811307 Genetics of aquatic animal

การปรบปรงพนธโดยการจดชดโครโมโซม

อ. ดร. ชล ไพบลยกจกล

การจดชดโครโมโซม

• การเหนยวน าใหเกดการเพมชดโครโมโซม(polyploidization)• การเหนยวน าใหเกด gynogenesis และ

androgenesis

การเหนยวน าใหเกด polyploid

• polyploid ในปลามอตราการรอดสง• triploid และ tetraploid• triploid --> monoploid (n) + diploid (2n) เปน

gamete ทไมมการลดชดโครโมโซม พบในปลาsalmon, ปลา rainbow trout

• tetraploid --> การแบงเซลลผดปกต หรอการปฏสนธระหวางไขและน าเชอทมโครโมโซม 2 ชดใชประโยชนในการผลตปลา triploid พบในปลาไซปรนดโลช (Misgurnus anguilicaudatus)

วตถประสงคในการท า polyploid

• สตวน าทเปน triploid อาจเจรญเตบโตดกวาdiploid เนองจากโครโมโซมมากขน อาจท าใหเซลลใหญขน• ท าใหสตวน าเปนหมน มการ gamete ไมสมบรณใชประโยชนในปลา salmonid, ปลานล, หอย

หลกการเหนยวน าใหเกด polyploid

• การ shock เพอใหไขเกบ polar body เพอผลตtriploid• การ shock เพอยบยงการแบงเซลลครงแรกของ

zygote (suppression of first cleavage) เพอผลตtetraploid

ปจจยทก าหนดความส าเรจในการเหนยวน า

• เวลาเรม shock --> เวลาทไขก าลงก าจด polarbody หรอ เมอ zygote ก าลงจะแบงเซลลครงแรก•อตราการฟก•อตราการเกด polyploid

• ระยะเวลาในการ shock• เวลาสน --> อตราฟกสง, อตราการเกด

polyploid ต า• เวลานาน --> อตราฟกต า, อตราการเกด

polyploid สง•อณหภม

วธการ shock และระดบการ shockทเหมาะสม

• การ shock ดวยความดนน า (hydrostatic pressureshock) 6000-8000 psi•แตกตางกนตามชนดของสตวน า•มประสทธภาพดในการยบยงการแบงเซลลแบบ mitosis•ความแปรปรวนต า

• การ shock ดวยอณหภม– sublethal temperature จะท าลาย spindle fiber ท าใหโครโมโซมเพมจ านวนขน– การ shock ดวยความเยนจะยบยงการแบงเซลลระยะ anaphase II มผลในชวงแคบ ใชในปลาเขตรอน เชน ปลาเฉา, ปลานล, ปลาดก– การ shock ดวยความรอนจะท าลาย spindle fiberใชไดดในปลาเขตหนาว และปลาเขตรอนบางชนด เชน ปลาหมอเทศ, ปลาไน, ปลากด

– ตองหาอณหภมและระยะเวลาทเหมาะสมส าหรบการ shock– ความแตกตางของอณหภม– มความแปรปรวนสง --> อณหภมกอนการฟก,ขนาดไขทเปลยนแปลงตามขนาดแมพนธและฤดกาล

• การ shock ดวยสารเคม– colchicine, cytochalasin-B, nitrous oxide และยาสลบหลายชนด– colchicine ยบยงการสราง spindle fiber– cytochalasin-B ยบยงการแบง cytoplasm นยมใชในหอย

• การ shock ดวยหลายวธรวมกน

ประสทธภาพของการ shock

• ความดน > อณหภม > สารเคม• ความดน มผลตอไขขนาดตาง ๆ เทากน• การ shock ดวยความรอนหรอความเยน ประสทธภาพขนกบชนดของสตวน า• สารเคมมประสทธภาพต า เนองจากสารตกคางภายหลงการ shock

การตรวจสอบสภาพ polyploid

• การนบจ านวนโครโมโซม– ไดผลแนนอนทสด– ตองฆาตวอยางสตวน า– ใชเวลามาก

• การวดปรมาตรของ nucleus ของเซลลเมดเลอดแดงหรอปรมาตรของเมดเลอดแดง– เซลลของ polyploid จะตองม nucleus ขนาดใหญขน และมปรมาณ DNA เพมขน

• การวดปรมาณ DNA ในเซลลโดยใชวธ flowcytometry– น าเลอดของสตวน าทตองการทดสอบมายอยดวย

RNAase เตมสารเรองแสง น าไปวดดวย flowcytometer เครองจะแสดงกราฟปรมาณ DNA

คณสมบตของสตวน า polyploid

• ขนาดตวไมแตกตางจากปลา diploid– ปลา triploid มขนาด nucleus 1.5-1.7 เทาของปลา diploid– ขนาดของเซลลเพมขน แตจ านวนเซลลลดลง

• การเจรญเตบโต– กอนวยเจรญพนธไมมความแตกตาง– ระยะวยเจรญพนธ triploid โตดกวา อตราแลกเนอดกวา เนองจากเปนหมน

• ปลา triploid เปนหมน– ยกเวน กลม salmonids และปลาตะเพยน– เพศผม testis เลกลง สามารถสราง sperm ได

การสรางประชากร triploid เพศเมยลวน

• ใชน าเชอจากปลาทไดจากการแปลงเพศจากเพศเมยเปนเพศผ• ใชไดกบปลาทมระบบการควบคมเพศแบบทเพศเมยสราง gamete เพยง genotype เดยว

การสรางประชากร triploid เพศผลวน

• เปลยนเพศปลาใหเปนเพศเมยโดยการใหฮอรโมนเพศเมย• น าปลาทไดผสมกบเพศผปกต ตรวจสอบอตราสวนเพศของลก

• ปลาเพศเมยตวใดใหลกเพศผตอเพศเมยใกลเคยง 1:2 หรอ 1:3 แสดงวาม genotype เปน XY• น าไขจากปลาเพศเมยทม genotype เปน XY มาผสมกบปลาเพศผปกต แลวน าไป shock จะไดปลา triploid ทม genotype เปน XXY หรอ XYYเปนเพศผลวน

Gynogenesis

• สารพนธกรรมของเชอตวผเสยคณสมบต(inactivation)• ไขทไดรบการผสมเพมจ านวนโครโมโซมเปน 2ชด• พบในปลา crucian carp, Carassius auratus

gibelio และปลาในสกล Poecilia และPoeciliopsis

หลกการเหนยวน า gynogenesis

• เหนยวน าไดครงแรกโดย Hertwig (1911)• ผสมไขกบเชอตวผทถกท าลายสารพนธกรรมแลว

(inactivated sperm)• เชอตวผจะกระตนใหไขเกดการแบงเซลล

meiosis II

• เมอสนสดการแบงเซลลไขจะก าจด polar bodyชดท 2 ออก เหลอเพยงโครโมโซม 1 ชด• ไขสามารถพฒนาเปนตวออนไดถงระยะตาง ๆแลวแตชนดปลา แตสวนใหญจะตายจากการมโครโมโซมชดเดยว เรยกวา haploid syndrome• การท าลายสารพนธกรรมของเชอตวผ (sperm

inactivation)• การเหนยวน าให zygote มโครโมโซม 2 ชด

(diploidization)

การท าลายสารพนธกรรมของเชอตวผ(sperm inactivation)

• ใชการฉายรงส ท าลายเฉพาะสารพนธกรรม ไมท าใหเซลลตาย• ท าใหเกดการจบกนของ pyrimidine ทอยบน DNAท าให DNA เสยสภาพ

• ผนง nucleus และเยอหม cytoplasm ของเชอตวผถกท าลาย ท าให nucleus ของเชอตวผถกยอยดวย enzyme ภายใน cytoplasm ของไข• gamma ray และ x ray• หาความเขมทเหมาะสมของรงสทใช• ความเขมทดทสด คอ ความเขมทใหลกปลาทมโครโมโซมหนงชดทงหมด และมอตราการฟกสงสด

• กราฟระหวางความเขมของรงสกบอตราการฟกเรยกวา Hertwig effect• การน า inactivated sperm มาผสมกบไข อาจท าใหเกดลกปลา diploid gynogenesis ได เพราะในไขปลาบางชนดมแนวโนมทไขจะไมก าจด polarbody ชดท 2 ดงนนในการท าควรมฉลากพนธกรรม (genetic marker) เพอยนยนผลการทดลอง

การใช genetic marker

• ใชไขจากแมปลาทม genotype เปน homologousของยนแฝง ซงเปนลกษณะทปรากฏชดเจน เชนลกษณะเผอกในปลาดก ลกษณะเกลด mirror ในปลาไน ถามเชอตวผมาผสมแลวลกปลาทไดมลกษณะเดน แสดงวาเกดจากการผสมกบเชอตวผสารพนธกรรมในเชอถกท าลายไมหมด

• ใชน าเชอจากปลาตางชนด น าเชอของปลาแตละชนดมประสทธภาพในการกระตนไมเทากน– ตองทราบวาเชอทน ามาใชสามารถผสมกบไขได– ลกผสมทไดควรตายกอนฟกเปนตว– หากเปนตวควรมลกษณะแตกตางจากลกปลา

gynogenesis อยางชดเจน

การเตรยมน าเชอเพอฉายรงส

• เจอจางน าเชอดวย เกลอแกง 0.85%, Ringer’ssolution, Hank’s solution• ultraviolet อ านาจทะลทะลวงต า ความเขมขนของน าเชอมผลตอระยะเวลาการฉายรงส

Hertwig effect

การคนสภาพของสารพนธกรรมโดยการกระตนดวยแสง (photoreactivation)

• การท าลายสารพนธกรรมเชอตวผดวย ultravioletถาปลอยใหไขไดรบแสงสวางภายหลงการผสมน าเชอฉายรงสกบไข จะท าใหสวนของสารพนธกรรมทถกท าลายแลวคนสภาพเดมได เรยกวาphotoreactivation

• เกดจากพนธะระหวางเบส pyrimidine ทเกดจากการฉายรงสถกท าลายดวย photoreactivationenzyme ซงมอยในไข enzyme จะท างานเมอมแสงสวาง (300-500 nm)

การเหนยวน าใหโครโมโซมเพมเปน 2 ชด(diploidization)

เหนยวน าโดยวธเดยวกบการเหนยวน าใหเกดpolyploid

การเหนยวน าท าได 2 ระยะ คอการเกบ polar bodyชดท 2 และ การยบยงการแบงเซลลครงแรกของzygote

• การเหนยวน าโดยการเกบ polar body ชดท 2เปนการยบยงขนตอนการแบงเซลลแบบ meiosisII แทงโครโมโซมมการแลกเปลยนชนสวนกบrecombinant chromosome ลกปลาทไดจะเปนheterozygous เรยกวา meiotic gynogenesis

• ถาเหนยวน าการเพมชดโครโมโซมในระยะกอนการแบงเซลล mitosis I ซงเปนระยะโครโมโซมจ าลองตวเองขนมา โดยไมมการแลกเปลยนทอนสวนของโครโมโซม โครโมโซมทเหมอนกนจะอยในเซลล ๆ เดยว ลกปลา gynogenesis ทเกดขนจะมยนทกต าแหนงอยในสภาพ homologousเรยกวา mitotic gynogenesis

ลกษณะของปลาทเกดจากการเหนยวน าgynogenesis

• ลกษณะทวไป เหมอนกบปลาทเปนแม• มระดบการผสมเลอดชดสง มกแสดงลกษณะดอยออกมามากวาลกปลาจากการผสมปกต• อตราการรอดต า ลกปลาพการคอนขางมาก• อตราการเจรญเตบโตต า

• เพศของลกปลา หากใชปลาทเพศเมยมการสรางเซลลสบพนธชนดเดยวจะไดลกปลาเพศเมยลวนเชน ปลาไน, ปลาเฉา, ปลาดกอย, coho salmon• หากการก าหนดเพศเปนแบบเพศเมยสรางเซลลสบพนธทม genotype ตางกน ลกปลาสวนใหญจะเปนเพศผ• แตเพศของลกปลาทไดอาจไดรบอทธพลจากสงแวดลอม เชน อณหภม และ modifying gene

การประยกตใชเทคนคการเหนยวน าgynogenesis

• การสรางประชากรปลาเพศเมยลวน (all-femalepopulation)– ใชกบปลาทมระบบก าหนดเพศแบบ XY และ

XO– ประโยชน– ปลาบางชนด ปลาเพศเมยโตดกวาปลาเพศผ– สรางปลาเพศผทมพนธกรรมเพศเมย

• การสรางปลาสายพนธแท• การสรางปลาโคลน (genetic clone)• การท าแผนทระหวางยน – centromere• การศกษาแบบแผนของพนธกรรมควบคมเพศ

การเหนยวน า androgenesis

• การทเชอตวผเจรญเปน zygote โดยไมเกดการปฏสนธกบไข• หลกการเดยวกบการเกด gynogenesis เพยงแตท าลายโครโมโซมของไขแทน• gamma ray และ x ray

• การเหนยวน าใหเกด diploidization ท าไดขนตอนเดยว คอการยบยงการแบงเซลล mitosis I ซงท ายาก• ประโยชน– ผลตสตวน าสายพนธแท– อนรกษเชอพนธกรรม