repository.usu.ac.id › bitstream › handle › 123456789... · BAB METODE PENELITIAN - repository.usu.ac.idinjeksi streptozotocin 60 mg/kgbb/ekor dosis tunggal serta pemberian

44

BAB 3 METODE PENELITIAN

3.1 Jenis dan Rancangan Penelitian Jenis penelitian adalah eksperimental laboratorik ex vivo, yang dipilih

karena baik sampel maupun perlakuan lebih terkendali, terukur dan

pengaruh perlakuan dapat lebih dipercaya. Rancangan penelitian ini

menggunakan rancangan randomized post test only control group

laboratory experimental design untuk mengetahui efek pemberian

curcuminoid terhadap ekspresi SOD pada fibroblas koklea setiap unit

eksperimen dengan pengukuran variabel yang hanya dilakukan setelah

pemberian perlakuan. Pengambilan sampel dilakukan secara acak dan

ada kontrol pembanding.

3.2 Tempat dan Teknik Pengambilan Data Penelitian 3.2.1 Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan di laboratorium terstandardisasi dan mempunyai

peralatan lengkap serta pengalaman memadai. Pemeliharaan hewan coba

dilakukan di Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas

Airlangga Surabaya, pembuatan sediaan dan teknik pemeriksaan

imunohistokimia dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi RSUD dr.

Soetomo Surabaya.

3.2.2 Teknik Pengambilan Data

Data yang dianalisis dalam penelitian ini merupakan data sekunder dari

sebuah penelitian besar yang dilakukan oleh Tengku Siti Hajar Haryuna

dan dibiayai oleh DIPA Direktorat Penelitian Pengabdian kepada

Masyarakat Tahun Anggaran 2015, sesuai dengan Surat Perjanjian

Penugasan Pelaksanaan Hibah Penelitian bagi Dosen Perguruan Tinggi

Batch I Universitas Sumatera No. 120/SP2H/PL/Dit.Litabmas/II/2015

tanggal 05 Februari 2015.

Universitas Sumatera Utara

45

3.3 Variabel Penelitian

3.3.1 Variabel bebas

Variabel bebas adalah stres hiperglikemik yang didapatkan melalui

injeksi streptozotocin 60 mg/kgbb/ekor dosis tunggal serta pemberian

curcuminoid dengan dosis 200 dan 400 mg/kgbb/ekor/hari selama 5 dan

10 hari.

3.3.2 Variabel terikat

Respon molekuler pada fibroblas berupa ekspresi SOD.

3.3.3 Variabel terkendali

Tikus Rattus norvegicus galur Wistar, jenis kelamin tikus, kandang tikus

terpisah, berat badan tikus, makanan dan minuman tikus, cara pemberian

perlakuan injeksi streptozotocin serta curcuminoid, prosedur penelitian

dan cara pemeliharaan hewan coba.

3.4 Sampel Tikus dipilih menjadi sampel penelitian karena memiliki kemiripan

struktur telinga dalam dengan manusia. Tikus telah digunakan sebagai

model hewan coba untuk penelitian penyakit ketulian genetik manusia dan

terbukti bermanfaat dalam membantu mengidentifikasi gen yang sesuai

pada manusia yang berperan dalam perkembangan sistem auditorius.

Melalui identifikasi genetik dan sekuensnya, tikus dinyatakan homolog

(>70%) dengan manusia (Gravel & Ruben, 1996).

Tikus Rattus norvegicus galur Wistar, jenis kelamin jantan, kondisi

sehat, umur dewasa (2-3 bulan), dengan berat badan 150-250 gram agar

perubahan berat selama penelitian relatif kecil (Hume, et al.,1978).

Sampel penelitian ini menggunakan tikus dengan galur populasi yang

sama, homogen dalam jenis kelamin dan umur, tikus tersebut merupakan

hasil pembiakan (breeding) di Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran

Universitas Airlangga. Perlakuan pada tikus dengan injeksi streptozotocin

dengan dosis tertentu, kemudian diukur variabel penelitian hanya setelah

pemberian perlakuan.


46

Rancangan penelitian memiliki kriteria; pengambilan sampel dilakukan

secara acak, streptozotocin diberikan dalam dosis tertentu sesuai berat

badan tikus, ada kontrol pembanding, dan bersifat double blind.

Selanjutnya data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan uji

variat untuk mencapai tujuan penelitian.

3.4.1 Besar sampel

Besar sampel ditentukan berdasarkan jumlah ulangan yang

dianggap telah cukup baik (Federer, 1955), dengan rumus sebagai

berikut:

Keterangan:

k = jumlah kelompok subyek penelitian (k=6)

r = jumlah ulangan

Perhitungan:

(6-1) (r-1) ≥ 15; 5r-5 ≥ 15; 5r ≥ 20; r ≥ 4

n = r x k; n = 4 x 6 = 24

ditetapkan besar sampel secara keseluruhan yaitu minimal 24 ekor tikus.

3.4.2 Pengelompokan sampel

Berdasarkan rumus di atas maka besar sampel adalah tikus yang

diambil peneliti secara random untuk tiap kelompok perlakuan, sehingga

sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah 24 ekor tikus yang

dibagi menjadi 6 kelompok sebagai berikut:

(k-1) (r-1) ≥ 15)

P1 (Perlakuan 1) K2 (Kelompok 2)

Subyek

P0 (tanpa perlakuan = kontrol) K1 (Kelompok 1)

K2 (Kelompok 2)

R P2 (Perlakuan 2)

P3 (Perlakuan 3)

P4 (Perlakuan 4)

P5 (Perlakuan 5)

K3 (Kelompok 3)

K4 (Kelompok 4)

K5 (Kelompok 5)

K6 (Kelompok 6)


47

K1 : Kelompok kontrol, diberikan injeksi buffer natrium sitrat.

K2 : Kelompok perlakuan diberikan injeksi streptozotocin 60

mg/kgbb/ekor dosis tunggal.

K3 : Kelompok perlakuan dengan injeksi streptozotocin 60

mg/kgbb/ekor dosis tunggal dan pemberian curcuminoid 200

mg/kgbb/ekor/hari selama 5 hari.










3.4.3 Teknik pengambilan sampel

Tikus Rattus norvegicus galur Wistar didapat dari institusi penyedia

yang memiliki kualifikasi standar. Sebelum digunakan sebagai subyek

penelitian, hewan coba dilakukan evaluasi klinis dan dikondisikan dalam

lingkungan yang sesuai (selama 14x24 jam) untuk meyakinkan bahwa

hewan tersebut tidak berpenyakit atau tidak berpotensi menularkan

penyakit.

Sebelum mendapatkan perlakuan penelitian, dilakukan skrining dengan

beberapa kriteria, yaitu:

1. Kriteria inklusi: hewan coba berusia 2-3 bulan, jenis kelamin jantan

dan berat badan 150-250 gram.

2. Kriteria eksklusi:

a. Hewan dinyatakan berpenyakit oleh dokter hewan konsultan, baik

penyakit menular atau tidak menular atau cedera fisik atau berpotensi

menularkan penyakit dalam kurun waktu evaluasi klinis di dalam kondisi

lingkungan yang sesuai (selama 14 x 24 jam).


48

b. Hewan terdeteksi memiliki kelainan bawaan yang dinyatakan oleh dokter

hewan konsultan.

c. Hewan berperilaku agresif, dalam pengamatan sering menyerang

anggota kelompok lain.

Setelah didapatkan sampel yang homogen melalui skrining dengan

kriteria inklusi dan eksklusi di atas, dilakukan pembagian kelompok

sampel yang homogen secara alokasi random sehingga setiap anggota

sampel mempunyai kesempatan sama untuk menempati kelompoknya.

Penelitian berlangsung dengan prosedur pelakuan hewan secara

benar ditinjau dari prinsip 3R (Reduction, Replacement, Refinement) serta

prinsip 5F (Freedom from Hunger and Thirst, Freedom from Discomfort,

Freedom from Pain, Injury or Disease, Freedom to Express Normal

Behaviour, Freedom from Fear and Distress) (FAO, 2011) dan

diberlakukan kriteria Putus Uji apabila subyek penelitian mengalami sakit

atau kematian sehingga tidak bisa memenuhi prosedur penelitian yang

membutuhkan waktu 5 - 10 hari. Selanjutnya tikus diterminasi dan

dilakukan pengambilan jaringan koklea untuk dibuat sediaan dan

pengecatan imunohistokimia untuk menganalisis ekspresi SOD.

3.5 Definisi Operasional Penelitian 1. Induksi Diabetes: injeksi Streptozotocin dengan dosis 60

mg/kgbb/ekor dosis tunggal secara intraperitoneal, kemudian kadar

gula darah diukur 2 hari pasca injeksi, sampai terjadi kondisi

hiperglikemia (KGD >200 mg/dl).

2. Hiperglikemia adalah keadaan dimana kadar gula darah tikus

mencapai >200 mg/dl yang diukur menggunakan strip pengukur kadar

gula darah merk Gluko DR® Bio Sensor dari allmedicus.

3. Fibroblas: sel yang terdapat pada jaringan dinding lateral koklea. Sel

berinti tunggal dalam bentuk yang panjang.

4. Ekspresi SOD diidentifikasi dengan pengecatan imunohistokimia yang

memperlihatkan sel fibroblas berinti tunggal berwarna coklat pada inti

dan sitoplasma pada jaringan dinding lateral koklea tiap kelompok di

bawah mikroskop cahaya yang dilengkapi mikrometer okuler dengan

perbesaran 40x oleh 2 orang pemeriksa (peneliti dan pemeriksa ahli


49

(dokter spesialis Patologi Anatomi)) untuk kemudian dilakukan

penghitungan skor imunoreaktif. Skor imunoreaktif diperoleh dengan

mengalikan skor luas dengan skor intensitas.

Hasil ukur skor imunoreaktif: 0-9.

Dalam penelitian ini digunakan Polyclonal Anti-SOD1 Antibody

catalog#:PA1345 dari Boster Immunoleader.

5. Curcuminoid: zat pigmen kuning yang diekstraksi dari tumbuhan

Curcuma domestica Val. atau Curcuma longa L. Pada penelitian ini

yang digunakan adalah curcuminoid serbuk dengan kadar 80%

curcuminoid standar dari Tradimun. Sediaan yang diberikan berupa

curcuminoid serbuk dengan dosis 200 dan 400 mg/kgbb/hari per ekor

tikus (dengan rerata berat badan tikus adalah 200 mg, maka dalam

penelitian ini dosis yang dipakai adalah 40 dan 80 mg/ekor/hari) karena

berdasarkan literatur dan penelitian terdahulu dosis tersebut dapat

meningkatkan ekspresi SOD.

3.6 Alat dan Bahan Penelitian

3.6.1 Hewan coba yang dikenai perlakuan

Tikus putih jantan Rattus norvegicus galur Wistar yang memenuhi

kriteria inklusi dan eksklusi akan mendapatkan pembagian kelompok

sesuai hasil randomisasi.

3.6.2 Bahan perlakuan

a. Streptozotocin

Streptozotocin disimpan pada suhu 200C. Konsentrasi

streptozotocin adalah 22,5 mg/l, disimpan dalam tabung reaksi

yang ditutup dengan aluminium foil (karena sensitif terhadap

cahaya).

b. Curcuminoid

Curcuminoid yang dipakai berasal dari Curcuma longa L. dengan

kadar curcuminoid (28,1 ± 1,0)% b/b dibandingkan dengan

standar yang distandarisasi menggunakan metode kromatografi

lapisan tipis dan densitometri. Sediaan yang diberikan berupa


50

curcuminoid serbuk dengan dosis 200 dan 400 mg/kgbb/hari

perekor tikus.

c. Buffer natrium sitrat dibuat dengan melarutkan 1,47 gram Natrium

sitrat dalam 50 ml dH2O.

d. Carboxy Methyl Cellulose (CMC) dibuat dengan mensuspensikan

0.5 gram CMC dalam 100 cc larutan akuades.

e. Eter sebagai obat anestesi inhalasi.

3.6.3 Alat dan bahan pemeriksaan laboratorium

Alat yang digunakan pada penelitian ini, antara lain: kandang tikus,

gunting bedah, disposible syringe, mikroskop binokuler, gelas obyek dan

cover glass, mikrotom, tabung reaksi, pipet pasteur steril, tabung silikon,

pipet mikro, beker gelas, NGT no.10, spuit 1 cc, spuit 3 cc, spuit 5 cc dan

lemari es, Gluko DR® Bio Sensor, timbangan, aluminium foil, pot, formalin

10 % untuk fiksasi jaringan.

Untuk Hematoxillin Eosin dan Imunohistokimia meliputi H2O2 3%, xylol,

alkohol 100%, PBS, HCL 0.5 M, antibodi primer SOD dan biotinylated

secondary Ab (anti rabbit), streptavidin berlabel peroksidase, pewarna

Meyer-hematoxilen, TrisHCl pH 6.8, entelen, akuades steril, parafin lunak,

poli-D-lysin, BSA 3%, tripsin 0.025%, substrat DAB.

3.7 Prosedur Penelitian 3.7.1 Tahap persiapan

Untuk menjamin bahwa semua prosedur yang dilakukan pada

penelitian ini laik etik, maka sebelum dilakukan penelitian proposal

diajukan terlebih dahulu pada komisi Etik Fakultas Kedokteran Universitas

Sumatera Utara untuk mendapatkan penilaian dan pengesahan kelaikan

etik.

3.7.2 Prosedur induksi diabetes menggunakan streptozotocin.

a. Tikus dipuasakan selama 4 jam untuk mengosongkan lambung dan

mengurangi risiko aspirasi.

b. Hitung dosis induksi streptozotocin dengan kebutuhan 60 mg/kgbb/ekor

tikus.


51

c. Hitung kebutuhan dapar sitrat yang dibutuhkan dengan konsentrasi

streptozotocin 22,5 mg/ml dalam dapar sitrat.

d. Siapkan tabung dan bungkus dengan aluminium foil pada bagian

luarnya.

e. 15 – 20 menit sebelum induksi, timbang streptozotocin yang dibutuhkan

kemudian larutkan ke dalam dapar sitrat dengan volume yang telah

ditentukan.

f. Masukan larutan streptozotocin yang diperoleh kedalam tabung

berbungkus aluminium foil.

g. 30 detik – 1 menit sebelum induksi pindahkan larutan streptozotocin ke

dalam spuit 1 ml.

h. Injeksikan larutan streptozotocin melalui intraperitoneal tikus sesuai

dengan kebutuhan dosis per ekor. Induksi dilakukan hanya satu kali.

i. Berikan larutan sukrosa 10% atau dekstrosa 10% sepanjang malam

pertama setelah induksi untuk menghindari sudden hypoglycemic post

injection.

j. Setiap pagi tikus diperiksa kadar glukosa darah puasa (tikus

dipuasakan dengan cara tidak diberi pakan dan kandang dikosongkan

dari sekam selama 6 jam). Hiperglikemia yang bermakna akan dijumpai

2 hari setelah induksi.

3.7.3 Prosedur pemberian curcuminoid

Curcuminoid (kadar curcuminoid 80%) dosis 200 mg dan 400 mg

disuspensikan dalam Carboxy Methyl Cellulose (CMC) 0.5% (CMC dibuat

dengan mensuspensikan 0.5 gram CMC dalam 100 cc larutan akuades).

Setelah disuspensikan, diberikan langsung ke lambung tikus dengan

menggunakan Naso Gastric Tube (NGT).

3.7.4 Perlakuan pada tikus

Setelah tikus putih beradaptasi terhadap lingkungan kandang di

laboratorium selama 2 minggu, selanjutnya perlakuan diberikan sesuai

dengan kelompok yang direncanakan.

3.7.5 Prosedur pengambilan jaringan koklea tikus


52

Tikus dikorbankan dengan inhalasi eter, dilakukan nekropsi jaringan

tulang temporal kepala tikus. Sampel jaringan diambil, difiksasi dengan

larutan buffer formalin 10% dan dilakukan dekalsifikasi dengan EDTA

selama 4 minggu. Selanjutnya dilakukan pemeriksaan laboratorium.

3.7.6 Pemeriksaan laboratorium

a. Fiksasi jaringan dengan pembuatan paraffin block jaringan.

Jaringan tulang didekalsifikasi dengan menggunakan EDTA selama

4 minggu. Jaringan selanjutnya dicuci dengan PBS 3-5 kali untuk

membersihkannya dari kontaminan. Kemudian jaringan difiksasi

pada larutan formalin 10%. Setelah itu dilakukan dehidrasi dengan

alkohol bertingkat (30%, 50%, 70%, 80%, 96% dan absolut)

masing-masing selama 60 menit. Dilakukan clearing menggunakan

xylol sebanyak 2 kali masing-masing 60 menit. Kemudian dilakukan

impregnasi dengan parafin lunak selama 60 menit pada suhu 480C.

Selanjutnya dilakukan blocking preparat dalam parafin keras pada

cetakan dan didiamkan selama sehari.

b. Proses deparafinisasi

Dilakukan pemotongan blok parafin setebal 4 µm dengan rotary

microtome. Jaringan yang sudah dipotong dimasukkan dalam air

hangat, lalu diletakkan pada kaca.

c. Proses pewarnaan Hematoxilin Eosin

Dimasukkan sediaan ke dalam xylol sebanyak 2 kali masing-

masing selama 5 menit, setelah itu dilakukan rehidrasi dengan

alkohol berseri (absolut, 96%, 80%, 70%, 50% dan 30%) masing-

masing selama 5 menit, kemudian bilas dalam dH2O selama 5

menit. Warnai sediaan dengan Hematoxilin selama 10 menit,

setelah itu direndam dalam tap water selama 10 menit lalu dibilas

dengan dH2O. Sediaan selanjutnya diwarnai kembali dengan

larutan Eosin selama 3 menit lalu didehidrasi dengan alkohol

berseri 30% dan 50% masing-masing selama 5 menit, cuci dengan

dH2O selama 5 menit dan dikering-anginkan. Inkubasi kembali

dengan xylol sebanyak 2 kali masing-masing selama 2 menit


53

kemudian dilakukan mounting dengan entelan dan tutup dengan

cover glass.

d. Pemeriksaan ekspresi SOD dengan teknik imunohistokimia.

Masukkan sediaan ke dalam xylol sebanyak 2 kali masing-masing

selama 5 menit, setelah itu dilakukan rehidrasi dengan alkohol

berseri (absolut, 96%, 80%, 70%, 50% dan 30%) masing-masing

selama 5 menit, kemudian dibilas dalam dH2O selama 5 menit.

Masukkan kembali ke dalam H2O2 3% selama 20 menit, lalu cuci

menggunakan PBS pH 7.4 sebanyak 3 kali selama 5 menit.

Blocking protein non-spesifik dilakukan dengan menggunakan 5%

FBS yang mengandung 0.25% Triton X-100. lalu cuci kembali

dengan PBS pH 7.4 sebanyak 3 kali, selama 5 menit. Inkubasi

dengan menggunakan antibodi primer [Polyclonal Anti-SOD1

Antibody (Boster Biological Technology Co.,Ltd. cat#:1345)] selama

60 menit lalu cuci dengan PBS pH 7.4 sebanyak 3 kali selama 5

menit. Selanjutnya, sediaan direaksikan dengan antibodi sekunder

(biotinylated secondary antibody) selama 60 menit, lalu cuci

kembali dengan PBS pH 7.4 sebanyak 3 kali selama 5 menit.

Inkubasi dengan dengan steptavidin-HRP selama 60 menit, lalu

cuci menggunakan PBS pH 7.4 sebanyak 3 kali selama 5 menit.

Tetesi dengan DAB dan inkubasi selama 30 menit, lalu cuci

menggunakan dH2O selama 5 menit. Masukkan sediaan ke dalam

larutan Mayer Hematoxylin sebagai counterstaining dan diinkubasi

selama 10 menit, lalu cuci menggunakan tap water. Selanjutnya,

sediaan dibilas dengan dH2O dan dikering-anginkan. Kemudian

dilakukan proses mounting menggunakan entelan lalu ditutup

dengan cover glass.

3.7.7 Penghitungan sel pada pemeriksaan imunohistokimia

Menggunakan mikroskop Olympus XC 10 dengan pembesaran 100.

Penghitungan jumlah fibroblas terekspresi dilakukan oleh peneliti dan

pemeriksa ahli.


54

1. Penghitungan dilakukan terhadap semua slide yang ada. Setiap

hewan coba diambil sampel jaringan, difiksasi dengan 10% formalin,

dilakukan dekalsifikasi dengan EDTA selama 4 minggu. Masing-

masing sampel jaringan dibuat sediaan irisan setebal 4 µm, kemudian

diwarnai dengan Hematoxilin Eosin (HE).

2. Semua slide yang sudah berkode ditutup nomor kodenya dan diberi

nomor baru secara acak sehingga pemeriksa dan peneliti yang ikut

memeriksa tidak mengetahui slide yang diperiksa milik sampel yang

mana (double blind).

3. Penghitungan dilakukan secara semi kuantitatif yaitu dengan

mengalikan skor luas (p) x intensitas (i) dimana skor luas ditentukan

dengan melihat luas daerah yang terwarnai positif (warna coklat)

dengan skor : 0 = 0%; 1 = 10%; 2 = 10–50%; 3 = 50%, sedangkan

skor intensitas adalah 0 = tidak terwarna, 1 = low (intensitas lemah), 2

= moderate (intensitas sedang), 3 = strong (intensitas kuat). Sehingga

didapatkan hasil perkalian adalah 0 – 9.

4. Pemeriksa terdiri dari 2 orang, masing-masing yaitu peneliti dan

pemeriksa ahli (dokter spesialis patologi anatomi).

5. Pemeriksaan dan penghitungan sel dilakukan secara terpisah diantara

ke 2 pemeriksa, disesuaikan dengan kemampuan/kesediaan waktu

pemeriksa.

6. Pemeriksaan dan penghitungan sel dilakukan terhadap masing-

masing slide pada bidang pandang di dinding lateral koklea yaitu

daerah yang ditandai dengan adanya fibroblas dengan pembesaran

40x.

7. Hasil penghitungan sel sesuai dengan slide yang diperiksa ditulis di

lembar kerja pada kotak yang sesuai.

8. Analisis statistik dilakukan bila semua hasil sudah dikembalikan ke

nomor kode.


55

3.8 Alur Penelitian

Pemeriksaan imunohistokimia fibroblas koklea untuk melihat

ekspresi SOD

Curcuminoid 200

mg/kgbb/hari selama 5 hari

Terminasi hari ke 5

Curcuminoid 200


Terminasi hari ke 10

Curcuminoid 400


Curcuminoid 400

mg/kgbb/hari selama 10

hari

Injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor dosis tunggal



Kelompok 2 / Perlakuan 1







Randomisasi

Kelompok Perlakuan

Kelompok 1 (Kontrol) (Injeksi Buffer Na-Sitrat (1x), dilanjutkan pemberian CMC

(setiap hari)

Populasi Hewan


56

3.9 Analisis Statistik Data penelitian yang diperoleh akan diolah dan dianalisis secara

univariat, bivariat dan multivariat dengan menggunakan IBM SPSS

Statistics. Analisis univariat dilakukan untuk memperoleh nilai rata-rata

hitung dan standar deviasi untuk tiap kelompok penelitian sehingga dapat

diketahui deskripsi masing-masing variabel dalam penelitian. Analisis

bivariat dilakukan untuk menguji hubungan antara variabel independen

terhadap variabel dependen, menganalisis kesetaraan antara masing-

masing kelompok dan mengetahui perbedaan (penurunan atau

peningkatan) yang terjadi pada masing-masing kelompok setelah

diadakan intervensi. Untuk menganalisis perbedaan atau peningkatan

pada masing-masing kelompok penelitian ini digunakan uji t-independent

bila data terdistribusi normal, atau Mann-Whitney bila data tidak

terdistribusi normal. Normalitas data dinilai dengan uji Shapiro-Wilk.

Analisis multivariat dengan uji ANOVA dan uji Post-Hoc Bonferroni

dilakukan untuk mengetahui kelompok perlakuan yang mana yang

memiliki perbedaan yang bermakna pada perubahan ekspresi SOD

(variabel terikat) setelah diinduksi DM dan pemberian curcuminoid

(variabel bebas). Perlakuan diuji pada taraf nyata 5%.


44

BAB 4 HASIL PENELITIAN

4.1 Profil Ekspresi SOD pada Fibroblas Koklea Tikus Model Diabetes Mellitus

Hasil penelitian yang didapat berdasarkan pemeriksaan histopatologis

dengan metode imunohistokimia. Diperoleh gambaran mikroskopis

variabel yang mewakili tiap kelompok perlakuan yaitu ekspresi SOD pada

fibroblas koklea tikus model DM (kelompok 2,3,4,5 dan 6). Gambaran

jumlah sel yang mengekspresikan SOD pada keenam kelompok penelitian

tampak pada gambar 4.1 dan tabel 4.1 dibawah ini:

Gambar 4.1 Nilai Rerata Ekspresi SOD pada Fibroblas Dinding Lateral

Koklea Tiap Kelompok Perlakuan

Gambar 4.1 menunjukkan terjadinya penurunan ekspresi SOD pada

fibroblas koklea tikus model DM yang tidak mendapatkan curcuminoid.

Pemberian curcuminoid meningkatkan ekspresi SOD pada fibroblas

koklea tikus model DM. Pada kelompok 4 dan 6 didapatkan perbedaan

ekspresi SOD yang lebih tinggi, yang menunjukkan bahwa dosis

curcuminoid yang lebih tinggi (400 mg/kgbb/hari/ekor) lebih baik dibanding

dosis yang lebih rendah (200 mg/kgbb/hari/ekor) dalam meningkatkan

ekspresi SOD pada fibroblas koklea yang diinduksi DM.

5.5

2

5.5

6.75 6.25

6.75

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Kelompok1

Kelompok2

Kelompok3

Kelompok4

Kelompok5

Kelompok6


45

Tabel 4.1 Nilai Rerata dan Standar Deviasi Ekspresi SOD antara

kelompok.

Kelompok (n=6)

Ekspresi SOD Nilai Rerata Standar Deviasi

1 5.5 1.000

2 2 0.816

3 5.5 1.000

4 6.75 1.500

5 6.25 2.062

6 6.75 1.500

Keterangan:

- Nilai rerata ekspresi SOD terendah sebesar 2 ditemukan pada

kelompok 2 dibandingkan kelompok lainnya, menggambarkan

bahwa ekpresi SOD paling sedikit ditemukan pada kelompok model

DM dibandingkan kelompok lainnya.

- Nilai rerata SOD paling tinggi sebesar 6,75 ditemukan pada

kelompok 4 dan 6 dibanding kelompok lainnya. Menggambarkan

bahwa ekspresi SOD paling banyak ditemukan pada fibroblas

koklea tikus yang diinduksi DM bersamaan dengan pemberian

curcuminoid 400 mg/kgbb/hari.


46

4.2 Pengecatan Hematoksilin Eosin dan Imunohistokimia Fibroblas Dinding Lateral Koklea

Pengecatan HE (Gambar 4.2) dilakukan untuk melihat potongan dinding

lateral koklea yang tepat secara histopatologis dan kemudian digunakan

sebagai pembanding untuk selanjutnya dilakukan pengecatan

imunohistokimia (Gambar 4.3)

Gambar 4.2 Penampang Dinding Lateral Koklea Rattus Norvegicus (tanda

panah) dengan Pengecatan HE (perbesaran 4)

Gambar 4.3 Penampang Dinding Lateral Koklea Rattus Norvegicus (tanda

panah) dengan Pewarnaan Imunohistokimia (perbesaran 4)


47

4.3 Hasil Uji Curcuminoid dalam meningkatkan Ekspresi SOD pada fibroblas koklea tikus model DM

A

B

C

D

E

F

Gambar 4.4 Ekspresi SOD pada tiap kelompok perlakuan (perbesaran

100) : (A) Kelompok 1; (B) Kelompok 2; (C) Kelompok 3;

(D) Kelompok 4; (E) Kelompok 5; (F) Kelompok 6. Tanda

panah menunjukkan ekspresi SOD pada fibroblas koklea

yang ditandai dengan warna coklat.


48

Keterangan:

Pada fibroblas koklea tikus model DM (kelompok 2) [Gambar 4.3 (B)]

diatas menunjukkan densitas yang lebih rendah (warna coklat lebih pucat)

dan ekspresi SOD (warna coklat yang lebih sedikit pada fibroblas koklea

dibanding kelompok lainnya [Gambar 4.3 (A), (C), (D), (E), (F)]. Pada

fibroblast koklea tikus model DM yang mendapatkan curcuminoid dosis

400 mg/kgbb/hari/ekor selama 5 dan 10 hari [Gambar 4.3 (D), (F)]

menunjukkan densitas yang lebih tinggi dan ekspresi SOD yang lebih

banyak dibandingkan kelompok yang mendapatkan curcuminoid dosis 200

mg/kgbb/hari/ekor selama 5 dan 10 hari [Gambar 4.3 (C), (E)]. Kelompok

kontrol [Gambar 4.3 (A)] menunjukkan densitas dan ekspresi SOD yang

lebih banyak dibandingkan kelompok DM [Gambar 4.3 (B)]. Hasil ini

menunjukkan perbedaan jumlah sel yang mengekspresikan protein SOD

pada fibroblas koklea antara semua kelompok.

Data hasil penelitian yang didapat berdasarkan pemeriksaan

histopatologis tersebut diatas selanjutnya diolah dan dianalisis secara

statistik untuk melihat kelompok perlakuan mana yang memiliki

perbedaan, yang hasilnya dapat dilihat pada tabel 4.2


49

Tabel 4.2 Hasil Uji ANOVA terhadap Ekspresi SOD pada Setiap Kelompok

Kelompok Perbedaan rerata ±

Standar error

Nilai p

Kelompok 1 Kelompok 2 3.500 ± 0.975 .032*

Kelompok 3 .000 ± 0.975 1.000

Kelompok 4 -1.250 ± 0.975 1.000

Kelompok 5 -.750 ± 0.975 1.000

Kelompok 6 -1.250 ± 0.975 1.000

Kelompok 2 Kelompok 3 -3.500 ± 0.975 .032*

Kelompok 4 -4.750 ± 0.975 .002*

Kelompok 5 -4.250 ± 0.975 .006*

Kelompok 6 -4.750 ± 0.975 .002*

Kelompok 3 Kelompok 4 -1.250 ± 0.975 1.000

Kelompok 5 -.750 ± 0.975 1.000

Kelompok 6 -1.250 ± 0.975 1.000

Kelompok 4 Kelompok 5 .500 ± 0.975 1.000

Kelompok 6 .000 ± 0.975 1.000

Kelompok 5 Kelompok 6 -.500 ± 0.975 1.000

*Bermakna secara statistik (p<0.05)

Dari tabel 4.2 diatas didapatkan bahwa terdapat perbedaan ekspresi

SOD yang signifikan (p<0.05) antara kelompok 1 dan 2, yang berarti

terdapat penurunan SOD yang bermakna pada kelompok model DM yang

tidak mendapatkan curcuminoid dibandingkan dengan kelompok kontrol.

Selain itu juga terdapat pebedaan yang signifikan (p<0.05) antara

kelompok 2 dengan seluruh kelompok perlakuan lainnya (kelompok 3, 4, 5

dan 6). Hal ini menunjukkan bahwa terdapat peningkatan ekspresi SOD

yang signifikan pada kelompok model DM yang mendapatkan curcuminoid

baik dosis 200 mg/kgbb/hari dan 400 mg/kgbb/hari baik diberikan selama


50

5 hari maupun 10 hari dibandingkan dengan kelompok model DM yang

tidak mendapatkan curcuminoid. Perbedaan dosis pemberian curcuminoid

tidak memberikan perubahan peningkatan ekspresi SOD yang signifikan

(p>0.05), tampak pada perbandingan antara kelompok 3 dengan

kelompok 4 dan juga kelompok 5 dengan kelompok 6. Perbedaan durasi

pemberian pun tidak memberikan perubahan peningkatan ekspresi SOD

yang signifikan (p>0.05), tampak pada perbandingan antara kelompok 3

dengan kelompok 5 dan juga kelompok 4 dengan kelompok 6.


64

BAB 5 PEMBAHASAN

5.1 Pengaruh Curcuminoid terhadap Ekspresi SOD pada Fibroblas Koklea Rattus norvegicus

Penelitian ini dilakukan untuk menjelaskan efek curcuminoid terhadap

perubahan molekuler fibroblas koklea yang mendasari mekanisme

terjadinya kerusakan koklea akibat stress oksidatif pada diabetes melitus.

Informasi yang ditemukan dalam penelitian ini diharapkan dapat menjadi

kajian ilmiah dalam memperjelas mekanisme sampai memperbaiki

kerusakan pada tingkat molekuler.

Pada penelitian ini induksi diabetes melitus dilakukan dengan

menggunakan streptozotocin dosis tunggal yang akan mengakibatkan

terjadinya kerusakan sel β pankreas. Kerusakan sel β pankreas tersebut

selanjutnya menyebabkan stress hiperglikemik yang mendasari terjadinya

patogenesis berbagai komplikasi diabetes melitus, termasuk kerusakan

koklea. Pemberian curcuminoid diharapkan dapat mengatasi stress

oksidatif yang dapat menyebabkan kerusakan yang terjadi secara

molekuler sehingga gangguan pendengaran dapat dicegah.

Koklea, terutama stria vaskularis, adalah organ yang sangat tergantung

pada mikrovaskuler. Permeabilitas endotel yang meningkat dapat

mengakibatkan perubahan pada keseimbangan elektrolit dalam endolimfe

yang berakibat kepada proses tranduksi dan transmisi sinyal pada sel-sel

rambut (Frisina dkk., 2006). Sedangkan organ Corti sebagai organ

pendengaran memiliki komponen yang kompleks dan menjadi target

organ yang berpotensial rusak akibat hiperglikemia (Pemmaiah & Srinivas,

2011).

Meskipun diketahui bahwa hiperglikemia adalah faktor penyebab

penting terjadinya komplikasi diabetes melitus, mekanisme pasti yang

mengakibatkan disfungsi bermacam sel dan organ belum diketahui

dengan jelas. Empat teori telah dipakai untuk menjelaskan hal ini yaitu: 1)

Peningkatan glukosa intrasel mengakibatkan pembentukan advanced


65

glycosylation end products atau AGEs melalui non enzim glikolasi dari

protein intra dan ekstraselular, 2) hiperglikemi meningkatkan metabolisme

glukosa melalui jalur sorbitol, 3) hiperglikemia meningkatkan pembentukan

diasilgliserol yang mengakibatkan aktvasi protein kinase C atau PKC, 4)

Hiperglikemi meningkatkan aliran darah melalui jalur heksosamin, yang

menyebabkan terbentuknya fruktosa 6 fosfat, sebuah bahan yang

menghasilkan produk glikosilasi O- linked dan proteoglikan (Powers,

2008).

Menurut Frisina et al (2006), hiperglikemi mengakibatkan perubahan

biokimia dalam sistem metabolik. Tiga konsekuensi utama berupa

pemecahan glukosa non enzimatik, aktivasi jalur polyol dan pembentukan

Reactive Oxygen Species atau ROS. Meskipun semua individu dengan

proses penuaan mengalami proses fisiologik abnormal yang sama seperti

oksidasi yang meningkat, glikasi dan meningkatnya produk akhir selama

metabolisme oksidatif, proses ini terjadi lebih cepat pada penderita

diabetes melitus.

Pada penelitian penelitian sebelumnya yang menggunakan hewan

coba dengan pajanan bising sebagai stresor mendapatkan bahwa

fibroblas dinding lateral koklea merupakan sel yang labil dan responsif

terhadap stimulus. Pajanan bising dapat menyebabkan gangguan pada

fibroblas yang diamati secara histopatologi tanpa adanya kerusakan pada

sel sensoris (Hirose & Liberman, 2003; Purnami, 2009).

Berdasar pada penelitian sebelumnya, pada penelitian ini digunakan

curcuminoid dengan dosis 200 mg/kgbb/hari per ekor karena pada dosis

tersebut curcuminoid mampu berperan sebagai antioksidan (Gonzalez-

Salazar et al., 2011; Bayrak et al., 2008) dan digunakan dosis 2x lipatnya

untuk melihat apakah terdapat pengaruh pemberian dosis terhadap

ekspresi SOD. Selain itu juga dihipotesiskan bahwa terdapat pengaruh

durasi pemberian curcuminoid terhadap ekspresi SOD (dose and time

dependent) (Van Erk et al., 2004).

Penelitian ini menunjukkan bahwa pada kelompok model DM tanpa

pemberian curcuminoid terjadi penurunan ekspresi SOD, yang dikaitkan


66

dengan terjadinya stres oksidatif akibat hiperglikemia. SOD merupakan

enzim antioksidan lini pertama yang berperan dalam katalisis radikal

superoksida menjadi hidrogen peroksida dan oksigen. SOD ekstraseluler

juga merupakan satu satunya enzim antioksidan yang dapat berperan

sebagai scavenger superoksida pada kompartemen ekstraseluler (Nozik-

Grayck, Suliman & Piantadosi, 2005). Pada diabetes, keadaan

hiperglikemia meningkatkan stress oksidatif melalui beberapa jalur.

Mekanisme yang sangat penting adalah overproduksi anion superoksida

melalui rantai transport elektron di dalam mitokondria. Pembentukan

spesies oksigen fisiologis (terutama radikal superoksida) terjadi pada saat

transfer elektron oleh sitokrom dalam proses rantai tranpor elektron.

Hiperglikemia menyebabkan peningkatan produksi donor elektron (NADH

dan FADH2) pada siklus trikarboksilat (Aronson, 2009).

Hasil tersebut diatas sesuai dengan hasil penelitian oleh Kasznicki et al

(2012) yang mendapatkan penurunan kadar SOD secara signifikan pada

plasma penderita diabetes yang menderita distal symmetric

polyneuropathy (DSPN). Palma et al (2014) juga mendapatkan hal yang

sama, bahwa aktivitas SOD menurun pada plasma dan hepar tikus model

diabetes melitus.

Pada penelitian ini didapatkan bahwa curcuminoid mampu

meningkatkan ekspresi SOD pada kelompok model DM, dimana

pemberian curcuminoid dengan dosis dosis 200 mg/kgbb/hari/ekor selama

5 hari (kelompok 3) dan 10 hari (kelompok 5) maupun dosis 400

mg/kgbb/hari/ekor selama 5 hari (kelompok 4) dan 10 hari (kelompok 6)

terbukti mampu meningkatkan ekspresi SOD secara signifikan (p<0.05).

Mekanisme kerja curcumin sebagai antioksidan didasari oleh sifat

scavenging curcumin terhadap radikal superoksida dan hidroksil oksida,

serta melalui upregulasi ekspresi enzim antioksidan endogen seperti SOD,

GSH dan GSHPx (Jagetia & Rajanikant, 2015; Malik & Mukherjee, 2014).

Upregulasi tersebut terjadi melalui mekanisme induksi terhadap gen Nrf2

[(Nuclear factor-(erythroid derived 2)-related factor-2)].. Nrf2 berada dalam

sitoplasma dan akan bertranslokasi ke dalam nucleus untuk menginisiasi


67

jalur antioksidan (Jagetia & Rajanikant, 2015; Tapia et al., 2012). Selain

itu curcumin bekerja melalui inhibisi aktivitas seluler yang menghasilkan

ROS melalui inhibisi aktivitas enzim NADPH oksidase,

lipoksigenase/siklooksigenase, xantin dehidrogenase, dan nitrit oksid

sintase, yang pada akhirnya akan meningkatkan bioavailabilitas enzim

antioksidan seluler (Khan & Mahboob, 2014).

Hasil tersebut diatas sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh

Jagetia & Rajanikant (2015) yang mendapatkan bahwa pemberian

curcumin sebelum dan sesudah radiasi pada tikus dapat meningkatkan

ekspresi SOD. Tapia et al (2012) juga mendapatkan hal yang serupa pada

percobaan yang melihat efek curcumin terhadap status oksidan-

antioksidan pada ginjal tikus yang mengalami stres oksidatif akibat

nefrektomi. Peranan curcumin dan regulasi ekspresi SOD juga didapati

oleh penelitian Jena et al (2013). Penelitian tersebut memperlihatkan

efektivitas curcuminoid dalam memperbaiki dan meningkatkan ekspresi

SOD pada korteks serebrum dan serebelum yang mengalami stress

oksidatif akibat PTU (6-propyl-2thiouracil).

Pada penelitian ini didapati perbedaan yang tidak signifikan secara

statistik (p>0.05) dalam hal perbedaan dosis dan durasi pemberian

curcuminoid. Besarnya dosis yang diberikan tidak mempengaruhi ekspresi

SOD yang telihat pada kelompok 3 dan 4, serta 5 dan 6, dimana dosis

400 mg/kgbb/hari/ekor tidak menunjukkan peningkatan ekspresi SOD

yang bermakna dibanding dengan dosis 200 mg/kgbb/hari/ekor.

Selain perbedaan besarnya dosis, perbedaan durasi pemberian

curcuminoid juga tidak memberikan pengaruh terhadap ekspresi SOD. Hal

ini terlihat pada kelompok 3 dan 5, serta 4 dan 6, dimana curcuminoid

dengan dosis yang sama (200 mg/kgbb/hari/ekor atau 400

mg/kgbb/hari/ekor) diberikan dalam waktu yang berbeda (5 dan 10 hari)

tidak menunjukkan perbedaan ekspresi SOD yang bermakna.

Hasil ini berbeda dengan hasil penelitian yang dilakukan oleh Haryuna

et al (2013) yang mendapatkan bahwa terdapat dose-response

relationship pada pemberian curcuminoid terhadap ekspresi SOD dan


68

CAT pada fibroblas dinding lateral koklea yang diinduksi bising. Selain itu

penelitian oleh Van Erk et al (2004) yang meneliti tentang peranan

curcumin terhadap ekspresi berbagai gen pada sel kanker kolon

mendapatkan hasil bahwa pada sel kanker kolon yang dipaparkan dengan

dua konsentrasi curcumin yang berbeda serta beberapa durasi paparan

curcumin yang berbeda, terjadi perbedaan ekspresi berbagai gen pada

perbedaan perlakuan tersebut, yang mengindikasikan bahwa efek

curcumin bersifat time and dose dependent.

Perbedaan hasil yang didapatkan pada penelitian ini dapat terjadi

akibat variasi dosis pemberian curcuminoid antar kelompok tidak jauh

berbeda (200 mg/kgbb/hari dan 400 mg/kgbb/hari), serta variasi durasi

pemberian curcuminoid juga cukup kecil (5 hari dengan 10 hari) sehingga

belum memberikan perbedaan dalam hal ekspresi SOD. Faktor lain yang

dapat berpengaruh adalah sifat curcumin yang dapat berperan sebagai

antioksidan pada dosis kecil, namun bersifat sebagai prooksidan pada

dosis besar( Malik & Mukherjee, 2014). Hal tersebut telah ditunjukkan oleh

beberapa penelitian, dimana curcumin pada dosis kecil mengurangi

produksi ROS, namun pada dosis besar justru meningkatkan produksi

ROS pada penelitian terhadap sel leukemia manusia (Chen et al., 2005).

Penelitian lain menunjukkan bahwa curcumin dosis rendah (<10microM)

dapat mencegah deplesi enzim antioksidan GSH namun pada dosis yang

lebih tinggi malah menyebabkan penurunan GSH secara bertahap pada

sel darah merah yang mengalami kerusakan oksidatif (Banerjee et al.,

2008). Selain hal-hal tersebut diatas, faktor lain yang juga dapat

berpengaruh adalah faktor farmakodinamik yang dapat mempengaruhi

efikasi obat, yaitu ceiling effect yaitu aktivitas intrinsik maksimal obat,

dimana penambahan dosis yang lebih besar tidak memberikan

penambahan efikasi obat.

5.2 Keterbatasan Penelitian Keterbatasan dari penelitian ini adalah bahwa dalam pengambilan

sampel dinding lateral koklea yang diperiksa secara imunohistokimia,

peneliti sulit mendapatkan potongan yang sama dari setiap sampel.


69

BAB 6

KESIMPULAN DAN SARAN

6.1 Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan, dapat diambil beberapa

kesimpulan sebagai berikut:

1. Curcuminoid dapat meningkatkan ekspresi SOD pada fibroblas koklea

tikus model diabetes mellitus yang bermakna secara statistik (p<0.05).

2. Curcuminoid dosis 400 mg/kgbb/ekor/hari tidak terbukti lebih baik

dibandingkan dosis 200 mg/kgbb/ekor/hari dalam meningkatkan

ekspresi SOD pada Rattus norvegicus model diabetes mellitus, dimana

pada pada penelitian ini didapatkan perbedaan yang tidak bermakna

secara statistik (p>0.05).

3. Curcuminoid dosis 200 mg/kgbb/ekor/hari yang diberikan selama 10

hari tidak terbukti lebih baik dibandingkan dengan curcuminoid 200

mg/kgbb/ekor/hari yang diberikan selama 5 hari dalam meningkatkan




4. Curcuminoid dosis 400 mg/kgbb/ekor/hari yang diberikan selama 10

hari tidak terbukti lebih baik dibandingkan dengan curcuminoid 400

mg/kgbb/ekor/hari yang diberikan selama 5 hari dalam meningkatkan





70

6.2 Saran

Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan, dapat disampaikan

beberapa saran sebagai berikut:

1. Perlu dilakukan penelitian dengan penambahan kelompok yang

mendapatkan terapi curcuminoid sebelum dilakukan induksi diabetes

melitus untuk melihat apakah curcuminoid memiliki sifat preventif

terhadap terjadinya stres oksidatif pada fibroblas koklea.

2. Perlu dilakukan penelitian dengan pemilihan sediaan curcuminoid yang

memiliki bioavailabilitas yang baik, seperti nanocurcumin atau kapsul

liposom.

3. Perlu dilakukan penelitian lanjutan dengan pemeriksaan OAE

(Otoaccoustic Emission) ataupun BERA (Brainstem Evoked Response

Audiometry) terhadap sampel sebelum dan sesudah pemberian

perlakuan untuk melihat apakah perubahan seluler yang terjadi dapat

mempengaruhi fungsi organ secara klinis dalam hal fungsi

pendengaran.


Documents

repository.usu.ac.id › bitstream › handle › 123456789... · BAB METODE PENELITIAN - repository.usu.ac.idinjeksi streptozotocin 60 mg/kgbb/ekor dosis tunggal serta pemberian