บทปฏิบัติการ อาหารและการให้อา ...fishtech.rmutsv.ac.th/fishtech3/Fishtech_SAR55/4.0.3...บทปฏ บ ต การ อาหารและการให

บทปฏบตการ

อาหารและการใหอาหารสตวนา

เรยบเรยงโดย

ผชวยศาสตราจารย ดร.ปรดา ภม

คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลยการประมง

มหาวทยาลยเทคโนโลยราชมงคลศรวชย วทยาเขตตรง

nexzza

Text Box

เอกสารหมายเลข 11

nexzza

Text Box

FISHTECH 4.0.3-02(3)

คานา

คมอปฏบตการ อาหารและการใหอาหารสตวนา เรยบเรยงขนเพอใชประกอบการสอนนกศกษาระดบ

ปรญญาตร สาขาเทคโนโลยการประมง คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลยการประมง มหาวทยาลยเทคโนโลย

ราชมงคลศรวชย ไดปรบปรงเนอหาใหสอดคลองกบเนอหาทฤษฎ ใหนกศกษาไดฝกปฏบต กอใหเกดทกษะ

และประสบการณดานอาหารสตวนามากยงขน

หวงเปนอยางยงวา คมอปฏบตการน จะเปนประโยชนแกนกศกษาในสาขาเทคโนโลยการประมง และ

สาขาอนทเกยวของ รวมถงผทสนใจทวไป

ปรดา ภม

พฤศจกายน 2555

สารบญ

หนา

บทปฏบตการท 1 แนะนาการใชเครองมอ 1

บทปฏบตการท 2 การคานวณปรมาณอาหาร 4

บทปฏบตการท 3 การวเคราะหความชน 9

บทปฏบตการท 4 การวเคราะหเถา 11

บทปฏบตการท 5 การวเคราะหไขมน 13

บทปฏบตการท 6 การวเคราะหโปรตน 16

บทปฏบตการท 7 การวเคราะหเยอใย 20

บทปฏบตการท 8 การผลตอาหารสตว 22

ภาคผนวก ก การคานวณหาปรมาณคารโบไฮเดรต

ภาคผนวก ข การเตรยมสารละลาย

24

25

สารบญภาพ

หนา

ภาพท 1 การแบงสวนประกอบทางเคมของอาหารสตว 6

ภาพท 2 ตอบลมรอน (hot air oven) 10

ภาพท 3 เตาเผา (muffle furnace) 12

ภาพท 4 เครองวเคราะหไขมน 15

ภาพท 5 ชดวเคราะหโปรตน

ภาพท 6 เครองวเคราะหไฟเบอร

19

21

1

ปฏบตการท 1 แนะนาเครองมอ

วตถประสงค เพอใหนกศกษาเขาใจการใชเครองมอ และอปกรณทใชในหองปฏบตการวเคราะหอาหารสตวไดถกตอง และปลอดภย

เครองมอในหองปฏบตการ

1. โถดดความชน หรอ โถอบแหง (Desiccator) โถดดความชนใชสาหรบใสสงของทไมตองการใหสมผสกบความชน วสดทใชเปนแกวใส ม 2 สวน

คอ ฝา และทใสสงของ ซงมสารดดความชน (silica gel) บรรจอยดานลาง ซงทาใหอากาศภายในแหงอยเสมอ (สารดดความชนมสนาเงน หากเปลยนเปนสชมพ หรอสชมพอมมวง แสดงวา มความชนในโถดดความชน จงไมควรใช ใหนาสารดดความชนมาอบในตอบแหง ท 100 องศาเซลเซยส นาน 3 ชวโมง จนความชนหมดไป (สนาเงน) ) เมอนาตวอยางอาหารททาการวเคราะหออกจากตอบ หรอเตาเผา แลวปลอยทงไวใหเยนในโถดดความชน ตวอยางอาหารนนจะไมดดความชนเขาไปอก

การใชโถดดความชน 1. การเปดฝา อยายกฝาขนตรง ๆ ใหใชมอจบสวนลางของโถดดความชน และใชมออกขางจบฝาให

แนน แลวดนฝาออกจากตว ชา ๆ ในแนวตรง (Slide) แลวใชมอประคองอกดานของฝาโถดดความชน ไวไมใหตก หากทฝาโถดดความชน มจกเปดใหอาการภายนอกเขา อยาจบทจกนน จะทาใหแตกหกได

2. หยบสงของทตองการ แลวปดฝาโถดดความชนทนท อยาเปดฝาทงไว 3. หากเปดฝาไมออก ใหหมนปมทสวนบนสดของฝา ใหลมออกมา เพอลดแรงดน แลวหมนปม

ใหแนนดงเดม

2. เครองชง 4 ตาแหนง การใชเครองชง 4 ตาแหนง ตองใชดวยความระมดระวง เนองจากมความไวสง ตอการเปลยนแปลง

ตาง ๆ เชน อณหภม ความสนสะเทอน กระแสลม เปนตน หามเคลอนยาย และวางบนพนเรยบ และแขงแรง

วธการใชเครองชง 1. ตรวจสอบใหเครองชงอยในแนวระนาบ เพอความถกตองในการชง โดยดทดานหลงของ

เครองชง ใหหยดลกนาอยกลางวงกลม 2. เปดเครอง (Worm up) โดยกดลง รอประมาณ 5 นาทกอนใชเครองชง ใหเครองชงตงคา

ตาง ๆ ใหเสรจเรยบรอย 3. นาตวอยางวางบนจาน ปดเครอง ชงทกดาน ปองกนลม รอจนตวเลข หยดนง จงอานคา

แลวนาตวอยางออก

2

ขอแนะนาในการใชเครองชง 1. ควรมการ Caribate สปดาหละครง เพอทดสอบความเทยงตรง 2. หามเคลอนยาย 3. ตอง Worm up เครองชงกอนทกครงทเปดเครองชง 4. หลงใชเครองชงตองทาความสะอาดทกครง และใชถงคลม ปองกนฝนละออง

3. ตอบแหง (Hot air oven; Oven) ใชสาหรบอบวสด เครองแกว หรอวตถดบอาหารสตว ใหแหง โดยการใชลมรอน ทาใหนาทตดกบ

วสด เครองแกว หรอวตถดบอาหารสตว ระเหยออกไป วธการใช 1. เปดสวทต (0n) โดยหมน ปมมาท I 2. กาหนดอณหภมทตองการ โดยกด SET คางไว พรอมหมนปม ไปทางซาย (เพมอณหภม) หรอ

ขวา (ลดอณหภม) ชา ๆ จนไดอณหภมทตองการ

4. เตาเผาความรอนสง (Muffle furnace) วธการใช 1. เปดฝาตโดยคอย ๆ ยกฝาขน ใหสด 2. นาภาชนะทบรรจตวอยางใสในต วางใหเปนระเบยบ และมระยะหางกนเลกนอย เพอการ

ขยายตวของภาชนะเมอโดนความรอน 3. เปดสวทต และกาหนดอณหภม โดยกด SET คางไวพรอมกดปม หรอ จนได

อณหภมทตองการ 4. ปดเครอง ประมาณ 30 นาท เพอใหอณหภมลดลง กอนเปดฝา นาภาชนะใสในโถดดความชน

5. ชดวเคราะหไขมน

ชดวเคราะหไขมน ประกอบดวยอปกรณ 3 สวน คอ ชดสกดไขมน (Soxtherm) ซงตอกบเครองควบคมความรอน (SE-TR controller) ชดหลอเยน (Cooling part) ชดปมลม (Air pressure) วธใช

1. เปดเครองควบคมความรอน เปดปมลม และชดหลอเยน ใหสงเกตทพดลม จะหมน แสดงวามนาหมนเวยนด

2. นาบกเกอรใสในชดสกดไขมน โดยหมนปม (ดานขวามอ) ขน นาบกเกอรใสใหพอด เมอใสบกเกอรครบแลว ใหหมนปม (ดานขวามอ) ลง กนบกเกอร จะสมผสพอดกบแทนใหความรอน

3. เมอสกดไขมนเสรจแลว ใหหมนปม (ดานขวามอ) ขน เพอนาบกเกอรออกจากเครอง

3

6. ชดวเคราะหโปรตน ประกอบดวย 2 สวน คอ เครองยอยโปรตน และ เครองกลนโปรตน

การใชเครองยอยโปรตน 1. นาหลอดยอยใสใน rack แลวนาไปวางบนเตา พรอมตอเขากบเครองดกไอกรด 2. เปดวาลวนา เปดเครองดกไอกรด สงเกต การเกดฟองอาการภายในขวด 3. เปดสวทตเครองยอยโปรตน และกาหนดอณหภม โดยกด SET คางไวพรอมกดปม หรอ

จนไดอณหภมทตองการ ขอควรระวง

กรณตวอยางทตองการยอยมไมครบกบจานวนหลอดของเครอง ตองใสหลอดเปลาใหครบ เพอรกษา

ประสทธภาพการดดไอกรด

การใชเครองกลนโปรตน 1. ตรวจเชคระบบสายยางตางๆ และ tank สารเคมใหพรอมใชงาน 2. เปดระบบนาหลอเยนทตอเขาเครองกลน 3. นาหลอดยอยทเตมนากลน 50 ml ใสในเครอง (ดานซาย) และขวดปากแคบวดปรมาตร

(ขวดเปลา) นาไปวางทเครองกลนโปรตน (ดานขวา) 4. เปดเครอง รอประมาณ 5 นาท เมอเครองพรอมทางานจะแสดงหนาจอ ดงน 5. เลอกเมน Method Execution โดยการหมนปมไปทางขวา 6. เลอกโปรแกรม M01 clean 7. เลอก continue (ขนตอนน อาจทาซา 2-3 ครง จนกวาจะสะอาด) 8. นาหลอดยอย (ทมตวอยาง) ใสในเครอง (ดานซาย) และขวดปากแคบวดปรมาตร (ซงบรรจ

กรดบอรค) นาไปวางทเครองกลนโปรตน (ดานขวา) โดยใหปลายของหลอดแกวทตอจากกระบอกแกวควบแนนของเครองกลนโปรตน จมอยในกรดบอรค

9. เลอกเมน Method Execution แลวเลอกโปรแกรม M00 Test 10. เลอก continue 11. เมอกลนเสรจ นาหลอดยอย และขวดปากแคบวดปรมาตร ออกจากเครองกลนเพอนาไปไต

เตรทตอไป ขอควรระวง

1. ควรลางเครอง (โดยใชโปรแกรม M01 Clean) กอน และหลงจากใชเครองทกครง 2. หากมตวอยางทตางกนในการกลนคราวเดยวกน ตองลางเครองกอนจะกลนตวอยางตอไป

Vapodest 30s Standby

4

ปฏบตการท 2 การคานวณปรมาณอาหาร

วตถประสงค เพอใหนกศกษาสามารถ ประเมนอตรารอด อตราการเปลยนอาหารเปนเนอ และคานวณปรมาณอาหารทใหแกสตวนา ไดถกตอง

การใหอาหารสตวนา มความสาคญตอการเลยงสตวนามาก ปรมาณอาหารทใหตองเพยงพอ สตวนาจงโตเรว หากใหอาหารมากเกนไป จะเปนผลเสยตอสตวนา อาจทาใหสตวนาตายได การคานวณปรมาณอาหารทใหแกสตวนา จงมความจาเปน และสาคญมาก ทนกศกษาควรมความเขาใจ เพอสามารถจดการการเลยงสตวนา ไดถกตองเหมาะสม

การคานวณปรมาณอาหาร

Daily Feed Consumption = Biomass × Feeding Rate การคานวณอตรารอด ประมาณไดจาก ปรมาณอาหารทกน โดยการคานวณกลบ Standing Biomass = Daily Feed Consumption (kg) Feeding Rate Number of fish = Standing Biomass Average Body Weight

Survival Rate = Number of fish × 100 Number of fish Stocked การตรวจสอบการเจรญเตบโต อตราการเจรญเตบโต จะวดในรปของเปอรเซนตนาหนกทเพมขน (percentage weight gain) หรออตราการเจรญเตบโตจาเพาะ (specific growth rat ; SGR)

1.1 % WG = นาหนกเฉลยสดทาย – นาหนกเฉลยเรมตน × 100 นาหนกเฉลยเรมตน

1.2 % SGR = ln นาหนกเฉลยสดทาย – ln นาหนกเฉลยเรมตน × 100 จานวนวน

5

ประสทธภาพของอาหาร 1. อตราการเปลยนอาหารเปนเนอ (Feed Conversion Ratio ; FCR) FCR = ปรมาณอาหารทกน นาหนกทเพมขน 2. Feed efficiency (FE) FE = นาหนกทเพมขน / ปรมาณอาหารทกน

3. Protein efficiency ratio (PER) PER = Increase in body weight / Amount of protein intake 4. Net protein utilization (NPU) or Productive protein value (PPV) NPU = protein content of fish at end of exp - protein content of fish at start of exp

Amount of protein intake in dry weight

6

การวเคราะหคณภาพอาหารสตวโดยวธประมาณ (Proximate analysis) โดยทวไปการวเคราะหคณภาพอาหารสตวทาได 3 วธ คอ

1. วธทางกายภาพ (Physical ananlysis) เปนการศกษาอาหารสตวอยางหยาบ คอ ดดวยตา และดมกลน ซงเปนวธทงาย สะดวก รวดเรว สามารถตรวจสอบในขนแรก ไดวาอาหารชนดนน ๆ มคณภาพดหรอไม กอนนาไปวเคราะหโดยวธประมาณตอไป

2. วธทางเคม หรอวธประมาณ (Chemical or proximal analysis) เปนการวเคราะหคณภาพอาหารสตวในหองปฏบตการ ซงตองใชเวลามาก คาใชจายเกยวกบอปกรณ เครองมอ สารเคม คอนขางสง แตคาทไดถกตองและเมนยา

3. วธทางชวภาพ (Biological procedure) เปนวธททดลองกบสตวทดลอง ซงตองเสยคาใชจายในเรองสตวทดลอง โรงเรอน และอปกรณทใชทดลองสงมาก เพราะนอกจากตองใชสตวทดลองจานวนมากแลว จาเปนตองวเคราะหอาหารสตวโดยวธประมาณควบคไปดวย

หลกการวเคราะหคณภาพอาหารสตวโดยวธประมาณ การวเคราะหคณภาพอาหารสตวโดยวธประมาณ คดคนขนมากวา 100 ปแลว โดยนกวทยาศาสตร 2 ทาน คอ เฮนเนเบอรก (Henneberg) และสโตแมน (Stohmann) ทสถานคนควาและทดลองวนเด ในประเทศเยอรมน โดยเรยกวธวเคราะหนวาวธประมาณ (proximate analysis หรอ Weende system) ซงวเคราะหหาสวนประกอบทางเคมของอาหารสตว 6 ชนด คอความชน โปรตน ไขมน สารเยอใย แรธาตหรอเถา ไนโตรเจนฟรเอกซแทรก ตามภาพท 1 อาหารสตว วตถแหง นาหรอความชน สารอนนทรย สารอนทรย แรธาตหรอเถา โปรตนรวม ไขมน คารโบไฮเดรต โปรตนทแทจรง สารประกอบ ไนโตรเจนฟรเอกซแทรก สารเยอใย ไนโตรเจนท ไมใชโปรตน ภาพท 1 แสดงการแบงสวนประกอบทางเคมของอาหารสตว ทมา : เสาวนต (2529)

7

นาหรอความชน (Water or moisture) การเปรยบเทยบคณคาทางอาหารของอาหารสตวแตละชนด ในชนแรกตองพจารณาดเปอรเซนตความชนกอน อาหารชนดใดมเปอรเซนตความชนมาก ทาใหเปอรเซนตของวตถแหงลดลง การวเคราะหเปอรเซนตความชน ไมใชความชนทแทจรง แตมสวนของไขมนทระเหยไดงาย (Volatile fatty acid) และสวนของนาตาลบางตวทถกทาลายทอณหภมสงกวา 70 องศาเซลเซยส รวมอยดวย

เถา (Mineral matter or ash) เปนสารพวกอนนทรย (Inorganic matter) ในการวเคราะห นาตวอยางไปเผาในเตาเผา (Muffle furnace) ทอณหภม 600 องศาเซลเซยส ทาใหสารประกอบอนทรย สลายเปนกาซคารบอนไดออกไซด สวนทเหลอคอ เถา

โปรตนรวม (Crude protein) ในอาหารสตว โปรตนรวม จะรวมถงโปรตนทแทจรง (True protein) และสารประกอบพวกไนโตรเจนทไมใชโปรตน (Non protein nitrogen) ซงไดแก กรดอมโนทเปนอสระ ครอาตน (Creatine) กรดฮพพรค (Hippuric acid) แอมโมเนย ไนเตรท ไนไตรท อามน (Amines) เพยวรน พรมดน ยเรย กรดยรค และฮอรโมนออกซโทซน (Oxytoxin) โดยทวไปแลว โปรตนในอาหารสตวนามไนโตรเจนอย 15-18 แตในการคานวณโปรตน ใชคาเฉลยของไนโตรเจนเปน 16% นนคอโปรตน 100 สวน มไนโตรเจน 16 สวน ดงนนไนโตรเจน 1 สวน อยในโปรตน 6.25 สวน (100/16) ซงในการวเคราะหอาหารสตว วเคราะหออกมาเปนจานวนไนโตรเจนและสามารถคานวณกลบไปเปนเปอรเซนตโปรตนไดโดยคณกบ แฟคเตอร 6.25

ไขมนรวม (Crude fat or ether extract) ไขมนรวมเปนสารประกอบทละลายไดในสารละลายพวกอเทอร (Ether) สารประกอบสวนใหญทสกดไดเปนไขมนทแทจรง (true fat) แตมจานวนเลกนอยทเปนสารประกอบอน ๆ ทละลายไดในอเทอร เชน วตามนทละลายไดในไขมน สารแคโรทน คลอโรฟล สารพวกสเตอรอล สารพวกฟอสโฟลปด และแวกซ เปนตน ซงไมทาใหคาของไขมนรวมเปลยนแปลงไปมาก

คารโบไฮเดรต (Carbohydrates) ในการวเคราะหอาหารสตวแบงคารโบไฮเดรตออกเปน 2 ประเภท คอสารเยอใย(Crude fiber) และไนโตรเจนฟรเอกซแทรก

8

สารเยอใย (Crude fiber) เปนสารประกอบคารโบไฮเดรตทยอยไดนอย หรอยอยไมไดเลย ในการวเคราะหสารเยอใย จะรวมถงสารประกอบเซลลโลส เฮมเซลลโลส และลกนน เลกนอย แต 95%เปนสารประกอบพวกเซลลโลส การวเคราะหสารเยอใยมหลกการคอ ตมตวอยางอาหาร ในกรดอยางเจอจางกอน แลวจงตมในดางอยางเจอจาง เพอใหกรดและดาง สกดสารประกอบโปรตน แปง นาตาลเฮมเซลลโลสบางสวนทละลายไดงาย แรธาตบางชนด และลกนนบางสวนออก สวนทเหลอเปนสารเยอใย และแรธาตทละลายไดยาก แตเมอเผาในเตาเผาแลว สวนทหายไปเปนสารเยอใย ซงสามารถคานวณโดยใชสตรได

ไนโตรเจนฟรเอกซแทรก (Nitrogen free extract) ไนโตรเจนฟรเอกซแทรกเปนสารพวก คารโบไฮเดรตทละลายนาไดงายไดแก แปง นาตาล เปนตน แตในการวเคราะหอาหารสตวตามระบบของวนเด ปรากฏวา มสารพวกเฮมเซลลโลส และลกนนบางสวน วตามนทละลายนา รวมอยดวย จงไมใชคาของแปงและนาตาลทแทจรง อยางไรกตามสวนใหญเปนสารพวกแปงและนาตาล

9

ปฏบตการท 3 การวเคราะหความชน

1. วตถประสงค เพอใหนกศกษาไดทราบวธการ และเรยนรเทคนคการวเคราะหหาความชนในอาหารสตวและวสด

อาหาร 2. อปกรณ

2.1 ถวยกระเบองเคลอบ (porcelain crucible) 2.2 ตอบ ( hot air oven) 2.3 โถดดความชน (desiccator) 2.4 คมคบ (tong) 2.5 เครองชงไฟฟาอยางละเอยด

3. วธการ 3.1 นาครซเบลเขาตอบทอณหภม 105 องศาเซลเซยส เปนเวลานาน 2-3 นาท 3.2 นาครซเบลทอบแลว ใสในโถดดความชน ทงไวใหเยน 3.3 นาครซเบลมาชง บนทกนาหนกทแนนอนไว 3.4 ชงตวอยางอาหารใสครซเบล ใหไดนาหนกประมาณ 1-2 กรม 3.5 นาตวอยางอาหารเขาตอบ อบทอณหภม 100 องศาเซลเซยส เปนเวลา 5-6 ชวโมง 3.6 นาตวอยางอาหารทอบแลวใสโถดดความชน ทงไวใหเยน นามาชง บนทกนาหนกไว จากนนนาเขาต อบอกครง จนไดเวลาตามตองการ ใสโถดดความชน ทงไวใหเยนแลวจงนามาชง ทาซาหลายครงจนไดนาหนกคงท ซงนาหนกทหายไปเปนนาหนกของความชน 4. การคานวณ

%ความชน = (a-b) × 100 w a = นาหนกของอาหารกอนอบแหง b = นาหนกของอาหารหลงอบแหง w = นาหนกของอาหารกอนอบแหง หรอ % ของวตถแหง (DM) = 100 - %ความชน

10

5. ผลการวเคราะห บนทกผลการชงนาหนก และผลการคานวณ พรอมคาเฉลยลงในตาราง

หมายเลขถวย นาหนกถวย นาหนกตวอยาง (กอนอบ)

นาหนกตวอยางรวมถวย (หลงอบ)

นาหนกตวอยาง (หลงอบ)

% ความชน

คาเฉลย ± SD

ภาพท 2 ตอบลมรอน (Hot air oven)

11

ปฏบตการท 4 การวเคราะหเถา

1. วตถประสงค เพอใหนกศกษาไดทราบวธการ และเรยนรเทคนคการวเคราะหหาเถาในอาหารสตวและวสด

อาหาร 2. อปกรณ

2.1 ถวยกระเบองเคลอบ (porcelain crucible) 2.2 เตาตมรอน (hot plate) 2.3 เตาเผา (muffle furnace)

2.4 โถดดความชน 2.5 ตดดควนพษ (hood)

2.6 คมคบ 2.7 เครองชงไฟฟาทศนยม 4 ตาแหนง

3 วธการ 3.1 อบถวยกระเบองเคลอบในตอบไฟฟาทอณหภม 105 องศาเซลเซยสเปนเวลา 5-6 ชวโมง แลว

นามาใสโถดดความชน ทงไวใหเยน ชงนาหนก บนทกไว 3.2 ชงตวอยางอาหารประมาณ 2 กรมใสถวยกระเบองเคลอบททราบนาหนกทแนนอนแลว นาไป

เผาในตควนจนหมดควน 3.3 นาไปเผาในเตาเผาทอณหภม 6000 ซ เปนเวลา 3 ชวโมง จนเถาเปนสขาว 3.4 นาเขาโถอบแหง เมอตวอยางอาหารเยนแลว นาออกมาชง บนทกผล

4. การคานวณ %เถา = (b-a) × 100 w a = นาหนกถวยกระเบองเคลอบ b = นาหนกถวยกระเบองเคลอบกบนาหนกของเถาภายหลงการเผา w = นาหนกของอาหารกอนเผา

12


หมายเลขถวย นาหนกถวย นาหนกตวอยาง (กอนอบ)

นาหนกตวอยางรวมถวย (หลงอบ)

นาหนกตวอยาง (หลงอบ)

% เถา


ภาพท 3 เตาเผา (Muffle furnace)

13

ปฏบตการท 5 การวเคราะหไขมน

การวเคราะหปรมาณไขมนดวยวธโดยตรง (direct extraction methods) เปนวธการสกดโดยตรงดวยตวทาละลายอนทรยตางๆ โดยทวไปสวนประกอบทเปนไขมนในอาหารเปนสารประกอบสกดออกไดดวยตวทาละลายตางๆ เชน อเทอร ปโตรเลยมอเทอร และไดเอทธลอเทอร ซงเปนสารละลายทไมมขว (non polar solvent) สารสกดทไดเราเรยกวา crude fat เปนลปดอสระ (free lipid) ทพบในอาหารนน แตถาทาการสกดดวยเอลกอฮอล สวนทสกดไดจะมสวนประกอบอนทตดอยกบไขมนปนอยดวย 1. วตถประสงค

เพอใหนกศกษาไดทราบวธการ และเรยนรเทคนคการวเคราะหหาไขมนในอาหารสตวและวสดอาหาร 2. สารเคม

ปโตรเลยม อเทอร ( Petrolium ether) 3. อปกรณ

3.1 อปกรณชดสกดไขมน (Soxtherm) ประกอบดวย บกเกอร เครองควบคมความรอน เครองปมลม และ เครองทาความเยน ( Cooling tower)

3.2 หลอดใสตวอยาง (Thimble) 3.3 สาล 3.4 ตอบไฟฟา (Hot Air Oven) 3.5 โถดดความชน (Descicator) 3.6 เครองชงไฟฟาทศนยม 4 ตาแหนง

4. วธวเคราะห 4.1 อบบกเกอรสาหรบหาไขมน ในตอบไฟฟา ทอณหภม 105 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท

ทงใหเยนในโถดดความชน และชงนาหนกทแนนอน 4.2 ชงตวอยางบนกระดาษกรองททราบนาหนก ถาตวอยางมไขมนมาก ใหชง 1 – 2 กรม ถา

ตวอยางมไขมนนอย ใหชง 3 – 5 กรม หอใหมดชด แลวใสในหลอดสาหรบใสตวอยาง (Thimble) คลมดวยสาล เพอใหตวทาละลายมการกระจายตวอยางสมาเสมอ

4.3 นาหลอดใสตวอยางใสในบกเกอร 4.4 เตมตวทาละลาย (ปโตรเลยม อเทอร) ในบกเกอรประมาณ 150 มลลลตร หรอจนทวม

ตวอยาง 4.5 ประกอบชดสกดไขมน พรอมทงเปดนาเยนหลออปกรณควบแนน เปดเครองปมลม และเปด

เครองควบคมความรอน

14

4.6 ใชเวลาในการสกดไขมน ประมาณ 1 ชวโมง (ทงน ขนอยกบ ชนด และปรมาณ ไขมนในตวอยาง)

4.7 ทาการ ลาง (Rinse) โดยปรบปมทดานขาง(ขวามอ)ใหอยในตาแหนง Recovery จนตวทาละลายลดตากวาตวอยาง แลวปรบปมทดานขางมาทตาแหนง Circulation นาน 30 นาท

4.8 ระเหยตวทาละลายออก โดยปรบปมทดานขางใหอยในตาแหนง Recovery จนตวทาละลายระเหยหมด

4.9 นาบกเกอร มาอบทอณหภม 105 องศาเซลเซยส ประมาณ 30 นาท ทงใหเยนในโถดดความชน

4.10 ชงนาหนกบกเกอร แลวอบซานาน 30 นาท จนกระทงผลตางของนาหนก 2 ครงตดกน ไมเกน 1 - 3 มลลกรม

4 การคานวณ % ไขมน = นาหนกไขมนหลงอบ × 100 นาหนกตวอยางเรมตน หรอ % ไขมน = b-a × 100 w เมอ b = นาหนกบกเกอรรวมไขมน a = นาหนกบกเกอร w = นาหนกตวอยาง


นาหนกบกเกอร นาหนกตวอยาง นาหนกบกเกอรรวมไขมน ปรมาณไขมน (%)


หมายเหต ตวอยางทสกดไขมนออกแลวนน เกบไวสาหรบวเคราะหหาปรมาณสารเยอใยตอไป

15

ภาพท 4 เครองวเคราะหไขมน

16

ปฏบตการท 6 การวเคราะหโปรตน (โดยวธของ Kjeldahl)

วธคเจล ดาหล ( Kjeldahl method) เปนการวเคราะหโปรตนในอาหารโดยการวเคราะหหาปรมาณไนโตรเจนทงหมดทมอยในตวอยาง วธน พฒนาโดย Dane Johan Kjeldahl เปนชาวเดนมารก ในชวงป ค.ศ.1800 เปนวธทใชวดปรมาณโปรตน อยางแพรหลาย ไดรบการยอมรบวามความแมนยา สามารถใชไดกบอาหารหลากหลายชนด รวมทงอาหารสตว

หลกการ

Kjeldahl method การยอยสลายโปรตน ซงประกอบดวยกรดอะมโน (amino acid) ทมไนโตรเจนเปนองคประกอบ การยอยสลายโปรตนจะเปลยน Organic –N เปน แอมโมเนย และปลอยไนโตรเจนออกมา ในรปของ nitrogen (NH3-N)

การวเคราะหหาโปรตนดวยวธ Kjeldahl ประกอบดวย 4 ขนตอนหลกคอ

1. การยอยตวอยาง (Digestion) ดวยกรดซลฟรกเขมขน ไนโตรเจนในตวอยางจะเปลยนเปนแอมโมเนยมซลเฟต (NH4)2SO4 ภายใตสภาวะอณหภมสงโดยมสารเรงปฏกรยา เชน CuSO4, Se, HgSO4, HgO หรอ FeSO4

2. การกลนแอมโมเนย (Distillation) โดยใช โซเดยมไฮดรอกไซด มาทาปฏกรยากบเกลอแอมโมเนยมซลเฟตทไดจากการยอยตวอยางแลว จะไดกาซแอมโมเนย ซงจบกาซนไดดวยสารละลายบอรค

3. การไตเตรตเพอหาปรมาณไนโตรเจน (Titration) เปนการนาสารละลายกรดบอรค ซงจบกาซแอมโมเนยไว มาไตเตรต กบสารละลายมาตรฐานกรดเกลอ (Hydrochloric acid; HCl)

4. การคานวณ นาปรมาณสารละลายมาตรฐานกรดเกลอ ทใชในการไตเตรต ไปคานวณ หาปรมาณไนโตรเจน แลวคณกบ Kjeldahl factor ซงคาเฉลยของไนโตรเจนในโปรตนอยทรอยละ 16 ไดเปนคาโปรตนหยาบ (crude protein; CP)

1. วตถประสงค

เพอใหนกศกษาไดทราบวธการ และเรยนรเทคนคการวเคราะหหาโปรตนในอาหารสตวและวสดอาหาร

17

2. สารเคม 2.1 กรดซลฟรก (H2SO4) เขมขน 93 – 98 % 2.2 สารเรงรวม (catalyst mixture) (คอปเปอรซลเฟต ; copper sulfate 7 กรม กบ โพแทสเซยม ซลเฟต ; potassium sulfate 100 กรม ผสมใหเขากน ) 2.3 โซเดยมไฮดรอกไซด (NaOH) 45 % (โดยละลาย 450 กรมของโซเดยมไฮดรอกไซด

ชนดเกลด ในนากลนใหไดปรมาตร 1 ลตร) 2.4 สารละลายกรดเกลอหรอ กรดไฮโดรคลอรก 0.1 นอรมอล (0.1 N HCl) 2.5 กรดบอรค (boric acid, H3BO3) 4% (ตมนากลน 50 มล. ใหรอน แลงใสผงกรดบอรคลง

ไป 4 กรม ตมจนละลายหมด ทงไวจนสารละลายเยนลงแลวจงเตมนากลนใหครบ 100 มล.

2.6 เมทธลเรด อนดเคเตอร (ละลายเมทธลเรด 1 กรม ในแอลกอฮอร 200 มล.) หรอใชอนดเคเตอรผสมระหวางเมทธลเรด และเมทธลนบล)

3. อปกรณ 3.1 หลอดยอยโปรตน 3.2 ขาตง (stand) และบวเรท (burette) สาหรบไตเตรตสารละลาย 3.3 ขวดปากแคบวดปรมาตร (erlenmeyer flask; ขวดชมพ) ขนาด 300 – 500 มล. 3.4 เครองยอย (digestion apparatus) 3.5 เครองกลน (distillation apparatus) 3.6 นากลน 3.7 กระบอกตวง (cylinder)

4 วธการ 4.1 ชงตวอยางอาหารใหไดนาหนกประมาณ 0.1 กรม (ถาตวอยางมโปรตนนอย ใหใชตวอยาง

ปรมาณมากขน) โดยชงดวยกระดาษกรองทไมมสารไนโตรเจน (ใชกระดาษกรอง Whatman 541) หอใหมดชดแลวใสในหลอดยอยโปรตน

4.2 หาปรมาณไนโตรเจน ตามขนตอนดงน 4.2.1 ขนตอนการยอย (digestion)

1. เตมสารเรงรวม 5 กรม เพอเปนตวชวยเรงปฏกรยาการยอย (ตามปกต เมอเตมกรดซลฟรกเขมขนลงไปแลว จดเดอด (boiling point) ของสารละลายจะเปน 330 องศาเซลเซยส แตเมอเตมสารเรง จะทาใหจดเดอด ของสารละลายเพมเปน 400 องศาเซลเซยส

2. เตมกรดซลฟรกเขมขน 20 มล. (ถาใชตวอยางมากกวา 2 กรมขนไป ใหเพมกรดซลฟรกเขมขนอก โดยเพม 10 มล. ตอ กรมของตวอยางทเพมขน)

3. นาไปตมบนเครองยอย โดยในครงแรกใหใชความรอนตา (350 องศาเซลเซยส) จนกระทงเดอด แลวจงเพมความรอนใหสงขน (370 องศาเซลเซยส) ถาสารละลายเดอดเรวเกนไป ให

18

ปดไฟสก 5 นาท แลวคอยเปดใหม จนกระทงสารละลายในหลอดยอยโปรตน มสเขยวใส ปดไฟเอาหลอดยอยออกจากเครองยอย แลวทงไวใหเยน จากนนเตมนากลนอกเลกนอย ตมตอไปอก2นาท เพอทาลายกรดซลฟรกทอาจเกดขน

4.2.2 ขนตอนการกลน (distillation) 1. เตรยมกรดบอรค โดยใสกรดบอรคในขวดรปชมพ ขนาด 250 มล. จานวน 40 มล.

แลวหยดอนดเคเตอรลงในกรดบอรค 2 – 3 หยด ตอจากนนนาไปวางทเครองกลนโปรตน โดยใหปลายของหลอดแกวทตอจากกระบอกแกวควบแนนของเครองกลนโปรตน จมอยในกรดบอรค

2. ตอหลอดยอยโปรตนเขากบเครองกลน (ดวธการใชเครองมอ บทท 1) 4.2.3 ขนตอนการไตเตรท (titration)

1. นาขวดรปชมพ (จากขนตอนการกลน) ไปไตเตรทดวยกรดเกลอมาตรฐานททราบความเขมขน (0.1 นอรมอล) จนถงจดยต (end point) หากใช เมทธลเรด เปนอนดเคเตอร สารละลายจะเปลยนเปนสชมพออน แตหากใชอนดเคเตอรรวม สารละลายจะเปลยนเปนสนาเงนออน หรอใชดางมาตรฐานททราบความเขมขน (0.1 นอรมอล) ไตเตรท แตควรใชอนดเคเตอรรวม ดจดยต จะสงเกตสไดชดเจน

2. จดปรมาตรกรดหรอดางไวเพอคานวณตอไป หมายเหต ในการวเคราะหโปรตนแตละครง ควรทาตวอยางทใชตรวจสอบ (blank) ดวย โดยไมตวอยาง สวนสารเคม ใสเชนเดยวกบการวเคราะหตวอยาง

5 การคานวณ (เมอใชกรดเกลอไตเตรท )

% โปรตน = 1.4 (V1 – V2) N × 6.25 W

v1 = ปรมาตรของกรดมาตรฐานทใชไตเตรทตวอยาง

v2 = ปรมาตรของกรดมาตรฐานทใชไตเตรทตวอยางทใชตรวจสอบ

N = เปนความเขมขนของกรดเกลอเปนนอรมอล W = นาหนกตวอยางอาหาร (กรม)

19


หลอดท นาหนกตวอยาง ปรมาตรกรดเกลอ % โปรตน


ภาพท 5 ชดวเคราะหโปรตน

20

ปฏบตการท 7 การวเคราะหเยอใย

เยอใยคอสวนของคารโบไฮเดรตทยอยไดยาก เปนสวนของผนงเซลลพช ประกอบดวยเซลลโลส เฮมเซลลโลส และลกนน (แตลกนนไมใชคารโบไฮเดรต) สารเหลานทนตอการยอยดวยกรดและดางคารโบไฮเดรตม 2 ชนดคอ เยอใย (fiber หรอ structural carbohydrate) และ Nitrogen free extract (NFE หรอ Non structural carbohydrate) เปนคารโบไฮเดรตทยอยได นาไปใชประโยชนได ประกอบดวยแปงและนาตาล

การวเคราะหปรมาณเยอใยโดยวธ Proximate analysis มจดออนบางประการ คอสวนทเปนโครงสรางของพชเชน เพคตน เฮมเซลลโลส และลกนน บางสวนอาจละลายมาอยในสวนของ NFE ทาใหคาทไดไมถกตองนก จงนยมใชการวเคราะหโดย วธ Detergent method หรอทเรยกวาวธการวเคราะหแบบ Forage fiber analysis แทน

การวเคราะหแบบ Detergent analysis แบงวตถแหงของอาหารสตวออกเปน 2 สวนใหญๆ คอ

1. Cell content หรอ Neutral Detergent Soluble (NDS) คอ สวนทอยภายในเซลลพชทงหมด สามารถละลายไดในสารละลาย detergent ทเปนกลาง ประกอบดวย กรดอะมโน ไขมน แปง นาตาล เพคตน Soluble Protein, Non- protein Nitrogent วตถแหงสวนนสตวทกชนดสามารถใชประโยชนไดเกอบทงหมด

2. Cell wall constituents หรอ Neutral Detergent Fiber (NDF) คอสวนประกอบของผนงเซลล ซงไมสามารถละลายในสารละลาย detergent ทเปนกลาง ประกอบดวยพวกเยอใยทงหมด คอ เฮมเซลลโลส เซลลโลส ลกนน ควตน ซลกา เคราตน วตถแหงสวนนเปนประโยชนตอสตวเคยวเอองเทานนเพราะในกระเพาะรเมน ของสตวเคยวเอองมจลนทรยทสามารถยอยเซลลโลส และเฮมเซลลโลสได

NDF แบงไดเปน 2 พวกคอ 2.1 เยอใยพวก Acid Detergent Soluble (ADS) เยอใยชนดนคอ Hemicellulose ซงเปน

สวนประกอบของผนงเซลล เปนสารประกอบพวกคารโบไฮเดรตทไมละลายนา สามารถละลายไดดในกรดออน และดางออน พชตระกลหญาจะม hemicellulose สงกวาพชตระกลถว และจะพบ hemicellulose มากทสวนใบของพช พชทกาลงงอกจะใช hemicellulose ทมในเมลดเปนอาหาร และในพชอาหารสตวพบวา hemicellulose จะอยรวมกบ ลกนน จงทาใหการยอยไดไมดเทาทควร เนองจาก ลกนนเปนตวขดขวางการยอยไดของ hemicellulose ซงทาใหยอยไดไมหมด

2.2 เยอใยพวก Acid Detergent Fiber (ADF) ประกอบดวย - Cellulose คอเยอใยทจดเปนคารโบไฮเดรตพวกทไมละลายนา นายอยของสตวทกชนดไมสามารถ

ยอย เซลลโลสได แตจลนทรยทอยในกระเพาะรเมนของสตวเคยวเออง และลาไสสวน Caecum ของมา

21

และกระตาย สามารถยอย เซลลโลสได ดงนนสตวเคยวเออง มา และกระตาย จงสามารถใชประโยชนได แตการยอยไดของ เซลลโลส จะมากหรอนอยเพยงใด ขนอยกบปรมาณ ลกนน

- Lignin เปนสวนประกอบทสาคญของผนงเซลลพช ทาใหผนงเซลลพชแขงแรง จะเปนสวนประกอบของเปลอก ซง หรอสวนทเปนเยอใยของราก ลาตน และจะถกสรางจากสวนโคนตน ไปสยอด เมอพชมอายมากขน ปรมาณลกนน จะเพมมากขนดวย จากการทลกนนเปนสารทไมมสตวชนดใดใชประโยชนไดเลย ในขณะเดยวกบการทลกนน อยรวมกบเซลลโลส และhemicellulose ทาใหการยอยไดของ เซลลโลส และ hemicellulose ลดลงดวย ดงนนปรมาณลกนน เซลลโลส และ hemicellulose มความสาคญตอการประเมนคณภาพของพชอาหารสตว ทใชสาหรบเลยงสตวเคยวเออง มา และกระตาย

- Cutin เปนสารทเคลอบผวดานนอกของผนงเซลลของพช สวนใหญจะพบบนผวของเมลด มลกษณะคลายขผง Cutin ยอยไมได และถามมากอาจจะลดการยอยไดของ เซลลโลส และ hemicellulose

- Acid Insoluble Ash (AIA) คอสวนของเถาทไมละลายในกรด จดเปนสารประกอบอนนทรย ประกอบดวย Silica ซงสวนใหญรางกายสตว ไมสามารถจะยอย หรอดดซมได และยงทาใหการยอยไดของอาหารลดลง

จากการวเคราะหโดยวธนจะทาใหทราบปรมาณสารทอยภายในเซลลซงเปนโภชนะทยอยได

งาย และองคประกอบของผนงเซลลสวนตางๆคอ cellulose,hemicellulose และ ligninทาใหสามารถประเมนคณคาทางอาหารโคนมโดยเฉพาะอยางยงอาหารหยาบไดแมนยายงขน

ภาพท 6 เครองวเคราะหไฟเบอร

22

ปฏบตการท 8 การผลตอาหารสตวนา

วตถประสงค เพอใหนกศกษาใหผลตอาหารสาเรจรปสาหรบสตวนา โดยใชเครองมอผลตอาหารเมดจม

ขนตอนการผลตอาหารปลา (Fish Feed methodology) 1. การชงนาหนก (Weighing) เมอทราบสตรอาหารเมดทตองการผลตแลว ตองคานวณดวา ถาตองการผลตอาหารเมดใหได

ปรมาณตามทกาหนด ตองใชวตถดบแตละชนดในปรมาณเทาใด จากนนจงทาการชงนาหนก วตถดบแตละชนด

2. การบด (Grinding) ในกรณทวตถดบมขนาดใหญ ไมละเอยด จาเปนตองตองนามาบดใหละเอยด สวนวตถดบ

พวกวตามน แรธาต และกรดอมโนสงเคราะห มขนาดละเอยดอยแลว ไมจาเปนตองบดอก และความรอนทเกดจากการบด ทาใหวตามน แรธาต และกรดอมโนสงเคราะห ถกทาลายได

3. การผสม (Mixing) การผสมวตถดบ เรมจากผสมวตถดบทมลกษณะแหง และมปรมาณมากกอน แลวใส

วตถดบทมปรมาณนอยภายหลง ผสมใหเปนเนอเดยวกนสกระยะ จากนนจงผสมวตถดบทใชปรมาณนอยมาก เชน วตามน แรธาต สารประสานอาหาร กรดอมโนสงเคราะห หรอยา แลวผสมใหเขากนอกครง จงผสมนา การผสมไขมน เชน นามนพช หรอนามนตบปลา

4. การอดเมด (Pelleting) ทาใหอาหารเหมาะสมแกการนามาใหสตวนากน อาหารเมดมความจแนน ทาใหสตวนากน

อาหารไดมากขน ไดรบธาตอาหารมากขน และชวยปองกนไมใหสตวนาเลอกกนวตถดบทชอบเทานน นอกจากน การอดเมดชวยใหอาหารสก เนองจากความรอนทเกดขน ทาใหสตวนาใชประโยชนจากอาหารไดมากขน

5. การลดความชน (Cooling and Drying) การลดความชนทาไดหลายวธ เชน ตากใหแหง โดยเกลยเปนชนบาง ๆ บนพนทสะอาด

หรอใชพดลมเปาใหแหง หรอใชเครองอบแหง ประมาณ 20 – 30 นาท ทอณหภม 50 – 70 องศาเซลเซยส

23

กจกรรม 1. ใหนกศกษา ผลตอาหารปลาโดยใชสตรทกาหนดให 2. ใหผลตอาหารจานวน 0.5 กโลกรม 3. นาอาหารทผลตได วเคราะหคณคาทางโภชนาการ

สตร 1 สตร 2 วตถดบ % วตถดบ %

ปลาปน 50 ปลาปน 45 รา 24 รา 20 แปงขาวเจา 20 แปงขาวเจา 29 นามนปลา 2.5 นามนปลา 2.5 นามนพช 1.5 นามนพช 1.5 พรมกซ 2 พรมกซ 2 สตร 3 สตร 4 วตถดบ % วตถดบ % ปลาปน 50 ปลาปน 35

รา 20 รา 30 แปงขาวเหนยว 24 แปงขาวเหนยว 29

นามนปลา 2.5 นามนปลา 2.5 นามนพช 1.5 นามนพช 1.5 พรมกซ 2 พรมกซ 2

24

ภาคผนวก ก การคานวณหาปรมาณคารโบไฮเดรต

การวเคราะหหาปรมาณคารโบไฮเดรตทงหมดในตวอยาง โดยทวไปคานวณจากผลตางของนาหนกแหงกบปรมาณองคประกอบสวนทเปนโปรตน ไขมนและเถา ปรมาณคารโบไฮเดรต = นาหนกแหง – (โปรตน + ไขมน + เถา) Nitrogen Free Extract (NFE) ประกอบดวย คารโบไฮเดรตทยอยไดงายเปนสวนใหญ ซงไดแกแปงและนาตาล แตอาจมสวนของเฮมเซลลโลสและลกนน ปนอยบาง คานไมไดทาการวเคราะหโดยตรง แตไดจากการคานวณโดยนาคาทงหมดมาหกออกจากคาของวตถแหง ดงสตร

% NFE = % วตถแหง - % เถา - % โปรตน - % ไขมน - % เยอใย สตรทแสดงมาทงหมดนเปนการคานวณปรมาณโภชนะของตวอยางในสภาพแหงตามปกต

(air dry basis) ถาตองการคานวณเปนคารอยละของวตถแหง (dry matter basis) คอไมมความชนอยในตวอยางเลย ใหแทนคา % วตถแหงดวย 100 และคาของโภชนะอน ๆ ทนามาเขาสตรกตองคานวณไวเปนรอยละของวตถแหงเชนกน ตวอยางเชน หญาเนเปยรมโภชนะคดเปนรอยละของวตถแหงดงน

เถา โปรตน ไขมน เยอใย หญาเนเปยร 5.3 7.8 1.1 39.0 ดงนนม NFE = 100 – 5.3 – 7.8 – 1.1 – 39.0 = 46.8% ของวตถแหง

25

ภาคผนวก ข การเตรยมสารละลาย

การเตรยมสารละลายกรดเกลอ 0.1 นอรมอล (0.1 N HCl)

กรดไฮโดรคลอรก (HCl) หรอกรดเกลอ เขมขน 37% โดยนาหนก ความหนาแนน 1.19 g /cm3 นาหนกสตร (formula weight) 36.46 g/mol

นอรมอล (Normalrity; N) คอ จานวนกรมสมมลของตวถกละลายทละลายอยในสารละลาย 1 ลตร

จานวนกรมสมมล = นาหนกสาร/นาหนกสมมล

นาหนกสมมล = นาหนกสตรของสาร / n

n คอ จานวนไฮโดรเจนในโมเลกลของกรดทสามารถให หรอจานวนไฮโดรเจนทเบสสามารถทาปฏกรยาได นาหนกสมมลของกรดเกลอ = 36.46 / 1 จานวนกรมสมมล สารละลายกรดเกลอ เขมขน 0.1 N หมายความวา ในสารละลายกรดเกลอ 1000 ml มกรดสารละลายเกลออย 0.1 กรมสมมล

หานาหนกกรดเกลอ จาก

จานวนกรมสมมล = นาหนกสาร (g) /นาหนกสมมล

0.1 กรมสมมล = นาหนกสาร / 36.46 นาหนกกรดเกลอ = 0.1×36.46 = 3.646 g

เนองจากสารละลายกรดเกลอเปนของเหลว มความเขมขน 37% โดยนาหนก หมายความวา ในสารละลายกรดเกลอ 100 g มเนอกรด HCl อย 37 g

นนคอ มเนอกรด 37 g ตองใชสารละลายกรด HCl 100 g หากตองการเนอกรด 3.646 g ตองใชสารละลายกรด HCl (100 × 3.646) 37 = 9.854 g

26

เนองจากกรดเกลอเปนของเหลว จงตองเปลยนหนวยจากนาหนกใหเปนหนวยปรมาตร

จากสตร ความหนาแนน = นาหนก /ปรมาตร สารละลาย HCl มความหนาแนน 1.19 g/ml 1.19 g/ml = 9.854 g / ปรมาตร ปรมาตร = 9.854 g / 1.19 g/ml = 8.28 ml

นนคอ ในการเตรยมสารละลายกรดเกลอ 0.1 N จานวน 1 ลตร (1000 ml) ตองใชสารละลายกรดเกลอเขมขน 37% จานวน 8.28 ml เจอจางดวยนากลนปรบปรมาตรใหได 1000 ml การเตรยมอนดเคเตอรผสม

1. ชง 0.125 กรม เมทลเรด และ 0.082 กรมเมทลนบล ละลายในเอทล แอลกอฮอล 95% ปรมาณ 100 มล.

2. ชง 0.1 กรม โบรโมครซอลกรน ละลายในนากลน และปรบปรมาตรเปน 100 มล. 3. ผสมสารละลายจากขอ 1 และ 2 ในอตราสวน 1:2 = 5:1

บทปฏบตการวชาเคมอาหาร

โดย ดลฤด พชยรตน

สาขาอตสาหกรรมอาหารและผลตภณฑประมง คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลยการประมง

มหาวทยาลยเทคโนโลยราชมงคลศรวชย วทยาเขตตรง ปการศกษา 2556

nexzza

Text Box


คานา คมอปฏบตการวชาเคมอาหาร จดทาขนเพอประกอบการเรยนการสอนภาคปฏบตการวชา เคมอาหาร (06-131-301) เพอใหนกศกษาไดอานและทาความเขาใจบทปฏบตการกอนเรยนและใชเปนคมอในการเรยน อนจะทาใหนกศกษาเกดทกษะและเขาใจในเนอหาวชามากขน ดลฤด พชยรตน สาขาอตสาหกรรมอาหารและผลตภณฑประมง คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลยการประมง มหาวทยาลยเทคโนโลยราชมงคลศรวชย วทยาเขตตรง

สารบญ

เรอง หนา

ขอปฏบตในการเรยนปฏบตการวชาเคมอาหาร 1 การเขยนรายงานปฏบตการ 3 เทคนคเบองตนในการวเคราะห 5 การเตรยมตวอยางสาหรบการวเคราะห 32 บทปฏบตการท 1 การวเคราะหหาปรมาณความชน 33 บทปฏบตการท 2 การวเคราะหหาปรมาณไขมน 36 บทปฏบตการท 3 การวเคราะหหาปรมาณเถา 40 บทปฏบตการท 4 การวเคราะหหาปรมาณโปรตน 43 บทปฏบตการท 5 การตรวจวดคาวอเตอรแอกตวต 48 บทปฏบตการท 6 การเกดอมลชนและผลของอมลซไฟเออร 51 บทปฏบตการท 7 การศกษาสมบตของเพคตน 55 บทปฏบตการท 8 การวเคราะหหาปรมาณนาตาลรดวซโดยวธ DNS method 60 บทปฏบตการท 9 การวเคราะหหาคาความเปนกรด (Acidity) 64 บทปฏบตการท 10 การวเคราะหหาปรมาณเกลอ (Sodium Chloride) 67 ภาคผนวก 70

1

ขอปฏบตในการเรยนปฏบตการวชา 06-131-301 เคมอาหาร 1. การแตงกาย แตงกายสภาพ สวมเสอกาวนทกครง ไมสวมรองเทาแตะ 2. การมาตรวจผล lab นอกเวลาเรยนในวนและเวลาราชการตองแตงกายสภาพ ไมสวมกางเกงขาสนและรองเทาแตะ 3. การเบกใชอปกรณ/เครองแกว และสารเคม - การเบกอปกรณ/เครองแกว และสารเคมในการทา lab ใหเขยนใบยมอปกรณ/เครองแกวและสารเคมทกครง หามหยบอปกรณ/เครองแกวหรอสารเคมมาใชโดยไมเขยนยม - สงคนอปกรณ/เครองแกวและสารเคมทนทททา lab เสรจเรยบรอยแลว - หากเครองมอ อปกรณ/เครองแกวแตกหกเสยหายทเกดจากการกระทาของนกศกษา นกศกษาจะตองรบผดชอบในการจดหา ซอมแซมเครองมอ อปกรณ/เครองแกวนนคน - เมอพบเครองมอ อปกรณ/เครองแกวชารดหรอใชงานไมได รายงานใหอาจารยหรอเจาหนาท ผควบคมหองปฏบตการทราบทนท 4. การเตรยม lab และดแลหอง lab - ในการเตรยมสารเคมใหนกศกษาเตรยมกอนทจะมการปฏบตการนน ๆ ลวงหนาอยางนอย 1 วน - หลงจากเสรจ lab นกศกษาทกคนจะตองรบผดชอบในการเกบลางทาความสะอาดเครองมอ อปกรณ/เครองแกว พรอมทงจดเกบใหเรยบรอย ทาความสะอาดพนโตะ ถอดปลก ปดไฟ-พดลมและนาขยะเปยกออกไปทงในถงขยะนอกหองปฏบตการทกครง - ในกรณททา lab ไมเสรจในชวโมงเรยน นกศกษาตองเขยนใบขอใชหองปฏบตการนอกเวลาราชการ และจะตองเขยนชอ ชนป วนทใชงาน เวลาเรมตนใชงาน-สนสดการใชงาน สภาวะทใชงาน ตดทเครองมอทกครง - นกศกษาเตรยมผาเชดโตะ กระดาษชาระและปากกาเคมมาใชในชวโมงทา lab 5. อปกรณ/เครองแกวทกชนทนามาใชตองสะอาดและแหง เนองจากความสกปรกเปนสาเหตหนงของความคลาดเคลอน อปกรณ/เครองแกวทใชแลวตองลางใหสะอาดและทาใหแหงจงจะรบคน หากลาง ไมสะอาด ไมรบคน 6. หามนาเครองแกวทใชวดปรมาตร เชน ขวดวดปรมาตร ปเปตต กระบอกตวง ไปใชในการให ความรอนหรออบใหแหงในตอบไฟฟา เนองจากความรอนมผลทาใหปรมาตรของเครองแกวคลาดเคลอนเสยไปได 7. สารเคมทอยในรปสารละลายทเปนของเหลว จะตองเทแบงสารจากขวดในปรมาณทพอใชใสบกเกอรกอนนาไปใช และหามใชปเปตตดดสารจากขวดโดยตรง หากสารละลายเหลอใหเททงลงในภาชนะหรอ ในททเตรยมไวให หามเทสารกลบลงขวดเดมเพอปองกนการปนเปอน

2

8. ปดฝาขวดสารเคมทนทเมอใชเสรจ เพอปองกนการสบเปลยนฝาขวดและการปนเปอนจากภายนอก ปดขวดฝาใหแนนและเชดรอบขวดใหสะอาดกอนคนเจาหนาท 9. การเตรยมสารละลายกรดหรอสารทมกลนจะตองเตรยมในตดดควน (hood) เทานน เพอปองกนอนตรายจากการสดดมกลนสาร 10. ในการทาใหกรดเจอจาง ใหเทกรดเขมขนลงในนาอยางชา ๆ พรอมกบกวนตลอดเวลา หามเทนาลงในกรดเขมขนใด ๆ 11. ดแลเครองชงใหสะอาดทงกอนและหลงชง ไมใชกระดาษชงสารชงสารทเปยกชน

3

การเขยนรายงานปฏบตการ การสงรายงานปฏบตการ 1. ใหสงรายงานปฏบตการ 1 กลม/ 1 เลม และตองสงภายใน 1 สปดาหหลงการทาปฏบตการ (สงรายงานชาหกคะแนน 1 คะแนน/วน) รายละเอยดของรายงานประกอบดวย 1. หนาปก ตองระบ

รายงานปฏบตการวชา......................

บทปฏบตการท.................... เรอง....................................

เสนอ อาจารย...........................

จดทาโดย ชอนกศกษา................... รหสนกศกษา........................

รายงานปฏบตการนเปนสวนหนงของรายวชา 06-131-301 เคมอาหาร ภาคเรยนท.................. ปการศกษา......................

สาขาวชาอตสาหกรรมอาหาร สาขาอตสาหกรรมอาหารและผลตภณฑประมง คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลยการประมง

มหาวทยาลยเทคโนโลยราชมงคลศรวชย วทยาเขตตรง

4

2. รปแบบการเขยนรายงาน 2.1 ชอบทปฏบตการ (บทปฏบตการท …….. เรอง ……………………………..)

2.2 วนททาการทดลอง 2.3 หลกการ/ทฤษฎทเกยวของ (เปนทฤษฎสน ๆ ทเกยวของโดยตรงกบการทดลองในบทนน ๆ) 2.4 วตถประสงคการทดลอง 2.5 วสด อปกรณและสารเคม (เขยนตามททดลองจรง) 2.6 ตวอยางอาหารทใชในการทดลอง 2.7 วธการทดลอง (เขยนตามททดลองจรง)

2.8 ผลการทดลอง (แสดงผลในรปของตาราง กราฟหรอการบรรยายตามความเหมาะสม และแสดงตวอยางการคานวณ)

2.9 สรปและวจารณผลการทดลอง (สรปผลทไดจากการทดลอง และวจารณผลการทดลอง โดยอางองถงทฤษฎ เปรยบเทยบผลการทดลองกบขอมลเอกสารอางองอน ๆ ทมความสมพนธกน หากมขอผดพลาดหรอปญหาทเกดขนจากการทดลอง ใหรายงานสงทนาจะมผลตอการทดลองและขอเสนอแนะในการแกไข เพอลดความผดพลาดในการทดลองประกอบการวจารณผล)

2.10 เอกสารอางอง ใชหลกการเขยนตามคมอการทาปญหาพเศษของคณะวทยาศาสตรและเทคโนโลยการประมง

2.11 ปกรายงาน

5

เทคนคเบองตนในการวเคราะห

ในการวเคราะหเพอหาองคประกอบของอาหารนน จาเปนอยางยงทผเรยนจะตองมความรเกยวกบวธการใชและการดแลรกษาเครองมอ อปกรณ/เครองแกวตาง ๆ ทใชในหองปฏบตการ และจะตองเรยนรหลกการเบองตนในการเตรยมสารละลายมาตรฐานทจะนาไปใชในการวเคราะห

1. เครองมอสาคญทใชในหองปฏบตการ

1.1 เตาเผา (Muffle furnace) เปนเครองมอทใชในการเผาตวอยางทงทเปนสารอนทรยและสารอนนทรยใหเปนผงเถา โดยมไฟฟาเปนตวทาใหขดลวดเกดความรอนทาใหอณหภมภายในเตาเผาสงขน ซงสามารถใหอณหภมสงถง1100 องศาเซลเซยสหรอมากกวา ทงนขนอยกบยหอหรอรนของเตาเผา ภายในเตาเผามลกษณะเปนหองเลก ๆ มฉนวนเปนอฐทนความรอนหมอยโดยรอบเพอปองกนไมใหความรอนออกมาภายนอกและสามารถคงความรอนภายในเตาเผาไวได มประตปด-เปด

รปท 1.1 เตาเผา ทมา : http://www.jjsciencelab.com/images/VUTHPROD23122549134547.jpg

1.2 ตอบลมรอน (Hot air oven)

เปนเครองมอทใชสาหรบใหความรอนดวยไฟฟาและมการหมนเวยนของอากาศรอนภายในตโดยใชแรงลม มกใชในการอบตวอยางเพอหาความชน ทาใหแหงหรอเพอไลความชน และใชสาหรบอบวสด อปกรณตาง ๆ ใหแหง โดยทวไปจะมชวงการใหความรอนสงถง 220 องศาเซลเซยสหรอมากกวา

6

รปท 1.2 ตอบลมรอน ทมา : http://www.geocities.com/khonwitran/ue.jpg

1.3 ตดดควน (Fume hood) เปนตทมคณสมบตในการดดไอกรดและไอสารเคม โครงสรางมความทนทานตอสารเคมและทนตอการกดกรอนของกรด-ดางเปนอยางด ทนตอความรอน ใชสาหรบการเตรยมสารละลายทมไอระเหย ทเปนพษ เชน โซเดยมไฮดรอกไซด กรดซลฟรก กรดไฮโดรคลอรก กรดอะซตกและสารพวกอเทอร เปนตน ซงสารเหลานจะตองเตรยมภายในตดดควน เพราะหากเตรยมภายนอกตจะเกดเปนไอหรอควนระเหยฟงกระจายไปทวหอง ซงเปนพษตอระบบทางเดนหายใจ ในการใชงานจะตองเปดพดลมดดอากาศทกครงเพอดดเอาไอระเหยไปตามทอและถายทงนอกตวอาคาร และหากมการเทกรดหรอสารเคมทงในต ดดควนจะตองเปดนาไลตามทนท

รปท 1.3 ตดดควน ทมา : http://www.jjsciencelab.com/images/VUTHPROD3072551171612.jpg

7

1.4 อางนาควบคมอณหภม (Water bath) เปนเครองมอใหความรอนทมลกษณะเปนอางสาหรบบรรจนา เครองจะทางานโดยอาศยพลงงานไฟฟา ดวยการเปลยนพลงงานไฟฟาใหเปนความรอน และสงผานแทงความรอนทอยรอบๆ อางเพอถายเท ความรอนใหกบนา สามารถตงปรบระดบอณหภมไดตามตองการโดยใหความรอนไดไมเกน 100 องศาเซลเซยส มกใชสาหรบใหความรอนกบตวอยางโดยผานทางนารอน ใชในการทาปฏกรยาของสารหรอเรงปฏกรยาตาง ๆ และใชในการระเหยสาร ซงภายหลงจากการใชงานควรถายนาออกทกครงเพอปองกนไมใหเกดตะกรนในอางตมนา

รปท 1.4 อางนาควบคมอณหภม ทมา : http://www.jjsciencelab.com/images/VUTHPROCAT2642550110522.jpg

1.5 เครองชง (Balance)

เปนเครองมอสาหรบบอกนาหนกของวตถหรอสารตวอยางทนาไปชง ซงความถกตองของคานาหนกทชงไดนนขนอยกบสมบตของเครองชง ไดแก ความถกตอง (accuracy) ความแมนยา (precision) และความไว (sensitivity) ตอการเปลยนแปลงของนาหนก และเทคนคทถกตองในการใชเครองชง

ชนดของเครองชงไฟฟา แบงออกเปน 2 ชนดตามความละเอยดของการชง ไดแก

1.5.1 เครองชงหยาบ (Top loading or Precision Balance) ใชชงนาหนกวตถหรอสงของทไมตองการความละเอยดมากนก โดยชงนาหนกไดนอยสด

เพยง 0.01 กรม

8

รปท 1.5.1 เครองชงหยาบ (Top loading or Precision Balance) ทมา : http://www.ncl.co.th/product/commerce/img/pl.jpg

1.5.2 เครองชงละเอยด (Analytical balance)

เปนเครองชงทใชสาหรบชงหานาหนกสารหรอตวอยางทตองการทราบนาหนกทแนนอน เครองชงจะประกอบดวยหองสาหรบวางตวอยางทมกระจกกนทง 4 ดาน เพอปองกนการเคลอนไหว ของอากาศรอบขางทอาจมผลตอการชงนาหนก มประตเปด-ปดเพอนาตวอยางเขาหรอออกไดสะดวก เครองชงแบบนมกใชชงสารเคมเพอเตรยมสารละลายหรอใชชงตวอยางเพอใชในงานวเคราะหทตองการความละเอยดสง สามารถแบงไดเปน 4 ชนดตามความละเอยดของการชง ไดแก

1) Macro analytical balance ชงนาหนกไดตงแต 200 ถง 0.0001 กรม 2) Semi macro analytical balance ชงนาหนกไดตงแตประมาณ 200 ถง 0.00001 กรม 3) Micro analytical balance ชงนาหนกไดตงแตประมาณ 30 ถง 0.000001 กรม 4) Ultra-micro analytical balance ชงนาหนกไดตงแตประมาณ 0.020 ถง 0.0000001 กรม

รปท 1.5.2 เครองชงไฟฟาชนดอานละเอยด ทมา : http://www.kern-sohn.com/images/shop/ABS.jpg

9

โดยทวไปเครองชงจะประกอบดวยปมสาหรบเปด-ปดเครอง ปมสาหรบตงนาหนกใหเปนศนย (tare) และจะระบพกดนาหนกสงสดทเครองชงสามารถชงไดไวบนเครองชง ขอควรระวงในการใชเครองชงชนดนคอไมชงสารทมนาหนกเกนพกดของเครอง และชงสารลงในภาชนะรองรบดวยความระมดระวง หากมสารหกหลนลงบนเครองชงตองใชแปรงสาหรบทาความสะอาดเครองชงปดออกทนท และตองไมชงสารทมอณหภมสง/ตากวาอณหภมหอง หากสารทจะชงมอณหภมสง/ตากวาอณหภมหองตองวางสารทงไวจนกวาสารมอณหภมเทากบอณหภมหองจงนาไปชง และกอนใชเครองชงทกครงควรปรบตาแหนงของลกนาใหอยตรงกลางเสมอเพอใหแนใจวาเครองชงมความสมดล ไมเอยงไปดานใดดานหนงซงอาจสงผลตอการชงนาหนกได 1.6 เตาไฟฟา (Hot plate)

เปนเครองมอใหความรอนแกสารตวอยาง มกใชในการระเหยหรอตมสารละลาย โดยภายในตวเครองจะมขดลวดใหความรอนหรอตวตานทาน ซงเมอไดรบกระแสไฟฟา กระแสไฟฟาจะถกปอนไปยงขดลวดและถกเปลยนไปเปนพลงงานความรอนผานไปยงแปนบนของตวเครอง ซงเปนอปกรณพเศษททนตอความรอนและถายเทความรอนไดด

รปท 1.6 เตาไฟฟา ทมา : http://www.g-scienceen.com/images/content432008130212.jpg

1.7 โถดดความชน (desiccator) โถดดความชนเปนอปกรณทใชในการเกบรกษาสารตวอยางเพอปองกนไมใหสารตวอยาง มความชนหรอดดความชนทมอยในอากาศ โดยอาศยสารดดความชน (เมดซลกาเจล) ทอยตรงดานลางของโถทาหนาทในการดดความชน ซงเมอใชงานไปไดระยะหนงเมดซลกาเจลจะดดความชนจนกระทงเปลยนสจากสนาเงนไปเปนสสม แสดงถงประสทธภาพในการดดความชนลดลงตองนาเมดซลกาเจลไปอบ ไลความชนในตอบไฟฟาแลวจงนากลบมาใชตอไป นอกจากนมกใชโถดดความชนในการวเคราะหแบบ ชงนาหนกของสารตวอยาง เชน การวเคราะหหาปรมาณความชนหรอเถา โดยใชเปนภาชนะปองกนการ ดดความชนของสารตวอยาง ปองกนการปลวของสารตวอยางเนองจากลมและปองกนฝนละอองทจะตกลง

10

มาบนสารตวอยาง ขณะวางพกสารตวอยางหรออปกรณ/เครองแกวทผานการใหความรอนเพอรอให สารตวอยางหรออปกรณ/เครองแกวมอณหภมลดลงจนถงอณหภมหอง กอนทจะนาไปชงเพอหานาหนก ทแนนอน ซงโถดดความชนสามารถชวยปองกนการดดความชน การปลวหรอปองกนสงปนเปอนตาง ๆ ทอาจมผลตอนาหนกทแนนอนของสารตวอยางหรออปกรณในระหวางรอชงได โถดดความชนทใช ในหองปฏบตการเปนแบบซบเลอร (scheibler) แสดงในรปท 1.7 ตวโถดดความชนและฝาทาดวยแกว ระหวางฝาและโถดดความชนทาดวยกรส (grease) เพอปองกนไมใหอากาศเขา โดยจะวางตวอยางบนแผนพอรซเลนทเจาะเปนร ซงดานลางจะมซลกาเจลอย ขอควรระวงในการใชโถดดความชนคอเมอนาตวอยางทรอนมาวางในโถดดความชนไมควรปดฝาทนท ควรปลอยใหอากาศขยายตวแลวจงปดฝา และเมอตวอยางในโถดดความชนเยนลงจงคอย ๆ เปดฝาใหอากาศเขาไปและนาตวอยางออกมาชง

รปท 1.7 โถดดความชน ทมา : http://www.agi.nu.ac.th/agmis/download/asset/6630-041-037.jpg

1.8 เครองกวนสาร (Magnetic stirrer) เปนเครองมอสาหรบใชเตรยมสารละลายตาง ๆ ทละลายยากหรอใชในการเตรยมสารครงละมาก ๆ เครองจะทางานโดยใชแทงแมเหลกทสามารถปรบระดบความเรวของการกวนไดในการกวนสารเพอผสมใหเขากน มทงแบบทมแผนใหความรอนและแบบทไมมแผนใหความรอน ซงเครองกวนสารแบบทมแผนใหความรอนจะใหความรอนทสามารถปรบระดบอณหภมไดไปพรอม ๆ กบการกวนสารละลายดวย แทงแมเหลก ซงจะชวยละลายสารทละลายยากไดดยงขน นอกจากนอาจใชเครองกวนสารแบบมแผนให ความรอนเปนเครองมอในการใหความรอนแทนการใชเตาไฟฟา (hot plate) ไดอกดวย

11

รปท 1.8 (a) เครองกวนสารแบบไมมแผนใหความรอน ทมา : http://www.pelletlab.com/v5Files/pellet/180002/custom/b_l_stirrer.jpg

(b) เครองกวนสารแบบมแผนใหความรอน ทมา : http://www.lms.co.jp/company/img/somu/HotplateStirrerAnalog2.jpg

2. เครองแกวทใชในหองปฏบตการ เครองแกวทใชในหองปฏบตการทสาคญไดแก

2.1 กระบอกตวง (Graduated cylinder) เปนอปกรณทใชสาหรบวดปรมาตรของของเหลวโดยประมาณ สามารถบอกปรมาตรของของเหลว

ไดอยางคราว ๆ หากตองการวดปรมาตรทแนนอนอาจตองใชอปกรณอนๆ เชน ปเปตตหรอบวเรตต กระบอกตวงทใชมขนาดความจตาง ๆ กนตงแต 5 มลลลตรไปจนถง 2,000 มลลลตร มคาเบยงเบนในการวด (relative deviation) เทากบ 1 เปอรเซนตของปรมาตรสงสดของกระบอกตวง ดงนนกระบอกตวงขนาดเลกจะวดปรมาตรไดถกตองกวากระบอกตวงทมขนาดใหญ ซงวธอานปรมาตรของของเหลวในกระบอกตวงนนสามารถทาไดโดยการยกกระบอกตวงใหตงตรงและใหทองนาอยในระดบสายตา และอานคาปรมาตร ณ จดตาสดของทองนา การใชกระบอกตวงเพอใชถายเทสาร (TD : to deliver) ใหเทออกจนหมดโดย ไมตองชะลางสวนทตดขางภาชนะออก จะไดของเหลวทมปรมาตรตามขดกาหนด

12

รปท 2.1 กระบอกตวง ทมา : http://ritter.tea.state.tx.us/student.assessment/resources/online/2006/

grade8/science/images/20graphicaa.gif

2.2 บกเกอร (Beaker) เปนอปกรณทใชสาหรบบรรจสารชนดตาง ๆ เพอใชในการทดลองในหองปฏบตการ โดยอาจใช

ในการชงสารหรอละลายสารเพอเตรยมสารละลาย ใชสาหรบตมสารละลายหรอใชในการระเหยสารละลาย ขนาดของบกเกอรทพบโดยทวไปจะมตงแต 5 มลลลตรไปจนถง 5000 มลลลตร ทขางบกเกอรจะมตวเลขระบความจสงสดของบกเกอรและมขดบอกปรมาตรซงเปนคาโดยประมาณ ทาใหผใชสามารถทราบปรมาณของของเหลวทบรรจอยไดอยางคราว ๆ บกเกอรมทงแบบสงและแบบเตย มจงอยทเรยกวา spout ซงชวยใหเทของเหลวออกไดโดยสะดวก และยงเปนทางออกของไอนาเมอทาการระเหยของเหลวในบกเกอรทปดดวยกระจกนาฬกา(watch grass)

การเลอกขนาดของบกเกอรเพอใสของเหลวนน โดยปกตใหระดบของเหลวอยตากวาปาก บกเกอรประมาณ 1 – 1.5 นว และไมควรใชบกเกอรในการทดลองทาปฏกรยาระหวางสารเพราะอาจทาใหเกดอนตรายได

รปท 2.2 บกเกอร ทมา : http://www.blundaaromatics.com/cart/images/equipment/Glass-Beakers-50-and-100ml.jpg

13

2.3 ขวดวดปรมาตร (Volumetric Flask) ขวดวดปรมาตรเปนอปกรณทใชสาหรบบรรจ (to contain) ของเหลวทปรมาตรหนงทตองการ

มลกษณะเปนขวดคอยาวทมขดบอกปรมาตรบนคอขวดเพยงขดเดยว มตวเลขบอกปรมาตรรวมไวทดานขางของขวด มขนาดตงแต 5 มลลลตรไปจนถง 5000 มลลลตร มกใชในการเตรยมสารละลายทตองการ ความเขมขนทแนนอน

การเตรยมสารละลายโดยใชขวดวดปรมาตร 1. การเตรยมสารละลาย กรณทตวถกละลายเปนของแขง จะตองชงสารททราบนาหนกแนนอน

นามาละลายดวยตวทาละลายในบกเกอรใหละลายหมด แลวเทลงในขวดวดปรมาตร กรณทตวถกละลายเปนของเหลวสามารถเทสารททราบปรมาตรทแนนอนลงในขวดวดปรมาตรไดโดยตรง

2. ใชตวทาละลายกลวลางบกเกอรหลาย ๆ ครงแลวเทลงในขวดวดปรมาตร เพอชะลางสารทตดอยทบกเกอรออกใหหมด

3. เตมตวทาละลายลงในขวดวดปรมาตร ใหสวนโคงเวาตาสดของสารละลายอยตรงขดบอกปรมาตร (อาจใชหลอดหยดชวยในการปรบปรมาตร) ซงการอานปรมาตรตองใหระดบสายตาอยในระดบเดยวกนกบขดบอกปรมาตร เพอปองกนการอานปรมาตรผด

4. ปดจดขวดวดปรมาตรแลวคาขวดจากบนลงลาง ทาซา 2 - 3 ครง เพอใหสารละลายผสมเปนเนอเดยวกนและมเนอสารเทาเทยมกนทกสวน 5. ถายสารละลายทเตรยมไดจากขวดวดปรมาตร เกบใสขวดสชา พรอมทงปดฉลากระบชอสาร ความเขมขน และวน เดอน ปทเตรยมสารไวขางขวด

รปท 2.3 ขวดวดปรมาตร ทมา : http://www.favorit-sci.com/images/Volumetric-flask.jpg

14

2.4 ขวดรปชมพ (Erlenmeyer Flask) ขวดรปชมพมลกษณะเปนขวดแกวทรงกรวย มขนาดตาง ๆ กน แตทนยมใชมากคอทมขนาด 125,

250 และ 500 มลลลตร ทขางขวดจะมตวเลขระบความจสงสดและมขดบอกปรมาตรโดยประมาณ ทาใหทราบปรมาณของของเหลวทบรรจอยไดอยางคราว ๆ สามารถใชไดในหลายกรณ เชน ใชใสสารละลายเพอไทเทรต ใชเตรยมเชอในทางจลชววทยา

รปท 2.4 ขวดรปชมพ ทมา : http://www.carolina.com/images/en_US/local/products/detail/726710_le_alt1.jpg

2.5 หลอดทดลอง (Test tube)

ใชสาหรบทดลองปฏกรยาระหวางสารละลายตาง ๆ หรอใชตมสารละลายทมปรมาณนอย ๆ หลอดทดลองมหลายชนดและหลายขนาด เชนหลอดทดลองชนดธรรมดาหรอชนดฝาเกลยว ขนาดหลอดทดลองจะระบตามความยาวหลอด x เสนผานศนยกลาง (มลลเมตร) สาหรบการทาความสะอาด หลงจากใชงาน ทาความสะอาดหลอดทดลองดวยแปรงลางหลอด ลางใหสะอาดและควาหลอดบนทวางหลอด (rack)

รปท 2.5 หลอดทดลองชนดธรรมดา ทมา : http://www.made-in-china.com/image/2f0j00VClEbcGrTfuTM/Test-Tube.jpg

15

2.6 กรวยกรอง (Glass Funnel) กรวยกรองเปนอปกรณทใชคกบกระดาษกรอง (filter paper) ในการกรองเพอแยกตะกอนของแขง

ทมลกษณะคลายวนหรอตะกอนละเอยดออกจากสารละลายทาใหไดสารละลายใส ซงการกรองดงกลาวเรยกวาการกรองดวยแรงดงดดโลก โดยในการกรองจะพบซอนกระดาษกรองลงในกรวยกรอง ใชนากลนฉดราดกระดาษกรองใหแนบตดกบผนงกรวยกรอง จากนนเทสารละลายทตองการกรองลงไป แลวใชภาชนะรองรบสารละลายทางดานลางของกรวย กรวยกรองมมมเกอบ ๆ 60 องศาและมทงแบบกานสนและกานยาว โดยกรวยกานยาวใชสาหรบกรองสารละลายทอณหภมหองหรอตากวา ขณะทกรวยกรองกานสนใชกรองสารละลายขณะรอน กรวยกรองมทงขนาดใหญและเลกโดยขนอยกบความยาวของเสนผาศนยกลางกรวย (วดขอบนอก)

รปท 2.6 กรวยกรอง

ทมา : http://glassmuseum.cca.gov.tw/pic/unit04/4-2-3-51-big.jpg

2.7 กระจกนาฬกา (Watch glass) กระจกนาฬกามรปทรงคลายกระจกนาฬกาเรอนกลม มหลายขนาด ขนอยกบความยาวของ

เสนผาศนยกลาง กระจกนาฬกาใชสาหรบปดบกเกอรหรออปกรณอนๆ เพอปองกนสารอนๆ หรอฝนละอองตกลงในสารละลายทบรรจอยในบกเกอร ใชปองกนสารละลายกระเดนออกจากบกเกอรเมอทาการตมหรอระเหยสารละลาย และอาจใชเปนภาชนะในการชงสารหรอใชใสสารเพอนาไปอบไลความชน

16

รปท 2.7 กระจกนาฬกา ทมา : http://www.dkimages.com/discover/previews/768/37495.JPG

2.8 หลอดหยด (Dropper) หลอดหยดเปนอปกรณทใชสาหรบดดสารท เปนของเหลวในปรมาณนอย ๆ เพอใชในการปฏบตการทดลองทางวทยาศาสตรหรอใชในการเตรยมสารละลายตาง ๆ เชนใชสาหรบดดอนดเคเตอรจากขวดไปหยดลงในสารละลายทจะนาไปไทเทรตทบรรจอยในขวดรปชมพ เพอดการเปลยนแปลงสของสารละลายเมอถงจดยต โดยมกเตมอนดเคเตอรลงไปในปรมาณนอย 2-3 หยด หรอใชในการปรบปรมาตรสารละลายในขวดวดปรมาตรในการเตรยมสารละลาย โดยเมอสารละลายทเตรยมไดมปรมาตรใกลถงขดวดระดบ ใชหลอดหยดหยดตวทาละลายลงไปทละนอยจนถงขดวดระดบ ซงหลอดหยดมลกษณะเปนหลอดแกวทปลายขางหนงยาวเรยวเลก ปลายอกขางหนงมกระเปาะยางสวมอย หลอดหยดเมอใชดดสารชนดหนงแลวหากยงไมทาความสะอาด หามนาไปดดสารตางชนดกนเพราะจะทาใหสารทดดมาเกดการปนเปอนได และอยาใหสารละลายสมผสกบกระเปาะยางเพราะจะทาใหสารละลายถกปนเปอนได และถาสารละลายมฤทธเปนกรดกจะกดกรอนกระเปาะยางดวย

รปท 2.8 หลอดหยด ทมา : http://www.quickgrow.com/images_shop/38920_eye_dropper.jpg

17

2.9 ชอนตกสาร (Spatula) เปนอปกรณทใชตวงสารทเปนของแขง โดยอาจใชตกสารเคมใสลงในภาชนะเพอชงนาหนกเพอเตรยมสารละลายหรอใชตกตวอยางตาง ๆ ทเปนของแขงเพอชงนาหนกใชในการวเคราะหทางเคม โดยเมอใช ชอนตกสารแลวจะตองทาความสะอาดชอนใหแหงกอนทจะใชชอนตกสารชนดอน และหามใชชอนตกสารในขณะทสารยงรอน ชอนตกสารมหลายแบบ มทงแบบททามาจากสแตนเลส (stainless steel spatula) และทาจากพลาสตก (plastic spatula) แลวแตวาจะเลอกใชชอนชนดใด ซงตองคานงถงดวยวาสารทจะใชนนสามารถเกดปฏกรยากบชอนตกสารไดหรอไม

(a) (b)

รปท 2.9 (a) ชอนตกสารททาจากพลาสตก (b) ชอนตกสารททาจากสแตนเลส ทมา : http://www3.ipst.ac.th/research/assets/web/mahidol/balances(6)/balance/spatula.htm

2.10 แทงแกวคน (Glass rod)

แทงแกวคนใชสาหรบคนสารละลายใหละลายผสมเปนเนอเดยวกนอยางสมาเสมอหรอใชคนสารทเปนของแขงใหละลายผสมเปนเนอเดยวกนกบสารละลาย และใชเมอจะเทสารละลายจากภาชนะหนง ลงในภาชนะอกชนดหนง โดยจะเทสารละลายใหไหลไปตามแทงแกวคนลงสภาชนะทรองรบ เพอปองกนการหกของสารละลายขณะเท

รปท 2.10 แทงแกวคน ทมา : http://www.blundaaromatics.com/cart/images/Glass-Rod.jpg

18

2.11 ปเปตต (pipette) เปนอปกรณทใชสาหรบวดปรมาตรของสารละลาย เพอใชในการถายโอน (TD, to deliver)

สารละลายใหไดปรมาตรตามทระบไว โดยทวไปปเปตตทใชในหองปฏบตการมอย 2 แบบ คอ Volumetric pipette หรอ Transfer pipette และ Measuring pipette ซงปเปตตแตละแบบจะมหลายขนาด ดงนนจงควรเลอกใชปเปตตใหเหมาะสมกบปรมาตรของสารละลายทจะใช

Volumetric pipette หรอ Transfer pipette เปนปเปตตทมลกษณะเปนกระเปาะตรงกลางทมปรมาตรแนนอนเพยงคาเดยว ใชสาหรบถายโอนสารละลายทมปรมาตรตามขนาดของปเปตต และเนองจากปเปตตชนดนมขดบอกปรมาตรสงสดเพยงขดเดยว จงสามารถวดปรมาตรไดเพยงคาเดยว คอถาหากใช Volumetric pipette ทมขนาด 25 มลลลตรกจะวดปรมาตรของสารละลายได 25 มลลลตรเทานน การถายเทสารละลายจากปเปตตชนดน หากทปลายดานบนของปเปตตมสญลกษณตว B อย หลงจากปลอยใหสารละลายไหลออกจากปเปตตจนหมดแลว ใหใชลกยางเปาสารละลายทตดคางทปลายปเปตตออก แตหากทปลายดานบนของปเปตตไมมสญลกษณตว B ใหปลอยสารละลายไหลออกจากปเปตตอยางชาๆ จนหมดแลวแตะปเปตตกบผวดานในของภาชนะทรองรบโดยไมตองใชลกยางเปาสารละลายทตดคางทปลาย ปเปตตออก

Measuring pipette จะมขดบอกปรมาตรตาง ๆ ไว ทาใหสามารถใชไดงานอยางกวาง คอสามารถใชแทน Transfer pipette ได แตวดปรมาตรไดแนนอนนอยกวา Transfer pipette และมความผดพลาดมากกวา โดยทวไป Measuring pipette ทนยมใชในหองปฏบตการม 2 ชนด คอ Mohr pipette และ Serological pipette

1) Mohr pipette ปเปตตชนดนมขดบอกปรมาตรสดทายไมถงปลายสดของปเปตต ดงนนเวลาใชตองระวงอยาใหสารละลายไหลลงไปตากวาขดบอกปรมาตรสดทาย ซงจะทาใหการถายเทปรมาตรไดมากกวาทเปนจรง

2) Serological pipette ปเปตตชนดนมลกษณะคลาย mohr pipette แตจะมขดบอกปรมาตรไปจนถงปลายสดของปเปตต ปเปตตชนดนเปนปเปตตทตองเปาสารละลายหยดสดทายออก โดยจะมสญลกษณเปนวงฝาทบอยตรงปลายดานบนของปเปตต หรอมตวอกษร B หรอ Blow out หรอมขดส 2 ขดวงรอบปเปตตทบรเวณปลายดานบนของปเปตต

19

รปท 2.11 Volumetric pipette (Transfer pipette) และ Measuring pipette ทมา : http://phetchabun2.net/digital_library/snet5/images/p_pipette.gif

วธการใชปเปตต 1. ใชมอซายบบลกยาง แลวนามาสวมทปลายดานบนของปเปตตทแหงและสะอาด โดยใชมอขวาจบ ปเปตต 2. จมปเปตตลงในสารละลายทตองการวดปรมาตร แลวคอย ๆ คลายมอทบบลกยางออก สารละลายจะคอย ๆ ถกดดขนมาบนปเปตต เมอระดบของสารละลายสงขนประมาณ 1 ใน 3 ของปเปตต เอาลกยางออกแลวใชนวมอขวาเลอนเขามาปดปลายดานบนปเปตต ยกปเปตตออกแลวเอยงใหอยในแนวนอน กลวลาง ปเปตตดวยสารละลายใหทว แลวปลอยทง ทาซา 1-2 ครง 3. จมปเปตตลงในสารละลายทตองการวดปรมาตร โดยใหปลายปเปตตอยตากวาระดบของสารละลายตลอดเวลาททาการดด จากนนนาลกยางมาสวมปเปตตแลวทาการดดของเหลวแบบขางตน โดยคอย ๆ ดดสารละลายขนมาในปเปตตอยางชา ๆ 4. เมอระดบของสารละลายขนไปสงเหนอขดบอกปรมาตร ใหถอดลกยางออกและใชปลายนวชของมอขวาเลอนขนไปปดปลายดานบนของปเปตตใหแนน ตงปเปตตใหตรงแลวคอย ๆ ผอนนวชเพอใหสารละลายสวนทเกนขดบอกปรมาตรไหลออกไปจนกระทงสวนเวาตาสดของสารละลายอยตรงขดบอกปรมาตรพอด ปดปเปตตดวยนวชใหแนนและแตะปลายปเปตตกบขางภาชนะทใสสารละลาย เพอใหสารละลายทตดอยทปลายปเปตตหมดไป 5. ปลอยสารละลายในปเปตตลงในภาชนะทเตรยมไวโดยเปดปลายนวชออก ใหสารละลายจากปเปตตไหลลงสภาชนะรองรบจนหมด หากเปนปเปตตชนดทไมตองเปาออกใหแตะปลายปเปตตกบขางภาชนะ เพอใหสารละลายหยดสดทายไหลลงมา หากมสารละลายตดทปลายปเปตต หามใชลกยางเปาเอาสารละลายทตดทปลายปเปตตใหไหลลงมา เพราะปรมาตรของสารละลายทไหลออกมาจากปเปตตจะมปรมาตรเทากบ

20

ทระบไวบนปเปตตพอด และปรมาตรของสารละลายทเหลอนไมใชปรมาตรของสารละลายทจะวด กรณทเปนปเปตตชนดทตองเปาออกใชลกยางในการเปาใหสารละลายไหลออกมาจนหมด

หมายเหต 1. การปรบปรมาตรของของเหลวใหอยตรงขดปรมาตรพอดนน จะตองไมมฟองอากาศเกดขน ณ บรเวณปลายของปเปตต 2. ปเปตตทใชแลว ใหแชนาทนท โดยแชใหปลายแหลมชขนและแชใหนาทวมถงปลายปเปตต หลงทาความสะอาดใหกลวลางดวยนากลนหลายๆ ครง และทาใหแหงกอนนามาใช 2.12 บวเรตต (burette)

เปนอปกรณทใชวดปรมาตรของสารละลายทมลกษณะคลายกบ Measuring pipette ทใชในการถายเท (TD, to deliver) สารละลาย โดยมขดบอกปรมาตรตาง ๆ ไวและใชกอกเปนตวปด-เปดบงคบการไหลของสารละลายทอยดานใน สวนมากใชในการไทเทรต ซงการวดปรมาตรของสารละลายจะแมนยาเมอมการใชบวเรตตดวยวธทถกตอง

บวเรตตทใชในงานวเคราะหมหลายขนาดตงแต 10 มลลลตร จนถง 100 มลลลตร ดงนนการเลอกใชบเรตตจงควรเลอกใหเหมาะสมกบลกษณะงานทนาไปใช การอานสเกลบนบวเรตตควรใหระดบของสารละลายอยระดบเดยวกบสายตา และถอสวนโคงทตาทสด (menicus) ของสารละลายเปนเกณฑในการอานปรมาตร

เทคนคการใชบวเรตต กอนใชบวเรตตจะตรวจสอบดวาบวเรตตทนามาใชสะอาดหรอไม และตรวจดกอกสาหรบไขให

สารละลายไหลดวยวาอยในสภาพทใชงานไดดหรอไม ซงการลางบวเรตตปกตใชสารทาความสะอาดและแปรงกานยาวถไปมาแลวลางดวยนาประปาหลาย ๆ ครงจนแนใจวาสารทาความสะอาดออกหมด ตอจากนนจะตองลางดวยนากลนอก 1-2 ครงกอนทจะนาไปใชงาน ลกษณะของบวเรตตทสะอาดจะไมมหยดนาเลก ๆ เกาะอยตามผวแกวดานในของบวเรตตและผวนาจะไมแตกแยก

สาหรบกอกปดเปดของบวเรตตกตองทาความสะอาดเชนเดยวกน อาจลางดวยสารทาความสะอาดหรอตวทาละลายอนทรย เชน เบนซน หรออะซโตน ใชสาลเชดเพอใหกรสททาไวเดมออกไป แลวทากรสทกอกใหม ซงการทากรสตองทาบาง ๆ หากทาหนามากเกนไปจะอดรกอกของบวเรตตได

เมอจะใสสารละลายในบวเรตต จะตองกลวลางบวเรตตดวยสารละลายนนกอน โดยเทสารละลาย ประมาณ 5-10 มลลลตรใสลงไปในบวเรตต และหมนบวเรตตเพอใหสารละลายเปยกผวดานในของบวเรตต อยางทวถง จากนนเปดกอกใหสารละลายไหลผานออกทางปลายบวเรตต แลวเทสารละลายนทงไป อาจทาซาอก 1-2 ครงหรอมากกวา เพอใหแนใจวาบวเรตตสะอาด ตอจากนนจงคอย ๆ เทสารละลายลงใน บวเรตตใหอยเหนอระดบขดศนยเพยงเลกนอย (กอนเทสารละลายลงในบวเรตตตองปดกอกกอนเสมอ)

21

แลวปรบปรมาตร โดยใหสวนเวาตาสดของสารละลายอยตรงขดบอกปรมาตรพอด และกอนเทสารละลายใส บกเกอรกอนทจะเทลงในบวเรตตนน ควรกลวลางบกเกอรสะอาดดวยสารละลายกอน 1-2 ครง เพอใหแนใจวาสารละลายจะไมปนเปอนจากบกเกอรทใส

รปท 2.12 ลกษณะการจบบวเรตตทถกตอง ทมา : http://web.ku.ac.th/schoolnet/f-snet5.htm

กลาวโดยสรปเทคนคการใชบวเรตตทถกตองควรปฏบตดงน

1. กอนนาบวเรตตไปใชตองตรวจสอบดวาบวเรตตสะอาดหรอไม หากไมสะอาดตองนาไปลางใหมใหสะอาด และกลวลางดวยนากลนอก 2-3 ครง และตรวจสอบกอกปด-เปดวาใชงานไดดหรอไม

2. กลวลางบวเรตตดวยสารละลายทจะใชเพยงเลกนอยอก 2-3 ครง โดยปลอยใหสารละลายไหลออกทางปลายบวเรตต

3. กอนทจะเทสารละลายลงในบวเรตตตองปดกอกบวเรตตกอนเสมอและตองมนใจวาไขกอก จนแนนแลว จากนนเทสารละลายลงในบวเรตตใหมปรมาตรเหนอขดศนยเลกนอย แลวเปดกอกใหสารละลายไหลออกทางปลายบวเรตตเพอปรบใหปรมาตรของสารละลายอยทขดศนยพอด (ทบรเวณปลายบวเรตตจะตองไมมฟองอากาศเหลออย หากมฟองอากาศจะตองเปดกอกใหสารละลายไลอากาศออกไป จนหมด)

4. หากมหยดของสารละลายตดอยทปลายบวเรตต ใหแตะปลายของบวเรตตกบบกเกอรเพอใหหยดสารละลายไหลออก

5. การจบปลายบวเรตตทถกตอง(ดงภาพ) หากใชบวเรตตเพอการไทเทรต หรอการถายเทสารใน บวเรตตลงสภาชนะทรองรบจะตองใหปลายบวเรตตอยในภาชนะนน ทงนเพอปองกนไมใหสารละลายหก

6. เมอปลอยสารละลายออกจากบวเรตตจนสารละลายลดลงถงขดบอกปรมาตรสดทายของบวเรตต ตองรบปดกอกบวเรตตทนท หากปลอยใหสารละลายเลยขดบอกปรมาตรสดทายลงมา จะไมทราบปรมาตรทแนนอนของสารละลายทผานบวเรตตลงมา

22

ในกรณทตองใชสารละลายทมจานวนมาก และใชบวเรตตในการถายเท เมอปลอยสารละลายจนถงขดบอกปรมาตรสดทายแลว ตองปดบวเรตตกอนแลวจงเตมสารละลายลงในบวเรตต ปรบใหมระดบอยทขดศนยใหม ตอจากนนกปลอยสารละลายลงมาจนกวาจะไดปรมาตร

3. การเตรยมสารละลาย สารละลาย (solution) คอ สารผสมทมลกษณะเปนเนอเดยวกนทเกดจากสาร 2 ชนดขนไปมารวมกน ในอตราสวนทสามารถเปลยนแปลงไดภายในขอบเขตจากด และจะเหมอนกนในทกสวนของสารละลาย สารละลายจะประกอบดวยตวทาละลาย (solvent) และตวถกละลาย (solute) โดยหากตวถกละลายและตวทาละลายมสถานะเดยวกนกบสารละลาย สารทมปรมาณมากกวาจะเปนตวทาละลาย สวนสารทมปรมาณนอยกวาจะเปนตวถกละลาย แตถาสารทงสองมสถานะแตกตางกนสารทมสถานะเดยวกนกบสารละลายจะเปนตวทาละลาย เชน สารละลายเกลอแกง (NaCl) ประกอบดวยตวทาละลายคอนา สวนตวถกละลายคอเกลอแกง สารละลายอาจอยในสถานะของแขง ของเหลวหรอกาซ แตในการทดลองทางเคมมกใชสารละลายทเปนของเหลว ดงนนในทนจะกลาวถงเฉพาะสารละลายของเหลวทมตวทาละลายเปนของเหลว และมตวถกละลายเปนของแขงหรอของเหลว การเตรยมสารละลาย หมายถง การเตรยมสารละลายโดยการนาตวถกละลายมาเตมตวทาละลายใหไดปรมาตรและความเขมขนตามตองการ และในการเตรยมตองทราบความเขมขนและปรมาตรของสารละลาย 3.1 หนวยทใชในการวด ในการคานวณเพอเตรยมสารละลายนน หนวยการวดทมกใชบอย คอ

1) หนวยนาหนก (weight) หนวยพนฐานทใช ไดแก กโลกรม (kg), กรม (g) และมลลกรม (mg) โดย 1 kg = 1000 g 1 g = 1000 mg 1 mg = 1000 μg

2) หนวยปรมาตร (volume) หนวยปรมาตรทใชกนมาก ไดแก ลตร (L), มลลลตร (ml), ลกบาศกเซนตเมตร (cm3) 1 L = 1000 ml 1 ml = 1 cm3

23

3.2 หนวยความเขมขนของสารละลาย ความเขมขนของสารละลาย เปนคาทแสดงถงปรมาณของตวถกละลายทมอยในสารละลายนน ซงจะบอกใหทราบวาในสารละลายทกาหนดให มตวถกละลายอยปรมาณเทาใด ซงหนวยความเขมขนของสารละลายทนยมใช ไดแก

1) รอยละหรอเปอรเซนตโดยนาหนก (% w/w) เปนหนวยทบอกนาหนกของตวถกละลายในสารละลาย 100 หนวยนาหนกเดยวกน เชน

สารละลาย NaCl เขมขน 10% โดยนาหนก หมายถง ในสารละลาย NaCl 100 g ม NaCl ละลายอย 10 g (นนคอ ในสารละลาย NaCl เขมขน 10% โดยนาหนก 100 g ประกอบดวย NaCl (ตวถกละลาย) 10 g ละลายในนากลน (ตวทาละลาย) 90 g)

2) รอยละหรอเปอรเซนตโดยปรมาตร (% v/v) เปนหนวยทบอกปรมาตรของตวถกละลายในสารละลาย 100 หนวยปรมาตรเดยวกน นยมใช

ในกรณททงตวทาละลายและตวถกละลายตางกเปนของเหลวทงค เชน สารละลายแอลกอฮอลเขมขนรอยละ 20 โดยปรมาตร หมายความวา ในสารละลายแอลกอฮอล 100 ml มแอลกอฮอลละลายอย 20 ml (นนคอ ในสารละลายแอลกอฮอลเขมขนรอยละ 20 โดยปรมาตร 100 ml ประกอบดวยแอลกอฮอล (ตว ถกละลาย) 20 ml ละลายในนากลน (ตวทาละลาย) 80 ml)

3) รอยละหรอเปอรเซนตโดยนาหนก/ปรมาตร (% w/v) เปนหนวยทบอกนาหนกของตวถกละลายในสารละลาย 100 หนวยปรมาตร ซงโดยทวไปถา

นาหนกของตวถกละลายมหนวยเปนกรม ปรมาตรของสารละลายมหนวยเปนมลลลตร มกใชในการเตรยมสารละลายทตวถกละลายอยในรปของแขง และละลายในตวทาละลายทเปนของเหลว (สวนใหญจะเปน นากลน) เชน สารละลาย Na2CO3 เขมขน 20% โดยนาหนก/ปรมาตร หมายถง ในสารละลาย Na2CO3 100 ml ม Na2CO3 ละลายอย 20 g (นนคอ ในสารละลาย Na2CO3 เขมขน 20% โดยนาหนก/ปรมาตร 100 ml ประกอบดวย Na2CO3 (ตว ถกละลาย) 20 g ละลายในนากลน (ตวทาละลาย) และปรบปรมาตรดวยนากลนในขวดวดปรมาตรใหไดปรมาตรเปน 100 ml)

4) โมลารต (molarity), โมลาร (molar), (mol/l), (M) เปนหนวยทบอก จานวนโมลของตวถกละลายทละลายอยในสารละลาย 1 ลตร เชน สารละลายกลโคส (C6H12O6) เขมขน 1.46 M หมายถง ในสารละลายกลโคส 1 L ม

C6H12O6 อย 1.46 mol

24

ซง จานวนโมล (mole, mol) = นาหนกของสาร (g) นาหนกโมเลกลของสาร (g/mol) กลโคสมนาหนกโมเลกล = 180.156 g/mol

จาก จานวนโมล (mole, mol) = นาหนกของสาร (g) นาหนกโมเลกลของสาร (g/mol)

1.46 mol = นาหนกของสาร (g) 180.156 (g/mol)

นาหนกของกลโคส (g) = 263.03 g

ดงนน ในสารละลายกลโคส (C6H12O6) เขมขน 1.46 M จะประกอบดวยกลโคส 263.03 g ในสารละลาย 1 L นนคอ ในสารละลายกลโคส (C6H12O6) เขมขน 1.46 M จะประกอบดวยกลโคส (ตว ถกละลาย) 263.03 g ละลายในนากลน (ตวทาละลาย) แลวปรบปรมาตรดวยนากลนในขวดวดปรมาตรใหไดปรมาตรเปน 1000 ml

5) นอรมาลต (Normality), นอรมอล (Normal), (N) เปนหนวยทบอก จานวนกรมสมมลของตวถกละลายทละลายอยในสารละลาย 1 ลตร

ซง จานวนกรมสมมล = นาหนกของสาร (g) นาหนกกรมสมมลของสาร (g)

นาหนกกรมสมมล = นาหนกโมเลกล (MW) จานวน H+ หรอ OH-

ตวอยางเชน - สารละลาย NaOH 1 N

จาก สารละลาย NaOH 1 N หมายความวา ในสารละลาย NaOH 1 ลตร ม NaOH อย 1 กรมสมมล



25

MW ของ NaOH = 40 NaOH ม OH- อะตอม = 1

นาหนกกรมสมมล = 40 1

= 40 g

จากสตร จานวนกรมสมมล = นาหนกของสาร (g) นาหนกกรมสมมลของสาร (g)

1 = นาหนกของสาร (g) 40 g นาหนกของ NaOH = 40 g

ดงนน ในสารละลาย NaOH 1 N จะประกอบดวย NaOH 40 g ในสารละลาย 1 L นนคอ ในสารละลาย NaOH 1 N จะประกอบดวย NaOH (ตวถกละลาย) 40 g ละลายในนากลน (ตว ทาละลาย) แลวปรบปรมาตรดวยนากลนในขวดวดปรมาตรใหไดปรมาตรเปน 1000 ml 3.3 ตวอยางการคานวณเพอเตรยมสารละลาย 3.3.1 การเตรยมสารละลายจากการละลายตวถกละลายทเปนของแขงในตวทาละลายทเปนของเหลว

1) จงเตรยมสารละลาย NaCl เขมขน 10% โดยนาหนก จานวน 500 g คานวณหาปรมาณของ NaCl ทใชเตรยมสารละลาย สารละลาย NaCl เขมขน 10% โดยนาหนก หมายถง สารละลาย NaCl 100 g ม NaCl ละลายอย 10 g สารละลาย NaCl 500 g ม NaCl ละลายอย 10 X 500 = 50 g 100 คานวณหาปรมาณนากลนทใชเตรยมสารละลาย นาหนกนากลน = 500 g - 50 g = 450 g

นนคอ ในการเตรยมสารละลาย NaCl เขมขน 10% โดยนาหนก จานวน 500 g ทาไดโดยชง NaCl 50 g ละลายในนากลน 450 g จะไดสารละลายตามตองการ

26

2) จงเตรยมสารละลาย Na2Co3 เขมขน 20% โดยนาหนก/ปรมาตร จานวน 250 ml คานวณหาปรมาณของ Na2Co3 ทใชเตรยมสารละลาย

สารละลาย Na2Co3 เขมขน 20% โดยนาหนก/ปรมาตร หมายถง สารละลาย Na2Co3 100 ml มเนอสาร Na2Co3 อย 20 g สารละลาย Na2Co3 250 ml มเนอสาร Na2Co3 อย 20 X 250 = 50 g

100 นนคอ ในการเตรยมสารละลาย Na2Co3 เขมขน 20% โดยนาหนก/ปรมาตร จานวน 250 ml เตรยมโดยชง Na2Co3 50 g ละลายในตวทาละลาย (นากลน) แลวปรบปรมาตรดวยนากลนในขวดวดปรมาตรใหไดปรมาตรเปน 250 ml จะไดสารละลายตามตองการ

3) ถาตองการเตรยมสารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด (NaOH) เขมขน 0.5 M จานวน 250 ml จะตองใช NaOH กกรม

คานวณหาปรมาณของ NaOH ทใชเตรยมสารละลาย สารละลาย NaOH เขมขน 0.5 M หมายความวา ในสารละลาย NaOH 1000 ml มเนอสาร NaOH 0.5 mol ถาสารละลาย NaOH 250 ml มเนอสาร NaOH 0.5 mol x 250 ml

1000 ml = 0.125 mol

เปลยนหนวยจาก mol เปนนาหนก (g)

ซง จานวนโมล (mole, mol) = นาหนกของสาร (g) นาหนกโมเลกลของสาร (g/mol)

0.125 mol = นาหนกของสาร (g)

40 g/mol ปรมาณของ NaOH ทใช = 0.125 mol x 40 g/mol = 5 g

นนคอ ในการเตรยมสารละลาย NaOH เขมขน 0.5 M จานวน 250 ml เตรยมโดยชง NaOH 5 g ละลายในตวทาละลาย (นากลน) แลวปรบปรมาตรดวยนากลนในขวดวดปรมาตรใหไดปรมาตรเปน 250 ml จะไดสารละลายตามตองการ

27

4) ถาตองการเตรยมสารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด (NaOH) เขมขน 0.5 N จานวน 250 ml จะตองใช NaOH กกรม

คานวณหาปรมาณของ NaOH ทใชเตรยมสารละลาย สารละลาย NaOH เขมขน 0.5 N หมายความวา ในสารละลาย NaOH 1000 ml มเนอสาร NaOH 0.5 กรมสมมล ถาสารละลาย NaOH 250 ml มเนอสาร NaOH 0.5 กรมสมมล x 250 ml

1000 ml = 0.125 กรมสมมล

เปลยนหนวยจากจานวนกรมสมมลเปนนาหนก (g)



MW ของ NaOH = 40

NaOH ม OH- อะตอม = 1

นาหนกกรมสมมล = 40 1

= 40 g

จากสตร จานวนกรมสมมล = นาหนกของสาร (g) นาหนกกรมสมมลของสาร (g)

0.125 = นาหนกของสาร (g) 40 g นาหนกของ NaOH = 5 g

นนคอ ในการเตรยมสารละลาย NaOH เขมขน 0.5 N จานวน 250 ml เตรยมโดยชง NaOH 5 g ละลายในตวทาละลาย (นากลน) แลวปรบปรมาตรดวยนากลนในขวดวดปรมาตรใหไดปรมาตรเปน 250 ml จะไดสารละลายตามตองการ

28

3.3.2 การเตรยมสารละลายจากสารละลายเขมขน 1) ตองการเตรยมสารละลายกรด HCl เขมขน 0.1 M จานวน 500 ml จากสารละลายกรด

HCl เขมขน 37% โดยนาหนก มความหนาแนน 1.19 g/cm3 มนาหนกตามสตร (formular weight) เทากบ 36.46 g/mol จะตองใชสารละลายกรด HCl เขมขน 37% โดยนาหนก กมลลลตร

สารละลายกรด HCl เขมขน 0.1 M หมายความวา ในสารละลายกรด HCl 1000 ml มเนอกรด HCl อย 0.1 mol ถาสารละลายกรด HCl 500 ml มเนอกรด HCl อย 0.1 mol x 500 ml 1000 ml = 0.05 mol

เปลยนหนวยจาก mol ใหเปนนาหนก (g)

ซง จานวนโมล (mole, mol) = นาหนกของสาร (g) นาหนกโมเลกลของสาร (g/mol)

0.05 mol = นาหนกของสาร (g) 36.46 g/mol ปรมาณของสารละลายกรด HCl ทใช = 0.05 mol x 36.46 g/mol = 1.823 g

แตเนองจากสารละลายกรด HCl ทนามาใชเตรยมสารละลายมความเขมขน 37 % โดยนาหนก

ซงสารละลายกรด HCl เขมขน 37% โดยนาหนก หมายความวา ในสารละลายกรด HCl 100 g มเนอกรด HCl อย 37 g

นนคอ มเนอกรด HCl 37 g ในสารละลายกรด HCl 100 g หากตองการเนอกรด HCl 1.823 g ใชสารละลายกรด HCl 100 g x 1.823 g

37 g = 4.927 g และเนองจากสารละลายกรด HCl ทใชเตรยมสารละลายอยในรปสารละลายทเปนของเหลวจงตองเปลยนหนวยจากนาหนกใหอยในรปของปรมาตร จากสตร ความหนาแนน = นาหนก ปรมาตร

สารละลายกรด HCl มความหนาแนน 1.19 g/cm3

29

1.19 g/cm3 = 4.927 g ปรมาตร ปรมาตรสารละลายกรด HCl เขมขน 37% ทตองใชในการเตรยมสารละลาย = 4.927 g 1.19 g/cm3 = 4.14 ml

นนคอ ในการเตรยมสารละลายกรด HCl เขมขน 0.1 M จานวน 500 ml จะตองใชสารละลายกรด HCl เขมขน 37% โดยนาหนก 4.14 ml เจอจางดวยนากลน แลวปรบปรมาตรดวยนากลนในขวดวกปรมาตรใหไดปรมาตรเปน 500 ml จะไดสารละลายตามตองการ

2) จงเตรยมสารละลายกรดอะซตก (CH3COOH) เขมขน 0.25 mol/l (M) ปรมาตร 100 ml

จากสารละลายกรดอะซตกเขมขน 0.5 mol/l (M) จากสตร C1V1 = C2V2 เมอ C1 = ความเขมขนของสารละลายกอนเจอจาง (mol/l) C2 = ความเขมขนของสารละลายหลงเจอจาง (mol/l) V1 = ปรมาตรของสารละลายกอนเจอจาง (ml) V2 = ปรมาตรของสารละลายหลงเจอจาง (ml) แทนคาลงในสตร 0.5 mol/l x V1 = 0.25 mol/l x 100 ml V1 = 0.25 mol/l x 100 ml 0.5 mol/l = 50 ml

นนคอ ในการเตรยมสารละลายกรดอะซตกเขมขน 0.25 mol/l จานวน 100 ml จะตองใช

สารละลายกรดกรดอะซตกเขมขน 0.5 mol/l 50 ml เจอจางดวยนากลน แลวปรบปรมาตรดวยนากลนในขวดวดปรมาตรใหไดปรมาตรเปน 100 ml จะไดสารละลายตามตองการ

30

3.4 วธเตรยมสารละลาย 3.4.1 การเตรยมสารละลายจากการละลายตวถกละลายทเปนของแขงในตวทาละลายท เปนของเหลว 1) คานวณหาปรมาณสารทใชในการเตรยมสารละลาย 2) ชงนาหนกตวถกละลายใหไดตามจานวน ใสในบกเกอร 3) เตมตวทาละลายลงไปเลกนอยและคนดวยแทงแกวคนจนตวถกละลายละลายหมด 4) เทสารละลายในบกเกอรลงในขวดวดปรมาตรตามขนาดทตองการ 5) ลางบกเกอรดวยตวทาละลายทละนอยหลาย ๆ ครงเพอลางสารทตดในบกเกอร แลวเทเตมลงในขวดวดปรมาตร 6) เมอปรมาตรรวมของสารละลายในขวดวดปรมาตรใกลถงขดบอกปรมาตรบรเวณคอขวดใหใชหลอดหยดเตมตวทาละลายลงในขวดวดปรมาตรทละนอยจนถงขดบอกปรมาตร โดยเมอมองในระดบสายตา ใหสวนโคงตาสดของสารละลายอยตรงขดบอกปรมาตรพอด 7) ปดจกขวด แลวกลบขวดขนลงใหสารละลายผสมกน 8) ถายสารละลายจากขวดวดปรมาตรเกบใสขวดสชา พรอมทงปดฉลากระบ ชอสาร ความเขมขนและวนทเตรยมสาร

3.4.2 เตรยมสารละลายจากสารละลายเขมขน (dilution) 1) คานวณหาปรมาตรสารตวอยางทใชในการเตรยมสารละลาย 2) ใชปเปตดดสารละลายตวอยางใหไดตามจานวน ใสลงในขวดวดปรมาตรตามขนาดทตองการ ซงภายในขวดมนากลนหรอตวทาละลายบรรจอยแลวบางบางสวน 3) เทเตมตวทาละลายเพมลงในขวดวดปรมาตร 4) เมอปรมาตรรวมของสารละลายในขวดวดปรมาตรใกลถงขดบอกปรมาตรบรเวณคอขวดใหใชหลอดหยดเตมตวทาละลายลงในขวดวดปรมาตรทละนอยจนถงขดบอกปรมาตร โดยเมอมองในระดบสายตา ใหสวนโคงตาสดของสารละลายอยตรงขดบอกปรมาตรพอด 5) ปดจกขวด แลวกลบขวดขนลงใหสารละลายผสมกน 6) ถายสารละลายจากขวดวดปรมาตรเกบใสขวดสชา พรอมทงปดฉลากระบ ชอสาร ความเขมขนและวนทเตรยมสาร

31

เอกสารอางอง วนเพญ จตรเจรญ. 2541. บทปฏบตการเคมอาหาร 1. สถาบนเทคโนโลยราชมงคล วทยาเขตลาปาง. 118 น. ประเสรฐ ศรไพโรจน. 2544. เทคนคทางเคม. พมพครงท 5. ประกายพรก, กรงเทพ ฯ. 243 น. ศภชย ใชเทยมวงศ. 2543. ปฏบตการเคมปรมาณวเคราะห. พมพครงท 6. สานกพมพแหงจฬาลงกรณมหาวทยาลย, กรงเทพ ฯ. 260 น. ประเสรฐ ศรไพโรจน. 2545. เคมพนฐานเลม 1. พมพครงท 1. ภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยศรนครนทรวโรฒ, กรงเทพฯ. 356 น. อนทรา หาญพงษพนธ. 2539. เคมทวไปสาหรบนสตวศวกรรมศาสตร. พมพครงท 6. สานกพมพแหงจฬาลงกรณมหาวทยาลย, กรงเทพ ฯ. 495 น. ประภาณ เกษมศร ณ.อยธยา อาพน เพญโรจน สะอาดศร กาญจนาลย ศภชย ใชเทยมวงศ และมานตย ปญจมาลา. 2541. เคมทวไป 1. พมพครงท 7. สานกพมพแหงจฬาลงกรณมหาวทยาลย, กรงเทพ ฯ. 380 น. นภดล ไชยคา พรวรรณ พนธมนาวน และ ลดดาวลย ผดงทรพย. เคม 1. สานกพมพทอป, กรงเทพ ฯ. 818 น. แปลจาก Raymond Chang (ed.). ___________. __________. วธการใชอปกรณวทยาศาสตร [ออนไลน]. เขาถงไดจาก : http://www. thainame.net /project/rujaruk/science2.html (27/2/2552) ศนยวทยาศาสตรและวทยาศาสตรประยกต มหาวทยาลยราชภฏเพชรบร. 2547. อปกรณในหองปฏบตการเคม [ออนไลน]. เขาถงไดจาก : http://psc.pbru.ac.th/CHEM/CHEM.htm (27/2/2552)

โครงการพฒนาเนอหาความรสาหรบเครอขายคอมพวเตอรเพอโรงเรยนไทย. 2543. เทคนคทางเคม [ออนไลน]. เขาถงไดจาก : http://web.ku.ac.th/schoolnet/f-snet5.htm (2/3/2552)

โครงการพฒนาเนอหาความรสาหรบเครอขายคอมพวเตอรเพอโรงเรยนไทย. 2543. ปรมาณสารสมพนธ [ออนไลน]. เขาถงไดจาก : http://web.ku.ac.th/schoolnet/f-snet5.htm (2/3/2552)

โรงเรยนลาปางกลยาณ. 2551. การเตรยมสารละลาย [ออนไลน]. เขาถงไดจาก : http://www.lks.ac.th/ student/kroo_su/chem16/4.8.htm (6/3/2552)

กาญจนา เหมอนแปน. 2546. การเตรยมสารละลาย [ออนไลน]. เขาถงไดจาก : http://ebook.nfe.go.th/ ebook/pdf/023/0023_98.pdf (6/3/2552)

32

การเตรยมตวอยางสาหรบการวเคราะห

ตวอยางอาหารทนามาวเคราะหควรทาใหเปนเนอเดยวกน โดยการบดละเอยด แลวแบงออกมา ในปรมาณทเหมาะสม ซงตวอยางทนามาวเคราะหนนตองเปนตวแทนของตวอยางทงหมดได ตวอยางผก ผลไม นาตวอยางมาลางนาใหสะอาด แยกเฉพาะสวนทกนได (edible portion) นาไปบดละเอยดใหเปนเนอเดยวกน ตวอยางอาหารแหง ตวอยางอาหารแหง เชน แปง เครองเทศ หรอธญพช จะตองนามาบดละเอยดและผสมใหเขากน บางชนดอาจตองรอนผานตะแกรงตามความเหมาะสม และเกบไวในภาชนะทแหง สะอาด ตวอยางเนอ ปลา นาตวอยางลางนาใหสะอาด แยกเฉพาะสวนทกนได หนเปนชนเลกแลวนาไปบดละเอยดใหเปนเนอเดยวกน ตวอยางอาหารกระปอง นาตวอยางทงหมดมาปนรวมใหเปนเนอเดยวกน หรออาจแยกเฉพาะสวนทเปนเนอนาไปวเคราะหโดยการ drain นาออก แลวนาสวนทเปนเนอไปบดละเอยดใหเปนเนอเดยวกนเพอนาไปวเคราะห

33

บทปฏบตการท 1 การวเคราะหหาปรมาณความชน

หลกการ ปรมาณความชน (Moisture Content) เปนปจจยสาคญอยางหนงทใชในการควบคมคณภาพของ

ผลตภณฑอาหาร ทงนเนองจากปรมาณความชนเปนตวบงบอกถงปรมาณนาทมอยในอาหาร ซงเปนสาเหตสาคญททาใหอาหารเกดการเนาเสยและสงผลตอระยะเวลาในการเกบรกษาของอาหาร โดยมกใชปรมาณความชนในการกาหนดราคาซอขายทยตธรรมตอทงผซอและผขาย เชน การวดความชนของขาวเปลอก เพอกาหนดราคารบซอ หรอการควบคมความชนของอาหารผง เชน นมผง ทหากมความชนมากไปจะ ทาใหเกดการจบตวกนเปนกอนและเกดการเสอมเสยไดงาย ในฐานะผซอยอมไมตองการวตถดบหรอสนคาทมความชนสง จงตองมการควบคมความชน เปนตน

การวเคราะหหาปรมาณความชนโดยวธอบแหงเปนการหานาหนกของตวอยางอาหารทหายไป เนองจากการระเหยของนาทมอยในอาหารภายหลงจากการใหความรอนแกอาหารเพอระเหยนาจนหมด หรออาจกลาวไดวาปรมาณความชน คอ ปรมาณนาในอาหารทระเหยออกไปภายหลงจากการใหความรอนแกอาหารเพอระเหยนาจนหมดนนเอง ซงปรมาณความชนทไดจากการวเคราะหดวยวธนนอกจากนาแลว ยงอาจรวมถงสารประกอบอน ๆ ทระเหยได (volatile matter) เชน กรดบางอยางหรอนามนหอมระเหย เปนตน

การวเคราะหหาปรมาณความชนโดยวธอบแหงสามารถแบงไดเปนหลายวธตามลกษณะของเครองมอ ทใชในการใหความรอน เชน การอบแหงโดยใชตอบไฟฟา (Air Oven Method ) ตอบแหงแบบสญญากาศ (Vacuum Oven Method ) การอบแหงดวยไมโครเวฟ (Microwave Oven Method) รงสอนฟราเรด (Infrared drying) และฮาโลเจน (Halogen drying) นอกจากใชการอบแหงแลวยงสามารถวเคราะหปรมาณความชน ในอาหารไดโดยวธอน เชน การกลนหรอไทเทรต เปนตน การวเคราะหหาปรมาณความชนโดยวธอบแหงในตอบไฟฟาเปนการใชความรอนแบบลมรอนในการ ทาใหนาระเหยออกจากตวอยาง โดยเมอความรอนสมผสกบอาหารความรอนจากอากาศจะถกถายเทไปยงผวของชนอาหารและทาใหนาในอาหารเปลยนสถานะจากของเหลวกลายเปนไอ ไอนาจะแพรผานชนของอาหารและถกพาออกไปพรอมกบการเคลอนทของอากาศรอน ทาใหความดนไอของอากาศทผวของอาหารลดลง เกดความแตกตางของความดนไอนาของความชนในอาหารกบในอากาศรอน ซงเปนแรงผลกดน ทาใหนาในอาหารระเหยออกมา ขอดของการวเคราะหดวยวธน คอ สามารถตรวจวเคราะหตวอยาง พรอมกนไดจานวนมากและใชกบตวอยางทไมเปนเนอเดยวกนได สวนขอเสยของการวเคราะหดวยวธนคอใชเวลานาน และตวอยางอาจดดความชนจากอากาศภายหลงจากการทาแหงกอนทจะนาไปชงนาหนก อาจทาใหผลทไดคลาดเคลอนจากความเปนจรง นอกจากนการใหความรอนทสงเกนไปอาจทาใหตวอยางเสยสภาพได

34

วตถประสงค 1. เพอใหนกศกษาไดทราบวธการและเรยนรเทคนคการวเคราะหหาปรมาณความชนของอาหารโดยวธ อบแหงในตอบไฟฟา (Air Oven Method) 2. เพอทราบปรมาณความชนของอาหารชนดตาง ๆ และเปรยบเทยบปรมาณความชนของอาหารแตละชนด วสด อปกรณ 1. ภาชนะอะลมเนยมสาหรบหาความชน (aluminium can/moisture can) 2. ตอบไฟฟา (Hot air oven) 3. เครองชงไฟฟาทศนยม 4 ตาแหนง 4. โถดดความชน (desiccator) 5. ทคบ (Tong) 6. อปกรณสาหรบเตรยมตวอยาง (มด เขยง เครองบดอาหารแหง) 7. ชอนตกสาร 8. ตวอยางอาหาร วธการทดลอง 1. อบภาชนะสาหรบหาปรมาณความชนพรอมฝาในตอบไฟฟาทอณหภม 105 องศาเซลเซยส เปนเวลานาน 2-3 ชวโมง นาออกจากตอบใสไวในโถดดความชน วางทงไวจนกระทงอณหภมของภาชนะลดลงเทากบอณหภมหอง (ใชเวลาประมาณ 15-30 นาท) ชงนาหนกและบนทกผล 2. อบภาชนะอะลมเนยมซาเชนเดยวกบขอ 1 จนไดนาหนกคงท (ผลตางของนาหนกทชง 2 ครงตดตอกนไมเกน 0.001-0.003 กรม) บนทกนาหนกทได 3. เตรยมตวอยางโดยสบหรอบดตวอยางอาหารใหมขนาดเลกเพอเพมพนทผวทาใหระเหยนาไดงาย 4. ชงตวอยางใหไดนาหนกทแนนอนประมาณ 3-5 กรม (บนทกเปนนาหนกตวอยางกอนอบ) ใสในภาชนะหาความชนซงทราบนาหนกทแนนอนแลว (ทาซาตวอยางละ 3 ซา) 5. นาไปอบในตอบไฟฟา โดยเปดฝาภาชนะ ทอณหภม 105 องศาเซลเซยส เปนเวลาประมาณ 3-4 ชวโมง เมอครบกาหนดเวลา ปดฝาภาชนะ นาออกจากตอบและวางไวในโถดดความชนจนกระทงอณหภมลดลง จนเทาอณหภมหอง (ใชเวลาประมาณ 15-30 นาท) ชงนาหนก บนทกผล 6. นาไปอบซาอกประมาณครงละ 30 นาท และกระทาเชนเดมจนไดนาหนกคงท (ผลตางของนาหนกทชง 2 ครงตดตอกนไมเกน 0.001-0.003 กรม) บนทกนาหนกทได 7. คานวณหาปรมาณความชน

35

ปรมาณความชน (รอยละโดยนาหนก) = (นาหนกตวอยางกอนอบ-นาหนกตวอยางหลงอบ) (กรม) x 100 นาหนกตวอยางกอนอบ (กรม) ผลการทดลอง ตารางท 1.1 ผลการวเคราะหหาปรมาณความชนในตวอยาง.........................

ซาท นน. ภาชนะ

(กรม) นน. ตวอยางกอนอบ (กรม)

นน. ตวอยางรวมนน. ภาชนะ หลงอบ (กรม)

นน. ตวอยาง หลงอบ (กรม)

นน. ตวอยาง กอนอบ

– นน. ตวอยาง หลงอบ (กรม)

ปรมาณความชน (รอยละโดย นน.)

1 2 3

คาเฉลย

เอกสารอางอง คณาจารยภาควชาวทยาศาสตรการอาหารและโภชนาการ. 2551. บทปฏบตการวชา 712-331 เคมอาหาร.

ภาควชาวทยาศาสตรการอาหารและโภชนาการ คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลย สงขลานครนทร วทยาเขตปตตาน. 44 น.

เนอทอง วนานวธ สมจตร สรพฒน อรอนงค นยวกล และ วรรณ จรภาคยกล. 2546. คมอปฏบตการรายวชา 052415 Laboratory in Food Biochemistry and Analysis. ภาควชาวทยาศาสตรและเทคโนโลยการอาหาร คณะอตสาหกรรมเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร. 86 น.

วรรณา ตงเจรญชย นภสรพ เหลองสกล และ ลาพง พมจนทร. 2550. ปฏบตการเคมวเคราะหอาหาร. คณะอตสาหกรรมเกษตร สถาบนเทคโนโลยพระจอมเกลาเจาคณทหารลาดกระบง. 68 น.

เอกดนย กอกมพงษ. ________. Moisture Determination : Thermogravimetric method [ออนไลน]. เขาถงไดจาก : http://www.thaiscience.com/lab_vol/p25/Moisture_Determination.asp (25/3/2552)

A.O.A.C. 2000. Official Method of Analytical Chemists. 17th ed. The Association of Official Analytical Chemists. Verginia.

36

บทปฏบตการท 2 การวเคราะหหาปรมาณไขมน

หลกการ ไขมนเปนสวนประกอบหลกทพบในอาหารแทบทกประเภท มบทบาทสาคญในการกาหนดลกษณะทางกายภาพของอาหาร เชน กลนรส (flavor), เนอสมผส (texture) และความรสกในปาก (mouth feel) นอกจากนยงกอใหเกดปฏกรยาออกซเดชนในอาหาร ซงเปนสาเหตททาใหอาหารเกดกลนรสทไม พงปรารถนา (off-flavor) ได

เนองจากไขมนมสมบตไมละลายนาแตจะละลายไดในตวทาละลายอนทรย ดงนนการวเคราะหหาปรมาณไขมนในอาหารจงแยกสกดไขมนออกจากตวอยางอาหารดวยตวทาละลายอนทรยชนดตาง ๆ เชน ปโตรเลยมอเทอร (petroleum ether) หรอไดเอทลอเทอร (diethyl ether) ซงตวอยางอาหารทนามาวเคราะหจะตองเปนตวอยางทแหง เนองจากนาจะขดขวางการชะไขมนออกจากตวอยางของตวทาละลาย ทาใหสกดไขมนไดไมด และตวอยางตองบดละเอยดเพอเพมพนทในการสมผสกบตวทาละลาย โดยการสกดจะใชเวลามากหรอนอยขนกบปรมาณไขมนในตวอยาง ภายหลงจากการสกดนาไประเหยแยกตวทาละลายออก สารทสกดไดเรยกวา ether extracted หรอ crude fat ซงจะมสารชนดอนทไมใชไขมน เชน เมดสตาง ๆ หรอวตามนทละลายในไขมนปนอยดวย แตมปรมาณนอยมากเมอเทยบกบสารทเปนไขมน อยางไรกด การว เคราะหไขมนโดยว ธนไมสามารถสกดไขมนทอยในรปท เปนสารเชงซอนกบโปรตนหรอคารโบไฮเดรต เชน lipoprotein หรอ glycoproteins ออกมาได จะตองยอยสลายพนธะทเชอมตอไขมน กบโมเลกลเหลานออกจากกน ซงอาจใชวธการยอยดวยกรด (acid hydrolysis) เพอปลดปลอยไขมนใหอย ในรปทสารละลายอนทรยทสามารถสกดออกมาไดงาย ซงจะชวยเพมประสทธภาพของการสกดไขมนไดดยงขน วตถประสงค 1. เพอใหนกศกษาไดทราบวธการและเรยนรเทคนคการวเคราะหหาปรมาณไขมนในอาหารดวยเครองสกดไขมน (Soxtherm automatic รน SE3M Gerhardt) 2. เพอทราบถงปรมาณไขมนทมในตวอยางอาหาร วสดอปกรณและสารเคม 1. ชดสกดไขมน ประกอบดวย 1.1 เครองสกดไขมน (Soxtherm automatic รน SE3M Gerhardt) ประกอบดวย - บกเกอรสาหรบวเคราะหหาปรมาณไขมน (Glass extraction beaker) - ลวดรองหลอดใสตวอยาง (Extraction holder thimbles)

37

- ชดอปกรณการกลน - เตาใหความรอน 1.2 ปมสญญากาศ 1.3 เครองทาความเยน (cooling bath) 2. หลอดใสตวอยาง (Thimble) 3. ตอบไฟฟา (Hot air oven) 4. โถดดความชน (desiccator) 5. ทคบ (Tong) 6. เครองชงทศนยม 4 ตาแหนง 7. กระดาษกรองเบอร 4 8. ปโตรเลยมอเทอร 9. โกรงสาหรบบดตวอยาง 10. ตวอยางอาหาร วธการทดลอง 1. อบบกเกอรสาหรบวเคราะหหาปรมาณไขมนพรอม Boiling ship ทใสลงในบกเกอรประมาณ 5-6 เมด ในตอบไฟฟาทอณหภม 105 ๐C นาน 2-3 ชวโมง วางทงไวใหเยนในโถดดความชนและชงหานาหนก ทแนนอน บนทกผล 2. ทาซาเชนเดยวกบขอ 1 จนไดนาหนกคงท (ผลตางของนาหนกทชง 2 ครงตดตอกนไมเกน 0.001-0.003 กรม) บนทกนาหนกทได 3. ชงตวอยางทผานการอบแหงและบดละเอยดแลวประมาณ 1-2 กรม (สาหรบตวอยางทมไขมนมาก) และ 3-5 กรม (สาหรบตวอยางทมไขมนนอย) ลงบนกระดาษกรอง บนทกนาหนกทแนนอน 4. หอตวอยางดวยกระดาษกรองใหมดชด แลวใสลงในหลอดสาหรบใสตวอยาง (thimble) 5. วางลวดรองหลอดใสตวอยางลงในบกเกอรไขมน แลวนาหลอดใสตวอยางใสลงในลวดรองหลอดตวอยางทวางอยในบกเกอรไขมน 6. เปดเครองสกดไขมน โดยเปดปมลมทงไวจนไมมเสยงดง จากนนเปดสวตสเครองสกดไขมน ตงอณหภมเครองท 150 ๐C และตงอณหภมเครอง cooling bath ทอณหภม 15 ๐C 7. เตมปโตรเลยมอเทอรจานวน 150 มลลลตรลงในบกเกอรไขมนทมตวอยางอย แลวตอบกเกอรเขากบตวเครองสกดไขมน 8. เมออณหภมเครองสกดไขมนทตงไว ถงอณหภม 150 ๐C ใหเรมจบเวลาในการสกดประมาณ 30 นาท (ปมอยทตาแหนง circulation)

38

9. เมอครบกาหนดเวลา ใหหมนปมจากตาแหนง circulation ไปทตาแหนง recovery โดยคางไวประมาณ 10-15 นาท โดยดจากระดบ solvent เปนหลก ซงระดบของ solvent ตองลดลงอยตากวาระดบหลอด ใสตวอยาง 10. เมอระดบ solvent ลดลงอยตากวาหลอดใสตวอยาง ใหหมนปมกลบไปท circulation 11. ทาการ rinsing 30 นาท-1 ชวโมง เพอใหตวทาละลายระเหยและกลนตวไหลชะผานตวอยางลงมา 12. เมอครบกาหนดเวลา ใหหมนปมมาท recovery และคางไวจนตวทาละลายแหงหมด แลวจงหมนปมกลบมาท circulation 13. ยกบกเกอรขนจากเตาใหความรอน และคางไวประมาณ 15 นาท 14. ตงอณหภมของเครองสกดไขมนจาก 150 ๐C ใหลดลงเหลอ 0 ๐C 15. ยกบกเกอรออกจากเครองสกดไขมน นาบกเกอรไปอบในตอบไฟฟาทอณหภม 100-102 ๐C นาน 30 นาท ทาใหเยนในโถดดความชน แลวชงนาหนก บนทกนาหนกทได 16. ทาซาโดยอบนานครงละ 30 นาท จนไดนาหนกคงท (ผลตางของนาหนกทชง 2 ครงตดตอกนไมเกน 0.001-0.003 กรม) บนทกนาหนก 17. คานวณหาปรมาณไขมน

ปรมาณไขมน (รอยละโดยนน.แหง) = นน. ไขมน (กรม) x 100 นน.ตวอยางแหง (กรม) ผลการทดลอง ตารางท 2.1 ผลการวเคราะหหาปรมาณไขมนในตวอยาง..................................................

ซาท นาหนกบกเกอรรวม boiling ship (กรม)

นาหนกตวอยางแหง (กรม)

นาหนกบกเกอรรวม Boiling

ship +

นน. ไขมนหลงอบ (กรม)

นน. ไขมน (กรม)

ปรมาณไขมน (รอยละโดย นน. แหง)

1 2 3

คาเฉลย

39

เอกสารอางอง คณาจารยภาควชาวทยาศาสตรการอาหารและโภชนาการ. 2551. บทปฏบตการวชา 712-332 การ

วเคราะหอาหาร. ภาควชาวทยาศาสตรการอาหารและโภชนาการ คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยสงขลานครนทร วทยาเขตปตตาน. 22 น.

เสาวลกษณ จตรบรรเจดกล. 2542. บทปฏบตการเคมชววสด. คณะอตสาหกรรมเกษตร มหาวทยาลย สงขลานครนทร. 25 น.

อาสาฬห จตรแจม. ____________. การวเคราะหไขมน [ออนไลน]. เขาถงไดจาก : http://www. thaiscience.com/lab_vol/p24/ fatanaly.asp (25/3/2552)

40

บทปฏบตการท 3 การวเคราะหหาปรมาณเถา

หลกการ เถา คอ สารประกอบอนนทรยทเหลอจากการใชความรอนทอณหภมสงเผาอาหารเพอสลายสารประกอบอนทรยในอาหารใหหมดไป ซงการวเคราะหหาปรมาณเถาในอาหารจะเผาทาลายสารอนทรย (organic matter) ในอาหารโดยใชความรอนจากเตาเผาทอณหภม 500-550 องศาเซลเซยส จนเหลอแต สารอนนทรย (inorganic matter) ซงปรมาณเถาในอาหารสามารถบงบอกถงปรมาณแรธาตตาง ๆ ทมอย ในอาหารได เชน การผลตแปงสาลทมการเตมแรเหลก การวเคราะหหาปรมาณแรเหลกในแปงจะตองเผาแปงใหเปนเถากอนจะนาไปวเคราะหหาปรมาณแรเหลกตอไป แตทงนคาของเถาทวเคราะหไดไมได เปนคาทแสดงถงปรมาณแรธาตทงหมดทมอยจรง ทงนเนองจากอาจมสวนประกอบของแรธาตบางชนด สญหายไปจากการระเหยขณะเผาดวยความรอนสง นอกจากนปรมาณเถายงใชเปนเครองบงชคณภาพของอาหารบางชนดได โดยสามารถใชตรวจสอบการปนเปอนของแรธาตในอาหาร ซงโดยทวไปปรมาณเถา ในอาหารแตละชนดจะคอนขางคงท หากพบวาปรมาณเถาในอาหารสงผดปกตแสดงวาอาจมการปลอมปนในอาหาร เชน การปนเปอนของทรายในขาว เปนตน วตถประสงค 1. เพอใหนกศกษาไดทราบวธการและเรยนรเทคนคการวเคราะหหาปรมาณเถาในอาหาร 2. เพอทราบปรมาณเถาทมอยในอาหารแตละชนด

วสดอปกรณ 1. ถวยกระเบองเคลอบ (porcelain crucible) สาหรบใสตวอยาง 2. เตาเผา (muffle furnace) 3. เตาไฟฟา (Hot plate) 3. เครองชงละเอยดทศนยม 4 ตาแหนง 4. โถดดความชน (desiccator) 5. ทคบ (Tong) 6. อปกรณสาหรบเตรยมตวอยาง (มด เขยง เครองบดอาหารแหง) 7. ชอนตกสารสแตนเลส 8. ตวอยางอาหาร

41

วธการทดลอง 1. เผาถวยกระเบองเคลอบพรอมฝาในเตาเผาทอณหภม 550 องศาเซลเซยส เปนเวลานาน 3 ชวโมง ปดสวทซเตาเผา แลวรอประมาณ 30-45 นาทเพอใหอณหภมภายในเตาลดลง จากนนนาถวยกระเบองออกจากเตาเผา ใสในโถดดความชน วางทงไวจนกระทงอณหภมลดลงเทากบอณหภมหอง (ใชเวลาประมาณ 15-30 นาท) ชงนาหนก บนทกผล 2. เผาถวยกระเบองเคลอบซาอกประมาณครงละ 30 นาท และกระทาเชนเดยวกบขอ 1 จนไดนาหนกคงท (ผลตางของนาหนกทชง 2 ครงตดตอกนไมเกน 0.001-0.003 กรม) บนทกนาหนกทได 3. เตรยมตวอยางโดยสบหรอบดตวอยางอาหารใหมขนาดเลก 4. ชงตวอยางใหไดนาหนกทแนนอนประมาณ 3-5 กรม (บนทกเปนนาหนกกอนเผา) ใสในถวยกระเบองเคลอบซงทราบนาหนกทแนนอนแลว (ทาซาตวอยางละ 3 ซา) 5. นาถวยกระเบองเคลอบทบรรจตวอยางไปเผาบนเตาไฟฟา (Hot plate) จนหมดควน (ทาในตดดควน) แลวจงนาไปเผาในเตาเผาทอณหภม 550 องศาเซลเซยส โดยเปดฝาภาชนะเปนเวลาประมาณ 3-4 ชวโมง จนกระทงตวอยางกลายเปนเถาสขาวหรอสเทาออน 6. เมอครบกาหนดเวลา ปดสวทซเตาเผา แลวรอประมาณ 30-45 นาท เพอใหอณหภมภายในเตาเผาลดลง จากนนนาถวยกระเบองออกจากเตาเผานาไปใสในโถดดความชน โดยปดฝาถวยในแตละตวอยาง ปลอยทงไวจนกระทงอณหภมลดลงเทากบอณหภมหอง (ใชเวลาประมาณ 15-30 นาท) ชงนาหนก บนทกผล 8. นาไปเผาซาอกประมาณครงละ 30 นาท และกระทาเชนเดมจนไดนาหนกคงท (ผลตางของนาหนกทชง 2 ครงตดตอกนไมเกน 0.001-0.003 กรม) บนทกนาหนกตาสด 9. คานวณหาปรมาณเถา

ปรมาณเถา (รอยละโดยนาหนก) = นาหนกตวอยางหลงเผา (กรม) x 100 นาหนกตวอยางกอนเผา (กรม) ผลการทดลอง ตารางท 3.1 ผลการวเคราะหหาปรมาณเถาในตวอยาง.....................................

ซาท นาหนกภาชนะ

(กรม) นาหนกตวอยางกอนเผา (กรม)

นาหนกตวอยาง รวมภาชนะหลงเผา

(กรม)

นาหนกตวอยางหลงเผา (กรม)

ปรมาณเถา (รอยละโดย นน.)

1 2 3

คาเฉลย

42

เอกสารอางอง คณาจารยภาควชาวทยาศาสตรการอาหารและโภชนาการ. 2551. บทปฏบตการวชา 712-332

การวเคราะหอาหาร. ภาควชาวทยาศาสตรการอาหารและโภชนาการ คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยสงขลานครนทร วทยาเขตปตตาน. 22 น.



ศนยวจยและพฒนาอาหารสตวนครราชสมา. _________. การวเคราะหเถา(Ash) [ออนไลน]. เขาถงไดจาก : http://www.dld.go.th/ncna_nak/index/Ash.html (25/3/2552) A.O.A.C. 2000. Official Method of Analytical Chemists. 17th ed. The Association of Official Analytical Chemists. Verginia.

43

บทปฏบตการท 4 การวเคราะหหาปรมาณโปรตน

หลกการ โปรตนเปนสารประกอบอนทรยทมไนโตรเจนเปนองคประกอบ ดงนนการวเคราะหหาปรมาณโปรตนในอาหารจงทาไดโดยการวเคราะหหาปรมาณไนโตรเจนทงหมดทมในอาหาร แลวคณดวยคา แฟคเตอร (F) ซงการวเคราะหหาปรมาณไนโตรเจนทงหมดโดยวธเจลดาหล (Kjeldahl Method) ประกอบดวยขนตอนหลก 3 ขนตอน คอ ขนตอนการยอย การกลนและการไทเทรต

1. ขนตอนการยอย (Digestion) เปนขนตอนการเปลยนสารประกอบไนโตรเจนทมในอาหารใหอยในรปของเกลอแอมโมเนยม ซลเฟต (NH4)2SO4 โดยตมตวอยางอาหารในกรดซลฟวรกเขมขน (H2SO4) ทอณหภมสง และเรงปฏกรยาดวยตวเรงปฏกรยา (Catalyst) เชน ทองแดง (Cu) ซลเนยม (Se) หรอปรอท (Hg) เพอใหตวอยางถกยอยไดเรวขน เตมโปแตสเซยมซลเฟต (K2SO4) เพอเพมจดเดอดของกรดซลฟวรก ซงหลงจากการยอย ไนโตรเจนในตวอยางอาหารจะถกเปลยนไปอยในรปเกลอแอมโมเนยมซลเฟต

Sample + H2SO4 (NH4)2SO4

2. ขนตอนการกลน (Distillation) เปนขนตอนการเปลยนแอมโมเนยมซลเฟตไปเปนกาซแอมโมเนย (NH3) และกลนเกบในสารละลายกรดบอรก (Boric acid) เพอนาไปไทเทรตหาปรมาณไนโตรเจนตอไป โดยนาสารละลายใสทไดจากการยอย มาเตมสารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด (NaOH) แอมโมเนยมซลเฟตจะถกเปลยนใหมสภาพเปนเบส อยในรปของกาซแอมโมเนยทระเหยได นามากลนเพอแยกกาซแอมโมเนยออกมาและดกจบกาซแอมโมเนยดวยสารละลายกรดบอรกเพอนาไปไทเทรตหาปรมาณไนโตรเจนตอไป

(NH4)2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2H2O + 2NH3 NH3 + H2O + B(OH)3 NH4[B(OH)4]

3. ขนตอนการไทเทรต (Titration) ไทเทรตหาปรมาณไนโตรเจน โดยนาสารละลายกรดบอรกทจบกาซแอมโมเนยไวมาไทเทรตกบสารละลายมาตรฐานกรดไฮโดรคลอรกททราบความเขมขนทแนนอน โดยใช mixed indicator เปน indicator ซงแอมโมเนย 1 โมลจะทาปฏกรยาพอดกบกรดไฮโดรคลอรก 1 โมล

NH4[B(OH)4] + HCl NH4Cl + B(OH)3 + H2O

cat.

44

ซงจากปรมาณสารละลายมาตรฐานกรดทใชในการไทเทรต สามารถคานวณหาปรมาณไนโตรเจนทงหมดได และคานวณหาปรมาณโปรตนทงหมดโดยนาปรมาณไนโตรเจนทไดมาคณดวยแฟคเตอร(Conversion factor, F) อยางไรกตามปรมาณโปรตนทคานวณไดจะสงกวาคาทเปนจรงเสมอ ทงนเนองจากการวเคราะหหาปรมาณไนโตรเจนโดยวธเจลดาหลนนจะมสารประกอบไนโตรเจนอน ๆ ทไมใชโปรตนรวมอยดวย ดงนนโปรตนทไดจากการวเคราะหโดยวธนจงอาจเรยกเปน crude protein หรอโปรตนหยาบ วตถประสงค 1. เพอใหนกศกษาไดทราบวธการและเรยนรเทคนควธวเคราะหหาปรมาณโปรตนในอาหาร 2. เพอทราบปรมาณโปรตนทมในตวอยางอาหาร วสดอปกรณและสารเคม 1. เครองชงทศนยม 4 ตาแหนง 2. kjeldalh flask 3. เครองยอย 4. เครองกาจดไอกรด 5. เครองกลน 5. บวเรต (Buret) ขนาด 50 มลลลตร 6. ขวดรปชมพ (Erlenmeyer flask) ขนาด 250 มลลลตร 7. Boiling chip 8. กรดซลฟวรกเขมขน (conc. H2SO4) 9. mixed catalyst : CuSO4 : K2SO4 = 1:10 10. สารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด (NaOH) เขมขน 40% 11. สารละลายกรดบอรกเขมขน 4 % (เตรยมโดยใชนารอน) 12. สารละลายมาตรฐานกรดไฮโดรคลอรก (HCl) เขมขน 0.1 N 13. mixed indicator 14. ตวอยางอาหาร

45

วธการทดลอง 1. ชงตวอยางใหไดนาหนกแนนอน 1-5 กรม (ขนอยกบปรมาณโปรตนในตวอยาง ถาตวอยางมปรมาณโปรตนมากใหใชตวอยางนอย) ใสลงในหลอดยอย (kjeldalh flask) เตม mixed catalyst (CuSO4 : K2SO4 อตราสวน 1:10) จานวน 10 กรม (CuSO4 0.91 กรม, K2SO4 9.09 กรม) เตมกรดซลฟวรกเขมขน 25 มลลลตร และใส Boiling chip 2-3 เมด (การเตมกรดซลฟวรกใหทาในตดดควน โดยนาหลอดยอยใสใน insert ract นาไปเตรยมในตดดควน) 2. นา insert ract ทมหลอดยอยตวอยางวางครบทกชองวางประกอบเขากบเครองยอย และเปดเครองกาจดไอกรด ตงอณหภมในการยอยตวอยางทอณหภม 200 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท จากนนปรบเพมอณหภมเปน 350 องศาเซลเซยส ทาการยอยตวอยางจนไดสารละลายใส ใชเวลาประมาณ 60 นาท รอให ไอกรดถกดดไปจนหมดและทงไวใหเยน 3. เปดนาเขาเครองกลน เปดสวตสเครองกลน รอสญญาณทเครองเปลยนจาก H เปน P 4. ตรวจสอบปรมาณนากลนและสารละลาย NaOH 40% ในถง ตลอดจนสายนากลนและสาย NaOH วาจมในถงถกตองหรอไม กดปม H2O และ NaOH ใหนากลนและสารละลาย NaOH ไหลเตมสาย โดยอาจใชหลอดยอยโปรตนรองรบ 5. เตมนากลนลงในหลอดยอยทวางทงไวจนเยนแลวประมาณ 75 มลลลตร ใหปรมาตรรวมในหลอดเทากบ 100 มลลลตร จากนนนาหลอดยอยมาตอเขากบเครองกลน 6. นาขวดรปชมพขนาด 250 มลลลตร ซงบรรจสารละลายกรดบอรกเขมขน 4 % ปรมาตร 25 มลลลตร หยด mixed indicator 2-3 หยด ไปวางไวทตาแหนงรองรบของเครองกลน โดยใหสวนปลายของอปกรณควบแนนจมอยในสารละลาย 7. ตง program เครองกลน โดย - กด program - Step 1 เตมนากลน (นากลนไหลประมาณ 10 ml/วนาท) หากเตมนากลนขางนอกเอง ตงเวลาเปน 0 - Step 2 เตมสารละลายโซเดยมไฮดรอกไซดเขมขน 40 % 50 มลลลตร ตงเวลาประมาณ 7 วนาท (สารละลาย NaOH ไหลประมาณ 10 ml ตอวนาท) - Step 3 รอทาปฏกรยา ไมตองตงคาอะไร เวลาเปน 0 - Step 4 การกลน ตงเวลาประมาณ 7 นาท (420 วนาท) Steam ตงเวลา 70 วนาท - Step 5 ดดทง ตงเวลา 30 วนาท 8. กด Run เครองจะเรมทางานตาม Step ทตงโปรแกรมไว โดยใน Step 2 เมอเตมสารละลาย NaOH ลงไป สารละลายในหลอดจะเปลยนจากสารละลายสเขยวใสเปนสดาหรอสนาเงนเขม หากสารละลาย ไมเปลยนสใหเตมสารละลาย NaOH เพมโดยกดปม NaOH จนสารละลายในหลอดยอยเปลยนสเปนสดาหรอสนาเงนเขม

46

9. หลงกลนเสรจเครองจะหยดทางาน นาหลอดยอยและสารละลายกรดบอรกในขวดรปชมพออก ลางสวนปลายของอปกรณควบแนนดวยนากลนลงในภาชนะรองรบ และกลนลางระบบทกครงทมการเปลยนตวอยาง โดยใสนากลนในหลอดยอยแลวทาการกลนโดยไมเตมดางประมาณ 3 นาท (วางขวดรปชมพเปลาในตาแหนงทรองรบ) 10. ไทเทรตสารละลายกรดบอรกดวยสารละลายมาตรฐานกรดไฮโดรคลอรกเขมขน 0.1 นอรมอล จนกระทงสของสารละลายเปลยนจากสเขยวเปนสมวงอมชมพ (ทาตวอยางละ 3 ซา) 11. ทา blank ตามวธการในขอ 1-10 โดยไมใสตวอยาง (หลงกลน Blank ไมเปลยนส) 12. หลงกลนตวอยางสดทายเสรจ ใหใหลางสวนปลายของอปกรณควบแนนดวยนากลน และกลนลางระบบเชนเดยวกบขอ 9 พรอมทงเชดทาความสะอาดเครองทงหมด 13. คานวณหาปรมาณไนโตรเจนจากสตร

ปรมาณไนโตรเจน (รอยละโดยนาหนก) = (A-B) x N HCl x 14.007 x100 Wt.sample x 1000 ปรมาณโปรตน (รอยละโดยนาหนก) = ปรมาณไนโตรเจน x F เมอ A คอ ปรมาณสารละลายกรดไฮโดรคลอรกทใชในการไทเทรตตวอยาง (มลลลตร) B คอ ปรมาณสารละลายกรดไฮโดรคลอรกทใชในการไทเทรต blank (มลลลตร) N คอ ความเขมขนของสารละลายกรดไฮโดรคลอรก (นอรมอล) Wt คอ นาหนกตวอยางเรมตน (กรม) F คอ แฟคเตอร (Conversion factor) ดจากตารางท 5.1 14.007 คอ นาหนกสมมลยของไนโตรเจน

ตารางท 4.1 คาแฟคเตอรทใชในการคานวณหาปรมาณโปรตนในอาหารชนดตาง ๆ

อาหาร % N ในอาหาร (X) F (100/X) ขาวเจาและผลตภณฑ ถวเหลองและผลตภณฑ ไข (Egg) นมและผลตภณฑนม เนอสตว (Meat) อาหารอน ๆ

16.81 17.51 14.94 15.66 16.00 16.00

5.95 5.71 6.68 6.38 6.25 6.25

47

ผลการทดลอง ตารางท 4.2 ผลการวเคราะหหาปรมาณโปรตนในตวอยาง.................................................

ซาท A

(ml) B

(ml) ปรมาณไนโตรเจน (รอยละโดย นน.)

ปรมาณโปรตน (รอยละโดย นน.)

หมายเหต

1 F = 2 3

คาเฉลย

เอกสารอางอง ใบศร สรอยสน. 2543. บทปฏบตการวชา 712-310 เคมอาหาร. ภาควชาวทยาศาสตรการอาหารและ

โภชนาการ คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยสงขลานครนทร วทยาเขตปตตาน. 28 น. คณาจารยภาควชาวทยาศาสตรการอาหารและโภชนาการ. 2551. บทปฏบตการวชา 712-332 การวเคราะห

อาหาร. ภาควชาวทยาศาสตรการอาหารและโภชนาการ คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลย สงขลานครนทร วทยาเขตปตตาน. 22 น.


นธยา รตนาปนนท. 2545. เคมอาหาร. พมพครงท 1. สานกพมพโอเดยนสโตร กรงเทพ ฯ. 504 น. ________________. 2550. ปฏบตการเคมอาหาร. คณะอตสาหกรรมเกษตร สถาบนเทคโนโลยพระจอมเกลา

เจาคณทหารลาดกระบง. 68 หนา วนเพญ จตรเจรญ. 2541. บทปฏบตการเคมอาหาร 1. สถาบนเทคโนโลยราชมงคล วทยาเขตลาปาง. 118 น. อาสาฬห จตรแจม. 2552. Protein analyzer (ตอนท 1) Kjeldahl Method [ออนไลน]. เขาถงไดจาก :

http://www.thaiscience.com/lab_vol/p23/Protein_analyzer.asp (25/3/2552)

48

บทปฏบตการท 5 การตรวจวดคาวอเตอรแอกตวต (Water Activity, Aw)

หลกการ

คาวอเตอรแอกตวต (Water Activity, Aw) คอ อตราสวนของความดนไอของนาในอาหาร (P) ตอความดนไอของนาบรสทธ (P0) ทอณหภมเดยวกน

Aw = P P0 หรอ Aw = %ERH 100

เมอ ERH = equilibrium relative humidity หรอความชนสมพทธทจดสมดล (ความชนสมพทธของอากาศทสมดลกบอาหาร)

ซงคาวอเตอรแอกตวตของผลตภณฑอาหารสามารถวดไดจากคาความชนสมพทธของอากาศทปลอยใหสมดลกบความชนของอาหาร ดงนนผลตภณฑจะตองถกวางไวในระบบปดเพอใหเกดความสมดลได ซง จดทเกดความสมดลคอจดทคาวอเตอรแอกตวตของตวอยางมคาเทากบความชนสมพทธในอากาศนนเอง

คาวอเตอรแอกตวตเปนปจจยสาคญทใชในการควบคมและปองกนการเสอมเสยของผลตภณฑอาหาร ซงมผลโดยตรงตอการกาหนดอายการเกบรกษาของผลตภณฑอาหาร ทงนเนองจากวอเตอรแอกตวตหรอแอกตวตของนา หมายถง นาในอาหารทอยในสภาพทจลนทรยสามารถนาไปใชในการเจรญเตบโตได และสามารถกอใหเกดปฏกรยาการเปลยนแปลงทางเคมตาง ๆ ได จงมผลตอการเปลยนแปลงของผลตภณฑอาหารทงทางดาน ส กลน รสชาตรวมถงการเจรญเตบโตของจลนทรยซงเปนสาเหตสาคญททาใหอาหารเกดการเนาเสย ดงนนคาวอเตอรแอกตวตจงเปนปจจยสาคญในการบอกถงคณภาพของผลตภณฑอาหาร โดยอาหารทมคาวอเตอรแอกตวตสงจะเกดการเสอมเสยไดงายและมอายการเกบรกษาทสนกวาอาหารทมคาวอเตอรแอกตวตตา คาวอเตอรแอกตวตมคาตงแต 0-1 อาหารสด เชน เนอสตว ผกสดจะมคา Aw สง คอมคา Aw > 0.9 อาหารกงแหง เชน แยม กงแหง จะมคา Aw ปานกลาง คอมคา Aw อยในชวง 0.6-0.9 ขณะทอาหารแหงตาง ๆ เชน นมผง ธญพช จะมคา Aw ตา คอมคา Aw ตากวา 0.6 ซงความสมพนธระหวางปรมาณความชนและคาวอเตอรแอกตวตของอาหารจะมลกษณะเปนไปในทศทางเดยวกน กลาวคอ เมอปรมาณความชนสงคาวอเตอรแอกตวตกสงดวย แตไมไดมความสมพนธกนในเชงเสนตรง

การลดคาวอเตอรแอกตวตในผลตภณฑอาหารสามารถทาไดโดยการลดปรมาณนาในอาหาร ซงกระบวนการทใชเพอลดปรมาณนาในอาหาร ไดแก การทาใหขน การทาแหง หรอการเตมตวถกทาละลายตาง ๆ เชน เกลอ นาตาล ลงไป

49

วตถประสงค 1. เพอใหนกศกษาไดทราบวธการและเรยนรเทคนคการวดคาวอเตอรแอกตวตในอาหารดวยเครองวดคา วอเตอรแอกตวต 2. เพอเปรยบเทยบคาวอเตอรแอกตวตของอาหารประเภทตาง ๆ วสดอปกรณ 1. อปกรณสาหรบเตรยมตวอยาง เชน มด เขยง เครองบดอาหาร 2. เครองวดคาวอเตอรแอกตวต (water activity meter) 3. เครองชงไฟฟา 4. ตวอยางอาหาร 3 ชนด (ตวอยางอาหารสด อาหารกงแหง และอาหารแหง) วธการทดลอง 1. เตรยมเปดเครองวดคาวอเตอรแอกตวตตามคมอการใชเครอง โดยเสยบปลก และกดปมสวทซเปดซงอยดานหลงเครอง ทาการวอรมเครองกอนใชงานประมาณ 30 นาท 2. Calibrate เครองดวยสารละลาย NaCl ทมคา Aw อยในชวงเดยวกบตวอยางอาหารทตองการวดทกครงกอนใชเครอง หรออาจใชนากลนในการ Calibrate โดยจะมคา Aw อยในชวง 0.997-1.003 3. บรรจตวอยางอาหารบดละเอยดลงในภาชนะบรรจทใชสาหรบเครองวดคาวอเตอรแอกตวต ใหไดปรมาณประมาณ 1 ใน 3 ของภาชนะบรรจ 4. เกลยตวอยางกระจายใหทว ครอบคลมพนทของกนภาชนะบรรจ และตรวจสอบความสะอาดบรเวณขอบและดานนอกของภาชนะบรรจ 5. ใสภาชนะบรรจลงไปในชองใสตวอยาง หมนปมจากตาแหนง OPEN/LOAD ไปยงตาแหนง READ เครองจะเรมทาการวดคาวอเตอรแอกตวต (วดตวอยางละ 3 ซา) 6. เมอเครองทาการวดคาวอเตอรแอกตวตเสรจเรยบรอยจะมสญญาณเตอน ทหนาจอ LCD ของเครองจะแสดงคาวอเตอรแอกตวตทอานคาไดสดทาย พรอมอณหภมของตวอยาง 7. บนทกคาวอเตอรแอกตวตทวดได และทาความสะอาดเครองกอนวดคาวอเตอรแอกตวตของตวอยางอาหารตอไป 8. เมอใชงานเสรจ ทาความสะอาดเครอง ปดสวตซทดานหลงและถอดปลก 9. ทาความสะอาดเซนเซอรดวย cleaning solution โดยไขนอตดานหลงเครองและถอดฝาครอบออก จากนนใชไมพนกระดาษชบ cleaning solution เชดทาความสะอาด เซนเซอรทอยดานขวามอ

50

ผลการทดลอง ตารางท 5.1 ผลการวดคาวอเตอรแอกตวตในตวอยางอาหาร.........................................

ตวอยางอาหาร คา Aw

อณหภม ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 เฉลย

1.

2.

3.

เอกสารอางอง

คณาจารยภาควชาวทยาศาสตรการอาหารและโภชนาการ. 2551. บทปฏบตการวชา 712-331 เคมอาหาร. ภาควชาวทยาศาสตรการอาหารและโภชนาการ คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลย สงขลานครนทร วทยาเขตปตตาน. 44 น. นธยา รตนาปนนท. 2545. เคมอาหาร. พมพครงท 1. สานกพมพโอเดยนสโตร กรงเทพ ฯ. 504 น. รชน ตณฑะพานชกล. 2547. เคมอาหาร. พมพครงท 2. สานกพมพมหาวทยาลยรามคาแหง กรงเทพ ฯ. 404 น.

รตนนท พรรณารโณทย. 2552. บทบาทของ Water Activity (Aw) ในอตสาหกรรมอาหาร [ออนไลน]. เขาถงไดจาก :http://www.tws.ac.th/thoenwit/Library/charpa/www.charpa.co.th/bulletin/water_activity. html (25/3/2552)

51

บทปฏบตการท 6 การเกดอมลชนและผลของอมลซไฟเออร

(Emulsion forming and effects of emulsifier)

หลกการ อมลชน (Emulsion) เปนระบบคอลลอยดชนดหนงทพบในอาหาร ประกอบดวยของเหลวตงแต 2 ชนดขนไป ซงปกตจะไมรวมเปนเนอเดยวกน เชน นากบนามน ถกนามาผสมใหเปนเนอเดยวกน ดวยการทาใหของเหลวชนดหนงแตกตวเปนหยดเลก ๆ (วฎภาคกระจายตว (dispered phase)) และกระจายตวอยในของเหลวอกชนดหนง (วฎภาคตอเนอง (continuous phase)) ซงอมลชนทเกดขนจะไมคงตว ตองเตมอมลซไฟเออรเปนตวชวยใหวฎภาคกระจายตวสามารถกระจายตวและคงตวอยในวฎภาคตอเนองได

อมลชนทพบในอาหารม 2 ชนด ไดแก 1) อมลชนชนดนามนในนา (oil in water, O/W) เปนอมลชนทมวฎภาคกระจายตวเปนนามนกระจายตวปนหยดเลก ๆ อยในวฎภาคตอเนองทเปนนา เชน นานม นาสลด และมายองเนส 2) อมลชนชนดนาในนามน (water in oil, W/O) เปนอมลชนทมวฎภาคกระจายตวเปนนา กระจายตวปนหยดเลก ๆ อยในวฎภาคตอเนองทเปนนามน เชน เนย

อมลซไฟเออร (Emulsifiers) คอ สารใด ๆ ทชวยใหวฎภาคกระจายตวสามารถกระจายตวและ คงตวอยในวฎภาคตอเนองได และเกดเปนอมลชน โดยอมลซไฟเออรจะชวยลดแรงตงผวของวฎภาคกระจายตวและวฎภาคตอเนอง ทาใหใหวฎภาคกระจายตวสามารถกระจายตวและคงตวอยในวฎภาคตอเนองได สารอมลซไฟเออรเปนสารประกอบทสามารถละลายไดทงในวฎภาคกระจายตวและวฎภาคตอเนอง เนองจากสามารถละลายหรอกระจายตวไดทงในนาและนามนหรอทเรยกวาเปนโมเลกลแอมพไฟล โดยโมเลกลของอมลซไฟเออรจะมทงสวนทเปนโพลารซงสามารถละลายไดในนา และสวนทเปนอะโพลารซงสามารถละลายไดในนามน ทาใหเชอมรอยตอระหวางวฎภาคนาและนามนไดด ชวยลดพลงงานอสระ ทผวทาใหวฎภาคกระจายตวรวมตวกนไดนอย ซงอมลซไฟเออรทใชในการลดแรงตงผวของอมลชน ม 2 ชนด คอ อมลซไฟเออรทมขนาดเลก (low molecular weight (MW) emulsifier) และสามารถลดแรง ตงผวไดมาก ไดแก ฟอสโฟลพด โมโนกลเซอรไรดและไดกลเซอรไรด แตอมลซไฟเออรเหลาน ไมสามารถรกษาความคงตวของอมลชนในระยะยาว จาเปนตองใชสารอมลซไฟเออรทมขนาดใหญ (high MW emulsifier) ซงไดแกโปรตน ซงทาหนาทรกษาความคงตวของอมลชนโดยใชกลไกการเพมประจ บนพนผวของเมดไขมน กลไกการกดขวางทพนผวของเมดไขมนโดยใชโมเลกลหรออนภาคท ผว รวมระหวางนามนกบนา นอกจากนโปรตนบางชนดทาหนาทเพมความหนดของวฎภาคนา ซงจะชะลอ การเคลอนทของเมดไขมนเขาหากน ทาใหระบบอมลชนคงตวอยได

52

กลไกการเกดอมลชน การทาอมลชน คอ การทาใหของเหลว 2 ชนด ซงปกตไมรวมเปนเนอเดยวกน ผสมเปนเนอเดยวกน โดยทาใหของเหลวทเปนวฎภาคกระจายตวแตกตวเปนหยดเลก ๆ กระจายตวอยในวฎภาคตอเนอง เชน การเขยานามนในนา นามนจะแตกตวเปนอนภาคเลก ๆ กระจายตวอยในนา แตเมอวางทงไวระยะเวลาหนง อนภาคนามนเลก ๆ จะคอย ๆ รวมตวกนเปนอนภาคทใหญขน และแยกตวออกจากนา ซงการเกดอมลชนชวระยะเวลาสน ๆ นเรยกวาอมลชนชวคราว การทาใหอมลชนมความคงตวทาไดโดยการเตมอมลซไฟเออรลงไป อมลซไฟเออรจะชวยลดแรงตงผวของของวฎภาคกระจายตวและวฎภาคตอเนอง โดยแทรกตวอยระหวางผวของวฎภาคกระจายตวและวฎภาคตอเนอง วฎภาคกระจายตวจะ ไมสามารถรวมตวกนได ทาใหเกดอมลชนทมความคงตวเรยกวาอมลชนถาวร

ความคงตวและการสญเสยความคงตวของอมลชน การกระจายตวของของเหลวในอมลชนมขนาดระหวาง 2-5 ไมครอน บางสวนมขนาดเลกหรอใหญกวา อมลชนทอยในสภาพนจะไมคงตว เนองจากตองการพลงงานจานวนมากเพอรกษาความอยตว การรวมตวกนบางครงมมากจนกระทงสวนหนงลอยขนสผวหนาหรอจมลงสกนภาชนะ การเตรยมอมลชนใหอยตวนนจาเปนตองเตมสารอมลซไฟเออรลงไป เพอปองกนไมใหเมดนามนเคลอนทเขามาจบตวกน แตการลดแรงตงผวอยางเดยวไมทาใหอมลชนนน ๆ คงตว เนองจากเมดไขมนยงสามารถเคลอนทเขาหากนแบบบราวนและรวมตวกนไดในระหวางการเกบรกษา ดงนนหากระบบอมลชนมสารทสามารถขดขวาง การเขารวมตวกนของเมดไขมน ไมวาโดยโมเลกลหรออนภาคทผวรวมระหวางนามนกบนา กจะทาใหอมลชนนน ๆ มความคงตวตามระยะเวลาทตองการได

วตถประสงค 1. เพอใหเขาใจการเกดอมลชนและลกษณะของอมลชน 2. เพอเปรยบเทยบความคงตวของอมลชนทมสารอมลซไฟเออรตางกน

วสดอปกรณและสารเคม 1. เครองตปน polytron รน PT 3100 2. water bath 3. กระบอกตวงขนาด 250 มลลลตร 4. บกเกอรขนาด 250 มลลลตร 5. ชอนตกสาร 6. ปเปต 7. เครองชงไฟฟา 8. นา 9. นามนพช

53

10. สารละลายกรดอะซตกเขมขน รอยละ 15 11. ไขแดง 12. เจลาตน 13. เกลอ 14. นาตาล

วธการทดลอง 1. เตรยมสวนผสมอมลชน โดยแบงการทดลองออกเปน 4 สตร ดงน

Emulsion

สวนผสม

นา (g)

นามนพช (g)

สลล. กรดอะซตก 15%

(ml)

นาตาล (g)

เกลอ (g)

Emulsifier/Stabilizer

ไขแดง (g)

เจลาตน (g)

1. Control 30 60 2 3 1 - - 2. ไขแดง 30 60 2 3 1 5, 10, 15, 20 - 3. เจลาตน 30 60 2 3 1 - 0.5, 1, 1.5, 2 4. ไขแดง + เจลาตน 30 60 2 3 1 5, 10, 15, 20 0.5, 1, 1.5, 2

2. เตรยมอมลชนโดยผสม ไขแดง นาตาล เกลอ ในบกเกอร เตมนาเลกนอย ตสวนผสมดวยเครองตปน polytron รน PT 3100 ทความเรว 8000 rpm เปนเวลา 2 นาท (ในกรณของเจลาตน จะตองผสมเจลาตน ในนาแลวนาไปใหความรอนใน water bath จนเจลาตนละลายหมด) แลวคอย ๆ เตมนามน ตจนกระทงนามนกลายเปนหยดเลก ๆ เขากบนา เตมนามนสวนทเหลอสลบกบสารละลายกรดอะซตกจนหมด 3. ปนตอไปจนไดผลตภณฑทมลกษณะเนอเนยนเรยบ (ใชเวลาในการตปนตงแตเรมเตมนามนจนเสรจประมาณ 4 นาท) 4. เทอมลชนทไดใสลงในกระบอกตวงขนาด 250 มลลลตร ปดฝากระบอกตวงดวยแผนฟลม และบนทกปรมาตรทแนนอน 5. วางกระบอกตวงทบรรจอมลชนไว โดยไมใหถกรบกวนทอณหภมหอง 6. สงเกตลกษณะของอมนชนและการแยกชนของนามนหลงการผสมเสรจ และภายหลงจากทงไว 15 นาท 30 นาท และ 24 ชวโมง โดยบนทกปรมาตรของชนนามนภายหลงจากทงไว 24 ชวโมง 7. คานวณคาความสามารถในการเกดอมลชน (emulsion capacity) โดยคดเทยบเปนเปอรเซนตจากปรมาตรทงหมด Emulsion capacity (%) = (ปรมาตรสวนผสมทงหมด – ปรมาตรของเหลวสวนใส) x 100 ปรมาตรสวนผสมทงหมด

54

ผลการทดลอง ตารางท 6.1 ผลการตรวจลกษณะของอมลชนและการแยกชนของนามนของอมลชนสตรตาง ๆ ทเวลา ............. นาท

Emulsion ลกษณะของอมลชนและการแยกชนของ

นามน

ปรมาตรสวนผสม

ทงหมด (ml)

ปรมาตรของเหลวสวนใส (ml)

ปรมาตรสวนผสมทงหมด

– ปรมาตรของเหลว

สวนใส (ml)

Emulsion capacity

(%)

1. Control 2. ไขแดง……….g 3. เจลาตน………..g 4. ไขแดง………..g

+ เจลาตน………..g

สรปและวจารณผลการทดลอง อภปรายผลวาตวอยางใดเปนอมลชนแบบชวคราวและถาวร และอมลชนทง 4 สตรแตกตางกนอยางไร emulsifier หรอ stabilizer มผลอยางไรตอการเกดอมลชน


คณาจารยภาควชาวทยาศาสตรการอาหารและโภชนาการ. 2551. บทปฏบตการวชา 712-331 เคมอาหาร. ภาควชาวทยาศาสตรการอาหารและโภชนาการ คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลย สงขลานครนทร วทยาเขตปตตาน. 44 น. นธยา รตนาปนนท. 2545. เคมอาหาร. พมพครงท 1. สานกพมพโอเดยนสโตร กรงเทพ ฯ. 504 น. ปารฉตร หงสประภาส. 2545. เคมกายภาพของอาหาร คอลลอยด อมลชน และเจล. พมพครงท 1. สานกพมพแหงจฬาลงกรณมหาวทยาลย กรงเทพ ฯ. 121 น. รชน ตณฑะพานชกล. 2547. เคมอาหาร. พมพครงท 2. สานกพมพมหาวทยาลยรามคาแหง กรงเทพ ฯ. 404 น. __________. 2552. บทปฏบตการท 10 อมลชน [ออนไลน]. เขาถงไดจาก : http://www.nan.rmutl.ac.th/ webnew/read/pakit/lab%2010.pdf (25/3/2552)

55

บทปฏบตการท 7 การศกษาสมบตของเพคตน (properties of pectin)

หลกการ เพคตนเปนสารไฮโดรคอลลอยดทสกดไดจากพช เชน เปลอกผลไมตระกลสมและกากแอปเปล ทาหนาทเปนสารทกอใหเกดเจล (gelling agent) และสารใหความคงตว (stabilizer) ในผลตภณฑอาหาร

สารประกอบเพคตนเปนกลมของโพลแซกคาไรดททาหนาทเปนองคประกอบโครงสรางของเซลลและเปนสารทสาคญในบรเวณชนมดเดลลาเมลลา (middle lamella) ทยดเหนยวเซลลเขาดวยกน โดยจบกบเซลลโลส เฮมเซลลโลสและไกลโคโปรตนของผนงเซลลพช โครงสรางโมเลกลของเพคตนประกอบดวย โพลเมอรของกรดกาแลกทโรนก (D-galacturonic acid) (ประมาณ 65 % โดยนาหนก) เปนสายหลก และมสายแขนงอาจเปนนาตาลอะราบโนส (L-arabinose) และนาตาลกาแลกโทส (D-galactose) บางสวนของหมคารบอกซล (-COOH) ทโมเลกลของกรดกาแลกทโรนกถกเอสเทอรไฟดดวยหมเมทธล (-CH3) เปนเมทธลเอสเทอร (-COOCH3) โมเลกลของเพคตนจงประกอบดวยทงหมของคารบอกซลทอยในรปของ -COOCH3 และ COOH อสระ เพคตนทผลตในทางการคาจงสามารถแบงตามระดบของเมทลเอสเทอรฟเคชนได 2 ชนด คอ

1. เพคตนทมเมทอกซลสง (high methoxyl (HM) pectin) คอกลมเพคตนทมระดบของเมทลเลชน (DM, degree of methylation) มากกวา 50 %

2. เพคตนทมเมทอกซลตา (Low methoxyl (LM) pectin) คอกลมเพคตนทมระดบของเมทลเลชน (DM, degree of methylation) ตากวา 50 % การเกดเจลของเพคตนชนด HM นน จะเกดไดเมอมนาตาลและกรดในปรมาณทเหมาะสมเทานน (นาตาลมากกวา 55 % (w/v), pH ประมาณ 2-3 (pH ตองไมมากกวา 3.5)) ทงนเนองจากเพคตนชนดนจะเกดเจลไดดในสภาวะทมการละลายไดตาสดและม pH ตา โดยเพคตนเมอรวมตวกบนาเกดเปนคอลลอยด ไฮโดรเจนไอออน (H+) จากกรดจะชวยลดจานวนประจลบของหมคารบอกซลใหนอยลง ทาใหลดแรงผลกกนระหวางประจลบทหมคารบอกซล ทาใหสายของเพคตนโมเลกลเขามาใกลกนและเกาะตวกนเปนตาขาย ขณะทนาตาลจะทาหนาทในการดงนาไว จงชวยใหสายโซของเพคตนละลายนาไดนอยลง ทาให สายของเพคตนเขาใกลกนไดดจนเกดเจลในทสด

วตถประสงค 1. เพอใหนกศกษาศกษาสมบตของเพคตน 2. เพอศกษาผลของ pH, ความเขมขนของเพคตน และความเขมขนของนาตาลตอการเกดเจลของเพคตน

56

วสดอปกรณและสารเคม

1. เครองชงไฟฟา

2. แทงแกวคน

3. ชอนตกสาร

4. บกเกอรขนาด 50, 100 มลลลตร

5. ปเปตขนาด 1 มลลลตร

6. Hot plate

7. เพคตน

8. นาตาลทราย

9. กรดซตรก 12 %

วธการทดลอง 1. ผลของ pH ตอการเกดเจล (gel formation) 1.1 ชงเพคตนจานวน 0.15 กรม ใสในบกเกอรขนาด 50 มลลลตร จานวน 10 ใบ และชงนาตาลจานวน 11 กรม สาหรบใชเปนสวนผสมในบกเกอรเพคตนแตละใบ โดยชงแยกใสอกภาชนะหนง 1.2 แบงนาตาลประมาณ 3 กรมผสมลงไปในเพคตนใหเขากน ละลายสวนผสมระหวางเพคตนและนาตาลดวยนาจานวน 11 มลลลตร เตมนาตาลสวนทเหลอลงไป คนใหละลายเขากน 1.3 ชงนาหนกรวมของสวนผสมและบกเกอรแตละใบ บนทกนาหนกทชงได จากนนตมสวนผสมในบกเกอรใหละลายเปนเนอเดยวกน และตมใหเดอดออน ๆ ตอไปเรอย ๆ จนนาหนกของสารละลายลดลง 2 กรม ทงไวใหเยน 1.4 เตมกรดซตรกลงไปในบกเกอรแตละใบจานวน 0, 0.1, 0.2 , 0.3 และ 0.4 มลลลตร ตามลาดบ (ทาตวอยางละ 2 ซา) 1.5 ใชแทงแกวคนคนใหสวนผสมทงหมดเขากน (ไมใชแทงแกวคนซารวมกนในแตละบกเกอร) ปดดวยพาราฟลม เกบในตทอณหภมหองเปนเวลา 24 ชวโมง เปรยบเทยบลกษณะปรากฏและความแขงแรงของเจล

2. ผลของความเขมขนของเพคตนตอการเกดเจล (gel formation) 1.1 ชงเพคตนจานวน 0, 0.05, 0.1, 0.15 และ 0.2 กรม ใสลงในบกเกอรขนาด 50 มลลลตร จานวน 10 ใบ ตามลาดบ (ทาตวอยางละ 2 ซา)

57

1.2 ชงนาตาลสาหรบใชเปนสวนผสมใสในบกเกอรเพคตนแตละใบจานวน 11 กรม แยกใสอกภาชนะหนง แบงนาตาลประมาณ 3 กรมผสมลงในเพคตนใหเขากน ละลายสวนผสมระหวางนาตาลและเพคตนดวยนา 11 มลลลตร เตมนาตาลสวนทเหลอลงไป คนใหละลายเขากน 1.3 ชงนาหนกรวมของสวนผสมและบกเกอรแตละใบ บนทกนาหนกทชงได จากนนตมสวนผสมในบกเกอรใหละลายเปนเนอเดยวกน และตมใหเดอดออน ๆ ตอไปเรอย ๆ จนนาหนกของสารละลายลดลง 2 กรม ทงไวใหเยน 1.4 เตมกรดซตรก 0.3 มลลลตร ลงในบกเกอรแตละใบ จากนนใชแทงแกวคนคนใหสวนผสมเขากน (ใชบกเกอรละอน) ปดดวยพาราฟลม เกบในตทอณหภมหองเปนเวลา 24 ชวโมง เปรยบเทยบลกษณะปรากฏและความแขงแรงของเจล

3. ผลของความเขมขนของนาตาลตอการเกดเจล (gel formation) 3.1 ชงเพคตนจานวน 0.15 กรม ใสในบกเกอรขนาด 50 มลลลตร จานวน 10 ใบ และชงนาตาลจานวน 0, 5, 10, 15 และ 20 กรม สาหรบใสผสมลงในบกเกอรเพคตนแตละใบตามลาดบ โดยชงแยกใสอกภาชนะหนง (ทาตวอยางละ 2 ซา) 3.2 แบงนาตาลประมาณ 3 กรมผสมลงไปในเพคตนใหเขากน ละลายสวนผสมระหวางเพคตนและนาตาลดวยนาจานวน 11 มลลลตร เตมนาตาลสวนทเหลอลงไป คนใหละลายเขากน 3.3 ชงนาหนกรวมของสวนผสมและบกเกอรแตละใบ บนทกนาหนกทชงได จากนนตมสวนผสมในบกเกอรใหละลายเปนเนอเดยวกน และตมใหเดอดออน ๆ ตอไปเรอย ๆ จนนาหนกของสารละลายลดลง 2 กรม ทงไวใหเยน 3.4 เตมกรดซตรกลงไปในบกเกอรแตละใบจานวน 0.3 มลลลตร 3.5 ใชแทงแกวคนคนใหสวนผสมทงหมดเขากน (ใชบกเกอรละอน) ปดดวยพาราฟลม เกบในตทอณหภมหองเปนเวลา 24 ชวโมง เปรยบเทยบลกษณะปรากฏและความแขงแรงของเจล

58

ผลการทดลอง

ตารางท 7.1 ผลของ pH ตอการเกดเจล (gel formation)

บกเกอร ปรมาณเพคตน (g)

ปรมาณนาตาล

(g)

ปรมาณกรดซตรก

(ml)

ลกษณะปรากฏและความแขงแรงของเจล

1 0.15 11 0

2 0.15 11 0.1

3 0.15 11 0.2

4 0.15 11 0.3

5 0.15 11 0.4

ตารางท 7.2 ผลของความเขมขนของเพคตนตอการเกดเจล (gel formation)



(g)


(ml)


1 0 11 0.3

2 0.05 11 0.3

3 0.10 11 0.3

4 0.15 11 0.3

5 0.2 11 0.3

ตารางท 7.3 ผลของความเขมขนของนาตาลตอการเกดเจล (gel formation)



(g)


(ml)


1 0.15 0 0.3

2 0.15 5 0.3

3 0.15 10 0.3

4 0.15 15 0.3

5 0.15 20 0.3

59

เอกสารอางอง เนอทอง วนานวธ สมจตร สรพฒน อรอนงค นยวกล และ วรรณ จรภาคยกล. 2548. คมอปฏบตการ

รายวชา 052415 Laboratory in Food Biochemistry and Analysis. ภาควชาวทยาศาสตรและเทคโนโลยการอาหาร คณะอตสาหกรรมเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร. 93 น.

นธยา รตนาปนนท. 2545. เคมอาหาร. พมพครงท 1. สานกพมพโอเดยนสโตร กรงเทพ ฯ. 504 น. วรรณา ตลยธญ. 2551. เคมอาหารของคารโบไฮเดรต. พมพครงท 2. สานกพมพแหงจฬาลงกรณ

มหาวทยาลย กรงเทพ ฯ. 163 น. ____________. 2552. เพกตน [ออนไลน]. เขาถงไดจาก: http://th.wikipedia.org/wiki/%E0%B9%80%

E0%B8%9E%E0%B8%81%E0%B8%95%E0%B8%B4%E0%B8%99 (20/4/2552)

60

บทปฏบตการท 8 การวเคราะหหาปรมาณนาตาลรดวซโดยวธ Dinitrosalicylic colorimetric method (DNS method)

หลกการ นาตาลรดวซ (reducing sugars) คอนาตาลโมโนแซคคาไรดหรอไดแซคคาไรดทมหมคารบอนลอสระในโมเลกล (C = O) เชนหมอลดไฮดหรอคโตนซงจะถกออกซไดซไดงาย จงมคณสมบตทสามารถรดวซโลหะอออน เชน Cu2+ หรอ Ag+ ไดผลตภณฑทไมละลายนา ตวอยางของนาตาลรดวซไดแก กลโคส มอลโตส ฟรคโตสและแลคโตส การวเคราะหหาปรมาณนาตาลรดวซโดยวธ DNS method จะอาศยการทาปฏกรยาระหวางนาตาลรดวซกบสารละลาย dinitrosalicylic reagent ซงประกอบดวย 3,5-dinitrosalicylic acid ในดาง โดยภายใตสภาวะทเปนดางนาตาลจะไปรดวซ 3,5-dinitrosalicylic acid ไดเปน 3-amino,5-nitrosalicylic acid ซงมสนาตาลแดง สามารถวดคาการดดกลนแสงไดท 570 นาโนเมตร วธนเหมาะกบตวอยางทมนาตาลรดวซปรมาณตา วตถประสงค 1. เพอใหนกศกษาไดทราบและเรยนรการวเคราะหหาปรมาณนาตาลรดวซโดยวธ Dinitrosalicylic colorimetric method (DNS method) 2. เพอทราบปรมาณนาตาลรดวซในตวอยางอาหาร วสดอปกรณและสารเคม 1. เครอง UV-VIS spectrophotometer 2. ควเวตต 3. water bath 4. vortex mixer 5. Hot plate 6. บกเกอร ขนาด 100, 250 และ 500 มลลลตร 7. ขวดวดปรมาตร ขนาด 25, 50 มลลลตร 8. กระบอกตวง ขนาด 100 มลลลตร 9. ปเปต ขนาด 1, 10 มลลลตร 10. หลอดทดลอง + ฝา 11. ชอนตกสาร 12. แทงแกวคน 13. กระบอกนากลน

61

14. rack 15. เครองชงไฟฟา 16. 3,5-ไดไนโตรซาลไซลก (3,5-Dinitrosalicylic acid) 17. โซเดยมไฮดรอกไซด (Sodium hydroxide, NaOH) 18. โพแทสเซยม โซเดยมทารเทรท (Potassium sodium tartrate, KNaC4H4O5 · 4H2O) 19. กลโคส (Glucose) 20. นากลน 21. นาแขง วธการทดลอง 1. การเตรยม DNS reagent 1.1 ละลาย 3,5-Dinitrosalicylic acid 1 กรม ในสารละลาย NaOH ความเขมขน 2 N 20 มลลลตร 1.2 เตมนากลน 50 มลลลตร 1.3 เตม Potassium sodium tartrate 30 กรม คนใหละลาย 1.4 เทสารละลายลงในขวดปรบปรมาตรขนาด 100 มลลลตร แลวปรบปรมาตรดวยนากลน

2. การเตรยมกราฟมาตรฐานของสารละลายกลโคส 2.1 เตรยมสารละลายมาตรฐานกลโคสความเขมขนเรมตน 1 mg/ml จานวน 100 มลลลตร โดยชงกลโคสทผานการอบแหงทอณหภม 100 องศาเซลเซยส นาน 2 ชวโมง มา 0.1 กรม ละลายดวยนากลน เทสารละลายลงในขวดวดปรมาตรขนาด 100 มลลลตร แลวปรบปรมาตรดวยนากลนจนถงขดบอกปรมาตร 2.2 ปเปตสารละลายมาตรฐานกลโคสใสในหลอดทดลอง หลอดละ 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 และ 1.0 มลลลตร เตมนากลนโดยใหปรมาตรรวมในแตละหลอดเปน 1 มลลลตร

2.3 ปเปตสารละลาย DNS 1 มลลลตร ลงในหลอดทดลอง ผสมใหเขากนดวยเครองผสม (vortex mixer) 2.3 นาไปตมนาเดอดนาน 3 นาท 2.4 หลงจากครบกาหนดเวลา ทาใหเยนลงทนท โดยแชในอางนาเยน 2.5 เตมนากลนลงในหลอดทดลองอกหลอดละ 10 มลลลตร ผสมใหเขากน 2.6 นาไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 540 นาโนเมตร 2.7 สาหรบ blank ใหใชนากลนแทนสารละลายกลโคสในขอ 2.2 ในปรมาณทเทากน 2.8 บนทกผลการทดลอง และนาคาทไดมาเขยนกราฟความสมพนธระหวางคาดดกลนแสงและปรมาณ

กลโคสในหนวยมลลกรม

62

3. การเตรยมตวอยาง 3.1 ตวอยางทเปนของแขง (ผก ผลไม แยม)

1) ชงตวอยาง 15 กรม นามาบดละเอยด เตมนากลนปรมาตร 40 มลลลตรนาไปตมใหเดอดบน hot plate เปนเวลา 1 ชงโมง (ระหวางทตมตองคอยระวงไมใหนาแหง โดยการเตมนาทดแทนนาทระเหยกลายเปนไอเนองจากความรอน) เมอเยนเทลงในขวดปรบปรมาตร แลวปรบปรมาตรเปน 100 มลลลตร ดวยนากลน

2) นาสารละลายทไดไปกรองดวยกระดาษกรอง Whatman No. 4

3.2 ตวอยางทเปนของเหลว 1) ผสมตวอยางใหรวมเปนเนอเดยวกน แลวกรองผานกระดาษกรอง Whatman No. 4 2) เจอจางตวอย างดวยน ากลนทผ านการตมและทาให เยนลงแลว โดยป เปตตวอย าง

มา 2.5 มลลลตร เจอจางดวยนากลน แลวปรบปรมาตรในขวดวดปรมาตรใหไดเปน 25 มลลลตร

4. วธวเคราะห 4.1 ปเปตสารละลายตวอยาง 0.1-1 มลลลตร เตมนากลนโดยใหปรมาตรรวมในแตละหลอดเปน

1 มลลลตร 4.2 เตมสารละลาย DNS 1 มลลลตร ลงในหลอดทดลอง ผสมใหเขากนดวยเครองผสม (vortex mixer)

4.3 ตมในอางนาเดอดนาน 3 นาท 4.4 หลงจากครบกาหนดเวลา ทาใหเยนลงทนท โดยแชในอางนาเยน 4.5 เตมนากลนลงในหลอดทดลองอกหลอดละ 10 มลลตร ผสมใหเขากน 4.6 นาไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 540 นาโนเมตร 4.7 บนทกผลการทดลอง

4.8 สาหรบ blank ใหใชนากลนแทนสารละลายตวอยางในขอ 4.1 ในปรมาณทเทากน 4.9 คานวณหาปรมาณนาตาลรดวซในตวอยางจากกราฟมาตรฐานของสารละลายกลโคส

63


ตารางท 8.1 ผลการตรวจวดคาการดดกลนแสงของสารละลายกลโคส

ปรมาณกลโคส (มลลกรม)

คา Abs ทความยาวคลน 540 นาโนเมตร

ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 เฉลย 0

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

ตารางท 8.2 ผลการตรวจวดคาการดดกลนแสงของสารละลายตวอยาง.......................................

หลอดท คา Abs ทความยาวคลน 540 นาโนเมตร 1 2 3

เฉลย



ศรวรรณ จาแนกสาร. 2551. ปรมาณสารประกอบฟนอลกและสมบตการตานปฏกรยาออกซเดชนของเปลอกและเนอกลวยหอมทองและกลวยไขทระดบความสกตางกน. วทยานพนธระดบปรญญาโท คณะอตสาหกรรมเกษตร สถาบนเทคโนโลยพระจอมเกลาเจาคณทหาร ลาดกระบง.

Nam Sun Wang. 2009. GLUCOSE ASSAY BY DINITROSALICYLIC COLORIMETRIC METHOD. [online]. Available : http://terpconnect.umd.edu/~NSW/ench485/lab4a.htm (April 8, 2009)

ดษฎ อตภาพ และ นองนช เจรญกล. 2551. บทท1 เคมของคารโบไฮเดรต. [ออนไลน]. เขาถงไดจาก : http://eu.lib.kmutt.ac.th/elearning/Courseware/BCT611/Chap1/chapter1_3.html (8 เม.ย. 2552)

64

บทปฏบตการท 9 การวเคราะหหาคาความเปนกรด (Acidity)

หลกการ

ความเปนกรดในอาหาร หมายถง ปรมาณกรดทมอยในอาหารทงกรดอนทรยและกรดอนนทรย การวเคราะหหาคาความเปนกรดในอาหารทาไดโดยการไทเทรตสารละลายตวอยางอาหารดวยสารละลาย NaOH โดยใช phenolphthalein เปนอนดเคเตอร ซงคาความเปนกรดทไดเรยกวาคาความเปนกรด ทไทเทรตได (Titratable acidity, TA) ซงจะรายงานในรปของกรดทมอยมากในอาหารชนดนน ๆ วตถประสงค 1. เพอใหนกศกษาไดทราบวธการและเรยนรเทคนควธวเคราะหหาคาความเปนกรดในอาหารโดยวธ การไทเทรต 2. เพอทราบคาความเปนกรดทไทเทรตไดของตวอยางอาหาร (Titratable acidity)


1. อปกรณสาหรบเตรยมตวอยางอาหาร เชน มด เขยง เครองบดอาหาร

2. บกเกอรขนาด 250 มลลลตร

3. ขวดรปชมพขนาด 125 มลลลตร

4. ขวดวดปรมาตรขนาด 100 มลลลตร

5. ปเปตขนาด 1 และ 10 มลลลตร

6. บวเรตต

7. กระดาษกรองวอทแมน (whatman) เบอร 4

8. กรวยกรอง

9. Hot plate

10. เครองชงไฟฟา

11. สารละลายมาตรฐานโซเดยมไฮดรอกไซด (NaOH) 0.1 N

12. สารละลายฟนอลฟทาลน (1 % ในเอธลแอลกอฮอล 95%)

13. ตวอยางอาหาร นาผลไม ผลไม แยม

65

วธการทดลอง

1. การเตรยมตวอยาง 1.1 ตวอยางทเปนของแขง

ผก / ผลไม/ แยม 1) ชงตวอยาง 15 กรม นามาบดละเอยดเตมนากลน 40 มลลลตร ผสมใหเขากน นาไปตมใหเดอด

บน hot plate เปนเวลา 1 ชวโมง เมอเยนนามาปรบปรมาตรดวยนากลนในขวดวดปรมาตรใหไดปรมาตรเปน 100 มลลลตร

2) นาสารละลายทไดไปกรองดวยกระดาษกรอง Whatman No. 4

1.2 ตวอยางทเปนของเหลว 1) เขยาผสมตวอยางใหรวมเปนเนอเดยวกน แลวกรองผานกระดาษกรอง Whatman No. 4

2. วธวเคราะห

1) ปเปตสารละลายตวอยางมา 2 มลลลตร ใสในขวดรปชมพขนาด 125 มลลลตร เจอจางดวย นากลนทผานการตมและทาใหเยนลงแลวปรมาตร 20 มลลลตร หยดฟนอลฟทาลนลงไป 2-3 หยด แลวนาไปไทเทรตกบสารละลาย NaOH 0.1 นอรมอล จนถงจดยต ไดสารละลายสชมพออน (ทดลอง 3 ซา)

2) คานวณหาคาความเปนกรดทไทเทรตไดของตวอยางอาหาร (Titratable acidity) โดยตวอยางนาสมหรอนาผลไมชนดอนคานวณเทยบเปนกรด citric แยมคานวณเทยบเปนกรด citric นาแอปเปลคานวณเทยบเปนกรด marlic นาองนคานวณเทยบเปนกรด tartaric

โดย 1 มลลลตรของสารละลาย NaOH ความเขมขน 0.1 N ทาปฏกรยาสมมลกบกรด citric 0.007 กรม

1 มลลลตรของสารละลาย NaOH ความเขมขน 0.1 N ทาปฏกรยาสมมลกบกรด malic 0.0067 กรม

1 มลลลตรของสารละลาย NaOH ความเขมขน 0.1 N ทาปฏกรยาสมมลกบกรด tartaric0.0075 กรม

รายงานคาความเปนกรด (Titratable acidity, TA) ในรป g acid/100 g (ml) ตวอยาง

66


ตารางท 9.1 ผลการวเคราะหหาคาความเปนกรดทไทเทรตได (Titratable acidity) ในตวอยาง...................

ครงท ปรมาตร/นาหนกของตวอยางทใชในการไทเทรต (ml/g)

ปรมาตร NaOH ทใชในการไทเทรต (ml)

คาความเปนกรดทไทเทรตได (Titratable acidity)

g acid/100 g (ml) ต.ย.

นอรมอล

ของ NaOH

1

2

3

เฉลย

เอกสารอางอง ใบศร สรอยสน. 2543. บทปฏบตการวชา 712-310 เคมอาหาร. ภาควชาวทยาศาสตรการอาหารและ

โภชนาการ คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยสงขลานครนทร วทยาเขตปตตาน. 28 น. คณาจารยภาควชาวทยาศาสตรการอาหารและโภชนาการ. 2551. บทปฏบตการวชา 712-332

การวเคราะหอาหาร. ภาควชาวทยาศาสตรการอาหารและโภชนาการ คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยสงขลานครนทร วทยาเขตปตตาน. 22 น.


A.O.A.C. 2000. Official Method of Analysis The Association of Official Analytical Chemists. 17th ed. The Association of Official Analytical Chemists,Inc

67

บทปฏบตการท 10 การวเคราะหหาปรมาณเกลอ (Sodium Chloride)

หลกการ เกลอแกงหรอโซเดยมคลอไรด (NaCl) เปนสารใหรสชาตและชวยถนอมรกษาอาหารใหเกบไวไดนาน เนองจากสามารถชวยยบยงการเจรญเตบโตของจลนทรยได ซงอาหารเกอบทกประเภทจะมเกลอ เปนสวนประกอบ การตรวจวเคราะหปรมาณเกลอในอาหารโดยวธการไทเทรต เปนวธทนยมใชในการตรวจวเคราะหปรมาณเกลอทมในอาหาร โดยภายใตสภาวะทเปนกรด โซเดยมคลอไรดในอาหารจะทาปฏกรยากบสารละลายมาตรฐานซลเวอรไนเตรทในปรมาณทมากเกนพอ ซงหลงจากโซเดยมคลอไรดทาปฏกรยากบ ซลเวอรไนเตรทจนหมดแลวจะมซลเวอรไนเตรทสวนหนงเหลออย ซงวเคราะหหาปรมาณซลเวอรไนเตรททเหลออยดวยการไทเทรตกบสารละลายมาตรฐานแอมโมเนยมไทโอไซยาเนต โดยมเฟอรรกอลม เปนอนดเคเตอร คานวณปรมาณเกลอโซเดยมคลอไรดจากปรมาณซลเวอรไนเตรทททาปฏกรยากบเกลอโซเดยมคลอไรดในอาหาร วตถประสงค 1. เพอใหนกศกษาไดทราบวธการและเรยนรเทคนควธวเคราะหหาปรมาณเกลอในอาหารโดยวธการไทเทรต


1. อปกรณสาหรบเตรยมตวอยางอาหาร เชน มด เขยง เครองบดอาหาร

2. บกเกอรขนาด 250 มลลลตร

3. ขวดรปชมพขนาด 125 มลลลตร

4. บวเรตต

5. Hot plate

6. เครองชงไฟฟาอยางละเอยด

7. สารละลายมาตรฐานซลเวอรไนเตรท (AgNO3) 0.1 N

8. สารละลายมาตรฐานแอมโมเนยมไทโอไซยาเนต (NH4SCN) 0.1 N

9. สารละลายอมตวแอมโมเนยมเฟอรรกซลเฟต (FeNH4(SO4)2•12H2O)

68

10. กรดไนตรกเขมขน (HNO3)

11. นากลน

12. ตวอยางอาหาร เชน กะป ปลา กงแหง ปลาในนาเกลอ


1. การเตรยมตวอยาง 1.1 ตวอยางอาหารสด

1) นาตวอยางมาลางนาใหสะอาด เอาสวนทเปนเปลอกหรอทกนไมไดออก เชน หากเปนปลา ใหขอดเกลด ตดหว ควกไส ตดหาง

2) ลางคราบเลอดและเมอกออกใหหมด แลวแลเอาแตเนอนามาบดละเอยดใหเปนเนอเดยวกน

1.2 กงแหง / ปลาแหง 1) นาตวอยางมาบดละเอยดใหเปนเนอเดยวกน

1.3 อาหารในนาเกลอ แยกอาหารออกจากนาเกลอ โดยวางใหสะเดดนาบนตะแกรงประมาณ 2 นาท นาอาหารทไดมาบดใหละเอยด

2. วธวเคราะห 2.1 ชงตวอยางบดละเอยด 1 กรม ใสในขวดรปชมพขนาด 125 มลลลตร บนทกนาหนกทแนนอน 2.2 ปเปตสารละลายซลเวอรไนเตรทเขมขน 0.1 นอรมอล ใสลงไปจานวน 20 ml (เพอใหอนมล คลอไรดตกตะกอนเปน AgCl) จากนนเตมกรดไนตรกเขมขนลงไป 20 มลลลตร โดยทาในตดดควน 2.3 นาสารละลายไปตมใหเดอดออน ๆ บน hot plate ประมาณ 15 นาท จนตะกอนอน ๆ ทไมใชตะกอน AgCl ละลายหมด วางทงไวใหเยน 2.4 เตมนากลน 50 มลลลตร และเตมสารละลายอมตวแอมโมเนยมเฟอรรกซลเฟต 5 มลลลตร เพอเปนอนดเคเตอร 2.5 นาไปไทเทรตกบสารละลายแอมโมเนยมไทโอไซยาเนต 0.1 นอรมอล จนสารละลายเปลยนสเปนสนาตาลออน (ซงแอมโมเนยมไทโอไซยาเนต จะไปทาปฏกรยากบซลเวอรไนเตรทสวนทเหลออย) บนทกปรมาตรของสารละลายแอมโมเนยมไทโอไซยาเนตทใชในการไทเทรต 2.6 หกลบปรมาตรของสารละลายแอมโมเนยมไทโอไซยาเนตทใชในการไทเทรตออกจากปรมาตรของสารละลายซลเวอรไนเตรททใชเตมลงไป จะไดปรมาตรของสารละลายซลเวอรไนเตรทททาปฏกรยากบอนมลคลอไรด นาคาทไดไปคานวณหาปรมาณโซเดยมคลอไรด

69

ปรมาณเกลอ (NaCl, รอยละ) = 5.8 x ((a x N AgNO3 ) - (b x N NH4SCN )) นาหนกตวอยาง (g)

a = ปรมาตรของสารละลายซลเวอรไนเตรต (มลลลตร) N AgNO3 = ความเขมขนของสารละลายซลเวอรไนเตรต (นอรมอล) (N AgNO3 = M) b = ปรมาตรของสารละลายแอมโมเนยมไธโอไซยาเนต (มลลลตร) N NH4SCN = ความเขมขนของสารละลายแอมโมเนยมไธโอไซยาเนต (นอรมอล) (N NH4SCN = M)


ตารางท 10.1 ผลการวเคราะหหาปรมาณเกลอในตวอยาง...................

ซาท

นาหนกตวอยาง

ทใชใน

การวเคราะห (กรม)

ปรมาตร สลล. AgNO3 ทใช

(มล.)

ปรมาตร สลล. NH4SCN ทใช ไทเทรต (มล.)

ปรมาตร สลล.

AgNO3 ททาปฏกรยากบ Nacl (มล.)

ปรมาณเกลอ (รอยละ)

นอรมอล

1 AgNO3 =

2 NH4SCN =

3

เฉลย

เอกสารอางอง ราณ สรกาญจนกล. 2550. ปฏบตการวเคราะหอาหาร. พมพครงท 2. สานกพมพมหาวทยาลยรามคาแหง กรงเทพ ฯ. 176 น.

ภทร ศกดเพชร. 2549. การแยกเกลอในนาปลา. วทยานพนธระดบปรญญาโท คณะอตสาหกรรมเกษตร มหาวทยาลยสงขลานครนทร.

ขนทอง เพชรนอก. 2546. คณภาพของกะปทจาหนายในกรงเทพมหานครและปรมณฑล. วทยานพนธระดบปรญญาโท ภาควชาผลตภณฑประมง มหาวทยาลยเกษตรศาสตร.

A.O.A.C. 1990. Official Method of Analysis. The Association of Official Analytical Chemists. 15th ed. The Association of Official Analytical Chemists,Inc.

วนเพญ จตรเจรญ. 2541. บทปฏบตการเคมอาหาร 1. สถาบนเทคโนโลยราชมงคล วทยาเขตลาปาง. 118 น.

70

ภาคผนวก

1. การวเคราะหปรมาณโปรตน

1.1 การเตรยมสารละลายโซเดยมไฮดรอกไซดเขมขนรอยละ 15 (NaOH 15%) สาหรบวเคราะหปรมาณโปรตน ชงโซเดยมไฮดรอกไซด 15 กรม ละลายในนากลน แลวปรบปรมาตรในขวดวดปรมาตรใหไดเปน 100 มลลลตร

1.2 การเตรยมสารละลายโซเดยมไฮดรอกไซดเขมขนรอยละ 40 (NaOH 40%) สาหรบวเคราะหปรมาณโปรตน ชงโซเดยมไฮดรอกไซด 40 กรม ละลายในนากลน แลวปรบปรมาตรในขวดวดปรมาตรใหไดเปน 100 มลลลตร

1.3 การเตรยมสารละลายกรดบอรกเขมขนรอยละ 4 (Boric acid 4%) สาหรบวเคราะหปรมาณโปรตน ชงกรดบอรก 4 กรม ละลายในนากลน แลวปรบปรมาตรในขวดวดปรมาตรใหไดเปน 100 มลลลตร

1.4 การเตรยมอนดเคเตอรผสม (Mixed indicator) สาหรบวเคราะหปรมาณโปรตน ชง Methyl red 0.1 กรม ผสมกบ Bromocresol green 0.1 กรม ละลายในเอธลแอลกอฮอล 95% แลวปรบปรมาตรในขวดวดปรมาตรใหไดเปน 100 มลลลตร

1.5 การเตรยมสารละลายมาตรฐานกรดไฮโดรคลอรกเขมขน 0.1 นอรมอล 1.5.1 วธการเตรยมสาร 1.5.1.1 สารละลายกรดไฮโดรคลอรกเขมขน 0.1 นอรมอล 1) ปเปตกรดไฮโดรคลอรกเขมขน 8.3 มลลลตร ใสลงในขวดวดปรมาตรขนาด 1000 มลลลตร ทมนากลนบรรจอยแลวบางบางสวน 2) ปรบปรมาตรดวยนากลนจนครบตามปรมาตรทกาหนด 3) เขยาใหสารละลายผสมเปนเนอเดยวกน 4) เกบสารละลายทไดใสในขวดสชา พรอมทงระบชนดสาร ความเขมขนและวนทเตรยมระบไวขางขวด

71

1.5.1.2 เมทธลเรด อนดเคเตอร (Methyl red indicator) ชง Methyl red 0.1 กรม ละลายในเอธลแอลกอฮอล 95% 60 มลลลตร แลวปรบปรมาตรดวยนากลนในขวดวดปรมาตรใหไดปรมาตรเปน 100 มลลลตร

1.5.2 วธหาความเขมขนทแนนอน 1) ชง Sodium tetraborate (Na2B4O7 .10H2O) ใหไดนาหนกทแนนอนประมาณ 0.4 กรม ใสลงในขวดรปชมพขนาด 250 มลลลตร (บนทกนาหนกทแนนอนของ Sodium tetraborate) 2) เตมนากลน 50 มลลลตร เขยาขวดให Sodium tetraborate ละลายหมด 3) หยด Methyl red ประมาณ 2-3 หยด 4) นาไปไทเทรตดวยสารละลายกรดไฮโดรคลอรกเขมขน 0.1 นอรมอล ทเตรยมไวจนสของสารละลายเปลยนเปนสชมพออน บนทกปรมาตรของสารละลายไฮโดรคลอรกทใชในการไทเทรต (ทา 3 ซา) 5) คานวณหาความเขมขนของสารละลายกรดไฮโดรคลอรกได จากสตร

Molarity (mol/l) / Normality (N) = g Na2B4O7 . 10H2O x 1000 ml HCl x 190.69

72

2. การวเคราะหหาปรมาณกรด

2.1 การเตรยมสารละลายมาตรฐานโซเดยมไฮดรอกไซดเขมขน 0.1 นอรมอล 2.1.1 วธการเตรยมสาร 2.1.1.1 สารละลายโซเดยมไฮดรอกไซดเขมขน 0.1 นอรมอล 1) ชงโซเดยมไฮดรอกไซด 4 กรม ละลายดวยนากลนและปรบปรมาตรในขวดวดปรมาตรใหไดเปน 1000 มลลลตร 2) เขยาใหสารละลายผสมเปนเนอเดยวกน 3) เกบสารละลายทไดใสในขวดสชา พรอมทงระบชนดสาร ความเขมขนและวนทเตรยมระบไวขางขวด (หามใชขวดฝาแกวใสสารละลาย)

2.1.1.2 ฟนอลฟทาลน อนดเคเตอร (Phenolphthalein indicator) ชง Phenolphthalein 1 กรม ละลายใน ethanol 95% แลวปรบปรมาตรในขวดวดปรมาตรใหไดเปน 100 มลลลตร

2.1.2 วธหาความเขมขนทแนนอน 1) ชงโพแทสเซยมไฮโดรเจนพทาเลต (Potassium hydrogen phathalate, HKC8H4O4) ทผานการอบแหงทอณหภม 120 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 ชวโมง แลวทาใหเยนในโถดดความชน ใหไดนาหนกทแนนอนประมาณ 0.8 กรม ใสลงในขวดรปชมพขนาด 250 มลลลตร 2) เตมนากลน 50 มลลลตร เขยาขวดใหสารละลายหมด 3) หยด Phenolphthalein ลงไป 3 หยด 4) นาไปไทเทรตดวยสารละลายโซเดยมไฮดรอกไซดเขมขน 0.1 นอรมอล จนสของสารละลายเปลยนเปนสชมพ (ทา 3 ซา) บนทกปรมาตรของสารละลายโซเดยมไฮดรอกไซดทใชในการไทเทรต 5) ทา Blank เหมอนขอ 2-4 โดยไมเตม Potassium hydrogen phathalate 6) หกลบปรมาณสารละลาย NaOH ทใชในการไทเทรต Blank ออกจากปรมาณสารละลาย NaOH ทใชในการไทเทรตสารละลาย HKC8H4O4 7) คานวณหาความเขมขนของสารละลายโซเดยมไฮดรอกไซดได จากสตร

Molarity (mol/l) / Normality (N) = g HKC8H4O4 x 1000 ml NaOH x 204.229

73

3. การวเคราะหหาปรมาณเกลอ

3.1 การเตรยมสารละลายมาตรฐานซลเวอรไนเตรท (Silver nitrate, AgNO3) เขมขน 0.1 นอรมอล 3.1.1 วธการเตรยมสาร 3.1.1.1 สารละลายซลเวอรไนเตรท เขมขน 0.1 นอรมอล 1) ชงซลเวอรไนเตรท 16.987 กรม ละลายดวยนากลนและปรบปรมาตรในขวดวดปรมาตรใหไดเปน 1000 มลลลตร 2) เขยาใหสารละลายผสมเปนเนอเดยวกน 3) เกบสารละลายทไดใสในขวดสชา พรอมทงระบชนดสาร ความเขมขนและวนทเตรยมระบไวขางขวด

3.1.1.2 สารละลายโพแทสเซยมโครเมต (Potassium chromate, K2CrO4) ความเขมขนรอยละ 5 ชง K2CrO4 5 กรม ละลายในนากลน แลวปรบปรมาตรของสารละลายใหไดเปน 100 มลลลตร ในขวดวดปรมาตร

3.1.2 วธหาความเขมขนทแนนอน 1) ชงโพแทสเซยมคลอไรด (Potassium chloride, KCl) ทผานการอบแหงทอณหภม 120 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 ชวโมง แลวทาใหเยนในโถดดความชน ใหไดนาหนกทแนนอนประมาณ 0.3 กรม ใสลงในขวดรปชมพขนาด 250 มลลลตร 2) เตมนากลน 40 มลลลตร เขยาขวดใหสารละลายหมด 3) เตมสารละลาย K2CrO4 1 มลลลตร 4) นาไปไทเทรตดวยสารละลายซลเวอรไนเตรทเขมขน 0.1 นอรมอล จนเกดตะกอน สนาตาลแดง และไมจางหายไปเมอเขยา (ทา 3 ซา) บนทกปรมาตรของสารละลายซลเวอรไนเตรททใชในการไทเทรต 5) ทา blank โดยใชนากลน 75 มลลลตร เตมสารละลาย K2CrO4 1 มลลลตร แลวนาไปไทเทรตกบสารละลายซลเวอรไนเตรทเขมขน 0.1 นอรมอล เชนเดยวกบขอ 4 บนทกปรมาตรของสารละลายซลเวอรไนเตรททใชในการไทเทรต ซงปรมาตรของสารละลายซลเวอรไนเตรทนจะตองนาไปหกออกจากปรมาตรของสารละลายซลเวอรไนเตรททใชในการไทเทรตสารละลายโพแทสเซยมคลอไรด 6) คานวณหาความเขมขนของสารละลายซลเวอรไนเตรทได จากสตร

Normality (N) = g KCl x 1000 ml AgNO3 x 74.555

74

3.2 การเตรยมสารละลายมาตรฐานแอมโมเนยม ไทโอไซยาเนต (Ammonium thiocyanate, NH4SCN)เขมขน 0.1 นอรมอล

3.2.1 วธการเตรยมสาร 3.2.1.1 สารละลายแอมโมเนยม ไทโอไซยาเนต เขมขน 0.1 นอรมอล 1) ชงแอมโมเนยม ไทโอไซยาเนต 7.612 กรม ละลายดวยนากลน และปรบปรมาตรในขวดวดปรมาตรใหไดเปน 1000 มลลลตร 2) เขยาใหสารละลายผสมเปนเนอเดยวกน 3) เกบสารละลายทไดใสในขวดสชา พรอมทงระบชนดสาร ความเขมขนและวนทเตรยมระบไวขางขวด

3.2.1.2 สารละลายกรดไนตรก (Nitric acid, HNO3) (1+1) กรดไนตรก 1 สวน ละลายในนากลน 1 สวน

3.2.1.3 สารละลายอมตวแอมโมเนยมเฟอรรกซลเฟต (FeNH4(SO4)2•12H2O) ละลายแอมโมเนยมเฟอรรกซลเฟต 5 กรมในนากลน และปรบปรมาตรใหไดเปน 100 มลลลตรในขวดวดปรมาตร

3.2.2 วธหาความเขมขนทแนนอน 1) ชงซลเวอรไนเตรท (Silver nitrate, AgNO3) ใหไดนาหนกทแนนอนประมาณ 0.7 กรม ใสลงในขวดรปชมพขนาด 250 มลลลตร 2) เตมนากลน 75 มลลลตร เขยาขวดใหสารละลายหมด 3) เตมสารละลายกรดไนตรก (1+1) 5 มลลลตร และเตมสารละลายอมตวแอมโมเนยม เฟอรรกซลเฟต 2 มลลลตร 4) นาไปไทเทรตดวยสารละลายแอมโมเนยม ไทโอไซยาเนตเขมขน 0.1 นอรมอล จนสารละลายเปลยนเปนสนาตาลแดงออน ซงเมอเขยาจะไมจางหายไป และสยงคงอยเมอวางสารละลายทงไว 1 นาท (ทา 3 ซา) บนทกปรมาตรของสารละลายแอมโมเนยม ไทโอไซยาเนตทใชในการไทเทรต 5) เตรยมสารละลายอางอง โดยใชนากลน 115 มลลลตร เตมสารละลายกรดไนตรก (1+1) 5 มลลลตร และเตมสารละลายอมตวแอมโมเนยมเฟอรรกซลเฟต 2 มลลลตร นาไปไทเทรตกบสารละลายแอมโมเนยมไทโอไซยาเนตเขมขน 0.1 นอรมอล ซงถอวาปรมาตรของสารละลายแอมโมเนยมไทโอ ไซยาเนตทใชไทเทรต blank และตองนาไปหกออกจากปรมาตรของสารละลายแอมโมเนยมไทโอไซยาเนตทใชในการไทเทรตสารละลายซลเวอรไนเตรท

75

6) คานวณหาความเขมขนของสารละลายแอมโมเนยม ไทโอไซยาเนตได จากสตร

Normality (N) = g AgNO3 x 1000 ml NH4SCN x 169.87

1

คมอปฏบตการจลชววทยาทวไป

เรยบเรยงโดย

อาจารยชาครยา ฉลาด

คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลยการประมง มหาวทยาลยเทคโนโลยราชมงคลศรวชย

วทยาเขตตรง

nexzza

Text Box


2

ขอปฏบตและขอแนะน าทควรทราบในการเรยนวชาปฏบตการจลชววทยาทวไป

ขอปฏบตตอไปนนกศกษาจะตองท าความเขาใจ และยดถอปฏบตตลอดเวลาทเขาท าปฏบตการ ทงนเพอประโยชนของตวนกศกษาเองและผอนทท าปฏบตการรวมกน

1. แตงกายสภาพเรยบรอย ตามกฎและระเบยบทก าหนดไว 2. เขาท าปฏบตการตรงตอเวลา โดยมการเชคชอกอนและหลงท าปฏบตการทกครง หากมาชา

เกนก าหนดของหองปฏบตการ จะไมอนญาตใหเขาท าปฏบตการ 3. ผทเขาท าปฏบตการไมถงรอยละ 80 ของเวลาเรยนทงหมด จะไมมสทธสอบ 4. หาม เลนหยอกลอ สงเสยงดง อนเปนการรบกวนสมาธผอนในหองปฏบตการ 5. หาม ทานอาหาร เครองดม สบบหร หรอน าอปกรณอนๆ ทไมเกยวของกบการท าการ

ทดลองเขามาในหองปฏบตการ 6. นกศกษาตองอานบทปฏบตการมากอนทจะถงเวลาท าการทดลอง เพอจะไดท าความเขาใจ

บทปฏบตการนนๆ และหากมขอสงสยหรอไมเขาใจจะไดเตรยมค าถามไวซกถามอาจารย เพอท าใหเขาใจไดงายขนเมอถงชวโมงเรยนปฏบตการ

7. กอนลงมอท าการทดลองจะตองตงใจฟงค าอธบายเพมเตมและขอเสนอแนะ ขนตอนการทดลองจากอาจารย ในบางบทปฏบตการอาจมการเพมเตมรายละเอยดหรอเทคนคบางอยาง ทงนเพอใหเกดความสะดวกในการท าปฏบตการแตละบท

8. นกศกษาควรเตรยมอปกรณบางอยางทเปนเครองใชเฉพาะตวบคคลเพอความสะดวกในการท าปฏบตการ เชน สมด ดนสอ ยางลบ ไมบรรทด กระดาษทชช ผาเชดมอ เปนตน

9. ตองลางมอดวยน ายาลางมอทจดเตรยมไวใหกอนและหลงจากเสรจท าการทดลองทกครง 10. นกศกษาตองสวมเสอกาวน (gown) ในการท าปฏบตการทางจลชววทยาเสมอ ทงนเพอ

ปองกนอนตรายทเกดจากเชอจลนทรย หรอจากสารเคมและสยอมตางๆ ไดอกทางหนง 11. ท าความสะอาดโตะปฏบตการดวยแอลกอฮอล 70% หรอน ายาฆาเชอกอนและหลงท าการ

ทดลองทกครง 12. ถาเกดอบตเหตในระหวางท าการทดลอง หรอท าเชอหกหรอท าภาชนะทมเชอตกแตก ใหเท

แอลกอฮอล 70% ทบบรเวณเชอ 10 นาท ใชกระดาษทชชเชดแลวน าไปทงในถงขยะทมฝาปดมดชด และใหนกศกษารายงานตออาจารยทนท

13. ขณะท าการทดลองใชปเปตหรอออโตปเปต (pipette / autopipette) หามใชปากดด ใหใชลกยางดดเทานน

3

14. ขณะท าการทดลองตองไมวางปเปต (pipette) ลวดเขยเชอ (loop) หรอเขมเขยเชอ (needle) ทเปอนจลนทรยลงบนโตะปฏบตการ ใหใสในภาชนะส าหรบอปกรณนนๆ

15. การบมเชอทงในและนอกตบมเชอ (incubator) ควรวางจานเพาะเชอ (plate / petri dish) ซอนกนในถงพลาสตกขนาดพอเหมาะ แลวรดดวยยางรด การบมเชอในลกษณะนท าใหจลนทรยสามารถเจรญไดโดยไมมขอจ ากดเรองการถายเทของอากาศ อกทงเปนการแยกจานเพาะเชอของแตละการทดลอง และแตละกลมท าการทดลอง ไมใหปะปนกน ซงสะดวกในการอานผลและยงปองกนมดและแมลงอนๆ ไมใหเขาไปในจานเพาะเชอดวย

16. นกศกษาทกคนควรไดลงมอท าปฏบตการดวยตนเอง เพอประสบการณตรงแกตนเอง และตองตดตามผลการทดลองตามเวลาทก าหนดไว ถาไมมาตามก าหนดจะไมผลใหตรวจเนองจากตบมมจ านวนจ ากด โดยตองรบผดชอบรวมกนภายในกลม และพงระลกอยเสมอวา “ ปฏบตการทไมมการตดตามอานผลการทดลองนน มคาเทากบไมไดท าปฏบตการ ”

17. เมอเสรจสนการทดลองตองท าความสะอาดภาชนะทมเชอจลนทรยตดคางอยโดยเรว โดยกอนน ามาลางตองน าไปท าลายจลนทรยดวยการน าเขาหมอนงความดนไอน า (autoclave) เพอฆาเชอกอนทกครง

18. นกศกษาตองบนทกผลการทดลองอยางละเอยด การวาดรปพยายามวาดใหไดรายละเอยดตรงตามความเปนจรงทมองเหนจากกลองจลทรรศน การเขยนรายงานปฏบตการใหนกศกษาใชแบบฟอรมทวไปของรายงานปฏบตการ

4

บทปฏบตการท 1 เรอง การแนะน าอปกรณและเครองมอตางๆ ในหองปฏบตการจลชววทยา

จดประสงคการสอน

1.1 รจกอปกรณและเครองมอตางๆ ทใชในหองปฏบตการจลชววทยา 1.2 เขาใจถงคณสมบตของอปกรณและเครองมอตางๆ ในหองปฏบตการ

จลชววทยา 1.3 เลอกใชอปกรณและเครองมอตางๆ ในหองปฏบตการจลชววทยาไดอยางถกตอง 1.4 เรยนรและเขาใจถงวธการดแลรกษาอปกรณและเครองมอตางๆ ใน

หองปฏบตการจลชววทยา บทน า ในการปฏบตการจลชววทยาทกครง เราควรเรยนรเกยวกบอปกรณและเครองมอใหเขาใจกอนทจะลงมอท า เชน ชอของอปกรณทงทเปนภาษาไทย และภาษาองกฤษ รปรางลกษณะ การใชงานขอควรระวง เปนตน เพอทจะสามารถเลอกใชอปกรณหรอเครองมอไดถกตองและเหมาะสม บางครงอปกรณหรอเครองมออาจจะมรปรางลกษณะคลายกน แตเราไมสามารถทจะใชแทนกนได อาจเกดขอผดพลาดหรออนตรายได ดงนนจงเปนสงส าคญอยางยงทผท าการทดลองควรทจะตระหนกถง เมอเรารวธการใชงานแลวยงตองรจกวธการดแลรกษาอปกรณและเครองมอในหองปฏบตการดวย เพราะเนองจากอปกรณแตละอยางนนมราคาแพงมาก และอปกรณบางอยางกไมสามารถหาซอไดตามรานตางๆ ทมอยโดยทวไป จงตองใชอปกรณและเครองมอในหองปฏบตการจลชววทยาอยางระมดระวงมากทสด อปกรณและเครองมอทางดานจลชววทยา 1. บกเกอร (Beaker)

บกเกอร เปนแกวใสใชส าหรบบรรจสารทมปรมาณมาก เพอละลายสารหรอท าปฏกรยาเคม และสามารถเทสารออกไดงายทางปากบกเกอร โดยจะมขดบอกปรมาตร ซงเปนคาโดยประมาณเทานน นอกจากนบกเกอรใชส าหรบตมสารละลายหรออาหารเลยงเชอทมปรมาณมากๆ

5

2. ขวดปรมาตรทรงกรวย (Erlenmeyer flask / Conical Flask) ขวดปรมาตรทรงกรวย ลกษณะทรงกรวยและมความจขนาดตางๆกน แตทนยมใชกนมากมความจเปน 250-500 มลลลตร สามารถใชไดในหลายกรณ เชน ในการไตเตรท การเตรยมอาหารเลยงเชอ เปนตน

3. หลอดทดลอง (Test tube)

หลอดทดลองมหลายชนดและหลายขนาด ชนดทมปากและไมมปาก ชนดธรรมดาและชนดทนไฟ หลอดทดลองสวนมากใชส าหรบทดลองปฏกรยาเคมระหวางสารตางๆ ทเปนสารละลาย ใชตมของเหลวทมปรมาณนอยๆ โดยม test tube holder จบกนรอนมอ ดานจลชววทยาหลอดทดลองจะใชใสเชอจลนทรยหรออาหารเลยงเชอ

4. ตะแกรงวางหลอดทดลอง (Test Tube Racks)

ตะแกรงวางหลอดทดลอง ใชส าหรบตงหลอดทดลองมทงท าดวยไมและโลหะ

5. กระบอกตวง (Graduated cylinder)

กระบอกตวง ใชส าหรบวดปรมาตรโดยประมาณของของเหลว ความจทใชมตงแต 5 - 2,000 มลลลตร การอานปรมาตรควรใหระดบสายตาอยในแนวเดยวกนกบสวนโคงเวา 6. หลอดหยด (Dropper)

6

หลอดหยด เปนอปกรณทใชส าหรบตวงของเหลวปรมาณนอยๆ ท าไดโดยการนบจ านวนหยดของของเหลวทหยดลงไปและสามารถเทยบมาตรฐาน (calibrate) ดวยกระบอกตวง ลกษณะ หลอดหยดมลกษณะเปนหลอดแกวทปลายขางหนงยาวเรยวเลกและปลายอกขางหนงมกระเปาะยางสวมอย

ขอควรระวง

อยาใหสารละลายสมผสกบกระเปาะยาง เพราะจะท าใหสารละลายถกปนเปอนได และถาสารละลายมฤทธเปนกรดกจะกดกรอนกระเปาะยางดวย ดงนนเมอท าการทดลองเสรจแลวควรรบดงกระเปาะยางออกจากหลอดแกวทนท 7. หลอดเกบกาซ (Durham tube)

หลอดเกบกาช เปนหลอดขนาดเลกประมาณ 5 x 50

มลลเมตร ใชส าหรบเกบกาซทจลนทรยสรางขนในระหวางทเจรญในหลอดอาหารเลยงเชอ

8. แทงแกวคนสาร (Glass stirrer rod)

แทงแกวคนสาร ใชส าหรบคนสารละลายใหผสมเปนเนอเดยวกนอยางสม าเสมอ หรอใชเมอจะเทสารละลายจากภาชนะหนงลงในภาชนะอกชนดหนง โดยจะเทสารละลายใหไหลไปตามแทงแกวคนสาร ส าหรบแทงแกวคนสารทมยางสวมอยอกปลายดานหนง เรยกวา Policeman จะใชส าหรบปดตะกอนทเกาะอย ขางๆ และถภาชนะใหปราศจากสารตางๆ ทเกาะอยขางๆ โดยยางสวมนนตองแนน

7

9. แทงแมเหลกคนสาร (Magnetic bar/Magnetic stirrer)

แทงแมเหลกคนสาร ใชในการกวนสารเคมทมความหนดนอยหรอกวนอาหารเลยงเชอในขณะตม สามารถปรบความเรวรอบไดตามความตองการโดยจะใชควบคกบ hot plate stirrer

10. จานเลยงเชอ/จานเพาะเชอ (Plate/Petri dish)

จานเลยงเชอหรอจานเพาะเชอ มฝาปด อาจจะท าดวย

แกวหรอพลาสตก มพนทผวของอาหารมากกวาหลอดทดสอบ ปกตจะบรรจอาหารเลยงเชอลงในจานประมาณ 15 – 20 มลลลตร

11. กระบอกเกบจานเลยงเชอ (Plate can/Petri dish can)

กระบอกเกบจานเลยงเชอ ใชเกบจานเลยงเชอ เมอใชงาน

เสรจแลวและงายตอการหยบใชในการทดลอง

12. หลอดดดสารละลายหรอปเปต (Pipette/Graduated pipette)

เครองดดสารละลาย เปนเครองมอทใชส าหรบถายอาหารเลยงเชอ สารละลายของเชอหรอสารเคม จากภาชนะหนงไปใสอกภาชนะหนงในปรมาณทแนนอน เครองดดสารละลายมหลายขนาด คอ 0.1 มลลลตร 1 มลลลตร 5 มลลลตร10 มลลลตร หรอ 20 มลลลตร เลอกใชงานตามความเหมาะสม

8

13. กระบอกใสปเปต (Pipette can/Graduated pipette can)

กระบอกใสปเปต ใชใสปเปต

14. ลกยางดดสายละลาย (Oval pipette bulb)

ลกยางดดสารละลาย ใชในการชวยดดสารละลาย โดยใชค

กบปเปต

15. เครองดดสารละลายอตโนมต (Autopipette,Tip)

เครองดดสารละลายอตโนมต ใชดดสารละลายไดปรมาณท

แมนย าทสด

16. ปากคบ (forcep)

ปากคบ ใชคบตวอยางของจลนทรยทตองการศกษา

9

17. ชอนตกสาร (Spatula/Spoon)

ชอนตกสาร ใชในการตกสารเคมหรออาหารเลยงเชอ

18. คมจบของรอน (Crucible tong)

คมจบของรอน ใชส าหรบจบของทรอนหรอบกเกอร

19. ขวดใสแอลกอฮอล 70% (Plastic wash bottle)

ขวดใสแอลกอฮอล ใชใสแอลกอฮอล 70%เพอใชท าความ

สะอาด

20. ขวดน ากลน (Distill water bottle)

ขวดน ากลน ใชใสน ากลนเพอใชในการทดลอง

10

21. สไลดส าหรบใสเชอ (Microscope slide)

สไลด เปนแผนแกวสเหลยมผนผา ขนาดประมาณ 2.5 x 7.5 เซนตเมตร ใชส าหรบเปนทรองรบเชอจลนทรยในการศกษาดวยกลองจลทรรศน

22. สไลดหลม (Cavity slide)

สไลดหลม ใชส าหรบดการเคลอนไหวของจลนทรย

23. กระจกปดสไลด (Cover glass/Cover slip/Cover slide)

กระจกปดสไลด ไวปดสไลดเพอใหเชอทศกษาแนบกบสไลด

24. แทงแกวสามเหลยม (Spreader)

แทงแกวสามเหลยม ใชเกลยเชอจลนทรยบนอาหารแขงใหสม าเสมอกน

11

25. หวงเขยเชอ (Loop/Inoculating loop)

หวงเขยเชอ ใชเขยเชอจลนทรย

26. เขมเขยเชอ (Needle)

เขมเขยเชอ ใชเขยเชอจลนทรยหรอแทงเชอ (stab)

จลนทรยลงไปในอาหารเลยงเชอ

27. เขมปลายงอ (Teasing needle)

เขมปลายงอ ใชส าหรบเขยหรอฉกเชอราใหเปนเสนเลกๆ และงายตอการดภายใตกลองจลทรรศน

28. ส าลพนไม (Cotton swab)

ส าลพนปลายไม ใชในการปายเชอหรอแตะเชอจลนทรย

ในแหลงตางๆ เพอน ามาศกษา

12

29. น ามนรวมแสงเมอดกลองจลทรรศนท 100 x (Immersion oil)

น ามนรวมแสง ใชรวมแสงเมอดกลองจลทรรศนท ก าลงขยาย 100x

30. กระดาษเชดเลนส (Lens cleaning tissue)

กระดาษเชดเลนส ใชเชดเลนสใกลวตถก าลงขยาย 100x ของกลองจลทรรศนเมอดเสรจแลว

31. กระดาษเลเบล (Label paper)

กระดาษเลเบล ใชเขยนบอกวาสงทอยในหลอดทดลอง

หรอจานอาหารเลยงเชอนนๆ วาเปนเชอจลนทรยชนดใดหรอชออะไร

32. กระดาษชงสาร (Tracing paper)

กระดาษชงสาร ใชใสสารเคมหรออาหารเลยงเชอในขณะ

ชงดวยเครองชง เพอตองการน าไปทดลองในปรมาณทตองการ

13

33. กระดาษกรอง (Filter paper)

กระดาษกรอง ไวกรองสารละลายทมตะกอน

34. กระดาษฟอลย (Aluminum foil)

กระดาษฟอลย ไวส าหรบหอหมบกเกอร หลอดทดลอง

หรออปกรณอนๆ เพอไมใหเชอเขาไปปนเปอน

35. เทปฆาเชอ (Autoclave tape/Sterile tape/Indicator tape)

เทปฆาเชอ ใชตดอปกรณวาน าไปฆาเชอแลวหรอไม ถา

หากวามการฆาเชอแลวแถบทเปนเสนบนเทปจะมสด า

36. ดนสอเขยนแกว (Colour pencil)

ดนสอเขยนแกว ใชเขยนบอกสงทอยในหลอดทดลองหรอจานอาหารเลยงเชอ

14

37. ตะเกยงแอลกอฮอล (Alcohol lamp)

ตะเกยงแอลกฮอล ใชส าหรบใหความรอน

38. ตะเกยงบนเสน (Bunzen lamp) ตะเกยงบนเซน เปนตะเกยงกาซทใชในหองปฏบตการทวไปเมอตองการอณหภมทสงพอประมาณ ตะเกยงบนเซนสามารถปรบปรมาณของอากาศได แตไมมทปรบปรมาณของกาซเชอเพลง ตะเกยงบนเซนมสวนประกอบดงตอไปน

1. ฐานของตะเกยง 2. ทอตวตะเกยง 3. ชองทางเขาของกาซซงเปนทอทยนจากฐานของ ตะเกยง 4. ชองปรบปรมาณของอากาศทโดนทอตวตะเกยง

39. กลองจลทรรศน (Microscope)

กลองจลทรรศน เปนอปกรณส าหรบมองดวตถทม ขนาด

เลกเกนกวามองเหนดวยตาเปลา กลองจลทรรศนสามารถแบงออกเปนประเภทใหญๆ ได 2 ประเภท คอ กลองจลทรรศนแบบใชแสงธรรมดา (Light microscopes) และกลองจลทรรศนแบบใชแสงอเลคตรอน (Electron microscopes)

15

40. ตปลอดเชอ (Laminar flow)

ตปลอดเชอ ใชในการเตรยมอาหารเลยงเชอ และใชใน

การทดลองทไมตองการใหมการปนเปอน

41. เครองชวยเขยาสาร (Vertex)

เครองชวยเขยาสาร เปนเครองชวยใหสารละลายเรวขน

42. เครองบมเชอ (Incubator)

เครองบมเชอ เปนตทควบคมอณหภมทตองการได ใชในการบมเชอจลนทรย ทอณหภมต ากวาหรอสงกวาอณหภมหองอาจจะใช water bath แทน Incubator ไดในบางกรณ

43. ตอบลมรอน (Hot air oven)

ตอบลมรอน สามารถควบคมอณหภมไดตงแต 30 - 250 องศาเซลเซยส ไวฆาเชอทอณภมสงๆ ใชฆาเชอในเครองแกวตางๆ เชน petri dish , pipette ทอณหภม 180 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 ชวโมง 30 นาท

16

44. หมอนงความดนไอน า (Autoclave)

หมอนงความดนไอน า เปนเครองมอทใชฆาเชอจลนทรยใน

อาหารเลยงเชอ สารละลายและเครองมอแพทย เปนการฆาเชอโดยความรอนของไอน า

45. ตเยนเกบเชอ (Stock culture refrigerator) และตเกบอาหารเลยงเชอ (Media/Medium

refrigerator)

ตเยนเกบเชอ ใชส าหรบเกบเชอทท าการทดลอง ตเยนเกบอาหารเลยงเชอ ใชส าหรบเกบอาหารเลยงเชอ

หรอสารอนๆ ทตองการเกบทอณหภมต า เชน ยาปฏชวนะ, serum, plasma

46. เตาใหความรอน (Hot plate/Stirror hot plate)

เตาใหความรอน ใชใหความรอนเมอตมน าหรอ

สารละลาย

17

47. เครองชง (Balance)

เครองชง ใชในการชงสารเคมหรออาหารเลยงเชอ

48. เครองนบเชอจลนทรย (Colony counter)

เครองนบเชอจลนทรย ใชนบเชอจลนทรย

49. อางควบคมความรอน (Water bath)

อางควบคมความรอน เปนเครองชวยในการปรบและ

ควบคมอณหภมของสารใหคงท

50. เครองแชปเปต (Cleaning pipette)

เครองแชปเปต ใชแชปเปตทท าการทดลองเสรจแลว เพราะมเชอจลนทรยอยตองแชใน cleaning pipette กอนน าไปฆาเชอดวยความรอนอกครงหนง

18

รายงานผลบทปฏบตการท 1 เรอง การแนะน าอปกรณและเครองมอตางๆในหองปฏบตการจลชววทยา

ชอ........................................................................นามสกล.....................................................................รหสนกศกษา………………………………….................สาขา.......................................................................... วนทท าการทดลอง……………….…..………………………………………………………..................................………. สมาชกในกลมทดลอง 1.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ 2.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ 3.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ ค าถาม 1. เพราะเหตใดจงตองรบทราบขอปฏบตในการใชหองปฏบตการจลชววทยา ............................................................................................................................. ................................. ......................................................................................... ..................................................................... ........................................................................................................... ................................................... 2. หากนกศกษารจกและเขาใจอปกรณและเครองมอทางจลชววทยา จะเกดผลดอยางไรบาง ............................................................................................................................. ................................. ........................................................................................................................................................ ...... ............................................................................................................................. ................................. สรปผลการทดลอง ............................................................................................................................. ................................. .................................................................................. ...................................................................... ...... ............................................................................................................................. ................................. ................................................................................................................................................. ............. ..................................................................................................................... ......................................... ............................................................................................................................. ................................. ........................................................................................................................................................ ...... ............................................................................................................................. .................................

19

บทปฏบตการท 2 เรอง การใชกลองจลทรรศน


2.1 รจกสวนประกอบตาง ๆ ของกลองจลทรรศนชนด Bright Field Microscope

2.2 สามารถใชและเกบรกษากลองจลทรรศนอยางถกวธ

กลองจลทรรศน (Microscope) จลชววทยา เปนวชาทศกษาเกยวกบสงมชวตซงมขนาดเลกมากจนไมสามารถมองเหนดวยตาเปลา ทมาของวชาจลชววทยามตนก าเนดมาจากการประดษฐกลองจลทรรศน ซงเปนเครองมอส าคญมากทสดอยางหนงในการศกษาวชาจลชววทยา เนองจากเชอจลนทรยทศกษามขนาดเลกมากจนไมสามารถมองเหนดวยตาเปลา ตองใชกลองจลทรรศนและวธการทถกตองจงเปนสงจ าเปนส าหรบผทจะศกษาวชาจลชววทยา

กลองจลทรรศนมอยหลายชนด ไดแก Bright field microscope, Dark field microscope, Phase contrast microscope, Fluorescence microscope และ Electron microscope แตกลองจลทรรศนทใชกนทวไปและประจ า คอ Light microscope ประกอบดวยสวนตาง ๆ ดงน (ภาพท 1) 1. Eye piece หรอ ocular lens เปนเลนสทอยใกลตาของผใชกลอง ซงเลนสนท าหนาทขยายภาพทเกดจาก objective lens อกครงหนง eye piece โดยปกตมกขยาย 10 เทา กลองบางชนดม eye piece เพยงอนเดยวเรยก monocular microscope บางชนดม 2 อน เรยก binocular microscope บางชนดม 3 อน โดยสองอนใชส าหรบใหตามองวตถ อกอนหนงใชตดกลองถายรป เพอบนทกภาพทเหนภายในกลองเรยกวา trinocular microscope บางชนดม 2 ตา 2 ชด ใชประโยชนเมอตองการดภาพ 2 คนพรอมกน เรยกวา dual – binocular microscope 2. ตวกลอง (Body tube หรอ Observation tube) เปนทส าหรบใหล าแสงผานจาก objective lens ไปยง eye piece สวนลางของตวกลองตดกบ revolving nosepiece 3. Objective lens เปนเลนสใกลวตถ ซงมกมหลายอน มก าลงขยายหลายขนาด ทนยมใชม 3 ขนาดก าลงขยาย คอ low power (4x และ 10x) high power หรอ medium power หรอ high dry หรอ high objective (40x) และ oil immersion objective (100x) ซงขนาดก าลงขยายสงสด (100x) ตวเลนสมขนาดเลกมากแสงจงเขาไปไดปรมาณนอย ล าแสงทสองเขา

20

จงตองจามาก โดยใช condenser ชวยรวมแสงและปองกนมใหล าแสงกระจายออกไปนอกเลนสโดยใชน ามน (immersion oil) ซงมดชนหกเหของแสงเทากบแกว คอ 1.52 หยดลงบนสไลดทตองการสองและขณะทสอง objective lens ตองจมอยในน ามนเสมอ 4. Revolving nosepiece เปนทส าหรบยด objective lens หมนไดรอบตวเพอเลอกใช objective ทมก าลงขยายตามตองการ 5. Arm หรอ limb เปนสวนของกลองจลทรรศนทใชส าหรบเพอยกเคลอนยาย 6. Coarse adjustment knob เปนปมส าหรบท าหนาทเลอนตวกลองหรอ stage (แลวแตชนดของกลอง) ขนและลงเพอปรบโฟกสของเลนสในกลองใหไดภาพชดเจน coarse adjustment knob นจะท าใหตวกลองหรอ stage เคลอนทไดเรวตามรองเฟอง 7. Fine adjustment knob ท าหนาทเชนเดยวกบ coarse adjustment knob แตจะท าใหตวกลองหรอ stage เคลอนทไดชามาก ซงท าใหปรบจดโฟกสไดงายขน แตการเคลอนทของ fine adjustment knob นมขดจ ากด เมอถงจดทไมสามารถจะหมนตอไปไดอก จะตองหยดและเปลยนไปใช coarse adjustment knob อยาพยายามหมน fine adjustment knob เมอถงขดจ ากดแลว เพราะจะท าใหฟนเฟองช ารดได 8. Stage เปนแทนรปสเหลยมส าหรบวางสไลดหรอสงของทตองการสองดดวยกลองจลทรรศน มชองตรงกลาง stage เรยกวา aperture ใหล าแสงผานจาก condenser ทอยใตแทนขนมา ผานวตถทจะดตรงขนไปยง objective lens 9. Mechanical stage เปนสวนประกอบทตดอย stage ของกลองท าหนาทชวยยดและชวยเลอนสไลดไปมาไดสะดวก และแนนอนกวาการใชมอ 10. Iris diaphragm ท าหนาทควบคมแสงทผานไปในกลองใหมากหรอนอยตามตองการ เมอเปด diaphragm เตมทแสงจะเขากลองไดมากทสด เมอปด diaphragm สนท ไมมแสงเขากลองเลย 11. Condenser ท าหนาทควบคมแสงทผานเขากลอง condenser สวนใหญประกอบดวยเลนส 2 อน และปรบเลอนขนลงได มหนาทกระจายล าแสงผานวตถเขาตาเราตามตองการ 12. Light source เปนแหลงก าเนดแสงของกลองซงอาจเปนหลอดไฟฟา หรอกระจกสะทอนแสง ซงดานหนงเปนกระจกแบนราบ อกดานหนงเปนกระจกเวา (Planoconocave mirror) 13. Filter กระจกกรองแสงเพอใหมแสงภายในกลองคลายแสงธรรมชาต 14. Base หรอฐานกลอง เปนสวนทเปนแทนรบน าหนก และยดสวนประกอบตางๆ ของกลองไดมนคง

21

ภาพท 1 สวนประกอบของกลองจลทรรศนชนด Bright field microscope

22

การทดลองท 1 วธใชและการเกบรกษากลองจลทรรศน วสดและอปกรณ

1. กลองจลทรรศนชนด Bright Field Microscope 2. กระดาษเชดเลนส 3. น ามน (immersion oil) 4. สไลดแบคทเรยยอมส 4 สไลด 5. สไลดของยสตยอมส 2 สไลด 6. สไลดของรายอมส 2 สไลด

วธการทดลอง 1. วางกลองจลทรรศนบนโตะ หมนเกาอใหไดระดบทนงสบายทสด เสยบปลกแลวเปดสวตซไฟ ปรบปม light source ใหอยทประมาณหมายเลข 6 เพอใหมแสงความเขมขนเทากบแสงธรรมชาต ปรบใหเลนสตา (eyepiece) อยหางกนเทากบความกวางของลกตานกศกษาแตละคน 2. หมน revolving nosepiece ใหใชเลนสวตถ (objective lens) ทมก าลงขยายต าสด (Low power) เขาทกอน โดยสงเกตจะมเสยงดง “กรก” หมนลอโฟกสหยาบ (coarse adjustment knob) ใหแทนวางสไลด (stage) อยต าสด ปรบแสงภายในกลองจากมานปรบแสง (Iris diaphragm) (ไมควรเปด Iris diaphragm มากเกนไป เมอใช low power, medium power เพราะวาถาแสงจาเกนไปท าใหมองเหนภาพไมชดเจน) ขณะทปรบมานปรบแสงตามองทเลนสตา จะเหนวาถาปรบให Iris diaphragm กวางขน แสงทสะทอนเขาในกลองจะสองสวางทวพนทวงกลมในกลอง (microscopic filed) 3. น าสไลดแบคทเรยยอมสวางบนแทน (ใหดานทยอมสอยบน) จบสไลดใหอยกบทดวย clip ของ mechanical stage เลอนบรเวณทมแบคทเรยใหอยตรงชองกลางของแทนวางสไลด (stage) 4. มองเขาไปในเลนสตา หมนลอโฟกสหยาบชาๆ ใหแทนและเลนสวตถเคลอนทเขาหากนจนเหนภาพ ปรบใหภาพชดโดยหมนลอโฟกสละเอยด (fine adjustment knob) ถายงเหนภาพไมชดใหปรบแสงใหพอเหมาะ 5. หมนเลนสวตถ high power (40x) เขาแทนท low power (10x) มองภาพในกลองพรอมกบปรบภาพ โดยหมนลอโฟกสหยาบอยางชาๆ ใหปลายเลนสวตถเคลอนทเขาใกลสไลดจนเหนภาพ แลวปรบใหภาพชดโดยหมนลอโฟกสละเอยดเปรยบเทยบภาพทเหนกบขอ 4 วาขนาดและรายละเอยดทเหนแตกตางกนอยางไร 6. หมน objective lens ไปทก าลงขยายต าสด (4x) หรอหมนไปอยระหวาง high power objective (40x) และ oil immersion objective (100x) หยดน ามนหนงหยดลงบน

23

สไลดตรงบรเวณทมแบคทเรยยอมส แลวหมนเลนสทใชน ามน (100x) เขาแทนท หมนลอโฟกสหยาบใหปลายเลนสจมน ามนชดสไลดชาๆ ขณะทหมนตามองทปลายเลนสวตถกบสไลดแลวคอยๆ ขยบลอโฟกสหยาบใหสไลดออกหางจากปลายเลนสอยางระมดระวงจนเหนภาพ หรอภาพแวบผานไป แลวจงปรบภาพใหคมชดดวยลอโฟกสละเอยด เปรยบเทยบกบภาพทเหนในขอ 4 และ 5 เมอเลกใช oil immersion objective ใหเลอน low power objective มาแทนทแลวจงดง สไลดออกจาก stage เพราะถาเลอนสไลดออกมาโดยไมเลอน low power objective เขาแทนทสไลดอาจขดกบเลนสของ oil immersion objective ซงอยชดกบสไลดมาก ท าใหเสยหายได 7. น าสไลดยสตและรามาสองดโดยวธการเชนเดยวกบขอ 3, 4 และ 5 แตไมตองสองดดวยเลนสวตถทใชน ามน (100x) เนองจากเซลลมขนาดใหญ เพยงแตใชเลนส high power กมองเหนชดเจนแลว บนทกผลลงในตารางท 2.1 8. การเกบและการรกษากลองจลทรรศน เมอเลกใชกลองจลทรรศนใหปฏบตดงน

8.1 ปด light souce และปดสวตซไฟ 8.2 หมน objective lens ใหก าลงขยายต าสดเขาท หมน coarse adjustment ให stage ต าสด แลวน าสไลดออกจาก stage 8.3 ใชกระดาษเชดเลนสซบน ามนออกจาก oil immersion objective ใหหมด (แตกรณทมการบกพรองปลอยใหน ามนแหงตดเลนส ใหใชกระดาษเชดเลนสจม xylon เชดน ามนออก) 8.4 ปด diaphragm และเลอน mechamical stage ใหเขาทเรยบรอย

8.5 ใชกระดาษทชชหรอผาทสะอาดท าความสะอาดสวนอนๆ ของกลอง ยกเวน เลนสใกลวตถคลมกลองแลวเกบเขาท 8.6 การเคลอนยายกลองจลทรรศนกระท าโดยใชมอหนงจบท arm ใหมนใชอกมอรองรบฐานกลองใหอยในสภาพตงตรงทกครง ไมจบหรอหวกลองจลทรรศนดวยมอเดยว

24

รายงานผลบทปฏบตการท 2 เรอง การใชกลองจลทรรศน

ชอ........................................................................นามสกล.....................................................................รหสนกศกษา………………………………….................สาขา.......................................................................... วนทท าการทดลอง……………….…..………………………………………………………..................................………. สมาชกในกลมทดลอง 1.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ 2.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ 3.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ ตารางท 2.1 จงวาดภาพแบคทเรย รา และยสต โดยแสดงรปรางและการจดเรยงตว

ชอจลนทรย รปรางและการจดเรยงตว (ก าลงขยายของ objective lens)

4x 10x 40x 100x

สรปผลการทดลอง ................................................................................................................................. ............................. ..................................................................................................... .........................................................

25

บทปฏบตการท 3 เรอง การเตรยมอาหารเลยงเชอและการท าใหปราศจากเชอ


3.1 สามารถเตรยมอาหารเลยงเชอและท าใหปราศจากเชอ 3.2 สามารถเตรยมอปกรณและท าใหปราศจากเชอ

การเตรยมอาหารเลยงเชอและการท าใหปราศจากเชอ อาหารเลยงเชอ (culture medium หรอ culture media) หมายถง สวนประกอบของสารอาหารทเอออ านวยใหจลนทรยมการแบงเซลล จลนทรยแตละชนดมความตองการสารอาหารตลอดจนสภาพความเปนกรด-ดางทแตกตางกน อาหารเลยงเชอสามารถแบงตามลกษณะการเตรยมได 2 พวก คอ 1. Dehydrate media เปนอาหารเลยงเชอส าเรจรปทผสมสารตาง ๆ ตามสตรมาเรยบรอยแลวเพยงแตค านวณวาจะตองชงสารมาเทาไร ผสมกบน าตามปรมาณทตองการ อาหารเลยงเชอแบบนประหยดเวลาในการเตรยมเหมาะส าหรบแหลงทตองใชอาหารเลยงเชอนนๆ ประจ า เชน ตามหองปฏบตการในโรงพยาบาล แตมตนทนสง

2. Common ingredient of culture media สารอาหารตองชงตามสตรแลวน ามารวมกน อาหารเลยงเชอแบบนตองใชเวลาในการเตรยมมาก การชงสารแตละชนดตองละเอยดและถกตองตรงตามสตร มฉะนนจะไมไดผลตามตองการ แตมขอดหลายอยาง เชน คาใชจายจะถกกวาและสามารถเตรยมอาหารเลยงเชอไดหลายชนดตามตองการ

อาหารเลยงเชอทนยมใชในหองปฏบตการส าหรบเลยงเชอแบคทเรย คอ Nutrient broth (NB), Nutrient agar (NA) ซงเปน complete media ทประกอบดวย beef extract 3 กรม, peptone 5 กรม ตอน ากลน 1 ลตร ถาจะใชเปนอาหารเเขงตองเตมวน 15 กรมตอลตร ส าหรบอาหารเลยงเชอรา คอ Potato dextrose agar (PDA) ซงเปน complete media เชนเดยวกน ประกอบดวยอาหารตอลตรดงน มนฝรง 200 กรม น าตาลเดกโตส 20 กรม และวน 15 กรม อาหารเลยงเชอบางชนดมการใส indicator ลงไป สภาพกรดหรอดางทเกดจากการใชสารตางๆ ทมอยในอาหารเลยงเชอนนๆ โดยดจากการเปลยนสของอาหารเลยงเชอ ส าหรบการท าใหอปกรณ เครองมอและอาหารเลยงเชอปราศจากเชอ (Sterilization) มวธการตางๆ กนตามสภาพของวตถทตองการท าใหปราศจากเชอดงน

26

1. Hot air oven เปนการฆาเชอจลนทรยโดยความรอนแหง ใชฆาเชอจลนทรยในพวกเครองแกวและโลหะตางๆ ทไมมสวนทเปนยาง สงของทจะเอาเขาตอบ ควรใสกลองโลหะหรอกลองกระดาษเพอไมใหสมผสกบสงแวดลอมหลงจากฆาเชอแลว 2. Autoclave เปนการฆาเชอจลนทรยโดยความรอนชน ใชฆาเชอจลนทรยในอาหารเลยงเชอและวสดทมยางเปนองคประกอบซงหอดวยกระดาษหรอกระดาษโลหะ (foil) รวมทงอปกรณการผาตดของแพทยดวย ปกตในหองปฏบตการจะใชความดนไอน า 15 ปอนดตอตารางนว อณหภมจะเปน 121 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 นาท

3. Filters เปนการท าใหปราศจากจลนทรยโดยการกรอง ใชส าหรบอาหารเลยงเชอหรอสารละลายทสลายไดงายดวยความรอน เชน อาหารเลยงเชอยเรยหรอซรม (ภาพท 2)

ภาพท 2 การท าใหปราศจากเชอโดยการกรอง (Filtration)

27

การทดลองท 1 การเตรยมอปกรณและการท าใหปราศจากเชอดวย Hot air oven วสดอปกรณ 1. กระดาษส าหรบหอ 2. ส าล 3. ไมขนาดเลก วธการทดลอง

1. น าส าลพนปลายไม (cotton swab) แลวหอดวยกระดาษฟอลย (นกศกษาท าคนละ 3 อน) 2. น าอปกรณทเตรยมไวทงหมดเขา Hot air oven เพออบฆาเชอในอณหภม 180 องศาเซลเซยส ประมาณ 3 ชวโมง การทดลองท 2 การเตรยมอาหารเลยงเชอและการท าใหปราศจากเชอโดย Autoclave วสดอปกรณ

1. กระดาษชงสาร ชอนตกสาร เครองชง 2. กระบอกตวง (cylinder) 3. ฟลาสก (erlenmeyer flask) 4. บกเกอร (beaker) 5. จานเพาะเชอปราศจากเชอ (plate/petri dish) 6. หลอดทดลอง (test tube) 7. แทงแกวคนสาร (glass stirrer rod) 8. ปเปต (pipette) 9. กระดาษวด pH 10. อาหารส าเรจรป 11. มนฝรง 12. น าตาลเดกโตรส (dextrose) 13. วน (agar) 14. ผาขาวบาง, ถงพลาสตก, เทปใส, ยางรด

28

วธการทดลอง ก. การเตรยมอาหารเลยงเชอแบบ Dehydrate media โดยใหนกศกษาแตละกลมเตรยมอาหารเลยงเชอ Nutrient agar ปรมาตรกลมละ 300 มลลลตร (ภาพท 3)

1. ค านวณและชงอาหารส าเรจรปตามจ านวนทตองการ (ดจากค าแนะน าขางขวดอาหาร) 2. ใสในฟลาสกขนาด 500 มลลลตร เตมน าจนครบ 300 มลลลตร คนใหเขากนดวยแทง

แกวคนสาร 3. ตมบน stirrer hot plate จนอาหารเลยงเชอใส 4. วดความเปนกรด-ดาง ดวยกระดาษวด pH ถาอาหารเปนกรดหรอเปนดางมากเกนไปให

ปรบดวย 0.1N NaOH หรอ 0.1N HCl จนได pH ตามทระบไวขางขวดอาหารเลยงเชอ 5. ใชปเปตบรรจอาหารลงหลอดทดลอง หลอดละ 7 มลลลตร แลวปดฝาหลอดทดลอง

(นกศกษาตองท าทกคน) เขยนชอกลมไวขางหลอด น าไปรวมกนในตะกราเพอน าไปท าใหปราศจากเชอดวย autoclave สวนอาหารทเหลอในฟลาสก ใหเทใสในขวดแกว ปดดวยจกส าล ปดทบดวยกระดาษฟอลยอกชน เขยนชอกลม น าเขา autoclave เพอท าใหปราศจากเชอ

6. เมอน าออกจาก autoclave อาหารเลยงเชอทอยในหลอดทดลองใหน ามาวางเอยง รอจนอาหารเยน จะไดอาหารเลยงเชอลกษณะเอยง เรยกวา agar slant สวนอาหารเลยงเชอทอยในขวดใหน ามาเทใสในจานอาหารเลยงเชอทผานการท าใหปราศจากเชอแลว รอจนอาหารเยน จะไดอาหารเลยงเชอทอยในจานอาหารเลยงเชอ เรยกวา agar plate

7. น าเขาตบมเชอ (incubator) ทอณหภม 35 องศาเซลเซยส เปนเวลา 18-24 ชวโมง เพอตรวจสอบวาอาหารเลยงเชอทเตรยมนนมการปนเปอน (contaminate/contamination) เชอจลนทรยทไมตองการหรอไม บนทกผลลงในตารางท 3.1

ภาพท 3 การเตรยมอาหารเลยงเชอ

29

ข. การเตรยมอาหารเลยงเชอแบบ Common ingredient media โดยใหนกศกษาแตละกลมเตรยมอาหารเลยงเชอ Potato dextrose agar (PDA)ปรมาตรกลมละ 200 มลลลตร สตรอาหาร PDA

ส าหรบการเตรยมอาหารเลยงเชอ 1 ลตร มนฝรง 200 กรม เดกโตรส 20 กรม วน 15 กรม น ากลน 1 ลตร (1,000 มลลลตร) วธการทดลอง 1. ค านวณและชงสารตามสตรอาหาร 2. ปอกเปลอกมนฝรงแลวหนเปนลกเตาเลกๆ น ามาชงตามจ านวนทค านวณไวใสบกเกอร 3. เตมน าพอทวมมนฝรง แลวตมใหเดอดประมาณ 15 นาท เนอมนฝรงจะนมแตไมเละ กรองเอาน ามนฝรง (กรองผานกระบอกตวง) แลวเตมน ากลนใหครบปรมาตร 200 มลลลตร เทใส beaker 4. ใสน าตาลเดกโตรสและวนตามจ านวนทค านวณ ไวแลวน า beaker ทมน ามนฝรง น าตาลเดกโตสและวน ไปตมบน stirrer hot plate ใหละลายอกครง 5. ใชปเปตบรรจอาหารทละลายเปนเนอเดยวกน ลงในหลอดทดลองหลอดละ 7 มลลลตร เพอท าเปน PDA slant (นกศกษาตองท าทกคน) ระวงอยาใหอาหารเปอนปากหลอด สวนอาหารทเหลอเทใสขวดแกว ปดจกหลอดและขวดแกว พรอมเขยนชอใหเรยบรอยเพอน าเขา autoclave

6. เมอน าออกจาก autoclave 6.1 หลอดอาหารทจะท า agar slant น าออกมาวางใหหลอดอาหารอยในลกษณะเอยง รอจนอาหารเเขง

6.2 สวนอาหารในขวดแกวใหน าไปแชใน water bath อณหภม 45-50 องศาเซลเซยส จนอาหารอณหภม 45-50 องศาเซลเซยส น าอาหารดงกลาวมาเทใสจานเพาะเชอทปราศจากเชอ (pour plate) ดวยวธ aseptic techhnique โดยใหนกศกษาแตละคน pour plate คนละ 2 plate เกบรวมกนเปนกลมเดยวกนเพอใชในการปฏบตการครงตอไป 7. เมอถงปฏบตการครงตอไป น าหลอดอาหาร PDA slant และ PDA plate ทเกบไวมาตรวจดวามการปนเปอนของจลนทรยทไมตองการหรอไม

30

รายงานผลบทปฏบตการท 3 เรอง การเตรยมอาหารเลยงเชอและการท าใหปราศจากเชอ

ชอ........................................................................นามสกล.....................................................................รหสนกศกษา………………………………….................สาขา.......................................................................... วนทท าการทดลอง……………….…..………………………………………………………..................................………. สมาชกในกลมทดลอง 1.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ 2.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ 3.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ ตารางท 3.1 ผลของการเตรยมอาหารเลยงเชอหลงจากการบม

ประเภท

อาหารเลยงเชอทเตรยม

อาหารเลยงเชอ Nutrient agar (NA)

อาหารเลยงเชอ Potato Dextrose Agar (PDA)

จ านวน ทเตรยมได

จ านวน ทปนเปอน

จ านวน ทเตรยมได

จ านวน ทปนเปอน

Agar slant (หลอด)

Agar plate (plate)

ค าถาม 1. การเตรยมอาหารเลยงเชอแบบ dehydrated media แตกตางจากการเตรยมอาหารเลยงเชอแบบ common ingredient media อยางไร .................................................................................... .................................................................... ...... ............................................................................................................................. ................................. ................................................................................................................................................... ........... ....................................................................................................................... .......................................

31

2. การท าใหปราศจากเชอโดยใชความรอนแหงกบความรอนชนแตกตางกนอยางไร ............................................................................................................................. ................................. ............................................................................................................................. ................................. ............................................................................. ........................................................................... ...... ............................................................................................................................. ................................. 3. ลกษณะอาหารเลยงเชอในรปแบบ agar slant แตกตางจากอาหารเลยงเชอในรปแบบ agar plate อยางไร ............................................................................................................................. ................................. ............................................................................................................................. ................................. ................................................................................................. ............................................................. ............................................................................................................................. ................................. 4. การท าใหปราศจากเชอโดยการใช filter ท าไดอยางไร ............................................................................................................................. ................................. ........................................................................................................................................................ ...... ............................................................................................................................. ................................. ............................................................................................................................. ................................. สรปผลการทดลอง ............................................................................................................................. ................................. .................................................................................. ...................................................................... ...... ............................................................................................................................. ................................. ................................................................................................................................................. ............. ..................................................................................................................... ......................................... ............................................................................................................................. ................................. ........................................................................................................................................................ ...... ............................................................................................................................. ................................. ............................................................................................................................. ................................. .......................................................................................... .................................................................... ............................................................................................................................. ................................. ........................................................................................................................................................ ......

32

บทปฏบตการท 4 เรอง เทคนคทางจลชววทยาและจลนทรยในธรรมชาต


4.1 สามารถถายเชอจลนทรยโดยวธ Aseptic technique 4.2 สามารถแยกเชอจลนทรยใหบรสทธโดยวธ Streak plate

4.3 สามารถตรวจนบจ านวนจลนทรยโดยวธ Pour plate และ Spread plate 4.4 สามารถศกษาจลนทรยในธรรมชาต

จลนทรยในธรรมชาตและเทคนคทางจลชววทยา เนองจากจลนทรยเปนสงมชวตขนาดเลก และมการกระจายตวอยทกหนทกแหงทงใน ดน น า และอากาศ แตการกระจายตวของจลนทรยในธรรมชาตมองดวยตาเปลาไมเหน การตรวจดวยกลองจลทรรศนกพบไดยาก และสภาพแวดลอมเหมาะสมกบจลนทรยชนดนนๆ และในการทดลองเพอพสจนวามจลนทรยอยทใดบาง ตองใชอาหาร เครองมอ และเครองใชทปราศจากเชออนๆ เพอใหมเพยงจลนทรยในแหลงทตองการตรวจสอบเทานนจงจ าเปนตองใชวธ aseptic technique Aseptic technique หมายถง วธการปองกนไมใหเชอจลนทรยทไมตองการปนเปอน (contaminate/contamination) ในระหวางการปฏบตตาง ๆ เชน การน า loop และ needle มาลนไฟกอนและหลงเขยเชอ การลนปากหลอดทดลอง ฟลาสก ขณะเปดและกอนปดหลงการถายเชอ เทคนคตางๆ ทจ าเปนตองใชในปฏบตการจลชววทยา 1. เทคนคการถายเชอจลนทรย (culture transfer technique) เปนการถายเชอจาก medium หนงไปยงอก medium หนง เรยกวธนวา subculturing ซงเปนหลกส าคญในการปฏบตทางจลชววทยาในการเตรยมและเกบรกษาเชอ หรอ stock culture โดยปกตจลนทรยพบทวไปในอากาศ บนโตะ ตามอปกรณ เครองมอตางๆ ซงอาจเปนสาเหตของการปนเปอนถาไมใชเทคนคปราศจากเชอ (aseptic technique) การถายเชอมหลายแบบ เชน 1.1 broth to broth 1.2 broth to slant 1.3 slant to broth 1.4 broth to agar 1.5 slant to agar

33

2. เทคนคในการแยกใหไดเชอบรสทธ (pure culture) ในธรรมชาตจลนทรยจะอยรวมกนเปนกลมปะปนกน เรยกวา mix culture แตในหองปฏบตการเราสามารถแยกจลนทรยเหลานออกเปนแตละชนดได หรอเรยกวา pure culture ซงเหมาะสมส าหรบการน ามาศกษาลกษณะของ culture รปราง และสมบตทางชวเคม เมอน าจลนทรยไปเพาะบนอาหารเลยงเชอ จลนทรยจะเจรญเปน colony อาจเกดจากเซลลเดยวหรอสปอรเดยว เมอมการเจรญเซลลทกเซลลใน colony หนงจะมลกษณะเหมอนกนทกประการ หรอมแตเชอบรสทธ (pure culture) เมอยาย colony ไปเลยงในอาหารใหมโดยใชเทคนคการถายเชอแบบ aseptic technique กจะเกดเปน colony ใหม ซงมแตเชอบรสทธเทานน การทดลองท 1 การถายเชอแบคทเรยโดยวธ aseptic technique วสดและอปกรณ

1. เชอ Bacillus subtilis 2. Nutrient broth 3. Nutrient agar slant 4. Semisolid agar 5. Sterile pipette 6. Loop และ needle

วธการทดลอง นกศกษาฝกการถายเชอโดยวธ aseptic technique 1. จาก agar culture ของ B. subtilis ไปยง nutrient agar slant โดยใช loop ขดหรอstreak ลงบนผวหนาอาหารเลยงเชอ (ภาพท 4) 2. จาก agar culture ของ B. subtilis ไปยง nutrient broth โดยใช loop แตะเชอและจมพรอมเขยา loop (inoculting) ในอาหารเลยงเชอ 3. จาก broth culture ของ B. subtilis ไปยง nutrient broth ปรมาตร 0.1 มลลลตร โดยใช Sterile pipette ขนาด 1 มลลลตร 4. จาก broth culture ของ B. subtilis ไปยง semisolid medium โดยใช neeldle แทงลงไป (stab) กลางอาหารเลยงเชอจนถงกนหลอดทดลอง

34

วธ aseptic technique (ภาพท 5) 1. จบ loop หรอ needle ดวยมอขวา ลนไฟจนกระทง loop รอนแดง แลวปลอยใหเยนราว 10 - 15 วนาท 2. ใชมอซายหยบหลอดทดลอง ใชนวกอย นวนาง และองมอขวา เปดจกหลอดอาหารเลยงเชอแลวถอไวหามวางลงบนโตะ 3. ลนปากหลอดดวยการผานเปลวไฟ และใชมอขวาคอยๆ สอด loop หรอ needle ลงไปแตะขนมา ระวงอยาให loop หรอ needle ชนกบปากหลอด 4. ลนไฟปากหลอดอาหารเลยงเชออกครง ปดจกแลววางกลบทเดม 5. หยบหลอดอาหารเลยงเชอใหมทตองการถายเชอแบคทเรยลงไป ท าเชนเดยวกบขอ 2 แลวจม loop หรอแทงดวย needle ลงไปในหลอดใหม ลนปากหลอด แลวปดจก 6. ลน loop หรอ needle จนรอนแดงเพอท าลายเชอจลนทรย 7. น าหลอดทงหมดบมไวอณหภม 35 องศาเซลเซยส เปนเวลา 18 - 24 ชวโมง การอานผล

สงเกตความขนใน nutrient broth และใน semisolid agar ถาขนแสดงวา B. subtilis มการเจรญและสงเกตแนวการเจรญของ B. subtilis บน nutrient agar slant บนทกผลลงในตารางท 4.1

ภาพท 4 การขดลากบนผว slant agar

35

ก ข ค

ง

จ ฉ ช ซ

ภาพท 5 ขนตอนการถายเชอแบบ aseptic technique

ก เผาลวดเขยเชอเพอฆาเชอใหลวดรอนแดงทงเสน ข. เปดจกหลอดพรอมกนทงสองหลอด ค. ลนปากหลอดทง 2 หลอด ง.ถายเชอจากหลอดหนงไปยงอกหลอดหนง จ.ลนไฟปากหลอดอกครงหลงเขยเชอ ฉ. ปดหลอดดวยจกส าลพรอมกน ช. เผาลวดเขยเชออกครงหนงเพอฆาเชอ ซ. เขยนชอเชอ วนททดลองทขางหลอด

36

การทดลองท 2 การแยกเชอแบคทเรยใหบรสทธ 2.1 Streak plate โดยวธ 16 streak วสดและอปกรณ

1. เชอ Staphylococcus aureus 2. Nutrient agar 3. Loop

วธการทดลอง 1. ใหนกศกษาทกคนเขยนชอนกศกษาและชอเชอไวทกนจานอาหารเลยงเชอ 2. น า loop ไปลนไฟจนรอนแดง ทงใหเยนแลวเขยเชอทตองการแยกบนอาหารแขง NA

โดยstreak เชอลงบรเวณ A 4 แถว 3. น า loop ลนไฟจนรอนแดง ทงใหเยน เขยเชอจากบรเวณ A ไปยงบรเวณ B อกแถว 4. น า loop ลนไฟจนรอนแดง ทงใหเยน เขยเชอจากบรเวณ B ไปยงบรเวณ C อกแถว

5. น า loop ลนไฟจนรอนแดง ทงใหเยน เขยเชอจากบรเวณ C ไปยงบรเวณ D อก 4 แถว แตระวงไมใหบรเวณ D ทบกบบรเวณ A เดดขาด (ภาพท 6 และ 7) 6. น าจานอาหารทมเชอเขาตบมอณหภม 35 องศาเซลเซยส เปนเวลา 18 - 24 ชวโมง สงเกตเชอทเจรญนนวาเปนโคโลนเดยวหรอไม และใหศกษาลกษณะโคโลนของเชอ S. aureus (ภาพท 8)บนทกผลลงในตารางท 4.2 เชอ E.coli + loop loop loop loop ลนไฟ loop ลนไฟ

loop ลนไฟ

ภาพท 6 ขนตอนการแยกเชอแบคทเรยใหบรสทธโดยวธ 16 ขด (16 streak)

37

ภาพท 7 ขนตอนการแยกเชอแบคทเรยใหบรสทธโดยวธขดลากแบบไขว (cross streak)

ภาพท 8 รายละเอยดของลกษณะโคโลนของเชอแบคทเรย

38

การทดลองท 3 การตรวจนบจ านวนจลนทรย โดยวธ pour plate และ spread plate 3.1 วธ Pour plate วสดและอปกรณ

1. เชอ Escherichia coli 2. Sterile test tube 3. Sterile pipette 4. น าเกลอ (0.85%NaCl) 5. Melted nutrient agar 6. Sterile petridish 7. Water bath ตงอณหภมท 50 องศาเซลเซยส

วธการทดลอง 1. ท า Serial dilution ของเชอ E.coli โดยท า dilution ใหได 10-4, 10-5 , 10-6 โดยใชน าเกลอเปนท าละลาย (diluent) การท าเปน serial dilution ท าดงน

1.1 เรยง test tube ลงใน rack และ label 1 ถง 6 ลงบนแตละหลอด 1.2 ใช sterile pipette ขนาด 5 มลลลตร ดดน าเกลอใสลงใน sterile tube หลอดละ 4.5 มลลลตร 1.3 ใช sterile pipette ขนาด 1 มลลลตร ดดเชอ E.coli ขนมา 0.5 มลลลตร ใสลงใน tube ท 1 ใช Sterile pipette อนใหม ขนาด 1 มลลลตร ดดขนลง 2 - 6 ครง และดดสารละลายจากหลอดท 1 ปรมาตร 0.5 มลลลตร ใสในหลอดท 2 1.4 ใช Sterile pipette อนใหม ขนาด 1 มลลลตร ดดขนลง 2 - 6 ครง และดดสารละลายจากหลอดท 2 ปรมาตร 0.5 มลลลตร ใสในหลอดท 3 1.5 ท าเชนเดยวกนจนถงหลอดท 6 กจะได serial dilution มความเขมขน 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 และ 10-6 ตามล าดบ 2. เขยนชอกลม ระดบความเขมขน 10-4 , 10-5 และ 10-6 ทกนของ sterile petridish ระดบความเขมขนละ 2 จาน 3. ใช sterile pipette ขนาด 1 มลลลตร ดดสารละลายในขอ 1.5 ทระดบความเขมขน 10-4, 10-5 และ 10-6 ตามล าดบใสใน sterile petri dish จานละ 1 มลลลตร หรอใสลงใน melted agar เลยกไดโดยดดจากความเขมขนต า มายงความเขมขนสง 4. เท meted agar (ซงบรรจในหลอด แชใน water bath อณหภมประมาณ 50 องศาเซลเซยส) ลงใน petri dish เชอ (จากขอ3) หมน petri dish ไปมาแลวปลอยใหอาหาร

39

เลยงเชอแขง กอนน าไปบมในตบมเชอ อณหภม 35 องศาเซลเซยส เปนเวลา 18 - 24 ชวโมง (ภาพท 9 และ 10) การอานผล นยมท าการตรวจนบจ านวนจลนทรยในจานทมเชอเจรญอยในชวง 30-300 โคโลน (colony) แลวค านวณจ านวนโคโลน ตอ 1 มลลลตร บนทกผลการทดลองลงในตารางท 4.3 เชน สมมตวาจานทระดบความเขมขน 10-5 อานได 85 CFU (colony forming unit) ดงนน จ านวนตอเชอ 1 มลลลตร ค านวณไดดงน ปรมาตร 1 มลลลตร ทระดบความเขมขน 10-5 นบได 85 CFU ปรมาตร 1 มลลลตร ทระดบความเขมขนทไมเจอจางหรอ undilute จะมเชอ = 85 CFU/ml.

10-5 = 85 x 105 CFU/ml. ดงนนจ านวนเชอเรมตนทงหมด = 8.5 x106 CFU/ml. 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml ปเปตทง 0.5ml

0.85% NaCl 4.5ml.

E. coli 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 plate ละ 1 ml. ลงใน sterile plate

ภาพท 9 การเจอจางเชอ (serial dilution) ดวยวธ 10-fold dilution เพอตรวจนบโดยวธ pour plate

40

ภาพท 10 การตรวจนบเชอดวยวธ pour plate

3.2 วธ Spread plate วสดและอปกรณ

1. Nutrient agar 2. Spreader 3. Beaker 4. Sterile pipette 5. 95% Alcohol

วธการทดลอง 1. เขยนชอกลม ระดบความเขมขน 10-4, 10-5 และ 10-6 ทกนของอาหารเลยงเชอ nutrient agar ทก plate 2. ใช sterile pipette ขนาด 1 มลลลตร ดด serial dilution ของ E.coli (ซงไดเตรยมไวเรยบรอยแลวในการทดลองท 3.1) ปรมาตร 0.1 มลลลตร ทระดบความเขมขน 10-4, 10-5 และ 10-6 ใสลงบน nutrient agar

41

3. จม spreader ลงใน beaker ซงมแอลกอฮอลบรรจอยยกขนมารอใหแอลกอฮอลไหลลงไปใน beaker จนเกอบหมดแลวเผาไฟ รอจนเยน ใช spreader กวาดไปบน nutrient agar ทมเชอ E.coli อย โดยกวาดใหทวผววน น าไปบมใน incubator ทอณหภม 35 องศาเซลเซยส เปนเวลา 18 - 24 ชวโมง (ภาพท 11 และ 12) การอานผล ท านองเดยวกนขอ 3.1 และใหค านวณเปนจ านวน CFU/1 มลลลตร บนทกผลการทดลองลงในตารางท 4.3

เชน ปรมาตร 0.1 มลลลตร ทระดบความเขมขน 10-5 นบได 85 CFU ปรมาตร 0.1 มลลลตร ทระดบความเขมขนทไมเจอจางหรอ undilute จะมเชอ = 85 CFU/0.1ml.

10-5 = 85 x 105 x 10 CFU/ml.

ดงนนจ านวนเชอเรมตนทงหมด = 8.5 x107 CFU/ml.

0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml ปเปตทง 0.5ml

0.85% NaCl 4.5ml.

E. coli 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 plate ละ 0.1 ml. ลงใน nutrient agar plate

จม spreader 95% alcohol ผานไฟ

ภาพท 11 การเจอจางเชอ (serial dilution) ดวยวธ 10-fold dilution

เพอตรวจนบโดยวธ spread plate

42

ภาพท 12 การตรวจนบเชอดวยวธ spread plate

ก. ปเปต suspension ของเชอใสลงบนผวหนาอาหารวนทแขงตวแลว ข. จมแทงแกวงอในแอลกอฮอล 95% ค. น าแทงแกวงอผานไฟ ง. เกลยเชอใหกระจายทวผวหนาอาหารพรอมหมนจานเลยงเชอ จ. บมเชอ ฉ. โคโลนเดยวๆ ของเชอทเจรญ

การทดลองท 4 จลนทรยในธรรมชาต วสดและอปกรณ NA 1 จาน วธการทดลอง

1. น า NA 1 จาน ใชดนสอเขยนแกว label ทกนจานเพาะเชอ (ดานทมอาหารเลยงเชอ) โดยแบงเปน 6 สวน ดงภาพท 13

43

2. ทดสอบจลนทรยในธรรมชาตในแตละสวน สวนท 1 เปน Control ไมตองท าอะไร สวนท 2 น าเหรยญ มาแตะลงบนผวหนาวน สวนท 3 ใช Control swab ลากบนพนโตะปฏบตการแลวแตะลงบนผวหนาวน สวนท 4 ใชนวแมมอแตะลงบนบรเวณหนาวน สวนท 5 ใชนวหวแมมอลางน าสะอาดและแหงสนท แตะบนผวหนาวน สวนท 6 ใชน าประปาหยดลงบนผววน 1 หยด

3. น า plate ไปบมในต incubator อณหภม 35 องศาเซลเซยส โดยคว า plate เปนเวลา 24 ชวโมง

4. สงเกตการเจรญโตของเชอจลนทรยโดยบนทกเปนลกษณะโคโลน บนทกผลการทดลองลงในตารางท 4.4

ภาพท 13 การตรวจสอบจลนทรยในธรรมชาต

ควบคม น ำ เหรยญ

นวสะอำด พนโตะ นวปกต

44

รายงานผลบทปฏบตการท 4 เรอง เทคนคทางจลชววทยาและจลนทรยในธรรมชาต

ชอ........................................................................นามสกล.....................................................................รหสนกศกษา………………………………….................สาขา.......................................................................... วนทท าการทดลอง……………….…..………………………………………………………..................................………. สมาชกในกลมทดลอง 1.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ 2.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ 3.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ ตารางท 4.1 ผลการถายเชอแบคทเรย

อาหารเลยงเชอ การเจรญของ B. subtilis (ขน + , ไมขน -) 1. Nutrient agar slant 2. Nutrient broth 3. Nutrient broth 4. Semisolid agar ตารางท 4.2 ผลการแยกเชอแบคทเรยใหบรสทธ

จลนทรย

ลกษณะของโคโลน ส

(color) รปราง(form)

ขนาด (size)

ขอบ (margin)

ระดบความนน

(elevation)

ผวหนา(surface)

45

ตารางท 4.3 การนบจ านวนจลนทรยโดยวธ pour plate และ spread plate วธการ

จ านวนจลนทรย (CFU) ทระดบ ความเขมขน

จ านวนจลนทรยทงหมด (CFU/ml)

10-5 10-6 10-7 Pour plate

Spread plate

ตารางท 4.4 จลนทรยในธรรมชาต

Zone ท จ านวนโคโลน/ลกษณะโคโลน 1 . control 2. เหรยญ 3 . พนโตะปฏบตการ 4 . นวมอ 5 . นวมอลางสะอาด 6. น าประปา ค าถาม 1. ท าไมตองคว าจานอาหารเลยงเชอ ขณะบมเชอทเจรญบนอาหารวนซงบรรจในจานเพาะเชอ ......................................................................................................................................................... ..... ............................................................................................................................. ................................. 2. ท าไมจงใช suspension ของเชอปรมาณตางกนในการตรวจนบจ านวนจลนทรยโดยวธ pour plate และ spread plate ............................................................................................................................. ................................. ............................................................................................................................. ................................. สรปผลการทดลอง ........................................................................ ................................................................................. ..... ............................................................................................................................. .................................

46

บทปฏบตการท 5 เรอง สณฐานวทยาของเเบคทเรย


5.1 สามารถยอมสแบคทเรยแบบ Simple stain 5.2 สามารถยอมสแบคทเรยแบบ Gram stain 5.3 สามารถศกษาการเคลอนทของแบคทเรย 5.4 สามารถยอมสโครงสรางตางๆ ของเเบคทเรย

สณฐานวทยาของแบคทเรย (Morphology of Bacteria) การศกษาทางกลองจลทรรศนเปนขนตอนแรกในการชเอกลกษณ (identify) ของแบคทเรยซงสามารถแบงเปนกลมใหญๆ ตามการตดสแกรมเปนแบคทเรยแกรมบวก (gram positive bacteria) และแบคทเรยแกรมลบ (gram negative bacteria) ลกษณะทางสณฐานวทยา ไดแก รปราง (shape) คอ กลม(coccus/cooci) แทง (rod/bacillus/bacilli) โคงงอ (spiral/spirillum) หรอเกลยว (spirochete) และการเรยงตวของเซลล (cell arrangement) รวมถงการมโครงสรางทเฉพาะตว เชน เอนโดสปอร (endospore) แฟลกเจลลา (flagella) แคปซล (capsule) และเมดสภายในเซลล (intracellar granules) ขนตอนในการเตรยมเชอแบคทเรยกอนการยอมส 1. label สไลดดวยดนสอเขยนแกว 2. ใชวธ aseptic technique โดยใช loop ถายเชอจากอาหารเหลว (broth) 1 loop หยดบนสไลดทสะอาด ถาใชเชอจากอาหารแขง (agar) ใหน ามาผสมกบน าหรอน าเกลอ 1 หยด ใช loop กระจาย (smear) เชอใหแผเปนแผนฟลมบางๆ ( เสนผานศนยกลางประมาณ 2 cm) โดยวน loop ไปทางเดยวกน

3. ทงไวใหแหงเองในอากาศ (air dry) 4. Fixation โดยผานสไลด (ใหรอย smear อยดานบน) ไปมา 4-5 ครง เหนอเปลวไฟของตะเกยง (ภาพท 14) 5. ใหวางสไลดบนแทงเหลกทพาดบนอางน า ท าการหยดสใหทวแผนฟลม เมอครบเวลาใหรนสทเหลอออก ลางดวยน ากอก ซบสไลดใหแหง น าไปศกษาดวยกลองจลทรรศน สไลดเตรยมเองทดเสรจแลวใหแชในน ายาฆาเชอ (cleaning solution)

47

การยอมสแบคทเรย แบคทเรยประกอบดวย protoplasmic matter จดประสงคของการยอมสกเพอใหแบคทเรยตดส ท าใหเหนงายในการศกษารปราง ขนาดและลกษณะของเซลล รวมถงสวนประกอบตาง ๆ และชวยในการจ าแนกใหเหนความแตกตางระหวางเซลลทมลกษณะคลายคลงกน การยอมสม 2 ประเภทใหญๆ คอ การยอมสเดยว (simple staining) และการยอมมากกวา 1 ส (differential staining) การทดลองท 1 Simple staining วสดและอปกรณ

1. ส methylene blue 2. เชอแบคทเรยทเลยงในอาหารแขง Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylocoocus aureus 3. สไลด และ loop

4. กลองจลทรรศนชนด bright field microscope และ oil immersion วธการทดลอง

1. ท าความสะอาดสไลดดวย alcohol 70% 2. เตรยมสไลดแบคทเรย (smear, air dry, fixation) ตามวธการดงกลาวขางตน ใหครบทง 3 เชอ 3. หยดส methylene blue ลงบนรอย smear ทงไว 1 นาท แลวลางออกดวยน า ซบใหแหง น าไปดดวยกลองจลทรรศนก าลงขยาย 100X (oil immersion lens)

4. บนทกผลในตารางท 5.1 การอานผล ใหดรปรางของเซลลวาเปน cocci, bacilli หรอ spirilli การเรยงตวของกลมเซลลวาเปนอยางไร (ภาพท 15 และ 16) และเหนโครงสรางพเศษอนๆ หรอไม เชน endospore, flagella หรอ capsule

48

ภาพท 14 การเตรยมสไลดเชอแบคทเรยกอนน าไปยอมส (a) เขยเชอแบคทเรยมาพอประมาณน ามาแตะลงบนหยดน าทเตรยมไวบนสไดล (b) เกลยใหหยดน าทมเชอแบคทเรยกระจายเปนฟลมบาง ๆ (c) น าหยดเชอแบคทเรยมาประมาณ 2-3 หวง (d) เกลยใหหยดเชอแบคทเรยกระจายเปนฟลมบาง ๆ (e) ทงไวใหเยน (air dry) (f) ตรงรอยเกลยเชอดวยความรอน (heat-fix)

49

ภาพท 15 การจดเรยงตวของเชอแบคทเรยทมรปรางทรงกลม (cocci)

ภาพท 16 การจดเรยงตวของเชอแบคทเรยทมรปรางแทง (bacilli)

50

การทดลองท 2 Gram staining วสดและอปกรณ

1. ชดยอมสแกรมประกอบดวย 1.1 Crystal violet 1.2 Gram iodine (mordant stain) 1.3 95% alcohol หรอ acetone (decolourizer) 1.4 Safranin (counter stain)

2. เชอทใชยอมใหใชเชอเหมอนการทดลองท 1 วธการทดลอง 1. ท าความสะอาดสไลดดวย alcohol 70% 2. เตรยมสไลดแบคทเรย (smear, air dry, fixation) ตามวธการดงกลาวขางตน ใหครบทง 3 เชอ 3. วธยอมสแกรมและขนตอนการตดสแกรม

3.1 หยด Crystal violet ใหทวมรอย smear 1 นาท แลวลางน า เทน าออก 3.2 หยด Gram iodine 1 นาท ลางน า 3.3 Decolourize ดวย 95% แอลกอฮอล โดยเอยงสไลดไปมาประมาณ 5-10 วนาท แลวลางน า ระวงอยา decolourize นานเกนไป เพราะจะท าใหส crystal violet iodine complex หลด 3.4 หยด Safranin counterstain 15 วนาท ลางน า แลวซบใหแหงกอนดดวยกลองจลทรรศน 4. บนทกผลการทดลองในตารางท 5.2 การอานผล เซลลตดสมวงของ crystal violet แบคทเรยแกรมบวก เซลลตดสแดงของ safranin แบคทเรยแกรมลบ

51

การทดลองท 3 การเคลอนทของแบคทเรย แบคทเรยเคลอนทไดโดยอาศย flagella ดงนน ถาจะตรวจดวาแบคทเรยใดเคลอนทไดหรอไม สามารถท าได 3 วธ คอ 1. ตรวจหา flagella โดยการยอม flagella stain 2. โดยการเลยงแบคทเรยใน semisolid media (motility test) 3. ตรวจสอบดวยกลองจลทรรศน โดยการท า hanging drop วสดและอปกรณ 1. เชอ Salmonella typhi และ Staphylococcus aureus อยางละ 1 หลอด 2. สไลดหลม 1 แผน 3. Loop วธการทดลอง 1. หยดน า 1 loop บนกลาง cover glass และจมน าหรอวาสลนแตะทมมทงสของกระจกปดสไลด น า loop ลนไฟฆาเชอ รอใหเยน จมเชอทอยในอาหารแขง แลวแตะเชอทตองการลงไปตรงหยดน า ระวงไมใหหยดน ากระจาย (หากเปนเชออยในอาหารเหลวไมตองหยดน า) 2. คว าสไลดหลมประกบกบ cover glass โดยใชหยดน าหอยอยตรงกลางของสไลดหลม 3. กลบสไลดขน น าไปสองดดวยจลทรรศน ก าลงขยายจาก 10X เปน 40X หาม ใชก าลงขยาย 100x 4. บนทกผลในตารางท 5.3 การอานผล เซลลเคลอนทได - motile เซลลเคลอนทไมได - non motile ใหสงเกตหากเปนการเคลอนทแบบ Brownian movement เปนการเคลอนทเนองจากอนภาคหรอเซลลกระแทกกบโมเลกลของน า อนภาคยงขนาดเลกจะยงเคลอนไหวไดแรง ซงการเคลอนทแบบนไมไดเกดจากเซลลทม flagella จงอานผลทแบคทเรยเคลอนไหวแบบนวา non - motile

52

การทดลองท 4 Endospore stainig Endospore พบในแบคทเรย Genus Bacillus และ Clostridium เปนโครงสรางพเศษของเซลลทจะสรางขนในระยะ stationary phase ของระยะการเจรญ เพอท าหนาทใหสามารถทนตอสภาวะแวดลอมทไมเหมาะสมกบการเตบโตของเซลลได วสดและอปกรณ 1. ชดส spore stain ประกอบดวย 5% Malachite green, Safranin 2. เชอ Bacillus subtilis และ Staphylococcus aureus วธการทดลอง (Schaeffer-Fultions method) 1. ท าความสะอาดสไลดดวย alcohol 70% 2. เตรยมสไลดแบคทเรย (smear, air dry, fixation) ตามวธการดงกลาวขางตน ใหครบทง 2 เชอ 3. หยดส malachite green ใหทวมรอย smear ทงไว 3-6 นาท โดยวางสไลดบนเปลวไฟ ใหสเดอดนาน 3-6 นาท คอยเตมสอยาใหสแหงตดสไลด ลางดวยน า 4. ยอมทบดวย 0.5% safranin 30 วนาท ลางน า

5. น าไปดดวยกลองจลทรรศนก าลงขยาย 100X บนทกผลในตารางท 5.4 การอานผล (ภาพท 17) สวนทตดสเขยว - endospore ของแบคทเรย สวนทตดสชมพ - vegetative cells

Vegetative cell

ภาพท 17 โครงสราง Endospore

53

การทดลองท 5 Acid fast staining เปนการยอมเพอตรวจหาเชอ Mycobacterium tuberculosis ซงท าใหเปนวณโรค เปนเชอทยอมสแกรมตดยาก แตจะตดสเมอยอมดวย acid fast stain วสดและอปกรณ

1. ชดส acid fast stain ซงประกอบดวย 1.1 carbol fuchsin 1.2 3% conc. HCl ใน 95%alcohol (acid alcohol) 1.3 0.5% methylene blue

2. Smear เสมหะของคนเปนวณโรค ซงมเชอ M. tuberculosis แลวบนสไลด วธการทดลอง (Kinyoun’s)

1. หยดส carbol fuchsin บนสไลดใหทวมรอยเชอ ทงไวประมาณ 3-5 นาท ลางน า 2. Decolourize ดวย acid alcohol จนกระทงสจาง (ประมาณ 1 นาท) ลางน า 3. ยอมทบดวย methylene blue ประมาณ 30 วนาท ลางน า ทงไวใหแหง แลวน าไปด

ดวยกลองจลทรรศน บนทกผลในตารางท 5.5 การอานผล เซลลรปแทงตดสแดงของ carbol fuchsin - acid fast bacilli เซลลอนๆ ตดสน าเงนของ methylene blue - non- acid fast bacilli การทดลองท 6 Capsule staining แบคทเรยบางชนดม capsule หม ซงเปนสารประกอบจ าพวก polysaccharide หรอ polypeptide การทจะมอง capsule ของแบคทเรยใหชดเจน นยมยอมแบบ negative staining คอ ยอมสภมหลง วสดและอปกรณ 1. ส India ink หรอ ส nigrosin 2. เชอ Bacillus subtilis และ Escherichia coli

54

วธการทดลอง 1. ท าความสะอาดสไลดดวย alcohol 70% 2. หยดน าบนสไลด 1 หยด 3. เขยเชอลงไป smear ใหเชอกระจาย โดยไมตอง air dry และ fixation 4. หยดส India ink หรอส nigrosin ลงบน smear เลกนอยลงบนรอย smear ปดทบดวย cover glass อยาใหเกดฟองอากาศ 5. น าไปดดวยกลองจลทรรศนก าลงขยาย 100x บนทกผลในตารางท 5.6 การอานผล จะเหน capsule เปนวงใสรอบ ๆ เซลล (ภาพท 18)

ภาพท 18 โครงสราง Capsule

55

รายงานผลบทปฏบตการท 5 เรอง สณฐานวทยาของเเบคทเรย

ชอ........................................................................นามสกล.....................................................................รหสนกศกษา………………………………….................สาขา.......................................................................... วนทท าการทดลอง……………….…..………………………………………………………..................................………. สมาชกในกลมทดลอง 1.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ 2.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ 3.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ ตารางท 5.1 ผลการยอมสแบบ simple stain (อธบายรายละเอยดพรอมวาดรป)

แบคทเรย รปราง การเรยงตว ลกษณะพเศษ B. subtilis

E. coli

S. aureus

56

ตารางท 5.2 ผลการยอมสแบบ Gram staining (อธบายรายละเอยดพรอมวาดรป) แบคทเรย รปราง การเรยงตว ตดสแกรม ลกษณะพเศษ

B. subtilis

E. coli

S. aureus

ตารางท 5.3 ผลการศกษาการเคลอนทของแบคทเรย

แบคทเรย เคลอนทได/เคลอนทไมได (วาดรป) S. typhi

S. aureus

ตารางท 5.4 ผลการยอมสเอนโดสปอร (endospore staining)

แบคทเรย ม/ไมม endospore (วาดรป) B. subtilis

S. aureus

57

ตารางท 5.5 ผลการยอมสทนกรด (acid fast staining)

แบคทเรย ลกษณะ (วาดรป) M. tuberculosis

ตารางท 5.6 ผลการยอมแคปซล (capsule staining)

แบคทเรย ม/ไมม capsule (วาดรป) B. subtilis

E. coli

ค าถาม 1. โครงสรางของแบคทเรยทแยกแบคทเรยแกรมบวกออกจากแกรมลบคอโครงสรางใด .................................................................................. ....................................................................... ..... ............................................................................................................................. ................................. 2. Endospore, Capsule และ Flagella มหนาทอะไร ............................................................................................................................. ................................. ...................................................................... .................................................................................... .... ............................................................................................................................. ................................. สรปผลการทดลอง ............................................................................................................................. ................................. ......................................................................................... ................................................................. .... ............................................................................................................................. .................................

58

บทปฏบตการท 6 เรอง การวดการเจรญเตบโตของแบคทเรย


6.1 สามารถวดการเตบโตของแบคทเรย 6.2 สามารถเขยนกราฟการเตบโตของแบคทเรยและหาคา generation time

6.3 สามารถท าการนบจ านวนแบคทเรย

การวดการเตบโตของแบคทเรย การวดหาการเตบโตของประชากรแบคทเรย ท าไดโดยเลยงเซลลแบคทเรยในอาหารเหลวทผานการฆาเชอแลวบมไวภายใตสภาวะแวดลอมทเหมาะสมตอการเจรญเตบโต และตองค านงถงวาแบคทเรยนนตองการออกซเจนหรอไมตองการดวย เซลลแบคทเรยจะแบงตวอยางรวดเรว เมอเขยนกราฟระหวางจ านวนเซลลทเพมขนกบเวลาทใชในการบม เรยกวา กราฟการเตบโตของแบคทเรย (Bacterial Growth Curve) จากกราฟเราสามารถหาคา generation time หรอระยะเวลาทแบคทเรยใชในการเพมจ านวนเปน 2 เทาได การสรางกราฟการเตบโตของแบคทเรยใหสมบรณตองใชเวลาประมาณ 24 ชวโมง โดยเลยงแบคทเรยในอาหารเหลวแลวน าเขาเครองเขยา จากนนวดจ านวนประชากรในแตละชวงเวลา แตวธดงกลาวเสยเวลามาก ในหองปฏบตการจงศกษาเฉพาะในระยะ lag phase กบ log phase เทานน สวนวธการนบจ านวนประชากรแบคทเรยอาจนบจ านวนเซลลทางออม (indirect method) เชน วดความขนของเซลล การทดลองท 1 วดการเตบโตของแบคทเรยโดยวธวดความขน วสดและอปกรณ

1. Escherichia coli เลยงใน Tryptic Soy Broth (TSB) จ านวน 20 มลลลตร ในฟลาสก ขนาด 250 มลลลตร 1 ฟลาสก

2. TSB 50 มลลลตร 1 ฟลาสก 3. sterile pipette ขนาด 15 มลลลตร 7 อน 4. sterile erlenmeyer flask ขนาด 250 มลลลตร 1 ใบ 5. spectrophotometer และ cuvette

6. shaker ตงความเรว 200 รอบตอนาท 7. กระดาษ semi-log

59

การเตรยม E. coli 1. ดดเชอ E. coli ทเพาะเลยง 1 คน จ านวน 0.5 มลลลตร ลงไปใน 50 มลลลตร TSB ทบรรจอยในฟลาสกขนาด 250 มลลลตร 2. เขยาท 35 องศาเซลเซยส 24 ชวโมง

3. ถายเชอ E. coli 0.5 มลลลตร ลงใน 50 มลลลตร TSB ทบรรจอยในฟลาสก ขนาด 250 มลลลตร กอนชวโมงปฏบตการ 60 นาท วธการทดลอง 1. ดดเชอ E. coli 3 มลลลตร โดยวธปราศจากเชอน าไปวด O.D. ท 580 nm โดยใช TSB เปน blank บนทกผลลงในตารางท 5.1 เปนเวลา 0 นาท

2. incubate ฟลาสกท 35 องศาเซลเซยส ใน incubator shaker โดยเขยาดวยความเรว 200 รอบตอนาท 3. ดดเชอ E. coli 3 มลลลตร จากฟลาสก เพอวด O.D. ท 580 nm ในชวงเวลาตอไปน 30, 60, 90, 120 และ 150 นาท โดยปฏบตเชนเดยวกบขอ 1 4. บนทกผลการทดลองในตารางท 6.1 แลว plot คา O.D. กบระยะเวลาทไดท าการทดลองบนกระดาษ semi-log และหาคา generation time จากกราฟในภาพท 19 ขอควรระวง คอ เมอน าเชอ E. coli ออกจาก incubator เพอท าการทดลองแตละชวงทก าหนด เมอทดลองแลวใหรบน าฟลาสกทมเชอกลบเขา incubator shaker ทนท การหาคา generation time แบบ indirection method generation time (G) = t(OD 0.4) – t(OD 0.2) = 90 - 60 = 30 นาท

การหาคา generation time แบบ direct method ใชสตรดงน n = t log 2/log b - log B g = generation time B = จ านวนแบคทเรยเมอเรมตนการทดลอง b = จ านวนแบคทเรยเมอเวลาผานไป t นาท t = เวลาทใชในการทดลองเมอจ านวนแบคทเรยเปลยนจาก Bเปน b

60

0 30 60 90 120 150 Time (minutes)

ภาพท 19 แสดงกราฟการเจรญเตบโตของแบคทเรย

การทดลองท 2 การวดการเตบโตของแบคทเรยโดยวธนบจ านวนเซลลโดยตรง (direct method) จากกราฟในภาพท 19 จะเหนวาเราอาจวดการเตบโตของแบคทเรยไดอกวธ คอ การนบจ านวนเซลลโดยตรง โดยการเลยงแบคทเรยเชนเดยวกบการทดลองท 1 แลวนบจ านวนเชอในแตละชวงทผานไป การทดลองนจะเปนการฝกการนบจ านวนแบคทเรยโดยวธ pour plate และ spread plate ในทนใหนกศกษานบจ านวนแบคทเรยในชวงตน log phase (เมอเลยงเชอผานไป 30 นาท) และในชวงปลาย log phase (เมอเลยงเชอผานไป 120 นาท) เทานน เพอนกศกษาจะใชค านวณคา generation time ตามแบบ direct method ได 2.1 Pour plate วสดและอปกรณ

1. E. coli ทเลยงเชนเดยวกบการทดลองท 1 เมอเวลาผานไป 30 นาท 5 มลลลตร 2. Sterile pipette ขนาด 1 มลลลตร 9 อน

3. Sterile normal saline (0.85% NaCl) 9 มลลลตร 4 หลอด 4. Melted nutrient agar หลอดละ 20 มลลลตร 6 หลอด 5. Water bath ตงอณหภมท 50 องศาเซลเซยส 1 เครอง

0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0

Optic

al de

nsity

at 5

80 n

m

61

วธการทดลอง (การเตรยม serial dilution) 1. ท า serial dilution ของเชอ E. coli เมอเลยงไว 30 นาท โดยท า dilution ใหได 10-2 10-3 10-4 โดยใช normal saline เปน diluent การท า serial dilution ท าดงน 1.1 เรยงหลอด sterile normal saline ลงใน rack และ label 1 ถง 4 1.2 ใช sterile pipette ขนาด 1 มลลลตร ดดเชอ E. coli ขนมาเปน 1 มลลลตร ใสลงใน tube ท 1 ดดขนลง 2-3 ครง เพอใหเชอผสมกบน าเกลอ และดดสารละลายออกจากหลอดท 1 ปรมาตร 1 มลลลตร ใสในหลอดท 2 1.3 ใช sterile pipette อนใหม ขนาด 1 มลลลตร ดดขนลง 2-3 ครง และดดสารละลายจากหลอดท 2 ปรมาตร 1 มลลลตร ใสในหลอดทดลองท 3 1.4 ท าเชนเดยวกนในหลอดท 4 จะได serial dilution ทมความเขมขน 10-1 10-2 10-3 และ 10-4 ตามล าดบ 2. เขยนชอกลม ระดบความเขมขน 10-2 10-3 และ 10-4 ทฝาดานลางของ sterile petri dish ระดบความเขมขนละ 2 จาน (duplicate) 3. ใช sterile pipette ขนาด 1 มลลลตร ดดสารละลายในขอ 1.4 ทระดบความเขมขน 10-2 10-3 และ 10-4 ตามล าดบ ใสใน sterile petri dish จานละ 1 มลลลตร และระดบความเขมขนละ 2 จาน โดยดดจากความเขมขนต ามายงความเขมขนสง เพอประหยด pipette 4. เท melted agar (ซงบรรจอยในขวด และแชใน water bath อณหภม 50 องศาเซลเซยส) ลงใน petri dish ทมเชอ (จากขอ 3.) หมน petri dish ไปมาแลวปลอยใหอาหารแขง น าไป incubate ในต incubator ทอณหภม 35 องศาเซลเซยส 18 - 24 ชวโมง 5. บนทกผลลงในตารางท 6.2 2.2 Spread plate วสดและอปกรณ

1. E. coli ทเลยงเชนเดยวกบการทดลองท 1 เมอเวลาผานไป 120 นาท 5 มลลลตร 2. Sterile pipette ขนาด 1 มลลลตร 10 อน

3. Sterile normal saline (0.85% NaCl) 9 มลลลตร 8 หลอด 4. Nutrient agar 6 plate 5. Spreader (แทงแกวสามเหลยม) 1 อน 6. Beaker บรรจ 95% แอลกอฮอล 50 มลลลตร 1 ใบ

62

วธการทดลอง 1. เจอจาง E. coli ดวย sterile normal saline จนไดระดบความเจอจางถง 10-8 ตามวธการเชนเดยวกบการทดลองท 2.1 2. เขยนชอกลม ระดบความเขมขน 10-6, 10-7 และ 10-8 ทฝาดานลางของ nutrient agar ทก plate 3. ใช sterile pipette ขนาด 1 มลลลตร ดด serial dilution ของ E. coli มลลลตร ทระดบความเขมขน 10-6, 10-7 และ 10-8 โดยใช sterile pipette 1 อน 4. จม spreader ลงใน beaker ซงมแอลกอฮอลบรรจอย ยกขนมารอใหแอลกอฮอลไหลลงลงไปใน beaker จนเกอบหมด แลวเผาไฟ รอจนเยนใช spreader กวาดไปบน nutrient agar ทม solution ของ E. coli อย โดยกวาดใหทวผววน น าไปบมในต incubator ท 35 องศาเซลเซยส 18-24 ชวโมง 5. บนทกผลลงในตารางท 6.2

63

รายงานผลบทปฏบตการท 6 เรอง การวดการเจรญเตบโตของแบคทเรย

ชอ........................................................................นามสกล.....................................................................รหสนกศกษา………………………………….................สาขา.......................................................................... วนทท าการทดลอง……………….…..………………………………………………………..................................………. สมาชกในกลมทดลอง 1.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ 2.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ 3.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ ตารางท 6.1 คาความขนของ E. coli ท O.D. 580 nm

เวลา (นาท) O.D. 580 nm 0 30 60 90 120 150

ตารางท 6.2 การนบจ านวนจลนทรยโดยวธ pour plate และ spread plate

วธการ จ านวนจลนทรย (CFU) ทระดบความเขมขน จ านวนจลนทรยทงหมด

(CFU/มล.)

1. Pour plate 10-2 10-3 10-4

2. Spread plate

10-6 1 0-7 10-8

สรปผลการทดลอง ............................................................................................................................ .................................. ............................................................................................................................. .................................

64

บทปฏบตการท 7 เรอง การทดสอบทางชวเคม


7.1 สามารถถายเชอแบคทเรยเพอทดสอบสมบตทางชวเคม 7.2 สามารถอานและแปลผลปฏกรยาชวเคมททดสอบ

การทดสอบทางชวเคม เนองจากแบคทเรยมอยทวไปในสงแวดลอม ในคน และในสตวเปนจ านวนมาก ดงนน จงไดมการทดสอบเพอจ าแนกชนดของแบคทเรย โดยการน าเชอแบคทเรยทเปนเชอบรสทธ (pure culture) น ามาท าการจ าแนก ขนตอนแรกในการทดสอบเพอจ าแนกชนดของแบคทเรย คอ การยอมสแกรม ซงจะท าใหทราบลกษณะรปรางและชนดของแกรม จากนนจงน ามาท าการทดสอบทางชวเคม ซงจะดลกษณะการใชอาหารหรอ substrate ไดแก น าตาล ผลผลตจากการเกดเมตาบอลซมตางๆ เชน indole methyl red และการหมกยอยน าตาล เปนตน ส าหรบแบคทเรยแตละกลมกจะมการทดสอบทแตกตางกน การทดลองท 1 Catalase test เปนการทดสอบเพอจ าแนกแบคทเรยทสามารถผลตเอนไซม catalase ซงโดยปกตในขบวนการหายใจแบบใชออกซเจน อะตอมของไฮโดรเจน (H) จะรวมตวกบออกซเจน (O2) ท าใหเกดไฮโดรเจนเปอรออกไซด (H2O2) ซงเปนอนตรายตอเซลล แตแบคทเรยสวนใหญสามารถผลตเอนไซม catalase เพอยอยสลายไฮโดรเจนเปอรออกไซดใหกาซออกซเจนและน าได ดงสมการ และนอกจากนปฏกรยานยงมประโยชนในการจ าแนกแบคทเรยสกล Staphylococcus spp. ออกจากสกล Streptococcus spp. อกดวย

2H2O2 2H2O + O2 วสดและอปกรณ

1. 3% H2O2 (3% Hydrogenperoxide) 2. เชอ Bacillus subtilis และ Staphylococcus aureus

Catalase

65

วธการทดลอง 1. วงกลมใตแผนสไลดดวยดนสอเขยนแกว 2 วง ขนาดเสนผาศนยกลาง 2 เซนตเมตร 2. หยด 3% H2O2 1 หยด ลงบนสไลดแตละวงแลวเขยทตองการทดสอบ 1 loop ลงใน

3% H2O2

อานผล (บนทกผลลงในตารางท 7.1) มฟองอากาศเกดขน (O2) catalase + ไมมฟองอากาศ catalase -

การทดลองท 2 Oxidase test แบคทเรยกลมแอโรบ (aerobic bacteria) มขบวนการ oxydative phosphorylation ส าหรบขบวนการหายใจและสรางพลงงาน ในระหวางทมขบวนการดงกลาวเกดขนจะมการถายเทอเลคตรอนใหแก ออกซเจน (O2) ผานลกโซอเลคตรอน โดยอาศยการท างานของไซโตโครม (cytochrome) ตางๆ ซงกคอ ลกโซของเอนไซด นนเอง ผลทไดท าใหเกดน า (H2O) cytochrome ประกอบบดวย heme ซงมธาตเหลก ท าใหอยสภาพรดกชน - ออกซเดชน ดงสมการ cytochrome 2 reduced cytocrome C + 2H + ½ O2 2Oxidized cytochrome C + H2O Oxidation

ส าหรบในการทดลองนจะท าการทดสอบ Oxidase ดวยวธ Kovac โดยใช Tetramethyl-p-phenylene-diaminehydrochloride ซงจะถกออกซไดสโดย cytochrome C ไดสารสน าเงนมวง (Wurster’s blue) ดงสมการ cytochrome C Tetramethyl-p-phenylene-diaminehydrochloride Wurster’s blue วสดและอปกรณ

1. เชอ Bacillus subtilis และ Escherichia coli 2. 1% teramenthyl-p-phenylene-diaminehydrochloride 3. cotton swab

66

วธการทดลอง 1. หยด 1% teramenthyl p-phenylene-diaminehydrochloride 1 หยดลงบน

กระดาษกรอง 2. ปายเชอ Bacillus subtilis และ Escherichia coli ทตองการทดสอบลงไป โดยใช

Cotton swab ขอควรระวง

การทดสอบน หามใช Loop ทท าดวยนโครม แตะเชอเพอทดสอบ เพราะอาจใหเกดผลบวกเทยม เนองจากขบวนการ Oxidase ระหวางสาร 1% teramenthyl-p-phenylene-diaminehydrochloride กบ loop การอานผล (บนทกผลลงในตารางท 7.2)

รอยทปายเชอเปลยนเปนส Wurster’s blue ภายใน 10 วนาท oxidase + รอยทปายเชอไมเปลยนส oxidase -

การทดลองท 3 การทดสอบทางวชาชวเคมอนๆ (บนทกผลลงในตารางท 7.3) วสดและอปกรณ

1. เชอแบคทเรย Bacillus subtilis 1 หลอด Staphylococcus aureus 1 หลอด Escherichia coli 1 หลอด Vibrio parahaemolyticus 1 หลอด

2. อาหารเลยงเชอเพอการจ าแนกชนดของแบคทเรย MacConkey agar (MCA) 4 plate Triple Sugar Iron agar (TSI) 4 หลอด Indole test medium 4 หลอด Methyl red test medium (MR-VP medium 4 หลอด Veges Proaskauer test medium (MR-VP medium) 4 หลอด Simmon’s citrate agar 4 หลอด Motility medium 4 หลอด Glucose fermentation medium 4 หลอด Lactose fermentation medium 4 หลอด Sucrose fermentation medium 4 หลอด

67

วธการทดลอง 2.1 MacConkey agar (MCA) ในการจ าแนกชนดของแบคทเรย โดยเฉพาะพวกทอยใน family Enterobacteriaceae

นยมเลยงบน MCA agar ซงอาหารนมสวนประกอบ คอ โปรตน เกลอน าด โซเดยมคลอไรด น าตาลแลกโตส วน และส 2 ชนด อาหารเลยงเชอชนดนจะใชส cryasl violet และเกลอน าดในการยบยงการเจรญของแบคทเรยแกรมบวก ท าใหแบคทเรยแกรมลบเจรญไดด และสามารถจ าแนกคณสมบตการหมกยอยน าตาลแลกโตส โดยแบคทเรยทสามารถหมกยอยน าตาลแลกโตสได เมอเจรญบนอาหาร MCA จะใหโคโลนสแดงหรอสชมพ ส าหรบแบคทเรยทไมสามารถหมกยอยน าตาลแลกโตส เมอเจรญบนอาหาร MCA แลวโคโลนจะไมมสและใส วธการทดลอง

1. น าเชอแบคทเรยทตองการทดสอบมา streak แบบ 16 ขด ลงบนอาหาร MCA การอานผล

ผลบวก : โคโลนมสแดงหรอชมพ แสดงวาเปนแบคทเรยทสามารถหมกยอยน าตาล แลกโตส ผลลบ : โคโลนใส (ไมมส) แสดงวาเปนแบคทเรยทไมสามารถหมกยอยน าตาลแลกโตส

2.2 Triple Sugar Iron agar (TSI) เปนอาหารเลยงเชอชนด differential medium ซงสามารถทดสอบความแตกตางของ

แบคทเรยในการ ferment carbohydrate แลวใหกรดหรอใหกรดและแกส (CO2 + H2) และความสามารถแบคทเรยในการสรางกาซไฮโดรเจนซลไฟด (H2S)

อาหารเลยงเชอ TSI จะเตรยมเปนอาหารแขงและเอยงในหลอดทดลอง (agar slant) โดยอาหารเลยงเชอ มสวนประกอบ คอ carbohydrate 3 ชนด คอ lactose 1% sucrose 1% และ glucose 0.1% แบคทเรยแตละชนดมสมบตในการ ferment carbohydrate ไดตางกน เชน บางชนด ferment ทง lactose และ glucose หรอบางชนดไม ferment เลย ผลทไดจากการ ferment carbohydrate จะไดกรดแตอาจมกาซ (CO2 + H2) หรอไมมกาซกได

Fermentation ทเกดบรเวณ slant จะเปนแบบ aerobic สวนทกนหลอด (butt) จะเปนแบบ anaerobic บน slant น าตาล glucose ซงเปน monosaccharide จะถก metabolize ผาน Emden-Meyerhof pathway ได pyruvic acid และจะถกยอยตอไปโดย

68

ผาน Kreb’s cycle ได CO2 , H2O และพลงงาน สวน lactose และ sucrose ซงเปน disaccharide จะถกยอยโดย specific enzyme ไดเปน monosaccharide ดงน

-galactosidase Lactose glucose + galactose

Invertase Sucrose glucose + fructose

ในสวนของ slant ซงมสภาพเปน aerobic เขยนสมการของปฏกรยาทเกดขนไดดงน Kreb’s cycle Glucose หรอ Galactose หรอ Fructose CO2 + H2O + energy Aerobic ในสวนของกนหลอดซงมสภาพเปน anaerobic นน glucose จะถก metabolize ผาน Embden-Meyerhof pathway ใหได ATP และ pyruvic acid ซงเปลยนไปเปน end products อกหลายตว ไดแก lactic acid และ organic acid อนๆ aldehyde , alcohol , CO2 , H2 , พลงงาน ในสวนกนหลอดสามารถแสดงเปนปฏกรยาไดดงน

Embden – Meyerhof pathway lactic acid Glucose organic acids

Anaerobic aldehyde, alcohol CO2 + H2 + energy

แบคทเรยบางกลมโดยเฉพาะพวก gram negative nonenteric bacillus จดเปนพวก non-fermenter คอ ไม ferment ทง glucose , lactose และ sucrose แตพวกนเจรญบน TSI ไดโดยใช peptone ซงอาจเปนแบบสภาพ aerobic หรอ anaaerobic จะใหผลบน TSI เปน 2 แบบ คอพวกทสามารถยอย peptone ไดทงบน slant และท butt สวนพวกทใช peptone แบบ aerobic ไดอยางเดยวจะท าใหเกด alkaline เฉพาะสวน slant เทานน สวน butt จะไมสามารถเปลยนแปลง (Alkaline/No change)

69

Peptone ammonia (NH2)

anaerobically

Change phenol red indicator into red

ในการ ferment glucose และ lactose หรอ sucrose product ทเกดขนนอกจากกรดแลว แบคทเรยบางชนดยงใหกาซดวย กาซทใหคอ CO2 และ H2 กลมท ferment carbohydrate แลวใหกาซดวย เรยกวา พวก anaerogenic ซงการเกดกาซใหดผลไดจากรอยแตกของ medium ฟองอากาศทแทรกอยระหวางหลอดกบ medium หรอบางครงกาซเกดมากจนดน medium ใหหลดจากกนหลอด นอกจากน TSI ยงสามารถใชทดสอบวาเชอแบคทเรยนนสามารถสราง H2S (gas) ไดหรอไมซง indicator ทใชเปนตวบอกการเกด H2S คอ เกลอแกง ferric ammonium citrate และ sodium thiosulfate indicator ทง 2 ชนด จะตองมอยใน medium

Bacterium + sodium thiosufate H2S (gas) (acid environment)

H2S + ferric ferrous sulfide (Insoluble

black precipitate) บางครง H2S สรางขนมาปรมาณมากจนบดบงสภาพเปนกรดทกนหลอดท าใหมองไมเหนสเหลองทกนหลอด แตขอใหค านงถงไวเสมอวาจะถกสรางในสภาวะทเปนกรดเทานน แมจะมองไมเหนสเหลองทกนหลอดกตองรายงานวา acid butt วธการทดลอง

1. ใช needle แตะเชอ แลวท าการโดยการ stab ใหลกถงกนหลอด แลวท าการ streak ตอบนผว slant

2. incubate ทอณหภม 35 องศาเซลเซยส เปนเวลา 18 - 24 ชวโมง

70

การแปลผล สงเกตการเปลยนแปลงทบรเวณ slant และบรเวณกนหลอด (butt)

: หากเกดสเหลอง แสดงวาเกดกรด (acid) : หากเกดสแดง แสดงวาเปนดาง (alkaline) : การมฟองอากาศในเนอวน แสดงวาเกดกาซ CO2 , H2 : หากมสด า แสดงวาเกด H2S

การบนทกผลจากการทดสอบ Triple Sugar Iron agar (TSI) Acid = A Alkaline = K หรอ Alk Gas หมายถง CO2 และ H2 = G หรอ Gas No change = NC

เชน 1. Acid slant acid butt

= Acid / Acid = A / A

2. Alkaline slant acid butt with gas = Alkaline / Acid Gas = K / A.G = Alk / A.G = K / A gas

3. Alkaline slant acid butt with gas and H2S = AlK /A.G H2S = K / A.G H2S = AlK / A ,Gas , H2S

4. Alkaline slant no change butt = AlK / NC

3.3 IMVIC test เปนการทดสอบทางชวเคม 4 ชนด คอ I = Indole test M = Methyl red test (MR test) V = Voges – Proskauer test (VP test) C = Citrate test

71

3.3.1 Indole test เปนการทดสอบความสามารถของแบคทเรยในการผลต Indole จากกรดอะมโน tryptophane ซงอยในอาหารเลยงเชอพวก peptone broth, casein และ tryptone วธการทดลอง

1. ใช loop แตะเชอทตองการทดสอบ inoculating ลงไปใน 1% peptone broth หรอ indole medium

2. บมทอณหภม 35 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 – 28 ชวโมง 3. น ามาหยดสาร Kovac’s reagent 5 หยด 4. เขยาหลอดทดลองเบาๆ 2 – 3 ครง 5. สงเกตการเปลยนสทผวของ medium

การแปลผล ผลบวก : มสแดงทผวของ medium (red ring) ผลลบ : สเหมอน Kovac’s reagent คอ สเหลอง 3.3.2 Methyl Red test (MR)

เปนการทดสอบวาแบคทเรยสามารถสรางกรดจากอาหารเลยงเชอทม glucose ไดมากหรอนอย โดยตรวจด pH ของอาหารนน เชอทสรางกรดไดมากจะท าให pH ของอาหารเลยงเชอต ากวา 4.2 ซงเปลยนส indicator ของ methyl red เปนสแดงได วธการทดลอง

1. ใช loop แตะเชอทตองการทดสอบ inoculating ลงไปใน MR /VP broth 2. บมไวทอณหภม 35 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 - 48 ชวโมง 3. น ามาหยดสาร methyl red 5 หยด 4. สงเกตการเปลยนสของ medium ทนทหลงจากหยด Indicator

การแปลผล ผลบวก : medium เปลยนเปนสแดง ผลลบ : medium เปลยนเปนสเหลอง

72

3.3.3 Voges Proskauer test (VP) เปนการทดลองวาแบคทเรยสามารถสรางสาร acxetyl methyl carbinol จาก glucose ไดหรอไมในสภาวะทสารละลายนนเปนดาง สารนจะถก oxidase เปน diacethyl ซงจะท าปฏกรยากบ creatine เกดเปนสแดง วธการทดลอง

1. ใช loop แตะเชอทตองการทดสอบ inoculating ลงไปใน MR /VP broth 2. บมไวทอณหภม 35 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 - 48 ชวโมง 3. น ามาหยดสาร 5% naphthol ลงไป 6 หยด แลวเขยา 4. หยดตอดวยสาร 40% KOH ลงไป 2 หยด 5. เขยาใหเขากนด ทงไว 10 – 15 นาท 6. สงเกตการเปลยนสของ medium

การแปลผล ผลบวก : medium เปลยนเปนสแดง

ผลลบ : medium เปลยนเปนสเหลอง 3.3.4 Citrate test ใชในการจ าแนกแบคทเรยแกรมลบโดยอาศยความสามารถในการใช citrate เปนแหลงคารบอนและแหลงพลงงาน โดยแบคทเรยทสามารถใช citrate จะผลตเอนไซม citriase ยอย citrate ใหผลผลตเปน oxaloacetate และ acetate ยงมเอนไซมอกหลายชนดคอ oxaloacetate decarboxylase ซงสามารถยอย acetate ไปเปน puruvate และ CO2 จะรวมกบ Na และ H2O ไดเปน Na2CO2 และสารประกอบทมฤทธเปนดาง ท าใหอาหารเลยงเชอม pH สงขน และสของ bromthymol blue ในอาหารเลยงเชอเปลยนจากสเขยวเปนสน าเงน วธการทดลอง

1. ใช loop แตะเชอทตองการทดสอบ แลวท าการ streak บนผวหนา Simmon’s citrate agar

2. บมไวทอณหภม 35 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 – 48 ชวโมง 3. สงเกตการเปลยนแปลงสของ medium

การแปลผล ผลบวก : มแบคทเรยขนและ medium เปลยนสจากสเขยวเปนสน าเงน

ผลลบ : ไมมแบคทเรยขน และ medium และไมเปลยนส (ยงคงเปนสเขยว)

73

การทดลองท 4 Motility test เปนการทดสอบวาแบคทเรยสามารถเคลอนทไดหรอไม โดยใช semisolid medium ซงมวนหรอ agar ผสมอยเพยง 0.5% เทานน วธการทดลอง

1. ใช needle แตะเชอทตองการทดสอบ แลวท าการ stab หรอแทงลงไปตรงๆ ในเนอวนใหลกประมาณ 2 เซนตเมตร

2. บมไวทอณหภม 35 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง 3. ตรวจดผลวามรอยขนเจรญออกนอกรอย stab หรอไม

การแปลผล (บนทกผลลงในตารางท 7.4) ผลบวก : เหนแบคทเรยแพรกระจายรอบๆ รอย stab หรอ media ขน ผลลบ : แบคทเรยจะเตบโตตามรอย stab เทานน และ medium ในหลอดทดลองใส การทดลองท 5 Carbohydrate fermentation test เปนการทดสอบวาแบคทเรยสามารถ ferment Carbohydrate แตละชนดไดหรอไมโดยสงเกตการเปลยนแปลงสของ medium น าตาลทใชในการทดสอบ ไดแก glucose, lactose, sucrose สวน fermentation medium ประกอบดวย sugar – free broth base เชน phenol red broth base ผสมกบน าตาลทตองการทดสอบ ซงมความเขมขนประมาณ 1% และม indicator ส าหรบบอกความเปนกรด - ดาง แบคทเรยซงสามารถใชน าตาลชนดนนใน metabolism ของมนจะใหสาร end product เปนพวก organic acid จงท าให pH เปนกรด ซงกรดนจะเปลยนสของ indicator เชน ถาใช phenol red เปน indicator แลว media จะเปลยนจากสสมแดงเปนสเหลอง ในการทดสอบวามกาซ (CO2 และ H2) เกดขนจากการ ferment น าตาลนนๆ ดวยหรอไม ท าการทดสอบไดโดยใสหลอดทดลองขนาดเลก เรยกวาหลอดเกบกาซ (Durham tube) ลงไปในหลอดอาหารเลยงเชอดวย วธการทดลอง

1. ใช loop แตะเชอทตองการทดสอบ inoculating ลงไปใน carbohydrate fermentation medium ชนดตางๆ

2. บมไวทอณหภม 35 องศาเซลเซยส เปนเวลา 18 - 24 ชวโมง 3. สงเกตการเปลยนแปลง medium และการเกดกาซในหลอดดกแกส (Durham tube)

74

การแปลผล (บนทกผลลงในตารางท 7.5) ผลบวก : medium มสเหลองรายงานผลวา A (acid) ถาม gas ดวย รายงายวา AG (acid and gas) ผลลบ : medium เปลยนเปนสชมพแดง (Reddish-pink) Delayed : medium สออกสมๆ ควรบมตอแลวตรวจสอบผลอกครงในวนถดไป

75

รายงานผลบทปฏบตการท 7 เรอง การทดสอบทางชวเคม

ชอ........................................................................นามสกล.....................................................................รหสนกศกษา………………………………….................สาขา.......................................................................... วนทท าการทดลอง……………….…..………………………………………………………..................................………. สมาชกในกลมทดลอง 1.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ 2.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ 3.............................................................................รหสนกศกษา............................................................

ตารางท 7.1 ผลการทดสอบ Catalase Test Bacteria Catalase reaction (+/-)

Bacillus subtilis Staphylococcus aureus

ตารางท 7.2 ผลการทดสอบ Oxidase Test

Bacteria Oxidase reaction (+/-) Bacillus subtilis Escherichia coli

ตารางท 7.3 ผลการทดสอบชวเคมดานตางๆ

3.1 MacConkey agar (MCA) Bacteria MacConkey Agar

Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Escherichia coli Vibrio parahaemolyticus

76

3.2 Triple Sugar Iron agar (TSI) Bacteria Triple Sugar Iron agar


3.3.1 Indole test

Bacteria Indole test Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Escherichia coli Vibrio parahaemolyticus

3.3.2 Methyl Red test (MR)

Bacteria Methyl Red test Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Escherichia coli Vibrio parahaemolyticus

3.3.3 Voges - Proskauer test (VP)

Bacteria Voges –Proskauer test Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Escherichia coli Vibrio parahaemolyticus

77

3.3.4 Citrate test Bacteria Citrate test


ตารางท 7.4 ผลการทดสอบการเคลอนทของแบคทเรย

Bacteria Motility test Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Escherichia coli Vibrio parahaemolyticus

ตารางท 7.5 ผลการทดสอบการใชน าตาลของแบคทเรย (Carbohydrate fermentation test)

Bacteria Carbohydrate fermentation test Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Escherichia coli Vibrio parahaemolyticus

สรปผลการทดลอง ..................................................................................................................................................... ......... ......................................................................................................................... ..................................... ............................................................................................................................. ................................. ........................................................... ............................................................................................... .... ............................................................................................................................. ................................. ............................................................................................................................. ................................. .............................................................................................. ................................................................

78

บทปฏบตการท 8 เรอง ยสตและรา

จดประสงคการสอน 8.1 บอกลกษณะทส าคญของยสต และรา 8.2 บอกความแตกตางของยสต และรา

ยสตและรา ยสตและรา จดเปน eucaryotic microorganism ภายในเซลลมออรแกเนลส และมเยอหมนวเคลยส (nuclear membrane) ท าใหเหนนวเคลยสไดชดเจน ยสตสวนใหญเปนพวกเซลลเดยว สบพนธแบบไมอาศยเพศโดยการแตกหนอ (budding) ภายในเซลลเหน vacuole ชดเจน ยสตบางชนดอาจมเสนใยแบบ true mycelium ราสวนใหญมเสนใยและสรางสปอรสตาง ๆ เหนชดเจน ไมสามารถสรางอาหารเองได การทดลองท 1 ศกษาลกษณะทวไปของยสต วสดและอปกรณ

1. เชอบรสทธของยสตบนอาหาร PDA streak ใหไดโคโลนเดยว - Schizosaccharomyces 1 จาน - Saccharomyces 1 จาน - Rhodotorula 1 จาน - Candida 1 จาน

2. Needle และ Teasing needle 3. ส Lactophenol cotton blue 4. สไลดและกระจกปดสไลด

วธการทดลอง 1. ใหตรวจดลกษณะ รปราง ขนาด สของโคโลนเดยวๆ ของยสตทง 4 ชนดวามลกษณะอยางไร บนทกผลและวาดภาพลงในตารางท 8.1 2. ใช Loop ทลนไฟฆาเชอแลว รอใหเยน เขยเชอยสตแตละชนดมาท า wet mount น าไปสองดดวยกลองจลทรรศน ก าลงขยาย 40X ศกษาถงลกษณะดงตอไปน

- รปรางของเซลล - การแตกหนอ

79

- การสราง pseudomycelium - การสราง true mycelium

- การสราง ascospore การทดลองท 2 ศกษาลกษณะทวไปของรา วสดและอปกรณ

1. เชอบรสทธของราบนอาหาร PDA - Rhizopus 1 จาน - Aspergillus 1 จาน - Penicillium 1 จาน - Mucor 1 จาน

2. Needle และ Teasing needle 3. ส Lactophenol cotton blue 4. สไลดและกระจกปดสไลด


1. ใหตรวจดลกษณะของราบนจานอาหาร PDA วาเสนใยมลกษณะปยฟ หรออดกนแนน และสของสปอรเปนสอะไร (ภาพท 20) 2. ท า wet mount เชอรา โดยหยด lactophenol cotton blue ลงบนสไลด เขยเชอราจากหลอดโดย aseptic technique โดยเขยใหตดเสนใยและสปอรวางลงบนหยด lactophenol cotton blue ปดดวยกระจกปดสไลด สองดดวยกลองจลทรรศนก าลงขยาย 10x และ 40x ศกษาลกษณะตอไปน

- ลกษณะเสนใย สใสหรอเขม - ลกษณะเสนใยวาเปน septate hypha หรอ non septate hypha

- ลกษณะ spore head วาเปนอยางไร - สปอรเปนแบบ sporangiospore หรอ conidiospore 3. บนทกผลและวาดภาพลงในตารางท 8.2

80

ภาพท 20 เชอราทพบโดยทวไป (A- Alternaria, B- Aspergillus, C- Botrytis, D-

Cephalosporium, E- Cladosporium, F- Fusarium, G- Geotrichum, J- Monilia, K- Mucor)

81

รายงานผลบทปฏบตการท 8 เรอง ยสตและรา

ชอ........................................................................นามสกล.....................................................................รหสนกศกษา………………………………….................สาขา.......................................................................... วนทท าการทดลอง……………….…..………………………………………………………..................................………. สมาชกในกลมทดลอง 1.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ 2.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ 3.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ ตารางท 8.1 ลกษณะทวไปของยสต ลกษณะส าคญ Schizosaccharom

yces

Saccharomyces

Rhodotorula Candida

ลกษณะโคโลน

สของโคโลน

รปรางของเซลล

การแตกหนอ

การสราง pseudomycelium

การสราง true mycelium

การสราง ascospore

82

ตารางท 8.2 ลกษณะทวไปของรา

ลกษณะเสนใย บนอาหาร PDA

Rhizopus Aspergillus Penicillium Mucor

สเสนใย

Septate หรอ Nonseptate

สสปอรบนอาหาร PDA

ชนดของ spore

วาดภาพประกอบ

ค าถาม 1. นอกจากยสตและราเปน eucaryotic microorganism ยงมจลนทรยกลมใดอกบาง ............................................................................................................................. ................................. ............................................................................................................................. ................................. ................................................................................................. ............................................................. 2. จงบอกเหตผลวาเพราะเหตใดจงดเชอราและยสตดวยกลองจลทรรศนทก าลงขยายสงสดท 40x ..................................................................................................... ......................................................... ............................................................................................................................. ................................. ......................................................................................................................................................... ..... สรปผลการทดลอง ........................................................................................................................ ...................................... ............................................................................................................................. ................................. ......................................................................................................................................................... ..... ............................................................................................................................. .................................

83

บทปฏบตการท 9 เรอง การควบคมจลนทรย


9.1 สามารถเลอกวธการควบคมหรอท าลายจลนทรยไดอยางเหมาะสม และท าได อยางมประสทธภาพ

9.2 สามารถอธบายผลของความรอนทมผลตอแบคทเรยทม spore และไมม spore

9.3 สามารถเปรยบเทยบความสามารถในการท าลายจลนทรยของ disinfectant และ antiseptic ชนดตาง ๆ

9.4 สามารถทดสอบประสทธภาพของยาปฏชวนะดวยวธตาง ๆ และเลอกใชได อยางถกตอง

9.5 สามารถใชอปกรณทใชท าลายจลนทรยในหองปฏบตการ การควบคมจลนทรย การควบคมจลนทรยชนดตาง ๆ เปนสงจ าเปนอยางยงในการปองกนการปนเปอน ในขณะท าการทดลอง ปองกนการตดโรคจากผปวยและอปกรณตางๆ รวมทงการแพรกระจายของจลนทรยทกอโรคในสงแวดลอม การควบคมจลนทรยมรปแบบ คอ การท าลายจลนทรยทกชนดรวมทง spore เรยกวา sterilization และการท าลายเฉพาะจลนทรยทกอโรคหรออาจกอโรคทปนเปอนในสงตาง ๆ เรยกวา disinfection ความรอน รงส และสารเคมตางๆ สามารถท าลายจลนทรยไดดวยกลไกลตางๆ กน เชน ความรอนท าใหโปรตนเสยสมบตไป สารเคมบางตวขดขวางการท างานของเอนไซม เปนตน ยาปฏชวนะ (antibiotic) ชนดตางๆ มผลในการยบยงหรอท าลายจลนทรยตางกน ปจจยส าคญขนอยกบชนดของเชอ กลไกการออกฤทธ และความเขมขนของยา การใชยาปฏชวนะอยางไมถกตองกอใหเกดการดอยา ซงเปนผลเสยในการรกษา ดงนน การทดสอบความไวของจลนทรยตอยา จงเปนทางหนงทจะชวยในการเลอกใชยาอยางมประสทธภาพ การทดสอบความไวของจลนทรยตอยามหลายวธแตทนยมใชม 2 วธใหญ ๆ คอ 1. Disc method โดยใชแผนยามาตรฐาน (high potency antibiotic disc) วางบนอาหารวนทมจลนทรยทตองการทดสอบแลวน าไปบม ยาจะแพรซมออกรอบๆ แผนยา ถายาสามารถยบยงการเตบโตของจลนทรยจะเปนวงใสรอบๆ แผนยาเรยกวา clear zone หรอ inhibition zone ขนาดของเสนผาศนยกลางของ inhibition zone จะเปนสดสวนกบความเขมขนของยา

84

น าไปเปรยบเทยบกบตารางมาตรฐานกจะทราบวาจลนทรยททดสอบนนไวตอยามาก (sensitive / susceptible) ไวตอยาปานกลาง (intermediate sensitive / intermediate susceptible) หรอดอตอยา (resistance) 2. Dilution method โดยเจอจางยาในอาหารเลยงเชอ วธทนยมใชคอ tube dilution method โดยเจอจางยาในอาหารเหลว (broth) ทความเขมขนตางๆ กน แลวเตมจลนทรยทตองการทดสอบลงไป แลวน าไปบม ถายาในหลอดใดสามารถยบยงหรอท าลายจลนทรยได หลอดนนจะใส วธนสามารถอานคา MIC (minimal inhibitory concentration) คอ คาความเขมขนต าสดของยาทสามารถยบยงการเตบโตของจลนทรยได ซงเปนตวชวาจลนทรยนนไวตอยาหรอไม และถาท าการถายเชอจากหลอดทไมพบวามเชอเจรญไปเพาะเลยงตอบนอาหารวนจะสามารถหาคาความเขมขนของยาต าสดทไมพบการเจรญของเชอบนอาหารวนซง เรยกวา Minimum Bactericidal Concentration (MBC) การทดลองท 1 ผลของความรอนตอเชอแบคทเรย วสดและอปกรณ 1. เชอ Bacillus subtilis อาย 72 ชวโมง หลอดละ 3 มลลลตร 1 หลอด เชอ Escherichia coli อาย 24 ชวโมง หลอดละ 3 มลลลตร 1 หลอด 2. Sterile test tube 5 หลอด 3. Sterile pipette ขนาด 1 มลลลตร 1 กระบอก 4. Nutrient ager (NA) 2 จาน วธการทดลอง

1. แบง NA plate ออกเปน 6 สวน เขยนชอเชอแบคทเรยทดสอบและเวลา (0,2,5,10,15 และ 20 นาท) ทง 2 plate ดงภาพท 21

B. subtilis E.coli

ภาพท 21 การทดสอบความรอนตอเชอแบคทเรย

0

2

5 10

15

20

2

5

2

5 10

15

20 0

85

2. ใช loop เผาไฟปลอยใหเยน แลวแตะเชอแบคทเรย 1 loop streak ลงบน NA plate ในสวนทเขยนเวลา 0 นาท

3. ใช pipette ดดเชอแบคทเรยใสใน sterile test tube 5 หลอด หลอดละ 0.5 มลลลตรเขยนเวลาก ากบทหลอด 2, 5, 10, 15 และ 20 นาท

4. น าหลอดทมเชอทงหมดไปใสใน water bath (100 องศาเซลเซยส) จบเวลาตามทเขยนก ากบไว

5. เมอครบเวลา 2 นาท น าหลอดทเขยนก ากบ 2 นาท ออกจาก water bath ใช loop เผาไฟปลอยใหเยน แตะเชอ 1 loop streak ลงบน NA plate ในชอง 2 นาท เมอครบเวลา 5 นาท น าหลอดทเขยน 5 นาท ไปท าเชนเดยวกน ท าเชนนจนครบทกหลอด ทง 2 เชอ 6. คว า NA plate แลวน าไป incubate ทอณหภม 35 องศาเซลเซยส บมเปนเวลา 18-24 ชวโมง บนทกผลลงในตารางท 9.1 การอานผล

ดจ านวนเชอแบคทเรยทง 2 ชนด ทเจรญแตละเวลาทโดนความรอน เปรยบเทยบกนแลวบนทกผลในตารางท 9.1 +++ แบคทเรยเจรญมาก ++ มแบคทเรยเจรญปานกลาง + มแบคทเรยเจรญนอย

- ไมมแบคทเรยเจรญเลย การทดลองท 2 ผลของแสง Ultraviolet (UV) ตอเชอแบคทเรย วสดและอปกรณ 1. เชอ B. sublilis และ E. coli อยางละ 1 หลอด 2. Nutrient agar (NA plate) 2 จาน 3. Sterile cotton swab 1 อน

4. ต UV วางอยดานหนาหองปฏบตการ วธการทดลอง

1. แบงครง NA plate และเขยนก ากบทกน NA plate ทง 2 plate ดงภาพท 22 2. ใช sterile cotton swab จมเชอ B. subtilis แลวน าไป spread ใหทวผวหนา NA

plate ของเชอ B. subtilis และท าเชนเดยวกนกบ E. coli

86

3. น า NA plate ทง 2 เชอ ในขอ 2 ไปวางใตแสง UV โดยเปดฝา plate ครงหนงใหแบคทเรยถกแสงUV นาน 2 และ 10 นาท ตามทเขยนก ากบไว

4. เมอครบเวลา ท าการปดฝา plate แลวคว า plate น าเขา incubator 35๐ซ บมเปนเวลา 18-24 ชวโมง B. subtilis E.coli

ภาพท 22 การทดสอบแสง Ultraviolet (UV) ตอเชอแบคทเรย การอานผล ดจ านวนเชอแบคทเรยทง 2 ชนด ทเจรญทงสองดานของจานอาหารเลยงเชอ เปรยบเทยบกนแลวบนทกผลในตารางท 9.2 +++ มแบคทเรยเจรญมาก ++ มแบคทเรยเจรญปานกลาง + มแบคทเรยเจรญนอย - ไมมแบคทเรยเจรญเลย การทดลองท 3 ผลของสารเคมตอเชอแบคทเรย วสดและอปกรณ 1. เชอ Bacillus subtilis 1 หลอด Staphylococcus aureus 1 หลอด Escherichia coli 1 หลอด Enterobacter aerugenes 1 หลอด 2. Nutrient agar (NA) 1 จาน 3. Sterile paper strip 2 แผน 4. สารเคม กลม antiseptics

- ยาแดง (mercurochrome) - ยาเหลอง (acrifavin)

ปด UV 2 นาท นนนนาท

ปด UV 10 นาท

87

5. สารเคมกลม disinfectants - 5% Lysol

6. Forceps 7. Beaker ใส 95% แอลกอฮอล

8. ตะเกยงแอลกอฮอล

วธการทดลอง 1. เขยนชอเชอแบคทเรย และชอน ายาฆาเชอก ากบทกน plate ดงภาพท 23 2. ใช loop ทเผาไฟแลว จมเชอแบคทเรย streak ตามเสนทขดเสนไว 3. ใช forcep จม 95% แอลกอฮอล ลนไฟปลอยใหเยน แลวคบ paper strip จม

น ายาฆาเชอใหเปยกทงแผนคอยๆ ลากใหแผน paper strip แตะขอบ plate ทใสน ายาฆาเชอ เพอไมใหเปยกมากเกนไป 4. น า paper strip มาวางตงฉากกบรอย streak ดงรป แลวใช forcep แตะ paper strip ใหตดกบวน

5. คว า plate แลวน าเขา incubator 35๐ ซ บมเปนเวลา 18-24 ชวโมง

B.subtilis paper strip

ชบน ายาฆาเชอ S. aureus

E. coli Ent. aerugenosa

ภาพท 23 การทดสอบสารเคมตอเชอแบคทเรย

การอานผล : น ายาฆาเชอจะแพรซมออกไปรอบแผน paper strip ถาน ายาฆาเชอสามารถยบยงการเตบโตของแบคทเรยได จะเกด clear zone บรเวณรอยตอระหวาง paper strip และรอย streak

: วดความกวางของ clear zone บนทกผลลงในตารางท 9.3

88

การทดลองท 4 ผลของยาปฏชวนะ (antibiotic) ตอเชอแบคทเรย วสดและอปกรณ

1. เชอ Bacillus subtilis 1 หลอด Staphylococcus aureus 1 หลอด Escherichia coli 1 หลอด Enterobacter aerugenes 1 หลอด 2. Nutrient agar (NA) 2 จาน

3. ไมพนส าลปราศจากเชอ (cotton swab) 4. แผนยามาตรฐาน (Antibiotic Disc) - Tetracycline (TE) - Penicillin G (P) - Ampicillin (AM) - Gentamicin (GM) - Streptomycin (S) - Chloramphenicol (C) 5. Forceps

6. Beaker ใส 95% แอลกอฮอล 7. ตะเกยงแอลกอฮอล


1. เขยนชอเชอแบคทเรย และชอยาปฏชวนะ ก ากบทกน plate 2. ใชไมพนส าลจมเชอทตองการทดสอบปายใหทวผวหนาอาหารเลยงเชอ Nutrient Agar 3. น าแผนยา (antibiotic disc) ไปวางบนผวหนาของอาหารและกดเบาๆ โดยใช forcep

ทปราศจากเชอ โดยวางแผนยาใหหางกนประมาณ 3 เซนตเมตร และหางจากขอบจานอาหารประมาณ 1.5 เซนตเมตร (ภาพท 24 และ 25)

4. คว า plate แลวน าเขา incubator 35 องศาเซลเซยส บมเปนเวลา 18-24 ชวโมง 5. การศกษาใหสงเกตด clear zone หรอ inhibition zone ทเกดขน และวด

เสนผาศนยกลาง บนทกผลลงในตารางท 9.4

89

(TE) (GM)

(P) (S) (AM) (C)

ภาพท 24 การทดสอบยาปฏชวนะ (antibiotic) ตอเชอแบคทเรย

ภาพท 25 การวางแผน antibiotic disc บนผวหนาอาหารเลยงเชอ (ก) ลกษณะ antibiotic disc ท

วางบนผวหนาอาหารเลยงเชอ (ข) การวดเสนผานศนยกลางของ clear zone (ค)

90

รายงานผลบทปฏบตการท 9 เรอง การควบคมจลนทรย

ชอ........................................................................นามสกล.....................................................................รหสนกศกษา………………………………….................สาขา.......................................................................... วนทท าการทดลอง……………….…..………………………………………………………..................................………. สมาชกในกลมทดลอง 1.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ 2.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ 3.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ ตารางท 9.1 ผลของความรอนตอเชอแบคทเรย

แบคทเรย ระยะเวลาทแบคทเรยถกความรอน (นาท)

0 2 5 10 15 20 B. sublilis E. coli

ตารางท 9.2 ผลของแสง Ultraviolet (UV) ตอเชอแบคทเรย

แบคทเรย เปดนาน 2 นาท เปดนาน 10 นาท

ไมถก UV (ปด) ถก UV ไมถก UV (ปด) ถก UV B. sublilis E. coli

91

ตารางท 9.3 ผลของสารเคมตอเชอแบคทเรย

แบคทเรย ความกวางของ clear zone (mm.)

ยาแดง ยาเหลอง 5% lysol B. sublilis S. aureus E. coli Ent. aerugenosa

ตารางท 9.4 ผลของยาปฏชวนะ (antibiotic) ตอเชอแบคทเรย

แบคทเรย ความกวางของ clear zone (mm.)

TE P AM GM S C B. sublilis S. aureus E. coli Ent. aerugenosa

ค าถาม 1. การควบคมจลนทรยเพอจดประสงคใด .................................................................................................................. ........................................ ............................................................................................................................. ............................. 2. Sterilization แตกตางจาก disinfection อยางไร ...................................................................................................................................... .................... .............................................................................................................. ............................................ สรปผลการทดลอง ............................................................................................................................. ............................. ..........................................................................................................................................................

92

บทปฏบตการท 10 เรอง จลนทรยในดน

จดประสงคการสอน 10.1 สามารถอธบายกระบวนการหมนเวยนของธาตไนโตรเจน 10.2 สามารถตรวจแอมโมเนย ไนไตรท และไนเตรต 10.3 สามารถแยก Rhizobium จากปมรากถว 10.4 สามารถตรวจนบจลนทรยในดนและอากาศ จลนทรยในดน ดนเปนแหลงของจลทรยหลายชนด ปรมาณจลนทรยในดนจะแตกตางกนไปขนอยกบองคประกอบหลายประการ เชน อณหภม ความชนของดน การหมนเวยนของอากาศในดน ตลอดจนสารอนทรยทอยในดน เปนตน ถาสภาพของดนเปลยนแปลงไปแมเพยงเลกนอยกจะมผลท าใหชนดและปรมาณของจลนทรยในดนเปลยนแปลงไปดวย จลนทรยเปนตวการส าคญในการหมนเวยนเปลยนแปลงของสารประกอบในดน ไดแก ไนโตรเจน คารบอน ซลเฟอร และฟอสฟอรส การหมนเวยนเปลยนแปลงของสารเหลานท าใหธาตและสารประกอบในธรรมชาตเกดภาวะสมดล และมผลอยางมากตอความอดมสมบรณของดน จลนทรยในดนจงมบทบาทส าคญตอการควบคมสภาพแวดลอม นอกจากนจลนทรยในดนบางชนด คอ พวก Actinomyces ยงผลตสารปฏชวนะซงน ามาใชเปนยารกษาโรค การทดลองท 1 Ammonification สารประกอบอนทรยทมไนโตรเจน เชน พวกกรดอะมโนในสตว ในพช และแมแตในจลนทรยเอง ตลอดจนของเสยทสงมชวตขบถายออกมา จลนทรยในดนสามารถใชสารประกอบเหลานแลวเปลยนแปลงจนไดผลเปนแอมโมเนยออกมา เรยกขบวนการนวา ammonification วสดและอปกรณ 1. ตวอยางดน 2. เชอ Pseudomonas fluorescens และ Bacilus subtilis ใน NA plate อายประมาณ 16 ชวโมง 3. Peptone broth 4 หลอด 4. Nessler’s reagent

93

5. จานหลม (spot plate) 6. ปเปตทปราศจากเชอ ขนาด 1 มลลลตร 4 อน (ใชเมอมาตรวจผลการทดลอง) วธการทดลอง 1. ใช loop ถายเชอแบคทเรยลงในหลอดอาหาร peptone เชอละ 1 หลอด และใช loop ตกตวอยางดนประมาณ 1 กรม ใสลงในหลอดอาหาร 1 หลอด หลอดทเหลอเกบไวเปน control 2. เขยาหลอดอาหารเลกนอยเกบหลอดทงหมดไวทอณหภมหอง 3. เมอครบ 7 วน น ามาตรวจผลดงน 3.1 ตรวจหาแอมโมเนยในหลอดอาหารทกหลอด บนทกผลในการทดลองดงน - = ตรวจไมพบแอมโมเนย + = ตรวจพบแอมโมเนย 3.2 จากหลอดทเตมดนลงไป ใหใช loop ทลนไฟฆาเชอแลว รอใหเยน จมอาหารมา smear บนสไลด เพอน าไปยอมส Gram ตรวจดรปรางและการตดสของแบคทเรย บนทกผล วธตรวจหาแอมโมเนย หยด Nessler’s reagent 2 หยดลงบนจานหลม ใชปเปตทฆาเชอแลวดดอาหารในหลอดประมาณ 0.1มล. น าไปหยดลงบนน ายาบนจานหลมโดยไมตองคน ถามแอมโมเนยจะเกดสเหลองถงสน าตาลแลวแตปรมาณแอมโมเนยโดยเปรยบเทยบกบหลอด control บนทกผลลงในตารางท 10.1 การทดลองท 2 Nitrate reduction และ Denitrification ในสภาพทไมม O2 (anaerobic condition) จลนทรยในดนหลายชนดสามารถ reduce nitrate (ไนเตรต) เปน nitrite (ไนไตรต) และเชอบางชนดอาจ reduce ตอเปน ammonia (แอมโมเนย) นอกจากนจลนทรยบางชนดสามารถเปลยน nitrate (ไนเตรต) เปนกาซ nitrogen (กาซไนโตรเจน) คนสบรรยากาศ กระบวนการเหลานท าใหดนสญเสยสารประกอบไนโตรเจน ท าใหความอดมสมบรณของดนสญเสยไปดวย วสดและอปกรณ 1. ตวอยางดน 2. จานหลม 3. Nitrate medium ซงม Durham tube ดวย 4 หลอด

94

4. เชอ Pseudomonas fluorescens และ Bacillus subtilis ใน NA อายประมาณ 16 ชวโมง 5. ปเปตทปราศจากเชอ ขนาด 1 มลลลตร 4 อน (ใชเมอมาตรวจผลการทดลอง) 6. Nessler’s reagent

7. Starch-iodine solution และสารละลาย 20% H2SO4 8. Diphenylamine reagent 9. ชดสยอมแกรม (gram staining) วธการทดลอง 1. หลอดอาหาร nitrate medium 4 หลอด น ามาปฏบตดงน 1.1 หลอดท 1 เกบไวเปน control

1.2 หลอดท 2 และ 3 เตมเชอ P. fluorescens และ B. subtilis หลอดละ 1 เชอ ประมาณ 1 loop

1.3 หลอดท 4 เตมดนตวอยางลงไป 1 กรม 2. เขยาหลอดทเตมดนและเชอแลวน าไป incubate ทอณหภมหอง

3. เมอครบ 7 วน น ามาตรวจผลดงน 3.1 ตรวจดกาซใน Durham tube ในหลอดอาหารทกหลอด 3.2 ทดสอบการเกด nitrite และ ammonia จากหลอดอาหารทกหลอด เมอไมพบ nitrite ใหทดสอบหา nitrate ดวย บนทกผลลงในตารางน

- = ตรวจไมพบสารททดสอบ + = ตรวจพบสารททดสอบ 3.3 จากหลอดทเตมดนลงไป น ามา 1 loop smear บนสไลด air dry และ fixation แลวน าไปยอมส gram ตรวจดรปรางและการตดสของแบคทเรย บนทกผล วธตรวจหา nitrite (ไนไตรต) ผสมสารละลาย H2SO4 หยดกบ starch iodine solution 3 หยด บน spot plate แลวหยดอาหารทตองการทดสอบลงไป 1 หยด ถาเกดสน าเงนเขมขนแสดงวาม nitrite (การผสมไมควรใช loop เพราะจะท าใหเกดผลผดพลาด) ควรอานผลทนทเพราะสทเกดขนจะคอยๆ จางหายไป บนทกผลลงในตารางท 10.1

95

วธตรวจหา nitrate (ไนเตรต) หยด diphenylamine ลงบน spot plate 3 หยด และหยดอาหารทตองการทดสอบลงไป ถาม nitrate จะเกดสน าเงน (ถาม nitrite อยในอาหารกจะไดสน าเงนกบ diphenylamine ดวยเชนกน ดงนนจงควรทดสอบหา nitrate เมอทดสอบดวย starch iodine solution แลวไมพบ nitrite) บนทกผลลงในตารางท 10.1 การทดลองท 3 Nitrogen fixation จลนทรยในดนบางชนดสามารถตรงกาซ nitrogen จากบรรยากาศไดท าใหเพมสารประกอบ nitrogen ในดน จลนทรยเหลานม 2 พวก คอ พวกทอาศยเปนอสระในดนแตสามารถจบ nitrogen จากอากาศโดยขบวนการ non-symbiotic nitrogen fixation ได เชน Clostridium, Azotobacter และพวกทตรง nitrogen จากอากาศไดเมออาศยกบพชอนโดยขบวนการ symbiotic nitrogen fixation เชน Rhizobium ทอาศยในปมราก (nodule) ของพชตระกลถว วสดและอปกรณ

1. โคโลนของเชอ Rhizobium sp. บรสทธบนอาหาร yeast extract mannitol congo red agar และบนอาหาร NA

2. Yeast extract mannitol congo red agar 2 จาน 3. น ากลนปราศจากเชอ 1 ขวด 4. พชตระกลถวทมปมราก 5. แอลกอฮอล 95% 6. ปากคบ (forcep) 7. บกเกอร ขนาดเลก 1 ใบ

วธการทดลอง 1. สงเกตลกษณะของสของโคโลน Rhizobium บนจานอาหาร yeast extract mannitol congo red agar และบนอาหาร NA 2. เลอกเดดเฉพาะปมรากถวทขนาดใหญและสชมพมาท าความสะอาดตามขนตอน ดงน 2.1 ลางดนออกจากปมถวใหสะอาดดวยน ากอก 2.2 แชปมรากถวในบกเกอรทมน าทฆาเชอแลวพรอมกบเขยาบอยๆ ทงไว 5 นาท 2.3 เทน าออก แลวแชดวยแอลกอฮอล 95% นาน 2 นาท

96

2.4 ลางอก 3 ครง ดวยน ายาทฆาเชอแลว 3. การแยกเชอจากปมรากถว 3.1 ใชสไลดสะอาด 2 อน จมแอลกอฮอลลนไฟเพอฆาเชอ 3.2 วางปมรากอยระหวางสไลดทงสองแลวบบแผนสไลดเขาหากนจนปมรากแตก 3.3 ใช loop จมของเหลวบนสไลดน าไป streak บน yeast extract mannitol congo red agar โดย streak ใหไดโคโลนเดยว ๆ 3.4 เกบอาหารเลยงเชอไวทอณหภมหอง 4. การดเชอโดยตรงจากปมรากถว ใช loop แตะของเหลวจากขอ 3.2 น าไป smear บนสไลด fixation และยอมส Gram น าไปสองดดวยกลองจลทรรศน สงเกตรปรางของเซลล

5. จานอาหารเลยงเชอในขอ 3. เมอครบ 7 วนน าตรวจผลดงน 5.1 สงเกตลกษณะโคโลนทขนบน yeast extract mannitol congored agar เปรยบเทยบกบโคโลนของ Rhizobium ในขอ 1.

5.2 ใชเขมเขยแตะโคโลนทคาดวาเปนของ Rhizobium น าไป smear บนสไลด fixation แลวยอมส Gram น าไปสองดดวยกลองจลทรรศน สงเกตรปรางของเซลล เปรยบเทยบกบสไลดทท าไดในขอ 4. บนทกผลลงในตารางท 10.2

97

รายงานผลบทปฏบตการท 10 เรอง จลนทรยในดน

ชอ........................................................................นามสกล.....................................................................รหสนกศกษา………………………………….................สาขา.......................................................................... วนทท าการทดลอง……………….…..………………………………………………………..................................………. สมาชกในกลมทดลอง 1.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ 2.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ 3.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ ตารางท 10.1 การตรวจหาแอมโมเนย ไนไตรต และไนเตรต

สารทตรวจหา NH4+ รปรางและการตดสแกรมของจลนทรยทเตมในดนตวอยาง

Peptone broth 1. P. fluorescens 2. B. subtilis 3. ดนตวอยาง 4. control

NH4+ NO3

- NO2- Gas

N2

รปรางและการตดสแกรมของจลนทรยในหลอดทเตม

ดนตวอยาง Nitrate medium 1. P. fluorescens 2. B. subtilis 3. ดนตวอยาง 4. control

98

ตารางท 10.2 การแยก Rhizobium จากปมราก

การศกษา ผลการทดลอง โคโลน Rhizoobium ในอาหาร YMCA

รปรางและการตดสกรมของ Rhizobium จากปมจากถว

รปรางและการตดสกรมของ Rhizobium จาก YMCA

ค าถาม 1. จลนทรยในดนมบทบาทอยางไรตอแหลงดนบาง .................................................................................................................. ........................................ ............................................................................................................................. ............................. .......................................................................................................................................................... 2. ผลทเกดขนกบแหลงดนโดยกระบวนการ nitrogen fixation กบกระบวนการ denitrification แตกตางกนอยางไร .......................................................................................................................................................... ............................................................................................................................. ............................. ............................................................................................................................. ............................. สรปผลการทดลอง ..................................................................................... ..................................................................... ............................................................................................................................. ............................. .......................................................................................................................................................... ............................................................................................................................. ............................. ............................................................................................................................. ............................. .............................................................................. ............................................................................ ............................................................................................................................. ............................. ..................................................................................................................................................... .....

99

บทปฏบตการท 11 เรอง การหมกแอลกอฮอล

จดประสงคการสอน 10.1 สามารถหมกแอลกอฮอลประเภทไวนผลไมไดอยางถกวธ 10.2 วดปรมาณแอลกอฮอลโดยใช Ebulliometer ไดอยางถกตอง 10.3 บอกถงสวนประกอบและหลกการท างานของเครองหมกระดบหองปฏบตการ (laboratory scale fermenter) การหมกแอลกอฮอล ไวน (wine) เปนเครองดมประเภทแอลกอฮอลซงไดจากการหมกน าองนดวยยสตโดยมการควบคมอยางเหมาะสม แลวท าใหใสโดยไมตองกลน ปรมาณแอลกอฮอลในไวนจะอยระหวาง 8-14 เปอรเซนต ไวนทเกดจากการหมกน าผลไมอน เรยกวา ไวนผลไม ผลไมทเหมาะสมในการท าไวนควรมรสเปรยวอมหวาน สกจด แตไมเนา มกลนผลไมแรง ตองไมมแปงและเลคตนมากเพราะจะท าใหไวนขน นอกจากนควรมราคาถกและหาซองาย สวนยสตทเหมาะสมในการใชท าไวนนนตองหมกไดดทอณหภมต าใหแอลกอฮอลสงทนตอแอลกอฮอลและซลเฟอรไดออกไซด ใหกลนหอม หมกเสรจตกตะกอนด ไดไวนคอนขางใสและไมกลายพนธงาย ยสตทนยมใชในการหมกไวนผลไม คอ Saccharomyces cerevisiae สายพนธตางๆ การทดลองท 1 การท าไวนผลไม วสดและอปกรณ 1. ผลไม (อยางใดอยางหนง) - สบปะรด 1 กโลกรม - มะยม 200 กรม - กระเจยบสด 10 ผล - มะขามเปยก 1 กอนเลก 2. น าตาลทราย 300 กรม 3. ขวดแกวสะอาด ขนาด 750 มล. 2 ขวด 4. หวเชอ (Starter) ยสต S. cerevisiae 100 มลลลตร 5. กระบอกตวงปราศจากเชอขนาด 50 มล. 1 ใบ 6. ผากรอง 1 ผน

100

7. บกเกอรขนาด 1,000 มลลตร 1 ใบ 8. Refractomter 9. Ebulliometer 10. กระดาษวด pH 11. กรดซตรก 12. สารละลายแอมโมเนยไฮดรอกไซด 13. มด เขยง ถาด วธการทดลอง 1. เตรยมน าผลไม 1.1 คนน าผลไม - สบปะรด ปอกเปลอก หนเปนชนเลกๆ คน แลวกรองเอาน า เตมน า 3 เทา (น าสบปะรด 1 สวน : น า 3 สวน) - มะยม ลางใหสะอาด เดดกานทง บดใหเมดแตก คน กรองเอาน า เตมน า 6-7 เทา - กระเจยบสด ลางใหสะอาด แกะเอาเฉพาะสวนแดง เตมน า 1 ลตร ตม กรองเอาน า - มะขามเปยก เตมน าลงไปเลกนอย คน กรองเอาน า เตมน า 15 เทา 1.2 เตมน าตาลทราย ปรบใหความเขมขนน าตาลเปน 20-25๐บรกซ ( Brix) โดยวดดวย refractormeter 1.3 ปรบ pH ของน าผลไมใหอยระหวาง 4-4.5 2. การยบยงหรอการท าลายจลนทรยทตดมากบน าผลไม

อาจท าโดยการตมทอณหภมประมาณ 60 องศาเซลเซยส นาน 15-30 นาท ทงไวใหเยนหรอเตมโปแตสเซยมหรอโซเดยมเมตาไบซลไฟท 150-200 ppm ทงไวอยางนอย 6 ชวโมง กอนเตมยสต บรรจน าผลไมใสขวดทแหงสะอาด ขวดละประมาณ 450-500 มลลลตร 3. การเตมยสตและการหมก ใชหวเชอยสตเปนเชอเรมตน (inoculum) ประมาณ 1-10 เปอรเซนต (น าผลไม 100 มลลลตร เตมหวเชอ 1-10 มลลลตร) หมกไวทอณหภมประมาณ 20-28 องศาเซลเซยส นาน 2 สปดาห

101

4. การตรวจผล ถายไวนใสขวดทสะอาดขวดใหม โดยใชสายยางดดเฉพาะสวนใสดวยวธกาลกน า แลวน าไวนทไดไปวดปรมาณความเขมขนของน าตาลทเหลอโดยใช refractomerและวดปรมาณแอลกอฮอลโดยใช ebulliometer บนทกผลทได 5. การหยดการหมก การท าไวนใส และการบม น าไวนทไดไปท าพลาสเจอรไรส หรอเตมโปแตสเซยมเมตาไบซลไฟท 80-100 ppm บมทงไวทอณหภมต า ประมาณ 10-15 oซ จะท าใหไวนใส และมรสชาตกลมกลอมดขน หมายเหต : การเตรยมหวเชอยสต ท าไดโดยน าน าผลไมชนดเดยวกบการใชท าไวนมาปรบความเขมขนน าตาลใหได 10๐บรกซ ปรบ pH ใหอยระหวาง 4.5-5 บรรจลงฟลาสกขนาด 250 มล. น าไปท าใหปราศจากเชอดวย autoclave เมอทงไวใหเยนแลวจงเขยเชอยสตทใชลงไป น าฟลาสกดงกลาวไปเขาเครองเขยา (shaker) ความเรวประมาณ 100 รอบตอนาทเปนเวลา 24 ชวโมง

102

รายงานผลบทปฏบตการท 11 เรอง การหมกแอลกอฮอล

ชอ........................................................................นามสกล.....................................................................รหสนกศกษา………………………………….................สาขา.......................................................................... วนทท าการทดลอง……………….…..………………………………………………………..................................………. สมาชกในกลมทดลอง 1.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ 2.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ 3.............................................................................รหสนกศกษา............................................................

ค าถาม 1. การเตรยมน าผลไมเพอท าไวนจะเตมน าตาลทรายใหมความหวาน 20-25 บรกซ ถาเตมมากหรอนอยกวานนจะไดหรอไม เพราะเหตใด .............................................................................................. ............................................................ ............................................................................................................................. ............................. .......................................................................................................................................................... 2. น าผลไมส าหรบท าไวน จะปรบพเอชใหอยระหวาง 4-4.5 เพออะไร ....................................................................... ................................................................................... ............................................................................................................................. ............................. .............................................................................................................................................. ............ สรปผลการทดลอง ...................................................................................................... .................................................... ............................................................................................................................. ............................. .......................................................................................................................................................... ............................................................................................................................. ............................. ............................................................................................................................. ............................. ............................................................................................... ........................................................... ............................................................................................................................. .............................

103

บทปฏบตการท 12 เรอง การตรวจจลนทรยในอาหารและน านม

จดประสงคการสอน 12.1 สามารถตรวจนบจลนทรยในอาหารโดยวธ standard plate count ดวยเทคนคการ pour plate และ spread plate 12.2 ทราบถงวธการตรวจสอบคณภาพของน านมโดยวธการตางๆ การตรวจจลนทรยในอาหารและน านม อาหารทมนษยใชบรโภคไดมาจาก 2 แหลงใหญ ๆ คอ พชและสตว ซงจลนทรยจากแหลงทงสองนมเขามาปะปนในอาหารอยเสมอ ประเภทและปรมาณของจลนทรยในอาหารนนๆ ขนอยกบประเภทของสารอาหาร กรรมวธการผลต และสภาพของการเกบรกษา การตรวจจลนทรยในอาหารจงมความส าคญ เพราะท าใหทราบถงชนดและปรมาณของจลนทรยทปะปนอยในอาหาร ในบางกรณจะตรวจหาเฉพาะจลนทรยทอาจเปนสาเหตท าใหอาหารเนาเสย หรอเปนสาเหตของโรคทอาจเปนอนตรายตอผบรโภค การตรวจจลนทรยในอาหารจงเปนตวบงชถงคณภาพของอาหารทางจลชววทยา ถาหากอาหารมจลนทรยอยมากกวาปกต หรอมจลนทรยทเปนสาเหตของโรคยอมแสดงวาอาหารนนผานกรรมวธทไมถกตองตามสขลกษณะ (sanitary) การตรวจจลนทรยในน านม เนองจากน านมเปนอาหารทอดมสมบรณประกอบไปดวย คารโบไฮเดรต ไขมน โปรตน วตามน และเกลอแรตางๆ ม pH ประมาณ 6.8 จงท าใหแบคทเรยหลายชนดสามารถเจรญและใชสารอาหารในน านมได น านมทรดจากแมววทสขภาพสมบรณจะมแบคทเรยอยจ านวนไมมากนก แตกมการปนเปอนไดหลงจากการรด โดยอาจจะมาจากภาชนะและอปกรณการรดนมจากแมวว ฝน และมลววซงอยภายในบรเวณโรงวว ดงนนการรกษาความสะอาดจงเปนสงจ าเปนมาก และผทท าการรดนมจะตองเปนผมสขภาพด การลดจ านวนแบคทเรยในน านมท าไดโดยการพาสเจอรไรซและการสเตอรไลซ แบคทเรยทพบมากในน านมและผลตภณฑจากนม โดยปกตจะเปนพวก Gram positive non motile microaerophilic หรอพวก anaerobic rods หรอ cocci เชน Lactobacillus, Microbacterium, Micrococcus และ Streptococcus เพอความปลอดภยของผบรโภคหนวยงานทเกยวของทางดานอาหารจงมมาตรฐานทางจลชววทยาเพอใชทดสอบนมดบ (raw milk) และ processed milk การทดสอบทใชกนมากคอ 1. Standard plate count (SPC)

2. Breed or direct micoscopic count 3. Reductase test

104

4. Coliform test 5. Test for specific microbial pathogens

การทดลองท 1 การตรวจหาจลนทรยในอาหารโดยเทคนคการ pour plate วสดและอปกรณ 1. จานเพาะเชอปราศจากเชอ 6 จาน 2. อาหารเลยงเชอทมวนใช Plate Count Agar (PCA) 100 มล. 1 ขวด (อณหภมประมาณ 50 องศาเซลเซยส) 3. 0.1% peptone water 225 มลลลตร 1 ฟลาสก 4. 0.1% peptone water 9 มลลลตร 5 หลอด 5. ปเปตปราศจากเชอ 1 มลลลตร 1 กระบอก 6. ตวอยางอาหาร 25 กรม วธการทดลอง 1. ชงอาหารหนก 25 กรม ใสลงในฟลาสกทม 0.1% peptone water อย 225 มลลลตร เขยาใหเขากนประมาณ 25 ครง จะไดตวอยางทมความเจอจาง 10-1 2. ใชปเปตดดตวอยางเจอจาง 10-1 มา 1 มลลลตร ใสลงในหลอดทม 0.1%peptone water อย 9 มลลลตร เขยาใหเขากนหลายๆ ครง จะไดตวอยางทมก าลงเจอจาง 10-2 3. ท าใหตวอยางอาหารเจอจางตอไปเปน 10-3 , 10-4 และ 10-5 ตามล าดบ 4. เขยาตวอยางอาหารทท าการเจอจาง 3 ความเจอจางสดทายหลายๆ ครง แลวใชปเปต 1 มลลลตร ดดตวอยางลงในจานเพาะเลยงทปราศจากเชอ dilution ละ 2 จานๆ ละ 1 มลลลตร 5. ใชอาหารเลยงเชอทมวนอย (PCA) เทลงในจานเพาะเลยง (ขอ 4) ประมาณจานละ 15-20 มลลลตร หมนจานเพาะเลยงเบาๆ เพอใหตวอยางอาหารกบวนเขากนด ตงทงไวใหอาหารวนแขง กลบจานเพาะเลยง และบมเชอเปนเวลา 18-24 ชวโมง การอานผล น าจานเพาะเลยงท incubate ไวจากขอ 5 มานบจ านวนโคโลนจากจานทมจ านวนโคโลนอยระหวาง 30-300 โคโลน ค านวนหาปรมาณของจลนทรยในอาหาร 1 กรม (รายงานผลเปน standard plate count per gram) พรอมกนนใหสงเกตลกษณะและสของโคโลนทพบวาเปนอยางไร บนทกผลไวในตารางท 12.1

105

การทดลองท 2 การตรวจหาจลนทรยในอาหารโดยเทคนค spread plate วสดและอปกรณ 1. Plate Count Agar (PCA) 6 จาน

2. แทงแกวส าหรบ spread 1 แทง 3. แอลกอฮอล 95% ในบกเกอร 1 บกเกอร 4. ใชอปกรณเดยวกนกบการทดลองท 1.1 ในขอท 3-6

วธการทดลอง 1. เอาตวอยางทท าการเจอจาง 3 dilution สดทาย จากขอ 4 ของการทดลองท 1 มาเขยาหลายๆ ครง แลวใชปเปต 1 มลลลตร ดดตวอยางใสลงในจานอาหาร PCA dilution ละ 2 จานๆ ละ 0.1 มลลลตร 2. จมแทงแกวส าหรบ spread ลงในแอลกอฮอล แลวน าแทงแกวมาผานเปลวไฟถอใหเยนลงประมาณอณหภมหอง เปดฝาจานใสอาหาร แตะแทงแกวทดานในของฝากอน แลวจงแตะแทงแกวลงรมๆ จาน เกลยหยดน าตวอยางใหกระจายไปทงผวหนาของอาหาร เสรจแลวน าแทงแกวไปจมลงในแอลกอฮอล และผานเปลวไฟอกครง (แทงแกวทใชกระจายตวอยางจมแอลกอฮอล และผานเปลวไฟกอน และหลงการปฏบตทกครง) ท าการกระจายตวอยางทเหลอตอไปจนเสรจทง 6 จาน 3. บมเชอเปนเวลา 18-24 ชวโมง การอานผล น าจานเพาะเลยงท incubate จากขอ 3 มานบจ านวนโคโลนจากจานทมจ านวนโคโลนอยระหวาง 30-300 โคโลน ค านวณหาปรมาณของจลนทรยในอาหาร 1 กรม (รายงานผลเปน standard plate count per gram) พรอมกนนใหสงเกตลกษณะและสของโคโลนทพบวาเปนอยางไร บนทกผลไวในตารางท 12.2 การทดลองท 3 การตรวจหาจลนทรยในน านมโดยวธ Direct microscopic count น าน านมหรอ bacterial suspension ทตองการตรวจหาจ านวนแบคทเรยมาใชปรมาตรจ านวนหนง smear ลงบนสไลดในพนททก าหนดให ยอมส ดดวยกลองจลทรรศนโดยใชเลนสน ามนหลายๆ field ในกรณนจ าเปนตองทราบเสนผาศนยกลางของ field ปรมาตรของตวอยางทใช พนทสไลดทใช smear

106

ถาพนทสไลดทใช smear 1 ตารางเซนตเมตร และเสนผาศนยของ field (ใน oil immersion lens) = 160 um และปรมาตรทใชในการ smear คอ 0.01 มลลลตร จะได จ านวนของแบคทเรยตอมลลลตร = คาเฉลยของจ านวนแบคทเรยตอ field x พ.ท. smear ปรมาตรทใช x พ.ท.ของ field = คาเฉลยของจ านวนแบคทเรยตอ field x 1 x 108 0.01 x 20064 = คาเฉลยของจ านวนแบคทเรยตอ field x 497,500

วธนถาจ านวนของแบคทเรยคอนขางมาก จะท าใหการวดคาแนนอนกวาในกรณทจ านวนของแบคทเรยนอย แตถามจ านวนมากเกนไปจ าเปนตองเจอจางตวอยางลง วสดและอปกรณ 1. สไลดทสะอาดมาก 2. น านมดบ 3. xylene 4. แอลกอฮอล 95% 5. ส methylene blue วธการทดลอง 1. ตกรอบสไลดใหมพนท 1 ตารางเซนตเมตร 2. เขยาหลอดน านมดบใหเขากนอยางสม าเสมอ ใช loop ตกขนมา 1 loop ซงจะมปรมาตรประมาณ 0.01 มลลลตร smear น านมลงบนดานตรงขามกบทตกรอบไวใหเตมบรเวณกรอบสเหลยมใหมความหนาสม าเสมอ ปลอยใหแหงบนพนทราบ 3. น าสไลดไป fix โดยแชลงในแอลกอฮอล 5 นาท 4. จากนนแชลงใน xylene นาน 3 นาท เพอละลายไขมนออก 5. ปลอยใหน าไหลผานสไลด 30 วนาท 6. หยดส methylene blue ลงบนสไลดใหทวมบรเวณ smear ปลอยทงไว 5 นาท 7. ลางสออกดวยน า แลวทงไวจนสไลดแหง จงน าไปดดวยกลองจลทรรศน objective lene 100x นบจ านวนจลนทรยในแตละวงกลมของกลอง (micriscopic field) นบอยางนอย 10 field แลวหาคาเฉลย น าไปค านวณตามสตร

107

การอานผลและค านวณ นบจ านวนแบคทเรยในแตละวงกลมของกลองใหไดอยางนอย 10 filed น าไปหาคาเฉลยและค านวณตามสตร แสดงผลในตารางท 12.3 การทดลองท 4 การตรวจหาจลนทรยในน านมโดยวธ Dye reduction test การเปลยนสของส methylene blue หรอส resazurin ชาหรอเรวขนอยกบกจกรรมของจลนทรยเกยวของกบการใชออกซเจน ถามจลนทรยอยมากสกจะจางลงอยางรวดเรว ในการทดลองนใชส resazurin

การเปลยนสของ resazurin ม 2 ขนตอน คอ (oxidized form) (reduced form) Resazurin ----------- resorufin ----------- hydroresorufin (blue) (pink) (colorless) วสดและอปกรณ 1. น านมดบและน านมทพาสเจอรไรซ อยางละ 1 หลอด 2. ปเปตปราศจากเชอ 1 มลลลตร 1 อน 3. water bath ตงอณหภม 37 องศาเซลเซยส 4. ส methylene blue solution หรอส resazurin solution วธการทดลอง 1. ใชปเปตขนาด 1 มลลลตร ดดส resazurin ทเตรยมไวใหมๆ ลงในหลอดทดลอง หลอดละ 1 มลลลตร จ านวน 2 หลอด 2. เขยาตวอยางน านมดบและน านมทพาสเจอรไรซ แลวใชปเปตขนาด 10 มลลลตร ดดน านมตวอยางลงในหลอดทมส resazurin ปรมาตรหลอดละ 10 มลลลตร และใสในหลอดทดลองเปลา 10 มลลลตร เปนหลอดควบคม 3. ปดจกใหแนนคว าและหงายหลอด 2-3 ครง เพอใหสกบน านมเขากนด (หามเขยา) จบเวลาไว 4. น าหลอดทงสองไปแชใน water bath อณหภม 37 องศาเซลเซยส ตรวจดผลทก 10 นาท จนครบ 1 ชวโมง สงเกตการเปลยนสของ resazurin ในหลอดทงสองเปรยบเทยบกน การอานผล สงเกตการเปลยนแปลงของส resazurin ในหลอดทงสองเปรยบเทยบกนทกๆ 10 นาท บนทกผลในตารางท 12.4

108

รายงานผลบทปฏบตการท 12 เรอง การตรวจจลนทรยในอาหารและน านม

ชอ........................................................................นามสกล.....................................................................รหสนกศกษา………………………………….................สาขา.......................................................................... วนทท าการทดลอง……………….…..………………………………………………………..................................………. สมาชกในกลมทดลอง 1.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ 2.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ 3.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ ตารางท 12.1 ผลการตรวจนบจลนทรยในอาหารแบบเทคนค pour plate

ตวอยางอาหาร จ านวนจลนทรย (CFU)

ทระดบความเขมขน ปรมาณของจลนทรย/

อาหาร 1 กรม ลกษณะสของโคโลน

ตารางท 12.2 ผลการตรวจนบจลนทรยในอาหารแบบเทคนค spread plate

ตวอยางอาหาร จ านวนจลนทรย (CFU)

ทระดบความเขมขน ปรมาณของจลนทรย/

อาหาร 1 กรม ลกษณะสของโคโลน

109

ตารางท 12.3 ผลการตรวจหาจลนทรยในน านมโดยวธ Direct microscopic count

ตวอยางน านม คาเฉลยจ านวนจลนทรย ในแตละวงกลมของกลอง

(micriscopic field)

ค านวณตามสตร

น านมดบ

น านมพาสเจอรไรซ

ตารางท 12.4 การตรวจหาจลนทรยในน านมโดยวธ Dye reduction test

ตวอยางน านม การเปลยนสของ resazurin ทเวลาตาง ๆ

(นาท) คณภาพของน านม 10 20 30 40 50 60

น านมดบ

น านมพาสเจอรไรซ

ค าถาม 1. การตรวจนบจลนทรยในอาหารดวยวธ standard plate count นยมใชเทคนคใดบาง .................................................................................... ...................................................................... 2. เพราะเหตใดเมอน านมเปรยวพรอมดมมาตรวจหาเชอจลนทรยดวยวธ dye reduction test จงมการเปลยนสอยางรวดเรว ............................................................... ........................................................................................... ............................................................................................................................. ............................. สรปผลการทดลอง ............................................................................................................................. ............................. .............................................................................................. ............................................................

110

บทปฏบตการท 13 เรอง การตรวจโคลฟอรมแบคทเรยในน าดม


13.1 สามารถใชเทคนคทางจลชววทยาในการตรวจสอบคณภาพน าเพอการบรโภค การตรวจโคลฟอรมแบคทเรยในน าดม

โรคตดเชอหลายโรคเกดจากการดมน าทไมสะอาด มเชอโรคปะปนลงไป เชน ไทฟอยด ทองรวง อหวาตกโรค โรคตบอกเสบ เปนตน โรคเหลานโดยเฉพาะโรคระบบทางเดนอาหารจดวาเปนโรคทมความส าคญและเปนปญหาทางดานสาธารณสขของประเทศไทย ปจจยส าคญทท าใหเกดโรค เนองจากมการปนเปอนเชอโรคลงไปในน า ดงนนการตรวจสอบคณภาพน าเฉพาะทางดานจลชววทยาจงเปนขอมลเบองตนทจะบงบอกถงการปนเปอนของเชอโรค รวมทงแสดงถงคณภาพและความปลอดภยของน าทจะบรโภคดวย

น าธรรมชาตมจลนทรยปนเปอนอยมากทงชนดและปรมาณ การตรวจคณภาพของน าทางจลชววทยา นอกจากจะตรวจนบจลนทรยทงหมดแลว ยงนยมตรวจจลนทรยบางชนดทเมอมอยในน าแลวสามารถบงบอกถงความเปนไปไดทน าอาจจะไดรบการปนเปอนจากเชอโรค โดยเฉพาะเชอโรคทางเดนอาหารของคนหรอสตว เชน เชอแบคทเรยทกอโรคอจจาระรวง ไดแก Vibrio cholerae (อหวาตกโรค) Shigella dysenteriae (โรคบด) เปนตน ซงเชอโรคเหลานจะตดมากบอจจาระของคนหรอสตวทเปนโรคหรอเปนพาหะ (carrier) ของเชอโรคดงกลาว จงใชจลนทรยเหลานเปนดชนบงบอกถงการปนเปอนจากอจจาระทงโดยทางตรงและทางออม (index of fecal contamination) จลนทรยดชนเหลานมหลายกลมดวยกน เชน coliform, fecal coliform, E.coli เเละแบคทเรยในวงศ (family) Enterobacteriaceae ทงกลม รวมทง Enterococci การตรวจสอบคณภาพน าไมนยมวเคราะหหาแบคทเรยทท าใหเกดโรค เนองจากมอยจ านวนนอยและมอายในชวงเวลาสน ๆ จงอาจท าใหผลการวเคราะหคลาดเคลอนได ดงนนจงนยมวเคราะหหาโคลฟอรมแบคทเรยมากกวาชนดอนๆ เนองจากจลนทรยเหลานเปนพวกทมแหลงอาศยปกตอยในระบบทางเดนอาหารของคนและสตว จงพบเปนปรมาณมากในอจจาระ ปกตไมกอใหเกดโรค ทนตอสภาพเเวดลอมภายนอกไดด สามารถตรวจวเคราะหไดงาย รวดเรว และไมสนเปลองกวาการตรวจจลนทรยทเปนเชอโรค การตรวจน าจะมการหาจ านวนเชอเเบคทเรยทงหมดในน าดวย เพราะจ านวนเชอทไดจะเปนตวบงชทงชนดและจ านวนของสารอนทรยทมอยในน า ท าใหทราบถงมลภาวะ (pollution) ของน าวาจะเปนอาหารท าใหเชอเพมจ านวนไดหรอไม น าดม น าใช น าในล าน าธรรมชาต น าในสระวายน า บอ

111

เกบน า น าทงทผานการบ าบด ลลล ควรมปรมาณจลนทรยในปรมาณสงสดไดเพยงใดจงจะปลอดภยนนขนอยกบวตถประสงคของการใชน านนๆ

ดงนนมาตรฐานทางจลชววทยาของน าจงก าหนดไวแตกตางกน เชน มาตรฐานน าทใชบรโภคไดก าหนดไว ดงน

1. การตรวจดวยวธ Standard plate count เกณฑก าหนดทเหมาะสม คอ ไมเกน 500 โคโลนตอมลลลตร

2. การตรวจดวยวธ Most probable number of coliform organisms (MPN) เกณฑก าหนดทเหมาะสม คอ นอยกวา 2.2 ตอ 100 มลลลตร

3. การตรวจหาเชอ E. coli ตองไมมเลย

โคลฟอรมแบคทเรย

โคลฟอรมแบคทเรย (Coliform bacteria) เปนแบคทเรยชแนะ (Bacteriological indicator) ซงถาตรวจพบในน ากแสดงวาน านนนาจะไมปลอดภย คออาจมเชอโรคอยในน า โคลฟอรม เปนแบคทเรยในวงศ Enterobacteriaceae มรปทอนสน (rod shape) ตดสแกรมลบ (gram negative) ไมสรางสปอร (non-spore forming) เคลอนทโดยใชแฟลกเจลลาทอยรอบเซลล (peritrichous flagella) สามารถเตบโตในอาหารเลยงเชอทมองคประกอบของสตรอาหารไมซบซอน เปนเชอทเตบโตในสภาพทมอากาศ (aerobe) และไมมอากาศ (anaerobe) หรอเรยกวาแฟคคลเตทฟ แอนแอโรบ (facultative anaerobe) สามารถรดวซไนเตรทใหเปนไนไตรท ยอยสลายน าตาลแลคโตส (lactose) และใหแกสออกมาเมอบมเชอทอณหภม 35 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 - 48 ชวโมง สามารถท าใหเกดกาซจากอาหารเหลว Briliant Green Lactose Bile broth (BGLB) ทอณหภม 35 องศาเซลเซยส ภายในเวลา 48 ชวโมง หรอเรวกวานน สามารถเจรญเตบโตในอาหารแขง EMB (Eosine Methylene Blue Agar) ทอณหภม 35 องศาเซลเซยส ในเวลา 24 ชวโมง โดยปกตแบคทเรยกลมนจะมทงพวกทอาศยอยในล าไสของคนและสตวเลอดอน เรยกวา fecal coliform อกพวกทพบในดนและพช เรยกวา non-fecal coliform สาเหตทพบเชอจากล าไสคนและสตวในดนหรอน า เพราะแรกเรมเปนเชอทปนเปอนจากอจจาระ แตตอมาเชอทอยในดนหรอน านสามารถเพมจ านวนไดในสภาพแวดลอมดงกลาว

112

โคลฟอรมเเบคทเรย (Coliform bacteria) แบงตามแหลงทมา เเบงไดเปน 2 ชนด คอ

1. Fecal coliform พวกนอาศยอยในล าไสของคน และสตวเลอดอน ถกขบถายออกมากบอจจาระ เมอเกดการระบาดของโรคระบบทางเดนอาหารจะพบแบคทเรยชแนะชนดน ไดแก Escherichia coli

2. Non-fecal coliform พวกนอาศยอยในดนและพชมอนตรายนอยกวาพวกแรก ใชเปนแบคทเรยชแนะถงความไมสะอาดของน าได เชน Aerobacter aerogenes หรอปจจบนเปลยนชอเปน Enterobacter aerogenes วสดและอปกรณ

1. Presumptive test - 10 มลลลตร Lactose broth พรอมหลอดจบแกส 10 หลอด - 10 มลลลตร Lactose broth

(double strength บรรจในหลอด 25 มลลลตร) 5 หลอด 2. Confirmed test

- Brilliant Green Lactose Bile broth 2% พรอมหลอดจบแกส - EC medium พรอมหลอดจบแกส

3. Completed test - Eosin Methylene Blue (EMB) Agar 1 จาน - 10 มลลลตร Lactose broth พรอมหลอดจบแกส 1 หลอด - Nutrient agar slant 1 หลอด - Glucose yeast extract agar deep 6 หลอด - Sterile distilled water ปรมาณ 9.9 มลลลตร 1 หลอด - Sterile pipette ขนาด 10 มลลลตร 3 อน - Sterile pipette ขนาด 1 มลลลตร 3 อน - Sterile petri dish 6 อน - Loop 1 อน - ขวดแกวเกบน าทฆาเชอแลว 1 ขวด - Water bath ท 44.5 0.2 องศาเซลเซยส

113

การทดลองท 1 การตรวจนบจลนทรยทงหมด ท าการตรวจโดยวธ Standard plate count ดวยเทคนคการ pour plate

1. ในการตรวจหาจลนทรยทงหมดในน าดมจะใช dilution ดงน undilute, 1:10 และ 1:100 ดงนนท undilute จะดดตวอยางน าดมทจะตรวจมา 1 มลลลตร ใสใน plate แลว label เปน undilute สวน dilution ท 1: 10 ดดตวอยางน าดมทจะตรวจ 0.1 มลลลตร แลวใส plate และ label เปน 1:10 ส าหรบ dilution ท 1:100 ดดตวอยางน าดมทจะตรวจ 0.1 มลลลตร ใสลงในน ากลนทผานการฆาเชอ 9.9 มลลลตร ผสมใหเขากนจะเปน dilution 1:100 แลวดดน าทเจอจาง 1:100 มา 1 มลลลตร ใสใน plate แลว label เปน 1:100 ท า dilution ละ 2 plate

2. น า melted agar ซงใชอาหารเลยงเชอ Plate Count Agar (PCA) มาเททบตวอยางแตละ plate แลวหมน plate ไปทางขวา 25 ครง ไปทางซาย 25 ครง เพอใหตวอยางน าดมผสมกบอาหารเลยงเชอกระจายไปทวทงจาน

3. เมออาหารเลยงเชอในจานแขงตวแลว ท าการ incubate ท 35 องศาเซลเซยส นาน 24 ชวโมง แลวน ามานบจ านวนโคโลน แลวหาคาเฉลยจ านวนแบคทเรยทงหมดในน า 1 มลลลตร และบนทกผล การทดลองท 2 การตรวจหา coliform bacteria ท าการตรวจโดยวธ Most Probable Number (MPN) ดวยเทคนค multiple tube technique ประกอบดวย 3 ขนตอน (ภาพท 26) คอ 1. Presumptive test เปนการตรวจหาแบคทเรยทสามารถสลายน าตาล lactose แลวใหแกส หลงจากทเอาตวอยางน าดมทจะตรวจใสลงในอาหาร lactose broth แลว incubate ท 35

องศาเซลเซยส เปนเวลา 24-48 ชวโมง ถามแกสคาดวาเกดจากกลม coliform 1.1 เขยาขวดเกบตวอยางน าขนลงประมาณ 25 ครง 1.2 ดดน าทจะตรวจใสใน lactose broth ทมปรมาตรหลอดละ 10 มลลลตร ทงหมด

15 หลอด โดยดดน าใสใน lactose broth หลอดละ 10 มลลลตร 5 หลอด หลอดละ 1 มลลลตร 5 หลอด และ 5 หลอดทเหลอ ดดน าใสเพยงหลอดละ 0.1 มลลลตร แลว label ทงหมด เขยาหลอดเบา ๆ เพอใหน าผสมกบ lactose broth 1.3 น าหลอดทงหมดเขา incubator ท 35 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24-48 ชวโมง ดแกสทหลอดดกแกส ถามแกสถอวาใหผลบวก 2. Confirmed test ขนตอนนเปนการยนยนวาเปนกลม coliform ทสามารถสลาย lactose แลวใหแกสจรง ท าไดโดยการถายเชอจากหลอด lactose broth ทใหแกสมาเลยงใน brilliant green lactose bile broth 2% (2%BGLB) แลว incubate ท 35 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24-48 ชวโมง

114

2.1 หลงจากดผลขนตอนเเรกในเวลา 24 ชวโมง วามแกสเกดขนกหลอด สวนหลอดทยงไมมแกสใหน ากลบ ไปบมใน incubator ตออก 24 ชวโมง แลวน ามาดผลใหม 2.2 น าหลอดทมแกสทกหลอดมาเขยาเบา ๆ แลวถายเชอในแตละหลอดลงใน brilliant green lactose bile broth 2% (2% BGLB) หลอดตอหลอด โดยใช loop 2-3 loop ตอหลอด แลว lable บนหลอดอาหาร 2%BGLB ใหตรงกบหลอด lactose broth แลวน าเขา incubator ท 35 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24-48 ชวโมง

2.3 ถาตรวจ fecal coliform ใหถายเชอจากหลอด lactose broth ทใหแกสทกหลอด มาใสใน ECmedium หลอดตอหลอด แลว incubate ท 44.5 0.2 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง

2.4 เมอครบ 24-48 ชวโมง ตรวจดผลทใหแกส บนทกผล แลวไปเปดตาราง MPN เพอหาคา MPN ตอ 100 มลลลตร (ตารางท 1) 3. Completed test ขนตอนนเปนการทดสอบทแนนอนวาเปน coliform จรง และเปนการตรวจสอบคณภาพการวเคราะหในขนยนยน โดยขนตอนนจะเปนการเเยกเชอจากหลอด BGLB มาลงใน eosin methylene blue (EMB) agar แลว incubate ท 35 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมงแลวดลกษณะโคโลนวาเปน trypical coliform หรอไม คอ ถาเปน Escherichia coli จะมโคโลนสเขยวเหลอบแสงคลายรอยตดของชนโลหะ เรยกวา metallic sheen ถาเปน Enterobacter aerogenes จะมโคโลนเปนสชมพ เเละท าการยอมสเเกรม ดรปราง และดการสลายน าตาล lactose แลวใหเเกสอกครง 3.1 ใช loop ถายเชอจากหลอด 2%BGLB ทใหแกสมา streak บนอาหาร EMB แลว incubate ท 35 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง 3.2 เมอเชอเจรญบน EMB แลว ตรวจดวามโคโลนมลกษณะเหมอน E. coli (โคโลน เปนสเขยวมนวาวคลายโลหะตด) หรอ Enterobacter aerogenes (โคโลนสชมพ) 3.3 ถายเชอจาก EMB ลง lactose broth และ nutrient agar แลว incubate ท 35องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง 3.4 วนรงขนดผลใน lactose broth วามแกสหรอไม และยอมเชอจาก nutrient agar วาเปนเเกรมลบ รปรางแทง ยอมสปอรแลวไมมสปอรหรอไม ถาจาก lactose broth ใหแกสและยอมสเเกรมเปนเเกรมลบ มรปรางแทง และไมมสปอร แสดงวาการทดสอบขนตอน completed test ใหผลบวก บนทกผลลงในตารางท 13.1

115

Presumptive test ใสตวอยางน าในหลอดอาหาร Lactose broth / Lauryl tryptose broth บมท 35oซ. เปนเวลา 24-48 ชม.

เกดแกส = ผลเปนบวก มแบคทเรยโคลฟอรม ไมเกดแกส = ผลเปนลบ ไมมแบคทเรยโคลฟอรม

Confirmed test ถายเชอจากหลอดเกดแกสลงใน

หลอด Brilliant green lactose bile broth (BGLB) (หรอ) streak ลงบน Eosin methylene blue agar (EMB) บมท 35oซ. เปนเวลา 24-48 ชม. บมท 35oซ. เปนเวลา 24 ชม. ไมเกดแกส = ผลเปนลบ เกดแกส = ผลเปนบวก * typical colony ทเกดบนอาหาร EMB เพอ ไมมแบคทเรย ยนยนวามแบคทเรย แสดงวาเปนแบคทเรยโคลฟอรมม 2 แบบ คอ โคลฟอรม โคลฟอรม 1. โคโลนของ Escherichia coli ลกษณะสเขม

ตรงกลางโคโลนสเกอบด าและทผวมสเขยวเหลอบเปนเงาโลหะ

2. โคโลนของ Enterobacter spp. ลกษณะโคโลนทบแสง เยมเปนเมอกสชมพ

การเกดโคโลนทง 2 แบบ ยนยนวาเปน แบคทเรยโคลฟอรม

Completed test Streak ลงบน EMB agar บมท 35oซ. เปนเวลา 24 ชม. ดผลเชนเดยวกบ *

เลอก typical coliform colony แบบ 1 (ถาไมมเลอกแบบ 2) แลวถายเชอลงใน

Lactose broth / Lauryl tryptose broth Nutrient agar slant บมท 35oซ. เปนเวลา 24-48 ชม. บมท 35oซ. เปนเวลา 24 ชม. แลวน าไปยอมสแกรม

ถามแกสเกดขนใน Lactose broth / Lauryl tryptose broth และแบคทเรยตดสแกรมลบ รปรางทอนสน ไมมสปอร แสดงวามแบคทเรยโคลฟอรมอยอยางสมบรณ

ภาพท 26 การตรวจสอบแบคทเรยโคลฟอรมในน า

116

ตารางท 1 ตารางคา Most Probable Number (MPN) ตอ 100 มลลลตร เมอใชตวอยางน า 10, 1, 0.1 มลลลตร ปรมาตรละ 5 หลอด

117

ตารางท 1 ตารางคา Most Probable Number (MPN) ตอ 100 มลลลตร เมอใชตวอยางน า 10, 1, 0.1 มลลลตร ปรมาตรละ 5 หลอด (ตอ)

118

รายงานผลบทปฏบตการท 13 เรอง การตรวจโคลฟอรมแบคทเรยในน าดม

ชอ........................................................................นามสกล.....................................................................รหสนกศกษา………………………………….................สาขา.......................................................................... วนทท าการทดลอง……………….…..………………………………………………………..................................………. สมาชกในกลมทดลอง 1.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ 2.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ 3.............................................................................รหสนกศกษา............................................................ ตารางท 13.1 ผลการตรวจสอบโคลฟอรมแบคทเรยในตวอยางน าดม

อาหารเลยงเชอ ระยะเวลา

(ชม.) จ านวนหลอดทใหเเกส

MPN/100ml. 10 ml. 1 ml. 0.1 ml.

Lactose broth (Presumptive test)

48

2% BGLB (Confirmed test)

48

EMB agar (Completed test) 24

Lactose broth (Completed test)

Gram stain (Completed test)

Total bacteria count (CFU/ml)

24

Undiluted ………………… ………………… total……….……... …………………

Diluted 10-1

………………… ………………… total……….……...………………

Diluted 10-2

………………….. ………………….. total……….…….. ………………….

119


กญจนา ธระกล และคณะ. 2538. จลชววทยาปฏบตการ. ภาควชาจลชววทยา คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร. 161-171น.

คมอปฏบตการจลชววทยาทวไป. 2541. ภาควชาจลชววทยา คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลย สงขลานครนทร.

คมอปฏบตการจลชววทยาอตสาหกรรม. 2542. ภาควชาจลชววทยา คณะวทยาศาสตรมหาวทยาลยสงขลานครนทร.

ธนสรา เหลาเจรญสข. 2540. คมอปฏบตการวชาจลชววทยาทางอาหาร. แผนกวชาชววทยา ภาควชาวทยาศาสตร คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยสงขลานครนทร.

ธรพร กงบงเกด. 2546. จลชววทยาอาหาร. ภาควชาอตสาหกรรมเกษตร คณะเกษตรศาสตร ทรพยากรธรรมชาตและสงแวดลอม มหาวทยาลยนเรศวร. 20น.

บญญต สขศรงาม. 2534. จลชววทยาทวไป. ภาควชาจลชววทยา คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยบรพา. 445น.

เบญจมาศ จตรสมบรณ และคณะ. 2547. จลชววทยาปฏบตการ. สาขาวชาชววทยา ส านกวชา วทยาศาสตร มหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร.

American Public Health Association. 1992. American Water Works Association and Water Pollution Control Federation. “Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater.” 18th Edition, American Public Health Association Inc., Washington D.C.

Beishier, L. 1991. Microbiology in Practise. The 5th ed. Harper Collins Publishers, Inc. USA.

Garbutt, J. 1997. Essentials of Food Microbiology. Arnold, London, England. Johnson, T.E. and Case, C.L. 1989. Laboratory Experiments in Microbiology. The 2th

ed. The Benjamin Cummings Publishing Company, Inc. USA. http://www.google.co.th/

Documents

บทปฏิบัติการ อาหารและการให้อา ...fishtech.rmutsv.ac.th/fishtech3/Fishtech_SAR55/4.0.3...บทปฏ บ ต การ อาหารและการให