DIPLOMAMUNKA

A 16-3 bakteriofág host-range mutációi

Maász Anita biológus hallgató

témavezető: Dr. Putnoky Péter

Pécsi Tudományegyetem Természettudományi Kar

Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszék

2004.

MA_DIP04.doc

TARTALOM RÖVIDÍTÉSEK 3 1. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 4 1.1. A 16-3 bakteriofág 4 1.1.1. A 16-3 bakteriofág genetikai és fizikai térképe 4 1.1.2. A 16-3 bakteriofág ismert génjei 6 1.1.3. A fágfertőzés folyamata 7 1.1.4. A h gén lokalizálása 9 1.2. A rhizobiumok 10 1.2.1. A szimbiózis kialakulása 10 1.2.2. Sejtfelszíni poliszacharidok 11 1.2.3. A szimbiózisban szerepet játszó fontosabb gének 12 2. KÍSÉRLETI ELŐZMÉNYEK 14 3. CÉLKITŰZÉSEK 16 4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 17 4.1. Baktériumtörzsek, bakteriofágok és plazmidok 17 4.2. Baktériumok és bakteriofágok szaporítása 18 4.3. Cseppteszt 18 4.4. Fágkötési teszt 19 4.5. Bakteriofág DNS izolálás 19 4.6. Plazmid DNS preparálás 20 4.7. DNS tisztítás a minták nukleotidsorrendjének meghatározásához 20 4.8. Agaróz gélelektroforézis és restrikciós endonukleázok alkalmazása 21 4.9. Fragmentizolálás 21 4.10. Ligálási reakció 21 4.11. Kompetens sejtek készítése 22 4.12. Transzformáció 22 4.13. PCR 23 4.14. DNS szekvencia meghatározás 24 4.15. Számítógépes szekvencia analízis 24 5. KÍSÉRLETI EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK 25 5.1. Egy host-range mutáció jellemzése 25 5.2. Újabb host-range fágmutánsok azonosítása 28 5.3. A fág baktériumfelszín felismerésében más fágfehérje is szerepet játszhat 30 5.4. A h mutáns fágok baktériumhoz történő kötődésének vizsgálata 30 6. ÖSSZEFOGLALÁS 34 7. FÜGGELÉK 35 8. FELHASZNÁLT IRODALOM 36 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

MA_DIP04.doc 2

RÖVIDÍTÉSEK

Amp ampicillin

ATP adenozin-5’-trifoszfát

bp bázispár

DMSO dimetil-szulfoxid

DNS dezoxi-ribonukleinsav

EDTA etilén-diamin-tetraacetát

EPS exopoliszacharid

IPTG izopropil-β-D-galaktopiranozid

kb kilobázis

Km kanamicin

KPS kapszuláris poliszacharid

LPS lipopoliszacharid

Neo neomicin

ORF open reading frame (nyitott leolvasási keret)

PCR polimeráz láncreakció

SDS nátrium-dodecil-szulfát

Tris tris-(hidroxi-metil)-amino-metán

X-gal 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-tiogalaktopiranozid

MA_DIP04.doc 3

1. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

1.1. A 16-3 bakteriofág A bakteriofágok a baktériumgenetika fontos eszközei, elég, ha csak az Escherichia

coli - lambda fág rendszerre utalunk, amely kiemelkedő jelentőségűvé vált. A rhizobium

genetikában, melynek fő célja a szimbiotikus baktériumgének megismerése, ennek

mintájára szintén fontosnak tűnt egy megfelelő fág - baktérium rendszer megismerése.

A rhizobiumok számos bakteriofágja ismert. Ezek közül többel végeztek sikeresen

általános vagy speciális transzdukciót. A legtöbb eredmény a Sinorhizobium meliloti

törzsek fágjaival született. Ezek közül is kiemelkedik a Magyarországon használt S.

meliloti 41 törzsön szaporodó 16-3 fág, amely az egyetlen részletesen tanulmányozott

rhizobium fág. A 16-3 fágot a talajból izolálták Balatonberény környékén (Szende et al.,

1960).

A virion kromoszómája kétszálú, lineáris, 60,8 kb nagyságú molekula (Dallman et al.,

1979), amely 10 bázis hosszú, 3’ túlnyúló ragadós végekkel rendelkezik. Alakjában és

több molekuláris sajátságában is emlékeztet a lambda fágra és ahhoz hasonlóan egy

speciális transzdukáló fág. Ismert a részletes genetikai-fizikai térképe (1. ábra), a

represszor fehérje szerkezete, a fág és a baktérium kromoszómáján lévő att régió pontos

szekvenciája, tanulmányozták a fág integrációjának mechanizmusát. Ennek

eredményeként egy speciális vektorcsaládot is kifejlesztettek, amely a fág int génjét és att

régióját hordozza. Ennek felhasználásával a legkülönbözőbb gének építhetők be a S.

meliloti 41 kromoszóma att helyére (Papp et al., 1993).

1.1.1. A 16-3 bakteriofág genetikai és fizikai térképe A 16-3 fág alapvető genetikai analízisét és térképezését különböző mutánsok

segítségével végezték el. Az izolált, mintegy 150 ts (hőérzékeny) mutáns a fágszaporodás

szempontjából korai és kései típusokra bontható. A korai és kései funkciók elkülönülését

jól tükrözi a 16-3 fág genetikai térképe, szoros korreláció van a gének elhelyezkedése és

működésének ideje között (1. ábra) (Orosz et al., 1973).

A géntérkép régiói a következők: h gén - ant gén - lizozim gén - immX régió - att régió

- int gén - xis gén - avirC operátor - C cisztron - avirT operátor (Orosz et al., 1973). A

géntérkép hossza a C cisztrontól a lizozim génig 40 térképegység hosszúságú.

MA_DIP04.doc 4

Elkészítették a 16-3 fág kromoszómájának fizikai térképét 10 féle restrikciós

endonukleáz segítségével. Ez száz térképezett hasítóhelyet tartalmaz (7. fejezet).

Lényegesen kevesebb a 16-3 fágról szerzett ismeretanyag, mint az, ami az E. coli lambda

vagy T4 fágjáról felhalmozódott. Ennek ellenére a 16-3 fág ma már a viszonylag jól

ismert bakteriofágok szűk köréhez tartozik (Orosz et al., 1973; Dallmann et al., 1979;

Dorgai et al., 1981).

1. ábra: A 16-3 bakteriofág genetikai és fizikai térképe. Az ábra felső részén a 16-3 fág publikált fizikai térképe látható két restrikciós endonukleázzal hasítva (Dorgai et al., 1983). A számok az 1. táblán (7. fejezet) található hasítóhelyek pozíciójára utalnak. A színes téglalapok a géneket, illetve a fontos régiókat jelölik. Az ábra alsó részén az egyes régiók felépítését tüntettük fel. PR, PC: a C cisztron promotereit, az OR az operátor régiókat jelöli. (Csiszovszki et al., 2003; Semsey et al., 1999; Dallmann et al., 1991)

MA_DIP04.doc 5

1.1.2. A 16-3 bakteriofág ismert génjei A 16-3 fágnak két fő regulátor génje van: a c cisztron és az immX régió (Orosz et al.,

1973). A c regulátorgén a 16-3 egyik legjobban ismert génje, amely a lizogén életciklus

kialakításában játszik szerepet, a fág baktériumba integrálódását és kivágódását

szabályozza. A gén kódoló régiója az (55)HindIII-(60)HindIII fragmenten található (1.

ábra). Két operátor régióval rendelkezik: avirC és avirT. Az avirC a géntől 5’ irányban

található, míg az avirT -t 3’ irányban a korai génekhez közel lokalizálták. A c gén

terméke egy represszor fehérje, amely transzkripciógátló hatást fejt ki. A DNS

szekvencia adatok alapján a C represszor egy 197 aminosav hosszúságú bázikus fehérje.

Amino-terminális doménje egy „helix-turn-helix” DNS kötő motívumot hordoz, amely az

operátor régióhoz való kötődésért felelős (Dallmann et al., 1991).

A másik regulátor régió, az immX a (41)EcoRI hasítóhely környékén lévő körülbelül

1500 bázispáros régióban foglal helyet (EcoRI L, H fragment) (1. ábra). A vizsgálatok

alapján ez a regulátor nagymértékű hasonlóságot mutat a lambda fág cI represszorával.

Az immX régió 3 részből áll: XU, XL és XV. Az XU és XL két átfedő cisztron, amelyek a

pXU, pXL fehérjéket kódolják. E fehérjék szabályozó tevékenységének célpontja az XV

régió, amely szintén három részből áll: XV1, XV2, XV3. Az XV1 egy rho független

transzkripció terminációs struktúra. Az XV2 az XV1 és XV3 expresszivitását növeli (Dorgai

et al., 1986; Csiszovszki et al., 2003).

A 16-3 egy tipikus temperált fág, amelyik helyspecifikus rekombináció révén képes

integrálódni a gazdakromoszóma egy meghatározott helyére. A baktérium és a fág

részéről is az att régiók (fág: attP, baktérium: attB) vesznek részt a folyamatban. A fág

genomjában az attP szekvencia a (48)EcoRI - (52)EcoRI hasítóhelyek között (K

fragment) található (1. ábra). Az att régión belül egy 51 bázispár hosszúságú szakaszt,

egy „core” (magi) régiót különíthetük el, amely a fágban és a baktériumban is azonos. E

részen belül történik meg a szálkicserélődés. A baktérium kromoszómáján található attB

hely két fordított orientációjú integráz kötőhelyet tartalmaz (Dorgai et al., 1993; Papp et

al., 1993).

A helyspecifikus rekombináció működését két rekombináns gén teszi lehetővé: az int

és a xis gén (1. ábra). Az int gén az integrációért felelős fehérjét (Int) kódolja, a xis gén

pedig a baktérium kromoszómájából történő kivágódásért felelős. Mindkét gént az att

régiótól 3’ irányban a (48)EcoRI - (55)HindIII hasítóhelyek között lokalizálták. A két gén

körülbelül 240 bázispár hosszú része átfed egymással. Mindkét gént a C represszor

MA_DIP04.doc 6

fehérje szabályozza. Az int gén által kódolt fehérje hordozza mindazon jegyeket, amelyek

a helyspecifikus rekombinázok integráz családjának tagjaira jellemzőek. Így az Int

fehérje is ebbe a csoportba sorolható. A homológia vizsgálatok alapján elmondható, hogy

a fehérje C-terminális részéhez közel a 346-os pozícióban található tirozin oldallánc vesz

részt a DNS szálak hasításában. Ezen oldallánc hidroxil csoportjának eltávolítása a

fehérje rekombináz aktivitásának elvesztéséhez vezet (Semsey et al., 1999).

A xis gén által kódolt fehérje (Xis) 140 aminosavból áll. Számítógépes analízis szerint

az N-terminálisán valószínűleg egy “helix-turn-helix” motívum található. Mérete hasonló

az eddig ismert néhány hasonló fehérje méretéhez, de azokhoz számottevő szekvencia

homológiát nem mutat.

A 16-3 fág h génje a (28) EcoRI - (37) EcoRI (D) fragmenten található. A fág farki

rost fehérjéjét (H) kódolja, amely a fág baktériumhoz tapadásában játszik fontos szerepet.

Az ant gén a h gén közelében, attól 3’ irányban helyezkedik el (1. ábra). Az általa

termelt fehérje (Ant) a fág poliklonális ellenanyagokkal történő reakciójában vesz részt

(Orosz et al., 1970).

1.1.3. A fágfertőzés folyamata A fág a fertőzés során először farki rostjával a baktérium sejtfal speciális

kiemelkedésein, az ún. fágreceptorokon tapad meg. Ezt fág adszorpciónak nevezzük,

amely hatékony, kalciumiont igénylő folyamat. A fág a tapadási folyamat után lítikus és

lizogén módon szaporodhat (2. ábra). Lítikus úton a fágok a baktériumon belül

sokszorozódnak, majd a baktériumsejtet „szétroncsolva” kiszabadulnak és újabb

baktériumokat fertőznek meg. A lizogén módon szaporodó fágok kromoszómájukat a

baktérium genomjába képesek integrálni és ott generációkon keresztül a baktériummal

együtt replikálódni.

A 16-3 tulajdonságainak és viselkedésének beható tanulmányozása során kiderült,

hogy ez a bakteriofág egy temperált (mérsékelt) fág, amely képes profágként a baktérium

genomjába integrálódni, illetve lítikus úton is szaporodni. Ezzel szemben léteznek

agresszív fágok, amelyek csak lítikus módon képesek önmaguk sokszorozására (Szende

et al., 1960).

A 16-3 fág integrációja helyspecifikus rekombináció révén valósul meg. A folyamat

meghatározott szekvenciájú rövid homológ DNS szakaszok között játszódik le,

MA_DIP04.doc 7

amelynek során profág keletkezik. Az, hogy a 16-3 fág helyspecifikus rekombinációs

rendszere E. coliban nem működik, arra utal, hogy a fág kromoszómába épüléséhez

specifikus gazdafaktor is szükséges, amely az E. coliban nem található meg. A 16-3

helyspecifikus rekombinációs rendszer közvetlen felhasználhatóságának tehát két

feltétele van, az egyik a specifikus gazdafaktor jelenléte, a másik pedig az, hogy a

rekombinációs célszekvencia az adott baktérium kromoszómáján megtalálható legyen

(Semsey et al., 1999).

A 16-3 fág csak a baktérium egy meghatározott régiójához (attB) tud

hozzákapcsolódni. Környezeti indukció hatására bekövetkező kivágódása során e régió

környéki kromoszómaszakaszokat képes magával vinni. Így a fág fehérjeburkába a fág

DNS helyett bakteriális DNS darabok kerülhetnek. A 16-3 fág tehát egy speciális

transzdukáló fág. Léteznek azonban általános transzdukcióra képes fágok, amelyek a

baktérium kromoszómájából bizonyos gyakorisággal (10-5) kivágódva bármely

baktérium-kromoszómadarabot magukkal ragadhatnak.

2. ábra: A bakteriofágok szaporodási formái ( lizogén, lítikus).

MA_DIP04.doc 8

Egyedi cys+ transzduktáns telepekből fágot indukáltak és megvizsgálták a fág DNS

restrikciós képét. Gyakran találtak stabilan transzdukáló, ugyanakkor életképtelen

fágokat, amelyeket dtr-nek neveztek el. Az ilyen fág csakis helper fág jelenlétében

szaporodott. A dtr fágokban a fág DNS óriási része hiányzott. A hiányzó szakaszt

bakteriális DNS helyettesítette. A deléció/inszerció nem érinti a ragadós végeket és a

replikációs origót, aminek következtében a dtr kromoszóma jól pakolódik és replikálódik.

A kiesett fág funkciókat és az ezeket kódoló fág DNS szakaszokat azonosítva

megállapították, hogy a Sinorhizobium meliloti DNS modifikáló aktivitással rendelkezik

(Svab et al., 1978 ).

Az érett fágrészecske elkészüléséhez (ún. eklipsz periódus) 28 °C-on minimálisan 80

percre, 36 °C-on 65 percre van szükség (Orosz et al., 1973). A fágot a késői gének által

kódolt 5 nagy (72 Kd, 18,5 Kd, 31,5 Kd, 47 Kd, 86 Kd) és 5 kicsi (25 Kd, 27 Kd, 50 Kd,

59 Kd, 68 Kd) fehérje építi fel. Eddigi ismereteink alapján a fágfej 6 (18,5 Kd, 31,5 Kd,

47 Kd, 50 Kd, 59 Kd, 68 Kd), a farokrész pedig 2 polipeptidláncot (72 Kd, 86 Kd)

tartalmaz. A két legkisebb fehérje (25, 27 Kd) helyzete még bizonytalan (Erdei et al.,

1982).

1.1.4. A h gén lokalizálása Ha a baktérium felszínén megváltozik a fág receptora, de még jelen van, akkor lehet

olyan fágmutánsokat izolálni, amelyek egy mutáció révén képesek ismét felismerni ezt a

felszínt. A jelenséget host-range mutációnak, az érintett gént pedig h génnek nevezzük.

Orosz László laborjában Palágyi Zsuzsanna (pZS plazmidok) határozta meg a h gén

körülbelüli helyzetét marker rescue technikával, mely során h mutáns fágból klónozott

DNS fragmenteket egy plazmidba. Ha a plazmidot tartalmazó baktériumon vad típusú

fágokat szaporítottak el, akkor homológ rekombináció révén a fágokban megjelenhet a h

mutáció. A h mutánsok nagy száma jelezte, hogy a kérdéses mutáció a klónozott DNS

szakaszon helyezkedik el. Egyre kisebb DNS fragmentumokkal dolgozva, ezen az elven a

pZS5 klón,- amely EcoRI hasítással keletkezett, illetve a BamHI enzimmel előállított

pZS10 klón (4. ábra) tartalmazta a mutációt. Így a h mutációt az 1,16 kb hosszúságú

BamHI szakaszon belül lehetett lokalizálni.

MA_DIP04.doc 9

1.2. A rhizobiumok A 16-3 bateriofág gazdabaktériuma a Sinorhizobium meliloti 41-es törzs, amely a

Rhizobiaceae családba tartozó endoszimbionta talajbaktérium. E család tagjai

(Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium, Sinorhizobium, röviden rhizobiumok)

nitrogénkötésre képesek. Általában a Leguminosae (hüvelyesek) növénycsalád tagjaival

alakítanak ki szimbiótikus kapcsolatot (Allen et al., 1981). Ez az együttélés mindkét fél

számára előnyös, hiszen a baktérium tápanyagokhoz jut a növény által, a növény pedig a

szervezete felépítéséhez szükséges nitrogént a baktériumok segítségével veszi fel. Így a

növény tulajdonképpen függetleníti fejlődését a talajtól és közvetve a légkör

nitrogéntartalmát hasznosítja. Az általunk vizsgált Sinorhizobium meliloti 41 (régi nevén

Rhizobium meliloti 41) egy pálcika alakú, endospóra nélküli Gram-negatív baktérium,

amely Medicago, Melilotus és Trigonella fajokkal alakít ki endoszimbiózist.

Gazdaságilag legfontosabb partnere a lucerna (Medicago sativa).

1.2.1. A szimbiózis kialakulása

A rhizobiumok hüvelyes növényekkel kialakított kapcsolatát endoszimbiózisnak

nevezzük. A baktériumok e folyamatban egy új növényi szerv, a szimbiótikus gümő

(nodulus) belsejében végzik a nitrogénfixációt. Ez a struktúra csak a megfelelő baktérium

jelenlétében alakul ki a gazdanövény gyökerén. A rhizobiumok a gümő belsejében a

nitrogéngázt ammóniává redukálják, hasznosíthatóvá téve ezáltal a növény számára.

A fertőzési folyamat függ a növény fiziológiai állapotától és a fertőzési helyek

egymástól való távolságától. A baktériumok a növény gyökérszőrsejtjein keresztül jutnak

be azok belsejébe. A baktériumok ezért először e képletekhez kapcsolódnak. Hatásukra a

fertőzési ponttal ellentétes oldalon megindul a gyökérszőrsejt növekedése, ami annak

görbülését eredményezi. A fertőzési ponton a sejtfal leépül és egy sejtösszetevőkből álló,

újonnan kialakuló csőszerű képlet, az infekciós fonal jön létre. Ebben a baktériumok a

kéregsejteken át a kéreg belsejébe jutnak, ahol mitózist indukálnak. Ennek hatására egy

új osztódószövet, a gümőmerisztéma jön létre (Dudley et al., 1987), amelyből aztán a

gümő fejlődik.

Ezzel egyidőben a baktériumok endocitózissal belépnek a gümősejtekbe, így egy ún.

peribakteroid membránnal határolódnak, amely transzportfehérjéket tartalmaz és jelentős

MA_DIP04.doc 10

anyagtranszportot bonyolít le. Közben a baktériumok fiziológiai változásokon mennek

keresztül, illetve térfogatuk 30-40-szeresére megduzzad, vagyis bakteroidokká alakulnak.

A bakteroidok nitrogenáz enzimének működéséhez nélkülözhetetlen bizonyos

mennyiségű (csekély) oxigén. A komplex azonban túl nagy oxigén-koncentrációra

érzékeny. A gazdanövényben egy olyan különleges hemoglobin képződik, a

leghemoglobin, amely biztosítja az alacsony, de még szükséges oxigén mennyiséget

(mikroaerob környezet).

1.2.2. Sejtfelszíni poliszacharidok

A szimbiózis kialakulásában fontos szerepük van a rhizobiális sejtfelszíni

poliszacharidoknak. Ezen belül elkülöníthetünk exopoliszacharidokat (EPS),

lipopoliszacharidokat (LPS) és kapszuláris poliszacharidokat (KPS).

Az exopoliszacharidok a sejtfelszínen felhalmozódó és a környezetbe nagy

mennyiségben kiválasztott extracelluláris poliszacharidok. Nélkülözhetetlen szerepet

töltenek be a gümőfejlődésben, ugyanakkor a szimbiózis kialakulásában nem

meghatározó a funkciójuk.

A S. meliloti 41 törzs egy szükcinoglükán természetű heteropoliszacharidot termel,

amely ismétlődő oktaszacharid egységekből épül fel. Az alegységek szukcinil, piruvil és

acetil módosításokat tartalmaznak. Ezek közül a szukcinil és piruvil csoportok

elengedhetetlenül szükségesek a gümő kialakulásához. (Hiányuk esetén gümő nem

képződik.)

A S. meliloti 41 által termelt exopoliszacharidot kromatográfiás módszerrel egy nagy

(HMW) és egy kis (LMW) molekulatömegű frakcióra lehet elkülöníteni. Az

exopoliszacharidok szintézise négy lépéses folyamat: 1. nukleotidcukrok szintézise

(UDP-glükóz, UDP-galaktóz); 2. az oktaszacharid alegységek szintézise a

nukleotidcukrokból egy lipidhordozó felszínén; 3. az alegységek módosítása piruvil,

szukcinil és acetil-csoportok elhelyezése révén; 4. az oktaszacharid alegységek

polimerizációja.

A lipopoliszacharidok a Gram-negatív baktériumok sejtfelszínének fontos alkotói, a

külső membrán integráns részei. Egy LPS molekula három szerkezeti egységre tagolható:

lipidA egység, amely a molekulát a külső membránhoz horgonyozza. Ehhez kapcsolódik

a konzerválódott szerkezetű „core” oligoszacharid, amellyel az ismétlődő

MA_DIP04.doc 11

oligoszacharidokból álló törzsspecifikus O-antigén alakít ki kapcsolatot (Kannenberg et

al.,1994).

A lipopoliszacharidok a nagy variabilitással és nagyfokú immunogén aktivitással

rendelkező alkotórészük (O-antigén) által fontos szerepet tölthetnek be például a

patogenitás mértékének meghatározásában. Ezek a sejtfelszíni struktúrák az új

eredmények alapján a rhizobiumoknál szerepet játszhatnak a szimbiózis kialakításában.

A kapszuláris poliszacharidok ─ más néven (erős immunogén hatásuk miatt) K-

antigének ─ a baktérium felszínéhez szorosabban kötődő struktúrák, amelyek (az EPS-sel

ellentétben) nem választódnak ki a környezetbe.

A KPS-ek szerkezetüket tekintve diszacharidegységekből felépülő poliszacharidok. A

diszacharidegységek a 2-keto-3-deoxi-oktulonsavat (Kdo) vagy annak valamilyen

variánsát tartalmazzák. Az EPS-sel ellentétben, melynek szerkezete fajon belül állandó, a

KPS törzsspecifikus antigén, vagyis a faj különböző törzsei eltérő szerkezetű sejfelszíni

KPS-sel rendelkeznek (Reuhs et al., 1997).

A S. meliloti 41 törzs KR5 nevű poliszacharidot termel. Ez a struktúra felépítésében

hasonló az E. coli törzs II. típusú K antigénjéhez (Reuhs et al., 1993). A KPS-ek képesek

akár az EPS-ek szerepét is betölteni a szimbiózisban. Erre az általunk vizsgált

baktériumtörzs exoB mutánsa mutatott rá, amely az EPS elvesztése mellett továbbra is ki

tudott alakítani szimbiózist a gazdanövénnyel. Ezt pedig a KPS biztosította (Putnoky et

al., 1990).

A KPS-ek elősegítik a bakteriofág baktériumhoz történő kötődését, azonban léteznek a

16-3 fágra rezisztens KPS⎯ baktériummutánsok, amelyekhez a fág nem tud

hozzákapcsolódni, mert megváltozott szerkezetű poliszacharidot termelnek, vagy

egyáltalán nem képeznek ilyen sejtfelszíni struktúrákat (Petrovics et al., 1993; Kereszt et

al., 1998; Kiss et al., 2001).

1.2.3. A szimbiózisban szerepet játszó fontosabb gének

A S. meliloti 41 törzs 6,7 Mb nagyságú genommal rendelkezik (Honeycutt et al.,

1993). Kromoszómája 3,7 Mb hosszú, emellett egy pSymA (1,4 Mb) és egy pSymB (1,7

Mb) megaplazmidot hordoz. A pSymA replikon a nod, nif és fix géneket illetve a

transzfert irányító szekvenciákat (oriT és tra gének) tartalmazza. A pSymB plazmidon az

oriT és tra gének homológjai és sok poliszacharid bioszintézist irányító gén található.

MA_DIP04.doc 12

Rendelkezik még néhány esszenciális aminosav bioszintézisét kódoló, illetve a

sejtosztódáshoz nélkülözhetetlen génnel. A hordozott gének által a pSymB megaplazmid

növeli a baktérium környezethez való alkalmazkodóképességét.

A szimbiózis kialakulásának és a nitrogénfixáció egyes lépéseinek kódolásáért felelős

géneket három csoportba sorolhatjuk: nodulációs gének, gümőinváziót meghatározó

gének és a nitrogénkötés génjei.

A nodulációs gének (nodABC) a növény által kibocsátott szignálmolekulák

(flavonoidok) megjelenésével aktiválódnak. Egy diffúzibilis molekula, a Nod-faktor

szintézisét kódolják, amely a gazdanövény gyökerén hoz létre változásokat: indukálja a

gümőmerisztéma és a gümő kialakulását.

A gümőinváziót meghatározó gének közé a sejtfelszíni struktúrák bioszintézis útjait

kódoló géneket soroljuk, hiszen a szimbiózis e szakaszában elsődleges szerepet ezek a

struktúrák játszanak. Az infekcióban hibás mutánsok gümőfejlődést tudnak indukálni,

azonban a fertőzési folyamat nem jön létre.

Az exopoliszacharidok szintézisét (1.2.2. fejezet) exo gének irányítják (exoA-W). A

KR5 antigén bioszintézisében szerepet játszó gének a pSymB megaplazmidon, az rkp-

1,2,3 régióba tartoznak. A poliszacharidok szintézisében és a transzportban jelentős

funkcióval bírnak az NdvA, B fehérjék, amelyeket az ndv gének kódolnak.

A nitrogénkötés génjei közé sorolhatók a nif és fix gének. A nif gének a nitrogenáz

enzimkomplex egyes részeit és kofaktorának szintézisét irányítják. A fix gének pedig a

nitrogenáz enzimkomplexhez elektront szállító rendszer elemeit kódolják.

MA_DIP04.doc 13

2. KÍSÉRLETI ELŐZMÉNYEK

Munkám kezdetekor a vad típusú 16-3 fág h génjének DNS-szekvencia

meghatározására vonatkozó kísérletek is megkezdődtek. (A kapott részletes eredmények

Békási Krisztina diplomamunkájában olvashatók.)

A vad típusú szekvencia meghatározásához először a fág fizikai térképe alapján a D

és a C EcoRI fragmentet kellett elválasztani egymástól (3. ábra). Ezután a D fragmentből

izolálva az 1,16 kb hosszúságú BamHI fragmentet, meghatározták annak nukleotid-

szekvenciáját.

3. ábra: A D EcoRI fragment helyzete a 16-3 fág fizikai térképén.

Az ábra felső részén a 16-3 kromoszóma EcoRI restrikciós hasítóhelyei és a fragmentek jelei vannak feltüntetve. Az alsó részen a D EcoRI fragment részletesebb fizikai térképe látható, amelyen a számozás a restrikciós hasítóhelyek pozíciójára utal a 16-3 fág publikált fizikai térképén. (7. fejezet) (Dorgai et al., 1983)

MA_DIP04.doc 14

A kapott szekvenciát elemezve megállapítható volt, hogy egyetlen esetben a

meghatározott 1157 bp-os szakaszon keresztül húzódik egy ORF. Valószínűnek tartották,

hogy ez az ORF határozza meg a H fehérje aminósavsorrendjét. A kapott szekvenciában

azonban sem a gén elejét (5’ vég), sem a gén végét (3’ vég) nem találták meg. Ezért

mindkét irányban meghatározták a szomszédos régiók nukleotidsorrendjét is. A 3’

irányban történő szekvenálás eredményeként a (36)BamHI helytől körülbelül 300 bp

távolságra elhelyezkedő transzlációs stop kodon, illetve egy transzkripció terminációs

szignálszerű szekvencia volt azonosítható, amelynek jelenléte alátámasztja, hogy ez

ténylegesen a h gént kódoló régió. Később a (34)BamHI helytől 5’ irányba haladva azt

próbálták meghatározni, vajon honnan kezdődik a h gén. Többféle esetleges transzlációs

start kodont is detektáltak (ATG, GTG, GTT). Ezek közül a valós kezdőpont

kiválasztásához a H fehérje termeltetésével kapcsolatos kísérleteket terveztek.

A bakteriofág genetikai-fizikai térképén Palágyi Zsuzsanna révén már ismert volt

egy host-range mutáció körülbelüli helyzete. A mutációt Orosz László laborjában

„marker-rescue” technikával azonosította. Eredményei azt mutatták, hogy ez a változás a

pDH1 klónon, a pPZS5 klónon ((29)BamHI - (36)BamHI fragmenten), illetve a pPZS10

klónon ((34)BamHI - (36)BamHI fragmenten) belül helyezkedik el (4. ábra). Az érintett

gén nukleotid-szekvenciáját és természetét azonban eddig még nem határozták meg.

4. ábra: Egy h mutáció elhelyezkedése a 16-3 fág fizikai térképén.

MA_DIP04.doc 15

3. CÉLKITŰZÉSEK

A 16-3 fág kizárólag a Sinorhizobium meliloti 41 baktériumtörzsön képes

szaporodni, feltehetően azért, mert ez a törzs egy speciális kapszuláris poliszachariddal

rendelkezik, amelynek szerepe van a gazdanövénnyel való szimbiózis kialakításában is.

Korábbi munkákban feltételezték, hogy a fág receptora ez a törzsre jellemző KPS. A

fágreceptor természetének tanulmányozása érdekében célul tűztük ki receptor-mutáns

baktérium és host-range fágmutánsok azonosítását és jellemzését. E munkában feladatunk

a bakteriofág vizsgálata volt.

Orosz László laborjában sok évvel ezelőtt egy mutációval azonosították a

megváltozott baktériumfelszín felismerésében szerepet játszó fehérjét (H) kódoló h gén

helyét a bakteriofág genetikai-fizikai térképén. Az érintett gén nukleotid-szekvenciájában

történt változásokat azonban még nem vizsgálták.

Ennek ismeretében célunk:

• a 16-3 bakteriofág feltételezett farki rost fehérjéjét kódoló h génben található

mutáció(k) helyzetének feltérképezése, és

• a mutáció(k) természetének meghatározása volt.

MA_DIP04.doc 16

4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.1. Baktériumtörzsek, bakteriofágok és plazmidok

A munkánk során használt baktériumtörzseket, bakteriofágokat és plazmidokat,

illetve azok jellemzőit az 1. táblázat foglalja össze.

1. táblázat: Alkalmazott baktériumtörzsek, bakteriofágok, plazmidok.

Elnevezés Jellemzők, hivatkozások

Baktériumtörzsek

AK631 RM41 ”kompakt” kolóniamorfológiájú változata (exoB631,

Nod+, Fix+) (Kondorosi et al., 1977)

RM41 S. meliloti 41 vad típusú (Exo+, Nod+, Fix+) (Putnoky et al., 1990)

XL1-Blue E. coli K12, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17, supE44, relA1, lacZ∆M15 (Stratagene USA)

GH4046 RM41 rkpM4046 (Hoffmann)

GH4178 RM41 rkpM4178 (Hoffmann)

GH4180 RM41 rkp-4180 (Hoffmann)

PP2511 AK631 rkp-3::Tn5 (212) KmR SmR (Kiss et al., 2001)

Bakteriofágok

16-3 S. meliloti 41 baktériumtörzsre specifikus vad típusú fág (Orosz et al., 1970)

16-3 h5 16-3 fág, host-range mutáns (ez a munka)

16-3 h15 16-3 fág, host-range mutáns (ez a munka)

16-3 h109 16-3 fág, host-range mutáns (ez a munka)

16-3 h111 16-3 fág, host-range mutáns (ez a munka)

16-3 h114 16-3 fág, host-range mutáns (ez a munka)

Plazmidok

pBS pBluescript II SK (+), AmpR, klónozó vektor, (Stratagene USA)

pBBR1-MCS 2 KmR, Tra─, Mob+ (Kovach et al., 1995)

pDH1 PLAFR1 kozmid 16-3 fág klón, h régió; (Dorgai et al., 1986)

MA_DIP04.doc 17

4.2. Baktériumok és bakteriofágok szaporítása

Az E. coli törzseket LB komplett táptalajon, a megfelelő antibiotikum jelenlétében 37

ºC-on, a S. meliloti törzseket pedig TA komplett táptalajon, 32 ºC-on növesztettük.

Az LB tápfolyadék komponensei: 10 g/l Bacto trypton

5 g/l Yeast extract

5 g/l NaCl (pH 7,2). (Meade et al., 1977)

A TA tápfolyadék komponensei: 10 g/l Bacto trypton

1 g/l Yeast extract

5 g/l NaCl (pH 7.0)

1 mM MgSO4

1 mM CaCl2 (pH 7,2-7,5). (Orosz et al., 1973)

A táptalajok készítésekor a tápoldatokat 1,5 % agarózzal, fedőagar esetében pedig 0,7

% agarral egészítettük ki.

A szilárd táptalajokban alkalmazott antibiotikum koncentrációkat a 2. táblázat

tartalmazza.

2. táblázat: Alkalmazott antibiotikum koncentrációk (µg/ml).

Antibiotikumok E. coli S. meliloti

ampicillin 100 —

kanamicin 30 200

tetraciklin 15 15

A bakteriofágok esetében 4 ml TA tápfolyadékban 0,2 ml megfelelő baktériumot

(friss kultúra) és 1 plakk növeszteni kívánt bakteriofágot kevertünk össze, majd ezt

éjszakán át 32 ºC-on erős rázatás mellett szaporítottuk.

4.3. Cseppteszt A kísérlet elvégzéséhez 4 ml TA fedőagarban elkevert, éjszakán át növesztett 0,2 ml

rhizobium kultúrát TA táptalajt tartalmazó lemezekre szélesztettünk. A tesztelendő

MA_DIP04.doc 18

bakteriofág szuszpenziójából 1 µl-t (105-106 db fág részecske) a megszilárdult fedőagar

tetejére cseppentettünk, majd 32 °C-on, termosztátban inkubáltuk. Ha a fág fertőzése

sikeres volt, másnapra tiszta tarfolt (plakk) vált láthatóvá. Kísérleteinkben ennek meglétét

illetve hiányát elemeztük.

4.4. Fágkötési teszt

A kísérletben éjszakán át növesztett baktériumkultúrát (RM41, GH4178, GH4180) és

megfelelő higítású (103 - 104 db/ml) bakteriofágot (16-3, 16-3 h5, 16-3 h109) használtunk.

A teszt kivitelezése előtt meghatároztuk a fágok titerét [16-3 (3,4x109); 16-3 h5

(1,05x1010); 16-3 h109 (4,2x109)]. Ezen értékek alapján állapítottuk meg a higítás

mértékét.

A reakcióhoz 800 µl TA tápoldatot, 200 µl baktériumot és 50 µl megfelelő fágot

használtunk. A vak (kontroll) oldatba baktérium helyett 200 µl TA oldatot adtunk. Ezután

az Eppendorf-csöveket azonos körülmények között kezeltük: 5 percig

szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd a baktériumokat a hozzájuk tapadt

fágrészecskékkel együtt lecentrifugáltuk (5 perc, 12000 rpm). Ezután a felülúszóból

származó 100 µl fágot 0,2 ml vad típusú baktériummal kevertük össze és fedőagar

jelenlétében TA táptalajt tartalmazó lemezekre szélesztve 32 °C-on növesztettük. E

fágtitrálással meghatározható volt a felülúszóban maradt (baktériumok által nem kötött),

fertőzőképes bakteriofágok száma.

4.5. Bakteriofág DNS izolálás

A szükséges mennyiségű DNS oldatot 20 ml TA táptalajban egész éjszakán át

növesztett bakteriofágból (109-1010 fág/ml) izoláltuk. 1,5 ml kultúrát Eppendorf-csőbe

mértünk és a sejteket centrifugálással ülepítettük. A felülúszót új csőbe átpipettázva 300

µl PEG/NaCl (20% PEG 6000; 2,5M NaCl) oldattal kevertük össze. Ezután a mintákat 15

percig jégen (0 °C) inkubáltuk, majd újra lecentrifugáltuk. Az üledéket 50 µl TE (50mM

Tris; 20mM EDTA; pH 8,0) oldatban szuszpendáltuk és 0,1 térfogat 10 % SDS oldatban

vettük fel. Az elegyet 1 térfogat 7,5 M hűtött ammónium-acetáttal kevertük össze. 15

perces 0 °C-on történő inkubáció után a csapadékot lecentrifugáltuk, majd a felülúszót új

csőbe mérve 0,6 térfogat izopropanollal csaptuk ki a DNS oldatot. A mintákat 15 percig -

20 °C-on inkubáltuk, majd 5 percig centrifugáltuk. Ezután az üledéket 400 µl 70 %-os

MA_DIP04.doc 19

etanollal mostuk, szárítottuk, majd 25 µl (vagy 50 µl) steril desztillált vízben oldottuk fel.

A kísérlet sikerességét restrikciós endonukleázokkal történő DNS emésztés után agaróz

gélelektroforézissel ellenőriztük (4.8. fejezet). Az emésztés során 1 µl bakteriofág DNS

mintát használtunk.

4.6. Plazmid DNS preparálás

A plazmid DNS oldatot 3 ml TA táptalajban éjszakán át növesztett sejtekből alkalikus

lízissel preparáltuk (Ish-Horovicz et al., 1981). 1,5 ml kultúrát Eppendorf-csőbe mértünk

és a sejteket centrifugálással ülepítettük, majd 100 µl TEG oldatban (25 mM TrisHCl; 10

mM EDTA; 50 mM glükóz; pH 8,0) szuszpendáltuk fel. A feltárást óvatos keverés

mellett 200 µl NS oldat (0,2 N NaOH; 1% SDS) hozzáadásával végeztük. A mintákat 5

percig jégen (0 ºC) inkubáltuk, majd 160 µl 0 ºC-os nátrium-acetátot (3M, pH4,8) adtunk

az oldathoz. A keletkezett csapadékot 5 perc 0 ºC-os inkubáció után 5 percig

centrifugáltuk, és a felülúszóban lévő plazmidot 320 µl izopropanollal csaptuk ki. 10 perc

–20 ºC-on történő inkubáció után a mintákat lecentrifugáltuk, 400 µl 70 %-os etanollal

mostuk és szárítottuk. A csapadékot 100 µl Tris-pufferben (50 mM TrisHCL; 100 mM

nátrium-acetát; pH 8,0) oldottuk fel, majd 200 µl 96%-os etanollal ismét kicsaptuk. 10

perc 0 ºC-os inkubáció után a mintákat újból lecentrifugáltuk, mostuk és szárítottuk, majd

kozmidok esetén 30 µl, pBluescript, illetve pBBR plazmidok esetében 50 µl RNáz (50-

100 µg/ml) oldatban vettük fel.

4.7. DNS tisztítás a minták nukleotidsorrendjének meghatározásához

A szekvenálási reakció előtt ─ nagy tisztaságú minták előállításához ─ erre a célra

tervezett tisztítási lépést végeztünk. A preparált DNS mintákhoz 0,1 térfogat 10 %-os

SDS oldatot adtunk, és 5 percig jégen inkubáltuk. Ezután az DNS-SDS elegyhez 1

térfogat (0 ºC-os) 7,5 M ammónium-acetát oldatot tettünk és a mintákat 15 percig jégen

inkubáltuk, majd a keletkezett csapadékot 5 percig centrifugáltuk (12000 rpm). A

felülúszót azonnal átpipettáztuk egy másik Eppendorf-csőbe, és a benne lévő DNS

oldatot 0,6 térfogat izopropanollal csaptuk ki. 20 perc –20 ºC-on történő inkubáció után a

mintákat 400 µl 70 %-os etanollal mostuk, szárítottuk, majd a tisztított DNS oldatot 25-

40 µl steril desztillált vízben oldottuk fel.

MA_DIP04.doc 20

4.8. Agaróz gélelektroforézis és restrikciós endonukleázok alkalmazása

A tisztított plazmid DNS mintából 0,2-0,5 µg-ot, a bakteriofág DNS preparátumból 1-

2 µg-ot használtunk fel restrikciós endonukleázokkal történő emésztésekhez. A mintákat

1-2 U mennyiségű FERMENTAS enzim, megfelelő enzimpuffer és steril desztillált víz

jelenlétében 1-2 óráig 37 ºC-on inkubáltuk. Az emésztés végén a reakcióelegybe 1/5 rész

mintafelviteli puffert (10 % ficoll; 0,25 M EDTA; pH 8,0; 0,2 % brómfenolkék) mértünk.

(Maniatis et al., 1982)

A restrikciós endonukleázokkal hasított minták fragmentjeit agaróz gélen választottuk

el. A gél készítéséhez az agarózt 0,5xTBE pufferben (5,4 g TRIS; 2,75 g bórsav; 2 ml 0,5

M EDTA/1000 ml; pH 8,0) oldottuk fel, majd 100 µg/ml koncentrációjú etídium-

bromidot mértünk bele, így a gél végkoncentrációja etídium-bromidra nézve 0,1 µg/ml

lett. Munkánk során többnyire 1%-os gélt készítettünk. A gél dermedése (40-60 perc)

után a fragmenteket 0,5xTBE pufferben 60-120 V-on, fragmentizolálás esetén 20-40 V-

on szeparáltuk. Az elektroforézis során molekulatömeg-standardként PstI enzimmel

hasított lambda fág DNS mintát alkalmaztunk. A kiértékelést UV fény segítségével

végeztük és az eredményeket dokumentáltuk.

4.9. Fragmentizolálás

A megfelelő restrikciós endonukleázokkal hasított fragmenteket elektroforézissel

választottuk szét. Az izolálni kívánt fragment elé a gélbe Whatman DE 81 papírt tettünk.

20 perces 60 V feszültség mellett történő futtatás után az izolálandó fragment a papírra

került, amelyről 2x50 µl 1M NaCl oldattal távolítottuk el. A DNS-t ezután 0,1 térfogat

3M nátrium-acetát oldat (pH 7,0) és 0,6 térfogat izopropanol hozzáadásával csaptuk ki.

20 perces (vagy éjszakán át) –20 ºC-on történő inkubáció után a mintát lecentrifugáltuk,

400 µl 70 %-os etanolban mostuk, szárítottuk és a keletkezett csapadékot 20 µl steril

desztillált vízben oldottuk fel.

4.10. Ligálási reakció

A ligálási elegyet vektor DNS oldat, fragment DNS oldat, 5x ligáz puffer (500 mM

Tris HCl; 100 mM MgCl2; 10 mM ATP; pH 7,6), steril desztillált víz és T4 ligáz enzim

MA_DIP04.doc 21

felhasználásával állítottuk össze 15 µl végtérfogatra. A vektor és a fragment mennyiségét

az ellenőrző emésztés eredményétől függően állapítottuk meg. A reakcióban a ligálandó

végek minősége alapján kétféle T4 DNS ligáz enzimet használtunk: tompa végek

esetében tömény, ragadós végek esetében higított ligázt alkalmaztunk. A ligálási elegyet

ezután legalább 1 óráig szobahőmérsékleten inkubáltuk.

4.11. Kompetens sejtek készítése

A kompetens sejtek készítéséhez E. coli XL1-blue törzset használtunk. 200 ml SOB

táptalajban (2 % Bacto trypton; 0,5 % Yeast extract; 10 mM NaCl; 2,5 mM KCl; pH 7,0)

22 °C-on történő erős rázatás mellett, 24 óráig növesztett baktériumkultúrát (OD= 0,5-

0,6) 10 percre jégre tettünk, ezután mindig 0 ºC-on dolgoztunk. A sejteket 10 perces

centrifugálással (4000 rpm) gyűjtöttük össze, majd 80 ml hideg TB pufferben (10 mM

PIPES; 15 mM CaCl2; 250 mM KCl; pH 6,7) szuszpendáltuk fel. A következő lépésben a

mintát újra 10 percig jégen inkubáltuk, lecentrifugáltuk, majd 20 ml 0 °C-os TB

pufferben vettük fel. A szuszpenzióhoz 1,5 ml DMSO-t adtunk, a sejteket Eppendorf-

csövekbe szétosztva transzformációig –80 °C-on tároltuk. (Inoue et al.,1990)

4.12. Transzformáció

Egy transzformáláshoz 100 µl kompetens sejtet használtunk fel. A sejteket –80 °C-ról

jégre tettük, és 15 perc elteltével hozzáadtuk a transzformációhoz használt vektorba ligált

DNS fragmentet, amelyet ezután 30 percig jégen inkubáltunk, majd 3 percig 37 °C-os

hősokkot alkalmaztunk. A hősokk után 400 µl SOC oldatot (2 % Bacto trypton; 0,5%

Yeast extract; 10 mM NaCl; 2,5 mM KCl; 20 mM glükóz; pH 7,0) adtunk a sejtekhez.

Egy óra 37 °C-on történő inkubáció után a sejteket szelektív LB táptalajra szélesztve

másnapig 37 °C-on inkubáltuk. A táptalaj 100 µl megfelelő antibiotikumot, 40 µl IPTG

(100 mM) és 40 µl X-gal (2%, DMSO) oldatot tartalmazott. A másnapra felnövő telepek

közül kék-fehér screen segítségével választottuk ki az inszertet tartalmazókat (fehér),

vagyis amelyeknél nem figyelhető meg β–galaktozidáz (lacZ gén) aktivitás. A

kiválasztott telepekkel további kísérleteket végeztünk.

MA_DIP04.doc 22

4.13. Polimeráz láncreakció (PCR)

A reakcióelegy 25 µl végtérfogatába: 1 µl higított (100x) templát DNS oldatot, 1-1

µl oligonukleotid primert [h31 (62,2 nmol); h51 (31,3 nmol); h32 (61,4 nmol); h52 (48,7

nmol)], 6 µl PCR-mixet (4x Taq puffer; 0,8 mM dNTP; 6 mM MgCl2), 15 µl steril

desztillált vizet, 1 µl (2-5 U) Taq polimeráz enzimet mértünk.

A reakció során előre megtervezett programot használtuk. A program leírása a 3.

táblázatban olvasható.

3. táblázat: A kísérlet során alkalmazott PCR program.

1. 94°C 2 perc 2. 94°C 30 mp 3. 65°C 30 mp 4. 72°C 1 perc 5. 35x GO TO 2 6. 25°C 1 perc 7. END

A PCR reakcióban felsokszorozni kívánt szekvenciához oligonukleotid primereket

terveztünk. A primereket és azok nukleotidsorrendjét az 4. táblázat tartalmazza.

4. táblázat: Alkalmazott primerek és szekvenciáik.

primerek szekvenciáik

h31 gcgggctgcaaaatccaga h51 caactgccgcggagatgg h32 ccgccagaaacgacttcc h52 gccattgcccgatgagg

Az oligonukleotid primerek reakcióban elfoglalt helyzetét a 5. ábra mutatja.

MA_DIP04.doc 23

4.14. DNS szekvencia meghatározás

A munkánk során tisztított plazmid DNS minták és PCR fragmentumok nukleotid-

szekvenciáját a megfelelő oligonukleotidok segítségével a MTA Szegedi Biológiai

Központ DNS Szekvenáló Laboratóriumában határozták meg. A szekvenálást Sanger-féle

láncterminációs módszer alapján működő reakcióval készítették elő és ABI PRISM

automata szekvenáló berendezéssel végezték.

4.15. Számítógépes szekvencia analízis

A meghatározott DNS részszekvenciákat számítógép segítségével összeillesztettük és

megvizsgáltuk mind a hat leolvasási keretben a kódoló kapacitásukat (LaserGene

programcsomag, DNA Star Inc., USA).

MA_DIP04.doc 24

5. KÍSÉRLETI EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK 5.1. Egy host-range mutáció jellemzése

Munkám kezdetekor folytak a vad típusú 16-3 fág h génjének DNS-szekvencia

meghatározására vonatkozó kísérletek. Emellett fontosnak tűnt a 16-3 fág farki rost

fehérjéjét kódoló génben hibás, mutáns allélek (h5, h15 allél) pontos szerkezetének

felderítése is.

A fágrezisztens receptor-mutáns baktériumon (GH4046) a rezisztencia-tesztben

vizsgált vad típusú populáció (kb. 5x109) egy töredéke „visszanyerte” fertőzőképességét.

Ez esetben a fágpopulációban feltételezéseink szerint olyan spontán mutációk jöhetnek

létre a baktériumfelszínt felismerő H farki rost fehérjét kódoló génben, amelyek révén a

fág „adaptálódik” a baktérium megváltozott, RkpM4046 receptorfehérjéjéhez.

A baktérium részéről jelen kell lennie valamilyen sejtfelszíni struktúrának,

amelyhez a bakteriofág kötődni képes. Az is bizonyos, hogy ezeknél a mutánsoknál

(GH4046, GH4178) a fágreceptor valamelyest különbözik a vad típusú

baktériumtörzsétől (RM41), hiszen a vad típusú fág nem képes azt felismerni.

Megvizsgáltuk az izolált fágplakkok morfológiáját, majd az azonos fenotípusú és

nagy számú plakkot adó fágokat választottuk ki kísérleteink folytatására.

Az ilyen módon izolált fágokat tisztítottuk és a bennük található feltételezett h allélt

h5 és h15 allélnek neveztük el, majd mindkét törzsből DNS preparátumot készítettünk.

Ezután azt vizsgáltuk, hogy a h génen belül megtalálhatók-e az újonnan izolált host-

range mutációk, illetve mi azoknak a pontos helyzete. Ennek érdekében PCR reakció

során felsokszoroztuk a h régiót két erre a célra tervezett oligonukleotid primer

segítségével (5. ábra). A tisztított PCR fragmentek nukleotid-szekvenciáját ezekkel és két

további primert használva határoztuk meg (5. ábra). Az oligonukleotid primerek

szekvenciája a 4.13. fejezetben található.

MA_DIP04.doc 25

5. ábra: A 16-3 fág h5 és h15 alléljében található mutáció helyzetének meghatározása. Az ábra felső része a 16-3 fág illetve a h régió fizikai térképét mutatja, összefoglalva a h régió elemzése során nyert következtetéseket (Dorgai et al., 1983). Az alsó részen a PCR kísérlethez használt primerek elhelyezkedését és a mutáns allélekben talált változás természetét foglaltuk össze.

A kapott szekvencia (6. ábra) elemzésekor „csak” egyféle host-range mutációt, egy

változást találtunk az általunk H fehérjét kódoló régiónak tartott szakaszon. Természetét

tekintve ez egy missense mutáció, ami olyan aminosavcserét jelent, amely a H fehérje

hosszát nem, de a fág baktériumhoz történő kötődését megváltoztatja. Esetünkben ez a

következőképpen alakult. A vad típusú bakteriofág h génjében ΄ggc΄, azaz glicint kódoló

triplet található, míg a mutáns fág h génjének ugyanezen helyén ΄gac΄ bázishármast

azonosítottunk, ami már nem glicint, hanem aszparaginsavat kódol.

MA_DIP04.doc 26

vad típusú bakteriofág

h5 mutáns allélt hordozó bakteriofág

h15 mutáns allélt hordozó bakteriofág

h109 mutáns allélt hordozó bakteriofág

h111 mutáns allélt hordozó bakteriofág

h114 mutáns allélt hordozó bakteriofág

6. ábra: A vad típusú bakteriofág, illetve a h5, h15, h109, h111 és h114 mutáns allélt hordozó fágok h génjének szekvenciarészlete (1650-2100 bp). A zöld téglalapok jelölik az egyes fágok szekvenciájában található eltérő bázishármas pozícióját.

MA_DIP04.doc 27

Ez az eredmény több dolgot is jelentett számunkra:

egyrészt alátámasztotta, hogy ez a feltételezett gén valóban a H farki rost

fehérjét kódoló ORF, és ez a fehérje a host-range jelenség kialakulását

befolyásolja. Azt vártuk, hogy a h génben és az általa expresszált fehérjében

olyan változás alakuljon ki, amivel a fág alkalmazkodni tud a baktérium szintén

mutáció által megváltozott fágfelismerő felszínéhez és ezt meg is találtuk. (A

baktériummutánsok izolálása, illetve azok vizsgálata Deák Veronika és

Pálvölgyi Adrienn diplomadolgozatában olvasható.)

a másik fontos megállapítás a mutáció és az aminosavcsere helye, amit

kísérleteink alapján a gén által kódolt H fehérje C-terminális részén

lokalizáltunk. Ebből azt a következtetést vonhatjuk le, hogy ez a C-terminális

rész funkcionálisan fontos szerepet tölt be a fág baktériumfelszínhez történő

tapadásában.

5.2. Újabb host-range fágmutánsok azonosítása

A fág baktériumfelszínt felismerő fehérjéje és a baktérium fágreceptora között

létrejövő kölcsönhatás pontosabb megismerése érdekében a már elmondott elvek alapján

(5.1. fejezet) újabb receptor-mutáns baktériumokat és host-range fágmutánsokat

izoláltunk. A kísérlet eredményét a 5. táblázat mutatja be.

5. táblázat: A host-range fágmutánsok megjelenése a különböző baktériumtörzseken. A fertőzésnél minden esetben ugyanazt a fágpopulációt alkalmaztuk.

Baktériumtörzs 16-3 fágpopulációval (5x109) való fertőzés után, egy lemezen lévő plakkok száma

RM41 5x109 plakk

GH4046 50 plakk

GH4178 50 plakk

GH4180 200 plakk

MA_DIP04.doc 28

Az 5. táblázat adatai alapján azt a következtetést vonhatjuk le, hogy valószínűleg

két eltérő fenotípusú fágot tartalmazott a vizsgált lizátum (a vad típusú fág nagy

többsége mellett). Az egyik a GH4046, illetve a GH4178 törzsön 50 plakk által képviselt

fág. Ezen felül (vagy kívül) a GH4180 baktériumot egy további, a kísérletben 150 (200)

plakkot adó fágmutáns is képes volt fertőzni. Azonban a GH4180 törzsön szaporodó

fágok 75%-a (150) nem képes a másik két baktériumtörzshöz (GH4046, GH4178)

kapcsolódni. Ezért mondhatjuk, hogy két különböző mutáns fágot sikerült kimutatnunk.

A mutánsok közül hármat kiválasztottunk és h109, h111, h114 jelzéssel láttuk el őket.

E fágok további jellemzését a 6. táblázat mutatja. A táblázatban összehasonlításképpen

feltüntettük az elsődlegesen izolált mutáns fágok fertőzőképességét is.

6. táblázat: A különböző host-range fág, receptor-mutáns és vad típusú baktérium gazdaspecifitása. A (-) jel a fágra való rezisztenciát, a (+) az érzékenységet jelenti.

Host-range bakteriofág-mutánsok

h109 h111 h114 h5 h15

GH4046 - - + + +

GH4178 - - + + + Receptor-

mutáns baktériumok

GH4180 + + + + +

RM41 + + + + +

A kapott eredményeket elemezve elmondható, hogy abban az esetben, ha a h114-es

fágtörzzsel fertőztük az rkpM4046 allélt tartalmazó baktériumot (GH4046), pozitív

eredményt kaptunk, vagyis a h114-es törzs mindkét baktériummutánson ugyanúgy képes

szaporodni, ahogy azt a h5 és h15 allélt tartalmazó fágok esetében is megállapítottuk. Ez

azt jelentheti, hogy e három bakteriofágban (h5, h15, h114) a mutáció ugyanabban a

régióban helyezkedhet el. (Az erre vonatkozó kísérletek és eredmények az 5.3.

fejezetben találhatók.) A táblázat adatai alapján a h109, h111 allélt hordozó fágok az

eredeti mutáns baktériumot (GH4046) nem, de az újonnan izolált mutánst (GH4180)

képesek fertőzni. Tehát feltételezhető, hogy a h109, h111-es törzsekben a mutáció

legalábbis más aminosavcserét eredményez a h génen belül, vagy más gént érint.

MA_DIP04.doc 29

5.3. A fág baktériumfelszín felismerésében más fágfehérje is szerepet játszhat

Az 5.2. fejezetben olvasható feltevések bizonyítása érdekében meghatároztuk az

újonnan izolált bakteriofágok (h109, h111, h114) h régiójának nukleotid-szekvenciáját is,

hasonlóan mint a h5 és h15 allél esetében (5.1. fejezet). Azt az eredményt kaptuk, hogy a

h114 mutáns allélben pontosan ugyanott és ugyanolyan mutáció található, mint az

előzőleg izolált mutánsoknál (h5, h15 – 5. ábra), viszont a h109 és h111 alléleket hordozó

fágok h régiójának egész területén nem találtunk változást (6. ábra). Tehát a mutáció egy

másik gén területére esik, ami azt feltételezi, hogy a fág ─ baktérium kölcsönhatásban a

fág több fehérjéje is részt vesz. Ezt a feltételezést alátámasztják a fág kezdeti

vizsgálatakor kapott eredmények, miszerint a h génben talált mutáción kívül egy Ant─

mutáció is izolálható és térképezhető volt, amely a fág poliklonális ellenanyagokkal való

reakcióját lényegesen gyengítette. Ezek ismeretében elképzelhető, hogy az általunk

izolált 16-3 h109 és h111 az ant gén mutáns allélje. Ennek megállapítására vonatkozó

kísérleteket a h109 allélt tartalmazó törzs esetében terveztünk.

Eredményeink nagyon hasonlítanak az E. coli ─ lambda fág rendszerben

tapasztaltakhoz. Mint ismeretes a lambda fág farki rost fehérjéjét (J) a j gén kódolja. E

gén 3’ végén szintén missense mutációt azonosítottak. A mutációt hordozó fágok csak a

receptor-mutáns baktériumokat képesek fertőzni. E baktériumokban a fág-baktérium

kapcsolat kialakításáért a malB gén által kódolt fehérje (MalB) felelős. A malB génben

szintén egy missense mutációt detektáltak a C-terminális részen. Tehát mind a fág, mind

a baktérium részéről a fehérjék C-terminális része fontos szerepet játszik a felismerés

folyamatában (Wang et al., 1998) (Werts et al., 1994).

A 16-3 fág ─ S. meliloti kapcsolatban szintén a fehérje C-terminális része alakít ki

kapcsolatot a fág és a baktérium között. Azonban a lambda fág esetében mindkét

oldalról egy-egy fehérje, míg a 16-3 fág – S. meliloti rendszerben legalább két fehérje

vesz részt a tapadásban.

5.4. A h mutáns fágok baktériumhoz történő kötődésének vizsgálata

A receptor-mutáns baktériumon újonnan izolált fágmutánsok (16-3 h109)

kötődésének megismerése céljából tervezett fágkötési tesztben a felnövesztett spontán

mutáns baktériumokat ismert titerű 16-3 fág szuszpenzióval inkubáltuk, majd a sejtek

lecentrifugálása után a felülúszót vad típusú KPS-t termelő (RM41) törzsön titráltuk

MA_DIP04.doc 30

(4.4. fejezet). A tesztben a kontroll oldatokban nem található baktérium, így a belőlük

nyert felülúszóból a fágok teljes mennyisége számolható. A baktériumokat is tartalmazó

elegyben pedig a fágok egy része hozzá tud tapadni a baktériumok sejtfelszíni

receptorához a fág kötődésének mértékétől függően. Így a felülúszóban csak azok a

fágok találhatók, amelyek nem képesek a baktérium fágreceptorához kapcsolódni. A fág

titerének nagymértékű csökkenése azt jelzi, hogy a vizsgált baktérium megkötötte a

fágot. Ellenkező esetben (ha a fág képtelen a baktériumhoz kötődni), a titer nem változik

jelentősen.

7. táblázat: Az izolált bakteriofágok kötődésének vizsgálata mutáns allélt tartalmazó (GH4046, GH4178, PP2511) és nem hordozó baktériumokon (RM41). A kontroll oldatok baktériumot nem tartalmaztak.

Bakteriofágok

Baktériumok 16-3 16-3 h5 16-3 h109

kontroll 255 395 469 RM41

RM41 0 0 2

16-3 16-3 h5 16-3 h109

kontroll 477 770 14 GH4046

GH4046 361 106 8

16-3 16-3 h5 16-3 h109

kontroll 252 406 556 GH4178

GH4178 35 17 46

16-3 16-3 h5 16-3 h109

kontroll 342 411 586 GH4180

GH4180 22 5 17

16-3 16-3 h5 16-3 h109

kontroll 467 644 561 PP2511

PP2511 311 553 497

MA_DIP04.doc 31

A 7. táblázat adatai alapján elmondható, hogy a vad típusú baktériumot (RM41)

mindhárom fág körülbelül ugyanolyan mértékben (100%) képes fertőzni. A baktérium

fágreceptorában nem történt változás, így a fágok felismerik azt és kromoszómájukat a

baktérium genomjába tudják juttatni (profág).

Különös eredményt kaptunk a fágok kötődését a GH4046 és a GH4178

baktériumon összehasonlítva. A GH4178 egy újonnan izolált mutáns, amely SDS-

poliakrilamid gélelektroforézissel vizsgálva ugyanolyan KPS-t termel, mint a GH4046 (7.

ábra). Az rkpM gén ugyanazon mutáns allélját hordozza, mint a GH4046 baktériumtörzs.

Mégis a tesztben a fágok GH4046 és GH4178 baktériumokhoz kötődésében szignifikáns

eltérés mutatkozott. Az eltérés oka feltételezéseink szerint a GH4178 baktérium

kromoszómáján más régióban bekövetkezett mutáció lehet, amely erősebb kötődés

létrejöttét engedélyezi. Ezt a hipotézist a GH4178 baktériummutánson végzett további

kísérletekkel szeretnénk alátámasztani.

7. ábra: A mutáns baktériumok sejtfelszínén található kapszuláris poliszacharidok.

Az ábrán Dr. Kerepesi Ildikó által készített SDS-poliakrilamid gél látható. Az ábra felső részén a KPS nagy molekulasúlyú, alsó részén a kis molekulasúlyú alkotója látható. A gélek felett a megfelelő mutáns törzsek számát tüntettük fel, amelyekből a KPS preparátum készült.

A GH4178 baktériummal egyidőben izolált mutáns törzsön (GH4180) mindhárom

fág erősebb kötődése észlelhető, mint a GH4046 vagy a GH4178 esetében, ami arra

vezethető vissza, hogy az újonnan izolált baktérium ─ eddigi mutánsokétól eltérő ─

MA_DIP04.doc 32

sejtfelszíni struktúrájában feltételezhetően olyan változás következett be, amely lehetővé

tette a fágok tapadását (7. ábra).

A két bakteriofágot (16-3 és 16-3 h5) összehasonlítva megállapítható, hogy a h5

mutáns allélt hordozó fág erősebb kötődést (85%) mutat az elsődlegesen izolált

baktériumhoz (GH4046), mint a vad típusú fág (25%). A GH4046 rkpM régiójában

létrejött mutáció által megváltozott sejtfelszíni struktúrához a vad típusú fág már nem

képes hozzátapadni, míg a h5 allélt hordozó fágról elmondható, hogy a genomjában

bekövetkezett mutáció révén újra felismeri a megváltozott KPS-t.

A fágok újonnan izolált mutáns baktériumokhoz (GH4178, GH4180) történő

kötődését vizsgálva ugyanez elmondható, bár az eltérés nem ennyire szignifikáns.

A h109 allélt hordozó mutáns fág tapadásáról azt állapíthatjuk meg, hogy a vad

típusú baktériumhoz erős a kötődése (szinte 100%), mivel a kísérletben kevés plakkot

képezett (2/469). A fág rkpM4046 allélt tartalmazó baktériumtörzshöz (GH4046) történő

kapcsolódása a vad típusú baktériumhoz képest gyengébb lett, ami azt mutatja, hogy a

fág a baktérium megváltozott sejtfelszíni struktúrájához nagy mértékben már nem képes

kapcsolódni. (A 16-3 h109 fág plakkjainak száma GH4046 baktériumon titrálva jelentősen

lecsökkent, ami a kísérleti körülmények megváltozásának is betudható.) A 16-3 h109 fágot

az újonnan izolált mutáns baktériumon (GH4180) titrálva elmondható, hogy az a

genomjában történt változások által „visszanyerte” fertőzőképességét, így kötődése

erősebb (97%) lett, a kísérletben kevesebb plakkot képezett (17/586).

Kontrollként egy Tn5 transzpozont tartalmazó baktériumot is felhasználtunk a

fágok vizsgálatához (PP2511). Ez a transzpozon a baktérium genomjában olyan

helyzetben van (rkp régióban), hogy jelenlétével megakadályozza a fágfelismerő

sejtfelszíni fehérjét kódoló gén expresszióját. Így a baktérium felszínén nem található

meg az a struktúra, amelyhez a fág farki rost fehérjéje hozzákapcsolódhatna. Tehát a fág

a tesztben körülbelül ugyanakkora mennyiségben képezett plakkokat a baktérium

jelenlétében, mint annak hiányában.

MA_DIP04.doc 33

6. ÖSSZEFOGLALÁS

Munkánk kezdetén a lucernával szimbiótikus nitrogénkötésre képes S. meliloti 41

baktériumot és a rajta szaporodó 16-3 bakteriofágot választottuk kísérleti

rendszerünkként.

Előzetes eredmények alapján ismert volt a vad típusú 16-3 fág h génjének

szekvenciája.

Orosz László laborjában meghatározták a 16-3 fág h génjét érintő host-range

mutáció körülbelüli helyzetét. A mutáció típusát, illetve azt, hogy milyen mértékben

módosítja ez a változás a fág baktérium-felszín felismerési mechanizmusát, még nem

vizsgálták. Így munkánk célja az volt, hogy jellemezzük a h génben bekövetkezett

mutációt.

Egyes fágrezisztens receptor-mutáns baktériumokon (amelyek nem termelnek

kapszuláris poliszacharidot) izolálhatók fertőzőképességüket visszanyert host-range

fágmutánsok. A felismerés specifitását módosítja a fág egy (esetleg több) génjében

bekövetkezett változás (host-range mutáció). Ezek segítségével azonosíthatók azok a

gének (fehérjék), amelyek a baktériumfelszín felismerésében szerepet játszanak.

A mutáns h gén (h5) pontos nukleotid-szekvenciájának meghatározása révén azt

figyelhettük meg, hogy a h5 allélt hordozó mutáns fág farki rost fehérjéjének C-terminális

részén egy aminosav eltérés található a vad típusú fehérjéhez képest. Tehát a mutáns gén

analízise megerősítette, hogy a régióban talált ORF kódolja a H fehérjét, és megmutatta,

hogy a baktériumfelszín felismerésében részt vesz annak C-terminális része.

Újabb eredményeink azt mutatják, hogy izolálhatók mind a baktérium (GH4180),

mind a fág oldaláról (16-3 h109 ) más fenotípusú és eltérően viselkedő mutánsok. Ezek

vizsgálata még nem fejeződött be. Kísérleteink alapján azt állapíthatjuk meg, hogy a h109

allélt hordozó fág esetében a változás máshol helyezkedik el, mint az eredeti

mutánsokban (16-3 h5, h15). Feltételezéseink szerint a mutáció egy másik gént érint. E

hipotézis bizonyításához további kísérleteket terveztünk.

MA_DIP04.doc 34

7. FÜGGELÉK

1. tábla: A 16-3 bakteriofág kromoszómáján található legfontosabb restrikciós hasítóhelyek. A restrikciós endonukleázokat számozás jelöli (1-100). A táblázatban

a hasítóhelyek pontos pozícióját is feltüntettük (bp). (Dorgai et al., 1983)

MA_DIP04.doc 35

8. FELHASZNÁLT IRODALOM Allen, O.N. and Allen, E.K. (1981) The Leguminosae: A source book of characteristics,

uses, and nodulation . The University of Wisconsin Press, Madison Csiszovszki, Z., Buzas, Z., Semsey, S., Ponyi, T., Papp, P. and Orosz, L. (2003) ImmX

immunity region of Rhizobium phage 16-3: Two overlapping cistrons of repressor function. J Bacteriol 185: 4382-4392.

Dallmann, G., Orosz, L., and Sain, B. (1979) Restriction mapping of DNA of temperate

Rhizobium meliloti phage 16-3 : Comparision of genetic and physical maps indicates a long genetically silent chromosomal arm. Mol Gen Genet 176: 439-448.

Dallmann, G., Marincs, F., Papp, P., Gaszner, M. and Orosz, L. (1991) The isolated N-

terminal DNA binding domain of the c repressor of bacteriophage 16-3 is functional in DNA binding in vivo and in vitro. Mol Gen Genet 227: 106-112

Dorgai, L., Olasz, F., Berenyi, M., Dallmann, G., Pay, A. and Orosz, L. (1981)

Orientation of the genetic and physical map of Rhizobium meliloti temperate phage 16-3. Mol Gen Genet 182: 321-325.

Dorgai, L., Polner, G., Jonas, E., Garamszegi, N., Ascher, Z., Pay, A., Dallmann, G. and

Orosz, L. (1983) The detailed physical map of the temperate phage 16-3 of Rhizobium meliloti 41. Mol Gen Genet 191: 430-433

Dorgai, L., Olasz, F. and Nemet, K. (1986) Lysogenic control of temperate phage 16-3 of

Rhizobium meliloti is governed by two distinct regions. Mol Gen Genet 205: 568-571. Dorgai, I., Papp, I., Papp, P., Kalman, M. and Orosz, L. (1993) Nucleotide sequences of

the sites involved in the integration of phage 16-3 of Rhizobium meliloti 41. Nucl Acids Res 21: 1671.

Dudley, M.E., T.W. Jacobs and S.R. Long (1987) Microscopic studies of cell divisions induced in alfalfa roots by Rhizobium meliloti. Planta 171: 289-301. Erdei, S., Dudas, B., Orosz, L. and Duda, E. (1982) Identification of structural proteins of

Rhizobium meliloti temperate phage 16-3. J Gen Virol 62: 145-152. Honeycutt, R.J., M.McClelland and B.W.S. Sobral (1993) Physical map of Rhizobium

meliloti 1021. J Bacteriol 175: 6945-6952. Inoue, H., Nojima, H. and Okayama, H. (1990) High efficiency transformation of

Escherichia coli with plasmids. Gene 96: 23-28. Ish-Horovicz, D. and Burke, J.F. (1981) Rapid and efficient cosmid cloning. Nucl Acids

Res 9: 2989-2998 .

MA_DIP04.doc 36

Kannenberg, E.L. and N.J. Brewin (1994) Host-plant invasion by Rhizobium meliloti:The

role of cell surface components Trend Microbiol 2: 277-283. Kereszt, A., Kiss, E., Reuhs, B., Carlson, R.W., Kondorosi, A. and Putnoky, P. (1998)

Novel rkp gene clusters of Sinorhizobium meliloti involved in capsular polysaccharide production and the invasion of the symbiotic nodule: rkpK gene encodes for a UDP-glucose dehydrogenase. J Bacteriol 180: 5426-5431.

Kiss, E., Kereszt, A., Barta, F., Stephens, S., Reuhs, B., L., Kondorosi, A. and Putnoky,

P. (2001) The rkp-3 gene region of Sinorhizobium meliloti Rm41 contains strain-specific genes that determine K antigen structure. Molecular Plant-Microbe Interactions 14: 1395-1403.

Maniatis, T., Fritsch, E.F. and Sambrook, J. (1982) Molecular cloning. A laboratory

manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Meade, H.M. and Signer, E.R. (1977) Genetic mapping of Rhizobium meliloti. Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 74: 2076-2078. Orosz, L. and Sik, T. (1973) Genetic mapping of rhizobiophage 16-3 Acta Microbiol.

Acad. Sci. Hung. 17: 185-194 Orosz, L., Svab, Z., Kondorosi, A. and Sik, T. (1973) Genetic studies on Rhizobio- phage

16-3: Genes and functions on the chromosome. Mol Gen Genet 125: 341- 350. Papp, I., Dorgai, L., Papp, P., Jonas, E., Olasz, F. and Orosz, L. (1993) The bacterial

attachment site of the temperate Rhizobium phage 16-3 overlaps the 3' end of a putative proline tRNA gene. Mol Gen Genet 240: 258-264.

Petrovics, G., Putnoky, P., Reuhs, B., Kim, J., Thorp, T.A., Noel, K.D., Carlson, R.W.

and Kondorosi, A. (1993) The presence of a novel type of surface polysaccharide in Rhizobium meliloti requires a new fatty acid synthase-like gene cluster involved in symbiotic nodule development. Mol Microbiol 8: 1083-1094.

Putnoky, P., Petrovics, G., Kereszt, A., Grosskopf, E., Ha, D.T.C., Banfalvi, Z. and

Kondorosi, A. (1990) Rhizobium meliloti lipopolysaccharide and exopolysaccharide can have the same function in the plant-bacterium interaction. J Bacteriol 172: 5450-5458.

Putnoky, P., Deak, V., Bekasi, K., Palvolgyi, A., Maasz, A., Palagyi, Z., Hoffmann, G.

and Kerepesi, I. (2004) H protein of bacteriophage 16-3 and RkpM protein of Sinorhizobium meliloti 41 are involved in phage adsorbtion. J Bacteriol 186: 1591-1597.

Reuhs, B.L., R.W. Carlson and J.S. Kim (1993) Rhizobium fredii and Rhizobium meliloti

produce 3-deoxy-D-manno-2-octulosonic-acid-containing polysaccharides that are structurally analogous to group II K antigenes (capsular polysaccharides) found in Escherichia coli. J Bacteriol 175: 3570-3580.

MA_DIP04.doc 37

Reuhs, B.L. (1997) Acidic capsular polysaccharides (K antigens) of Rhizobium. In Biology of Plant-Microbe Interactions. Stacey, G., Mullin, B., Gresshoff, P.M. (eds). St. Paul: International Society for Molecular Plant-Microbe Interactions, pp. 331-336.

Semsey, S., Papp, I., Buzas, Z., Patthy, A., Orosz, L. and Papp, P. (1999) Identification of

site-specific recombination genes int and xis of the Rhizobium temperate phage 16-3. J Bacteriol 181: 4185-4192.

Semsey, S., Blaha, B., Koles, K., Orosz, L. and Papp, P. (2002) Site-specific integrative

elements of Rhizobiophage 16-3 can integrate into prolin tRNA (CGG) genes in different bacterial genera. J Bacteriol 184: 177-182.

Svab, Z., Kondorosi, A. and Orosz, L. (1978) Specialized transduction of a cysteine

marker by Rhizobium meliloti phage 16-3. J Gen Microbiol 106: 321-327 . Szende, K. and Ordogh, F. (1960) Die Lysogenie von Rhizobium meliloti.

Naturwissenschaften 47: 404-412 Wang, J., Michel, V., Hofnung, M. and Charbit, A. (1998) Cloning of the j gene of

bacteriophage lambda, expression and solubilization of the J protein: first in vitro studies on the interactions between J and LamB, its cell surface receptor. Res Microbiol 149: 611-624.

Werts, C., Michel, M., Hofnung and Charbit, A. (1994) Adsorption of bacteriophage

lambda on the LamB protein of E. coli K12: point mutations in gene j of lambda responsible for extended host-range. J Bacteriol 176: 941-947.

MA_DIP04.doc 38

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

A diplomadolgozatom alapjául szolgáló kísérleteket a Pécsi Tudományegyetem

Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszékén végeztem.

Köszönettel tartozom témavezetőmnek, Dr. Putnoky Péternek munkám

irányításáért, bizalmáért, a felmerülő problémák megoldásában nyújtott segítségéért és

bírálataiért.

Köszönetet szeretnék mondani a tanszéken dolgozó oktatóknak: Dr. Hoffmann

Gyulának, Siposné Dr. Kerepesi Ildikónak, akik tanácsaikkal, észrevételeikkel és

tapasztalataikkal hozzásegítettek dolgozatom megírásához.

Hálás vagyok laboránsainknak: Miklósvári Zoltánné, Maricának és Keidl

Zoltánné, Juditnak, hogy kísérleteim kivitelezéséhez megfelelő légkört és technikai

hátteret biztosítottak.

MA_DIP04.doc 39