A DNA Fragment of Herpes Cacu

8/12/2019 A DNA Fragment of Herpes Cacu

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P r o c . N a t . A c a d . S c i . USAV o l . 6 9 , N o . 1 2 , p p . 3 7 8 4 - 3 7 8 9 , D e c e m b e r 1 9 7 2

DNA F r a g m e n t o f H e r p e s S i m p l e x 2 a n d I t s T r a n s c r i p t i o ni n Human C e r v i c a l C a n c e r T i s s u e

( v i r u s / D N A - R N A hybridization/DNA-DNA h y b r i d i z a t i o n )NIZA FRENKEL*t, BERNARD ROIZMAN*, E N Z O C A S S A I * t , AND ANDRE N A HM I A S* D e p a r t m e n t s o f M i c r o b i o l o g y a n d B i o p h y s i c s , Th e U n i v e r s i t y o f C h i c a g o , C h i c a g o , I l l i n o i s 6 0 6 1 2 ; a n d D e p a r t m e n t o fP e d i a t r i c s , Emory U n i v e r s i t y S c h o o l o f M e d i c i n e , A t l a n t a , G e o r g i a 3 0 3 2 2C o m m u n i c a t e d b y L e o n 0 . J a c o b s o n , O c t o b e r 1 2 , 1 9 7 2

AB ST R AC T A human c e r v i c a l tumor, f r e e o f d e te c t ab l ei n f e c t i o u s h e r p e s s i m p l e x 2 v i r u s , c o n t a i n e d a fragmentc o m p r i s i n g 39 o f h e r p e s v i r a l D N A . R e n a t u r a t i o n k i n e t -i c s i n d i c a t e t h a t an a v e r a g e o f 1 t o 3 . 5 DNA f r a g m e n t s o fh e r p e s s i m p l e x v i r u s a r e p r e s e n t p e r c e l l , depending o n t h ep l o i d y o f t h e c e l l s i n t h i s p a r t i c u l a r t u m o r . V i r u s - s p e c i f i cs e q u e n c e s w e r e f o u n d l i n k e d t o h i g h l y r e p e t i t i v e s e q u e n c e so f h o s t D N A , wh ich r e a s s o c i a t e d under c o n d i t i o n s d e s i g n e dt o p r e c l u d e r e a s s o c i a t i o n o f v i r a l s e q u e n c e s . T he t umo ra l s o c o n t a i n e d RNA t r a n s c r i p t s complementary t o 5 o ft h e v i r a l D N A . T h e f r a c t i o n o f v i r a l DNA t e m p l a t e t r a n -s c r i b e d i n t h e c e r v i c a l tumor i s c o n s i d e r a b l y l e s s thant h a t t r a n s c r i b e d i n p r o d u c t i v e l y i n f e c t e d c e l l s ( 5 0 ) .H e r p e s s i m p l e x v i r u s e s 1 a n d 2 ( H S V - 1 a n d H S V - 2 ) a r e i m -m u n o l o g i c a l l y a n d b i o l o g i c a l l y r e l a t e d , s h a r e i n common a b o u t5 0 o f t h e i r D N A s e q u e n c e s w i t h g o od m at ch i ng o f b a s ep a i r s , a n d n o r m a l l y d e s t r o y t h e c e l l s t h e y p r o d u c t i v e l y i n f e c t( r e v i e w e d i n r e f s . 1 - 3 ) . N u m e r o u s s t u d i e s h a v e r e l a t e d HSV-2w i t h human g e n i t a l c a n c e r s a n d , i n p a r t i c u l a r , w i t h c a r c i n o m ao f t h e c e r v i x 4 . T h e a s s o c i a t i o n b e t w e e n t h e v i r u s a n d c a n c e r( 5 ) i s b a s e d o n v i r a l a n d s e r o - e p i d e m i o l o g i c s t u d i e s i n h u m a n s 5 , 6 ) a n d o n t h e f i n d i n g o f v i r a l a n t i g e n s i n e x o f o l i a t e d c e l l sf r o m p a t i e n t s w i t h c e r v i c a l d y s p l a s i a s a n d c anc e r s 7 . T h ea b i l i t y o f t h i s v i r u s t o p r o d u c e t u m o r s , a l b e i t r a r e l y , i n h a m -s t e r s 8 a n d m i c e ( 3 ) a n d to t r a n s f o r m h a m s t e r c e l l s i n t om a l i g n a n t m e t a s t a s i z i n g c e l l s 9 a l s o t e s t i f i e s t o i t s p o t e n t i a lo n c o g e n i c i t y . H o w e v e r , e v i d e n c e f o r t h e p r e s e n c e o f v i r a lg e n o m e i n t u m o r s a n d p a r t i c u l a r l y o f v i r a l p r o d u c t s c h a r a c t e r -i s t i c o f n o n p r o d u c t i v e i n f e c t i o n , h a s b e e n l a c k i n g . S u c h p r o d -u c t s w o u l d b e e x p e c t e d i f t h e t u m o r c e l l a r o s e f r o m a n o n -p r o d u c t i v e l y i n f e c t e d n o r m a l c e l l .

M A T E R I A L S AND METHODSS o l u t i o n s , C h e m i c a l s , a n d E n z y m e s . H y b r i d i z a t i o n b u f f e rc o n s i s t e d o f 5 0 mM T r i s e H C I ( p H 8 . 0 5 ) - 7 0 mM N a C l . L a b e l -i n g b u f f e r c o nt ai ne d 7 0 mM p o t a s s i u m p h o s p h a t e ( p H 7 . 4 ) -

7 mM M g C l 2 - 1 mM 2 - m e r c a p t o e t h a n o l . R e t i c u l o c y t e s t a n -d a r d b u f f e r c o n s i s t e d o f 1 0 mM K C 1 - 1 . 5 mM M g C l 2 - 1 0 mMT r i s HCl ( p H 7 . 4 ) . d G T P , d A T P a n d dCTP w e r e o b t a i n e df r o m S c h w a r z - M a n n , O r a n g e b u r g , N . Y . [ 3 H ] T T P ( 5 0 C i /A b b r e v i a t i o n s ; HSV, h e r p e s s i m p l e x v i r u s : HEp-2 c e l l s , humane p i d e r m o i d c a r c i n o m a c e l l s . .

t P r e s e n t a d d r e s s : Weizmann I n s t i t u t e , R e h o v o t , I s r a e l .A d d r e s s r e p r i n t r e q u e s t s t o D r . Roizman.t P r e s e n t a d d r e s s : I n s t i t u t e o f M i c r o b i o l o g y , T h e U n i v e r s i t yo f F e r r a r a , F e r r a r a , I t a l y .

m m o l ) a n d [ m e t h y l - H ] t h y m i d i n e ( 5 0 C i / m m o l ) w e r e f r o mN e w E n g l a n d N u c l e a r C o . , B o s t o n , M a s s . R N a s e f r e e o fD N a s e a c t i v i t y a n d D N a s e f r e e o f R N a s e a c t i v i t y w e r e f r o mW o r t h i n g t o n B i o c h e m i c a l s , F r e e h o l d , N . J . E s c h e r i c h i a c o l iD N A p o l y m e r a s e I w a s a g i f t o f t h e D e p a r t m e n t o f B i o c h e m -i s t r y , S t a n f o r d U n i v e r s i t y . T h e s i n g l e s t r a n d - s p e c i f i c N e u r o -s p o r a n u c l e a s e w a s p r e p a r e d a s p u b l i s h e d ( 1 0 ) .

C e l l s a n d V i r u s . Human e p i d e r m o i d c a r c i n o m a ( H E p - 2 )c e l l s w e r e i n f e c t e d w i t h a m u l t i p l i c i t y o f 5 p l a q u e - f o r m i n gu n i t s o f t h e G p r o t o t y p e o f H S V - 2 ( 1 ) p e r c e l l .C e r v i c a l T u m o r . A e x o p h y t i c c e r v i c a l t u m o r w e i g h i n g 7 0 gw a s s u r g i c a l l y r e m o v e d f r o m a 5 9 - y e a r - o l d woman w h o h a d

n o t r e c e i v e d p r e v i o u s r a d i a t i o n t h e r a p y . T h e t u m o r c i r c u m -f e r e n t i a l l y c o r r o d e d t h e c e r v i x , e x t e n d e d i n t o t h e f o r n i c e sa n d t h e p a r a m e t r i u m , a n d i n v o l v e d p a r a m e t r i a l l y m p h n o d e s( s t a g e I I B ) . L i g h t m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n o f e m b e d d e ds e c t i o n s s h o w e d t h a t a b o u t 8 0 o f t i s s u e c o n s i s t e d o f t u m o rc e l l s o f t h e l a r g e t y p e . T h e t u m o r w a s t e s t e d f o r v i r u s b y ii n o c u l a t i o n o f s u s c e p t i b l e c e l l c u l t u r e s w i t h a 1 0 t u m o r s u s -p e n s i o n , i i i n o c u l a t i o n o f d a y - o l d h a m s t e r s , a n d i i i f l u o r e s -c e nt a n t i H S V - 1 a n d H S V - 2 a n t i b o d y s t a i n i n g . N o v i r u s o ra n t i g e n w a s f o u n d .

P r e p a r a t i o n o f H S V - 2 D N A . P r e p a r a t i o n o f i n t a c t v i r a lDN f r o m c y t o p l a s m i c v i r i o n s w a s a s p u b l i s h e d 1 1 . DNAf o r i n v i t r o l a b e l i n g w a s k e p t i n t a c t . D N A l a b e l e d i n v i v oranged f r o m 1 2 , 0 0 0 - 7 0 , 0 0 0 c p m p e r M g o f DNA; i t was s h e a r e di n a F r e n c h p r e s s a n d d i a l y z e d e x t e n s i v e l y a g a i n s t h y b r i d i z a -t i o n b u f f e r . V i r a l DNA p r e p a r e d b y t h i s m e t h o d i s f r e e o f h o s tDNA, a s d e t e r m i n e d b y i s o p y c n i c b o n d i n g i n a m o d e l Ec e n t r i f u g e a n d b y h y b r i d i z a t i o n w i t h e x c e s s h o s t D N A 1 2 .E x t r a c t i o n a n d P u r i f i c a t i o n o f R N A. R N A w a s e x t r a c t e d( 1 3 ) f r o m w h o l e i n f e c t e d c e l l s at 2 a n d 8 h r a f t e r i n f e c t i o nt o e n s u r e r e c o v e r y o f HSV R N A m o l e c u l e s c o v a l e n t l y b o u n dt o p o l y ( A ) s e q u e n c e s ( 1 4 ) . T h e R N A was d i g e s t e d w i t hD N a s e , e x t r a c t e d w i t h p h e n o l ( a t pH 7 . 6 a n d p H 9 . 0 a n dc h l o r o f o r m - i s o a m y l a l c o h o l , a n d p r e c i p i t a t e d w i t h e t h a n o l .

T h i s p r o c e s s w a s r e p e a t e d o n c e m o r e . A f t e r t h e s e c o n d e t h a n o lp r e c i p i t a t i o n , t h e R N A p e l l e t was d i s s o l v e d a n d d i a l y z e da g a i n s t h y b r i d i z a t i o n b u f f e r .V i r a l DNA Was L a b e l e d I n V i t r o 1 5 . 0 . 1 M u g o f DNase wasa d d e d t o 5 u g o f H S V - 2 D N A i n 0 . 9 m l o f l a b e l i n g b u f f e r a n di n c u b a t e d f o r 1 5 m i n at 3 7 0 t o ni ck t h e DNA a n d t h e n f o r

3 7 8 4


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H e rp e s S im p l ex 2 DNA F r a g m e n t 3 7 8 51 0 m i n a t 7 0 t o i n a c t i v a t e th e D N a s e . T h e m i x t u r e t h e n r e -c e i v e d 5 0 , l e a c h o f d A T P , d C T P , a n d dGTP t o y i e l d a f i n a lc o n c e n t r a t i o n o f 0 . 2 , M f o r e a c h n u c l e o t i d e . T h e s o l u t i o n w a st h e n t r a n s f e r r e d t o a v i a l c o n t a i n i n g 1 mCi o f [ 3 H ] T T P l y -o p h i l i z e d j u s t b e f o r e t h i s s t e p a n d 1 - 1 0 u n i t s o f E . c o l i DNAp o l y m e r a s e I . T h i s m ix tu r e w a s i n c u b a t e d at 1 8 0 f o r 8 h r , t h e nm a d e 1 w i t h r e s p e c t t o S a r k o s y l , a n d p a s s e d t h r o u g h aS e p h a d e x G - 5 0 c o l u m n e q u i l i b r a t e d w i t h 1 0 mM T r i s ( p H7 . 4 ) - i mM E D T A - 0 . 1 S a r k o s y l . T h e DNA w a s t h e n e x -t r a c t e d w i t h p h e n o l a n d d i a l y z e d a g a i n s t h y b r i d i z a t i o n b u f f e r .T h e s p e c i f i c a c t i v i t y o f t h e l a b e l e d H S V - 2 DNA w a s 5 . 3 X 1 0 8c p m / , u g .

E x t r a c t i o n o f T u m o r R N A a n d D N A. T h e c e r v i c a l t u m o rw a s h o m og en iz e d i n r e t i c u l o c y t e s t a n d a r d b u f f e r a n d e x -t r a c t e d w i t h p r o t e i n d e n a t u r i n g age nts a s f o r p r e p a r a t i o n o fi n f e c t e d c e l l RNA. E t h a n o l w a s a d d e d t o th e l a s t a q u e o u sp h a s e , a n d th e D N A w a s s p o o l e d o n a g l a s s r o d . T h e p r e c i p i -t a t e d R N A w a s p r o c e s s e d a s d e s c r i b e d a b o v e . T h e s p o o l e dD N A w a s d i g e s t e d w i t h R N a s e ( 5 0 , g / m l ) , t h e n e x t r a c t e dw it h p h e no l a n d c h l o r o f o r m - i s o a m y l a l c o h o l i n t h e p r e s e n c eo f 0 . 5 s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e a n d e x t e n s i v e l y d i a l y z e da g a i n s t h y b r i d i z a t i o n b u f f e r .

P a r t i a l R e a s s o c i a t i o n o f C e r v i c a l T u m o r DNA a n d I t s Fr ac -t i o n a t i o n . C e r v i c a l t u m o r DNA ( 3 . 2 6 m g / m l i n h y b r i d i z a t i o nb u f f e r ) w a s d e n a t u r e d b y h e a t i n g a t 1 1 0 0 f o r 1 0 m i n ; t h e n i tw a s a l l o w e d t o r e a s s o c i a t e a t 5 3 0 f o r 1 . 6 h r . T h e DNA w a st h e n d i l u t e d w i t h s o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r t o a f i n a l N a+c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 1 2 M a n d p u t o n h y d r o x y a p a t i t e i n a wate r -j a c k e t e d c o l u m n h e a t e d t o 5 0 0 . T h e a b s o r b e d DNA w a s e l u t e df i r s t w i t h 0 . 1 9 M a n d s u b s e q u e n t l y w i t h 0 . 4 M p h o s p h a t e .T h e D N A i n t h e 0 . 1 2 M e f f l u e n t a n d t h a t e l u t e d w i t h 0 . 1 9 Ma n d w i t h 0 . 4 M p h o s p h a t e w e r e c o n c e n t r a t e d a n d d i a l y z e da g a i n s t h y b r i d i z a t i o n b u f f e r . O f t h e t o t a l D N A, 6 3 w a sr e c o v e r e d i n t h e 0 . 1 2 M e f f l u e n t a n d w a s t h e r e f o r e s i n g l e -s t r a n d e d , 2 6 e l u t e d i n 0 . 1 9 M p h o s p h a t e , a n d 1 e l u t e d a t0 . 4 M p h o s p h a t e . H y b r i d i z a t i o n o f c e r v i c a l t u m o r DNA w a sc a r r i e d t o a n e q u i v a l e n t C Q t o f 9 1 . 8 c o r r e c t e d f o r b o t h s i z e o fDNA [ f r o m a n a s s u m e d 1 . 6 X 1 0 5 t o 4 0 0 n u c l e o t i d e s l o n g ( 1 6 ) a n d f o r m o l a r i t y o f t h e m o n o v a l e n t c a t i o n s [ 0 . 1 2 M p h o s p h a t e( 1 7 ) ] i n h y b r i d i z a t i o n b u f f e r . Human c e l l DNA t h a t r e a s -s o c i a t e s a t t h i s C J t c o n s i s t s o f r e p e t i t i v e s e q u e n c e s ( 1 8 , 1 9 ) .T h e r e a s s o c i a t i o n a n d f r a c t i o n a t i o n o f c e r v i c a l t u m o rD N A w a s de si g n ed t o p e r m i t r e c o v e r y o f r e a s s o c i a t e d s e -q u e n c e s a n d DN c o v a l e n t l y l i n k e d t o t h e s e s e q u e n c e s b u t t oe x c l u d e v i r a l DNA t h a t i s n o t i n t e g r a t e d , i . e . , n o t c o v a l e n t l yb o u n d t o h o s t D N A. T h e d e s i gn o f t h e s e e x p e r i m e n t s i s b a s e do n t h e f o l l o w i n g c o n s i d e r a t i o n s : i T h e C Q t 5 0 o f v i r a l DNA i s 0 . 4 ( 2 0 ) . A t C Q t o f 1 0 , t h e DNAi s c o m p l e t e l y r e a s s o c i a t e d . A s s u m i n g t h a t c e r v i c a l t u m o rDNA c o n t a i n s 1 0 m o l o f v i r a l DNA p e r m o l o f c e l l u l a r DNAa n d t h at v i r a l DNA s t r a n d s a r e i n t a c t , i . e . , 1 . 6 X 1 0 6 n u c l e o -t i d e s l o n g , a n d n o t i n t e g r a t e d , w e c a l c u l a t e t h a t v i r a l DNAw o u l d r e q u i r e a minimum o f 1 6 0 0 h r t o c o m p l e t e l y r e a s s o c i a t eb u t t h a t l i t t l e o r n o r e a s s o c i a t i o n w o u l d o c c u r i f t h e DNAw e r e a l l o w e d t o h y b r i d i z e f o r 1 . 6 h r , i . e . , t o a n e q u i v a l e n t C Q to f 0 . 0 1 . T h e r e a s s o c i a t i o n o f v i r a l s e q u e n c e s i s e x p e c t e d t o b ee v e n l o w e r s i n c e t h e h y b r i d i z a t i o n w a s d o n e a t 4 1 0 b e l o w t h eTm o f H S V - 2 DNA ( 1 1 ) . i i H S V - 2 DNA c o n t a i n s 6 9 g u a n i n e p l u s c y t o s i n e m o l e sp e r c e n t . U n d e r th e c o n d i t i o n s o f o u r s t u d i e s , s i n g l e - s t r a n d e d

c o l u m n s w i t h 0 . 1 9 M p h o s p h a t e b u t n o t w i t h 0 . 1 2 M p h o s -p h a t e . C o n s e q u e n t l y , o n l y t h e r e a s s o c i a t e d c e r v i c a l t u m o rD N A f r e e o f s i n g l e - s t r a n d e d H S V - 2 DNA s h o u l d e l u t e f r o mh y d r o x y a p a t i t e w i t h 0 . 4 M p h o s p h a t e . i i i T h e c a l c u l a t i o n a n d f r a c t i o n a t i o n w e r e v e r i f i e d i n a r e -c o n s t r u c t i o n e x p e r i m e n t i n w h i c h u n s h e a r e d H S V - 2 DNA i n ac o n c e n t r a t i o n e q u i v a l e n t t o t h at o f 1 0 DNA m o l e c u l e s p e rDNA c e l l e q u i v a l e n t w a s a l l o w e d t o r e a s s o c i a t e f o r 1 . 6 h r a n dt h e n w a s f r a c t i o n a t e d o n h y d r o x y a p a t i t e .V i r a l D N A - R N A H y b r i d i z a t i o n s w e r e d o n e a s d e s c r i b e d( 2 1 ) . L a b e l e d DN w a s m i x e d w i t h e x c e s s o f u n l a b e l e d i n -f e c t e d c e l l o r c e r v i c a l t u m o r R N A i n h y b r i d i z a t i o n b u f f e r a n ds e a l e d i n a 1 0 0 - , u l m i c r o p i p e t t e , i m m e r s e d f o r 7 m i n i n ane t h y l e n e g l y c o l b a t h h e a t e d t o 1 1 5 0 , t h e n i n c u b a t e d a t 6 7 0( 2 5 0 b e l o w t h e T m ) . T h e a m o u nt o f DNA i n t h e h y b r i d i z a t i o nm i x t u r e w a s c o n s t a n t f o r a n y o n e p r e p a r a t i o n , b u t v a r i e df r o m p r e p a r a t i o n t o p r e p a r a t i o n d e p e n d i n g o n i t s s p e c i f i ca c t i v i t y . A s a c o n t r o l , i d e n t i c a l a m o u n t s o f t h e same DNAw e r e i n c u b a t e d w i t h a m o u n t s o f u n i n f e c t e d H E p - 2 c e l l R N Ac o r r e s p o n d i n g t o t h o s e i n t h e i n f e c t e d c e l l s a n d i n c e r v i c a lR N A h y b r i d i z a t i o n s . A f t e r h y b r i d i z a t i o n , t w o a l i q u o t s o fth e m i x t u r e w e r e d i g e s t e d w i t h N e u r o s p o r a c r a s s a n u c l e a s e t od e p o l y m e r i z e r e s i d u a l s i n g l e - s t r a n d e d DNA. T wo o t h e r a l i -q u o t s o f t h e h y b r i d i z a t i o n m i x t u r e s e r v e d a s c o n t r o l s f o r t o t a lDNA i n t h e m i x t u r e .W h en v i r u s - s p e c i f i c u n l a b e l e d R N A i s i n e x c e s s a n d th ea m o u n t o f D N A r e a s s o c i a t i o n i s n e g l i g i b l e , t h e h y b r i d i z a t i o nr e a c t i o n i s p r e d i c t e d b y t h e r e l a t i o n s h i p ( 2 1 )D t / D o a l e R l t e n - e - k R n t 1 - ( a l + . . . a n ) [ 1 ]w h e r e D t / D o i s t h e f r a c t i o n o f DNA r e m a i n i n g s i n g l e s t r a n d e d ;s u b s c r i p t s 1 - n r e f e r to c l a s s e s o f RNA d i f f e r i n g i n m o l a r r a t i o s ;R 1 . . . R n r e p r e s e n t R N A c o n c e n t r a t i o n s i n m o l / l i t e r ; a n d a ,a n d a n are c o r r e s p o n d i n g f r a c t i o n s o f t h e t o t a l DN s e r v i n g a st e m p l a t e s f o r t h e c l a s s e s o f RN d i f f e r i n g i n a b u n d a n c e .W e ar e c o n c e r n e d h e r e o n l y w i t h t h e t o t a l amount o f D N A( a l + . . . a n ) s e r v i n g a s t e m p l a t e f o r b o t h a b u n d a n t a n ds c a r c e v i r a l R N A t r a n s c r i p t s . T h i s a m o u n t i s d e t e r m i n e d b yp l o t t i n g D t / D o a g a i n s t R o t , w h e r e R O i s t h e c o n c en t ra t i o n o ft o t a l c e l l R N A ( m o l n u c l e o t i d e p er l i t e r i n t h e h y b r i d i z a t i o nm i x t u r e a n d t i s t i m e o f h y b r i d i z a t i o n i n s e c o n d s .T h e r e c o v e r y o f c e r i v e a l t u m o r R N A w a s s o l o w as to r e -q u i r e l e n g t h y h y b r i d i z a t i o n a n d , t h e r e f o r e , f o r m a t i o n o f D N A -D N A h y b r i d s c o u l d n o t b e p r e v e n t e d . T h e p e r c e n t o f v i r a lD N A t r a n s c r i b e d w a s d e t e r m i n e d b y s u b t r a c t i o n f r o m t h ea m o u n t o f h y b r i d f o r m e d i n t h e p r e s e n c e o f c e r v i c a l t u m o rRN t h e a m o u n t o f h y b r i d f o r m e d w i t h e q u a l c o n c e n t r a t i o n so f u n i n f e c t e d H E p - 2 c e l l RNA.

H y b r i d i z a t i o n s o f I n V i t r o - L a b e l e d HSV-2 DNA w i t h C e r v i c a lT u m o r DNA w e r e d o n e i n 1 . 0 6 M N a C l - 5 0 mM T r i s ( p H8 . 0 5 ) a t 7 9 . T h e n u c l e a s e d i g e s t i o n w a s d o n e a s d e s c r i b e da b o v e e x c e p t th at t he f i n a l c o nc e ntr at i o n o f N a C l i n t h e d i -g e s t i o n m i x t u r e w a s a d j u s t e d to 4 6 mM b y d i l u t i o n .

R E S U L T SP e r c e n t o f V i r a l D N A T r a n s c r i b e d i n P r o d u c t i v e I n f e c t i o na n d i n C e r v i c a l T u m o r . W V e c o m p a r e d th e t r a n s c r i p t i o n a l p r o -g r a m o f H S V - 2 i n p r o d u c t i v e l y i n f e c t e d H E p - 2 c e l l s w i t h t h a ti n c e r v i c a l t u m o r c e l l s . C o n s i s t e n t w i t h e a r l i e r a n a l y s e s o f

H S V - 1 - i n f e c t e d c e l l s ( 2 1 ) , w e c h o s e R N A e x t r a c t e d at 2 a n d 8v i r a l DNA i s q u a n t i t a t i v e l y e l u t e d f r o m h y d r o x y a p a t i t e

P r o c . N at . A c a d . S c i . USA 6 9 1 9 7 2

h r a f t e r i n f e c t i o n , i . e . , b e f o r e t h e o n s e t o f v i r a l DNA s y n t h e s i s


3/6

3 7 8 6 M e d i c a l S c i e n c e s : F r e n k e l e t a l ., , 1 . 0 0

; Q 9 0._

. 0.80. _ I0 . 7 0 ,

M Qd=a 0.60

F o

Cervical tumor0

2 h r I n f e c t e d He 2 c e l l s_

I r n f e c t e d H E p - 2 c e l l s

3 A i2 . @

0 1 0 0 0 2 0 0 3 6 : 00R o t ( m o l n u c l e o t i d e s s e c . l i t e r ~ l F I G . 1 . H y b r i d i z a t i o n o f l a b e l e d HSV-2 DNA w i t h e x c e s sRNA e x t r a c t e d f r o m HEp-2 c e l l s i n f e c t e d f o r 2 a n d 8 h r a n d f r o m

t h e c e r v i c a l t u m o r . F o r c e l l s i n f e c t e d f o r 2 a n d 8 h r , t h e e x p e r i -m e n t a l l y d e t e r m i n e d p o i n t s a r e s h o w n as o p e n a n d h a l f - f i l l e dc i r c l e s , r e s p e c t i v e l y . The l i n e s a r e c o m p u t e r p l o t s c a l c u l a t e d a c -c o r d i n g t o E q . [ 1 ] a n d f i t t e d b y a n o n l i n e a r l e a s t - s q u a r e m e t h o d .T h e n e t a m o u n t o f DNA h y b r i d i z i n g w i t h c e r v i c a l t u m o r RNAw a s c a l c u l a t e d b y s u b t r a c t i o n o f t h e a m o u n t o f DNA-DNA h y -b r i d f o r m e d i n t h e p r e s e n c e o f HEp-2 RNA f r o m t h e a m o u n t o fh y b r i d ( D N A - D N A a n d D N A - R N A ) f o r m e d i n th e p r e s e nc e o fc e r v i c a l t u m o r RN A.a n d a f t e r t h e a p p e a r a n c e o f i n f e c t i o u s p r o g e n y , r e s p e c t i v e l y .T h e r e s u l t s o f D N A - R N A h y b r i d i z a t i o n s t u d i e s ma y b es u m m a r i z e d a s f o l l o w s ( F i g . 1 ) : i T h e t r a n s c r i p t s p r e s e n t i nth e t u m o r a n d t h e c e l l s i n f e c t e d f o r 2 h r a n d f o r 8 h r h y b r i d i z ew i t h 5 , 2 1 , a n d 50 o f HSV-2DNA, r e s p e c t i v e l y . i i T h ed u r a t i o n o f h y b r i d i z a t i o n o f HSV-2 DNA w i t h RNA f r o m

I S1 . 61 . 41 ] .

A

_--- ---g-- @V.l.U..S

,,Wa . . -

i e H o u r s 2 wF I G . 2 . H y b r i d i z a t i o n o f i n v i t r o l a b e l e d HSV-2 DNA i n t h e

p r e s e n c e o f c e r v i c a l t u m o r DNA a n d HEp-2 D N A . ( A ) HSV-2[3H]DNA ( 4 6 n g / m l ) w a s h y b r i d i z e d i n t h e p r e se nc e o f HEp-2DNA ( 3 . 0 7 m g / m l ) ( - ) o r c e r v i c a l t u m o r DNA ( 3 . 2 6 mg/ml)( 0 ) f o r t h e t i m e i n t e r v a l s s h o w n . T h e p l o t f o r c e r v i c a l t u m o rDNA b e g i n s t o d e v i a t e f r o m t h e i n i t i a l r a t e a f t e r 4 0 . 2 o f t h eDNA w a s i n t h e h y b r id f o r m . The p l o t f o r HEp-2 DNA c o n t i n u e st o i n c r e a s e l i n e a r l y u n t i l at l e a s t 4 8 8 h r , at w h i c h p o i n t 65.7 o ft h e DNA w a s i n h y b r i d f o r m , i n d i c a t i n g t ha t t h e i n v i t r o - l a b e l e dDNA r e a s s o c i a t e s n o r m a l l y w i t h s e c o n d - o r d e r k i n e t i c s . ( B )HSV-2 [ 3 H ] DNA ( 1 2 n g / m l ) w a s h y b r i d i z e d i n t h e p r e se nc e o fc e r v i c a l t u m o r DNA i n c o n c e n t r a t i o n s o f 5 mg/ml ( r ) , 3 . 2 6mg/ml ( V ) , 1 . 7 4 mg/ml ( A ) , 1 . 0 9 mg/ml ( o ) , o r w i t h HEp- 2DNA ( 0 ) . The f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f DNA i n t h e h y b r i d i z a t i o nw a s a d j u s t e d w i t h HEp-2 DNA t o t h e h i g h e s t c o n c e n t r a t i o n o ft u m o r DNA i n o r d e r t o m i n i m i z e t h e v a r i a t i o n i n v i s c o s i t y o f t h eh y b r id i z at i o n m i x t u re .

T A B L E 1 . R e h y b r i d i z a t i o n o f DNA h y b r i d f o r m e d i n t h ep r e s e n c e o f c e r v i c a l t u m o r RNA * o f DNA

o f i n h y b r i dDNA a b o v e c o n t r o lS o u r c e o f DNA RNA i n E x - O b -RNA C o t R o t h y b r i d p e c t e d s e r v e d

1 s t H y b r i d i z a t i o nC e r v i c a l tumor 2 . 4 1 0 0 0 4 5 . 0 5 . 0 5 . 2U n i n f e c t e dHEp-2 1 0 0 0 3 9 . 8

2 n d H y b r i d i z a t i o nC e r v i c a l t u m o r 0 2 1 1 1 0 0 2 6 . 7 1 4 . 6 1 4 . 4U n i n f e c t e dH E p - 2 1 1 0 0 1 2 . 3T h e DNA i n th e h y b r i d o b t a i n e d b y h y b r i d i z a t i o n o f DNAl a b e l e d i n v i t r o w i t h c e r v i c a l RNA c o n s i s t s o f 8 8 . 4 DNA-DNAh y b r i d a n d 1 1 . 6 D N A - R N A h y b r i d . T h e c a l c u l a t i o n i s b a s e d

o n th e amount o f DNA i n h y b r i d f o r m e d i n t h e p r e s e n c e o fH E p - 2 RN A. I n t h e s e c o n d h y b r i d i z a t i o n d o n e to a b o u t t h e sameR o t a s t h e f i r s t , b u t t o a d i f f e r e n t DNA C o t b e c a u s e o f d e c r e a s e dDNA c o n c e n t r a t i o n , we c o u l d e x p e c t t h a t a l l 1 1 . 6 o f DNAt h a t h y b r i d i z e d to c e r v i c a l tumor RNA w o u l d e n d u p i n D N A -RNA h y b r i d . I n a d d i t i o n , t h e DNA o r i g i n a l l y i n th e DNA-DNAh y b r i d w o u l d e n d u p i n p a r t ( 1 2 . 3 o f 8 9 ) i n DNA-DNA h y -b r i d a n d i n p a r t ( 5 o f 8 9 ) i n DNA-RNA h y b r i d . T h e p r e -d i c t e d t o t a l DNA h y b r i d i z i n g i n t h e p r e s e n c e o f c e r v i c a l tumors h o u l d , t h e r e f o r e , b e 1 4 . 6 g r e a t e r t h a n t h a t h y b r i d i z i n g i n t h ep r e s e n c e o f H E p - 2 RN A.

* I n m o l n u c l e o t i d e s e c l i t e r - I a n d f o r 7 0 mM N a C l .

p r o d u c t i v e l y i n f e c t e d c e l l s w a s t o o s h o r t f o r a p p r e c i a b l ea m o u n t s o f DNA-DNA h y b r i d s t o f o r m . H o w e v e r , b e c a u s et h e a m o u n t s o f RNA r e c o v e r e d f r o m t h e c e r v i c a l t u m o r w e r es m a l l , t h e p r o l o n g e d h y b r i d i z a t i o n o f v i r a l DNA w i t h c e r v i c a lR N A p e r m i t t e d D N A - D N A h y b r i d s t o f o r m . We t h e r e f o r ee x a m i n e d t h e 5 d i f f e r e n c e a t t h e p l a t e a u l e v e l ( F i g . 1 ) b e -t w e e n t h e amount o f h y b r i d f o r m e d i n t h e p r e s e n c e o f c e r v i c a lt u m o r RNA a n d i n t h e p r e s e n c e o f H E p - 2 R N A to a s c e r t a i nt h a t i t i s n o t d u e t o D N A - D N A h y b r i d i z a t i o n , a n d t h r e e s e t so f d ata b e a r o n t h i s p o i n t . F i r s t , i d e n t i c a l n e t h y b r i d i z a t i o n( 5 a b o v e c o n t r o l ) w a s o b t a i n e d w i t h t h r e e d i f f e r e n t p r e p a r a -t i o n s o f p u r i f i e d i n v i v o - l a b e l e d DNA d i f f e r i n g w i d e l y i n s p e c i f i ca c t i v i t y a n d , t h e r e f o r e , i n c u b a t e d a t d i f f e r e n t DNA C o t t or e a c h t h e R o t v a l u e s . T h e n e t a m o u n t s o f h y b r i d w e r e , t h e r e -f o r e , i n d e p e n d e n t o f th e DN p r e p a r a t i o n a n d o f t h e a m o u n t so f DNA u s e d i n t h e s e t e s t s . S e c o n d , t h e s a m e amount o fh y b r i d f o r m e d w h e n R o t a n d DNA c o n c en t ra t i o n w e r e k e p tc o n s tant , b u t th e d u r a t i o n o f h y b r i d i z a t i o n t a n d RNA c o n -c e n t r a t i o n R W w e r e v a r i e d s o as t o v a r y t h e e x t e n t o f v i r a lD N A - D N A h y b r i d f o r m e d . L a s t l y , c o n c l u s i v e e v i d e n c ee m e r g e d f r o m an a n a l y s i s o f t h e h y b r i d f o r m e d i n t h e p r e s e n c eo f c e r v i c a l t u m o r R N A. B r i e f l y , 4 . 6 . u g o f DNA w i t h a s p e c i f i ca c t i v i t y o f 1 2 , 0 0 0 c p m / u g w e r e h y b r i d i z e d w i t h c e r v i c a lt u m o r R N A t o a R o t o f 1 0 0 0 . T h e s a m e amount o f DNA wash y b r i d i z e d w i t h a n i d e n t i c a l c o n c e n t r a t i o n o f u n i n f e c t e dH E p - 2 R N A f o r t h e s a m e i n t e r v a l . The a m o u n t o f h y b r i df o r m e d i n t h e p r e s e n c e o f u n i n f e c t e d H E p - 2 RN i n d i c a t e dt h a t , o f t h e t o t a l DNA h y b r i d f o r m e d i n t h e p r e s e n c e o f c e r v i -c a l t u m o r R N A ( 4 5 o f i n p u t ) , 8 8 w a s i n D N A - D N A h y -b r i d a n d 1 2 i n D N A - R N A h y b r i d . T h e h y b r i d f o r m e d i n t h ep r e s e n c e o f c e r v i c a l t u m o r RNA w a s d i g e s t e d w i t h N e u r o s p o r a

I I

P r o c . N at . A ca d. S c i . USA 6 9 ( 1 9 7 2 )


4/6

H e r p e s S i m p l e x 2 DNA F r a g m e n t 3 7 8 7c r a s s a n u c l e a s e , d e n a t u r e d w i t h 0 . 3 M N a OH f o r 1 0 h r t oh y d r o l i z e t h e R NA , t h e n d i a l y z e d a g a i n s t h y b r i d i z a t i o nb u f f e r . T h e DNA r e c o v e r e d a f t e r a l k a l i t r e a t m e n t w a s t h e n h y -b r i d i z e d a g a i n w i t h RNA e x t r a c t e d f r o m c e r v i c a l t u m o r a n df r o m u n i n f e c t e d H E p - 2 c e l l s ( T a b l e 1 . S i n c e t h i s DNA w a se n r i c h e d w i t h v i r a l DNA s e q u e n c e s tr an s c r i b e d i n t h e c e r v i c a lt u m o r , we c o u l d p r e d i c t ( l e g e n d t o T a b l e 1 ) t h a t t h e d i f f e r e n c eb e t w e e n t h e a m o u n t o f h y b r i d f o r m e d i n t h e p r e s e n c e o f c e r v i -c a l t u m o r RNA a n d i n t h e p r e s e n c e o f H E p - 2 RNA s h o u l d b e1 4 . 6 . T h e a c t u a l d i f f e r e n c e w a s 1 4 . 4 . W e c o n c l u d e t h a tt h e a m o u n t o f v i r a l DNA t r a n s c r i b e d i n t h e t u m o r i s 5 , i . e . ,c o n s i d e r a b l y l e s s t h a n i n p r o d u c t i v e l y i n f e c t e d c e l l s .

A m o u n t a n d G e n e t i c C o m p l e x i t y o f V i r a l DNA P r e s e n t i nC e r v i c a l T u m o r D N A. W e c o m p a r e d t h e r a t e s o f r e a s s o c i a t i o no f H S V - 2 DNA l a b e l e d i n v i t r o i n t h e p r e s e n c e o f v a r i o u sa m o u n t s o f c e r v i c a l t u m o r a n d H E p - 2 D NA. I n t h e f i r s t s e r i e so f h y b r i d i z a t i o n s , l a b e l e d H S V - 2 DNA w a s h y b r i d i z e d w i t h as i n g l e c o nc e ntr at i o n o f c e r v i c a l t u m o r DNA a n d w i t h a ne q u i v a l e n t amount o f H E p - 2 DNA f o r v a r i o u s i n t e r v a l s . I nt h e s e c o n d s e r i e s o f e x p e r i m e n t s , c e r v i c a l t u m o r DNA a n dH E P - 2 DNA w e r e m i x e d i n v a r i o u s p r o p o r t i o n s s o t h at t hef i n a l c o n c e n t r a t i o n o f DNA w a s c o n s t a n t . T h e s e w e r e t h e nm i x e d w i t h l a b e l e d DNA a n d a l l o w e d t o h y b r i d i z e f o r v a r i o u sl e n g t h s o f t i m e .I n g e n e r a l , t h e r e a s s o c i a t i o n o f DNA f o l l o w s s e c o n d - o r d e rr e a c t i o n k i n e t i c s a n d i s p r e d i c t e d b y t h e r e l a t i o n s h i p ( 2 2 ) :D t / D o = 1 / ( 1 + K C o t ) , w h e r e D t / D o i s t h e f r a c t i o n o f s i n g l e -st ra n ded DNA r e m a i n i n g a f t e r h y b r i d i z a t i o n f o r t i m e t , C Oi s th e c o n c e n t r a t i o n o f DNA i n m o l n u c l e o t i d e / l i t e r , a n d Ki s a c o n s tant . A p l o t o f D o / D t a g a i n s t t s h o u l d y i e l d a s t r a i g h tl i n e w i t h a n i n t e r c e p t o f 1 a n d h a v i n g a s l o p e p r o p o r t i o n a l t oC O . T h e r e s u l t s o f h y b r i d i z a t i o n s t u d i e s a r e s h o w n i n F i g . 2 a sa s e r i e s o f p l o t s o f D o / D t aga i n s t t f o r e a c h c o n c e n t r a t i o n o fc e r v i c a l t u m o r DNA t e s t e d . T h e i n v i t r o l a b e l e d DNA i n t h ep r e s e n c e o f HEp-2 DNA a l o n e h y b r i d i z e s at a c o n s t a n t r a t ec o n s i s t e n t w i t h t h e k i n e t i c c o m p l e x i t y o f HS V DNA ( 2 0 )e x c e p t t h a t , u n l i k e H S V - 1 DNA, H S V - 2 DNA h a s a s m a l lamount o f r e p e t i t i v e s e q u e n c e s t h at c a u s e t h e i n t e r c e p t ( F i g .2 ) t o b e 1 . 1 9 8 i n s te ad o f 1 . 0 . T h i s a p p e a r s t o b e a ge ne r a lc h a r a c t e r i s t i c o f H S V - 2 D NA , s i n c e s i m i l a r k i n e t i c s w e r e o b -t a i n e d w i th t w o DNA p r e p a r a t i o n s l a b e l e d i n v i v o . The p o i n t sf o r t h e l a b e l e d D N A , h y b r i d i z e d i n t h e p r e s e n c e o f c e r v i c a lt u m o r DNA , i n i t i a l l y f o r m a s t r a i g h t l i n e w i t h t h e s a m e i n t e r -c e p t , b u t l a t e r l e v e l o f f a n d u l t i m a t e l y a p p e a r t o i n t e r c e p tt h e l i n e r e p r e s e n t i n g t h e h y b r i d i z a t i o n k i n e t i c s o f t h e l a b e l e dDNA i n t h e p r e s e n c e o f HEp-2 DNA a l o n e . T h e r e s u l t s i m p l yt h a t o n l y a p o r t i o n o f t h e v i r a l DNA i s p r e s e n t i n t h e t u m o rc e l l s , a n d t h a t a f t e r t h i s p o r t i o n o f t h e DNA w a s e x h a u s t e dt h e h y b r i d i z a t i o n o f l a b e l e d DNA de c e l e ra t e d t o t h at o b -s e r v e d i n t h e a b s e n c e o f v i r a l DNA p r e s e n t i n t h e t u m o r .W e may c a l c u l a t e t h e a m o u n t o f v i r a l DNA i n t h e t u m o r b ys u b s t i t u t i n g i n t h e g en e ra l e q u a t i o n f o r DNA-DNA h y b r i d i -z a t i o n s t h e o b s e r v e d 1 . 1 9 8 i n t e r c e p t i n p l a c e o f t h e 1 . 0 i n t e r -

c e p t a n d b y r e w r i t i n g t h e e q u a t i o n as[ ( D o / D t ) - 1 . 1 9 8 ] - t - 1 = K C o [ 2 ]

S i n c e th e v i r a l DNA i n t h e h y b r i d iz a t i o n t e s t c o m e s f r o m t w os o u r c e s , i . e . , t h e l a b e l e d DNA a n d t h a t f r a c t i o n o f t h e c e r v i c a lt u m o r DNA t h a t i s v i r a l , t h e e q u a t i o n b e c o m e s[ ( D o / D t ) - 1 . 1 9 8 ] . t - = K C o 0 + K f C o C [ 3 ]

2 . 5

2 . 0

1 . 5

1 . 0

0 . 5

O 0

VI S0 0 . 5 1 . 0 1 . 51 o 2 . c

F I G . 3 . C a l c u l a t i o n o f th e r a t i o o f H S V - 2 DNA t o c e r v i c a lDNA i n t h e c e r v i c a l t u m o r . T h e d a t a i n t h e i n i t i a l , l i n e a r p o r -t i o n s o f t h e p l o t s s h o w n i n F i g . 2B w e r e p l o t t e d a s [ ( D o / D t ) -1 . 1 8 9 ] t - a g a i n s t t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e c e r v i c a l t u m o r DNAi n t h e h y b r i d i z a t i o n m i x t u r e . T h e l i n e i s a c o m p u t e r p l o t f i t t e db y a l i n e a r r e g r e s s i o n . T h e r a t i o f o f v i r a l DNA t o t u m o r - c e l lDNA w a s c a l c u l a t e d f r o m E q . [ 3 ] . T h e c a l c u l a t e d i n t e r c e p t f o rt h e l i n e i s ( 4 . 5 i 0 . 5 ) X 1 0 - 7 s e c 1 - . S i n c e C n v i s 4 . 1 1 X 1 0 - 8m o l n u c l e o t i d e - l i t e r - 1 a n d th e c a l c u l a t e d v a l u e s f o r K = h SD i s( 1 0 . 9 7 1 . 0 7 ) - l i t e r - m o l n u c l e o t i d e 1l see' a n d t h e s l o p e o f t h el i n e i s t a n d a r d d e v i a t i o n i s ( 1 . 1 2 0 . 0 8 2 ) X 1 0 - 4 , t h e v a l u e o ff i s ( 1 . 0 2 0 . 1 7 ) X 1 0 - 5 . The v a l u e s f o r t h e i n t e r c e p t a n d t h es l o p e a r e s i g n i f i c a n t w i t h i n 95 c o n f i d e n c e l e v e l s . T h e a p p a r e n ts c a t t e r o f t h e p o i n t s i n th e p l o t i s d u e t o t h e e x t r e m e s e n s i t i v i t yo f t h i s t y p e o f p l o t .w h er e f i s t h e m o l a r r a t i o o f n u c l e o t i d e s i n v i r a l DNA t on u c l e o t i d e s i n c e l l u l a r DNA i n t h e c e r v i c a l t u m o r , C O W a n dG ar e t h e c o n c en t ra t i o n s o f v i r a l DNA l a b e l e d i n v i t r o a n dc e r v i c a l t u m o r D N A, r e s p e c t i v e l y , i n t h e h y b r i d i z a t i o n m i x -t u r e . f may b e c a l c u l a t e d f r o m a p l o t o f [ ( D o / D t ) - 1 . 1 9 8 ] ta g a i n s t C o a n d b y c a l c u l a t i o n o f t h e v a l u e o f K f r o m t h ei n t e r c e p t K C O V . T h e p l o t b a s e d o n i n i t i a l , a s c e n d i n g p o i n t s i nF i g . 2B y i e l d e d a s t r a i g h t l i n e ; t h e v a l u e o f f c a l c u l a t e d f r o mt h i s p l o t ( F i g . 3 ) i s ( 1 . 0 2 0 . 1 7 ) X 1 0 - 5 . C a l c u l a t i o n o f t h en u m b e r o f v i r a l DNA m o l e c u l e s p e r c e l l h i n g e s on t h e c o n t e n to f DNA i n t h e t u m o r c e l l s , w h i c h r a n g e s f r o m 6 p , p e r n o r m a lc e l l ( 2 3 ) to 7 p g p e r HeLa c e l l ( 2 4 ) , w h i c h o r i g i n a t e d f r o m ac e r v i c a l t u m o r . From t h e m o l e c u l a r w e i g h t o f H S V - 2 DNA[ ( 9 9 5 ) X 1 0 6 ] a n d t h e c o r r e c t i o n f a c t o r ( 0 . 8 ) f o r t h e f r a c -t i o n o f t u m o r c e l l s i n t h e t u m o r t i s s u e , we c a l c u l a t e t h a t t h ea v e r a g e n u m b e r o f v i r a l DNA m o l e c u l e s p e r t u m o r c e l l r a n g e sf r o m 1 ( h e t e r o p l o i d c e l l ) t o 3 . 5 ( d i p l o i d c e l l ) .T h e g e n e t i c c o m p l e x i t y o f t h e DNA f r a g m e n t p r e s e n t i n t h et u m o r e m e r g e s f r o m t h e r e g i o n o f th e p l o t a t w h i c h t h e h y -b r i d i z a t i o n b e g i n s t o d e v i a t e f r o m t h e s t r a i g h t l i n e s r e p r e s e n t -i n g t h e i n i t i a l r a t e s . T h e d a t a ( T a b l e 2 ) i n d i c a t e t h a t t h et u m o r c o n t a in s a u n i q u e f r a g m e n t c o n s t i t u t i n g a b o u t 3 9 ,

i . e . , 3 9 X 1 0 6 d a l t o n s , o f t h e HSV-2 DNA m o l e c u l e .V i r a l DNA S e q u e n c e s i n R e a s s o c i a t e d H o s t DNA R e p e t i t i v eS e q u e n c e s . T h i s e xp e ri me nt w as l i m i t e d b y t h e a m o u n t o fc e r v i c a l t u m o r DNA r e c o v e r e d a f t e r r e a s s o c i a t i o n u n d e r t h es t r i n g e n t c o n d i t i o n s u s e d a n d a f t e r e l u t i o n f r o m h y d r o x y a p a -t i t e w i t h 0 . 4 M W p h o s p h a t e b u f f e r . B r i e f l y , v i r a l DNA l a b e l e di n v i t r o w a s m i x e d w i t h r e a s s o c i a t e d c e r v i c a l t u m o r DNA a n dw i t h e x a c t l y t h e s a m e a m o u n t o f u n f r a c t i o n a t e d c e r v i c a lt u m o r DNA , a n d h y b r i d i z e d t o r e l a t i v e l y l o w C o t l e v e l s . iA t l o w C o t l e v e l s ( F i g . 4 ) th e a m o u n t o f h y b r i d f o r m e d i n t h e

p r e s e n c e o f r e a s s o c i a t e d t u m o r c e l l DNA w a s c o n s i s t e n t l y

P r o c . N at . A c a d . S c i . USA 6 9 1 9 7 2

00to0 )O D

0 1 a 00


5/6

3 7 8 8 M e d i c a l S c i e n c e s : F r e n k e l e t a l .1 . 3

1 . 2

1 . 1 -

~ ~ ~A - n g ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 00 10 2 0 3 0 40H o u r s

F I G . 4 . I n i t i a l r a t e s o f h y b r i d i z a t i o n o f i n v i t r o - l a b e l e d HSV- 2DNA i n t h e p r e s en c e o f a f a s t r e a s s o c i a t i n g f r a c t i o n o f t u m o r - c e l lD N A. HSV-2 [ 3 H ] DNA ( 9 n g / m l ) was h y b r i d i z e d i n t h e presenceo f s o n i c a t e d tumor DNA ( 0 . 4 2 m g / m l ) r e a s s o c i a t e d and e l u t e df r o m h y d r o x y a p a t i t e as d e s c r i b e d i n t h e t e x t ( o p e n c i r c l e s ) , and i nt h e p r e s e n c e o f s o n i c a t e d u n f r a c t i o n a t e d c e r v i c a l tumor DNA( 0 . 4 2 m g / m l ) ( c l o s e d c i r c l e s ) . The l o w e r i n t e r c e p t as compared t ot h a t s h o w n i n F i g . 2 i s d u e t o t h e f a c t t h a t we are e x a m i n i n g ar e l a t i v e l y l o w C o t reg i o n .h i g h e r t h a n i n t h e p re sence o f c e r v i c a l tumor D N A , i nd i c at i ngb o t h t h e p r e s en c e a n d some e n r i c h m e n t o f v i r a l DNA s e-quences i n t h e r e a s s o c i ate d D N A . i i A t 4 0 0 h r ( n o t s h o w n )t h e e x t e n t o f t h e h y b r i d f o r m e d i n t h e p r e s en c e o f reasso-c i a t e d DNA was t h e same as i n t h e p r e s en c e o f u n f r a c t i o n a t e dD N A , i n d i c a t i n g no e n r i c h m e n t . The e n r i c h e d s equ en c es a r i s ef r o m a b o u t 20 o f t o t a l HSV-2 D N A .

D I SCU S S I O NV i r u s - S p e c i f i c RNA S e q u e n c e s . The t u m o r c o nta i n s t r a n -s c r i p t s a r i s i n g f r o m 5 o f v i r a l D N A . T h i s amount o f DNA i s

c o n s i d e r a b l y l e s s t h a n t h a t tr an s c r i b e d i n p r o d u c t i v e l y i n -f e c t e d HEp-2 c e l l s e i t h e r e a r l y ( 2 1 ) o r l a t e ( 5 0 ) i n i n f e c -t i o n a n d much l e s s t h a n t h a t r e q u i r e d t o s p e c i f y s t r u c t u r a lp r o t e i n s ( 2 1 , 2 5 ) . T w o p o i n t s b e a r on t h es e d at a : i H S V - 2 ,l i k e a l l o t h e r h e r p e s v i r u s e s , n o r m a l l y k i l l s t h e p r o d u c t i v e l yi n f e c t e d c e l l ( 2 ) . Most o f t h e c y t o l y t i c f u n c t i o n s o f t h e v i r u s ,i . e . , i n h i b i t i o n o f h o s t DNA a n d p r o t e i n s y n t h e s i s a n d a l t e r -a t i o n o f h o s t RNA m e t a b o l i s m , e t c . ar e e a r l y f u n c t i o n s .C l e a r l y i f t h e i n f e c t e d h o s t i s t o s u r v i v e , t h e f u n c t i o n s ex-p r e s s e d b y t h e v i r u s s h o u l d b e f e w e r t h a n t h o s e e x p r e s s e de a r l y i n p r o d u c t i v e i n f e c t i o n . ( i i ) T h e s e c o n d p o i n t concernst h e n a t u r e o f t h e v i r a l f u n c t i o n s e x p r e s s e d i n t h e c e r v i c a lt u m o r . We do n o t know what t h e s e f u n c t i o n s a r e , but t wop r e l i m i n a r y f i n d i n g s ar e o f i n t e r e s t . F i r s t , a f r a c t i o n o f t h ev i r a l DNA t e m p l a t e t r a n s c r i b e d i n t h e c e r v i c a l t u m o r c e l l si s a l s o t r a n s c r i b e d e a r l y i n p r o d u c t i v e i n f e c t i o n o f HEp-2c e l l s w i t h H S V - 2 . S e c o n d , a b o u t h a l f o f t h e v i r a l DNAt e m p l a t e t r a n s c r i b e d i n t h e c e r v i c a l tumor b e l o n g s t o t h e s e to f sequences t h a t ar e s h a r e d i n common b e t w e e n HSV-1 andHSV-2 ( 1 2 , 2 6 ) .HSV-1 and HSV-2 d i f f e r i n t h e amount o f DNA t r a n s c r i b e de a r l y i n p r o d u c t i v e i n f e c t i o n o f HEp-2 c e l l s . T h u s , a t 2 h ra f t e r i n f e c t i o n w i t h HSV-1 4 4 o f t h e DNA i s t r a n s c r i b e d( 2 0 ) , w h e r e a s o n l y 2 1 o f DNA i s t r a n s c r i b e d e a r l y i n c e l l si n f e c t e d w i t h H S V - 2 . The s i g n i f i c a n c e o f t h i s d i f f e r e n c e , p a r -t i c u l a r l y w i t h r e s p e c t t o t h e somewhat h i g h e r o n c o g e n i c p o -t e n t i a l o f H S V - 2 , i s n o t c l e a r .

C h a r a c t e r i s t i c s o f V i r a l DNA P r e s e n t i n t h e T u m o r . DNA-DNA h y b r i d i z a t i o n s i n d i c a t e t h a t o n l y 39 o f t h e v i r a l g e -nome i s i n t h e t u m o r c e l l s . S i n c e o n l y a f r a g m e n t o f t h e DNAi s p r e s e n t i n t h e t u m o r t i s s u e , f r o m 1 t o a maximum o f 3 . 5 f r a g -

m e n t s p e r c e l l , we c a n c o n c l u d e t ha t t he f r a g m e n t a ro se a s ac o n s e q u e n c e o f a s i n g l e e v e n t o f i n f e c t i o n e i t h e r b e f o r e o r a f t e rt h e c e l l b e c a m e m a l i g n a n t . I n f e c t i o n o f human c e l l s c u l t i v a t e di n v i t r o w i t h HSV-2 i s i nv a ri a bl y p r o d u ct i v e, a n d i n a c u t ei n f e c t i o n t h e v i r u s r e a d i l y m u l t i p l i e s i n c e r v i c a l t i s s u e s . An o n p r o d u c t i v e i n f e c t i o n c o u l d a r i s e a s a c o ns e q u e nc e o f i n f e c -t i o n b y a d e f e c t i v e v i r u s o r as a r e s u l t o f i n f e c t i o n o f a n o n -p e r m i s s i v e c e l l w i t h v i r u s c a p a b l e o f m u l t i p l y i n g i n p e r m i s s i v ec e l l s . W h i l e we c a nn o t e xc lu d e t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e c e r v i xc o n t a i n s r e s t r i c t i v e o r n o n p e r m i s s i v e c e l l s t h a t p r e c l u d e t h ee x p r e s s i o n o f many v i r a l f u n c t i o n s a n d s u r v i v e , a n a t t r a c t i v ea l t e r n a t i v e i s t h a t n o n p r o d u c t i v e i n f e c t i o n s i n w h i c h t h e v i r a lg e n o m e i s p e r p e t u a t e d w i t h o u t c e l l d e s tr u c t i o n a r i s e s a l s o , i fn o t e x c l u s i v e l y , f r o m i n f e c t i o n w i t h p a r t i c l e s c a r r y i n g d e f e c -t i v e g e no m e s. T r a ns f o r ma ti o n o f s u s c e p t i b l e c e l l s i n v i t r o ( 9 )b y H S V - 2 w a s a c c o m p l i s h e d o nl y w it h U V - i r r a d i a t e d v i r u s ,and , to o u r k n o w l e d g e , i n f e c t i o u s v i r u s c a n n o t b e i s o l a t e dr o u t i n e l y a n d w i t h e a s e f r o m c e r v i c a l t u m o r t i s s u e s o r c e l lc u l t u r e s .

V i r a l DNA S e q u e n c e s L i n k e d t o H i g h l y R e p e t i t i v e H o s t S e -q u e n c e s . W e w a n t e d t o d e t e r m i n e w h e t h e r v i r a l DNA a n d h o s tDNA a r e c o v a l e n t l y l i n k e d . T h e c h o i c e o f e x p e r i m e n t a l t e c h -n i q u e w a s b a s e d o n t h e o b s e r v a t i o n t h a t H S V - 1 a n d HSV-2c o nta i n a l k a l i - l a b i l e b o n d s ( 1 1 , 2 7 ) . S i n c e t he n at ur e o f t h e s eb o n d s i s n o t c l e a r , we c h o s e a n a l t e r n a t i v e t o t h e c l a s s i c a lt e c h n i q u e o f l o o k i n g f o r v i r u s - s p e c i f i c s e q u e n c e s i n h i g h m o l e c-u l a r w e i g h t DNA o b t a i n e d b y s e d i m e n t a t i o n o f t u m o r DNAi n a l k a l i n e d e n s i t y g r a d i e n t s . W e l o o k e d f o r v i r a l DNA s e -q u e n c e s i n t u m o r c e l l DNA r e a s s o c i a t e d u n d e r c o n d i t i o n sd e s i g n e d t o e x c l u d e , b y a w i d e m a r g i n , t h e r e a s s o c i a t i o n o f t h ev i r a l D N A . T h e r e a s s o c i a t e d c e l l DNA c o n s i s t s m o s t l y o fh i g h l y r e p e t i t i v e s e q u e n c e s . T h e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e r e -a s s o c i a t e d c e r v i c a l t u m o r DNA c o n t a in s v i r a l s e q u e n c e s t h a tv a r y i n t h e s e n s e t h a t s o m e a r e p r e s e n t i n l a r g e r a m o u n t s t h a no t h e r s . A t r i v i a l e x p l a n a t i o n o f t h e d ata i s t h a t v i r a l s e q u e n c e sa r e f r a g m e n t e d a n d t h a t some o f t h e s e s e q u e n c e s a r e c o v a -l e n t l y l i n k e d t o h o s t r e p e t i t i v e s e q u e n c e s . A m o r e l i k e l y e x -p l a n a t i o n i s t h a t f r a g m e n t a t i o n o f t u m o r - c e l l DNA d i d o c c u r ,p a r t i c u l a r l y d u r i n g h e a t d e n at u r a ti o n o f t h e DNA a t 1 1 5 0 f o r

TABLE 2 . G e n e t i c c o m p l e x i t y o f HSV-2 DNAi n t h e c e r v i c a l t u m o rC o n c e n t r a t i o n( m g / m l ) o f c e r v i c a lt u m o r DNA i n o fh y b r i d i z a t i o n Time DNA i nm i x t u r e ( h r ) D o / D t h y b r i d

F i g . 2 A3 . 2 6 4 3 . 4 1 . 6 7 4 0 . 1 68 3 . 2 1 . 8 2 4 4 . 9 9F i g . 2 B5 . 0 0 4 6 . 3 1 . 6 1 3 8 . 0 47 8 . 1 1 . 6 7 4 0 . 0 4

3 . 2 6 7 8 . 1 1 . 6 1 3 7 . 8 71 1 9 . 1 1 . 6 5 3 9 . 2 6

1 . 7 4 9 6 1 . 5 6 3 5 . 9 31 1 9 . 1 1 . 6 2 3 8 . 1 3

A v e r a g e o f v i r a l g e n o m e i n tumor 3 9 . 3 0T h e p o i n t s u s e d i n t h e s e c a l c u l a t i o n s a r e t h e f i r s t two p o i n t si n t h e p o r t i o n w h e r e t h e c u r v e d e v i a t e s f r o m th e i n i t i a l r a t e .

P r o c . N a t . A c a d . S c i . USA 6 9 ( 1 9 7 2 )


6/6

H e r p e s S i m p l e x 2 DNA F r a g m e n t 3 7 8 97 m i n , t h a t th e v i r a l s e q u e nc e s t h at r e m a i n e d l i n k e d t o r e p e t i -t i v e s e q u e n c e s w e r e t h o s e n e ar t h e e n d s o f t h e v i r a l DNAm o l e c u l e , a n d t h a t t h e p r o b a b i l i t y o f v i r a l s e q u e n c e s r e m a i n i n gc o v a l e n t l y l i n k e d t o h o s t DNA d e c r e a s e d i n p r o p o r t i o n t ot h e i r d i s t a n c e f r o m t h e e n d s . W e c a n n o t d i s c r i m i n a t e b e t w e e nt h e s e t w o p o s s i b i l i t i e s , b u t t h e d a t a d o a r g u e t h a t a t l e a s t s o m eo f t h e v i r a l s e q u e n c e s a r e c o v a l e n t l y l i n k e d t o r e p e t i t i v e s e -q u e n c e s o f h o s t D N A .

R e l a t i o n s h i p B e t w e e n HSV-2 a n d C e r v i c a l T u m o r s . T h i s i st h e f i r s t d e m o n s t r a t i o n o f v i r a l D N A, v i r a l R NA , a n d o fc o v a l e n t l i n k a g e o f v i r a l DNA t o c e l l DNA i n a c e r v i c a l t u m o r .T h e s e d a t a w o u l d b e p r e d i c t e d i f t h e v i r u s c au s es t h e t u m o r ,b u t i n t h e m s e l v e s d o n o t e x c l u d e t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e p r e s -e n c e o f t h e v i r a l g e n o m e i s u n r e l a t e d t o t h e t r a n s f o r m i n ge v e n t t h a t l e d t o t h e t u m o r . W h i l e m o r e t u m o r s , b o t h n a t u r a la n d e x p e r i m e n t a l , s ho ul d b e a n a l y z e d , d i r e c t p r o o f o f t h ec a u s a l r e l a t i o n may u l t i m a t e l y e m e r g e o n l y f r o m a n a l y s i s o fp o p u l a t i o n s p r o t e c t e d f r o m a c q u i r i n g i n f e c t i o n w i t h HSV-2 5 .

W e t h a n k D r . S . S i l v e r s t e i n f o r p r e p a r a t i o n o f N e u r o s p o r ac r a s s a n u c l e a s e , D r s. M. Noyayama a n d J . P a g a n o f o r t he p ro -c e d u r e f o r l a b e l i n g DNA i n v i t r o , a n d D r . E . F r a n k l i n f o r h i s a s -s i s t a n c e i n o b ta i ni n g t h e t u m o r . T h e s t u d i e s d o n e a t t h e U n i v e r -s i t y o f C h i c a g o w er e a id ed b y g r a n t s f r o m U n i t e d S t a t e s P u b l i cH e a l t h S e r v i c e ( C A 0 8 4 9 4 ) , t h e A m e r i c a n C a n c e r S o c i e t y (V C1 0 3 H ) , a n d t he N a ti o na l S c i e n c e F o u n d a t i o n (GB 2 7 3 5 6 X ) . Thes t u d i e s d o n e at Emory U n iv e r si ty S c h oo l o f M e d i c i n e w e r e a i d e db y a g r a n t f r o m t h e A m e r i c a n C a n c e r S o c i e t y . N . F . w a s a p o s t -d o c t o r a l f e l l o w s u p p o r t e d b y W h i t e h a l l F o u n d a t i o n . E . C . w a s af e l l o w o f t h e I n t e r n a t i o n a l A g e n c y f o r R e s e a r c h o n C a n c e r , L y o n ,F r a n c e .1 . R o i z m a n , B . , S p e a r , P . G . K i e f f , E . D . ( 1 9 7 2 ) i n P e r s p e c -t i v e s i n V i r o l o g y , e d . P o l l a r d , M. ( A c a d e m i c P r e s s , N e wY o r k , V o l . V I I I , p p . 1 2 9 - 1 6 9 .2 . R o i z m a n , B . ( 1 9 7 2 ) i n O n c o g e n e s i s a n d H e r p e s u i r u s e s , e d s .B i g g s , P . M . , d e T h e , G . P a y n e , L . N . ( I n t . A g e n c y f o rR e s . o n C a n c e r , L y o n ) , p p . 1 - 2 1 .3 . N a h m i a s , A . J . , N a i b , Z . M. J o s e y , W. E . ( 1 9 7 0 ) i n P e r -s p e c t i v e s i n V i r o l o g y , e d . P o l l a r d , M. ( A c a d e m i c P r e s s , N e wY o r k ) , V o l . V I I , p p . 7 3 - 8 9 .

4 . N a i b , Z . M . , N a h m i a s , A . J . J o s e y , W. E . ( 1 9 6 6 ) C a n c e r1 9 , 1 0 2 6 - 1 0 3 0 .5 . N a h m i a s , A . J . , N a i b , Z . M. J o s e y , W. E . ( 1 9 7 2 ) i nO n c o g e n e s i s a n d H e r p e s v i r u s e s , e d s . B i g g s , P . W . , d e T h e ,G . P a y n e , L . N . ( I n t . A g e n c y f o r R e s . o n C a n c e r , L y o n ) ,p p . 4 0 3 - 4 0 8 .6 . R a w l s , W . E . , T o m p k i n s , W. A . F . M e l n i c k , J . L . ( 1 9 6 9 )A m e r . J . E p i d e m i o l . 8 9 , 5 4 7 - 5 5 4 .7 . R o y s t o n , I . A u r e l i a n , L . ( 1 9 7 0 ) P r o c . N a t . A c a d . S c i . USA6 7 , 2 0 4 - 2 1 2 .8 . N a h m i a s , A . J . , N a i b , Z . M . , J o s e y , W. E . , M u r p h y , F . A . L u c e , C . F . ( 1 9 7 0 ) P r o c . S o c . E x p . B i o l . M e d . 1 3 4 , 1 0 6 5 -1 0 6 9 .9 . D u f f , R . R a p p , F . ( 1 9 7 1 ) J . V i r o l . 8 , 4 6 9 - 4 7 7 .1 0 . R a b i n , F . Z . , P r e i s s , B . F r a s e r , M. J . ( 1 9 7 1 ) P r e p . B i o -c h e m . 7 , 2 8 3 - 3 0 7 .1 1 . K i e f f , E . D . , B a c h e n h e i m e r , S . L . R o i z m a n , B . ( 1 9 7 1 ) J .V i r o l . 8 , 1 2 5 - 1 3 2 .1 2 . K i e f f , E . D . , H o y e r , B . , B a c h e n h e i m e r , S . L . R o i z m a n , B .( 1 9 7 2 ) J . V i r o l . 9 , 7 3 8 - 7 4 5 .1 3 . L e e , S . Y . , M e n d e c k i , J . B r a v e r m a n , G . ( 1 9 7 1 ) P r o c . N a t .A c a d . S c i . USA 6 8 , 1 3 3 1 - 1 3 3 8 .1 4 . B a c h e n h e i m e r , S . L . R o i z m a n , B . ( 1 9 7 2 ) J . V i r o l . , i np r e s s .1 5 . N o n o y a m a , M. P a g a n o , J . S . ( 1 9 7 2 ) N a t u r e , i n p r e s s .1 6 . W e t m u r , J . G . D a v i d s o n , N . ( 1 9 6 8 ) J . M o l . B i o l . 3 1 , 3 4 9 -3 7 0 .

1 7 . B r i t t e n , R . J . S m i t h , J . ( 1 9 7 0 ) C a r n e g i e I n s t . W a s h i n g t o nY e a r b . 6 8 , 3 7 8 - 3 8 9 .1 8 . B r i t t e n , R. J . ( 1 9 6 9 ) C a r n e g i e I n s t . W a s h i n g t o n , Y e a r b . 6 7 ,3 2 7 - 3 3 0 .1 9 . S a u n d e r s , G . F . , S h i r a k a w a , S . , S a u n d e r s , P . P . , A r r i g h i , F .E . H s u , T . C . ( 1 9 7 2 ) J . M o l . B i o l . 6 3 , 3 2 3 - 3 3 4 .2 0 . F r e n k e l , N . R o i z m a n , B . ( 1 9 7 1 ) J . V i r o l . 8 , 5 9 1 - 5 9 3 .2 1 . F r e n k e l , N . R o i z m a n , B . ( 1 9 7 2 ) P r o c . N a t . A c a d . S c i . U SA6 9 , 2 6 5 4 - 2 6 5 8 .2 2 . B r i t t e n , R . J . ( 1 9 6 9 ) C a r n e g i e I n s t . W a s h i n g t o n Y e a r b . 6 7 ,3 3 2 - 3 3 5 .2 3 . L e u c h t e n b e r g e r , C . L e u c h t e n b e r g e r , R . ( 1 9 5 4 ) A m e r . J .P a t h o l . 3 0 , 6 5 - 8 5 .2 4 . L i n , H . J . C h a r g o f f , E . ( 1 9 6 4 ) B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 9 1 ,6 9 1 - 6 9 4 .2 5 . S p e a r , P . G . R o i z m a n , B . ( 1 9 7 2 ) J . V i r o l . 9 , 1 4 3 - 1 5 9 .2 6 . R o i z m a n , B . F r e n k e l , N . ( 1 9 7 2 ) i n M o l e c u l a r B a s i s f o rV i r a l N e o p l a s i a , P r o c 2 5 t h A n n u a l S y m p . o f th e M. D . A n -d e r s o n H o s p i t a l a n d Tumor I n s t i t u t e , i n p r e s s .2 7 . F r e n k e l , N . R o i z m a n , B . ( 1 9 7 2 ) J . V i r o l . , i n p r e s s .

P r o c . N at . A c a d . S c i . US A 6 9 ( 1 9 7 2 )

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A DNA Fragment of Herpes Cacu