า 2557 ิทยาลัิลปากรยศ - Silpakorn University · 2016-08-01 · ง 54313205: สาขาวชาจิุลชีววิทยา คําสาคํัญ

การทาบรสทธ และคณสมบตของเอนไซมเฮพารเนสผลตโดยแบคทเรยทคดแยกได

จากตะกอนดนเลนนากรอย

โดย

นางสาวประภาศร คณตชยเดชา

วทยานพนธนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต

สาขาวชาจลชววทยา ภาควชาจลชววทยา

บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

ปการศกษา 2557

ลขสทธของบณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

สำนกหอ

สมดกลาง

การทาบรสทธ และคณสมบตของเอนไซมเฮพารเนสผลตโดยแบคทเรยทคดแยกได

จากตะกอนดนเลนนากรอย

โดย

นางสาวประภาศร คณตชยเดชา

วทยานพนธนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต

สาขาวชาจลชววทยา ภาควชาจลชววทยา

บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

ปการศกษา 2557

ลขสทธของบณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

สำนกหอ


PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF HEPARINASE PRODUCED BY

BACTERIA ISOLATED FROM BRACKISH SEDIMENT

By

Miss Prapasri Khanitchaidecha

A Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree

Master of Science Program in Microbiology

Department of Microbiology

Graduate School, Silpakorn University

Academic Year 2014

Copyright of Graduate School, Silpakorn University

สำนกหอ


บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร อนมตใหวทยานพนธเรอง “การทาบรสทธ และคณสมบตของเอนไซมเฮพารเนสผลตโดยแบคทเรยทคดแยกไดจากตะกอนดนเลนนากรอย” เสนอโดย นางสาวประภาศร คณตชยเดชา เปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาจลชววทยา

……...........................................................

(รองศาสตราจารย ดร.ปานใจ ธารทศนวงศ) คณบดบณฑตวทยาลย

วนท..........เดอน.................... พ.ศ...........

อาจารยทปรกษาวทยานพนธ

อาจารย ดร.วรญ พลสวสด

คณะกรรมการตรวจสอบวทยานพนธ

.................................................... ประธานกรรมการ

(ผชวยศาสตราจารย ดร.เอกพนธ บางยขน) ............/......................../..............

.................................................... กรรมการ

(อาจารย ดร.วรภทร สงวนไชยไผวงศ) ............/......................../..............

.................................................... กรรมการ .................................................... กรรมการ

(อาจารย ดร.ทกษวน ทองอราม) (อาจารย ดร.วรญ พลสวสด) ............/......................../.............. ............/......................../..............

สำนกหอ


ง

54313205: สาขาวชาจลชววทยา คาสาคญ : เฮพารเนส/ การทาบรสทธเอนไซม/ เฮพารน ประภาศร คณตชยเดชา : การทาบรสทธ และคณสมบตของเอนไซมเฮพารเนสผลต โดยแบคทเรยทคดแยกไดจากตะกอนดนเลนนากรอย. อาจารยทปรกษาวทยานพนธ : อ.ดร.วรญ พลสวสด. 89 หนา. จากการคดแยกแบคทเรยทมความสามารถในการสรางเอนไซมเฮพารเนสจากตวอยางตะกอนดนเลนนากรอยและนาเคม พบวา แบคทเรยไอโซเลท RYA_En1 ซงแยกไดจากตะกอนดนเลนนากรอยสามารถสรางเอนไซมเฮพารเนสไดสงสดจากการทดสอบการยอยเฮพารนโดยวธ plate

assay ซงใหคาม potency index เทากบ 2.27 0.05 และไดทาการจดจาแนกไอโซเลทดงกลาวโดยอาศย 16S rRNA พบวา มความคลายคลงกบแบคทเรยในยนส Aeromonas (similarity 97-100%)

และไดกาหนดชอสายพนธ คอ Aeromonas sp. RYA_En1 เอนไซมเฮพารเนสซงผลตไดภายในเซลลแบคทเรยถกทาใหบรสทธขนโดยผานการตกตะกอนดวยเกลอแอมโมเนยมซลเฟต โครมาโทกราฟชนด ion exchange (DEAE-Sepharose Fast Flow column) และโครมาโทกราฟชนด

gel filtration (Sephadex G-100 column) ตามลาดบ หลงจากผานขนตอนการทาบรสทธขน พบวา มกจกรรมจาเพาะของเอนไซมเทากบ 0.63 U/mg protein และมความบรสทธเอนไซมเพมขน 2.42

เทา เมอนาเอนไซมเฮพารเนสทผานการทาบรสทธมาศกษาคณสมบตของเอนไซม พบวา มนาหนกโมเลกลประมาณ 90 kDa จากการวเคราะหโดยวธ SDS-PAGE คาความเปนกรด-ดาง และอณหภมทเหมาะสมตอกจกรรมของเอนไซมเทากบ 7.0 และ 37 C ตามลาดบ คาความเปนกรด-ดาง และอณหภมทกจกรรมเอนไซมมความเสถยรคอ 20-40 C และความเปนกรด-ดางท 7.0 ตามลาดบ กจกรรมของเอนไซมเฮพารเนสจากแบคทเรย Aeromonas sp. RYA_En1 สามารถถกยบยงโดยไอออน Ba2+ และ Mg2+ สวนไอออนทสงผลกระตนกจกรรมเอนไซมไดสงสด คอ Co2+ และ Mn2+ ทความเขมขน 100 mM ภาควชาจลชววทยา บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

ลายมอชอนกศกษา........................................ ปการศกษา 2557 ลายมอชออาจารยทปรกษาวทยานพนธ ........................................

สำนกหอ


จ

54313205: MAJOR: MICROBIOLOGY

KEY WORD: HEPARINASE/ PURIFICATION ENZYME/ HEPARIN

PRAPASRI KHANITCHAIDECHA: PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF

HEPARINASE PRODUCED BY BACTERIA ISOLATED FROM BRACKISH SEDIMENT. THESIS

ADVISOR: PH.D. WARANYOO PULSAWAT. 89 pp.

According to the isolation of heparinase producing bacteria from brackish and marine

sediments, isolate RYA_En1 demonstrated highest heparin degradation activity noticeably from

potency index of 2.27±0.05 resulted from plate assay. The identification using 16S rRNA, the

isolate revealed highest similarity of 97-100% closed to Aeromonas genus henceforth the isolate

was described as Aeromonas sp. RYA_En1. Heparinase produced by Aeromonas sp. RYA_En1

was purified by precipitation with ammonium sulfate, ion exchange chromatography (DEAE-Sepharose Fast Flow column) and gel filtration chromatography (Sephadex G-100

column), respectively. After those purification steps, enzyme specific activity was 0.6 unit per

milligram of proteins and increased 2.42 folds compared to its crude enzyme. Later, the purified

enzyme was determined characteristics and it was found that its molecular weight was about 90

kDa. The optimum pH and temperature for enzyme activity were 7.0 and 37 degree celcius,

respectively. The pH and temperature for stability of enzyme activity were 7.0 and 20-40 degree

celcius, respectively. In addition, enzyme activity of Heparinase from Aeromonas sp.

RYA_En1was inhibited by Ba2+ and Mg2+ whereas it was promoted by presence of Co2+ and Mn2+

at concentration of 100 mM.

Department of Microbiology Graduate School, Silpakorn University

Student's signature ........................................ Academic Year 2014

Thesis Advisor's signature ........................................

สำนกหอ


ฉ

กตตกรรมประกาศ

ผวจยขอกราบขอบพระคณ อาจารย ดร.วรญ พลสวสด อาจารยทปรกษาวทยานพนธหลกเปนอยางสง ทกรณาใหคาแนะนา ปรกษา แกไขขอบกพรองตางๆ ทเปนประโยชน และใหความสนบสนนในการจดหาสารเคม และอปกรณเครองมอทใชในงานวจยน ตลอดจนตรวจแกไขวทยานพนธใหมความสมบรณยงขน

ขอกราบขอบพระคณผชวยศาตราจารย ดร. เอกพนธ บางยขน ประธานกรรมการรวมพจารณาการสอบวทยานพนธ ใหคาปรกษา และชวยเหลออปกรณในงานวจย ตลอดจนตรวจแกไขวทยานพนธ ใหสาเรจลลวงได

ขอกราบขอบพระคณ อาจารย ดร. วรภทร สงวนไชยไผวงศ และอาจารย ดร. ทกษวน ทองอราม กรรมการรวมสอบวทยานพนธ ทใหคาแนะนา คาปรกษา และตรวจแกไขวทยานพนธจนเสรจสมบรณ

ขอขอบพระคณบณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร ทใหเงนสนบสนนงานวทยานพนธ จานวน 10,000 บาท และขอกราบขอบพระคณคณาจารยประจาภาควชาจลชววทยาทกทาน ทใหความร และคาแนะนาทเปนประโยชนตอการทางานวจยตลอดมา และขอขอบพระคณคณกรพรรณ เศวตสวรรณกล และเจาหนาทประจาภาคจลชววทยา ทเอออานวยความสะดวกในการใชอปกรณ สารเคม และใหคาแนะนาชวยเหลอใหงานวจยนสาเรจลลวงได ขอขอบพระคณพอรารกษ รมรน ทใหคาปรกษา แนะนา และแกไขปญหาของงานวจยน ตลอดจนทงเพอน พและนอง ทใหกาลงใจ และมสวนชวยเหลอกนตลอดมา สดทายขอกราบขอบพระคณบดา มารดา และพนอง ทใหการสนบสนนในดานตางๆ และเปนกาลงใจใหงานวจยนสาเรจสมบรณยงขน

สำนกหอ


ช

สารบญ หนา บทคดยอภาษาไทย ........................................................................................................................................... ง บทคดยอภาษาองกฤษ ...................................................................................................................................... จ กตตกรรมประกาศ ............................................................................................................................................ ฉ สารบญตาราง ..................................................................................................................................................... ญ สารบญภาพ ........................................................................................................................................................ ฏ บทท

1 บทนา ....................................................................................................................................................... 1

ความเปนมาและความสาคญของปญหา .................................................................................... 1

วตถประสงคของการศกษา.......................................................................................................... 3

สมมตฐานของการศกษา .............................................................................................................. 3

ขอบเขตงานวจย ............................................................................................................................ 3

2 วรรณกรรมทเกยวของ .................................................................................................................... 4

ไกลโคซามโนไกลแคน................................................................................................................ 4

เฮพารน .................................................................................................................................. 6

เฮพารานซลเฟต .................................................................................................................... 7

เอนไซมเฮพารเนส ........................................................................................................................ 8

เฮพารเนส I ........................................................................................................................... 8

เฮพารเนส II .......................................................................................................................... 10

เฮพารเนส III ..................................................................................................................... 11

แหลงของจลนทรยทสามารถผลตเอนไซมเฮพารเนส ............................................................. 12

การศกษาการทาบรสทธเอนไซมเฮพารเนส .............................................................................. 15

คณสมบตของเอนไซม ................................................................................................................. 21

ประโยชนของเอนไซมเฮพารเนส ............................................................................................... 25

สำนกหอ


ซ

บทท หนา 3 อปกรณและวธการดาเนนงานวจย ................................................................................................. 26

แหลงเชอจลนทรย................................................................................................................ 26

สารเคมและอาหารเลยงเชอ ................................................................................................ 26

อปกรณและเครองมอทใชในงานวจย ............................................................................... 29

ขนตอนการดาเนนงานวจย .......................................................................................................... 31

การคดกรองแบคทเรยทมประสทธภาพในการผลตเอนไซมเฮพารเนสโดยวธ Heparinase plate assay ............................................................................................ 32

Azure assay ............................................................................................................... 32

การเพาะเลยงแบคทเรยทผลตเอนไซมเฮพารเนส ............................................................ 33 การเกบรกษาแบคทเรยทผลตเอนไซมเฮพารเนส ............................................................ 33 การวเคราะหกจกรรมเอนไซมเฮพารเนส ......................................................................... 33 การทาบรสทธเอนไซมเฮพารเนสจากแบคทเรยทคดกรองได ....................................... 34 การศกษาคณสมบตของเอนไซมเฮพารเนส ..................................................................... 36 4 ผลการทดลอง และวจารณผลการทดลอง .......................................................................................... 38

การคดกรองแบคทเรยทมประสทธภาพในการสรางเอนไซมเฮพารเนส ............................... 38

Heparinase plate assay ........................................................................................................ 38 Azure assay .......................................................................................................................... 42 การผลตสารสกดหยาบเอนไซมเฮพารเนส จากแบคทเรยไอโซเลท RYA_En1 .................. 43 การทาบรสทธเอนไซมเฮพารเนสจากแบคทเรย ไอโซเลท RYA_En1 ................................. 44 การศกษาคณสมบตเอนไซมเฮพารเนส ..................................................................................... 52 5 สรป อภปรายผล และขอเสนอแนะ ............................................................................................... 61

สรปผลการทดลอง........................................................................................................................ 61 ขอเสนอแนะ .................................................................................................................................. 62 รายการอางอง ..................................................................................................................................................... 63

สำนกหอ


ฌ

บทท หนา ภาคผนวก ................................................................................................................................................ 67

ภาคผนวก ก อาหารเลยงเชอ สารละลาย และสารเคมทใชในการทดลอง ................................ 69 ภาคผนวก ข กราฟมาตรฐาน และการวเคราะห ........................................................................... 75 ภาคผนวก ค ขอมลการทดลอง ....................................................................................................... 79

ประวตผวจย ............................................................................................................................................ 88

สำนกหอ


ญ

สารบญตาราง

ตารางท หนา 1 ประเภทของไกลโคซามโนไกลแคน ............................................................................................. 5 2 จลนทรยทสามารถสรางเอนไซมเฮพารเนส ................................................................................. 13 3 เทคนคและคณสมบตของคอลมนโครมาโทกราฟชนดตางๆ .................................................... 15 4 ชนดของ Ion exchange ทงแบบ Anion และ Cation exchangers .............................................. 16 5 ขนตอนการทาบรสทธเอนไซมเฮพารเนส และการเปรยบเทยบปรมาณเอนไซมของ

จลนทรย ................................................................................................................................ 19 6 คณสมบตบางประการของเอนไซมเฮพารเนสจากเชอจลนทรย ............................................... 23 7 คา Potency index ของแบคทเรยทคดแยกได และ Escherichia coli (negative control) ทใช ทดสอบการผลต เอนไซมเฮพารเนสบนอาหาร LB Agar ทประกอบดวยเฮพารน 0.1 % (w/v) บมทอณหภม 30 C ระยะเวลา 72 h .......................................................... 39

8 คากจกรรมเอนไซมของเชอแบคทเรยทคดแยกได โดยวธ Azure assay ทอณหภม 37 C

คาความเปนกรด – ดางท 7.0 ............................................................................................. 42

9 คากจกรรมเอนไซมเฮพารเนส ในแตละชวงหลอดหลงจากผานคอลมน DEAE-Sepharose

โครมาโทกราฟ .................................................................................................................... 47 10 ขนตอนการทาบรสทธเอนไซมเฮพารเนสจากเชอแบคทเรย Aeromonas sp. RYA_En1 ...... 52 11 ความสมพนธระหวางความเขมขนของโปรตนกบคาการดดกลนแสงทความยาวคลน

595 nm .................................................................................................................................. 76 12 การทาบรสทธเอนไซมเฮพารเนสจากเชอ Aeromonas sp. RYA_En1 ทอณหภม 37 C

ความเปนกรด – ดางท 7.0 ................................................................................................ 79 13 อทธพลของอณหภมทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซมเฮพารเนส จากเชอ

Aerommonas sp. RYA_En1 ทคาความเปนกรด-ดาง 7.0 ............................................... 80 14 อทธพลของความเปนกรด-ดางทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซมเฮพารเนส จากเชอ

Aerommonas sp. RYA_En1 ทอณหภม 37 C ............................................................ 80 15 อทธพลของความเสถยรของอณหภมทมผลตอกจกรรมเอนไซมเฮพารเนส จากเชอ

Aerommonas sp. RYA_En1 (20 C) ทคาความเปนกรด-ดาง 7.0 ................................ 81

สำนกหอ


ฎ

ตารางท หนา 16 อทธพลของความเสถยรของอณหภมทมผลตอกจกรรมเอนไซมเฮพารเนส จากเชอ

Aerommonas sp. RYA_En1 (25 C) ทคาความเปนกรด-ดาง 7.0 ................................ 81 17 อทธพลของความเสถยรของอณหภมทมผลตอกจกรรมเอนไซมเฮพารเนส จากเชอ




Aerommonas sp. RYA_En1 (45 C) ทคาความเปนกรด-ดาง 7.0 ................................ 83

21 อทธพลของความเสถยรของอณหภมทมผลตอกจกรรมเอนไซมเฮพารเนส จากเชอ Aerommonas sp. RYA_En1 (50 C) ทคาความเปนกรด-ดาง 7.0 ................................ 84

22 อทธพลของความเสถยรของความเปนกรด-ดางทมผลตอกจกรรมของเอนไซมเฮพารเนส จากเชอ Aeromonas sp. RYA_En1 (คาความเปนกรด-ดาง 7.0) ทอณหภม 37 C ..... 84

23 อทธพลของชนดไอออนทมผลตอกจกรรมเอนไซมของเอนไซมเฮพารเนสจากเชอ Aeromonas sp. RYA_En1 (Without adding metal ion) ทอณหภม 37 C คาความเปนกรด-ดาง 7.0 .................................................................................................... 85

24 อทธพลของชนดไอออนทมผลตอกจกรรมเอนไซมของเอนไซมเฮพารเนสจากเชอ Aeromonas sp. RYA_En1 (Ba2+) ทอณหภม 37 C คาความเปนกรด-ดาง 7.0 .......... 85

5 อทธพลของชนดไอออนทมผลตอกจกรรมเอนไซมของเอนไซมเฮพารเนสจากเชอAeromonas sp. RYA_En1 (Ca2+) ทอณหภม 37 C คาความเปนกรด-ดาง 7.0 .......... 85

6 อทธพลของชนดไอออนทมผลตอกจกรรมเอนไซมของเอนไซมเฮพารเนสจากเชอ Aeromonas sp. RYA_En1 (Co2+) ทอณหภม 37 C คาความเปนกรด-ดาง 7.0 .......... 86

7 อทธพลของชนดไอออนทมผลตอกจกรรมเอนไซมของเอนไซมเฮพารเนสจากเชอ Aeromonas sp. RYA_En1 (Mg2+) ทอณหภม 37 C คาความเปนกรด-ดาง 7.0 ......... 86

8 อทธพลของชนดไอออนทมผลตอกจกรรมเอนไซมของเอนไซมเฮพารเนสจากเชอ Aeromonas sp. RYA_En1 (Mn2+) ทอณหภม 37 C คาความเปนกรด-ดาง 7.0 ......... 86

สำนกหอ


ฏ

สารบญภาพ

ภาพท หนา 1 โครงสรางเฮพารน ......................................................................................................................... 6

2 โครงสรางเฮพารานซลเฟต ........................................................................................................... 7 3 ตาแหนงการยอยสลายพนธะ glycosidic linkge โดยเอนไซมเฮพารเนส I

และผลตภณฑทเกดขน ..................................................................................................... 9

4 ตาแหนงการยอยสลายพนธะ glycosidic linkage โดยเอนไซมเฮพารเนส II ......................... 10 5 ตาแหนงการยอยสลายพนธะ glycosidic linkage โดยเอนไซมเฮพารเนส III ........................ 11 6 แผนภาพขนตอนการทาวจยทงโครงการ .................................................................................... 31 7 โคโลนและเกดโซนใสของแบคทเรย ไอโซเลท RYA_En1 (A), RYB_En1 (B), SKA_En1(C),

RYA_HT1 (D), RYB_HT1 (E) และ SKA_HT1 (F) บนอาหาร LB agar ทม สวนประกอบของเฮพารน ทอณหภม 30 C ระยะเวลา 72 h ...................................... 40

8 ไอโซเลทแบคทเรย RYA_En1 ทคดแยกไดจากตะกอนดนเลน คลองกะเฉด ตาบลกะเฉด อาเภอแกลง จงหวดระยอง .......................................................................... 43

9 ความสมพนธระหวางปรมาณโปรตนทความยาวคลน 280 nm และคากจกรรม เอนไซมทความยาวคลน 232 nm จากเชอแบคทเรย Aeromonas sp. RYA_En1 ทผานการแยกใหบรสทธดวยคอลมนโครมาโทกราฟชนด DEAE Sepharose .......... 47

10 การแยกขนาดโมเลกลของโปรตนดวยวธ SDS-PAGE ท . % (v/v) และยอมสดวย Coomassie Brilliant Blue R- จากคอลมนโครมาโทกราฟชนด DEAE-Sepharose และยอมสดวย Coomassie Brilliant Blue R-250 ............................ 48 11 ความสมพนธระหวางปรมาณโปรตนทความยาวคลน 280 nm และคากจกรรม เอนไซมทความ

ยาวคลน 232 nm จากเชอแบคทเรย Aeromonas sp. RYA_En1 ทผานการทาบรสทธดวยคอลมนโครมาโทกราฟแบบ gel filtration ชนด Sephadex G-100 .............................. 50

12 การแยกขนาดโมเลกลของโปรตนในแตละขนตอนการทาบรสทธ โดยวธ SDS-PAGE

ท 12.5% (v/v) เจล และยอมสดวย Coomassie Brilliant Blue R-250……….….….……….. 51 อณหภมทเหมาะสมตอกจกรรมของเอนไซมเฮพารเนส จากเชอแบคทเรย

Aeromonas sp. RYA_En1 คาความเปนกรด-ดาง 7.0 ..................................................... 54

สำนกหอ


ฐ

ภาพท หนา อทธพลของอณหภมตอความเสถยรของเอนไซมเฮพารเนส จากเชอแบคทเรย

Aeromonas sp. RYA_En1 คาความเปนกรด-ดาง 7.0 เปนเวลา 6 h .............................. 55 1 คาความเปนกรด-ดางทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซมเฮพารเนส จากเชอแบคทเรย

Aeromonas sp. RYA_En1 ทอณหภม 37 C ................................................................... 56 1 อทธพลของความเสถยรของเอนไซมเฮพารเนสจากเชอ Aeromonas sp. RYA_En1 ทคาความเปนกรด-ดางเทากบ 7.0 ทอณหภม 37 C เปนเวลา 6 h ............................... 58 1 อทธพลของชนดไอออนตอกจกรรมเอนไซมเฮพารเนส ทความเขมขน 1, 10 และ 100 mM

ทอณหภม 37 C คาความเปนกรด-ดาง 7.0 ..................................................................... 59

18 กราฟมาตรฐานโปรตน (Bovine serum albumin) ทความยาวคลน nm ............................ 75

สำนกหอ


1

บทท 1 บทนา

1. ความเปนมาและความสาคญของปญหา

เฮพารเนส (Heparinase) เปนเอนไซมทจลนทรยหลากหลายชนดสามารถสรางออกมาได โดยจลนทรยบางชนดอาจตองมตวชกนาใหมการสรางเอนไซม แตบางชนดสามารถสรางเอนไซมออกมาไดโดยไมตองใชสารชกนา เชน ราบางสายพนธไดแก Aspergillus flavus (MTCC-

8654) (Banga and Tripathi, 2009 : 99-104) และแบคท เ รยบางสายพน ธ ไดแ ก Bacillus sp.

Bacteroides sp. และ Pedobacter heparinus (Kim et al., 2004 : 684-690, Yoshida et al., 2002 : 1181-

1184) ซงจลนทรยทพบวาสามารถสรางเฮพารเนสไดนน สวนใหญคดแยกไดจากดนในธรรมชาต และในลาไสของมนษย (human intestine)

เฮพารเนส เปนเอนไซมทสามารถยอยสลายโมเลกลของเฮพารน (Heparin) และ เฮพารานซลเฟต (Heparan sulfate) ซงเปนอนพนธของเฮพารน ใหเปนโอลโกแซกคาไรดสายสน (short chain length oligosaccharides)ได เฮพารเนสสามารถจาแนกออกเปน 3 ชนด โดยแตละชนดของเอนไซมจะมความจาเพาะตอซบสเตรต (substrate) ทตางกนดงน เฮพารเนส มกลไกการตดของ พอลแซกคาไรดในตาแหนงทม 1,4-linked D-glucuronate หรอ L-iduronate residuce และ 1,4-α-

linked 2-sufoamine-α-deoxy ซงตาแหนงการตดจะขนอยกบชนดของเอนไซม และซบสเตรต ไดแก เฮพารเนส I (Heparinase I, EC. 4.2.2.7) จะมความจาเพาะตอเฮพารน และเฮพารานซลเฟตในอตราสวน 3:1, เฮพารเนส II (Heparinase II, EC. No number) มความจาเพาะตอเฮพารนและ เฮพารานซลเฟตในอตราสวน 2:1 และเฮพารเนส III (Heparinase III, EC. 4.2.2.8) มความจาเพาะตอ เฮพารานซลเฟตเพยงชนดเดยว ซงการจดจาแนกเอนไซมเฮพารเนสจะจดจาแนกตามชนดของ ซบสเตรตและตาแหนงของการยอยสลายพนธะบนสายพอลเมอรของสารเฮพารนทแตกตางกน นอกจากความสามารถในการตดพนธะทตาแหนงแตกตางกนแลว และยงสามารถใชขนาดของโมเลกลในการจาแนกชนดของเอนไซมเฮพารเนสไดอกทางหนง ขนาดโมเลกลของเอนไซม เฮพารเนสทง 3 ชนดมทผลตไดจาก Pedobacter heparinus มดงน เฮพารเนส I มขนาดโมเลกลเทากบ 43 kDa, เฮพารเนส II มขนาดโมเลกลเทากบ 72 kDa และ เฮพารเนส III มขนาดโมเลกลเทากบ 84 kDa (Yoshida et al., 2002 : 1181-118 )

สำนกหอ


2

เอนไซมเฮพารเนสสามารถนามาใชประโยชนในหลายดานโดยเฉพาะในทางดานการแพทย และเภสชกรรม เชน ใชในการเตรยมสารละลายลมเลอด ใชในการปรบอตราเรวในการเกดโปรทรอมบน (Prothrombin) และทรอมโบพลาสตน (Thromboplastin) ในกระบวนการ การแขงตวของเลอด (blood clotting) ใหกลบมามอตราเปนปกตหลงจากไดรบเฮพารนเขาไปในรางกาย นอกจากนเอนไซมเฮพารเนสยงถกประยกตใชในกระบวนการเตรยมสารตานเนองอก (antitumor agents) ใชในการตรวจสอบโครงสรางของเฮพารน หรอแอนะลอกของเฮพารน สามารถประยกตใชเฮพารเนสในการเตรยมเฮพารนสายสน (Low Molecular Weight Heparin หรอ LMWH) ซงเปนสาร anticoagulant ทมประสทธภาพสง และยงนาเอนไซมเฮพารเนส มาใชในการลดหรอขจดการทางานของสารเฮพารน (deheparinization) ในหนวยกรองทใชเฮพารนในปรมาณมากเกนขนาด ในปจจบนจลนทรยทสามารถผลตเอนไซมเฮพารเนสไดในระดบทางการคา ไดมาจากเชอแบคทเรย Pedobacter heparinus ซงมการใชสารเฮพารนเปนสารชกนาใหจลนทรยดงกลาวสรางเอนไซมเฮพารเนสขน ดงนนจงไดศกษาและทาการคดแยกเชอจลนทรยทมประสทธภาพในการสรางเอนไซม เฮพารเนสทเทยบเทา หรอมประสทธภาพทสง โดยไมใชสารชกนาใหมการสรางเอนไซมเฮพารเนสเพอเปนการลดตนทนในกระบวนการการผลต

ในการดาเนนการวจยครงน จงจะมงเนนในการคดกรองเชอจลนทรยทมประสทธภาพและมความเหมาะสมในการผลตเอนไซมเฮพารเนส และศกษาการทาใหเอนไซมบรสทธ รวมทงการศกษาคณสมบตบางประการของเอนไซมเฮพารเนส

สำนกหอ


3

2. วตถประสงคของการศกษา 2.1 ศกษากจกรรม และปรมาณของเอนไซมเฮพารเนสทผลตโดยแบคทเรยทคดแยกได

ทงเอนไซมสกดหยาบ และเอนไซมทผานการทาบรสทธ

2.2 ศกษาสภาวะหรอปจจยแวดลอมทสงผลตอกจกรรมของเอนไซมเฮพารเนส เชน อณหภม คาความเปนกรด-ดาง ไอออนวาเลนซ I และ II เปนตน

2.3 สามารถตรวจสอบขนาดโมเลกลของเอนไซมเฮพารเนสจากเชอแบคทเรยทคดแยกได

3. สมมตฐานของการศกษา 3.1 เชอแบคทเรยทคดแยกไดมความสามารถผลตเอนไซมเฮพารเนสไดแตกตางกน 3.2 ปจจยแวดลอมสงผลตอกจกรรมของเอนไซมเฮพารเนส 3.3 สามารถตรวจสอบขนาดโมเลกลเอนไซมเฮพารเนสทผลตจากเชอแบคทเรย

ทคดกรองได

4. ขอบเขตงานวจย

4.1 วเคราะหกจกรรมจาเพาะ และปรมาณเอนไซมเฮพารเนสทผลตโดยแบคทเรย ทคดแยกได ทงเอนไซมสกดหยาบและทผานการทาบรสทธ

4.2 ทาบรสทธเอนไซมเฮพารเนสโดยอาศยการตกตะกอนเอนไซมดวยเกลอแอมโมเนยมซลเฟตอมตว วธโครมาโทกราฟโดยผาน Ion-exchanger column และ gel filtration เปนตน

4.3 วเคราะหผลกระทบของปจจยแวดลอมทสงผลตอกจกรรม และปรมาณผลผลตเอนไซมเฮพารเนส

4.4 ตรวจสอบขนาดโมเลกลของเอนไซมเฮพารเนสทผลตจากเชอแบคทเรย ทคดกรองได

สำนกหอ


4

บทท 2

วรรณกรรมทเกยวของ

1. ไกลโคซามโนไกลแคน (Glycosaminoglycans)

ไกลโคซามโนไกลแคน (Glycosaminoglycans ; GAGs) หรอ มวโคพอลแซกคาไรด (Mucopolysaccharide) มลกษณะเปนซลเฟตพอลแซกคาไรด (sulfated polysaccharide) สายยาว ไมแตกแขนง ประกอบดวยหนวยไดแซกคาไรดซาๆ หลายหนวยซงประกอบดวยนาตาล hexose

หรอนาตาลท มคา รบอน 6 อะตอม หรอกรดยโรนก (uronic acid) และกาแลกโตซามน (Galactosamine) จานวน 40 – 100 ซา ไกลโคซามโนไกลแคนสามารถพบไดบนผวเซลลใตชนของเ ย อ ห ม เ ซ ลล (Extracellular matrices ; ECM) (Godavarti et al., 1996: 751-758) Extracellular

matrices เปนโครงสรางทประกอบดวยโปรตนทพบไดในเนอเยอของมนษย สวนประกอบหลกของ Extracellular matrices คอ ไกลโคโปรตน (Glycoprotein) ซงเปนโปรตนทยดตดกบคารโบไฮเดรต ซงมกเปนนาตาลทมโมเลกลสนๆ ดวยพนธะโควาเลนซ ซงไกลโคโปรตนหลกของ Extracellular

matrices ม 3 ชนด คอ โปรตโอไกลแคน (Proteoglycan), คอลลาเจน (Collagen) และไฟโบรเนกตน (Fibronectin) ซงเสนใยคอลลาเจนจะฝงตวอยในโปรตโอไกลแคนเชงซอน (Proteoglycan complex)

ประกอบดวยโมเลกลของโปรตโอไกลแคน ตอขยายดวยสายยาวของคารโบไฮเดรต ทาใหมลกษณะเปนกง และไฟโบรเนกตน จะมลกษณะคลายกาวยด Extracellular matrices ใหตดกบเยอหมเซลลตรงตาแหนงของเยอโปรตน (Integrins)

GAGs มชอเรยกทแตกตางกนขนอยกบนาตาลสองชนดซงเปนองคประกอบของ พอลแซกคาไรด คอ N-acetylgalactosamine (GalNAc) หรอ N-acetylglucosamine (GlcNAc) กบ กรดยโรนก เชน glucuronate (GlcA) หรอ iduronate เปนตน นอกจากนยงมความแตกตางกนในทางเรขาคณตของพนธะไกลโคซดกอกดวย (ตารางท 1)

สำนกหอ


5

ตารางท 1 ประเภทของไกลโคซามโนไกลแคน

ชอ กรดยโรนก เฮกโซซามน เอกสารอางอง

เฮพารน (Heparin)

GlcUA หรอ IdoUA GlcNAc หรอ GlcNS หรอ GlcAc (6s) หรอ GlcNS (6S) (Limtiaco et al., : - )

เฮพารานซลเฟต (Heparan sulfate)

GlcUA หรอ IdoUA GlcNAc หรอ GlcNS หรอ GlcAc (6s) หรอ GlcNS (6S) (Sugahara and Kitagawa. 2002: 163-175)

คอนดรอยตนซลเฟต (Chondroitin sulfate)

GlcUA หรอ GlcUA (2S) GalNAc หรอ GalNAc (4S) หรอ GalNAc (6S) หรอ GalNAc (4S, 6S)

(Gargiulo et al., 2009: 1485-1491)

เดอมาแตนซลเฟต (Dermatan sulfate)

GlcUA หรอ IdoUA หรอ IdoUA (2S)

GalNAc หรอ GalNAc (4S) หรอ GalNAc (6S) หรอ GalNAc (4S, 6S)

(Linhardt et al., 1991: 1609-1619)

เคอราแตนซลเฟต

(Keratan sulfate)

Gal หรอ Gal (6S) GlcNAc หรอ GlcNAc (6S) (Funderburgh. 2002: 187-194)

สำนกหอ


6

1.1 เฮพารน (Heparin)

เฮพารนเปนยาตานการแขงตวของเลอด (blood coagulation) ถกจดใหอยในกลมของไกลโคซามโนไกลแคน ซงประกอบดวยมอนอเมอรสองชนด เ รยกวา โคพอลเมอร (Co-polymer) โดยทวไปพอลเมอรกลมนจะมลกษณะทเรยกวา พอลดสเพอรส (Polydisperse) ซงความยาวของแตละโมเลกลจะไมเทากน จงทาใหนาหนกโมเลกลแตกตางกน ดงนนนาหนกโมเลกลของพอลเมอรนจะเปนคาเฉลยของนาหนกโมเลกลทงหมด

เฮพารน เปนซลเฟตพอลแซกคาไรด ซงประกอบดวยหนวยไดแซกคาไรดทซาๆกน (Repeating disaccharide) ของกรดยโรนก และกลโคซามน (Mourier et al., 2015: 46-53) ดงภาพท 1 ทมหมซลเฟตจานวนมากมาเกาะทนาตาลทงสองทาใหเฮพารนมประจรวมเปนลบ ประจลบของเฮพารนจะจบ และกระตนโปรตน แอนตทรอมบน III (antithrombin III) ชวยปองกนการแขงตว แหลงทพบเฮพารนอยใตชนเนอเยอ และ Extracellular matrices ของเซลลสตว และจะถกปลดปลอยออกมากตอเมออยในหลอดเลอดของเนอเยอไดรบการบาดเจบ และนอกจากนเฮพารนยงพบในสงมชวตหลายชนด รวมทงสตวไมมกระดกสนหลงทไมมระบบการแขงตวของเลอดดวย สวนเฮพารนทมคณภาพระดบใชเปนยาไดมาจากเนอเยอของสตว เชน ลาไสหมหรอปอดวว (Linhardt and Gunay, 1999 : 5-16)

L – Idoronic acid D - Glucosamine

ภาพท 1 โครงสรางของเฮพารน

สำนกหอ


7

เฮพารน ม 2 แบบ คอ Un-fractionated heparin (UFH) และ Low molecular weight

heparin (LMWH) เฮพารนออกฤทธโดยการชวยเหลอของแอนตทรอมบน ตอตานการทางานของทรอมบน (Thrombin) ไมใหสลายไฟบรโนเจน (Fibrinogen) จงไมมการสรางไฟบรน (Fibrin) นอกจากจะตอตานทรอมบนแลว เฮพารนยงออกฤทธตอตาน factor IXa, Xa, Xia และ XIIa โดยจะออกฤทธททรอมบน และfactor Xa มากทสด ผลทไดคอ ไมมการสรางลมเลอดใหม เฮพารนออกฤทธปองกนไมใหมการสรางลมเลอดขนมาใหม 1.2 เฮพารานซลเฟต (Heparan sufate)

เฮพารานซลเฟต (Heparan sulfate) มโครงสรางคลายเฮพารน (ภาพท 2) แตมความแตกตางกนทจานวนซลเฟตซงเฮพารนจะมซลเฟตทสงกวาเฮพารานซลเฟต และกรดอะมโนของ กลโคซามน (Hovingh and Linker. 1970 : 6170-6175) พบไดในเซลลหลายชนดโดยเฉพาะบนผวเซลลตบ และพบมากในผนงเสนเลอด และสมอง

D – Glucuronic acid D – Glucosamine

ภาพท 2 โครงสรางของเฮพารานซลเฟต

สำนกหอ


8

ประโยชนของเฮพารนทใชในทางการแพทย

1. ใชในโรคหลอดเลอดหวใจแบบเฉยบพลน

2. รกษาสภาวะอดตนของหลอดเลอดดาและเสนเลอดในปอดอดตน

3. สาหรบการผาตด

4. ใชในการทาหตถการของการชวยชวต

5. ปองกนการแขงตวของเลอดขณะทาการฟอกเลอดดวยเครองไตเทยม

2. เอนไซมเฮพารเนส (Heperinase)

เอนไซมเฮพารเนสถกจดอยในกลมไลเอส (Lyase) เนองจากมการเรงปฏกรยาการเคลอนยายหมตางๆ ออกจากซบสเตรตตรงบรเวณทมการสรางพนธะคอยางจาเพาะทตาแหนงระหวางคารบอน และออกซเจนบนสายพอลแซกคาไรด เกดผลตภณฑทประกอบดวยพนธะค คอ โอลโกแซกคาไรคสายสน เอนไซมเฮพารเนสจงมชอตามระบบ (systematic name) คอ Heparin

lyase หรอ Heparin eliminase

เฮพารเนสเปนเอนไซมทพบไดทงในสตว และจลนทรย เฮพารเนสสามารถยอยสลายพนธะไกลโคซดกลงคเกจ (Glycosidic linkages) ระหวาง N-sulfated D-glucosamine และ sulfated

D-glucuronic acid บนสายพอลแซกคาไรดของเฮพารน และเฮพารานซลเฟต (Tripathi et al., 2012 : 307-321) เฮพารเนสแบงไดเปน 3 ชนด โดยการพจารณาจากชนดของซบสเตรตทเอนไซม เฮพารเนสใชในการยอยสลาย คอ เฮพารน เฮพารานซลเฟต และการเกดปฏกรยาในการยอยสลายซบสเตรต ซงเฮพารเนสทง 3 ชนด เปนเอนไซมทใชในระดบการคา ซงผลตไดจากเชอ Pedobacter heparinus ไดแก

2.1 เฮพารเนส I (Heparinase I) EC. 4.2.2.7

เฮพารเนส I เปนเอนไซมทมกลไกการยอยสลายสายพอลแซกคาไรด ทมหมซลเฟตในปรมาณทสงโดยเอนไซมจะเรงปฏกรยาในการยอยสลายพนธะไกลโคซดกทตาแหนง 1-4

ซงอยระหวาง hexosamine และ O-sulfated iduronic residue ผลตภณฑทไดหลงจากการยอยสลายคอ โอลโกแซกคาไรด ซงประกอบไปดวยกรดยโรนกทไมอมตว ดงภาพท 3 และสามารถตรวจวดผลตภณฑทเกดขน โดยการวดดวยคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 232 nm เฮพารเนส I สามารถยอยสลายไดทงเฮพารน และเฮพารานซลเฟตในอตราสวน 3 : 1 ดงนนเอนไซมเฮพารเนส I จงมความจาเพาะเจาะจงตอเฮพารน มากกวาเฮพารานซลเฟต

สำนกหอ


9

ภาพท 3 ตาแหนงการยอยสลายพนธะ glycosidic linkage โดยเอนไซมเฮพารเนส I และผลตภณฑท

เกดขน

Heparin

N-sulfated glucosamine 2-O-sulfated iduronic acid

สำนกหอ


10

2.2 เอนไซมเฮพารเนส II ยงไมระบ EC (Heparinase II no EC number)

เฮพารเนส II เปนเอนไซมทมกลไกการยอยสลายสายพอลแซกคาไรด โดยจะเรงปฏก รยาในการยอยสลายพนธะไกลโคซดกตาแหนง 1-4 ซงอยระหวาง hexosamine และ กรดยโรนก คอ iduronic และ glucuronic acid ในโครงสรางเฮพารน และเฮพารานซลเฟต หลงจากเกดปฏกรยาจะไดผลตภณฑเปนโอลโกแซกคาไรด (oligosaccharide) ซงจะประกอบไปดวย กรดยโรนกทไมอมตว ดงภาพท 4 และสามารถตรวจวดผลตภณฑทเกดขน โดยการวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 232 nm เฮพารเนส II สามารถยอยสลายไดทง เฮพารน และ เฮพารานซลเฟตในอตราสวน 2 : 1

ภาพท 4 ตาแหนงการยอยสลายพนธะ glycosidic linkage โดยเอนไซมเฮพารเนส II

Heparinase II

N-sulfated หรอ glucuronic หรอ idoronic acid

N-acetylated glucosamine

สำนกหอ


11

2.3 เฮพารเนส III (Heparinase III) EC. 4.2.2.8

เฮพารเนส III เปนเอนไซมทมกลไกการยอยสลายพอลแซกคาไรด โดยเอนไซมจะมความจาเพาะเจาะจงตอซบสเตรต คอ เฮพารานซลเฟตเพยงอยางเดยว ดงนนจงไมสามารถใชยอยเฮพารน หรอ LMWH ได เอนไซมจะเรงปฏกรยาในการยอยสลายพนธะไกลโคซดกทตาแหนง 1-4

ซงอยระหวาง hexosamine และ glucuronic acid หลงจากเกดปฏก รยาจะไดผลตภณฑ เ ปน โอลโกแซกคาไรด ซงจะประกอบไปดวยกรดยโรนกทไมอมตว ดงภาพท 5 และสามารถตรวจวดผลตภณฑทเกดขน โดยการวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 232 nm

ภาพท 5 ตาแหนงการยอยสลายพนธะ glycosidic linkage โดยเอนไซมเฮพารเนส III

Heparinase III

N-sulfated หรอ N-acetylated glucuronic acid

glucosamine

สำนกหอ


12

3. แหลงของจลนทรยทสามารถสรางเอนไซมเฮพารเนส

จลนทรยทสามารถสรางเอนไซมเฮพารเนสสามารถแยกไดจากแหลงตางๆ ซงดนเปนแหลงของจลนทรยทสามารถสรางเอนไซมเฮพารเนสไดเปนจานวนมาก นอกจากนยงพบจลนทรยทสรางเอนไซมเฮพารเนสไดในลาไส และสารคดหลงของมนษย

เอนไซมเฮพารเนสจากจลนทรยแตละชนดจะมสมบตทแตกตางกนไป ขนอยกบชนดของจลนทรย ซงในทนเราสามารถแบงจลนทรยทสรางเอนไซมเฮพารเนสไดเปน 2 กลม คอ กลมของแบคทเรย และเชอรา ดงตารางท 2 นอกจากนยงพบเอนไซมเฮพารเนสทผลตไดจากสตวประเภทหอย ซงจดอยในไฟลมมอลลสกา (Phylum Mollusca) คอ Bursatella leachii และ Dolabella auriculaira (Abirami et al., 2011: 112-116; Rajaganapathi and Kathiresan. 2002: 264-266)

สำนกหอ


13

ตารางท 2 จลนทรยทสามารถสรางเอนไซมเฮพารเนส

จลนทรย ชนด แหลงทพบ เอกสารอางอง

Acinetobacter calcoaceticus แบคทเรยแกรมลบ ดน (Banga and Tripathi. 2009: 99-104)

Aspergillus flavas (MTCC-8654) เชอรา ดน (Banga and Tripathi. 2010: 1004-1016)

Aspergillus oryzae เชอรา ดน (Banga and Tripathi. 2010: 1004-1016)

Bacillus circulans แบคทเรยแกรมบวก ดน (Yoshida et al., 2002 : 1004-1016) Bacteroides fragilis แบคทเรยแกรมลบ ตวอยางทางคลนก (Riley. 1987 : 384-386) Bacteroides heparinolyticus แบคทเรยแกรมลบ ชองปาก (Nakamura et al., 1988 : 1070-1071) Bacteroides malaninogenicus แบคทเรยแกรมลบ ชองปาก (Nakamura et al., 1988: 1070-1071)

Bacteroides oralis แบคทเรยแกรมลบ ชองปาก (Nakamura et al., 1971 : 1146) Bacteroides stercoris HJ-15 แบคทเรยแกรมลบ ลาไสมนษย (Kim et al., 2001 : 2635-2641) Bacteroides thetaiotaomicron แบคทเรยแกรมลบ - (Riley. 1987: 384-386)

Corynebacterium sp. แบคทเรยแกรมบวก ดน (Gao et al., 1999 : 64-67) Pedobacter heparinus แบคทเรยแกรมลบ ดน (Payza and Korn. 1956 : 88-89) Sphingobacterium sp. แบคทเรยแกรมลบ ดน (Gao et al., 2003 : 813-816)

สำนกหอ


14

แบคทเรยทผลตเอนไซมเฮพารเนสไดในระดบทางการคา คอ Pedobacter heparinus (ซงเดมถกเรยกวา Flavobacterium heparinum) Pedobacter heparinus จดอยในจนส Pedobacter แฟมล Sphingobacteriaceae และไฟลม Bacteroidetes สามารถคดแยกไดจากดน เปนแบคทเรยทไมกอโรค (non-pathogenic bacteria) โคโลนมสเหลอง เปนแบคทเรยแกรมลบ (gram-negative) รปรางเปนแทง ไมมการเคลอนท (Payza and Korn. 1956: 88-89) ซงเชอ Pedobacter heparinus มความนาสนใจเนองจากสามารถผลตเอนไซมไดหลายชนด ซงเปนเอนไซมทสามารถยอยสลายสารในกลมของไกลโคซามโนไกลแคนได 5 ชนด ประกอบดวย เอนไซมเฮพารเนส I, เฮพารเนส II และ เฮพารเนส III (Yang et al., 1985: 1849-1857) และเอนไซมคอนดรอยตเนส AC และ B (Su et al.,

2001: 581-589; Yamagata et al., 1968: 1523-1535) เอนไซมทไดแบคทเรยดงกลาวสามารถผลตไดจดอยในกลมของ intracellular enzyme ซงอยบรเวณ periplasmic space พบวาเปนโครงสรางของแบคทเรยแกรมลบซงอยระหวาง outer membrane และยงพบเอนไซมทความสาคญในการยอยสลายสารชวโมเลกลของใหญทจาเปนตอการเจรญเตบโตของเซลลอกดวย

สำนกหอ


15

4. การศกษาการทาบรสทธเอนไซมเฮพารเนส

การทาใหเอนไซมบรสทธเปนการแยกเอนไซมทตองการศกษาออกจากโปรตนชนดอนๆ ทปนเปอนอยในสารละลายเอนไซม โดยปจจยทใชในการพจารณาเลอกวธการแยกเอนไซมใหบรสทธ คอ สมบตของเอนไซม เอนไซมแตละชนดมคณสมบตทางกายภาพและทางเคมทแตกตางกน จงใชคณสมบตทแตกตางกนนมาชวยในการแยกเอนไซมทตองการหรอสนใจออกจากโปรตนตวอน หรอสงปนเปอนอนๆ จงนาหลกการนมาประยกตใชในการศกษาการทาบรสทธเอนไซมเฮพารเนสซงวธทนยมใชในการทาบรสทธเอนไซมไดแก

4.1 วธการตกตะกอน

วธการตกตะกอนเอนไซมมหลายวธขนอยกบชนดของเอนไซมแตละชนด ซงวธทนยมใชมากทสด คอ การตกตะกอนดวยเกลอแอมโมเนยมซลเฟต สามารถตกตะกอนโปรตนโดยอาศยหลกการ Salting Out โดยเมอความเขมขนเกลอเพมขน เกลอจะแยงนาทอยรอบๆโปรตนทาใหโปรตนตกตะกอนลงมา และในการตกตะกอนโปรตนดวยเกลอจาเปนจะตองกาจดเกลอออก เนองจากเกลออาจจะรบกวนการวเคราะห หรอมผลตอขนตอนการทาบรสทธ การกาจดเกลอออกโดยการทา Dialysis นอกจากการตกตะกอนโปรตนดวยเกลอแลวยงมวธการตกตะกอนทจด ไอโซอเลคทรค (isoelectric point) และการตกตะกอนดวยตวทาละลายอนทรยเปนตน

4.2 วธโครมาโทกราฟ

คอลมนโครมาโทกราฟ เปนเทคนคทนยมใชในการแยกสารตางๆ ซงมหลายชนด ดงตารางท 3 ซงเปนกระบวนการททาใหสารมความบรสทธเพมขน

ตารางท 3 เทคนคและคณสมบตของคอลมนโครมาโทกราฟชนดตางๆ

เทคนค คณสมบต Ion Exchange Chromatography แยกตามลกษณะของประจ Gel Filtration (Size Exclusion) Chromatography แยกตามขนาดของโมเลกล Affinity Chromatography แยกตามความจาเพาะในการจบกบ Ligand

สำนกหอ


16

โครมาโทกราฟ ทนยมใชในการแยกโปรตน ไดแก

4.2.1 โครมาโทกราฟแบบแลกเปลยนประจ

โครมาโทกราฟแบบแลกเปลยนประจ เปนกระบวนการแลกเปลยนประจระหวางเฟสเคลอนท (mobile phase) ทเปนของเหลว กบเฟสคงท (stationary phase) ทเปนของแขงไมละลายในตวทาลาย เรยกวา เมทรกซ (matrix) โครมาโทกราฟแบบแลกเปลยนประจสามารถแบงออกเปน 2 ชนด คอ Anion exchange และ Cation exchange ดงตารางท 4 ซงเมทรกซจะเปน พอลเมอรทสามารถจบกบประจทงประจบวกและลบได ดงนนจงสามารถโปรตนตามประจท pH

นนๆของโปรตน ซงโปรตนทจบกบคอลมนจะถกชะออกโดยการเพมความเขมขนของเกลอในบฟเฟอรทใชชะคอลมน โดยโปรตนทมประจนอยจะจบกบเมทรกซไดไมแนนจงจะถกชะออกมากอน สวนโปรตนทสามารถจบกบเมทรกซไดแนนจะถกชะออกมาภายหลงดวยความเขมขนของเกลอทสงขน

ตารางท 4 ชนดของ Ion exchange ทงแบบ Anion และ Cation exchangers

ชนดของ Anion Exchangers หมททาหนาท (Functional group)

Diethylaminoethyl (DEAE) -O-CH2-CH2-N+H(CH2CH3)2

Quaternary Aminoethyl (QAE) -O-CH2-CH2-N+(C2H5)2-CH2-CHOH-CH3

ชนดของ Cation Exchangers หมททาหนาท (Functional group)

Carboxymethyl (CM) -O-CH2-COO-

Sulphopropyl (SP) -O-CH2 –CHOH-CH2-O-CH2- CH2- CH2SO3-

4.2.2 โครมาโทกราฟแบบ gel filtration หรอ size exclusion

เปนการแยกโปรตนตามขนาดโดยมเมทรกซทมลกษณะทเปนเมดเจล และมรพรนขนาดตางๆ สวนใหญจะทาดวยพอลแซกคาไรค หรอ พอลอะครลาไมด ภายในเมดเจลแตละเมดมชองวางทจาเพาะซงจะยอมใหสารทมโมเลกลคาหนงผานเขาไปในเมดเจลได สวนสารทมขนาดใหญจะไมสามารถเขาไปในเมดเจลไดจงถกชะออกมากอน จากหลกการทไดกลาวมาจะสามารถแยกโมเลกลทมขนาดใหญออกจากโมเลกลทมขนาดเลก ตวอยางของ gel filtration เชน Sephadex, Agarose และ Sepharose เปนตน

สำนกหอ


17

จากรายงานการวจยในหลายๆ ฉบบทมการศกษาเกยวกบการทาบรสทธเอนไซม เฮพารเนสทผลตไดจากจลนทรยตางๆ เชน รา และแบคทเรย นามาทาใหเอนไซมมความบรสทธมากขนดวยขนตอนทแตกตางกน เมอไดเอนไซมทบรสทธจงนามาศกษาคณสมบตของเอนไซมตอไป

Banga Jaspreet and Tripathi C. K. M. ไดทาการทดลองแยกเอนไซมเฮพารเนส บรสทธจากแบคทเรย Acinetobacter calcoaceticus โดยการทาให เซลลแตกดวยว ธ Freeze and thaw

เนองจากเอนไซมเฮพารเนสเปนเอนไซมทอยภายในเซลล จากนนนาสารละลายเอนไซมมาผานการแยกบรสทธดวยคอลมนโครมาโทกราฟชนด DEAE-Sephadex A50, SP-Sephadex C50 และ Sephacryl S-200 HR ตามลาดบ ซงไดเอนไซมทมความบรสทธเพมขน 51.2 เทา และมาคากจกรรมจาเพาะของเอนไซมเทากบ 41 U/ g protein เอนไซมเฮพารเนสทพบมลกษณะของปฏกรยาทคลายกบเอนไซมเฮพารเนส I ของ Flavobacterium heparinum ซงมขนาด 43 kDa (Banga and Tripathi.

2009: 99-104)

ใน ป ค .ศ . 2010 Banga Jaspreet and Tripathi C. K. M. ไดทาศกษาการทาบรสทธเอนไซมเฮพารเนสจากรา Aspergillus flavus (MTCC-8654) โดยการทาใหเซลลแตกดวยคลนเสยงความถสง (ultrasonication) เพอปลดปลอยเอนไซมใหออกมาในสารละลาย จากนนตกตะกอนดวยโปรตามนซลเฟต (protamine sulfate) ความเขมขน 1 mg/mg protein เพอใหสารละลายเอนไซมมความเขมขนเพมขน จากนนนาสารละลายเอนไซมมาผานคอลมนโครมาโทกราฟชนด DEAE-

Sephadex A-50, CM-Sephadex C-50 และ Sephadex G-100 ตามลาดบ พบวา มคากจกรรมจาเพาะของเอนไซมบรสทธ เทากบ 44.6 U/ g protein และมความบรสทธเพมขนเปน 40.5 เทา (Banga

and Tripathi. 2101 : 1004-1016)

Xiaolai Ma และคณะ ไดศกษาเอนไซมเฮพารเนส จากเชอแบคทเรย Flavobacterium heparinum โดยนาไปผานขนตอนการตกตะกอนดวยเกลอแอมโมเนยมซลเฟต เพอแยกโปรตนทปนเปอนออกจากเอนไซม แลวทาใหเอนไซมบรสทธขนโดยการผานคอลมนโครมาโทกราฟชนด Octyl-Sepharose, CM-52, SP-650 และ Sephadex G-100 ตามลาดบ หลงจากผานการทาบรสทธ พบวา คากจกรรมเอนไซมจาเพาะ เทากบ 90.33 U/mg protein และมความบรสทธเพมขน 185.1 เทา และเอนไซมเฮพารเนสทพบเปนเฮพารเนส I ซงมขนาดโมเลกล เทากบ 43 kDa (Ma et al., 2006:

209-215)

สำนกหอ


18

Kim Wan-Seok และคณะ สามารถผลตเอนไซมเฮพารเนส จากแบคทเรย Bacteroides stercoris HJ-15 เอนไซมทไดจากการทาใหเซลลแตก และนามาผานคอลมนโครมาโทกราฟชนด DEAE-Sepharose แลวทาใหเอนไซมมความเขมขนสงขนโดยการตกตะกอนดวยเกลอแอมโมเนยมซลเฟตทความอมตวรอยละ 30 70 จากนนทาใหบรสทธโดยผานคอลมนโครมาโทกราฟชนด Bio-Gel P-100, hydroxyapatite และ CM-Sephadex C-50 ตามลาดบ และเอนไซมทพบมความคลายกบเอนไซมเฮพารเนส I ซงมขนาดโมเลกลเทากบ 48 kDa (Kim et al., 2004: 684-690)

ใน ป ค.ศ. 2002 Yoshida และคณะ ไดทาการทดลองผลตเอนไซมเฮพารเนสจากแบคทเรย Bacillus circulans และทาบรสทธเอนไซมโดยผานขนตอนตางๆ ดงน ตกตะกอนโปรตนดวยเกลอแอมโมเนยมซลเฟตความอมตวรอยละ 30-60 เพอแยกเอนไซมออกจากโปรตนทปนเปอน จากนนนาสารละลายเอนไซมมาทาใหมความบรสทธมากขนโดยผานคอลมนโครมาโทกราฟชนด DEAE-Sephacel, Sulfated cellulofine และ Sephacryl S-200HR ตามลาดบ พบคากจกรรมเอนไซมเทากบ 0.81 U/mg protein และเอนไซมเฮพารเนสจาก Bacillus circulans สามารถยอยสลายไดทง เฮพารน และเฮพารานซลเฟต ซงมความคลายกบเอนไซมเฮพารเนส II จาก Flavobacterium heparinum แตมความแตกตางกนทขนาดของโมเลกลของเอนไซม (Yoshida et al., 2002: 1181-

1184)

จากขอมลการทาบรสทธเอนไซมเฮพารเนสจากเชอจลนทรยชนดตางๆ สามารถสรปผลไดดงตารางท 5 ซงเปนการเปรยบเทยบขนตอนการทาบรสทธ และปรมาณเอนไซมทไดหลงจากผานการทาบรสทธ

สำนกหอ


19

ตารางท 5 ขนตอนการทาบรสทธเอนไซมเฮพารเนส และการเปรยบเทยบปรมาณเอนไซมของจลนทรย จลนทรย ขนตอนการทาบรสทธ Total activity (U) Specific activity

(U/mg)

เอกสารอางอง

Acinetobacter calcoaceticus - DEAE-Sephadex A-50

- SP-Sephadex C-50

- Sephacryl S-200 HR

4256.2 41.0 (Banga and Tripathi. 2009: 99-104)

Bacteroides stercoris HJ-15 - DEAE-Sepharose

- ตกตะกอนดวย Ammonium sulfate

- Bio-Gel P-100

- hydroxyapatite

- CM-Sephadex C-50

0.5 16.0 (Kim et al., 2004: 684-690)

Flavobacterium heparinum - ตกตะกอนดวย Ammonium sulfate

- Octyl-Sepharose

- CM-52

- SP-650

- Sephadex G-100

13.01 90.33 (Ma et al., 2006: 209-215)

สำนกหอ


20

ตารางท 5 แสดงขนตอนการทาบรสทธเอนไซมเฮพารเนส และการเปรยบเทยบปรมาณเอนไซมของจลนทรย (ตอ) จลนทรย ขนตอนการทาบรสทธ Total activity (U) Specific activity

(U/mg)


Bacillus circulans - ตกตะกอนดวย Ammonium sulfate

- DEAE-Sephacel

- Sulfated cellulofine

- Sephacryl S-200HR

15.7 0.85 (Yoshida et al., 2002: 1181-1184)

Aspergillus flavus (MTCC-8654) - ตกตะกอนดวย protamine sulfate

- DEAE Sephadex A-50

- CM-Sephadex C-50

- Sephadex G-100

- 44.6 (Banga and Tripathi. : -10 )

สำนกหอ


21

5. คณสมบตของเอนไซม

คณสมบตเฉพาะของเอนไซม (enzyme characterization) หมายถง คณสมบตจาเพาะของเอนไซมทมความจาเปนตอการทางานของเอนไซมชนดนน และเฉพาะเอนไซมชนดนนเพยงชนดเดยว ในปจจบนนยมศกษาคณสมบตเฉพาะของเอนไซมตางๆ ดงน

5.1 คาความเปนกรด-ดางทเหมาะสม (optimum pH)

คอ คาความเปนกรด-ดางทเอนไซมสามารถทางานไดสงสด ซงในการศกษาทาไดโดยบมเอนไซมในสารละลายบฟเฟอรทมคาความเปนกรด-ดาง ตงแต 1-14 ซงจะใชระบบบฟเฟอรชนดตางๆ แลวตดตามการทางานของเอนไซมในปฏกรยาทคาความเปนกรด-ดาง นนๆ จากนนนาคาทไดมาวาดกราฟ ซงกราฟทไดจะมลกษณะเปนรประฆงควา คาความเปนกรด-ดางทใหคากจกรรมเอนไซมสงสดคอ คาความเปนกรด-ดางทเหมาะสมในการทางานของเอนไซม โดยเชอจลนทรยทสามารถผลตเอนไซมเฮพารเนสได เชน Acinetobacter calcoaceticus มคาความเปนกรด-ดางทเหมาะสมคอ 7.5 (Banga and Tripathi. 2009: 99-104) จากเชอรา Aspergillus flavus (MTCC-8654)

มคาความเปนกรด-ดางทเหมาะสมตอกจกรรมเอนไซมคอ 7.0 (Banga and Tripathi. 2010: 1004-

1016) (ตารางท 6)

5.2 อณหภมทเหมาะสม (optimum temperature)

คอ อณหภมทเอนไซมสามารถทางานไดสงสด ซงการศกษาจะมลกษณะคลายกบการหาคาความเปนกรด-ดางทเหมาะสม โดยตดตามการทางานของเอนไซมทมคาความเปนกรด-ดางทเหมาะสม แตจะบมปฏกรยาทอณหภมตางๆกน อณหภมทใหคากจกรรมเอนไซมสงสดกคอ

คาอณหภมทเหมาะสมในการทางานของเอนไซม และอณหภมทเหมาะสมตอกจกรรรมเอนไซม เฮพารเนสจากเชอจลนทรยชนดอน เ ชน Acinetobacter calcoaceticus และ Aspergillus flavus

(MTCC-8654) มอณหภมทเหมาะสมตอกจกรรมเอนไซมเทากบ 35 C (Banga and Tripathi. 2009:

99-104; Banga and Tripathi. 2010: 1004-1016) ซงเอนไซมเฮพารเนสจากจลนทรยบางชนดมอณหภมทเหมาะสมทคอนขางสงเชน เฮพารเนสทผลตไดจาก Bacteroides stercoris HJ-15 มอณหภมทเหมาะสมคอ 50 C (Kim et al., 2004: 684-690) (ตารางท 6)

5.3 ความเสถยรของเอนไซมทคาความเปนกรด-ดางตางๆ (pH stability)

เอนไซมททางานไดดทคาความเปนกรด-ดาง ทเหมาะสม แตความสามารถในการทางานอาจจะอยไดในชวงเวลาสนๆ จงจาเปนตองศกษาความเสถยรในการทางานของเอนไซมทคาคาความเปนกรด-ดางตางๆ เพอนาเอนไซมนนไปใชประโยชนได โดยการบมเอนไซมทคาความเปนกรด-ดางตางๆ เปนเวลาทมากพอ โดยความเสถยรของอณหภมของเอนไซมเฮพารเนส จากเชอ

สำนกหอ


22

Flavobacterium heparinum มความเสถยรของความเปนกรด-ดางอยท 7.0 (Yang et al., 1985: 1849-

1857)

5.4 ความเสถยรของเอนไซมทอณหภมตางๆ (temperature stability)

การศกษาความเสถยรของเอนไซมทอณหภมตางๆ มวธการศกษาทคลายกบการศกษาความเสถยรของเอนไซมทความเปนกรด-ดาง ซงในขนตอนการบมปฏกรยาเอนไซมจะบมทอณหภมทแตกตางกน แตระยะเวลาการบมเทากน ซงความเสถยรของอณหภมของเอนไซม เฮพารเนสจากเชอจลนทรย อาทเชน Bacteroides stercoris HJ-15 พบวา มความเสถยรของเอนไซมทอณหภม 25-50 C แตเมออณหภมสงขนมากกวา 50 C จะมคากจกรรมของเอนไซมลดลงอยางรวดเรว (Kim et al., 2004 : 684-690)

5.5 ความจาเพาะกบซบสเตรต (substrate specificity) ของเอนไซม เนองจากเอนไซมแตละชนดจะมความจาเพาะตอซบสเตรตทตางกน ซงขนอยกบโครงสรางการขดตวตรงบรเวณแอกทฟของเอนไซมนนๆ (Active site) และในเอนไซมบางชนดอาจจะทางานไดดกบสารทมโครงสรางทคลายกบซบสเตรต ดงนนในการศกษาสมบตของเอนไซมจงตองศกษาความจาเพาะตอซบสเตรตทหลากหลาย ในสวนของซบสเตรตของเอนไซมเฮพารเนส คอ เฮพารน และเฮพารานซลเฟต ซงจลนทรยทสามารถผลตเอนไซมเฮพารเนสได จะมความจาเพาะจงเจาะตอซบสเตรตทตางกนขนอยกบชนดของเอนไซมทจลนทรยนนสามารถผลตขนมาได (ตารางท 6) 5.6 ตวยบยง (inhibitor) และตวกระตน (activator) ของเอนไซม ในการทางานของเอนไซมบางครงอาจจะถกยบยงโดยตวยบยงบางชนด เชนโลหะหนก หรอสารทมโครงสรางคลายกบซบสเตรต และบางชนดสามารถถกกระตนการทางานของเอนไซมได ในสวนเชอจลนทรยทสามารถผลตเอนไซมเฮพารเนสได จะมตวยบยงซงเปนไอออนของโลหะ เชน เชอ Bacillus circulans มตวกระตนการทางานของเอนไซม คอ Ba2+ Ca2+ และ Mg2+

ทความเขมขน 5 mM และตวยบยงคอ Mn2+ Co2+ และ Cu2+(Yoshida et al., 2002 : 1181-1184)

สำนกหอ


23

ตารางท 6 คณสมบตบางประการของเอนไซมเฮพารเนสจากเชอจลนทรย

จลนทรย

ชนดของเฮพารเนส

ขนาดโมเลกล(kDa)

อณหภมทเหมาะสม

( C)

คาความเปนกรด-ดางทเหมาะสม


Acinetobacter calcoaceticus Heparinase I 120 35 7.5 (Banga and Tripathi. 2009: 99-104)

Aspergillus flavus (MTCC-8654) Heparinase I 24 35 7.0 (Banga and Tripathi. 2010: 1004-

1016)

Aspergillus oryzae Heparinase - - - (Banga and Tripathi. 2010: 1004-

1016)

Bacillus circulans Heparinase II 111 45 7.5 (Yoshida et al., 2002: 1181-1184)

Bacteroides fragilis Heparinase - - - (Riley. 1987: 384-6)

Bacteroides heparinolyticus Heparinase I 63 - 8.5

(Nakamura et al., 1988: 1070-1071)

and (Watanabe et al., 1998: 283-

288)

Bacteroides stercoris HJ-15 Heparinase I 48 50 7.0 (Kim et al., 2004: 684-690)

สำนกหอ


24

ตารางท 6 คณสมบตบางประการของเอนไซมเฮพารเนสจากเชอจลนทรย (ตอ)

ชนดของเฮพารเนส

ขนาดโมเลกล(kDa)

อณหภมทเหมาะสม

( C)

คาความเปนกรด-ดางทเหมาะสม


Bacteroides stercoris HJ-15 Heparinase II 83 45 7.2 (Kim et al., 2001: 2635-2641)

Bacteroides thetaiotaomicron Heparinase I - - - (Riley. 1987: 384-386)

Corynebacterium sp. Heparinase - - - (Gao et al., 1999 : 64-67)

Pedobactetr heparinus Heparinase I

Heparinase II

Heparinase III

43

85

73

45

7.6

(Bohmer et al., 1990: 13609-13617)

Sphingobacterium sp. Heparinase II 76 (Gao et al., 2003: 813-816)

สำนกหอ


25

6. ประโยชนของเอนไซมเฮพารเนส

โดยทวไปเฮพารเนสทผลตเพอนามาใชประโยชนและผลตเพอจาหนายในระดบทางการคา ไดมาจากเชอ Pedobacter heparinus ซงม 3 ชนด คอ เฮพารเนส I, เฮพารเนส II และเฮพารเนส III เฮพารเนสมประโยชนทงในดานการแพทย และการวเคราะหตางๆ ไดแก

ดานการแพทย นามาใชประโยชนในกระบวนการการแขงตวของเลอดหลงจากไดรบยาเฮพารนใหกลบมาอยในสภาวะปกต โดยจะปรบอตราการเกดโปรทรอมบน (prothrombin) และทรอมโบพลาสตน (thromboplastin), ใชในการเตรยมยาสลายลมเลอดชนดทมมวลโมเลกลตา (low molecular weight heparin ; LMWH), สารตานเนองอก (antitumor agents) โดยเฮพารเนสจะทาการยอยสลาย HSPG sugar backbones ทาให Fibroblast growth factors (FGF) เพมขนและสามารถยบยงเนองอกได (Schulze Daniel et al., 2011:144) และเฮพารเนสยงใชในการยบยงการสรางเสนเลอดใหมทผดปกต (neovascularization) โดยเอนไซมเฮพารเนส สามารถยอยสลายเยอเบสเมนท

(basement membrane) ทาใหมการปลดปลอย Fibroblast Growth Factor มากขนจงเปนผลทาใหมการยบยง การสรางเสนเลอดใหมทผดปกตได (Sasisekharan et al., 1994: 1524-1528)

สำนกหอ


26

บทท 3

อปกรณและวธดาเนนงานวจย

1. แหลงเชอจลนทรย

1.1 RYA_En1 คดแยกไดจากตะกอนดนเลนนากรอย คลองกะเฉด ตาบลกะเฉด อาเภอแกลงจงหวดระยอง

1.2 RYB_En1 คดแยกไดจากตะกอนดนเลนนากรอย คลองกะเฉด ตาบลกะเฉด อาเภอแกลง จงหวดระยอง

1.3 SKA_En1คดแยกไดจากตะกอนดนเลนนาเคม ดอนหอยหลอด ตาบลบางจะเกรง ตาบลแหลมใหญ ตาบลบางแกว และตาบลโคน อาเภอเมอง จงหวดสมทรสงคราม

1.4 RYA_HT1 คดแยกไดจากตะกอนดนเลนนากรอย คลองกะเฉด ตาบลกะเฉด อาเภอแกลง จงหวดระยอง

1.5 RYB_HT1 คดแยกไดจากตะกอนดนเลนนากรอย คลองกะเฉด ตาบลกะเฉด อาเภอแกลง จงหวดระยอง

1.6 SKA_HT1 คดแยกไดจากตะกอนดนเลนนาเคม ดอนหอยหลอด ตาบลบางจะเกรง ตาบลแหลมใหญ ตาบลบางแกว และตาบลโคน อาเภอเมอง จงหวดสมทรสงคราม

2. สารเคมและอาหารเลยงเชอ

2.1 Acetic acid Glacial (CH3COOH) ยหอ J.T. Baker บรษท J.T. Baker Chemicals

ประเทศจน 2.2 Bovine Serum Albumin (BSA) ยหอ SIGMA-ALDRICH บรษท SIGMA

ALDRICH ประเทศเยอรมน 2.3 Ammonium persulfate (NH4)2.S2O8 ยหอ ANALYTICAL NNIVAR REAGENT

บรษท Ajax Finechem ประเทศนวซแลนด

สำนกหอ


27

2.4 Barium chloride (BaCl2) ยหอ SIGMA-ALDRICH บรษท SIGMA-ALDRICH

ประเทศเยอรมน 2.5 Beef extract powder ยหอ BiomarkTM บรษท Biomark Laboratories ประ เทศ

อนเดย

2.6 Bromothymol blue ยหอ BDH indicators บรษท BDH Chemik ประเทศองกฤษ

2.7 Calcium acetate (Ca(CH3COO)2.H2O ยหอ Fluka Chemika บรษท Fluka Chemie ประเทศสวตเซอรแลนด

2.8 Calcium chloride (CaCl2.2H2O) ยหอ Laboratory Reagent Rankenบรษท RFCL

Limited ประเทศอนเดย 2.9 Chloroform (CHCl3) ยหอ RCI Lanscan บรษท RCI Lanscan ประเทศไทย

2.10 Cobalt (II) Chloride (CoCl2).6H2O) ยหอ ANALYTICAL UNIVAR REAGENT บรษท Asia Pacific Specialty Chemicals ประเทศออสเตรเลย

2.11 Coomassie® brilliant blue ยหอ Fluka Chemika บรษท Fluka Chemie ประเทศสวตเซอรแลนด

2.12 Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) ยหอ Uvivar บรษท Ajax Finechem

ประเทศออสเตรเลย

2.13 Glycerol (CH2OHCHOHCH2OH) ยหอ ANALYTICAL UNIVAR REAGENT

บรษท Ajax Finechem ประเทศนวซแลนด 2.14 Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa ยหอ SIGMA-ALDRICH

บรษท SIGMA-ALDRICH ประเทศเยอรมน

2.15 Hydrochloric acid 37% (HCl) ยหอ Applichem บรษท Applichem ประเทศเยอรมน

2.16 Maganesium chloride (MgCl2.6H2O) ยหอ ANALYTICAL UNIVAR REAGENT บรษท Ajax Finechem ประเทศนวซแลนด

2.17 Magnesium sulfate heptahydrated (MgSO4.7H2O) ยหอ Univar บรษท Ajax

Finechem ประเทศออสเตรเลย

2.18 Maltose monohydrate (C12H22O11) ยหอ Merck บรษท Merck ประเทศเยอรมน

2.19 Manganese (II) Chloride (MnCl2.4H2O) ยหอ Fluka Chemika บรษท Fluka

Chemie ประเทศสวตเซอรแลนด

สำนกหอ


28

2.20 Methanol (CH3OH) ยหอ QRëCTM บรษท Quality Reagent Chemical Product

ประเทศนวซแลนด 2.21 Orthophosphoric acid 85% (H3PO4) ยหอ ANALYTICAL UNIVAR REAGENT

บรษท Ajex Finechem ประเทศนวซแลนด 2.22 Polyethyleneglycol 12000 ยหอ Fluka Chemikaบรษท Fluka Chemie ประเทศ

สวตเซอรแลนด 2.23 Protamine sulfate salt from salmon ยหอ SIGMA-ALDRICHบรษท SIGMA-

ALDRICH ประเทศเยอรมน 2.24 Proteose peptone ยหอ LAB M บรษท LAB M ประเทศองกฤษ

2.25 Sephadex G-100 ยหอ GE Healthcare บรษท GE Healthcare Bio Sciences ประเทศสวเดน

2.26 Sodium acetate trihydrate (C2H3NaO2.3H2O) ยหอ AnalaR NORMAPUR บรษท VWR PROLABO® CHEMICALS ประเทศเบลเยยม

2.27 Sodium chloride (NaCl) ยหอ Univar บรษท Ajax Finechem ประเทศออสเตรเลย

2.28 Sodium hydroxide (NaOH) ยหอ DAEJUNG บรษท KOSDAQประเทศเกาหล 2.29 Sodium lauryl sulfate (C12H25NaO4S) ยหอ LOBA Chemie บรษท LOBA Chemie

ประเทศอนเดย 2.30 Tryptone soya broth ยหอ Himedia® บรษท Himedia Laboratories ประเทศอนเดย

2.31 Tris base ยหอ SAFC บรษท SIGMA-ALDRICH ประเทศสวตเซอรแลนด

2.32 Yeast extract powder ยหอ Titan media บรษท Titan biotech LTD.ประเทศอนเดย

สำนกหอ


29

3. อปกรณและเครองมอทใชในงานวจย

3.1 กระดาษกรอง ขนาด 0.45 ไมครอน ยหอ Minisart บรษท Sartorius stedim biotech

ประเทศเยอรมน

3.2 กลองจลทรรศน รน ECLIPSE E200 ยหอ Nikon ประเทศญปน

3.3 เครองแกวตางๆ ยหอ PYREX บรษท Pyrex® Laboratory Glassware ประเทศสหรฐอเมรกา

3.4 เครองกวนสารใหความรอน (Hot plate) ยหอ Vigo ประเทศเยอรมน 3.5 เครองชงละเอยดทศนยม 4 ตาแหนง รน BA210S บรษท Sartorius ประเทศเยอรมน

3.6 เครองชงละเอยดทศนยม 3 ตาแหนง รน L420S บรษท Sartorius ประเทศเยอรมน

3.7 เครองวดความเปนกรด-ดาง (pH meter) รน 713 pH meter บรษท Metrohn ประเทศสหรฐอเมรกา

3.8 เครองสเปกโตรโฟโตมเตอร (Spectrophotometer) รน CECIL 1011 1000 series

ประเทศองกฤษ

3.9 เครองผสมสาร (Vortex mixer) ยหอ VORTEX MIXER รน KMC-1300V บรษท VISION SCIENTIFIC ประเทศเกาหล

3.10 เครองสเปกโตรโฟโตมเตอร UV/VIS (UV/VIS Spectrometer) รน T70 บรษท PG

Instrument ประเทศองกฤษ 3.11 เครองหมนเหวยงปรบความเยน (Refrigerated centrifuge) รน Z36HK บรษท

HERMLE ประเทศเยอรมน 3.12 ตแชเยอกแขงอณหภมตา (Ultra-low Freezer) อณหภม -20 Cยหอ MIRAGE

ประเทศญปน 3.13 ตบมเชอแบบเขยา (Incubator shaker) รน NB-205 VL ยหอ N-BIOTEK บรษท

SCIENTIFIC PROMOTION ประเทศเกาหล 3.14 ตบมเชอ (Incubator) ยหอ SANYO บรษท Sanyo Electric ประเทศญปน 3.15 ตลามนารโฟว (Laminar Flow) รน V-190 บรษท EHRET ประเทศเยอรมน

3.16 ตอบฆาเชอลมรอน (Hot air oven) บรษท MEMMWRT ประเทศเยอรมน

3.17 ถงไดอะไลซส ยหอ Cellu•Sep T1 บรษท Membrance filtration products, Inc.

ประเทศสหรฐอเมรกา

สำนกหอ


30

3.18 บวเรตแกวขนาด 1 50 cm ยหอ PYREX บรษท Pyrex® Laboratory Glassware

ประเทศสหรฐอเมรกา 3.19 ป ม (Pump) ร น P-50 ย ห อ Pharmacia Biotech บ รษท Pharmacia Biotech

ประเทศสวเดน 3.20 หมอนงความดน (Autoclave) รน HA-240MN บรษท Hirayama ประเทศญปน

3.21 อ า ง ควบ คม อณห ภ ม (Water bath) ร น Eco Temp TW 20 บ รษท Julabo ประเทศองกฤษ

สำนกหอ


31

4. ขนตอนการดาเนนงานวจย

กระบวนการของงานวจยทงโครงการวจยสรปโดยยอ ขนตอนท 1

ทาใหเซลลแตกโดย sonicator

ขนตอนท 2

ภาพท 6 แผนภาพขนตอนการทาวจยทงโครงการ

- Gel filtration chromatography

ขนตอนการทาบรสทธเอนไซมเฮพารเนส

- การตกตะกอนโปรตนดวยแอมโมเนยม

- Anion-exchanger chromatography

การเพาะเชอแบคทเรยทสามารถผลตเอนไซมเฮพารเนสได

Crude enzyme

วดปรมาณโปรตน

ศกษาสภาวะและปจจยแวดลอมทสงผลตอกจกรรม

ตรวจสอบขนาดของเอนไซมโดยวธ SDS-PAGE

วดกจกรรมเอนไซม

เอนไซมทผานขนตอนการทาบรสทธ Crude enzyme

สำนกหอ


32

4.1. การคดกรองแบคทเรยทมประสทธภาพในการสรางเอนไซมเฮพารเนสโดยวธ

4.1.1 Heparinase plate assay (Zimmermann et al., 1990: 3593-3594)

นาแบคทเรยไอโซเลทตางๆ ทคดแยกได มาเลยงบนอาหาร Flavobacterium agar

(ภาคผนวก ก) เปนเวลา 24 h ใชเขมเขยถายโอนเชอแบคทเรย ลงตรงกลางของอาหาร LB agar ทประกอบดวยเฮพารน 0.1% (w/v) (ผนวก ก) บมทอณหภม 30 C ระยะเวลา 72 h จากนนทาใหเซลลแตกดวยคลอโรฟอรม เปนเวลา 20 min แลวนาไปบมตออก 60 min ทอณหภม 37 C หลงจากนนเทโปรตามนซลเฟต (Protamine sulfate) 2% (w/v) (ภาคผนวก) บนอาหารแลวบมตอเปนเวลา 1-

2 h ทอณหภม 37 C บนทกคาโซนใส (Clear zone) ทเกดขนเนองจากการยอยสลายเฮพารน และหาคา Potency index เพอคดแยกเชอจลนทรยทมประสทธภาพในการผลตเอนไซมเฮพารเนส

Potency index = ขนาดโซนใสทเกดขน (cm) ขนาดโคโลน (cm)

4.1.2 วธ Azure assay (Galliher et al., 1981: 360-365)

เตรยมตวอยางเชอแบคทเรยทคาดวานาจะสามารผลตเอนไซมเฮพารนเนสไดมาเลยงในอาหาร Flavobacterium M1 ปรมาตร 1 L บมเชอแบคทเรยเปนเวลา 24 h โดยทาการเขยาทความเรวรอบ 180 rpm อณหภม 30 C หลงจากนนนาอาหารเลยงเชอทมเชอเจรญอยไปปนเหวยงท 12840xg นาน 10 min ท 4 C จากนนทงสวนใส เกบตะกอนเซลล ท 4 C เพอทาการวเคราะห (หรอเกบไวท -40 C หากยงไมทาการวเคราะหทนท) จากนนเตมนากลนปราศจากเชอใสในหลอดทมตะกอนเซลลอยปรมาตร 5 ml ผสมใหเปนเนอเดยวกน จากนนนาไปทาใหเซลลแตกโดยการ Sonicate นาไปปนเหวยงท 6000 rpm หลงจากนนนาสวนใสมาวเคราะหกจกรรมเอนไซม โดย ปเปตสวนใสทไดมาปรมาตร 100 l ใสในหลอดใหม ผสมกบ 100 l ของเฮพารน (ความเขมขน 25 mg/ml ในบฟเฟอร 0.25 M sodium acetate – 0.0025 M cacium acetate ทคาความเปนกรด-ดาง

7.0 ) นาไปบมทอณหภม 30 C จากนนปเปตตวอยางมา 10 l ใสในหลอดใหม แลวเตม Azure A

dye solution ความเขมขน 0.02 mg/ml จากนนนาไปวดคาการดดกลนแสงท 620 nm ภายในเวลา 1 h

สำนกหอ


33

4.2 การเพาะเลยงแบคทเรยทผลตเอนไซมเฮพารเนส

นาตวอยางแบคทเรยไอโซเลทตางๆ ทกลาวในขอ 4.1 มาเพาะเลยงบนอาหาร

trypticase broth (ภาคผนวก ก) จากนนนาเชอไปบมทอณหภม 30 C เขยาทความเรวรอบ 180 rpm เปนเวลา 24 h หลงจากนนทาการแยกตะกอนเซลลออกจากอาหารเลยงเชอโดยการปนเหวยงทความเรวรอบ 8,000 rpm แลวแยกเกบตะกอนเซลลและอาหารเลยงเชอเพอใชในการเตรยมสารสกดหยาบสาหรบการวเคราะหเอนไซมเฮพารเนสตอไป

4.3 การเกบรกษาเชอแบคทเรยทผลตเอนไซมเฮพารเนส

การเกบรกษาหวเชอ ซงจะชวยรกษาสภาพของสายพนธแบคทเรยใหคงอยไดนาน และไมเกดการกลายพนธ ซงการเกบรกษาแบคทเรยจะมอยหลากหลายวธ ซงในการทดลองนจะใชการเกบแบบแชแขงในอาหารเหลวทเตมกลเซอรอลความเขมขน 15% (v/v) โดยเรมจากเลยงแบคทเรยในอาหารเลยงเชอชนดแขง เมอแบคทเรยเจรญเตมทแลว จงใช cotton swab ปายแบคทเรยใหไดมากพอจากนนนาแบคทเรยทไดมาใสใน cryotube ทมอาหาร Flavobacterium medium ผสมกบ กลเซอรอลความเขมขน 15% (v/v) แลวนาไปเกบทตแชแขง -20 C

4.4 การวเคราะหกจกรรมเอนไซมเฮพารเนส

(Unsaturated double bond detecting by absorbance at 232 nm)

นาสารละลายเฮพารน ความเขมขน 1 mg/ml ผสมกบสารละลายแคลเซยมแอซเตทความเขมขน 10 mM ปรมาตร 100 l และสารละลายเอนไซมปรมาตร 20 l จากนนผสมใหเขากน แลวนาไปบมปฏกรยา ทอณหภม 37 C เปนเวลา 10 min เมอครบเวลาจงหยดปฏกรยาเอนไซมดวยอณหภม 60 C ในอางควบคมอณหภมเปนเวลา 5 min นาสารละลายมาวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 232 nm

1 Unit Enzyme หมายถง ปรมาณเอนไซมทใชในการเรงปฏกรยาการสลายเฮพารน ใหเกดผลตภณฑ 1.0 mole/min ภายใตสภาวะ ความเปนกรด-ดาง 7.0 และอณหภม 37 C

สำนกหอ


34

4.5 การทาบรสทธเอนไซมเฮพารเนสจากแบคทเรยทคดกรองได 4.5.1 การตกตะกอนโปรตนดวยเกลอแอมโมเนยมซลเฟต (modified Yoshida et

al., 2002 : 1181-118 )

นาสารสกดหยาบมาทาการตกตะกอนโปรตนดวยเกลอแอมโมเนยมซลเฟตโดยแบงระดบความอมตวของเกลอแอมโมเนยมซลเฟตทใชในการตกตะกอน โดยเรมจากความเขมขนอมตวรอยละ 60 จากนนเตมผงเกลอแอมโมเนยมซลเฟตทละนอย พรอมๆกบการกวนสารสกดหยาบทอณหภม 4 C จนกระทงเกลอละลายหมด จะสงเกตไดวาสารละลายเอนไซมมความขนเพมมากขน จากนนตงสารละลายไวในสภาวะนงขามคน และนาสารละลายทงหมดมาปนเหวยงแยกตะกอนโปรตนทความเรว 10,000 rpm ทอณหภม 4 C เปนเวลา 20 min จากนนนาสวนของตะกอนทไดมาละลายดวยสารละลายบฟเฟอร Tris-HCl ความเขมขน 10 mM คาความเปนกรด-ดาง . และนาสวนใสทแยกตะกอนโปรตนออกไปแลวมาเพมความเขมขนของเกลอแอมโมเนยมซลเฟตใหสงขนเปนรอยละ 80 และละลายเกลอทละนอยและแยกตะกอนโปรตนออกจากสารละลายเชนเดม จากนนนาตะกอนโปรตนทไดในแตละชวงความเขมขนของเกลอทละลายในบฟเฟอร Tris-HCl

ความเขมขน 10 mM คาความเปนกรด-ดาง 7.0 นาไปกาจดเกลอออกโดยวธไดอะไลซสตอไป นาสารละลายโปรตนทผานการตกตะกอนในแตละชวงและกาจดเกลอออกแลว มาวเคราะหกจกรรมเอนไซมเฮพารเนส และปรมาณโปรตนดวยวธ Bradford Assay (Bradford. 1976: 248-254)

4.5.2 กาจดเกลอโดยการไดอะไลซส

นาสารละลายทไดจาก ขอ 4.5.1 มาทาการกาจดเกลอออกโดยบรรจลงในถงไดอะไลซส และนาไปแชในสารละลายในบฟเฟอร Tris-HCl ความเขมขน 10 mM คาความเปนกรด-ดาง 7.0 โดยระหวางการแชถงไดอะไลซสจะตองกวนตลอดเวลา ทอณหภม 4 C เปนเวลา 24 h โดยตองเปลยนบฟเฟอรใหมทกๆ 4 h จากนนนาสารละลายออกจากถงไดอะไลซส มาวเคราะหคากจกรรมจาเพาะของเอนไซม

4.5.3 การทาบรสทธเอนไซมโดยวธโครมาโทกราฟแบบ anion exchange ชนด DEAE-Sepharose Fast Flow column

นาคอลมนทบรรจอนภาค DEAE-Sepharose ทมขนาด 1×5 cm มาตอเขากบเครอง fraction collector เตมสารละลายบฟเฟอร Tris-HCl ความเขมขน 10 mM คาความเปนกรด-ดาง 7.0

ปลอยใหบฟเฟอรเขาสคอลมนปรมาณ 3 เทาของปรมาณ DEAE-Sepharose หรอจนกวาสารละลายทไหลออกจากคอลมนจะมคาความเปนกรด-ดางเทากบบฟเฟอร ดวยอตราการไหล 0.5 ml/min

สำนกหอ


35

เพอทาใหอนภาค DEAE-Sepharose อมตวไปดวยบฟเฟอร ซงขนตอนนเปนการปรบสมดลคอลมน (equilibrium)

หลงจากปรบสมดลคอลมนดวยบฟเฟอรแลวจงเตมเอนไซมทตองการแยกใหบรสทธลงในคอลมน โดยเอนไซมทตองการแยกจะตองละลายในบฟเฟอร Tris-HCl ความเขมขน 10 mM คาความเปนกรด-ดาง 7.0 ซงปรมาณเอนไซมจะตองอยในปรมาณท DEAE-Sepharose

สามารถยดจบไวไดหมด

เรมเกบสารละลายทออกมาจากคอลมนโดยใชบฟเฟอรเดมใหไหลผานคอลมนเพอทาการชะโปรตนทไมยดเกาะกบอนภาค DEAE-Sepharose หลงจากนนชะโปรตนทยดเกาะกบคอลมนใหหลดออกดวยวธ Linear gradient ดวยสารละลายโซเดยมคลอไรดทความเขมขน 0 – 0.5 M ทอยในสารละลายบฟเฟอร Tris-HCl ทความเขมขน 10 mM คาความเปนกรด-ดาง 7.0 ในการเกบสารละลายทออกจากคอลมนจะเกบใสในหลอดทดลอง ปรมาตร 3 ml จากนนนาสารละลายมาวเคราะหปรมาณโปรตนโดยวดคาดดกลนแสงทความยาวคลน 280 nm และวเคราะหกจกรรมเอนไซมเฮพารเนส และทาไดอะไลซสเพอใชในขนตอไป

4.5.4 การทาบรสทธเอนไซมโดยวธโครมาโทกราฟแบบ gel filtration

นาสารละลายเอนไซมมาทาใหบรสทธขนโดยนามาผานคอลมนทมเจล Sephadex

G-100 บรรจอย ซงเตรยมโดยนาเจล Sephadex G-100 มาตมในสารละลายบฟเฟอร Tris-HCl ความเขมขน 10 mM คาความเปนกรด-ดางท 7.0 เปนเวลา 5 h ใหเจลพองตว และตงทงไวใหเยนทอณหภมหอง จากนนนาเจลมาบรรจในคอลมนขนาด 1.5 × 50 cm ใหมปรมาตรเรซนในคอลมนเทากบ 50 ml จากนนลางคอลมนดวย สารละลายบฟเฟอร Tris-HCl ความเขมขน 10 mM คาความเปนกรด-ดางท 7.0 ปรมาตร 3 เทา ของเรซนในคอลมน และปรบสมดลของคอลมนดวยบฟเฟอรชนดเดยวกน นาสารละลายเอนไซมทไดจากการทาไดอะไลซส ในขอ 4.5.3 มาเตมลงในคอลมน และชะคอลมนดวยบฟเฟอรชนดเดยวกน โดยใชอตราการไหลของตวชะเทากบ 8 ml/h เกบสารละลายเอนไซมหลอดละ 1 ml นาสารละลายเอนไซมทเกบไดแตละหลอดมาหาปรมาณโปรตนโดยวดคาการดดกลนแสงท 280 nm และวเคราะหกจกรรมเอนไซม

สำนกหอ


36

4.6. การศกษาคณสมบตเอนไซมเฮพารเนส

4.6.1 การตรวจสอบความบรสทธและนาหนกโมเลกลของเอนไซมโดยวธ อเลกโตรโฟรซสแบบแปลงสภาพ (SDS-PAGE) (Laemmli, 1970) ประกอบชดเจลอเลกโตรโฟรซส เปดกระแสไฟฟาท 100 V นาตวอยางโปรตนทตองการทดสอบความบรสทธและหานาหนกโมเลกลมาผสมกบสยอม Bromophenol blue ปรมาตร 5 l แลวตมในอางนาเดอด ทอณหภม 100 C นาน 5 min ทงใหเยนลง แลวจงปเปตตวอยางลงในชองวางสาหรบใสตวอยางโปรตนบรเวณสวนบนของ stacking gel โดยทาพรอมกบโปรตนมาตรฐานททราบนาหนกโมเลกล ปลอยใหตวอยางโปรตนเคลอนทไปภายในเจล จนเหนสของ Bromophenol blue เคลอนทลงไปจนสดขอบลางของเจล นาแผนเจลออกจากชดทดสอบไปยอมดวยสยอม Coomassie Brilliant Blue R-250 นานประมาณ 10 min ลางสสวนเกนออกดวยนาแลวแชเจลตอใน Destaining solution (ภาคผนวก ก) ทา 2-3 ครงๆละประมาณ 10 min จนกระทงสวนทเปนพนหลงใส

4.6.2 อทธพลของอณหภมตอการทางานของเอนไซมเฮพารเนส

นาสารละลายเฮพารนความเขมขน 1 mg/ml ทละลายในสารละลายบฟเฟอรท คาความเปนกรด-ดางทเหมาะสมตอกจกรรมของเอนไซมมาผสมกบเอนไซมเฮพารเนส บรสทธ ปรมาตร 20 l ลงในหลอดทดลอง เขยาใหผสมกนดแลวนาไปบมในอางนาปรบอณหภม ทอณหภมตงแต 20 – 45 C เปนเวลา 10 min จากนนหยดกจกรรมเอนไซมโดยการตมทอณหภม 60 C เปนเวลา 5 min และนามาหากจกรรมเอนไซมบรสทธ ดงขอท 4.4

4.6.3 อทธพลของคาความเปนกรด-ดาง ตอการทางานของเอนไซมเฮพารเนส เตรยมสารละลายเฮพารนทความเขมขน 1 mg/mlในสารละลายบฟเฟอรชนดตางๆ ตงแตคาความเปนกรด-ดางท 6.0 – 9.0 ผสมกบเอนไซมทผานการทาใหบรสทธ ปรมาตร 20 l ใสลงในหลอดทดลอง เขยาใหเขากนด และบมในอางควบคมอณหภมทเหมาะสมตอกจกรรมเอนไซม (ในขอ 4.6.2) เปนเวลา 10 min จากนนหยดกจกรรมเอนไซมโดยการตมทอณหภม 60 C เปนเวลา 5 min และนามาหากจกรรมเอนไซมบรสทธ ดงขอท 4.4

สำนกหอ


37

4.6.4 อทธพลของอณหภมทมผลตอความเสถยรของเอนไซมเฮพารเนส

นาเอนไซมเฮพารเนสทผานการทาบรสทธมาบมในอางควบคมอณหภมท 20, 25,

30, 37, 40, 45 และ 50 C ตามลาดบ จากนนเกบผลทก 1 h จนครบ 6 h มาวเคราะหหากจกรรมเอนไซม โดยใชสารละลายเฮพารน ความเขมขน 1 mg/ml ผสมกบสารละลายเอนไซมขางตน แลวนามาบมทอณหภมทเหมาะสมตอกจกรรมเอนไซม เปนเวลา 10 min จากนนหยดปฏกรยาเอนไซมโดยการตมทอณหภม 60 C เปนเวลา 5 min และนามาหากจกรรมเอนไซมบรสทธ ดงขอท 4.4

4.6.5 อทธพลของคาความเปนกรด-ดางตอความเสถยรของเอนไซมเฮพารเนส

นาเอนไซมทผานขนตอนการทาบรสทธมาบมทคาความเปนกรด-ดางทเหมาะตอกจกรรมเอนไซม ทอณหภม 37 C จากนนเกบผลทก 1 h จนครบ 6 h มาวเคราะหหากจกรรมเอนไซม โดยใชสารละลายเฮพารนทมความเขมขน 1 mg/ml ผสมกบสารละลายเอนไซม แลวนาไปบมทอณหภม 37 C เปนเวลา 10 min จากนนหยดปฏกรยาเอนไซมโดยนาไปตมในอางควบคมอณหภม 60 C นาน 5 min และนามาหากจกรรมเอนไซมบรสทธ ดงขอท 4.4

4.6.6 อทธพลของชนดไอออนตอการทางานของเอนไซมเฮพารเนส

นาสารละลายเอนไซมบรสทธเฮพารเนส มาทดสอบกบไอออนชนดตางๆ คอ แบเ รยมคลอไรด แคลเ ซยมคลอไรด แมกน เ ซยมคลอไรด แมงกานสคลอไรด และ คอปเปอรคลอไรด ทความเขมขน 1, 10 และ 100 mM จากนนวเคราะหหากจกรรมเอนไซมบรสทธ ดงขอท 4.4 โดยผสมกบสารละลายเฮพารนทความเขมขน 1 mg/ml แลวนาไปบมทอณหภม 37 C เปนเวลา 10 min จากนนหยดปฏกรยาเอนไซมโดยนาไปตมในอางควบคมอณหภม 60 C เปนเวลา 5 min

สำนกหอ


38

บทท 4

ผลการทดลอง และวจารณผลการทดลอง

1. การคดกรองแบคทเรยทมประสทธภาพในการสรางเอนไซมเฮพารเนสโดยวธ

1.1 Heparinase plate assay

ในการคดเลอกแบคทเรยทมความสามารถในการผลตเอนไซมเฮพารเนสไดมประสทธภาพสง จากแบคทเรย 6 ไอโซเลททคดแยกไดจากตะกอนดนเลนนากรอยและนาเคม ในป พ.ศ. 2553 ทจงหวดระยองและสมทรสงคราม เมอทดสอบการสรางเอนไซมเฮพารเนสบนอาหาร LB

Agar ทมเฮพารนเปนองคประกอบ โดยทาใหเซลลในโคโลนแตกดวยดวยไอคลอโรฟอรม และ เทสารละลายโปรตามนซลเฟต จนทวมจานอาหารเลยงเชอ จะทาใหเหนโซนใสบนอาหารเลยงเชอ ดงภาพท 7 โซนใสดงกลาวเกดจากการทแบคทเรยสามารถสรางเอนไซมยอยสลายเฮพารนโดยการตดพนธะเบตา ทตาแหนง C4 และ C5 ของยโรเนท ในขณะแบคทเรยทไมสามารถยอยสลายเฮพารนจะเกดเปนลกษณะตะกอนสขาวของโปรตามนซลเฟตซงทจบอยกบโมเลกลของเฮพารน ดงนนประสทธภาพในการผลตเอนไซมเฮพารเนสจะพจารณาจากคา Potency index

จากการทดสอบนไดนาแบคทเรยจานวน 6 ไอโซเลท พบวา ความสามารถในการยอยสลายเฮพารนในอาหาร LB Agar โดยม Negative control คอ Escherichia coli ซงไมสามารถสรางเอนไซมเฮพารเนสได พบวา แบคทเรยทมคา Potency index คอ RYA_En1, RYA_HT1 และRYB_En1 มคาเทากบ 2.27 0.05, 2.15 0.05 และ 1.93 0.10 ตามลาดบ (ตารางท 7) ในขณะท Escherichia coli ไมสามารถวดคา Potency index ไดเนองจากไมสามารถยอยสลายเฮพารนไดจงไมพบโซนใสบนอาหาร LB Agar

สำนกหอ


39

ตารางท 7 คา Potency index ของแบคทเรยทคดแยกได และ Escherichia coli (negative control) ในการทดสอบการผลตเอนไซมเฮพารเนสบนอาหาร LB Agar ทประกอบดวยเฮพารน 0.1% (w/v) ทอณหภม 30 C ระยะเวลา 72 h

หมายเหต : (-) หมายถง ไมสามารถวดโซนใสได

จากตารางท 7 พบวาแบคทเรยทดสอบทงหมด แบคทเรยทมคา Potency index ในอาหาร LB Agar ทประกอบดวยเฮพารน 0.1% (w/v) คอแบคทเรยไอโซเลท RYA_En1 มคา Potency

index เทากบ 2.27 0.05 โดยแสดงลกษณะการเกดโซนใส แสดงดงภาพท 7 คา Potency index

ของแบคทเรยไอโซเลท RYA_En1 มคาสงสด เนองจากการวดคา Potency index ใหผลการทดสอบทไมชดเจนจงทาการยนยนผลการทดสอบโดยการหาปรมาณดวยวธ Azure assay

แบคทเรย เสนผาศนยกลาง (cm)

คา Potency index โซนใส โคโลน

RYA_En1 3.10 0.10 0.83 0.06 2.27 0.05

RYB_En1 2.97 0.06 1.03 0.06 1.93 0.10

SKA_En1 - 0.23 0.06 -

RYA_HT1 2.88 0.03 0.73 0.06 2.15 0.05

RYB_HT1 0.27 0.12 0.27 0.12 -

SKA_HT1 0.47 0.06 0.47 0.06 -

Escherichia coli - 0.45 0.05 -

สำนกหอ


40

ภาพท 7 โคโลนและการเกดโซนใสของแบคทเรย ไอโซเลท RYA_En1 (A), RYB_En1 (B),

SKA_En1 (C), RYA_HT1 (D), RYB_HT (E) และ SKA_HT1 (F) บนอาหาร LB agar ทมสวนประกอบของเฮพารน ทอณหภม 30 C ระยะเวลา 72 h

หมายเหต 1 ; รปโคโลนบนผวหนาอาหารเลยงเชอแขง, 2 ; รปโซนใสบนอาหารเลยงเชอแขง

A2 A

B B2

C C2

สำนกหอ


41

ภาพท โคโลนและการเกดโซนใสของแบคทเรย ไอโซเลท RYA_En (A), RYB_En (B),

SKA_En (C), RYA_HT (D), RYB_HT (E) และ SKA_HT (F) บนอาหาร LB agar ทมสวนประกอบของเฮพารน ทอณหภม C ระยะเวลา h (ตอ)

หมายเหต ; รปโคโลนบนผวหนาอาหารเลยงเชอแขง, ; รปโซนใสบนอาหารเลยงเชอแขง

D D

E E2

F F2

สำนกหอ


42

1.2 Azure assay

จากวธ Heparinase plate assay เปนการคดกรองเชอแบคทเรยแบบเบองตน จงตองมวธ Azure assay เพอเปนการยนยนผลในการคดกรองเชอแบคทเรย โดยการวดปรมาณเอนไซมทเชอแบคทเรยสามารถผลตเพอยอยสลายเฮพารน โดยวธ Azure assay จะวดปรมาณเฮพารนทเหลอจากการยอยของเอนไซมเฮพารเนสทสรางได พบวาเชอแบคทเรยทคดแยกไดทง 6 ไอโซเลท สามารถวดปรมาณเอนไซมทเชอแบคทเรยสรางขนไดดงตารางท 8 ซงพบวา เชอไอโซเลท RYA_En1 มคากจกรรมจาเพาะของเอนไซมเทากบ 90.1 U/mg protein ซงมคามากทสดและผลการทดลองทไดมความสอดคลองกบผลการทดลองโดยวธ Heparinase plate assay ดงนนจงนา เชอไอโซเลท RYA_En1 มาทาการศกษาในขนตอนตอไป

ตารางท 8 คากจกรรมเอนไซมของเชอแบคทเรยทคดแยกได โดยวธ Azure assay ทอณหภม 30 C

คาความเปนกรด-ดาง 7.0

แบคทเรย Total activity (U) Total protein (mg.) Specific activity (U/mg)

RYA_En1 884 9.81 90.1 RYB_En1 817 40.39 20.2 SKA_En1 758 40.07 18.9 RYA_HT1 814 37.29 21.8

RYB_HT1 771 13.37 57.7

SKA_HT1 621 15.93 38.9

สำนกหอ


43

2. สารสกดหยาบเอนไซมเฮพารเนส จากแบคทเรย ไอโซเลท RYA_En1

ในขนตอนการผลตสารสกดหยาบเอนไซมเฮพารเนส นาเชอแบคทเรยไอโซเลททคดเลอก คอ RYA_En1 (ภาพท 8) มาเตรยมสารละลายแขวนลอยเซลลทมความขนเทากบ 0.132 0.002 ทความยาวคลน 600 nm นาไปเลยงในอาหาร tryptone broth แลวนาไปบมทอณหภม 30 C เขยาเชอทความเรวรอบ 180 rpm จนครบ 24 h จากนนนามาแยกตะกอนเชอดวยเครองปนเหวยงทความเรวรอบ 6,000 rpm เปนเวลา 20 min แลวนาสวนของตะกอนไปทาใหเซลลแตกดวยเครองโซนเคเตอร ทาการปนเหวยงเพอแยกเศษเซลลและสวนใส ซงสารละลายสวนใสทได คอ สารสกดหยาบเอนไซมเฮพารเนส

ภาพท 8 ไอโซเลทแบคทเรย RYA_En1 ทคดแยกไดจากตะกอนดนเลน คลองกะเฉด ตาบลกะเฉดอาเภอแกลง จงหวดระยอง

ในงานวจยนเรมจากสารสกดหยาบเอนไซมเฮพารเนส ปรมาตร 150 ml เมอนาสารสกดหยาบมาวเคราะหกจกรรมเอนไซมและปรมาณโปรตนดวยวธ Bradford assay พบวา มคากจกรรมเอนไซมเทากบ 0.99 U/ml ปรมาณโปรตนเทากบ 3.74 mg/ml และมคา specific activity

เทากบ 0.26 U/mg protein ซงคา specific activity เรมตนมปรมาณทนอยเมอเปรยบเทยบกบรายงานสารสกดหยาบเอนไซมเฮพารเนสเรมตนจากเชอ Flavobacterium heparinum มคาเทากบ 0.49 U/mg protein (Ma et al., 2006: 209-215) การศกษาเอนไซมเฮพารเนสจากเชอ Bacteroides stercoris

HJ-15 มคา specific acivity เรมตนอยท 6.5 10-3 U/mg protein ซงเปนการเรมตนดวยคา specific

activity ทถอวาคอนขางตา (Kim et al., 2004: 684-690) การศกษาเอนไซมเฮพารเนสจากเชอ

สำนกหอ


44

Bacillus circulans เรมตนดวยคา specific activity เทากบ 0.0183 U/mg protein (Yoshida et al., 2002

: 1181-1184) การศกษาเอนไซมเฮพารเนสจากเชอ Acinetobacter calcoaceticus และเชอ Aspergillus flavus (MTCC-8654) เ รมตนไดสารละลายเอนไซมเฮพารเนสมคา specific activity เทากบ 0.8 U/ g protein และ 1.1 U/ g protein ตามลาดบ (Banga and Tripathi. 2009: 99-104 และBanga

and Tripathi. 2010 : 1004-1016) ซงจะเหนไดวาจากหลายๆ รายงานมคา specific activity ทสงเนองจากมการใชเฮพารนเปนสารในการชกนาใหผลตเอนไซมเฮพารเนสออกมาไดในปรมาณมาก แตจากการทดลองนไมมการชกนาใหสรางเอนไซมจงอาจจะไดผลผลตของเอนไซมเฮพารเนสทนอยเมอเทยบกบงานวจยอนๆ

3. การทาบรสทธเอนไซมเฮพารเนสจากแบคทเรย ไอโซเลท RYA_En1 3.1 การตกตะกอนดวยเกลอแอมโมเนยมซลเฟต

การทาบรสทธเอนไซมเฮพารเนส (Heparinase) จากแบคทเรยไอโซเลท RYA_En1 โดยนาเอนไซมสกดหยาบทไดในขนตอนกอนหนานมาผานขนตอนการทาบรสทธ โดยเรมจากการตกตะกอนโปรตนดวยเกลอแอมโมเนยมซลเฟต ซงวธนสามารถกาจดโปรตนทปนเปอนบางสวนออกได และทาใหความเขมขนของเอนไซมเพมขน นาตะกอนโปรตนทมเอนไซมอยนนมากาจดเกลอออกโดยวธไดอะไลซส (Dialysis) และนาถงไดอะไลซสไปใสภาชนะทบรรจดวยพอลเอททลนไกลคอล (Polyethyleneglycol, PEG) ขนาด 12000 Da ใหทวมหรอครอบคลมถงไดอะไลซส

ทงนเพอให PEG ดดซบนาออก ซงชวยเพมความเขมขนของสารละลายเอนไซม ในการทาบรสทธดวยวธนใชเอนไซมสกดหยาบปรมาตร 150 ml ถกตกตะกอนดวยเกลอแอมโมเนยมซลเฟตในชวงความอมตวรอยละ 60 โดยมปรมาตรลดลงเหลอ 50 ml มคาความเขมขนเอนไซมเทากบ 1.76 U/ml ทาใหมความเขมขนเพมขนเปน 1.78 เทาของความเขมขนเอนไซมในเอนไซมสกดหยาบ ทาใหความเขมขนโปรตนเทากบ 6.79 mg/ml มความเขมขนของโปรตนเพมขนเทากบ 1.81 เทา อยางไรกตามทงเอนไซมสกดหยาบและเอนไซมหลงผานการตกตะกอนดวยแอมโมเนยมซลเฟตมคา enzyme specific activity เทากน คอ 0.26 U/mg protein

จากรายงานงานวจยทเกยวของในการทาบรสทธเอนไซมเฮพารเนส ขนตอนการตกตะกอนดวยเกลอแอมโมเนยมซลเฟตจากเชอจลนทรยชนดอนๆ ไดแก เอนไซมเฮพารเนสจากเชอ Bacillus circulans ถกตกตะกอนในชวงความอมตวรอยละ 30-60 โดยมปรมาตรลดลงจากเดม 175 ml เหลอ 90 ml และพบวา มปรมาณเอนไซมเทากบ 120.5 U และปรมาณโปรตนเทากบ 3627 mg เมอนามาคดคา specific activity มคาเปน 38.2 mU/mg protein ซงเอนไซมมความบรสทธเพมขน 2.1 เทา เมอเปรยบเทยบกบสารสกดหยาบ (Yoshida et al., 2002: 1181-1184) จากเชอ

สำนกหอ


45

Bacteroides sp. ใชความอมตวของเกลอแอมโมเนยมซลเฟตทรอยละ 50 (Taniguchi et al., 1983 :

1252-1257) จาก เ ชอ Bacteroides stercoris HJ-15 ตกตะกอนดวยความอมตว รอยละ 30-70

(Kim et al., 2004: 684-690) จากเชอ Flavobacterium heparinum ตกตะกอนทความอมตวรอยละ 80

พบวา ปรมาณเอนไซมหลงจากผานการตะกอนเทากบ 68.06 U และปรมาณโปรตนเทากบ 129.7

mg ทาใหมคา specific activity เทากบ 0.525 U/mg protein และมความบรสทธเพมขนเปน 1.08 เทา (Ma et al., 2006: 209-215) และเมอเปรยบเทยบความบรสทธทเพมขนของเอนไซมระหวางงานวจยกบงานวจยของ Yoshida และคณะพบวา มความบรสทธเพมขน 2.1 เทา แตผลของงานวจยนมคาความบรสทธเทากบสารสกดหยาบ เนองจากผวจยไดการตกตะกอนเอนไซมเฮพารเนสดวยเกลอแอมโมเนยมซลเฟตชวงความอมตวทคอนขางกวาง เมอเปรยบเทยบกบงานวจยอนทเลอกชวงการตะกอนทแคบกวาทาใหไดเอนไซมทตองการ และสามารถกาจดโปรตนทปนเปอนออกได จงทาใหคาความบรสทธเพมสงขน ดงนนจากงานวจยเกยวกบ เอนไซมเฮพารเนสจงนยมตกตะกอนดวยเกลอแอมโมเนยมซลเฟตทความอมตวตงแตรอยละ 30 จนถงรอยละ 80 แตกตางกนไปตามชนดของจลนทรย แลวสามารถทาใหเอนไซมมความบรสทธเพมขน

3.2 การทาบร สทธ เอนไซมโดยว ธ โครมาโทกราฟแบบ anion exchange ชนด DEAE-Sepharose Fast Flow column

นาเอนไซมเฮพารเนสทผานขนตอน 4.5.3 มาทาบรสทธตอโดยใชคอลมนไอออน โครมาโทกราฟ ชนด DEAE-Sepharose Fast Flow ขนาดคอลมนทใชคอ 1 5 cm สารละลายททาใหเกดความสมดล คอ สารละลายบฟเฟอร Tris- HCl ความเขมขน 10 mM คาความเปนกรด-ดาง

7.0 และสารละลายทใชชะคอลมนเพอใหโปรตนทเกาะอยกบอนภาคของ DEAE-Sepharose คอ สารละลายโซเดยมคลอไรด ความเขมขน 0.0-0.5 M คาความเปนกรด-ดาง 7.0 หลงจากชะคอลมน และเกบโปรตนทถกชะทกปรมาตร 3 ml ในหลอดทดลอง พบวาโปรตนทงหมดทออกมาจากคอลมนอยในชวงหลอดท 2-190 และพบกจกรรมของเอนไซมเฮพารเนสทชะดวยความเขมขนของเกลอ 0.0, 0.2, 0.3 และ 0.4 M ในชวงหลอดท 2-24, 53-78, 94-105 และ 120-131 ตามลาดบ แตไมพบกจกรรมเอนไซมเฮพารเนสในความเขมขนเกลอในชวงอนๆ (ภาพท 9) เอนไซมทผานคอลมน DEAE-Sepharose สามารถจบกบตวแลกเปลยนประจไดด ทงนเนองจากคอลมน DEAE-Sepharose

เปน anion exchanger จงสามารถยดจบโปรตนทเปนชนดประจลบไวภายในคอลมน และถกชะออกมาดวยสารละลายโซเดยมคลอไรดในชวงความเขมขนทแตกตางกน จากการทดลองพบวาเอนไซมเฮพารเนสทแยกไดจงมประจทแตกตางกน คอ เอนไซมทแยกจากคอลมนดวยสารละลาย

สำนกหอ


46

บฟเฟอรในชวง washing เปนเอนไซมทมประจเปนบวก และเอนไซมทแยกดวยสารละลายโซเดยมคลอไรดในชวงทชะสารออกเปนเอนไซมทมประจเปนลบ

นาสารละลายเอนไซมเฮพารเนสในชวงหลอดท 2-24 รวมกน ทาเชนเดยวกนกบหลอดท 53-78, 94-105 และ120-131 และนาสารละลายเอนไซมทง 4 ชวง มาวดคากจกรรมเอนไซม และปรมาณโปรตนไดผลดงตารางท 5 และเมอนาสารละลายเอนไซมทง 4 ชวงไปตรวจสอบขนาดโมเลกลของเอนไซมเฮพารเนสดวยวธเจลอเลกโตรโฟรซส (SDS-PAGE) พบวา ชวงหลอดท 2-24

มกจกรรมเอนไซมทสง แตกมปรมาณโปรตนทสงเชนกน แสดงวา ในชวงหลอดท 2-24 ยงมโปรตนปะปนอยหลากหลายชนด โดยสงเกตไดจากแถบแบนโปรตนทปรากฏอยหลายแถบ ชวงหลอดท 53-78 จะมคากจกรรมจาเพาะของเอนไซมเทากบ 0.17 U/mg protein ซงเปนคากจกรรมจาเพาะของเอนไซมทตากวาชวงหลอดอนๆ และยงมแถบแบนโปรตนหลายแถบเชนกน สาหรบชวงหลอดท 94-105 มคากจกรรมจาเพาะของเอนไซมเทากบ 0.35 U/mg protein ซงใกลเคยงกบหลอดท 120-131

มคากจกรรมจาเพาะของเอนไซมเทากบ 0.34 U/mg protein แตปรากฎโปรตนเพยงแถบแบนเดยว ทงยงมปรมาณเอนไซมสงกวา ชวงหลอดท 120-131 นอกจากนโปรตนปรากฎอยทประมาณ kDa ซงทมความใกลเคยงกบเอนไซมเฮพารเนส II จากเชอ Pedobacter heparinus ซงมขนาดโมเลกลเทากบ 85 kDa (Shriver et al., 1998: 22904-22912) ดงนน ในขนตอนการทาบรสทธนจงเลอกชวงหลอดท 94-105 มาทาบรสทธในขนตอนตอไป ซงพบวาเอนไซมในชวงหลอดดงกลาว ม enzyme specific activity เทากบ 0.35 U/mg protein ซงสงกวาเอนไซมทผานขนตอนการตกตะกอนดวยแอมโมเนยมซลเฟต 1.35 เทา จากผลการทดลองจะเหนไดวาเอนไซมเฮพารเนส หลงจากผานการทาบรสทธมคา specific activity มากกวากอนการทาบรสทธ ซงแสดงใหเหนวาคอลมน โครมาโทกราฟชนด DEAE-Sepharose มประสทธภาพในการจบโปรตนจงทาใหคา specific

activity เพมขน เมอเปรยบเทยบกบรายงานการทาบรสทธเอนไซมจากเชอ Bacillus circulans พบวาการทาบรสทธดวยวธการตกตะกอนดวยเกลอแอมโมเนยมซลเฟต และผานคอลมน DEAE-

Sepharose มคากจกรรมเอนไซมจาเพาะของเอนไซมเปน 0.088 U/mg protein และมความบรสทธเพมขน 2.3 เทาเมอเปรยบเทยบกบขนตอนการตกตะกอนดวยเกลอแอมโมเนยมซลเฟต และพบแถบแบนโปรตนเพยงขนาดเดยวซงมขนาดโมเลกลเทากบ 111 kDa (Yoshida et al., 2002: 1181-1184) การศกษาเอนไซมเฮพารเนสจากเชอ Aspergillus flavus (MTCC-8654) มระดบความบรสทธของเอนไซมเมอผานคอลมน DEAE-Sephadex A-50 เพมเปน 2.6 เทา และหลงจากผานคอลมน

DEAE-Sephadex A-50 พบวา เอนไซมมแบนโปรตนเพยงชนดเดยวซงมขนาดโมเลกลเทากบ 29

kDa (Banga and Tripathi. 2010 : 1004 -1016)

สำนกหอ


47

ภาพท 9 ความสมพนธระหวางปรมาณโปรตนทความยาวคลน 280 nm และคา กจกรรมเอนไซมทความยาวคลน 232 nm จากเชอแบคทเรย Aeromonas sp. RYA_En1 ทผานการแยกใหบรสทธดวยคอลมนโครมาโทกราฟชนด DEAE-Sepharose

หมายเหต : กรอบ A คอ fraction ท 2-24 กรอบ B คอ fraction ท 53-78 กรอบ C คอ fraction ท 94-

105 และ กรอบ D คอ fraction ท 120-131

ตารางท 9 คากจกรรมเอนไซมเฮพารเนส ในแตละชวงหลอดหลงจากผานคอลมน DEAE Sepharose

โครมาโทกราฟ

Fraction Total activity (U) Total protein (mg) Specific activity

(U/mg)

Fraction ท 2-24 91.170 1.982 235.210 5.261 0.388

Fraction ท 53-78 1.180 0.021 7.000 0.056 0.168

Fraction ท 94-105 2.420 0.035 7.110 0.009 0.340

Fraction ท 120-131 0.870 0.073 2.560 0.041 0.339

Fraction คอ ชวงหลอดทเกบสารละลายเอนไซมทผานคอลมน DEAE Sepharose

A

B C D

สำนกหอ


48

ภาพท 10 การแยกขนาดโมเลกลของโปรตนดวยวธ SDS-PAGE ท 12.5% (v/v) และยอมสดวย Coomassie Brilliant Blue R-250 จากคอลมนโครมาโทกราฟชนด DEAE-Sepharose

แถวท M โปรตนมาตรฐาน ขนาด 22-175 kDa

แถวท 1 สารละลายเอนไซม fraction ท 2-24




หมายเหต : ในกรอบสเหลยมคอ ขนาดของโมเลกลของเอนไซมของแตละชวงของ fraction

สำนกหอ


49

3.3 การทาบรสทธเอนไซมโดยวธโครมาโทกราฟแบบ gel filtration ชนด Sephadex

G-100

นาสารละลายเอนไซมทผานขนตอนในขอ 4.5.3 มาทาใหบรสทธตอ โดยใชคอลมนโครมาโทกราฟชนด Sephadex G-100 ขนาดคอลมนเทากบ 1 50 cm สารละลายทใชในการทา equilibration และแยกเอนไซมออกจากคอลมน เมอทาการชะโปรตนดวย Tris-HCl ความเขมขน 10 mM คาความเปนกรด-ดางท 7.0 จากผลการทดลองพบวา พบกจกรรมเอนไซมในชวงหลอดท 7-12 (ภาพท 11) สารละลายเอนไซมเฮพารเนสทแยกไดมปรมาตรรวมเทากบ 3 ml พบวา มปรมาณเอนไซม และปรมาณโปรตนทงหมดเทากบ 1.23 U และ 1.95 mg ตามลาดบ (ตารางท 9) มความเขมขนของเอนไซมเทากบ 0.41 U/ml และความเขมขนของโปรตนเทากบ 0.65 mg/ml สามารถคานวณคากจกรรมจาเพาะไดเทากบ 0.63 U/mg protein ซงมความบรสทธเพมขนจากขนตอนการทาบรสทธดวยคอลมน DEAE-Sepharose เปน 1.8 เทา เมอเปรยบเทยบเอนไซมเฮพารเนสทผลตไดจาก เชอ Bacillus circulans พบวา การทาบรสทธดวยจากขนตอน DEAE-Sephacel ไปยงขนตอน Sephacryl S-200 (gel filtration) ทาใหเอนไซมมความบรสทธเพมขน 9.1 เทา แตเนองจากไดผานการทาใหบรสทธโดย Sulfate cellulofine กอนขนตอน Sephacryl S-200 แสดงวา การผานขนตอนการทาบรสทธ สามารถกาจดโปรตนทปนเปอนออกจากสารละลายเอนไซมเฮพารเนสไดจงทาใหมความบรสทธทสงขน (Yoshida et al., 2002 : 1181-1184)

สำนกหอ


50

ภาพท 11 ความสมพนธระหวางปรมาณโปรตนทความยาวคลน 280 nm และคากจกรรมเอนไซมทความยาวคลน 232 nm จากเชอแบคทเรย Aeromonas sp. RYA_En1 ทผานการแยกใหบรสทธดวยคอลมนโครมาโทกราฟชนด Sephadex G-100

สำนกหอ


51

การทาบรสทธเอนไซมเฮพารเนสจากแบคทเรย Aeromonas sp. RYA_En1 ดวยการตกตะกอนโปรตนดวยเกลอแอมโมเนยมซลเฟต, ผานคอลมนโครมาโทกราฟชนด ion exchange

และคอลมนโครมาโทกราฟชนด gel filtration ตามลาดบ สามารถทาใหเอนไซมเฮพารเนสมความบรสทธ ซงเมอนามาตรวจสอบความบรสทธดวย SDS-PAGE ไดดงภาพท 12 และจากภาพแสดงใหเหนโปรตนในสารละลายสกดหยาบเอนไซม และสารละลายเอนไซมหลงผานขนตอนการทาใหบรสทธ จะสงเกตไดจากแผนเจล SDS-PAGE มแถบโปรตนทเขม และมขนาดประมาณ 90 kDa

ภาพท 12 การแยกขนาดโมเลกลของโปรตนดวยวธ SDS-PAGE ท 12.5% (v/v) และยอมสดวย Coomassie brilliant Blue R-250

แถวท 1 โปรตนมาตรฐาน ขนาด 20-120 kDa

แถวท 2 Crude heparinase

แถวท 3 เอนไซมทตกตะกอนดวยเกลอแอมโมเนยมซลเฟตทความเขมขนรอยละ 60

แถวท 4 เอนไซมทผานการแยกดวย DEAE-Sepharose (Fraction ท 94-105) แถวท 5 เอนไซมทผานการแยกดวย Sephadex G-100 (Fraction ท 7-12)

36

120 90

50

27

1 2 3 4 5

20

kDa

สำนกหอ


52

ตารางท 10 ขนตอนการทาบรสทธเอนไซมเฮพารเนสจากเชอแบคทเรย Aeromonas sp. RYA_En1

Purification step Total

volume

(ml)

Total

protein

(mg)

Total

activity

(U)

Specific

activity

(U/mg)

Purification

Fold

Yield

(%)

Culture extract 150 561.60 148.35 0.26 1.00 100.00

(NH4)2SO4 precipitation 50 339.70 88.00 0.26 1.00 59.32

DEAE-Sepharose 10 7.11 2.47 0.35 1.35 1.67

Sephadex G-100 3 1.95 1.23 0.63 2.42 0.83

% yield หมายถง (ปรมาณเอนไซมของสารสกดหยาบ/ปรมาณเอนไซมของแตละขนตอน) 100

4. การศกษาคณสมบตเอนไซมเฮพารเนส

4.1 ตรวจสอบขนาดของ เอนไซมโดยว ธ เลก โทรโฟร ซสแบบแปลงสภาพ (SDS-PAGE)

การวเคราะหหานาหนกโมเลกลของเอนไซมเฮพารเนสทผานการทาบรสทธในแตละขนตอนดวยวธ SDS-PAGE ดงภาพท 12 พบวา แถบโปรตนในสารละลายเอนไซมสกดหยาบ มปรมาณมากทสดซงจะแสดงใหเหนวามโปรตนหลากหลายชนดอยในสารละลาย และปรมาณโปรตนจะลดลงตามลาดบการทาบรสทธ พบแถบโปรตนของเอนไซมเฮพารเนสบรสทธมขนาดประมาณ 90 kDa

จากรายงานการวจยทเกยวกบนาหนกโมเลกลของเอนไซมเฮพารเนส จากจลนทรยชนดอน มรายงานวาเอนไซมเฮพารเนส จากเชอ Pedobacter heparinus เนองจากเชอ Pedobacter heparinus สามารถผลตเอนไซมเฮพารเนสไดทง 3 ชนด ซงมนาหนกโมเลกลดงตอไปน เฮพารเนส I มนาหนกโมเลกล 43 kDa (Yang et al.,1985 : 1849-1857) เฮพารเนส II มนาหนก 85 kDa และ เฮพารเนส III มนาหนก 73 kDa ซงหากเปรยบเทยบกบขนาดนาหนกโมเลกลเอนไซมเฮพารเนสทผลตไดจาก Aeromonas sp. จะมขนาดใกลเคยงกบ เฮพารเนส II ของเชอ Pedobacter heparinus จากเชอ Acinetobacter calcoaceticus พบวาเปนเฮพารเนส I มนาหนกโมเลกล 120 kDa (Banga and

Tripathi. 2009 : 99-104) จากเชอ Bacteroides stercoris HJ-15 สามารถผลตเฮพารเนส I ซงมขนาดโมเลกลเทากบ 48 kDa (Kim et al., 2004 : 684-690) และ จากเชอ Bacillus circulans สามารถผลต เฮพารเนส II ซงมขนาดโมเลกลเทากบ 111 kDa (Yoshida et al., 2002 : 1181-1184) จากขอมล

สำนกหอ


53

รายงานวจยจะสงเกตไดวาเอนไซมเฮพารเนสชนดเดยวกนจะมขนาดของโมเลกลของเอนไซมทตางกนออกไปขนอยกบชนดของจลนทรย 4.2 อทธพลของอณหภมตอการทางานของเอนไซมเฮพารเนส

อณหภมเปนปจจยทมผลตอการทางานของเอนไซม เอนไซมแตละชนดมอณหภมททาใหคากจกรรมเอนไซมสงสด เรยกวา อณหภมทเหมาะสมตอกจกรรมของเอนไซม (optimum

temperature) ในการทดลองนนาเอนไซมเฮพารเนสบรสทธ ไปทาการศกษาอณหภมทมผลตอกจกรรมของเอนไซม โดยนามาศกษาทอณหภม 20 – 40 C พบวา อณหภมทมกจกรรมเอนไซมสงสด คอ 37 C รองลงมา คอ 30 C มคากจกรรมเหลออยรอยละ 86 และพบวาเมออณหภมสงกวา 37 C มปรมาณเอนไซมลดลงอยางรวดเรวเหลอนอยกวา 30% ดงภาพท 13 ทงนอาจเพราะอณหภมทเพมสงขนนนไปทาใหโครงสรางของโปรตนถกทาลาย หรอเปลยนแปลงไปจากเดม ดงนนจากผลการทดลอง อณหภมทเหมาะสมตอเอนไซมเฮพารเนส จากเชอแบคทเรย Aeromonas sp. RYA_En1

เทากบ 37 C จากรายงานการวจยทเกยวกบอณหภมทเหมาะสมตอการทางานเอนไซมเฮพารเนส จากจลนทรยชนดอน มรายงานวา เอนไซมเฮพารเนสจาก Acinetobacter calcoaceticus มอณหภมทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซมเทากบ 35 C (Banga and Tripathi. 2009 : 99-104), Bacteroides stercoris HJ-15 มอณหภมทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซมเทากบ 50 C (Kim et al., 2004 : 684-690) , Bacillus circulans มอณหภมทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซมเทากบ 45 C (Yoshida et al., 2002 : 1181-1184)

สำนกหอ


54

ภาพท 13 อทธพลของอณหภมทเหมาะสมตอกจกรรมเอนไซมเฮพารเนส จากเชอแบคทเรย Aeromonas sp. RYA_En1 ทอณหภม 20-45 C คาความเปนกรด-ดาง 7.0

4.3 อทธพลของอณหภมทมผลตอความเสถยรของเอนไซมเฮพารเนส

การศกษาอทธพลผลของอณหภมทมผลตอความเสถยรของเอนไซมเฮพารเนส บรสทธโดยบมเอนไซมทอณหภมชวง 20-50 C เปนเวลา 6 h พบวาอณหภม 20-40 C เอนไซม เฮพารเนสมความเสถยร มกจกรรมเอนไซมคอยๆลดลง แตยงมกจกรรมเอนไซมเหลออยมากกวารอยละ 60 ในขณะทอณหภม 45 และ 50 C คากจกรรมเอนไซมลดลงอยางรวดเรวใน 1 ชวโมงแรก และมกจกรรมเอนไซมตากวารอยละ 20 อณหภมทสงขนอาจสงผลตอโครงสรางของเอนไซมจงทาใหเอนไซมไมสามารถทางานได หรอเอนไซมอาจเสยสภาพได ดงนนจากผลการทดลองพบวาเอนไซมมความเสถยรทอณหภม 20-40 C ดงภาพท 14

สำนกหอ


55

ภาพท 14 อทธพลของอณหภมตอความเสถยรของเอนไซมเฮพารเนส ของเชอ Aeromonas sp.

RYA_En1 ทอณหภม 20-50 C ความเปนกรด-ดาง 7.0

จากรายงานการวจยทศกษาเกยวกบความเสถยรของอณหภมทมผลตอกจกรรมเอนไซมเฮพารเนสจากเชอ Bacteroides stercoris HJ-15 มความเสถยรของอณหภม 25-50 C แตเมออณหภมทมากกวา 50 C คากจกรรมเอนไซมจะลดลงอยางรวดเรว (Kim et al., 2004 : 684-690)

สำนกหอ


56

4.4 อทธพลของคาความเปนกรด-ดางตอการทางานของเอนไซมเฮพารเนส

เอนไซมเปนโปรตนทมความไวตอการเปลยนแปลงของสงแวดลอม การเปลยนแปลงของคาความเปนกรด-ดางเพยงเลกนอยอาจทาใหอตราการเรงปฏกรยาของเอนไซมเพมขนหรอ ลดลงได เอนไซมจะทางานไดดทสดทคาความเปนกรด-ดางหนงเทานน เรยกวา คาความเปนกรด-ดางทเหมาะสม (optimum pH) ซงเอนไซมแตละชนดจะมคาความเปนกรด-ดางทเหมาะสมแตกตางกนไป ในการทดลองนาเอนไซมเฮพารเนสบรสทธ มาทดลองศกษาคาความเปนกรด-ดางทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซมเฮพารเนส โดยศกษาคาความเปนกรด-ดางในชวง 6.0-9.0 คาความเปนกรด-ดางทตางกนจะสงผลตอการทางานของเอนไซมเฮพารเนส ดงภาพท 15 โดยคาความเปนกรด-ดางทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซมอยในชวงคาความเปนกรด-ดาง 7.0-7.5 คาความเปนกรด-ดางททาใหกจกรรมเอนไซมมคาสงสดเทากบ 7.0 และรองลงมาคอ คาความเปนกรด-ดางท 7.5 ซงมคากจกรรมของเอนไซมเหลอรอยละ 90

ภาพท 15 คาความเปนกรด-ดางทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซมเฮพารเนส จากเชอแบคทเรย Aeromonas sp. RYA_En1 ทอณหภม 37 C

สำนกหอ


57

จากรายงานการวจยทเกยวของกบคาความเปนกรด-ดางทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซมเฮพารเนส จากเชอจลนทรยชนดอน มรายงานวา เอนไซมเฮพารเนสมคาความเปนกรด-ดางทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซมอยในชวง 7.0-8.5 เชน Acenitobacter calcoaceticus มคาความเปนกรด-ดางทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซมอยท 7.5 (Banga and Tripathi. 2009:

99-104), Aspergillus flavas (MTCC-8654) มคาความเปนกรด-ดางทเหมาะตอการทางานของเอนไซมอยท 7.0 (Banga and Tripathi. 2010: 1004-1016), Bacteroides stercoris HJ-15 มคาความเปนกรด-ดางทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซมอยท 7.0 (Kim et al., 2004: 684-690) Bacillus circulans มคาความเปนกรด-ดางทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซมอยท 7.5 (Yoshida et al.,

2002: 1181-1184)

4.5 อทธพลของคาความเปนกรด-ดาง ทเหมาะตอความเสถยรของเอนไซม

เฮพารเนส

จากการศกษาผลของคาความเปนกรด-ดาง ทเหมาะสมตอกจกรรมเอนไซม เฮพารเนสซงพบวามคาความเปนกรด-ดางเทากบ 7.0 จงนาคาความเปนกรด-ดางทเหมาะสมมาศกษาความเสถยรของเอนไซมเฮพารเนส โดยนาสารละลายเอนไซมมาบมกบสารละลายบฟเฟอรคาความเปนกรด-ดาง 7.0 เปนเวลา 6 h โดยจะเกบผลทก 1 ชวโมง เพอนาไปวดคากจกรรมเอนไซม พบวากจกรรมเอนไซมเฮพารเนสเหลอมากกวารอยละ 60 ดงภาพท 16 เนองจากคาความเปน กรด-ดาง เปนปจจยหนงตอการทางานของเอนไซม ซงสงผลตอโครงสรางของเอนไซมอาจถกเปลยนแปลง และอาจสงผลใหเอนไซมสญเสยสภาพ (denature) ได โดยเอนไซมแตละชนดกจะมความเสถยรของคาความเปนกรด-ดางทตางกนออกไป

สำนกหอ


58

ภาพท 16 อทธพลของความเสถยรของเอนไซมเฮพารเนสจากเชอ Aeromonas sp. RYA_En1 ทคาความเปนกรด-ดางเทากบ 7.0 อณหภม 37 C เปนเวลา 6 h

จากรายงานการวจยทเกยวของกบคาความเปนกรด-ดางทเสถยรตอกจกรรมเอนไซม จากเชอ Flavobacterium heparinum มคาความเปนกรด-ดางทเสถยรเทากบ 7.0 (Yang et

al.,1985 : 1849-1857)

สำนกหอ


59

% R

elativ

e act

ivity

4.4 อทธพลของชนดไอออนตอการทางานของเอนไซมเฮพารเนส

การศกษาไอออนของโลหะ 5 ชนด ตอกจกรรมเอนไซม ดงภาพท 17 พบวาไอออนของ Ba2+ และ Mn2+ ทความเขมขน 1, 10 และ 100 mM จะยบยงกจกรรมเอนไซมเฮพารเนสเพยงเลกนอย ยกเวนทความเขมขน 100 mM ของ Mn2+ สามารถกระตนการทางานของเอนไซมได สาหรบไอออน Mg2+ เมอเพมความเขมขนสงขน (10 และ 100 mM) จะสงผลใหมการยบยงการทางานของเอนไซมเพมขน ตามลาดบ ในสวนของ Ca2+ ความเขมขนทสามารถกระตนการทางานของเอนไซมไดดอยท 10 mM และไอออนทสามารถกระตนการทางานของเอนไซมไดสงสดคอ Co2+ ทความเขมขน 100 mM ซงจากงานวจยทเกยวของ เอนไซมเฮพารเนสจาก เชอ Aspergillus favus (MTCC-8654) Co2+ และ Mn2+ ทความเขมขน 100 mMจะชวยสงเสรมกจกรรมของเอนไซมดทสด และ Ba2+ เปนตวทยบยงการทางานของเอนไซม (Banga and Tripathi. 2010 : 1004-1016) จากเชอ Acinetobacter calcoaceticus เอนไซมจะถกยบยงโดย Ba2+, Hg2+ และ Cd2+ ทความเขมขน 0.1

mM และตวกระตนการทางานของเอนไซมคอ Cu2+ และ Fe2+ (Banga and Tripathi. 2009: 99-104)

จากเชอ Bacillus circulans (Yoshida et al., 2002: 1181-1184) ไอออนทสามารถกระตนการทางานของเอนไซมไดคอ Ba2+, Ca2+ และ Mg2+ ทความเขมขน 5 mM ซงมความใกลเ คยงกบเชอ Bacteroides stercoris (Kim et al., 2004: 684-690)

ภาพท 17 อทธพลของชนดไอออนตอกจกรรมเอนไซมเฮพารเนส ทความเขมขน 1, 10 และ 100 mM ทอณหภม 37 C คาความเปนกรด-ดาง 7.0

None Ba2+ Ca2+ Co2+ Mg2+ Mn2+

สำนกหอ


60

กลไลการทางานของเอนไซม เมอไดรบอทธพลของไอออนของโลหะ ซงจะทาใหเกดการกระตน และการยบยงการทางานของเอนไซม เนองจากเอนไซมเฮพารเนสเปนโปรตนทมประจรวมทเปนลบ จงทาใหไอออนประจบวกสามารถจบกบเอนไซม เชน Ca2+ เปนไอออนททาใหเอนไซมเฮพารเนสมความเสถยรขนทความเขมขนของไอออนเทากบ 10 mM (Ma et al., 2006: 209-

215) ในบางกรณไอออนของโลหะจะทาใหโครงสรางเอนไซมมความเสถยรสงผลทาใหการทาหนาทเรงปฏกรยาไดดขน หรอไอออนของโลหะจะสามารถทางานรวมกบเอนไซมในการจบ ซบสเตรตทบรเวณเรง (active site)

ดงนนการศกษาชนดของไอออนของโลหะ จงมความสาคญในการศกษาคณสมบตของเอนไซมเฮพารเนส เนองจากไอออนของโลหะเปนโคแฟกเตอรของเอนไซมชนดหนง ซงเอนไซมบางชนดจะเรงปฏกรยาไดกตอเมอมไอออนของโลหะ ซงจากการทดลองเอนไซม เฮพารเนส จากเชอ Aeromonas sp. RYA_En1 มปฏกรยาเอนไซมเพมขนเมอมไอออนของ Co2+ และ Mn2+ ทความเขมขน 100 mM ซงมความคลายคลงกบเอนไซมเฮพารเนสทผลตไดจากเชอ Aspergillus flavus (MTCC-8654) (Banga and Tripathi. 2010 : 1004-1016)

สำนกหอ


61

บทท 5

สรปผล อภปรายผล และขอเสนอแนะ

จากการคดกรองแบคทเรยทมประสทธภาพในการผลตเอนไซมเฮพารเนส ซงคดแยกไดจากตะกอนดนเลน จากจงหวดระยองและ สมทรสงคราม ดวยวธ Heparinase plate assay พบวาไอโซเลท RYA_En1 มคา potency index เทากบ 2.27 0.05 ซงเปนคามากทสด เมอทาการทดสอบดวยวธ Azure assay พบวา ไอโซเลท RYA_En1 มคากจกรรมจาเพาะของเอนไซมเทากบ 90.1 U/mg

protein แสดงใหเหนวาเชอไอโซเลท RYA_En1 มประสทธภาพในการผลตเอนไซมเฮพารเนสไดดทสงจงไดคดเลอกเชอไอโซเลท RYA_En1 มาเพาะเลยงในสภาวะทเหมาะสมตอการผลตเอนไซมเฮพารเนส โดยการเพาะเลยงเชอจะไมมการใชซบสเตรตในการชกนาใหแบคทเรยในการผลตเอนไซม แลวทาบรสทธเอนไซมดวยการตกตะกอนดวยแอมโมเนยมซลเฟต, โครมาโทกราฟชนด ion exchange (DEAE-Sepharose Fast Flow column) และโครมาโทกรา ฟช นด gel filtration

(Sephadex G-100 column) ตามลาดบ พบวาเมอผานการตกตะกอนดวยเกลอแอมโมเนยมซลเฟตทความอมตวรอยละ 0-60 มคากจกรรมเอนไซมทงหมดเทากบ 88 U และมคากจกรรมจาเพาะเปน 0.26 U/mg protein ขนตอนตอมานาสารละลายเอนไซมทผานการตกตะกอนดวยเกลอแอมโมเนยมซล เฟตไปกาจด เก ลอโดยการทาไดอะไลซส แลว จงนามาทาบร สทธ ตอดวยคอลมน โครมาโทกราฟชนด DEAE-Sepharose Fast Flow พบกจกรรมเอนไซมใน 4 ชวงการเกบโปรตน โดยชวงท 1 (fraction ท 2-24) แยกออกมาไดในชวง washing แสดงวาเอนไซมมประจเปนบวก สวนชวงท 2-4 (fraction ท 53-78, 94-105 และ 120-131 ตามลาดบ) มประจเปนลบเนองจากแยกไดในชวง elution ดวยเกลอโซเดยมคลอไรดทความเขมขน 0.1, 0.2, และ 0.3 M ตามลาดบ แตในงานวจยนไดเลอกเอนไซมชวงท 3 เทานน มาทาการทดลองตอ ซงเอนไซมชวงท 3 มความบรสทธเพมขน 1.35 เทา และเหลอผลผลตรอยละ 1.67 ในขนตอนท 3 นาสารละลายเอนไซมทแยกไดจากคอลมน DEAE-Sepharose มาทาใหมความเขมขนเพมขนดวย PEG แลวนามาทาใหบรสทธตอดวยคอลมนโครมาโทกราฟชนด Sephadex G-100 ไดสารละลายเอนไซมทมความบรสทธเพมขนเปน 2.42 เทา มคากจกรรมเอนไซมจาเพาะเทากบ 0.63 U/mg protein และเหลอผลผลตรอยละ 0.83 เมอนามาตรวจสอบความบรสทธดวย SDS-PAGE พบวา สารละลายเอนไซมมแถบแบนโปรตนของเอนไซมประมาณ 90 kDa เอนไซมเฮพารเนสบรสทธทางานไดดทคาความเปนกรด-ดางท 7.0

อณหภม 37 C ความเสถยรของอณหภม 20-40 C และคาความเปนกรด-ดาง ท 7.0 และสวนไอออนของโลหะทมผลตอการกระตนกจกรรมเอนไซมใหเพมขนคอ Co2+ และ Mn2+ ทความเขม

สำนกหอ


62

100 mM และไอออนของโลหะทยบยงกจกรรมเอนไซมเฮพารเนส คอ Ba2+ทความเขมขน 1-100 mM

ขอเสนอแนะ

ในงานวจยนไดศกษาแบคทเรยทสามารถสรางเอนไซมเฮพารเนสโดยไมมตวชกนาใหมการสรางเอนไซม ดงนนในงานวจยนอาจพบวา ปรมาณเอนไซมทไดมามปรมาณทนอย จงอาจจะมการแกไขโดยการใสสารชกนาเพอใหแบคทเรยสรางเอนไซมเฮพารเนสเพมมากขน นอกจากนยงตองศกษาเอนไซมในขนตอนการทาบรสทธดวยโครมาโทกราฟชนด DEAE-Sephadex ซงจะพบวามกจกรรมของเอนไซมเฮพารเนสออกมา 4 ชวง แตในงานวจยนไดเลอกมาทาการทดลองเพยง 1 ชวงเทานน ดงนนจงควรนาเอนไซมในชวงทเหลอมาทาการทดลองตอทงหมด ซงจะสงผลใหงานวจยมความสมบรณยงขน และควรทาการศกษาความจาเพาะเจาะจงของเอนไซมตอซบสเตรตเพอจะไดทราบชนดของเอนไซมเฮพารเนส

สำนกหอ


63

รายการอางอง Abirami, P. et al. (2011). "Isolation and characterization of 37 kDa heparinase from the purple fluid

of Dolabella auricularia." India Journal of Geo-Marine Science 40, 1 (February):

112-116.

Banga, Jaspreet., and Tripathi C. K. M. (2009). "Rapid purification and characterization of a novel

heparin degrading enzyme from Acinetobacter calcoaceticus." New Biotechnology

26, 1-2 (October):99-104.

Banga, Jaspreet., and Tripathi C. K. M. (2010). "Purification and characterization of a novel heparin

degrading enzyme from Aspergillus flavus (MTCC-8654)." Applied Biochemistry

and Biotechnology 160, 4 (February): 1004-1016.

Bohmer, Linde H. et al. (1990). "Purification and characterization of a novel heparinase." Journal

of Biological Chemistry 265, 23 (August):13609-13617.

Bradford, M. M. (1976). "A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities

of protein utilizing the principle of protein-dye binding." Analytical Biochemistry

72, (May): 248-254.

Funderburgh, J. L. (2002). "Keratan sulfate biosynthesis." IUBMB Life 54, 4 (Oct): 187-194.

Galliher, P. M. et al. (1981). "Heparinase production by Flavobacterium heparinum." Applied and

Environmental Microbiology 41, 2 (Feb): 360-365.

Gao, N. et al. (1999). "Strain screening and fermentation conditions of a novel heparinase-

producing strain." Wei Sheng Wu Xue Bao 39, 1 (February): 64-67.

Gao, N. et al. (2003). "Production of a novel heparinase from Sphingobacterium sp." Wei Sheng

Wu Xue Bao 43, 6 (December): 813-816.

Gargiulo, V. et al. (2009). "Structural analysis of chondroitin sulfate from Scyliorhinus canicula: a

useful source of this polysaccharide." Glycobiology 19, 12 (Dec): 1485-1491.

สำนกหอ


64

Godavarti, R. et al. (1996). "Heparinase III from Flavobacterium heparinum: cloning and

recombinant expression in Escherichia coli." Biochemical and Biophysical

Research Communications , (August): -75

Hovingh, P., and Linker A. (1970). "The enzymatic degradation of heparin and heparitin sulfate. 3.

Purification of a heparitinase and a heparinase from flavobacteria." Journal of

Biological Chemistry 245, 22 (November): 6170-6175.

Kim, Byung-Taek. et al. (2001). "Purification and characterization of acharan sulfate lyases, two

novel heparinases, from Bacteroides stercoris HJ-15." European Journal of

Biochemistry 268, 9 (May): 2635-2641.

Kim, Wan-Seok. et al. (2004). "Purification and characterization of heparin lyase I from

Bacteroides stercoris HJ-15." Journal of biochemistry and molecular biology 37,

6 (November): 684-690.

Limtiaco, Jonh. F. K. et al. (2011). "NMR methods to monitor the enzymatic depolymerization of

heparin." Analytical and Bioanalytical Chemistry 399, 2 (January): 593-603.

Linhardt, R. J. et al. (1991). "Structural features of dermatan sulfates and their relationship to

anticoagulant and antithrombotic activities." Biochem Pharmacol 42, 8 (Sep 27):

1609-1619.

Linhardt, R. J., and Gunay N. S. (1999). "Production and chemical processing of low molecular

weight heparins." Semin Thromb Hemost 25 Suppl 3: 5-16.

Ma, Xiaolai. et al. (2006). "Effect of CaCl2 as activity stabilizer on purification of heparinase I

from Flavobacterium heparinum." Journal of chromatography. B, Analytical

technologies in the biomedical and life sciences 843, 2 (November): 209-215.

Mourier, Pierre. et al. (2015). "Quantitative compositional analysis of heparin using exhaustive

heparinase digestion and strong anion exchange chromatography." Analytical

Chemistry Research 3, 0 (March): 46-53.

สำนกหอ


65

Nakamura, Takeshi., Okada K., and Takazoe L. (1971). "Biological activity of endotoxin from oral

heparinase producing Bacteroides." Journal of Dental Research 5: 1146.

Nakamura, Takeshi., Shibata Yukinaga, and Fujimura Setsuo. (1988). "Purification and properties

of Bacteroides heparinolyticus heparinase (heparin lyase, EC 4.2.2.7)." Journal of

Clinical Microbiology 26, 5 (May): 1070-1071.

Payza, A. N., and Korn E. D. (1956). "Bacterial degradation of heparin." Nature 177, 4498

(January): 88-89.

Rajaganapathi, J., and Kathiresan K. (2002). "Heparinase in purple fluid of the sea hare, Bursatella leachii." Current science 82, (February): 264-266.

Riley, T. V. (1987). "Heparinase production by anaerobic bacteria." Journal of Clinical Pathology

40, 4 (April): 384-386.

Sasisekharan, R. et al. (1994). "Heparinase inhibits neovascularization." PNAS, Proceedings of

the National Academy of Sciences 91, 4 (February): 1524-1528.

Daniel, Schulze. et al. (2011). "Anti-tumor effects of fibroblast growth factorbinding protein

(FGF-BP) knockdown in colon carcinoma." Molecular cancer 10 (November) : 144

Shriver, Z. et al. (1998). "Heparinase II from Flavobacterium heparinum. Role of cysteine in

enzymatic activity as probed by chemical modification and site- directed

mutagenesis." Journal of Biological Chemistry 273, 36 (Sep) 4: 22904-22912.

Su, H. et al. (2001). "Development of a genetic system for the transfer of DNA into Flavobacterium

heparinum." Microbiology 147, Pt 3 (March): 581-589.

Sugahara, K., and Kitagawa H. (2002). "Heparin and heparan sulfate biosynthesis." IUBMB Life

54, 4 (Oct): 163-175.

สำนกหอ


66

Taniguchi, H. et al. (1983). "Purification and characterization of mucopolysaccharidase from an

oral strain of Bacteroides sp." Applied and Environmental Microbiology 46, 6

(December): 1252-1257.

Tripathi, C. K.., Banga J., and Mishra V. (2012). "Microbial heparin/heparan sulphate lyases:

potential and applications." Applied Microbiology and Biotechnology 94, 2 (April):

307-321.

Watanabe, M. et al. (1998). "Characterization of heparinase from an oral bacterium Prevotella heparinolytica." Journal Biochemistry 123, 2 (February): 283-288.

Yamagata, T. et al. (1968). "Purification and properties of bacterial chondroitinases and

chondrosulfatases." The Journal of Biological Chemistry 243, 7 (April): 1523-1535.

Yang, V. C. et al. (1985). "Purification and characterization of heparinase from Flavobacterium heparinum." The Journal of Biological Chemistry 260, 3 (February): 1849-1857.

Yoshida, Eiichi. et al. (2002). "Purification and characterization of heparinase that degrades both

heparin and heparan sulfate from Bacillus circulans." Bioscience, Biotechnology,

and Biochemistry 66, 5 (May): 1181-1184.

Zimmermann, J. Joseph., Robert Langer, and Cooney. Charles L. (1990). "Specific plate assay for

bacterial heparinase." Applied and Environmental Microbiology 56, 11

(November): 3593-3594.

สำนกหอ


ภาคผนวก

สำนกหอ


ภาคผนวก ก

สำนกหอ


69

ภาคผนวก ก

อาหารเลยงเชอ สารละลาย และสารเคมตางๆ ทใชในการทดลอง

1. อาหารเลยงเชอ

1.1 Flavobacterium M1 broth

Proteose peptone 5.0 g

Sodium chloride 3.0 g

Beef extract 2.0 g

Yeast extract powder 1.0 g

ละลายสวนประกอบทงหมดในนา 950 ml และเขยาจนกระทงสวนประกอบละลายหมด ปรบคาความเปนกรด-ดาง ใหเปน 7.0 ดวย 1 M โซเดยมไฮดรอกไซด ปรบปรมาตรสารละลายใหเปน 1 L ดวยนากลน จากนนนาไปทาใหปลอดเชอดวยหมอนงความดนทอณหภม 121 C ความดน 15 lb/in2 เปนเวลา 15 min

1.2 Trypticase broth

Trypticase 10.0 g

NaCl 1.0 g

K2HPO4 2.5 g

MgSO4 0.5 g

Maltose 20.0 g


สำนกหอ


70

1.2 Lauria – Bertani medium (LB medium) (Zimmermann et al., 1990)

Tryptone 10 g

Yeast extract powder 5 g

Sodium chloride 10 g

Sodium Heparin 1 g


2. สารละลาย

2.1 สารละลายสาหรบการหากจกรรมเอนไซม

2.1.1 สารละลายเฮพารน ความเขมขน 1 mg/ml

Sodium heparin 10 mg

0.1 M Sodium acetate 10 ml

(เกบทอณหภม 4 C ไมเกน 1 เดอน)

2.1.2 0.1 M Sodium acetate

Sodium acetate 13.61 g

นากลน 1,000 ml (เกบทอณหภม 4 C)

2.1.3 0.01 M Calcium acetate Calcium acetate 1.58 g

นากลน 1,000 ml

(เกบทอณหภม 4 C)

สำนกหอ


71

2.2 สารละลายสาหรบหาปรมาณโปรตน

สารละลาย Bradford dye reagent

Coomassie-Brilliant blue G-250 100 g

Ethanol 50 ml

85% Phosphoric acid 50 ml

ปรบปรมาตรดวยนากลน ใหเปน 1,000 ml (เกบทอณหภม 4 C และไมโดนแสง)

3. การเตรยมสารเคมสาหรบการหานาหนกโมเลกลเอนไซม

3.1 สารเคมสาหรบ SDS – PAGE

3.1.1 สารละลาย 1.5 M Tris – HCl คาความเปนกรด-ดาง 8.8

Tris base 36.34 g

นากลน 100 ml

ปรบคาความเปนกรด-ดางดวยกรดไฮโดรคลอรกเขมขน หลงจากนนปรบปรมาตรใหเปน 200 ml ดวยนากลน 3.1.2 สารละลาย 0.58 M Tris – HCl คาความเปนกรด-ดาง 6.8

Tris base 14.05 g


ปรบคาความเปนกรด-ดางดวยกรดไฮโดรคลอรกเขมขน หลงจากนนปรบปรมาตรใหเปน 200 ml ดวยนากลน 3.1.3 สารละลาย 10 % (w/v) Sodium dodecyl sulfate (SDS)

Sodium dodecyl sulfate (SDS) 10.0 g

นากลน 100 ml 3.1.4 สารละลาย 10 % (w/v) Ammonium persulfate

Ammonium persulfate 10.0 g


สำนกหอ


72

3.1.5 สารละลายสาหรบยอมเจล Coomassie stain solution

เตรยมความเขมขนท 0.1 % (w/v) Coomassie brilliant blue R-250

Coomassie brilliant blue R – 250 0.11 g

Methanol 50 ml

Glacial acetic acid (99 %) 10 ml


3.1.6 สารละลายสาหรบลางสยอม (destaining solution)

Methanol 50 ml

Glacial acetic acid (99 %) 70 ml

ปรบปรมาตรใหเปน 1000 ml ดวยนากลน

3.1.7 สสงเคราะหสาหรบผสมโปรตน (5x loading dye)

0.58 M Tris – HCl คาความเปนกรด-ดาง 6.8 12.5 ml Glycerol 20 ml

10 % (w/v) SDS 20 ml

β – mercaptoethanol 5 ml

0.5 % (w/v) Bromophenolblue 5 ml

นากลน 37.5 ml

3.1.8 สารละลายบฟเฟอร Tris glycine

Glycine 94 g

Tris base 15.1 g

10 % (w/v) SDS 50 ml

ปรบปรมาตรใหเปน 1000 ml ดวยนากลน

สำนกหอ


73

3.2 การเตรยมเจล SDS – PAGE

3.2.1 การเตรยม Polyacrylamide gel 12.5 % (v/v) (separating gel)


1.5 M Tris – HCl คาความเปนกรด-ดาง 8.8 2.62 ml

10 % (w/v) SDS 105 l

40 % (w/v) acrylamide 2.99 ml

2 % (w/v) Bis-acrylamide 3.15 ml

TEMED 10.5 l

10 % (w/v) APS 105 l 3.2.2 การเตรยม Polyacrylamide gel 5 % (v/v) (stacking gel)


0.5 M Tris – HCl คาความเปนกรด-ดาง 6.8 2.62 ml

10% (w/v) SDS 52 l

40 % (w/v) acrylamide 477 l

2 % (w/v) Bis- acrylamide 503 l TEMED 10.5 l

10 % (w/v) APS 52 l

สำนกหอ


ภาคผนวก ข

สำนกหอ


75

y = 1.546x - 0.095R² = 0.9765

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70

A 595

Protein mg/ml

ภาคผนวก ข

กราฟมาตรฐานและการวเคราะห

1. การวเคราะหปรมาณโปรตนตามวธ Bradfrod Assay (Bradford. 1976: 248-54)

1.1 เตรยมสารละลายตวอยางทตองการหาปรมาณโปรตน ทความเขมขนทเหมาะสม100 ไมโครลตร ลงในหลอดทดลอง

1.2 เตมสารละลาย reagent ในขอ 2.2 ภาคผนวก ก ซงถกเจอจางดวยนากลนในอตราสวน 1:4 (reagent: นากลน) ปรมาตร 5 ml ผสมใหเขากน และตงทงไวทอณหภมหอง เปนเวลา 5 min (แตไมควรเกน 1 h) 1.3 นาไปวดปรมาณโปรตนทความยาวคลน 595 nm

1.4 การสรางกราฟมาตรฐานของโปรตนสามารถทาไดโดยใชสารละลายโปรตนมาตรฐาน Bovine serum albumin ทมความเขมขนตงแต 0.0 – 1.0 mg/ml แลววเคราะหเหมอนดงทกลาวมาขางตน ดงภาพท 16

ภาพท 18 กราฟมาตรฐานโปรตน (Bovine serum albumin) ทความยาวคลน 595 nm

สำนกหอ


76

ตารางท 11 ความสมพนธระหวางความเขมขนโปรตนกบ คาการดดกลนแสงทความยาวคลน 595 nm

Bovine serum albumin

(mg/ml)

คาการดดกลนแสง 595 nm คาเฉลย

ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3

0.0 0.000 0.003 0.002 0.002

0.1 0.127 0.130 0.129 0.129

0.2 0.199 0.200 0.203 0.201

0.3 0.279 0.274 0.293 0.282

0.4 0.356 0.372 0.350 0.359

0.5 0.421 0.425 0.425 0.424

0.6 0.466 0.482 0.473 0.474

0.7 0.515 0.500 0.525 0.513

0.8 0.571 0.579 0.568 0.573

0.9 0.617 0.621 0.600 0.613

1.0 0.655 0.671 0.671 0.666

จากกราฟมาตรฐานของโปรตนทไดสามารถคานวณหาปรมาณโปรตนของสารละลายทตองการได ดงน

ปรมาณโปรตน mg/mlคาการดดกลนแสง 595 nm + 0.095

1.546

สำนกหอ


77

2. การคานวณคาพารามเตอรของการทาบรสทธของเอนไซม

2.1 คากจกรรมจาเพาะ (Specific activity)

คากจกรรมจาเพาะ (U/ml) =กจกรรมเอนไซม (U)

โปรตน (mg)

2.2 กจกรรมเอนไซมรวม (Total activity)

กจกรรมเอนไซมรวม (U) = กจกรรมเอนไซม (U/ml) ปรมาตร (ml)

2.3 ปรมาณโปรตนรวม (Total protein)

ปรมาณโปรตนรวม (mg) = ปรมาณโปรตน(mg/ml) ปรมาตร (ml)

2.4 ความบรสทธทเพมขน (Purification fold)

ความบรสทธทเพมขน = คากจกรรมเอนไซมจาเพาะของขนตอนการทาบรสทธ

คากจกรรมเอนไซมจาเพาะของสารสกดหยาบ

2.5 คาผลผลตทเหลอ (Recovery)

คาผลผลตทเหลอ = คากจกรรมเอนไซมรวมของขนตอนการทาบรสทธ 100

คากจกรรมรวมของสารสกดหยาบเอนไซม

2.6 คากจกรรมสมพทธ (Relative activity) ของเอนไซม

คากจกรรมสมพทธของเอนไซม= กจกรรมของเอนไซม

คากจกกรรมเอนไซมสงสด ในสภาวะทกาหนด ×100

สำนกหอ


ภาคผนวก ค

สำนกหอ


79

ภาคผนวก ค ขอมลผลการทดลอง

1. การทาบรสทธเอนไซมเฮพารเนส ตารางท 12 การทาบรสทธเอนไซมเฮพารเนสจากเชอ Aeromonas sp. RYA_En1 ทอณหภม 37 C

คาความเปนกรด-ดางท 7.0

Purification

step OD 1 2 3 คาเฉลย SD

Enzyme

activity

(U/ml)

Protein

(mg/ml)

Culture extract Enzyme 232 5.180 4.830 4.820 4.943 0.205 0.989 0.041

Protein 280 2.320 2.280 2.360 2.320 0.040 3.491 0.062

(NH4)2SO4

precipitation

Enzyme 232 8.500 8.500 9.400 8.800 0.520 1.760 0.104

Protein 280 4.610 4.520 4.480 4.610 0.067 6.918 0.103

DEAE-

Sepharose

Enzyme 232 1.200 1.230 1.270 1.233 0.035 0.247 0.007

Protein 280 0.522 0.521 0.521 0.522 0.001 0.711 0.009

Sephadex G-

100

Enzyme 232 1.045 1.035 1.005 1.028 0.021 0.206 0.004

Protein 280 2.420 2.425 2.410 0.484 0.002 0.653 0.002

หมายเหต : Culture extract enzyme 232 nm และ protein 280 nm คณคาการเจอจาง 10 เทา (NH4)2SO4 precipitation 232 nm คณคาการเจอจาง 100 เทา และ protein 280 nm คณคาการเจอจาง 10 เทา DEAE-Sepharose 232 nm คณคาการเจอจาง 10 เทา Sephadex G-100 232 nm คณคาการเจอจาง 5 เทา

สำนกหอ


80

2. การศกษาคณสมบตบางประการของเอนไซมเฮพารเนส ตารางท 13 อทธพลของอณหภมทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซมเฮพารเนส จากเชอ

Aeromonas sp. RYA_En1 คาความเปนกรด-ดาง 7.0 อณหภม

( C)

OD232 คาเฉลย SD

Enzyme

activity

(U/ml)

% Relative

activity 1 2 3

20 0.195 0.180 0.135 0.170 0.006 0.032 0.005 15.776 2.077

25 0.505 0.520 0.490 0.505 0.003 0.101 0.003 49.342 0.791

30 0.895 0.835 0.920 0.883 0.009 0.176 0.009 85.993 5.437

37 1.045 1.035 1.005 1.028 0.004 0.205 0.003 99.946 0.093

40 0.370 0.345 0.350 0.355 0.003 0.070 0.001 34.208 0.779

45 0.145 0.135 0.150 0.143 0.002 0.029 0.002 13.962 0.942

ตารางท 14 อทธพลของความเปนกรด-ดาง ทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซมเฮพารเนส จากเชอ Aeromonas sp. RYA_En1 ทอณหภม 37 C

pH


Enzyme

activity

(U/ml)

% Relative

activity 1 2 3

6.0 0.445 0.420 0.395 0.420 0.005 0.082 0.003 38.448 1.806

6.5 0.635 0.650 0.625 0.637 0.003 0.127 0.003 59.568 1.868

7.0 1.050 1.060 1.085 1.065 0.004 0.214 0.003 100.000 0.000

7.5 0.960 0.945 0.985 0.963 0.004 0.193 0.004 90.129 0.863

8.0 0.460 0.445 0.475 0.460 0.003 0.092 0.003 42.984 0.917

8.5 0.420 0.410 0.395 0.408 0.003 0.081 0.002 37.809 1.227

9.0 0.095 0.085 0.100 0.093 0.002 0.019 0.002 8.999 0.605

สำนกหอ


81

ตารางท 15 อทธพลของความเสถยรของอณหภมทมผลตอกจกรรมของเอนไซมเฮพารเนส จากเชอ Aeromonas sp. RYA_En1 (20 C) คาความเปนกรด-ดางท 7.0

เวลา (ชม.)


Enzyme

activity (U/ml)

% Relative

activity 1 2 3

0 0.648 0.640 0.656 0.648 0.008 0.130 0.002 99.948 0.234

1 0.600 0.604 0.601 0.602 0.002 0.120 0.000 92.813 1.381

2 0.591 0.593 0.598 0.594 0.004 0.119 0.001 91.626 0.912

3 0.563 0.563 0.565 0.564 0.001 0.113 0.000 86.948 0.902

4 0.561 0.561 0.563 0.562 0.001 0.112 0.000 86.639 0.898

5 0.560 0.560 0.588 0.569 0.016 0.114 0.003 87.808 1.828

6 0.553 0.557 0.554 0.555 0.002 0.111 0.000 85.563 1.296




Enzyme activity

(U/ml)

% Relative

activity 1 2 3

0 0.656 0.658 0.659 0.658 0.002 0.132 0.000 99.899 0.232

1 0.639 0.642 0.638 0.640 0.002 0.128 0.000 97.166 0.455

2 0.607 0.603 0.608 0.606 0.003 0.121 0.001 92.052 0.657

3 0.588 0.590 0.593 0.590 0.003 0.118 0.001 89.671 0.243

4 0.593 0.591 0.591 0.592 0.001 0.118 0.000 89.875 0.571

5 0.585 0.591 0.583 0.586 0.004 0.117 0.001 89.064 0.643

6 0.570 0.574 0.568 0.571 0.003 0.114 0.001 86.684 0.541

สำนกหอ


82




Enzyme activity

(U/ml)

% Relative activity

1 2 3

0 0.668 0.670 0.662 0.667 0.004 0.133 0.001 100.002 0.301

1 0.658 0.660 0.663 0.660 0.003 0.132 0.001 99.057 1.219

2 0.661 0.659 0.600 0.640 0.035 0.128 0.001 95.975 4.389

3 0.651 0.651 0.652 0.651 0.001 0.130 0.000 97.705 0.937

4 0.598 0.597 0.593 0.596 0.003 0.119 0.001 89.402 0.394

5 0.554 0.560 0.558 0.557 0.003 0.111 0.001 83.605 0.930

6 0.550 0.552 0.557 0.553 0.004 0.111 0.001 82.957 1.253




Enzyme activity

(U/ml)

% Relative activity

1 2 3

0 0.681 0.686 0.683 0.683 0.003 0.137 0.001 100.000 0.253

1 0.675 0.671 0.679 0.675 0.004 0.135 0.001 98.782 0.718

2 0.663 0.669 0.661 0.664 0.004 0.133 0.001 97.220 0.632

3 0.659 0.659 0.655 0.658 0.002 0.132 0.000 96.246 0.647

4 0.658 0.655 0.657 0.657 0.002 0.131 0.000 96.099 0.595

5 0.598 0.595 0.592 0.595 0.003 0.119 0.001 87.075 0.781

6 0.586 0.580 0.590 0.585 0.005 0.117 0.001 85.660 0.856

สำนกหอ


83




Enzyme activity

(U/ml)

% Relative

activity 1 2 3

0 0.670 0.673 0.668 0.670 0.003 0.134 0.001 99.802 0.172

1 0.652 0.655 0.651 0.653 0.002 0.131 0.000 95.513 0.433

2 0.640 0.637 0.638 0.638 0.002 0.128 0.000 93.416 0.612

3 0.571 0.575 0.570 0.572 0.003 0.114 0.001 83.708 0.430

4 0.530 0.539 0.535 0.535 0.002 0.107 0.001 78.243 0.392

5 0.459 0.451 0.456 0.455 0.004 0.091 0.001 66.636 0.832

6 0.448 0.450 0.447 0.448 0.002 0.090 0.000 65.610 0.322




Enzyme activity

(U/ml)

% Relative

activity 1 2 3

0 0.664 0.659 0.662 0.662 0.003 0.132 0.001 100.000 0.262

1 0.143 0.147 0.140 0.143 0.004 0.029 0.001 21.663 0.548

2 0.129 0.130 0.127 0.129 0.002 0.026 0.000 19.446 0.231

3 0.089 0.090 0.073 0.084 0.010 0.017 0.002 12.693 1.420

4 0.003 0.004 0.006 0.004 0.002 0.001 0.001 0.655 0.233

5 0.003 0.002 0.001 0.002 0.001 0.000 0.000 0.302 0.150

6 0.002 0.003 0.002 0.002 0.001 0.000 0.000 0.353 0.088

สำนกหอ


84




Enzyme activity

(U/ml)

% Relative

activity 1 2 3

0 0.661 0.663 0.667 0.664 0.003 0.133 0.001 100.051 0.313

1 0.004 0.004 0.005 0.004 0.001 0.001 0.000 0.653 0.086

2 0.003 0.002 0.001 0.002 0.001 0.000 0.000 0.302 0.152

3 0.003 0.003 0.003 0.003 0.000 0.001 0.000 0.452 0.002

4 0.001 0.001 0.002 0.001 0.001 0.000 0.000 0.201 0.086

5 -0.002 -0.001 -0.001 -0.001 0.001 0.000 0.000 -0.201 0.088

6 0.000 0.001 0.002 0.001 0.001 0.000 0.000 0.150 0.150

ตารางท 22 อทธพลของความเสถยรของความเปนกรด -ดางทมผลตอกจกรรมของเอนไซม เฮพารเนส จากเชอ Aeromonas sp. RYA_En1 (pH 7.0) ทอณหภม 37 C



Enzyme activity

(U/ml)

% Relative

activity 1 2 3

0 0.681 0.680 0.683 0.681 0.002 0.136 0.000 99.952 0.223

1 0.631 0.630 0.628 0.630 0.002 0.126 0.000 92.373 0.606

2 0.596 0.594 0.591 0.594 0.003 0.119 0.001 87.092 0.721

3 0.573 0.570 0.575 0.573 0.003 0.115 0.001 84.010 0.228

4 0.498 0.485 0.497 0.493 0.007 0.099 0.001 72.371 0.969

5 0.465 0.470 0.468 0.468 0.003 0.094 0.001 68.607 0.443

6 0.439 0.440 0.437 0.439 0.002 0.088 0.000 64.353 0.489

สำนกหอ


85

ตารางท 23 อท ธพลของชนดไอออนท มผล ตอกจกรรมของ เอนไซม เ ฮพา ร เนสจาก เชอ Aeromonas sp. RYA_En1 (Without adding metal ion) ทอณหภม 37 C คาความเปนกรด-ดางท 7.0

ความเขมขน mM


Enzyme activity

(U/ml)

% Relative activity

1 2 3

0 0.520 0.529 0.519 0.523 0.006 0.105 0.001 99.873 0.110

ตารางท 24 อท ธพลของชนดไอออนท มผล ตอกจกรรมของ เอนไซม เ ฮพา ร เนสจาก เชอ Aeromonas sp. RYA_En1 (Ba2+) ทอณหภม 37 C คาความเปนกรด-ดางท 7.0

ตารางท 25 อทธพลของชนดไอออนทมผลตอกจกรรมของเอนไซมเฮพาร เนส จากเชอ Aeromonas sp. RYA_En1 (Ca2+) ทอณหภม 37 C คาความเปนกรด-ดางท 7.0

ความเขมขน

mM


Enzyme activity

(U/ml)

% Relative activity

1 2 3

1 0.486 0.480 0.489 0.485 0.005 0.097 0.001 92.689 1.861

10 0.488 0.485 0.490 0.488 0.003 0.098 0.001 93.195 1.473

100 0.470 0.465 0.468 0.468 0.003 0.094 0.001 89.373 1.431


mM


Enzyme activity

(U/ml)

% Relative activity

1 2 3

1 0.554 0.540 0.552 0.549 0.008 0.110 0.002 104.860 1.160

10 0.620 0.621 0.619 0.620 0.001 0.124 0.000 118.480 1.914

100 0.518 0.510 0.520 0.516 0.005 0.103 0.001 98.614 2.140

สำนกหอ


86

ตารางท 26 อทธพลของชนดไอออนทมผลตอกจกรรมของเอนไซมเฮพาร เนส จากเชอ Aeromonas sp. RYA_En1 (Co2+) ทอณหภม 37 C คาความเปนกรด-ดางท 7.0

ตารางท 27 อทธพลของชนดไอออนทมผลตอกจกรรมของเอนไซมเฮพาร เนส จากเชอ Aeromonas sp. RYA_En1 (Mg2+) ทอณหภม 37 C คาความเปนกรด-ดางท 7.0

ตารางท 28 อทธพลของชนดไอออนทมผลตอกจกรรมของเอนไซมเฮพาร เนส จากเชอ Aeromonas sp. RYA_En1 (Mn2+) ทอณหภม 37 C คาความเปนกรด-ดางท 7.0


mM


Enzyme

activity (U/ml)

% Relative activity

1 2 3

1 0.509 0.510 0.512 0.510 0.002 0.102 0.000 97.524 1.160

10 0.596 0.591 0.598 0.595 0.004 0.119 0.001 113.708 1.914

100 0.811 0.810 0.816 0.812 0.003 0.162 0.001 155.238 2.140


mM


Enzyme

activity (U/ml)

% Relative activity

1 2 3

1 0.577 0.570 0.572 0.573 0.004 0.115 0.001 109.503 1.761

10 0.450 0.451 0.449 0.450 0.001 0.090 0.000 85.993 0.784

100 0.439 0.435 0.438 0.437 0.002 0.087 0.000 83.576 1.303


mM


Enzyme

activity (U/ml)

% Relative activity

1 2 3

1 0.484 0.470 0.481 0.478 0.007 0.096 0.001 91.419 2.390

10 0.490 0.491 0.484 0.488 0.004 0.098 0.001 93.316 0.891

100 0.647 0.650 0.649 0.649 0.002 0.130 0.000 123.957 1.156

สำนกหอ


87

คายอ (Abbreviation)

แอลฟา

β เบตา

% เปอรเซนต

C องศาเซลเซยส

kDa กโลดาลตน

h ชวโมง

ml มลลลตร

mg มลลกรม

g กรม

mM มลลโมลาร

nm นาโนเมตร

U ยนต

OD คาการดดกลนแสง

l ไมโครลตร

%(w/v) เปอรเซนตโดยนาหนกตอปรมาตร

%(v/v) เปอรเซนตโดยปรมาตร

rpm ความเรวรอบตอนาท

lb/in2 ปอนดตอตารางนว

สำนกหอ


88

ประวตผวจย

ชอ-สกล นางสาวประภาศร คณตชยเดชา ทอย 27/10 หม 3 ตาบลกะเฉด อาเภอเมอง จงหวดระยอง 21100

ประวตการศกษา พ.ศ. 2549 – 2554 วทยาศาสตรบณฑต สาขาจลชววทยา มหาวทยาลยศลปากร พระราชวง

สนามจนทร จงหวดนครปฐม

พ.ศ. 2555 – ปจจบน ศกษาตอระดบปรญญามหาบณฑต สาขาจลชววทยา บณฑตมหาวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร พระราชวงสนามจนทร จงหวดนครปฐม

ประวตการทางาน

พ.ศ. 2556 ผชวยสอน 518 202 ปฏบตการจลชววทยาทวไป 1(0-3-0)

ภาคการศกษาท 1 ปการศกษา 2556

พ.ศ. 2557 ผชวยสอน 518 202 ปฏบตการจลชววทยาทวไป 1(0-3-0)

ภาคการศกษาท 1 ปการศกษา 2557

ทน

พ.ศ. 2557 ไดรบทนอดหนนการศกษาจากเงนงบประมาณแผนดน (หมวดเงนทวไป)ของบณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร ปงบประมาณ 2557 ครงท 2

ผลงานดเดนและรางวลทางวชาการ

ผลงานทางวชาการ 1. Khanitchaidecha, P. and Pulsawat, W. (2015) “Purification and Characterization of

Heparin Degrading Enzyme by isolated bacteria from brackish sediment” The 6th International

conference on Fermentation Technology for Value Added Agricultural Products. 29-31 July, 2015,

Centara Hotel & Convention Center, Khon Kaen, Thailand. (Poster and awaiting of acceptance for

research article publishing)

2. Khanitchaidecha, P. and Pulsawat, W. (2014) “Purification and characterization of

Heparinase produced by bacteria isolated from marine sediment in Rayong province, Thailand”

The 4th Conference on Taxonomy and Systematics in Thailand. 23-25 May, 2014, Faculty of

Science, Naresuan University Phitsanulok, Thailand. (Best poster award)

สำนกหอ


89

3. Pulsawat, W., Krethathorn, S. and Khanichaidecha, P. (2013) “Heparinase produced

by isolated marine and brackish bacteria” The 5th International Conference on Fermentation

Technology for Value Added Agricultural Products with Joint Session from Research Group for

Development of Microbial Hydrogen Production Process from Biomass-KKU. 21-23 August,

2013, Centrara Hotel and Convention Centre Khonkaen, Thailand. (Poster)

4. Pulsawat, W. and Khanichaidecha, P. (2012) “Screening and Environmental Factors

Effecting on Growth of Hepaeinase-Producing Bacteria.” KKU Res. J. 593-606 (Reseach article)

สำนกหอ


Documents

า 2557 ิทยาลัิลปากรยศ - Silpakorn University · 2016-08-01 · ง 54313205: สาขาวชาจิุลชีววิทยา คําสาคํัญ