A Technique for the Cultivation of Higher Plants Plant Physiol.-1951-Kathrein-843-7

7/29/2019 A Technique for the Cultivation of Higher Plants Plant Physiol.-1951-Kathrein-843-7

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A TECHNIQUE FOR THE CULTIVATION OF HIGHER PLANTSUNDER STERILE CONDITIONS

HENRY R. KATHREIN( W I T H TWO F I G U R E S )

R e c e i v e d F e b r u a r y 1 2 , 1 9 5 1To s t u d y t h e e f f e c t s o f m i c r o o r g a n i s m s o f t h e s o i l o n p l a n t g r o w t h , i t i se s s e n t i a l t h a t m e t h o d s b e d e v e l o p e d b y w h i c h p l a n t s c a n b e g r o w n u n d e rs t e r i l e c o n d i t i o n s . F R E D ( 2 ) h a s r e p o r t e d t h e u s e o f a m o d i f i c a t i o n o f K E L -

L E R M A N ' s ( 5 ) s y s t e m b y w h i c h p e a s w e r e g r o w n i n s o i l u n d e r s t e r i l e c o n d i -t i o n s . T h i s m e t h o d e n t a i l e d t h e u s e o f a g l a s s c y l i n d e r w h i c h f i t t e d o n t o as p e c i a l l y c o n s t r u c t e d m e t a l p o t i n w h i c h t h e p l a n t w a s t o b e g r o w n . A g l a s sb e a k e r w a s i n v e r t e d o v e r t h e c y l i n d e r t o p r e v e n t c o n t a m i n a t i o n . I n am e t h o d d e v e l o p e d b y G E R R E T S E N ( 3 , 4 ) o a t s , m u s t a r d , a n d s u n f l o w e r s w e r eg r o w n i n q u a r t z s a n d u n d e r s t e r i l e c o n d i t i o n s . S t e r i l i t y o f t h e p o t s w a sm a i n t a i n e d b y c o v e r i n g t h e s a n d w i t h a l a y e r o f s t e r i l e c o r k f i l i n g s m i x e dw i t h k a t a d y n e s i l v e r . I n b o t h m e t h o d s d e s c r i b e d , t h e n u t r i e n t s a l t s w e r ea d d e d d i r e c t l y t o t h e p o t b e f o r e s t e r i l i z a t i o n .

R E U S Z E R ( 6 ) h a s d e s c r i b e d a m e t h o d o f c u l t i v a t i n g s q u a s h a n d s u n f l o w e r su n d e r s t e r i l e c o n d i t i o n s . I n t h i s m e t h o d , t h e s e e d w a s p l a c e d i n a v e r m i c u -l i t e p l a n t t u b e a n d t h e r o o t a l l o w e d t o g r o w d o w n i n t o a c h a m b e r c o n t a i n i n ga n u t r i e n t s o l u t i o n . A s i m i l a r t e c h n i q u e f o r g r o w i n g p l a n t s w i t h t h e i r r o o t si n a s t e r i l e medium h a s b e e n p r e s e n t e d b y B L A N C H A R D a n d D I L L E R ( 1 ) .T h i s m e t h o d i n v o l v e d t h e p l a c i n g o f t h e s e e d i n a n a l u m i n u m c o l u m n f i l l e dw i t h v e r m i c u l i t e . Upon g e r m i n a t i o n , t h e r o o t p e n e t r a t e d a g a u z e l a y e r i n t oa s t e r i l e n u t r i e n t s o l u t i o n .S t u d i e s o n t h e n u t r i t i o n o f p l a n t s a r e b e i n g c o n d u c t e d i n t h i s l a b o r a t o r yb y t h e u s e o f s a n d c u l t u r e . T h e p l a n t s a r e w a t e r e d w i t h n u t r i e n t s o l u t i o n so f known c o m p o s i t i o n a n d f l u s h e d p e r i o d i c a l l y w i t h d i s t i l l e d w a t e r t o p r e -v e n t s a l t a c c u m u l a t i o n . N o n e o f t h e a b o v e m e t h o d s w e r e c o m p l e t e l y a p p l i -c a b l e t o t h i s m e t h o d o f r a i s i n g p l a n t s ; t h e r e f o r e , t h e t e c h n i q u e d e s c r i b e d i nt h i s p a p e r w a s d e v e l o p e d . T h i s t e c h n i q u e i n v o l v e s t h e c u l t u r i n g o f h i g h e rp l a n t s i n p u r e q u a r t z s a n d i n s u c h a m a n n e r t h a t t h e e n t i r e p l a n t i s h e l du n d e r c o m p l e t e l y s t e r i l e c o n d i t i o n s u n t i l m a t u r i t y i s r e a c h e d .

S e e d s w e r e s t e r i l i z e d i n a s m a l l f i l t e r f l a s k u s i n g a 0 . 1 % o m e r c u r i c c h l o r i d es o l u t i o n . T h e p e r i o d o f s t e r i l i z a t i o n v a r i e d w i t h t h e t y p e o f s e e d t o b e s t e r i l -i z e d ; i n t h e c a s e o f o a t s , i m m e r s i o n f o r a f o u r m i n u t e p e r i o d w a s s u f f i c i e n tt o d e s t r o y t h e m i c r o o r g a n i s m s p r e s e n t . D u r i n g t h e s t e r i l i z a t i o n p e r i o d , avacuum w a s a l t e r n a t e l y a p p l i e d a n d r e l e a s e d ; a n d t h e f l a s k w a s s h a k e n t or e m o v e a i r b u b b l e s f r o m t h e s u r f a c e o f t h e s e e d . T h e s e e d s w e r e t h e n w a s h e df o u r o r f i v e t i m e s w i t h s t e r i l e d i s t i l l e d w a t e r t o r e m o v e a n y t r a c e o f t h em e r c u r i c c h l o r i d e . F o l l o w i n g t h i s t r e a t m e n t , t h e s e e d s w e r e t r a n s f e r r e d t o ab a c t e r i o l o g i c a l a g a r a n d a l l o w e d t o g e r m i n a t e . C o n t a m i n a t i o n w a s c h e c k e d

8 4 3


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PLANT PHYSIOLOGYb y t h e s t e r i l i t y o f t h e a g a r m e d i u m o n w h i c h t h e s e e d s w e r e p l a c e d . A l ls e e d s w h i c h s h o w e d c o n t a m i n a t i o n w e r e d i s c a r d e d . When t h e r o o t s o f t h ep l a n t s r e a c h e d a n e l o n g a t i o n o f a p p r o x i m a t e l y f i v e m m . , t h e s e e d s w e r et r a n s f e r r e d a s e p t i c a l l y w i t h f o r c e p s t o t h e s t e r i l e p o t s o f s a n d .D e t a i l s o f t h e a p p a r a t u s d e s c r i b e d b e l o w a r e s h o w n i n f i g u r e 1 . A s t a n d -a r d f o u r i n c h g l a z e d s o i l j a r w i t h a h o l e i n t h e s i d e n e a r t h e b a s e was u s e d

COTTON PLUG- 1 0 0 MM. GLASSCYLINDERALUMINUMTUBE

JAR

WATERING

SOIL

) L L E C T I O N

F I G . 1 . A p p a r a t u s u s e d f o r t h e c u l t u r i n g o f h i g h e r p l a n t s u n d e r s t e r i l e c o n d i t i o n s .as a c u l t u r e c h a m b e r . A r u b b e r s t o p p e r w i t h a g l a s s t u b e p a s s i n g t h r o u g hi t was i n s e r t e d i n t o t h e h o l e a t t h e b a s e o f t h e p o t . To p e r m i t t h e d r a i n a g eo f excess n u t r i e n t s o l u t i o n , t h i s g l a s s t u b e was c o n n e c t e d t o a 1 0 0 0 m l . E r l e n -m e y e r f l a s k b y means o f r u b b e r t u b i n g . A g l a s s c y l i n d e r 1 0 0 mm. i n d i a m -e t e r a n d 4 0 0 t o 6 0 0 mm. i n l e n g t h a n d s t o p p e r e d a t t h e t o p w i t h a l a r g e c o t -t o n p l u g was f i t t e d o n t o t h e t o p o f t h e s o i l j a r a n d h e l d i n p l a c e b y a p a r a f f i ns e a l . A p i e c e o f 1 / 4 i n c h a l u m i n u m t u b i n g wound t i g h t l y b e t w e e n t h e l a y e r s

SCREW

PARAFFIN

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BRIEF PAPERS

o f t h e c o t t o n p l u g w a s p a s s e d down t h e c y l i n d e r i n t o t h e s o i l j a r . The a l u -m i n u m t u b i n g w a s ma de w i t h a t h r e e i n c h l o o p o n t h e s o i l j a r e n d w i t h h o l e sd r i l l e d a t o n e i n c h i n t e r v a l s o n t h e l o o p . T h i s t u b i n g a l l o w e d t h e p l a n t t o b ew a t e r e d d i r e c t l y a t t h e s u r f a c e o f t h e s a n d w i t h o u t w a s h i n g t h e s a n d f r o ma r o u n d t h e r o o t s o f t h e p l a n t s . The t o p o f t h e a l u m i n u m t u b i n g was c o n -n e c t e d t o a b o t t l e o f s t e r i l e n u t r i e n t s o l u t i o n a n d a b o t t l e o f s t e r i l e d i s t i l l e dw a t e r w i t h r u b b e r t u b i n g . T h i s a l l o w e d t h e s o i l j a r s t o b e w a t e r e d w i t hn u t r i e n t s o l u t i o n a n d f l u s h e d w i t h d i s t i l l e d w a t e r . The b o t t l e s u s e d f o rn u t r i e n t s o l u t i o n a n d d i s t i l l e d w a t e r w e r e 2 0 - l i t e r a s p i r a t o r b o t t l e s . An yn u m b e r o f s o i l j a r s m ay b e c o n n e c t e d t o o n e n u t r i e n t s o l u t i o n b o t t l e a n do n e d i s t i l l e d w a t e r b o t t l e b y m e a n s o f g l a s s T c o n n e c t i o n s . C i r c u l a t i o n o fa i r i n s i d e t h e g l a s s c y l i n d e r s m ay b e a c c o m p l i s h e d b y a d d i n g a n o t h e r T c o n -n e c t i o n a n d f o r c i n g a i r t h r o u g h a c o t t o n s t o p p e r e d t u b e i n t o t h e a l u m i n u mw a t e r i n g t u b e .

T h e s o i l j a r s c o n t a i n i n g t h e q u a r t z s a n d w e r e c o v e r e d w i t h a l a y e r o fg a u z e , c o t t o n , a n d k r a f t p a p e r t i e d i n p l a c e . T h e r u b b e r c o n n e c t i o n s o f t h ed r a i n a g e t u b e s a t t h e b o t t o m o f t h e j a r s w e r e a l s o w r a p p e d w i t h g a u z e , c o t -t o n a n d p a p e r c o v e r s . T h e j a r s w e r e t h e n s t e r i l i z e d i n a n a u t o c l a v e f o r t h r e eh o u r s a t 1 2 1 0 C , 1 5 p o u n d s s t e a m p r e s s u r e t o i n s u r e c o m p l e t e s t e r i l i z a t i o n .T h e b o t t o m s o f t h e g l a s s c y l i n d e r s w e r e c o v e r e d w i t h g a u z e , c o t t o n , a n dp a p e r w r a p p e r s t i e d i n p l a c e . A l l o t h e r c o n n e c t i o n s o f t h e a p p a r a t u s w e r ec o v e r e d w i t h g a u z e , c o t t o n , a n d p a p e r w r a p p e r s t o m a i n t a i n s t e r i l i t y a f t e ra u t o c l a v i n g . T h e g l a s s c y l i n d e r s , d r a i n a g e b o t t l e s , a n d a l l T c o n n e c t i o n sw e r e a u t o c l a v e d 1 5 m i n u t e s a t 1 5 p o u n d s o f p r e s s u r e . B e c a u s e o f t h e i r s i z e ,t h e 2 0 - l i t e r a s p i r a t o r b o t t l e s w h i c h w e r e u s e d f o r n u t r i e n t s o l u t i o n s a n d d i s -t i l l e d w a t e r w e r e s t e r i l i z e d b y d r y h e a t ( 1 8 0 0 C , o n e a n d a h a l f h o u r s ) . T h et o p a n d b o t t o m o p e n i n g s w e r e p l u g g e d w i t h c o t t o n . F o l l o w i n g t h e s t e r i l i z -i n g p r o c e s s , t h e s e p l u g s w e r e r e p l a c e d w i t h r u b b e r s t o p p e r s w h i c h h a d g l a s st u b i n g c o n n e c t i o n s . T h e s t o p p e r s a n d c o n n e c t i o n s w e r e s t e r i l i z e d i n a n a u t o -c l a v e . T h e n u t r i e n t s o l u t i o n s a n d d i s t i l l e d w a t e r w e r e s t e r i l i z e d b y p a s s i n gt h e m t h r o u g h a s i z e A , n o r m a l p o r o s i t y B e r k e f e l d f i l t e r .

A f t e r t h e s e e d s h a d b e e n s t e r i l i z e d a n d t h e p r o p e r s t a g e o f g e r m i n a t i o nr e a c h e d , t h e y w e r e t r a n s f e r r e d a s e p t i c a l l y t o t h e s o i l j a r s . The p a p e r , c o t -t o n , a n d g a u z e w r a p p e r w a s l o o s e n e d f r o m t h e t o p o f t h e s o i l j a r ; a n d t h es e e d s w e r e p o s i t i o n e d i n t h e s a n d b y m e a n s o f s t e r i l e f o r c e p s . T h e w r a p -p i n g s w e r e t h e n r e m o v e d f r o m t h e g l a s s c y l i n d e r a n d j a r , a n d t h e c y l i n d e rw a s p l a c e d o n t o p o f t h e j a r . The c y l i n d e r w a s s e a l e d t o t h e j a r i m m e d i -a t e l y w i t h s t e r i l e p a r a f f i n . T h e p a r a f f i n w a s a p p l i e d w i t h a h a l f i n c h b r u s ht h a t h a d b e e n s t e r i l i z e d w i t h t h e p a r a f f i n i n a s m a l l E r l e n m e y e r f l a s k . Thea l u m i n u m t u b i n g e m e r g i n g f r o m t h e c o t t o n p l u g a t t h e t o p o f t h e c y l i n d e rw a s t h e n c o n n e c t e d t o t h e n u t r i e n t s o l u t i o n a n d d i s t i l l e d w a t e r b o t t l e s b yr e m o v i n g t h e w r a p p i n g s a n d m a k i n g t h e c o n n e c t i o n . T h e c o n n e c t i o n f r o mt h e b o t t o m o f t h e s o i l j a r t o t h e c o l l e c t i n g E r l e n m e y e r f l a s k s w a s made i n t h es a m e m a n n e r . T h e a p p a r a t u s w a s t h e n c o m p l e t e l y a s s e m b l e d , a n d t h e s e e d sw e r e w a t e r e d w i t h d i s t i l l e d w a t e r . The n u t r i e n t s o l u t i o n a n d d i s t i l l e d w a t e r

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PLANT PHYSIOLOGY . . . .. :: . . : . :. . . . . . . . .

: . . .W:.. . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . .F I G . 2 . O a t p l a n t s w h i c h h a v e b e e n g r o w n u n d e r c o m p l e t e l y s t e r i l e c o n d i t i o n s .

w e r e c o n t r o l l e d b y mea ns o f s c r e w c l a m p s w h i c h e n a b l e d t h e w a t e r i n g w i t hn u t r i e n t s o l u t i o n o r t h e f l u s h i n g o f t h e j a r s w i t h d i s t i l l e d w a t e r . S t e r i l i t yo f t h e s o i l j a r s was c h e c k e d p e r i o d i c a l l y b y r e m o v i n g t h e d r a i n a g e b o t t l e sa n d p l a t i n g t h e n u t r i e n t s o l u t i o n w i t h v a r i o u s b a c t e r i o l o g i c a l m e d i a .

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BRIEF PAPERS

C o m p l e t e s t e r i l i t y w a s m a i n t a i n e d o n o a t p l a n t s o v e r a p e r i o d o f e i g h tw e e k s a f t e r w h i c h t i m e t h e y w e r e h a r v e s t e d f o r a n a l y s i s . A v e r a g e h e i g h t o ft h e s e p l a n t s w a s 5 0 0 m m . F i g u r e 2 s h o w s a s e t o f o a t p l a n t s r a i s e d u n d e rs t e r i l e c o n d i t i o n s b y t h e a b o v e m e t h o d .THE S A M U E L R O B E R T S N O B L E F O U N D A T I O N

A p D M O R E , OKLAHOMALITERATURE CITED

1 . B L A N C H A R D , F R E D A . a n d D I L L E R , V I O L E T M. T e c h n i q u e f o r g r o w i n gp l a n t s w i t h r o o t s i n a s t e r i l e m e d i u m . P l a n t P h y s i o l . 2 5 : 7 6 7 - 7 6 9 .1 9 5 0 .2 . F R E D , E . B . T h e g r o w t h o f h i g h e r p l a n t s i n s o i l f r e e o f m i c r o o r g a n i s m s .J o u r . G e n . P h y s i o l . 1 : 6 2 3 - 6 2 9 . 1 9 1 9 .3 . G E R R E T S E N , F . C . Das K a t a d y n V e r f a h r e n z u r s t e r i l e n K u l t u r h o h e r e rP f l a n z e n . P l a n t a 2 3 : 5 9 3 - 6 0 5 . 1 9 3 5 .4 . G E R R E T S E N , F . C . T h e i n f l u e n c e o f m i c r o o r g a n i s m s o n t h e p h o s p h a t e i n -t a k e o f t h e p l a n t . P l a n t a n d S o i l 1 : 5 1 - 8 1 . 1 9 4 8 .5 . K E L L E R M A N , K . F . U . S . D e p t . A g r . , B u r . P l a n t I n d . , B u l l . 1 2 0 . 1 9 1 4 .6 . R E U S Z E R , H E R B E R T W. A m e t h o d f o r d e t e r m i n i n g t h e c a r b o n d i o x i d ep r o d u c t i o n o f s t e r i l e a n d n o n - s t e r i l e r o o t s y s t e m s . S o i l S c i . S o c .A m e r . P r o c . 1 4 : 1 7 5 - 1 7 9 . 1 9 4 9 .

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