาทมฝาปดมดชด เกบไวทอณหภมหอง
3.2.4 การเตรยมสเพอใชในการยอมเชอ ซงสวนประกอบของสตางๆดงน
3.2.4.1 ส Carbol fuchsin ในสารละลาย DMSO
Basic fuchsin crystals 4.0 กรม
นากลน 75.0 มลลลตร
ละลายสในนากลน ใหอนทอณหภมประมาณ 56-60 องศาเซลเซยส ผสม สารใหเขากนด โดยใช magnetic
bar ประมาณ 5-10 นาท สงเกตดวาสละลายจนหมด ปดตวทาความรอน แลวเตมสารละลายตอไปน
Ethyl alcohol 25.0 มลลลตร
Phenol crystals (แชในนาอนใหละลายกอนใชผสม)12.0 มลลลตร
ผสมสารทง 3 ชนดใหเขากนด แลวเตมสารละลายตอไปน
Glycerol 25.0 มลลลตร
DMSO 25.0 มลลลตร
(เท DMSO เปนลาดบสดทายลงในสารละลายทเตรยมไว และควรเทอยางชาๆ ดวยความระมดระวง ) ละลาย
สารทงหมดใหเขากน ตงทงไว 30 นาท กรองใสขวดสชา เกบไวทอณหภมหอง
18
3.2.4.2 Decolourize และ counterstaining solution
Malachite green 4.4 กรม
นากลน 220.0 มลลลตร
ละลายสในนากลนแลวเตม
Glacial acetic acid 30.0 มลลลตร
Glycerol 50.0 มลลลตร
ละลายสารทงหมดใหเขากน กรองใสขวดสชา เกบไวทอณหภมหอง
3.3 ขอควรระวงในการปฏบตงานในหองปฏบตการ
ตวอยางอจจาระทสงตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium spp. สวนใหญจะมาจากผ ปวยตดเชอเอดส
ซงเปน เชอโรคทจะสามารถตดตอไดจากการปฏบตงาน นอกจากน ผปวยอาจมเชอโรคอนๆ ทอาจ เปน
อนตรายแกผปฏบตงานไดอกหลายอยาง เชน เชอไวรส เชอแบ คทเรยทสามารถพบไดในตวอยางสงตรวจ ก
สามารถตดตอไปยงผปฏบตงานได เชน เชอวณโรค ซงพบมากในผปวยเอดส เชอราบางชนดก เปนสาเหตท
ทาใหผทมรางกายแขงแรงตดเชอและมอาการปวยทรนแรงได ถาไมระวงในขณะปฏบตงาน โดยเฉพาะอยาง
ยงเชอราทมสปอรทสามารถฟ งกระจายไปในอากาศไดงาย โดยผปฏบตงานในหองปฏบตการสามารถตดเชอ
ตางๆทปนเปอนในอจจาระสงตรวจไดหลายทาง เชน
- ทางอากาศ วธนจะตดตอโดยการหายใจเขาไป เชอโรคจะฟ งกระจายในรปของฝ นละอองหรอ
ละอองไอนาเลกๆ ผปฏบตงานในหองปฏบตการ ตองเพมความระมดระวงเปนอยางมาก ขณะทาการสเมยร
อจจาระควรเตรยมในตปลอดเชอ สวมเสอคลม ถงมอและผาปดจมกดวยทกครง กรณทมก ารปนเพอ เกบ
ตะกอนมาสเมยร ซงตองปน ดวยเครองปนเหวยงความเรวสง ในภาชนะทมฝาปด ไมควรเปดฝาทนททเครอง
หยด แตควรรอใหเครองปนหยดส กพก เพอใหละอองฟ งกระจายอย รวมตวขางลางกอน และไมทาใหเครอง
ปนหยดอยางกะทนหน เพราะจะทาใหมละอองฟ งกระจายขนได
- ทางปาก ขณะปฏบตงานไมควรนานวมอ ปากกา ดนสอ เขาปากโดยเดดขาด เพราะสงตางๆ
เหลานอาจมการปนเปอนเชอโรคตางๆ ได และไมควรนาอาหารหรอเครองดมรบประทานในหองปฏบตการ
- ทางสมผส ขณะปฏบตงานอาจมการกระเดนของสาร เปรอะเปอนเชอโรค อาจเขาทางเยอเมอก
เชน เยอบตาหรอทางผวหนงทมแผลหรอรอยถลอก ซงควรปองกนดวยการสวมเสอคลม ถงมอ แวนตาหรอ
หนากากขณะปฏบตงาน กรณทตวอยางสงตรวจมการเปร อะเปอนถงมอ ควรถอดทงและเปลยนถงมอคใหม
ทนท
- ทางบาดแผลหรอจากการถกของแหลมคมแทง การใชเขม หลอดแกว เครองแกวตางๆ อาจเกด
อบตเหตทาใหบาดเจบ เปนทางเขาของเชอโรคได ควรระมดระวงเสมอ ไมควรประมาท ไมควรหยอกลอกน
19
ในขณะปฏบตงาน เพอไมใหเกดอบตเหต ควรปฏบตตามหลกของ Universal precaution อยางเครงครด ทงน
เพอปองกนการตดเชอทมการปนเปอนจากตวอยางสงตรวจหรอการตดเชอตางๆในขณะปฏบตงาน
งานวจยทเกยวของ
วฒนพงศ วทธาและคณะ (2542) ไดศกษาการสอบเทยบผลการตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium
parvum ของโรงพยาบาลศนย โรงพยาบาลทวไป และศนยวทยาศาสตรการแพทย รวม 50 แหง ดวยการสง
ตวอยงสไลดทยอมส modified cold Zielh-Neelsen acid fast จานวน 3 สไลด เพอตรวจวนจฉยเชอ
Cryptosporidium parvum พบวาไดรบรายงานผลการตรวจกลบมาจานวน 46 แหง และพบวารายงานถกตอง
ทง 3 สไลด จานวน 6 แหง รายงานถกตอง 2 สไลด จานวน 30 แหง รายงานถกตอง 1 สไลด จานวน 8 แหง
และรายงานผลไมถกตองทง 3 สไลด จานวน 2 แหง จากรายงานผลการตรวจพบวาเจาหนาทหองปฏบตการ
ทผานการอบรมและโอกาสปฏบตงานในการตรวจวนจฉยบอยครง สามารถตรวจว นจฉยไดถกตอง สวน
เจาหนาทหองปฏบตการทมการตรวจนอยครง ควรมการฟนฟวชาการ เพอปองกนการตรวจทผดพลาด
สถาพร จตตปาลพงศและคณะ (2543) ไดศกษาความชกของโรค cryptosporidiosis ในโคนม ดวย
การเกบตวอยางอจจาระจากโค นมเพศเมย จานวน 363 ตว ดวยการตรวจหาเชอดวยวธ Enzyme
immunoassay (Prospect T) และวธ sheather sucrose centrifugation รวมกบการยอมสแอซดฟาส พบวา การ
ตดเชอ Cryptosporidium ในโคนมมอตรารอยละ 16.71โดยโคนมทโตเตมทสามารถตดเชอ Cryptosporidium
ได แตจะไมปลอยเชอออกมาเปนจานวนมาก และเชอ Cryptosporidium ทพบในโคนม นคาดวา อาจจะม
บทบาทสาคญในการแพรกระจายของโรค Cryptosporidiosis ระหวางสตวหรอตดตอจากสตวมาสคนได
เทวนทร อนปนแกวและคณะ (2552) ไดศกษาความชก ปจจยเสยง และการแยกสายพนธกรรมของ
เชอ Cryptosporidium spp. จากอจจาระของโคนม ในเขตภาคตะวนตกของประเทศไทยไดแกจงหวดสระบร
กาญจนบรและนครปฐม ดวยการเกบตวอยางอจจาระโคนมจานวน 400 ตวอยาง และทาการตรวจหาเชอ
Cryptosporidium spp. ดวยวธยอมส DMSO modified acid fast และวธ Polymerase Chain Reaction-
Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) พบวาความชกของการตดเชอ Cryptosporidium
spp. ในโคนมพบรอยละ 0.5 ดวยวธ DMSO modified acid fast และรอยละ 1.3 ดวยวธ PCR –RFLP สวน
ปจจยเสยงพบวาอายเปนเพยงป จจยสยงเดยวทมนยสาคญทางสถตตตอการตดเชอนในโคนม การแยกสาย
พนธกรรมของเชอพบวาเชอชนด Cryptosporidium parvum (bovine genotype) ซงจากการวจยแสดงใหเหน
แนวโนมทเชอ C. parvum มโอกาสทจะถายทอดถงมนษยได โดยเฉพาะคนทตองทางานเกยงของกบโคนม
20
Betancount (2002) ไดศกษาตวอยางนาจากแหลงธรรมชาตเพอตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium
parvum ดวยวธ PCR พบวาสงสงตรวจทเกบจากแหลงนา ธรรมชาตนนจะมโอกาสพบ oocyst ของเชอได
นอยกวาสงสงตรวจจากอจจาระ ดงนนควรตรวจ หาเชอ ดวยวธ Nested PCR-RFLP ทมความไวสง ซง
สามารถตรวจพบ oocyst ของเชอไดตงแต 1 ถง 10 oocysts
อมร เหลกกลาและคณะ (2009) ไดศกษาเปรยบเทยบความสามารถในการตรวจวนจฉยเชอ
Cryptosporidium parvum จานวน 3 หนวยงานหลกในม .หดล ดวยการสงอจจาระจานวน 30 ตวอยาง ซงม
ความเขมขนของ oocyst ตงแต 6-1,500 ตว และมอจจาระ 3 ตวอยางทไมไดใสเชอลงไป ถอเปนกลมควบคม
แลวจดสงไปยงหองปฏบตการทง 3 แหง เพอทาการยอมสพเศษ dimethyl sulfoxide (DMSO)
หรอ modified acid fast (Kinyoun’s) ตามความชานาญของแตละหนวยงาน พบวาผลการตรวจดวยการยอมส
ทง 2 วธ มความไวเหมอนกน จงสรปไดวาการใชวธยอมดวยวธใดขนอยกบความถนดและการฝกฝนอยาง
ถกตองของบคลาการหองปฏบตการ จะชวยในการตรวจวนจฉยและการรกษาผปวยอยางถกตองได
Cui et al. (2014) ไดศกษาโรค Cryptosporidiosis ทมสาเหตจากเชอ Cryptosporidoium parvum
ดวยการหา subtype ในฟารมโคนมทางทศตะวนตกเฉยงเหนอของจน ดวยการเกบตวอยางอจจาระจากฟารม
โคนมจานวน 252 ตวอยางมาตรวจดวยวธ Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length
Polymorphism (PCR-RFLP) และการตรวจ small subunit ดวย DNA sequence พบวามอตราการตดเชอ
สงสด 83% ในลกววทมอายไดประมาณ 2-3 สปดาหหลงคลอด ซงทาใหลกววมอาการทองเสย และอาจ
เสยชวตได ซง Cryptosporidium spp. ทเปนสาตทาใหสตวมอาการทองเสยและเสยชวตม 3 species คอ C.
parvum, C. bovis และ C. ryanae เมอตรวจหา subtype พบวาเปน subtype IIdA15G1 ซง subtype นมการ
รายงานเปนครงแรกในประเทศจนททาใหววในฟารมเกดอากการทองเสยและเสยชวตดวย
21
บทท 4
เทคนคในการปฏบตงาน
4.1 แผนปฏบตงาน
เมอตวอยางอจจาระสงมายงภาควชาฯ ผปฏบตงานจะมการวางแผนในการตรวจวนจฉยเชอ
Cryptosporidium spp. ตามตารางดงน
ลกษณะของ
สงสงตรวจ
จานวนของการ
สเมยรสไลด
สทใชในการ
ยอม
การรายงานผล ระยะเวลาในการ
รายงานผลการตรวจ
อจจาระม
ลกษณะทม
มก
สเมยรสไลด
จานวน 2 แผน คอ
แผนท 1 สาหรบ
ตรวจดวยการดสด
แผนท 2 สาหรบ
การยอมสพเศษ
Rapid DMSO
modified acid fast
สทใชในการ
ยอมม 2 ส คอ
1. ส Carbol
fuchsin
2. ส Malachite
green
1. ตรวจพบเชอจะ
รายงานเปน Positive for
Cryptosporidium spp.
2. ตรวจไมพบเชอ
รายงานเปน Not found
for Cryptosporidium
spp.
มอาจารยผรบผดชอบใน
ภาควชาฯ เซนตรบรอง
ผลการตรวจและมการ
ลงวน เดอน ปทรายงาน
ผลดวยทกครง
จะทาการรายงานผล
การตรวจทก
วนจน วนพธ และวน
ศกร
22
4.2 ขนตอนการปฏบตงาน ประกอบดวย 6 ขนตอน ดงน
ขนตอนการสงตวอยางสงสงตรวจมายงหองปฏบตการภาควชาฯ
การเตรยมสเมยรสไลดจากอจจาระเพอการ
ยอมส
การตรวจวนจฉยเชอดวยวธดสด
การตรวจวนจฉยเชอดวยการยอมสพเศษ Rapid DMSO
modified acid fast
การ mount สไลดดวย permount
ตวอยางสงสงตรวจจากโรงพยาบาล
เวชศาสตรเขตรอน
ตวอยางสงสงตรวจจากหนวยงานอนๆ
ศนย Laboratory Center
คณะเวชศาสตรเขตรอน
ม. มหดล
จดรบตวอยางสงสงตรวจ
ทภาควชาฯ
ทาการตรวจวนจฉยเชอ C. parvum
และรายงานผลทกวนจนทร วนพธและวนศกร
เกบรวบรวมตวอยางสงสงตรวจไวในตเยน
4 องศาเซลเซยส จนถงกาหนดวนตรวจ
ใชไมจมฟนจมตวอยางอจจาระหลายๆแหง โดยควรเลอก
จากบรเวณทมมก แลวปายตวอยางลงบนแผนสไลด ทง
ใหแหงทอณหภมหอง (air dry)
ใชไมจมฟนปายอจจาระหลายๆแหง ขนาดประมาณเทา
เมดถวเขยว (เลอกบรเวณทมลกษณะเปนมก) แลวละเลง
ใน NSS และในไอโอดน ทไดหยดเตรยมไวคนละดาน
ของสไลด แลว คนอจจาระและสารละลาย ใหเปนเนอ
เดยวกน ปดทบดวย coverslip นาไปดใตกลองจลทรรศน
นาสไลดทปายอจจาระแลวทงใหแหงทอณหภมหอง
การตรวจวนจฉยเชอดวยกลองจลทรรศน
และรายงานผล
นาสไลดจมใน absolute methanol เพอ Fix ฟลมอจจาระ นาน 10 วนาท
นาไปยอมดวยส Carbol fuchsin DMSO นาน 5 นาท
ลางสออกดวยนาประปา โดยการจมสไลดลงในภาชนะทใสนาประปาไว
นาส Malachite green มาหยดลงบนฟลมอจจาระ นาน 3 นาท
จมลางสไลดใหสะอาดดวยนาประปา ทงใหแหง แลว จงนาสไลดไป
mount ดวย permount
สไลดทยอมสแลว นาไปไลนาออกดวยการจมใน absolute ethanol นาน 30
วนาท 2 ครง แลวจง clear ดวย xylene 30 วนาท 2 ครง และ mount ดวย
permount ทงใหแหง 5 นาท
23
ขนตอนท การสงตวอยางสงสงตรวจมายงหองปฏบตการภาควชาฯ เนองจากการตรวจวนจฉย
เชอ Cryptosporidium spp. เปนการตรวจวนจฉยเชอฉวยโอกาสในผปวยเอดสโดยวธดสดและยอมสพเศษ
งานนเปนหนงในงานบรการวชาการของภาควชาฯ และจากการทภาควชาฯจดใหมการฝกอบรมทางหองปฏบตการ
ของเชอดงกลาวเปนประจาทกป ทาใหหนวยงานตางๆทงจากภายในและภายนอกคณะฯ สงตวอยางมาตรวจวนจฉย
เชอนมากยงขน ในขนแรกตวอยาง สงสงตรวจ จะนามาสงทหนวยรบ - สงสงสงตรวจทหองปฏบตการกลางของ
โรงพยาบาลเวชศาสตรเขตรอน (Tropical Medicine Laboratory Center) อาคารราชนครนทร คณะเวชศาสตรเขตรอน
เพอลงทะเบยน จากนน Laboratory Center จงจดสงตวอยางมาทภาควชา ฯเพอรบบรการตรวจ ซงเลขานการ
ภาควชาฯ จะทา หนาทลงบนทกขอมลตางๆในแบบฟอรมการรบ - สงสงสงตรวจ เชนวน เดอน ปทรบ
ตวอยาง ชนดของตวอยางสงตรวจ ชอผสง และผรบตวอยาง สงสงตรวจ วน เดอน ปทรายงานผลการตรวจ
และผ รบผลการตรวจ ดวย (รปท 4) โดยปกตตวอยางทนามาสงจะถกเกบไว ในตเยนทอณหภม 4 องศา
เซลเซยส จะตรวจวนจฉยเชอและรายงานผลการตรวจทกวนจนทร วนพธและวนศกรของทกสปดาห
รปท 4 แบบฟอรมการรบสงสงตรวจและรายงานผลการตรวจทภาควชาฯ
24
ขนตอนท การตรวจวนจฉยเชอดวยการดสด มขนตอนดงน
1) ควรตรวจดชอ-นามสกลและหมายเลข Hospital number (HN) ของผปวยทภาชนะใสอจจาระให
ตรงกบใบสงตรวจจากแพทย หากมปญหาชอ -นามสกลของผปวย ไมตรงกน จะตดตอไปท
Laboratory Center ของโรงพยาบาลเวชศาสตรเขตรอน เพอมารบสงสงตรวจคน
2) ตรวจอจจาระดวยตาเปลา เพอด ส ลกษณะความออน - แขง และลกษณะเนอของอจจาระเชน มมก
เลอด หรอกากอาหารมาก
2.1 ถาอจจาระแขง (มสวนเนออจจาระมากกวานา) ใหใชไมจมฟนปายอจจาระเพยง
เลกนอยเพอทาสเมยรบางๆลงบนแผนสไลดทม NSS และไอโอดน อยางละ 1-2 หยด
ทหยดไวคนละดานของสไลด
2.2 ถาอจจาระมมก ควรใชไมจมฟนจมหรอใชหลอดหยดพลาสตกดดอจจาระบรเวณทม
มก ปายบางๆบนแผนสไลดทม NSS และไอโอดนทเตรยมไว
2.3 ถาอจจาระเหลวเปนนาใหใชสาลพนปลายไมจมอจจาระ ทาบางๆบนแผนสไลด ทม
NSS และไอโอดนทหยดไว
2.4 อจจาระทมกากมาก จะเหนมเศษของอาหารปนอยมาก ควรกรองกากออกดวยผากอซ
(ใชผากอซทบ 2 ชนทชบนาไวพอหมาด )ๆ ดวยการตกอจจาระขนาดประมาณ 1 กรม
ผสมลงในนาเกลอ ใช ไมจมฟนคน ใหเขากนด แลว กรองผานผากอซลงในหลอด
ทดลอง นาไปปนทความเรว 2,000 รอบตอนาท นาน 2 นาท เทนาสวนบนทง นา
ตะกอนทไดมาทาสเมยรอจจาระบางๆบนแผนสไลดทม NSS และไอโอดน ทเตรยม
ไว
3) ใชไมสะอาดเขยตวอยางอจจาระในขอ 2 ขนาดประมาณเทาเมดถวเขยว (หากเปนไปไดควรเลอก
บรเวณทมลกษณะเปนมก) แลวละเลงทงใน NSS และไอโอดนตามลาดบ คนใหเปนเนอเดยวกน
สเมยรทเหมาะสม ไมควรหนาหรอบางเกนไป โดยสงเกตจาก เมอนาสเมยร ไปวางทาบบน
หนงสอพมพยงสามารถอานตวหนงสอได
4) ใช coverslip ปด โดยไมใหมฟองอากาศเกดขน (เอยง coverslip ประมาณ 45 องศา แตะลงบนหยด
NSS และ ไอโอดน ทเตรยมไวแลว คอยๆปลอย coverslip ลงชา )ๆ
5) นาสไลดตรวจภายใตกลองจลทรรศน โดยเรมดจากขนาดกาลงขยายตา 10 เทา (10X objective lens)
กอน ใหเรมดตงแตขอบ coverslip แลวไลขนและลงเปนระบบ จนทวทงแผน (รปท 5) พยายาม
ปรบแสงไฟใหสวางนอย เชอระยะ oocyst จะเหนเปนเมดกลมวาวๆ ขอบ cyst เรยบ เมอตรวจพบ
สงทสงสยวาจะเปน oocyst ใหใชกาลงขยายมากขนโดยปรบเลนสไปทขนาดกาลงขยายสง 40X
เพอดรายละเอยดของเชอ
6) ดลกษณะของเชอดวยการดสดเพอเปรยบเทยบกบลกษณะของเชอรา (รปท 6)
25
รปท 5 การตรวจวนจฉยเชอภายใตกลองจลทรรศนธรรมดา โดยหมนขนและลงอยางเปนระบบจนทวสไลด
รปท 6 ลกษณะ oocyst ของเชอ Cryptosporidium spp. ดวยวธการดสด (ก และ ข) เปรยบเทยบกบเชอราชนด
ยสต (ค และ ง) ดวยกลองจลทรรศนธรรมดาดวยกาลงขยายสง 40X
ปกตการตรวจดเชอโปรโตซวชนดตางๆจะตองดทงใน NSS และ ไอโอดน เพอทจะมองเหน
รายละเอยดภายในของเชอ ในการด oocyst ของเชอ Cryptosporidium spp. ใน NSS จาเปนตองหร
ไฟใหสวางนอยทสด จงจะเหน oocyst ทมลกษณะวาว ใสและมสชมพเรอๆ และเหนกอน residuum
ทอยภายในไดดวย สวนการดเชอนใน ไอโอดนอาจจะดไดยากกวา เพราะสของไอโอดนทเขม ทาใหไม
เหนลกษณะวาว ใสของ oocyst และอาจจะไมเหนกอน residuum ไดชดเจน
26
ขนตอนท การเตรยมสเมยรสไลดจากอจจาระเพอการยอมส
1) เขยนชอและนามสกลของผปวยพรอมวน เดอนปททาการสเมยร ทปลายดานหนงของสไลด โดยใช
ปากกาหวเพชรในการเขยน label แตหากสไลดทใชปลายดานหนงทมขอบฝา สามารถใชดนสอในการ
เขยน label รายละเอยดตางๆไดบนสไลดสวนทเปนฝา
2) ใชไมจมฟนเขยหรอใชหลอดหยดพลาสตกดดอจจาระจากบรเวณตาง ขๆองตวอยางทสงตรวจ และควร
เลอกเขยหรอดดอจจาระ จากบรเวณ ทมมก นาอจจาระนไปละเลงบนสไลด สะอาด (ไมมไขมน
เคลอบอย) ทเตรยมไว โดยละเลงเปนวงกลม เพอเพมพนทและโอกาสในการตรวจพบเชอ จากนน
จงนาไปทาใหแหงโดยนาไปผานเปลวไฟอยางรวดเรว ประมาณ 5 วนาท
3) ควรจะทงสไลดใหแหงสนทอกครงทอณหภมหอง (air dry) โดยปกตจะใชเวลานาน 3 นาท จงนาไปยอม
ดวยส Rapid DMSO modified acid fast
1)
ขนตอนท การตรวจวนจฉยเชอดวยวธยอมสพเศษ Rapid DMSO modified acid fast โดยมขนตอน
ตางๆ ดงน
1) สไลดทปายอจจาระและทงใหแหงทอณหภมหอง (air dry) แลวนามา fix โดยการจมลงใน absolute
methanol นาน 10 วนาท
2) หยดส Carbol fuchsin DMSO ใหทวมและทวบรเวณทสเมยร ทงไว 5 นาท ขนตอนนจะทาให oocyst
ตดสแดง
3) ลางสออกดวยนาประปา จนกระทงสรอบๆบรเวณทสเมยรสะอาด คอลางสออกจนไมมสแดงของ
Carbol fuchsin DMSO เปอนอยนอกสเมยร
4) หยดส Malachite green (decolourize - counterstain) ลงไปบรเวณสเมยรทงไว 3 นาท หรอจนกวาสพน
จะเปนสเขยว
5) จมลางสไลดใหสะอาดดวยนาประปา ทงใหสไลดแหง (รปท 7)
การทาสเมยรอจจาระทด สเมยรควรไมหนาหรอบางจนเกนไป เพราะถาสเมยรหนาเกนไป
ทาใหเกดการซอนทบกนของเศษตะกอนอจจาระ ทาใหยากตอการ ตรวจวนจฉยและอาจทาใหเกดการ
ผดพลาดในการตรวจ ได หากสไลดทสเมยรบางเกนไป หรอไมได นาอจจาระ บรเวณทเปนมก มาทา
การสเมยร อาจทาใหตรวจไมพบเชอได เพราะเชอ Cryptosporidium spp. สวนใหญจะตรวจพบบรเวณ
ทเปนมก
27
ขอควรระวงในการยอมส
1. การทาสเมยรสไลดตองทงใหแหงกอนนาไปยอมส จะทาให oocyst ตดสไดด แตถาสเมยรไมแหง
แลวนาไปยอมสจะทาให oocyst หลดได
2. เวลาทใชในการยอมเชอดวยส Carbol fucshin DMSO และส Malachite green สามารถ
ปรบเปลยนได ตามความเขมขนของสยอมทเตรยมในแตละ lot ดงนนหลงจากการเตรยมสแตละ
lot ควรมการทดลองยอมสนนๆกบสไลดทม oocyst ของเชอ หรอ positive control เพอทดสอบ
วาสทเตรยมในแตละครง ควรจะใชเวลาในการยอมสนานเทาใด
3. หลงการยอมดวยสแดงของ Carbol fucshin DMSO ขนตอนของการลางส ควรลางสออกให
หมด หากลางสออกไมหมด เมอหยดส Malachite green ลงไป และลางออกจะพบวาสพนสเมยร
จะเปนสมวงแดง แทนทจะเปนสเขยว
4. เทคนคสาคญในการยอมสคอตลอดขนตอนการยอมสไมควรใหสไลดแหงโดยเดดขาด เพราะจะ
ทาให oocyst ของเชอเหยวได ยกเวนในขนตอนกอนนาไป mount ดวย permount
5. การยอมสไลดของผปวยทกครงควรมสไลดทมเชอ Cryptosporidium spp. (positive control)
ยอมสควบคดวย
28
รปท 7 ขนตอนการยอมสพเศษ Rapid DMSO modified acid fast เพอตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium spp.
29
ขนตอนท การ mount สไลดดวยนายา permount
1) นาสไลดทยอมดวยส Rapid DMSO modified acid fast ทตากใหแหงแลว จมลงใน absolute ethanol
นาน 30 วนาท จานวน 2 ครง แตละครงควรซบนายาสวนเกนออกดวยกระดาษอเนกประสงค แลว
จงจมลางอกดวย absolute ethanol ใน jar ท 2
2) นาสไลดมาจมใน xylene นาน 30 วนาท จานวน 2 ครง ซบ นายาสวนเกนออก ดวยกระดาษ
อเนกประสงค แลวจงจมอกครงดวย xylene ใน jar ท 2
3) หยด permount ประมาณ 1-2 หยด ลงบนบรเวณทสเมยร
4) ปดทบดวย coverslip (รปท 8) โดยวางกระจกปดสไลดใหดานหนงแตะสไลดตรงทรมของหยดนา
โดยใหเอยงกระจกปดสไลดทา มม 45 องศา คอยๆ ปลอยอกดานหนงลง กรณทสเมยรมขนาดสน
ควรใช coverslip ขนาด 22x22 มลลเมตร แตหากบรเวณทสเมยรมขนาดยาวมากควรใช coverslip
ขนาด 22x40 มลลเมตร การปด coverslip ใมควรใหเกดฟองอากาศ แตหากเกดฟองอากาศ ควรใช
forcep กดลงตรงกลางบรเวณทสเมยร เพอไลฟองอากาศออกใหหมด แตหากในบรเวณ coverslip
ยงคงมฟองอากาศ อยอก ควรนาสไลดไปแชใน xylene ประมาณ 3 นาท หรอจนกระทง แผน
coverslip หลดออก แลวจงหยดนายา permount ลงไปใหมและปดทบดวย coverslip อกครง ทงให
permount แหงในอณหภมหอง โดยใชเวลาประมาณ 5 นาท จงนาสไลดไปตรวจหาเชอภายใตกลอง
จลทรรศน โดยเรมดจากกาลงขยายตา 10X กอน แลวจงเพมกาลงขยายใหสงขนเปน 40X และ 100X
(กาลงขยายสงสด 1,000 เทา) ตามลาดบ แลวรายงานผล
30
รปท 8 ขนตอนการ mount สไลดดวยนายา permount
31
ขอควรระวงในการ mount สไลด
1. สไลด ทยอมส แลวเมอ จะนามา mount ตองทงไว ใหแหง สนทกอน จงนามาจมใน absolute
ethanol หากสไลดไมแหง แลวนามาจม ใน absolute ethanol จะทาใหสเขยวในพนสเมยรหลด
ออกหมด ทาใหสไลดเปนสมวงแดง ซงทาใหการอานผลยากหรอผดพลาดได
2. กอนการเปลยนจมสไลดลงใน absolute ethanol หรอ xylene ในแตละ jar ทกครงควรใชกระดาษ
อเนกประสงคซบใหนายาสวนเกนออกกอน โดยวางใหขอบสไลดดานทใกลสเมยรตงบนกระดาษ
เพอใหนายาไหลลงจนหมด
3. ในขนตอนการดงนาออกดวย absolute ethanol และการ clearing สไลดดวย xylene หากมการ
เตรยมสไลดไดด เมอหยดนายา permount ลงบนสเมยร permount ควรแผเตมบรเวณทสเมยร
ปกตจะใช permount ในปรมาณ 1 หรอ 2 หยด ขนอยกบพนทความกวางของสเมยร ถาสเมยร
กวาง ควรหยด permount จานวน 2 หยด ปดทบดวย coverslip เมอเตรยมเสรจภายใน coverslip
ตองไมมฟองอากาศ หากมฟองอากาศเกดขนเลกนอย ทบรเวณใกลขอบ coverslip เราสามารถใช
forcep กดลงตรงกลางบรเวณทสเมยร เพอไลฟองอากาศออก ในการทาความสะอาดสไลดใหใช
กระดาษอเนกประสงคจม xylene เลกนอยเชดรอบๆแผนสไลด จะไดสไลดทสวยงามและสะอาด
ไมมคราบของ permount ตดอย สไลดยอมสสามารถเกบ ไวเปนสไลดอางอง (Reference slide)
ไดนานมากกวา 5 ป
4. ในกรณทการ mount สไลดทาใหเกดฟองอากาศขนาดเลกๆจานวนมาก จนไมสามารถไล
ฟองอากาศออกไดหมด ใหนาแผนสไลดนนจมใน xylene รอจน coverslip หลดออกจากสไลด
แลวจงใชกระดาษอเนกประสงคเชดรอบๆบรเวณทสเมยรกอน แลวจงหยดนายา permount และ
ปดดวย coverslip อกครง ปรบแตงจนไดสไลดทสวยงาม ซงเราสามารถแกไขการ mount สไลด
ไดหลายครง จนกวาจะ mount สไลดไดสวยตามทตองการ แตไมควรแชสไลดใน xylene ทงไว
คางคน เพราะจะทาใหแผนสไลดนนเปราะและแตกงาย
32
ในการตรวจวนจฉย oocyst ของเชอ Cryptosporidium spp. จะทาการตรวจทง 2 วธคอการดสด
กอน ซงการตรวจวนจฉยจะยากมาก แลวจงตรวจยนยนดวยการยอมสพเศษทกครง ในการตรวจดเชอสดใน
NSS จะเหน oocyst มรปรางกลม ขนาดประมาณ 4-6 ไมครอน ลกษณะซสตวาวๆ ใสมสชมพเรอๆผนง ซสต
บางมาก ขางใน oocyst จะเหน residuum มลกษณะเปนกอนจานวน 4-5 กอน (รปท 6 ก) สวนการด oocyst
ในสไลดทหยดดวย 1% iodine จะดไดยากกวา เพราะสของ iodine จะเขมทาให oocyst มสเขมกวาใน NSS
เราจงไมเหน oocyst ทมลกษณะวาว ใส และอาจจะไมเหนกอน residuum ทชดเจนได (รปท 6 ข) ในการ
ตรวจอจจาระบางครงจะพบเชอรา ซงมขนาดใกลเคยงกบซสตของเชอ C. parvum แตเชอราจะมลกษณะซสต
กลมวาวๆ รปรางกลมหรอรได มทงขนาดเลกและใหญ และเชอรามผนงซสตทหนากวา อาจไมเหนเมด
แกรนลภายใน (รปท 6 ค) หรออาจจะเหนเมดแกรนล ภายใน (รปท 6 ง) ดงนนการตรวจ ยนยนเชอดวยการ
ยอมสพเศษจงมความจาเปนอยางยง
Oocyst ของเชอ C. parvum ในสเมยรสไลดทยอมสแลว บางตวกยอมไมตดส ซงเราสามารถสงเกต
ไดจากลกษณะรปรางกลม ใส ทภายในมรปโคงกลวงตดสชมพเรอๆ (รปท 9 ก) สวน oocyst ทยอมตดส จะ
พบเหน sporozoite อยภายใน ตงแต 1-4 sporozoites และส background ของสเมยรจะตดสเขยว (รปท 9 ข-จ)
รปท 9 ลกษณะ oocyst ของเชอ Cryptosporidium spp. ดวยการยอมสพเศษ Rapid DMSO modified acid fast
ดดวยกลองจลทรรศนธรรมดากาลงขยายสงสด 100X
33
ขนตอนท การรายงานผลการตรวจวนจฉยเชอ
หลงการตรวจวนจฉย หากตรวจพบ oocyst ของเชอ Cryptosporidium spp. อาจารยทมหนาท
รบผดชอบจะทาการ ตรวจเพอยนยนลกษณะของเชอทตรวจพบและรบทราบ ผลการตรวจ เมอผลการตรวจ
ถกตอง จงรบรองผลการตรวจ ในใบเอกสารทสงมาพรอมกบตวอยางสงตรวจ ปกตการ รายงานผล จะม
รายละเอยดวา ตรวจพบเชอ หรอตรวจไมพบเชอ Cryptosporidium spp. เทานน และจะสงผลกลบไปยง
Laboratory Center ของโรงพยาบาลเวชศาสตรเขตรอน เพอประสานงานใหหนวยงานทสงตรวจมารบผลการ
ตรวจตอไป ใบสงตรวจสวนใหญ จะมขอมลรายละเอยดตางๆ (รปท 10) ดงน
1. ชอ - นามสกล ของผปวย
2. เลขท Hospital number (HN)
3. หนวยงานทสงตวอยางตรวจ
4. สถานทตรวจบรการ
5. วนทรบตวอยางสงสงตรวจ
6. ผลการตรวจวนจฉย
7. ผตรวจวนจฉย
8. ผรบรองผลการตรวจ
9. วนทรายงานผลการตรวจ
การรายงานผลการตรวจม 2 แบบ คอ
- กรณตรวจพบเชอ ใหรายงานเปน ตรวจพบเชอหรอ Positive for Cryptosporidium spp.
- กรณตรวจพบไมเชอ ใหรายงานเปน ตรวจไมพบเชอหรอ Not found for Cryptosporidium
spp.
ขอควรคานงในการรายงานผลการตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium spp. ดวยวธดสด
กรณตรวจพบเชอ Cryptosporidium spp. สามารถรายงานผลได แตควรตรวจสไลดทวทงแผน
เพอตรวจดวามการ ตดเชอโปรโตซวอนๆ รวมดวยหรอไม และควรทาการตรวจยนยนดวยการยอมส
พเศษ
กรณตรวจไมพบเชอ ควรมการตรวจอยางละเอยดจนทวทงแผนสไลด ควรทาการตรวจยนยนดวย
การยอมสพเศษกอน จงจะสามารถรายงานผลได
ขอควรคานงในการรายงานผลการตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium spp. ดวยวธยอมสพเศษ
กรณตรวจพบเชอ สามารถรายงานผลได แตควรตรวจไปอกประมาณ 10 fields ดวยกลอง
จลทรรศนกาลงขยายสง 40X เพอตรวจดอยางละเอยดวามการตดเชอโปรโตซวกลม คอกซเดยอนๆ รวม
ดวยหรอไม
34
รปท 10 ใบสงตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium spp. ดวยการยอมสพเศษทสงมาจากหนวยงานตางๆ และ
บนทกผลการตรวจหาเชอจากภาควชาฯ
35
4.3 วธการตดตามและประเมนผลการปฏบตงาน
หลงจากการตรวจและรายงานผลการตรวจวนจฉยเชอ Cryptsporidium spp. แลวจะมการถาย
เอกสารไวจานวน 1 ฉบบ เพอเกบไวเปนหลกฐานการตรวจ กรณหนวยงานทสงตวอยางมาตรวจทาผลการ
ตรวจสญหายจะตดตอกลบมาเพอขอสาเนาผลการตรวจอกครง นอ กจากนยงใชเปนขอมลทางดานสถตเกยว
การตรวจเชอดงกลาวของภาควชาฯ ดวย
การตรวจวนจฉยเชอ Cryptsporidium spp. ดวยการตรวจย นยนเพอประเม นคณภาพของ
หองปฏบตการปรสตวทยาจานวน 5 หนวยงาน จะมการสงตวอยางอจจาระมาใหตรวจประมาณ 5 ครงใน
ปงบประมาณ ผถกประเม นจะทาการตรวจและสงผลการตรวจ กลบไปยงหนวยงานทเปนผทาการประเม น
ภายในเวลา 1 เดอน หลงจากนนประมาณ 1 เดอนถดไป กรรมการประเมนคณภาพของหองปฏบตการกจะ
รายงานผลทถกตองกลบมายงหนวยงานทถกประเมณ เพอใหรบทราบผลการตรวจดงกลาว
งานชวยสอนภาคปฏบตการเกยวกบการตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium spp. ดวยการยอมส
พเศษใหแกนกศกษาหลกสตรตางๆนน โดยจะไมมการดเชอดวยการดสด แตจะใหตรวจวนจฉยเชอดวยการ
ยอมสพเศษเทานน จะพบวานกศกษามความพงพอใจกบทสไลดทเตรยมให เพราะเปนสไลดทมเชอเยอะมาก
และนกศกษาสามารถตรวจพบเชอไดดวยตวเอง
การตรวจวนจฉยเชอ Cryptsporidium spp. ในการจดอบรมเชงปฏบตการของภาควชาฯ จะมการจด
อบรมเปนประจาทกป หลงจากผเขาอบรมไดรบการฝกเทคนคตางๆแลว หากสงสยและไมสามารถตรวจวนจฉย
เชอดงกลาวได กจะตดตอมาเพอสอบถามและจะสงสไลดหรอตวอยางอจจาระทสงสยมายงภาควชาฯ ซงผเขยน
จะเปนผตรวจยนยนตวอยางนน และจะสงผลการตรวจกลบไปยงหนวยงานนนๆดวยการสงผลทางไปรษณย
4.4 จรรยาบรรณในการปฏบตงาน
ในการตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium spp. มความจาเปนอยางยงทผปฏบตงานตองม
จรรยาบรรณในการตรวจทางหองปฏบตการ ตองรายงานผลตามความเปนจรง กรณตรวจพบเชอ
Cryptosporidium spp. กสามารถรายงานผลการตรวจไดวา “ ตรวจพบเชอ Cryptosporidium spp. ” กรณ
ตรวจไมพบเชอ ควรมการตรวจอยางละเอยดจนทวทงแผนสไลดนน จงจะสามารถรายงานไดวา “ ตรวจไม
พบเชอ Cryptosporidium spp.” ตองมเจาหนาท ทมความเชยวชาญและรบผดชอบดวยตาแหนง เชน นก
เทคนคการแพทยชวยในการตรวจยนยนผลการตรวจนน
ผปฏบตงานควรมจรรยาบรรณในการรายงานผลการตรวจดวย ผปฏบตงานไมควรรายงานผลทาง
โทรศพทหรอโทรสารโดยเดดขาด ควรแจงใหเจาหนาทมารบผลการตรวจดวยตนเอง
36
ตวอยางกรณศกษา
จากการทไดรวบรวมขอมลหรอปญหาตางๆและประสบการณทไดจากการปฏบตงานในการตรวจ
วนจฉยเชอ Cryptosporidium spp. จากตวอยางอจจาระ ของหนวยงานภาครฐและโรงพยาบาลตางๆ จานวน 4
แหง โดยสามารถสรปปญหาทเกดขนและแนวทางในการแกไข ตามรายละเอยดดงน
หมายเลข หนวยงานภาครฐ/
โรงพยาบาล
ปญหาทพบในการตรวจ แนวทางแกไข
1 ภาควชาปรสตวทยา
คณะแพทยศาสตร
ศรราชพยาบาล
ม. มหดล
1. เจาหนาท หองปฏบตการ ขาด
ประสบการณในการตรวจวนจฉยเชอ
Cryptosporidium spp. ดวยวธการด
สด ทาใหเจาหนาทจะตองทาการ
สเมยร ตวยางอจจาระสงตรวจ และ
ยอมดวยวธ Modified acid fast ซงใช
หลกการยอมเดยวกนกบการยอมหา
เชอวณโรค ถงแมการยอมสน จะ
สามารถใชตรวจวนจฉยเชอ
Cryptosporidium spp. ได แตขนตอน
การยอมจะยงยากกวาการยอม สดวย
วธ Rapid DMSO modified acid fast
2. กรณแพทยสงตรวจดวยวธดสด
หรอ direct smear เจาหนาทกจะตรวจ
เฉพาะเชอโปรโตซวตวอนๆ ทม
ขนาดใหญ สวนเชอ
Cryptosporidium spp. ทมขนาดเลก
จงไมสามารถวนจฉยได
1.ควรมการสงเสรม ให
เจาหนาทหองปฏบตการม
การเพมพนทกษะ และ
ประสบการณ ดวยการสงไป
ฝกอบรมเทคนคตางๆในการ
ตรวจวนจฉยเชอ
Cryptosporidium spp. ดวย
การดสด และการยอมสดวย
วธ Rapid DMSO modified
acid fast
2.หากแพทยสงตรวจโปรซว
ในลาไส เจาหนาท
หองปฏบตการควรใชวธด
สด หรอ direct smear ควบค
กบการยอมสสงสงตรวจดวย
วธ Rapid DMSO modified
acid fast เพอจะไดไมพลาด
ในการวนจฉยเชอขนาดเลก
เชน เชอ Cryptosporidium
spp.
37
หมายเลข หนวยงานภาครฐ/
โรงพยาบาล
ปญหาทพบในการตรวจ แนวทางแกไข
1 ภาควชาปรสตวทยา
คณะแพทยศาสตร
ศรราชพยาบาล
ม. มหดล (ตอ)
3. การายงานผลจากการตรวจดวย
กลองจลทรรศนนน เจาหนาทมกจะ
รายงานผลเปน Cryptosporidium
parvum
3. การรายงานจากการตรวจ
ดวยกลองจลทรรศนนน ควร
รายงานเปน
Cryptosporidium spp.และ
หาก ตองการระบวาเปน
species ไหน ควรนาตวอยาง
อจจาระสงตรวจนนไปตรวจ
แยกชนดของเชอดวยวธทาง
อณชววทยาหรอ PCR
38
หมายเลข หนวยงานภาครฐ/
โรงพยาบาล
ปญหาทพบในการตรวจ แนวทางแกไข
2 โรงพยาบาลราชวถ 1.เจาหนาทหองปฏบตการขาด
ประสบการณในการตรวจวนจฉยเชอ
Cryptosporidium spp. ดวยวธการด
สด ทาใหเจาหนาทจะตองทาการ
สเมยรตวยางอจจาระสงตรวจและ
ยอมส Modified acid fast ซงใช
หลกการยอมเดยวกนกบการยอมหา
เชอวณโรค ถงแมการยอมสนจะ
สามารถใชตรวจวนจฉยเชอ
Cryptosporidium spp. ได แตขนตอน
การยอมจะยงยากกวาการยอมส ดวย
วธ Rapid DMSO modified acid fast
2. เจาหนา ทหองปฏบตการไมเคย
ไดรบการสงไปฝกอบรม การ ตรวจ
วนจฉยเชอนทหนวยงานอนๆ แตม
การฝกอบรมเฉพาะในหองปฏบตการ
เดยวกนเทานน ทาใหขาดการ
แลกเปลยนประสบการณและการ
เพมพนความรดานการตรวจวนจฉย
เชอใหมๆ
1.ควรมการสงเสรมให
เจาหนาทหองปฏบตการม
การเพมพนทกษะและ
ประสบการณ ดวยการสงไป
ฝกอบรมเทคนคตางๆในการ
ตรวจวนจฉยเชอ
Cryptosporidium spp. ดวย
การดสดและการยอมสดวย
วธ Rapid DMSO modified
acid fast
2. หากแพทยสงตรวจโปรโต
ซวในลาไส เจาหนาท
หองปฏบตการควรใชวธด
สด หรอ direct smear ควบค
กบการยอมสสงสงตรวจดวย
วธ Rapid DMSO modified
acid fast เพอจะไดไมพลาด
ในการวนจฉยเชอขนาดเลก
เชน เชอ Cryptosporidium
spp.
39
หมายเลข หนวยงานภาครฐ/
โรงพยาบาล
ปญหาทพบในการตรวจ แนวทางแกไข
2 โรงพยาบาลราชวถ
(ตอ)
3.หลงจากการยอมสเสรจเรยบรอย
แลว เจาหนาทหองปฏบตการจะไมม
การ mount สไลดทนท ทาใหจะตอง
ตรวจหาเชอดวยกลองจลทรรศน
กาลงขยายสงสด 100X ซงทาใหใช
เวลาในการตรวจหาเชอนาน
4. ในหองปฏบตการไมมโปสเตอร
หรอหนงสอภาพส ( Atlas)
ประกอบการตรวจ หากเกดขอสงสย
เกยวกบการ ตรวจ วนจฉย เจาหนาท
หองปฏบตการจะดภาพประกอบจาก
google ซงทาใหการวนจฉยผดพลาด
ได
3.หลงจากการยอมสเสรจ
เรยบรอยแลว ควรมการ
mount ไลดทนท ซงจะ ทา
ใหเจาหนาทหองปฏบตการ
สามารถตรวจวนจฉยเชอ
ดวยกลองจลทรรศน
กาลงขยายสง 40X ได และ
สามารถเหน oocyst ของเชอ
ไดชดเจนขน เพอชวย
ประหยดเวลาในการตรวจ
วนจฉยได
4. ควรมการสงซอหนงสอ
Atlas หรอโปสเตอรภาพสท
ผลตโดยหนวยงานท
นาเชอ ถอ เพอเกบไวใน
หองปฏบตการสาหรบใช
ประกอบการตรวจวนจฉย
เชอ
40
หมายเลข หนวยงานภาครฐ/
โรงพยาบาล
ปญหาและประสบการณทพบในการ
ตรวจ
แนวทางแกไข
3 ภาควชาพยาธวทยา
โรงพยาบาลสงขลา
นครนทร จงหวด
สงขลา
1.ไมเคยมการเปดใหบรการรบตรวจ
วนจฉยเชอ Cryptosporidium spp. มา
กอน ในปพ.ศ. 2549 ไดสงเจาหนาท
หองปฏ บตการมารบการอบรม
เกยวกบการตรวจเชอนทภาควชาฯ
เปนระยะเวลา 2 วน
หลงจากนนจ งมการเปดรบบรการ
ตรวจหาเชอนขนในหองปฏบตการ
แตเจาหนาทกยงไมสามารถตรวจเชอ
ดวยการดสดได และทาการตรวจดวย
วธยอมสพเศษ Rapid DMSO
modified acid fast ทไดรบการอบรม
จากภาควชาฯ ซงกยงไมมนใจในการ
ตรวจวนจฉยมากนก
เมอประมาณปลายปพ .ศ . 2549
หนวยงานดงกลาว ไดสงเจาหนาท
หองปฏบต การจานวน 1 ทาน มา
ฝกอบรมหลกสตรระยะสน ประมาณ
3 เดอน เกยวกบเทคนคตางๆ ทใชใน
การตรวจ หาเชอน ซงผเขยนคมอ ได
เปนผฝกเทคนคเกยวกบการตรวจเชอ
น รวมทง การตรวจเชอดวยวธการด
สด หลงจากนนเจาหนาท ทานน
สามารถตรวจเชอดวยการดสด การ
ยอมสพเศษ และมความมนใจ ในการ
รายงานผลมากยงขน
1. ควรมการจดอบรมภายใน
หองปฏบตการ เกยวกบการ
ตรวจหาเชอดวยวธการดสด
โดยมอบหมายใหเจาหนาท ผ
ทไดรบการอบรมระยะสน 3
เดอนและได รบ ตาแหนง
นกวชาการวทยาศาสตร
การแพทย เปนผฝกอบรมให
หรออาจจะสงเจาหนาท
หองปฏบตการทานอนๆ ไป
อบรมหลกสตรระยะสน
ภายนอกหนวยงาน ใหมาก
ขน
41
หมายเลข หนวยงานภาครฐ/
โรงพยาบาล
ปญหาและประสบการณทพบในการ
ตรวจ
แนวทางแกไข
3 ภาควชาพยาธวทยา
โรงพยาบาลสงขลา
นครนทร จงหวด
สงขลา (ตอ)
ตอมา เจาหนาท ทานนกสามารถ ปรบ
ตาแหนงเปนนกวชาการวทยาศาสตร
การแพทยได
2. หลงจากการยอมสเสรจเรยบรอย
แลว เจาหนาทหองปฏบตการจะไมม
การ mount สไลดทนท ทาใหจะตอง
ตรวจหาเชอดวยกลองจลทรรศน
กาลงขยายสงสด 100X ซงทาใหใช
เวลาในการตรวจหาเชอนาน
2. หลงจากการยอมสเสรจ
เรยบรอยแลว ควรมการ
mount ไลดทนท ซงจะทาให
เจาหนาทหองปฏบตการ
สามารถตรวจวนจฉยเชอ
ดวยกลองจลทรรศน
กาลงขยายสง 40X ได และ
สามารถเหน oocyst ของเชอ
ไดชดเจนขน เพอชวย
ประหยดเวลาในการตรวจ
วนจฉยได
42
หมายเลข หนวยงานภาครฐ/
โรงพยาบาล
ปญหาทพบในการตรวจ แนวทางแกไข
4 โรงพยาบาลชมชน
จงหวดยโสธร ขนาด
30 เตยง
1.เจาหนาทหองปฏบตการขาด
ประสบการณในการตรวจวนจฉยเชอ
Cryptosporidium spp. ดวยวธการด
สดและการยอมส เนองจาก ใน
หองปฏบตการไมมสสาหรบยอมเชอ
และเจาหนาทหองปฏบตการสามารถ
ตรวจหาเชอโปรโตซวทมขนาดใหญ
จากการดอจจาระสงตรวจสดเทานน
2. เจาหนาทหองปฏบตการ บางทาน
เคยไดมารบการอบรมเชงปฏบตการ
เกยวกบการตรวจเชอน ทภาควชาฯ
เปนเวลา 2 วนแลว แตยงไมสามารถ
ตรวจวนจฉยเชอดวยการดสดได
3. ขาดงบประมาณในการสงซอวสด
ตางๆ รวมถงชดสยอมเชอแบบ
สาเรจรป
1.ควรมการสงเสรมให
เจาหนาทหองปฏบตการม
การเพมพนทกษะและ
ประสบการณ ดวยการสงไป
ฝกอบรมเทคนคตางๆในการ
ตรวจวนจฉยเชอ
Cryptosporidium spp. ดวย
การดสดและการยอมส ดวย
วธ Rapid DMSO modified
acid fast
2. ควรมการสงเจาหนาท
หองปฏบตการไปฝกอบรม
เกยวกบการตรวจวนจฉยเชอ
Cryptosporidium spp.
หลกสตรระยะสนประมาณ
3 เดอน เพอใหมความมนใจ
และสามารถวนจฉยเชอได
อยางเชยวชาญ
3. ควรมการจดหา
งบประมาณในการซอสยอม
แบบสาเรจรป ซงจะมราค า
ถกกวาการซอสแตละชนด
มาเตรยมเอง
43
หมายเลข หนวยงานภาครฐ/
โรงพยาบาล
ปญหาทพบในการตรวจ แนวทางแกไข
4 โรงพยาบาลชมชน
จงหวดยโสธร ขนาด
30 เตยง (ตอ)
4.ในหองปฏบตการไมมหนงสอ
ภาพส (Atlas) ประกอบการ ตรวจ
วนจฉยเชอ
5. ขาดแพทยเฉพาะทางทมความรและ
เชยวชาญเกยวกบการตดเชอฉวย
โอกาสในผปวย เอดส ทาใหมการสง
ตรวจเชอนนอยมาก ถงแมจะมจานวน
ผปวยเอดสเพมมากขนกตาม
4.ในหองปฏบตการควรม
หนงสอภาพส ( Atlas)
ประกอบการ ตรวจ วนจฉย
เชอนนดวย
5.ควรมการสงเสรมหรอ
อบรมแพทยททาหนาทใน
การวนจฉยและรกษาการตด
เชอฉวยโอกาสในผปวย
เอดส
44
บทท 5
ปญหา อปสรรคและแนวทางการแกไขในการพฒนางาน
5.1 ความไมถกตองของชอสยอมทระบในใบสงตรวจ
ปญหาทพบบอย คอ เจาหนาทหองปฏบตการหลายแหง จะเกดความสบสนระหวางการสงตวอยาง
อจจาระเพอตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium spp. ดวยวธ Acid Fast Bacilli (AFB) ซงการยอมสนเปนการ
ยอมเพอตรวจวนจฉยเชอวณโรคโดยตรง แตกสามารถตรวจหาเชอ Cryptosporidium spp. ไดเชนกน
นอกจากน โรงพยาบาลตางๆทวประเทศจะตรวจหาเชอ Cryptosporidium spp. ดวยการยอมสดวยวธ
Modified acid fast ซงเปนการยอมดวยวธของ Kinyoun หรอเปนการยอมสทนกรดเพอตรวจวนจฉยเชอวณ
โรค โดยวธนจะยอมตวอยางสงตรวจดวยส Carbol fuchsin และทาการการลางสสวนเกน (decolourization)
ดวย acid alcohol และทาการ counterstain ดวย methylene blue โดยใชเวลาในการยอมสประมาณ 10-15
นาท สวนในหองปฏบตการของภาควชาพยาธโปรโตซว จะทาการยอมสพเศษเชอดวยวธ Rapid DMSO
modified acid fast ซงหลกการของวธนคลายกบการยอมสดวยวธ Modified acid fast แตจะมการเตรยมส
Carbol fuchsin ใน dimethylsulfoxide เปนการเพมประสทธการยอม ใหเรวขน นอกจากนยงมการทา
decolourization และ counterstain ไปพรอมกนดวยส malachite green ในสารละลาย acetic acid จงไมตองทา
การ decolourization ดวย acid alcohol อกรอบ ทาใหการยอมสพเศษดวยวธน ใชเวลาเพยง 8-10 นาทเทานน
วธการยอมนม ขนตอนทไมยงยาก สะดวกรวดเรว และใหผลการตรวจทชดเจนยงขน ทาใหการอานผลงาย
กวา มความไวและความจาเพาะสงกวาการยอมสพเศษดวยวธอนๆ
แนวทาง การแกไข คอ ผทาการตรวจวนจฉยเชอ จะมการแจง รายละเอยด แกเจาหนาท
หองปฏบตการจากโรงพยาบาลตางๆทจะสงตวอยางอจจาระมาตรวจ รวมทง เจาหนาทของ Laboratory
Center ของโรงพยาบาลเวชศาสตรเขตรอน ดวย โดยใหระบชอของชนดของเชอท ตองการตรวจวนจฉยให
ชดเจน และไมควรระบชอสยอมในใบสงตรวจ
45
5.2 การทาสเมยร
ปญหาทพบบอย ในการทาสเมยรสไลดสาหรบการ ตรวจเชอดวยวธ ดสด คอลกษณะอจจาระทสง
มาตรวจวนจฉยเชอ Cryptospridium spp. สวนใหญจะมลกษณะเปนมก ทาใหอจจาระมความเหนยวมาก ทา
ใหมการทาสเมยรสไลดยากมากขน
แนวทางการแกไข คอ การทาสเมยรไมควรหนาหรอบางเกนไป โดยการหยด NSS และ ไอโอดน
อยางละ 1-2 หยด ลงบนสไลด โดยหยดไวคนละดานของสไลดใชไมสะอาดเขยตวอยางอจจาระ หรอใชหลอด
หยดพลาสตกดดอจาระหลายๆแหง ใหไดขนาดประมาณเทาเมดถวเขยว (ควรเลอกบรเวณทมลกษณะเปนมก)
แลวละเลงทงใน NSS และ ไอโอดน ตามลาดบ คนใหเปนเนอเดยวกน แลวใช coverslip ปด และเพอไมใหม
ฟองอากาศเกดขน ควรเอยง coverslip ประมาณ 45 องศา แตะลงบนหยด NSS และ ไอโอดนทละเลงอจจาระไว
แลว คอยๆ ปลอย coverslip ลงชาๆ จากนนนาสไลดไปตรวจดวยกลองจลทรรศน วธทดสอบ การทาสเมยร
อจจาระทเหมาะสมสาหรบการดสดนน คอเมอสเมยรเสรจแลว นาไปวางทาบบนกระดาษหนงสอพมพ
ความหนาของสเมยรตองไมทบจนไมสามารถอานตวอกษรทอยดานลางของสเมยรได และไมบางจนไมม
เนออจจาระอยในสเมยร ซงการทาสเมยรอจจาระทด ตองสามารถอานตวหนงสอในหนงสอพมพได
การทาสเมยรสาหรบการยอมสทด คอใชไมจมฟนสะอาดเขยตวอยางอจจาระหรอใชหลอดหยด
พลาสตกดดอจาระหลายๆแหง ควรเลอกอจจาระ จากบรเวณทมมก และนาอจจาระนไปละเลงบนสไลด
สะอาด (ไมมไขมนเคลอบอย ) ทเตรยมไว โดยละเลงเปนวงกลม เพอเพมพนทและโอกาสในการตรวจพบ
เชอ จากนนจงนาไปทาใหแหงโดยนาไปผานเปลวไฟอยางรวดเรว และควรจะทงสไลด ใหแหงสนท ท
อณหภมหองกอนแลวจงนาไปยอมส ทงนควรปลอยสเมยรสไลดใหแหงสนทกอนเสมอ เพราะถาสเมยรไม
แหงแลวนาไปยอมส อาจทาใหตวเชอหลดและอาจตรวจไมพบเชอ ทาใหการตรวจวนจฉยผดพลาดได
การทาสเมยรนนมความสาคญมาก ความหนาของสเมยรตองเหมาะสม กลาวคอสเมยรตองไมหนา
หรอบางจนเกนไป ถาส เมยรหนาเกนไปจะทาใหตรวจไมพบหรอพบ oocyst ของเชอไดยาก (รปท 11 ก)
เนองจากจะมตะกอนของอจจาระซอนทบกน และตรวจพบ artifact เปนสวนใหญ ซง artifact อาจมรปราง
กลม ขนาดไมเทากน ขนาดใหญบางเลกบาง เมอยอมสจะ ตดสชมพเรยบสมาเสมอ แตจะไมมลกษณะของ
sporozoite อยภายใน (รปท 11 ข) หากสเมยรสไลดบางเกนไปอาจทาใหตรวจไมพบเชอ (รปท 11 ค) และทา
ใหการตรวจวนจฉยผดพลาดได
46
รปท 11 สไลดสเมยรอจจาระทหนาเกนไป (ก และ ข ) และบางเกนไป (ค) เมอทาการตรวจตรวจดวยกลอง
จลทรรศนธรรมดากาลงขยายสง 40X
การทาสเมยรทด นน จะ สามารถตรวจวนจฉยเชอไดอยางถกตอง และแมนยา แตทงนตองขนอย กบ
ประสบการณและความชานาญของผตรวจดวย
ขอดของการ ทาสเมยรเพอตรวจวนจฉยเชอดวยกาดสด ถงแมบางครงแพทยไมไดสงตรวจโปรโตซวตว
อนๆแตหากตรวจพบเชอโปรโตซวตวอนๆทมขนาดใหญ กวา เชอ Cryptosporidium spp. กสามารถรายงาน
ผลได ซงกจะเปนประโยชนตอการรกษาของผปวยเปนอยางมาก
5.3 การเตรยมสและการยอมสสเมยร
ขนตอนของการเตรยมสนนถอวามความสาคญเชนกน หากเตรยมสไมด อาจทาให oocyst ของเชอ
ยอมไมตดส การยอมสเมยรประกอบดวยส 2 ชนดคอ Carbol fuchsin ในสารละลาย DMSO และ Malachite
green การเตรยมส Carbol fuchsin มขนตอนการใชความรอนชวยทาใหสสก จากประสบการณพบวาความ
รอนทอณหภมประมาณ 56-60 องศาเซลเซยส นาน 5-10 นาท เปนเงอนไขทเหมาะสมทจะทาใหสสกดและ
ทาใหการตดส oocyst ชดเจนมากขน นอกจากนถายอมสไดดนนส background ควรเปนสเขยว (รปท 12 ก)
ปญหาทพบบอย คอ การตมส Carbol fuchsin หากตมไมสกจะทาใหลางสแดงออกยากมาก และ
เมอทาการยอมดวยส Malachite green แลวลางดวยนาประปา จะทาใหส background เปนสมวงแดง (รปท
12 ข) ซงทาใหการตรวจวนจฉยเชอยากและอาจผดพลาดได และการตมสหากใชความรอนนานเกนไป จะทา
ส Carbol fuchsin เขม และสงผลใหเมอยอมส oocyst ตดสแดงเขมหรอสมวงแดงได
47
แนวทางการแกไข คอ ในการเตรยมส Carbol fuchsin ในสารละลาย DMSO แตละครง ควรตมสให
สกในเวลาทเหมาะสมประมาณ 5-10 นาท เมอเตรยมสเรยบรอยแลว ควรมการ นาสไลดทเปน positive
control ของเชอ Cryptosporidium spp. มาทดลองยอม หากส Carbol fuchsin สกพอด จะทาให oocyst ของ
เชอตดสชมพหรอสแดง จากนนจงทาการยอมทบดวยส Malachite green โดยการยอมทดนน สพนควรเปนส
เขยว (Bronsdon, 1984) โดยสของ oocyst และสพนทมความแตกตางกนอยางชดเจน ทาใหงายตอการตรวจ
และวนจฉยเชอได
รปท 12 Background ของสเมยรอจจาระทยอมไดดจะตดสเขยว (ก) และหากยอมไมด background จะตดส
มวงแดง (ข)
การทาเตรยมสทดนน ทาใหประหยดเวลาในการลางสในขนตอนการยอม และการลางสดวยนาประปางาย
ขน เปนการประหยดนาประปาดวย
การยอมสสเมยรทดนน จะทาใหเหนส oocyst ของเชอและสของ background ทมความแตกตางกนอยาง
ชดเจน ซงทาใหการตรววนจฉยงายขน
48
5.3 การ mount สไลด
การ mount สไลดภายหลงการยอมสนน มประโยชนคอ ทาใหผตรวจสามารถมองเหน sporozoite
ทอยภายใน oocyst ไดชดเจนยงขน จากประสบการณของผเขยนพบวา หากไมได mount สไลด background
หรอสพนของสเมยรจะไมใส เมอทาการตรวจหาเชอ ภายใตกลองจลทรรศนทขนาดกาลงขยาย สงสด 100X
และใช oil สามารถพบ sporozoite แตอาจมองเหนรปรางไมชดเจน (รปท 13) นอกจากนการใชกาลงขยายสง
มากในการตรวจ ทาใหตองใชเวลานานมากในการตรวจ วนจฉย แตในสไลดทนาไป mount แลว ท
กาลงขยาย สง 40X กจะเหนส background ใสขน เหน oocyst ชดเจนยงขน และยงสามารถมองเหน
sporozoite ภายในไดอกดวย (รปท 14 ก และ ข) ในผปวยบางรายอาจม oocyst ออกมาในอจจาระจานวนนอย
และรปรางของ sporozoite ภายในกไมเปนรปเคยว ทาใหยากตอการวนจฉยและการรายงานผล (รปท 15 ก)
สวนใหญผปวยท sporozoite ภายในเปนรปเคยวและเหนไดชดเจน จะทาใหตรวจและรายงานผลไดงายขน
(รปท 15 ข) ในกรณ false positive คอยอมและตรวจพบลกษณะคลายเชอคอ สงทมรปรางกลม ขนาดไม
เทากน (ใหญบางเลกบาง) ยอมตดสชมพเรยบสมาเสมอ แตภายในจะไมพบลกษณะของ sporozoite (รปท 15
ค)
ปญหาทพบบอย คอ การเกดฟองอากาศในขณะทาการ mount สไลด
แนวทางแกไข โดยการใช forcep กดลงบน coverslip ใหฟองอากาศถกกดเคลอนออกมาภายนอก
แตหากยงไมสามารถไลฟองอากาศออกมาได ใหแชสไลดนนลงในสารละลาย xylene ซงจะทาให permount
ละลาย จงแยก coverslip ออกจากสเมยรสไลดได และทาการ mount สไลดใหมอกครง
รปท 13 Oocyst ของเชอ Cryptosporidium spp. ทไมชดเจนทพบในสไลดยอมสทไมไดทาการ mount และ
ทาการตรวจเชอดวยกลองจลทรรศนธรรมดาทกาลงขยายสงสด 100X
100X
5 µm
49
รปท 14 ความชดเจนของ oocyst ในสไลดทผานการ mount (ก) เปรยบเทยบกบสไลดทไมผานการ mount
(ข) และทาการตรวจดวยกลองจลทรรศนธรรมดาทกาลงขยายสง 40X
รปท 15 ลกษณะ oocyst ของเชอ Cryptosporidium spp. (ก และ ข) และ artifact (ค) ทยอมตดสคลาย oocyst
ของเชอทตรวจพบไดดวยกลองจลทรรศนธรรมดาทกาลงขยายสงสด 100X
50
ขอดของการ mount สไลด
1. ทาให oocyst ของเชอใสขน และสามารถตรวจ หาเชอดวยกลองจลทรรศน ธรรมดาทกาลง
กาลงขยายสง 40X ได
2. สไลดทยอมสเรยบรอยและผานการ mount สไลด โดยไมมฟองอากาศ จะสามารถเกบ เปน
สไลดอางองไดนานหลายป
ขอเสนอแนะ
การสงอจจาระเพอตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium spp. นนควรสงตรวจตดตอกนเปนเวลา 3
วน เนองจากเชอนจะออกมาในอจจาระไมสมาเสมอเชนเดยวกนกบในอจจาระของผปวยโรคบด มตวจากเชอ
อะมบา หากสงตวอยางอจจาระเพอตรวจวนจฉยเพยงครงเดยว อาจตรวจไมพบเชอ ทงๆทผปวยยงมอาการ
ทองเสยเรอรง ในผ ปวยบางรายทมการตดเชอไมรนแรง อาจม oocyst จานวนนอยในอจจาระ จงตองใชวธ
ตรวจททาใหเชอแบบเขมขนคอ Formalin-acetate sedimentation และวธ Sheather’s sucrose flotation เพอ
แยก oocyst ออกจากตะกอนอจจาระ ทาใหสามารถตรวจพบ oocyst มากขน
นอกจากนการยอมสไลดของผปวย ควรมสไลดทมเชอ Cryptosporidium spp. (positive control)
ยอมสควบคดวยทกครง เพอเปรยบเทยบคณภาพของสและ oocyst ของเชอดวยทกครง
51
บรรณานกรม
Betancount WQ, Peele ER, Rose JB. Review article Cryptosporidium parvum and Cyclospora
cayetanensis: a review of laboratory methods for detection of these waterborne parasites. J
Microbiol Methods 2002; 49: 209-24.
Bronsdon MA. Rapid Dimethyl Sulfoxide- Modified Acid Fast Stain of Cryptosporidium oocysts in stool
specimens. J Clin Microbiol 1984; 952-53.
Cui Z., Wang R., Huang J., Wang H., Zhao J., Luo N et al. Cryptosporidiosis caused by
Cryptosporidoium parvum subtype IIdA15G1 at a dairy farm in Northwestern China. Parasite &
Vectors 2014,7: 529.
Current W. Garcia L. Cryptosporidiosis. Clin Microbiol Review 1991; 325-28.
Garcia LS, Bruckner DA, Brewer TC, Shimizu RY. Techniques for the recovery and identification of
Cryptosporidium oocysts from stool specimens. J Clin Microbiol 1983; 18:185-90.
Hijjawi NS, Meloni BP, Morgan UM, Thompson RCA. Complete development and long-term
maintenance of Cryptosporidium parvum human and cattle genotypes in cell culture. Int J Parasitol
2001; 31: 1048-55.
Hijjawi NS, Meloni BP, Ng’anzoc M, Ryana UM, Olsonc ME, Coxd PT, et al. Complete development of
Cryptosporidium parvum in host cell-free culture. Int J Parasitol 2004; 34: 769-77.
Http://www.gotoknow.org.
Jokipii L, Pohjola S, Jokipii AMM. Cryptosporidium: a frequent finding in patients with gastrointestinal
symptoms. Lancet 1983; 358-61.
Ma P. Laboratory diagnosis of coccidiosis, in L. Leive and D. Schlessinger (ed.), Microbiol -184.
American Society for Microbiol, Washington, D.C 1984; 224-31.
Ma P, Soave R.. Three-step stool examination for cryptosporidiosis in 10 homosexual men with protracted
watery diarrhea. J Infect Dis 1983; 147: 824-28.
Nanduri J, Williams S, Aji T, Flanigan TP. Characterization of an immunogenic glycocalyx on the
surfaces of Cryptosporidium parvum oocysts and sporozoites. Infect Immun 1999; 67: 2022-24.
Nime FA, Burek JD, Page DL, Holscher MA, Yardley JH . Acute enterocolitis in a human being infected
Acute enterocolitis in a human being infected with the protozoan Cryptosporidium. J Gastroenterol
1976; 70: 592-98.
Ryan U., Hijjawi N. New developments in Cryptosporidium research Int J parasitol 2015;367-73.
52
Tyzzer EE. A sporozoan found in the peptic glands of the common mouse. Proc Soc Exp Biol Med 1907;
5: 12-13.
Vejdani M, Mansour R, Hamzavi Y, Vejdani S, Nazeri N, Michaeli A, et al. Immunofluorescence Assay
and PCR Analysis of Cryptosporidium Oocysts and Species From Human Feacal Specimens.
Jundishapur Microbiol 2014; 7(6): e10284.
เทวนทร อนปนแกว , พพฒน อรณวภาส, นงนช ภญโญภานวฒน ,วษณวฒน ฉมนอย, สถาพร จตตปาลพงศ.
ความชก ปจจยเสยง และการแยกสายพนธกรรมของเชอ Cryptosporidium spp. จากอจจาระของโคนม
ในเขตจงหวดสระบร กาญจนบรและนครปฐม.การประชมทางวชาการของมหาวทยาลยเกษตรศาสตร
ครงท 47; 2552.
ภาควชาพยาธโปรโตซว. หนงสอการตรวจทางหองปฏบตการเพอหาเชอโปรโตซวในโรคเอดส. 2542.
ประยงค ระดมยศ, อญชล ตงตรงจตร, ศรวชา ครฑสตร, พลรตน วไลรตน สภลคน โพธพฤกษ . หนงสอคมอ
Atlas of Medical Parasitology. ภาพพมพ 2556.
วฒนพงศ วทธา , ภารด มามชย , ปรชา ปญญารกกจ . การประเมณผลการสอบเทยบระหวางหองปฏบตการ
ของเชอ Cryptosporidium parvum.การประชมวชาการกรมวทยาศาตรการแพทยครงท 9; 2542.
สถาพร จตตปาลพงศ, นงนช ภญโญภานวฒน , วษณวฒน ฉมนอยม, บรนทร นมสพรรณ , จฑาทพ ศรพนธ.
การตรวจหาเชอ Cryptosporidium จากอจจาระของโคนมในประเทศไทยโดยวธ enzyme
immunoassay (Prospect T) และวธ sheather sucrose centrifugation รวมกบการยอมสแอซดฟาส .
มหาวทยาลยเกษตรศาสตร; 2543.
อมร เหลกกลา, จนทรา สทธกรชย , ยบลรตน สวรรณคร , พนธพบ เลศลายตวน , เยาวลกษณ สขธนะ . การ
เปรยบเทยบการตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium parvum หองปฏบตการ 3 แหง. วารสารวจย
รายงานสาธรณสข 2009; 524-37.
ภาคผนวก
ตารางขอมลการสงตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium spp., C. belli และ C. cayetanensis ดวยวธยอมส
พเศษ Rapid DMSO modified acid fast ของภาควชาฯ จากตวอยางอจจาระของผปวย ในโรงพยาบาล
เวชศาสตรเขตรอนและจากหนวยงานตางๆ ทวประเทศ (ระหวางป พ.ศ. 2555 - 2557)
ขอมลสงสง
ตรวจ
Cryptosporidium spp. C. belli C. cayetanensis
2555 2556 2557 2555 2556 2557 2555 2556 2557
จานวน case
ทงหมด
25 30 31 15 8 14 7 2 9
ชาย 12 16 20 8 4 9 4 1 5
หญง
10 10 9 4 2 4 2 1 4
เดก (ไมทราบ
เพศและอาย)
3 2 0 3 2 1 1 0 0
งานประเมน
คณภาพของ
หองปฏบตการ
ปรสตวทยา
(5 หนวยงาน)∗
- 2 2 - - - - - -
ผลการตรวจ
- พบเชอ
- ไมพบเชอ
- 4 4 - 1 3 1 1 -
25 26 27 15 7 11 6 1 9
รวม 86 37 18
ระหวางป พ.ศ. 2555 - 2557 opportunistic protozoa ทภาควชาฯไดใหบรการตรวจวนจฉยมากทสดคอเชอ
Cryptosporidium spp. รองลงมาคอเชอ C. belli และ เชอ C. cayetanensis ตามลาดบ ในการตรวจวนจฉยนนจะ
ตรวจหาเชอทไดระบไวในใบสงตรวจทสงมาพรอมกบตวอยางสงสงตรวจเทานน
∗เปนการตรวจประเมนคณภาพของหองปฏบตการปรสตวทยาของหนวยงาน 5 แหง ไดแก 1. ภาควชาปรสต
วทยา คณะแพทยศาสตรศรราชพยาบาล ม. มหดล 2. ภาควชาปรสตวทยา คณะเทคนคการแพทย ม. มหดล 3. งาน
หองปฏบตการเวชศาสตรชนสตร คณะเวชศาสตรเขตรอน ม. มหดล 4. สาขาวชาโรคตดเชอและอายรศาสตรเขต
รอน ภาควชาอายรศาสตร คณะแพทยศาสตรศรราชพยาบาล ม. มหดล 5. หองปฏบตการจลทรรศนศาสตรคลนก
ภาควชาพยาธวทยา คณะแพทยศาสตรโรงพยาบาลรามาธบด ม. มหดล
กราฟแสดงการใหบรการตรวจวนจฉยเชอ Cryptosporidium spp. เชอ C. belli และเชอ C. cayetanensis ดวย
วธยอมสพเศษ Rapid DMSO modified acid fast ทภาควชาพยาธโปรโตซว ระหวางป พ.ศ. 2555 - 2557
0
5
10
15
20
25
30
35
Cryptosporidium spp. C. belli C.cayetanensis
25
15
7
30
8
2
31
14
9
2555
2556
2557
จานวนผ ปวย
ชนดเชอฉวย
โอกาส