87-166-1-SM

IDENTIFIKASI DAN FILOGENETIKA BAKTERI Aeromonas spp. ISOLAT AIR KOLAM BEBERAPA

KOTA BERDASARKAN PADA SIKUEN GEN 16S rRNA

IDENTIFICATIONAND PHYLOGENETIC OF Aeromonasspp. WATER POND ISOLATES FROM SOMECITIESBASEDON16SrRNAGENESEQUENCE

Visi Tinta Manik, Topik Hidayat1, Diah KusumawatyProgram Studi Biologi Jurusan Pendidikan Biologi FPMIPA UPI

ABSTRAK

Air dapat menjadi perantara bagi bakteri patogen untuk menginfeksi penyakit, salah satunya adalah bakteri Aeromonas. Bakteri ini merupakan patogen baik pada manusia atau hewan khususnya ikan. Hubungan kekerabatan antara bakteri Aeromonas perlu diketahui untuk mengetahui keanekaragaman dan penyebaran strain di perairan, sehingga dapat digunakan untuk uji kualitas air secara tepat dan cepat. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui karakteristik, dan hubungan filogenetika dari bakteri Aeromonas spp. Dari 44 isolat yang diperoleh dilakukan uji morfologi (pewarnaan Gram), uji biokimia yang meliputi uji RS+Novobiocin, motilitas, oksidasi, OF, indol, VP, sitrat, fermentasi laktosa, deteksi hemolisis, dan deteksi gen lipase. Kemudian 8 isolat terpilih dan dua isolat kontrol disikuensing berdasarkan pada gen 16S rRNA. Pohon filogenetika didapatkan dengan menggunakan Clustal X dan MEGA 5. Hasil yang diperoleh dari pohon filogenetika, bakteri Aeromonas spp. dapat digolongkan menjadi 3 grup yaitu grup pertama terdiri dari lima isolat yang berkelompok sendiri, grup kedua terdiri dari dua isolat yang berdekatan dengan Aeromonas veronii dan kelompok terakhir terdiri dari satu isolat serta dua isolat kontrol berdekatan dengan grup Aeromonas hydrophila. Dari delapan isolat yang ditemukan, Aeromonas spp. merupakan bakteri Gram negative berbentuk basil pendek, bersifat motil, positif uji oksidase, dan OF.

Kata kunci : Aeromonas spp., filogenetika, gen 16S rRNA

ABSTRACT

Water can be an intermediary factor for pathogenic bacteria to infect the disease, one of which is Aeromonas. This bacterium is pathogenic to either humans or animals especially fish. Phylogenetic relationship between Aeromonas spp. need to describe to know the diversity and distribution of strains in water, so it can be used to test water quality accurately and quickly. This study aimed to determine the characteristics, and phylogenetic relationships of Aeromonasspp. Morphology test (Gram staining); biochemical tests include RS+Novobiocin, motility, oxidation, OF, indole, VP, citrate, lactose fermentation, hemolysis detection; and detection of lipase gene were determined from 44 isolates. Then 8 selected isolates and two control isolates were sequenced based on 16S rRNA gene. Phylogenetic trees obtained using Clustal X and MEGA 5. The results of the phylogenetic tree, Aeromonas spp. can be classified in to

_______________________1 Penulis Penanggung Jawab

Visi Tinta Manik, Topik Hidayat1, Diah KusumawatyIdentifikasi dan Filogenetika Bakteri Aeromonas spp.

Isolat Air Kolam Beberapa Kota Berdasarkan Pada Sikuen Gen 16S rRNA

3 groups, the first group consisted of five isolates clustered alone, the second group consists of two isolates which have close relationship with Aeromonas veronii and the last group consisted of one isolate andt wo control isolates have close relationship with Aeromonas hydrophila.

Keywords: Aeromonas spp., phylogenetic, 16S rRNA gene

Bakteri Aeromonas spp.umumnya hidup di lingkungan perairan (Ottaviani et al., 2011). Aeromonas hydrophila dapat ditemukan diberbagai lingkungan perairan seperti air tanah, air permukaan, air payau, air laut, air minum, dan air dari limbah (Holmes et al.,1996 dalam EPA, 2006), termasuk di air kolam ikan (Wulandari, 2012).

Aeromonas spp. merupakan patogen, baik pada manusia maupun hewan (ikan, amfibi, reptil) (Gosling, 1996 dalam EPA, 2006). Pada manusia, dapat menyebabkan gangguan gastrointestinal, infeksi dan luka pada usus halus, dan berbagai infeksi lainnya (Janda & Abbot, 2010). Gastroenteritis merupakan penyakit paling umum yang disebabkan oleh bakteri ini, terutama menginfeksi individu yang masih muda, orang tua, dan individu yang memiliki daya imunitas lemah (Janda & Abbot, 2010), bahkan menurut Janda dan Abbot (1998) dalam EPA (2006) bakteri ini dapat juga menyebabkan septicemia, meningitis, endocarditis, dan lain-lain.

Selain patogen pada manusia, bakteri Aeromonas spp. juga dikenal sebagai bakteri patogen pada ikan. Beberapa anggota bakteri ini banyak disebutkan perannya yang berkaitan dengan patologi ikan. Pada ikan, bakteri Aeromonas spp. dapat menyebabkan haemorrhagic septicemia, furunculosis, cutaneous ulcerative disease, head ulcer disease (Austin & Austin, 2007).

Aeromonas spp. memiliki taksonomi yang kompleks, karena memiliki karakter yang berbeda-beda bahkan pada level intraspesies (Soler et al., 2004; Ottaviani et al., 2011), hal tersebut berdampak pada kesulitan mengidentifikasi

bakteri Aeromonas spp. pada level spesies karena bakteri ini memiliki heterogenitas pada fenotip dan genotipnya (Janda & Abbott, 2010; Beaz-Hindalgo et al., 2010; Morandi et al., 2005; Figueras et al., 2000).

Teknik molekuler telah dikembangkan untuk mengatasi masalah identifikasi bakteri. Gen 16S rRNA merupakan gen yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi bakteri Aeromonas spp., karena gen 16S rRNA merupakan gen yang digunakan secara universal dan dapat mengidentifikasi bakteri yang memiliki kekerabatan yang sangat dekat (Woese et al.,1987 dalam Martinez-Murcia et al.,1992). Putchucheary et al. (2012) telah melakukan identifikasi bakteri Aeromonas hydrophila dan Aeromonas caviae dengan menggunakan sikuen gen 16S rRNA. Sikuen tersebut juga dapat digunakan untuk identifikasi Aeromonas salmonicida, Aeromonas bestiarum (Martinez-Murcia et al., 2005), dan Aeromonas veronii (Graf, 1999).

Identifikasi bakteri Aeromonas spp. yang berasal dari air masih jarang dilakukan di Indonesia, padahal hal ini penting untuk melihat keragaman, kekerabatan, dan penyebaran strain di perairan, sehingga dapat digunakan sebagai DNA barcode dan dapat digunakan untuk pengujian kualitas air secara tepat dan cepat.

Berdasarkan latar belakang tersebut telah dilakukan identifikasi filogenetika bakteri Aeromonas spp. yang diisolasi dari air kolam sebagai tempat hidup hewan air seperti ikan dengan menggunakan penanda gen 16S rRNA untuk mengetahui kekerabatan bakteri Aeromonas spp. secara

Formica Online, Volume 1, Nomor 1, Januari 2014

evolusi agar hasilnya dapat dipakai untuk keperluan penelitian selanjutnya.

METODEIsolasi bakteri

Air dari berbagai kota diambil dengan menggunakan botol steril, kemudian isolasi bakteri Aeromonas spp. dilakukan dengan menggunakan metode pengenceran dengan konsentrasi 10-1 dan 10-2. Satu ml sampel air hasil pengenceran diambil lalu ditanam dengan cara diteteskan ke dalam medium RS + novobiosin, kemudian dihomogenkan (diratakan) dengan menggunakan batang L sampai terasa kesat. Lalu kultur diinkubasi pada suhu 37°C selama 18-24 jam. Hasil positif dapat dilihat dari penampakkan koloni yang berwarna kuning tanpa warna hitam di tengah koloni (SNI, 2009).

Identifikasi Morfologi dan Biokimia Bakteri Aeromonas spp.

Identifikasi morfologi yang dilakukan adalah Pewarnaan Gram dan Uji KOH 3 % (Arthi et al., 2003). Uji biokimia meliputi uji RS+novobiosin, uji motilitas, uji oksidasi, uji oksidatif fermentatif (OF) (SNI, 2009), uji fermentasi laktosa (Al-Fathlawy & Al-Ammar, 2013), uji Indol, sitrat, Voges-Proskauer (VP) (Abbot et al.,2003), dan deteksi hemolisis ((Monfort & Beleux, 1991)

Identifikasi Bakteri Aeromonas spp. secara Molekuler

Isolasi DNA bakteri menggunakan teknik boiling. Sebanyak satu loop penuh bakteri dari TSA dimasukkan ke dalam tabung mikrosentifuge 1.5 ml yang berisi 1 ml Posfat Buffer Saline (PBS 1x), kemudian tabung 1.5 ml tersebut disentrifugasi selama 3 menit dengan kecepatan 5000 rcf. Selanjutnya supernatan dibuang, Kemudian TE 1x 100 µl ditambahkan pada pelet bakteri dalam tabung 1.5 ml dan dihomogenkan dengan menggunakan vortex. Setelah dihomogenkan, tabung 1.5 ml disimpan di

dalam air mendidih pada suhu 100o C selama 10 menit. Sebanyak 100 µl lisat dipindahkan ke tabung mikrosentrifuge 1.5 ml yang baru. Selanjutnya lisat tersebut ditambahkan dengan 900 µl TE 1x yang sebelumnya disimpan di kulkas, kemudian hasil isolasi DNA disimpan pada suhu – 20o C (modifikasi Yanez et al.,2003).

Identifikasi molekuler yang dilakukan adalah deteksi gen spesifik lipase (lip) (Cascon et al., 1996) dan deteksi gen 16S rRNA. Amplifikasi DNA menggunakan alat PCR dilakukan dengan total volume reaksi 12.5 µl atau ½ reaksi menurut protokol merk Master Mix KAPPA 2GTM Fast Ready Mix 2x. Program suhu PCR untuk deteksi gen lip adalah pra denaturasi 95oC selama 5 menit, denaturasi 95oC selama 15 detik, annealing 59oC selama 15 detik, elongasi 72oC 30 detik dan final elongasi pada suhu 72oC selama 10 menit dengan 28 siklus.

Proses amplifikasi gen 16S rRNAdilakukan dengan menggunakan alat PCR. Komposisi yang digunakan menurut protokol Gotaq Green Master Mix 2x/ KAPA Fast Ready Mix yaitu dengan total volum 50µl, yang berisi KAPA/GoTaq Master Mix sebanyak 25µl, Primer F/R masing-masing 2µl, DNA templat 4µl, dan deion steril 19µl. Proses amplifikasi diawali dengan denaturasi awal pada suhu 95oC selama 5 menit, diikuti 28 kali siklus yang terdiri dari tahap denaturasi pada suhu 95oC selama 30 detik, proses annealing pada suhu 54oC selama 30 detik, proses elongasi pada suhu 72oC selama 90 detik, dan diakhiri proses elongasi akhir pada suhu 72oC selama 10 menit. Hasil amplifikasi kemudian dielektroforesis dengan gel agaros 1.5% dan hasilnya dilihat di bawah UV.



Tabel 1. Sikuen Primer yang digunakanNo

Gen Primer 5’3’ Pustaka

1 Lip F : AAC CTG GTT CCG CTC AAG CCG TTGR: TTG CCT CGC CTC GGC CCA GCA GCT

Cascon et al., 1996

2 16S rRNA

27F : AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG1492R : GGT TAC CTT GTT ACG ACT T

Hill et al., 2003

Filogenetika Bakteri

Proses sikuensing dilakukan dengan menggunakan mesin sequencer BigDye Applied System model 3730 yang dilakukan di Macrogen inc., Korea. Analisis data dilakukan dengan menerjemahkan hasil sikuensing kemudian sikuen tersebut disejajarkan dan di bandingkan dengan data sikuen gen 16S rRNA yang ada di database Bank gen NCBI (National Center of Biotechnology Information) di alamat website http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi

Proses aligment menggunakan program Tool Multiple-sequence alignment dari software Crustal-X dan software MEGA (version 5) untuk menganalisis filogenetika bakteri Aeromonas spp. tersebut melalui pohon filogeni.

HASIL DAN PEMBAHASANTotal ada empat puluh empat isolat

yang diisolasi dan terpilih untuk diidentifikasi secara morfologi dan biokimia menurut SNI (2009), dari 44 isolat yang di uji, 37 isolat bakteri yang diuji diduga termasuk genus Aeromonas sedangkan 7 isolat bukan merupakan Aeromonas. Hal ini berdasarkan kriteria SNI (2009) jika uji RS positif (warna koloni kuning), bakteri merupakan garam negatif dengan sel berbentuk basil pendek, bersifat motil, positif menghasilkan enzim oksidase, dan positif oksidatif dan fermentatif maka bakteri tersebut merupakan Aeromonas. Hasil Uji gen lipase menunjukkan dari 37 isolat terdapat

delapan isolat memiliki gen lipase, enam isolat diantaranya memiliki gen lipase pada ukuran 760bp, sedangkan dua isolat lainnya memiliki gen lipase pada ukuran >760 bp. Menurut Lee et al. (2000) dan Cascon et al.(1996) bakteri Aeromonas yang memiliki gen lipase pada ukuran 760 bp merupakan bakteri Aeromonas hydrophila.

Hasil uji Indol pada sepuluh isolat terpilih menunjukkan 80% isolat positif uji indol, 60% isolat positif uji sitrat, 50 % isolat positif mampu memfermentasi laktosa, 90% isolat positif uji VP, dan semua isolat memiliki kemampuan hemolisis tipe β.Abbot et al.(2003) melaporkan dari hasil uji VP pada sembilan spesies yaitu A. hydrophila, A. bestiarum, A. salmonicida, A. caviae, A. media, A. eucrenophila, A. sobria, A. veroni bv. veronii, danA. veronii bv. sobria, terdapat empat spesies yang negatif uji VP yaitu A. caviae, A. media, A. eucrenophila, A. sobria, dan A. veronii bv. Sobria. Sedangkan menurut Awan et al. (2005), dari enam spesies Aeromonas yang diuji yaitu yaitu A. hydrophila, A. veronii bv. sobria, A. caviae, A. trota, A. schubertii, dan A. jandaei,hasil negatif uji VP adalah A. trota, A. schubertii. Hasil yang berbeda dilaporkan oleh Erdem et al. (2011) yang menyatakan bahwa A. caviae dan A. sobria negatif uji VP.

Gambar .1 Hasil elektroforesis gen lipasepada gel agaros 1.5 %

(M= DNA 100pb, Fermentas ;(1)= isolat K.35 ; (2)= AKIS 1 ; (3)= isolat AKG 1 ; (4)= isolat

AKC ; (5)= isolat ATCC 7966 ; (6)= isolat AKT 1 ; (7)= isolat AKIS 3 ; (8)= isolat AKIA 1 ; (9) Isolat

AKI 1 ; (10)= isolat AKB 1)


Abbot et al. (2003) melaporkan dari sembilan spesies anggota Aeromonas (A. hydrophila, A. bestiarum, A. salmonicida, A. caviae, A. media, A. eucrenophila, A. sobria, A. veroni bv. veronii, danA. veronii bv. sobria) semuanya memberikan hasil positif untuk uji indol begitu pula dengan pengujian yang dilakukan oleh Erdem et al. (2011) menyatakan uji indol positif terhadap A. hydrophila, A. caviae, dan A.sobria. Pada tahun 2005, Awan et al., melakukan uji Indol pada enam spesies anggota Aeromonas yaitu A. hydrophila, A. veronii bv. sobria, A. caviae, A. trota, A. schubertii, dan A. jandaei. Dari keenam spesies tersebut hanya satu spesies yang negatif uji indole yaitu A. schubertii.

Abbot, et al. (2003) menyatakan dari delapan spesies Aeromonas yang diujikan yaitu A. hydrophila,A. bestiarum, A. salmonicida, A. caviae, A. media, A. eucrenophila, A. sobria, dan A. veronii hanya satu spesies yaitu Aeromonas eucrenophila yang negatif uji sitrat. Menurut laporan Awan et al. (2005), dari enam spesies Aeromonas yang di uji yaitu A. hydrophila, A. veronii bv. Sobria, A. caviae, A. trota, A. schubertii, dan A. jandaei hanya dua spesies yang negatif uji sitrat yaitu A. schubertii, dan A. jandaei.

Jayavignesh et al. (2011) yang menyatakan bahwa Aeromonas hydrophila memiliki kemampuan memfermentasi laktosa. Namun hal ini dibantah oleh menyatakan bahwa Aeromonas hydrophila tidak mampu memfermentasi laktosa seperti halnya bakteri Aeromonas sobria (Erdem et al., 2011). Perbedaan hasil uji biokimia yang terjadi antara para peneliti dan yang telah dilakukan ini diduga disebabkan oleh perbedaan sumber dan asal isolat yang digunakan.

Hasil deteksi gen 16S rRNA menunjukkan semua isolat memiliki gen tersebut pada ukuran mendekati 1500 bp. Hal ini sesuai dengan Sahu et al. (2012) yang menyatakan gen 16S rRNA pada

Aeromonas spp. terdapat pada posisi 1500 bp.

Gambar 2. Hasil elektroforesis gen 16S rRNA pada gel agaros 1.5% (M= DNA LadderLow

Range,ready-to-use, Fermentas ;(1)= isolat ATCC 7966 ; (2)= isolat K35 ; (3)= isolat AKIS 1 ; (4)= isolat AKG 1 ; (5)= isolat AKC ; (6)= isolat AKB

1 ; (7) = isolat AKT 1 ; (8)= isolat AKIS 3; (9) Isolat AKI 1 ; (10)= isolat AKIA 1)

Hasil analisis filogenetika bakteri Aeromonas spp. yang diperoleh dapat dilihat pada gambar 3. Hasil dari pohon filogenetika menunjukkan bahwa dari semua isolat yang diujikan terbagi menjadi tiga kelompok. Kelompok pertama dapat dilihat dari isolat didalam kotak berwana kuning yang terdiri dari isolat AKC, AKIS 1, AKIA 1, dan AKIS 3 semua isolat tersebut mengelompok sendiri. Kelima isolate pada kelompok pertama ini diduga merupakan kelompok transisi yang akan menjadi spesies jenis baru. Selanjutnya kelompok kedua (didalam kotak berwarna hitam) yang terdiri dari isolat AKI 1 dan isolat AKT 1 memiliki kedekatan dengan Aeromonas veronii srain ATCC, hal ini menunjukkan memang kedua isolat tersebut merupakan Aeromonas veronii sesuai dengan hasil BLAST. Yang terakhir kelompok ke tiga yang terdiri dari isolat AKB 1 beserta isolat kontrol ATCC 7966 dan isolat K.35 memiliki kekerabatan dengan Aeromonas hydrophila ATCC 7966 dari gene bank, hal ini dapat dilihat dari percabangan yang dekat diantara ketiga isolat tersebut.

Berdasarkan Martinez-Murcia et al. (1992) pohon filogenetika yang didapat dari A. hydrophila, A. media, A. caviae, A.trota, A. sobria, A. salmonicisa, A.



euchrenophila, dan A. veronii dengan sekuen gen 16S rRNA menunjukkan kedekatan antara A. hydrophila dan A. media, serta A. caviae dan A.trota, sedangkan A. veronii berada pada cabang paling bawah.

Gambar 4.27. Pohon filogenetika isolat bakteri Aeromonas spp.

berdasarkan gen 16S rRNA

Tabel 3. perbandingan hasil Identifikasi Isolat Aeromonas spp.

Nama isolat

Hasil uji biokim SNI

Hasil uji biokimia tambahanS FL VP Ind Hem

ATCC 7966

Aeromonas - + + + Β

K.35 Aeromonas + + + + ΒAKG 1 Aeromonas + - + - ΒAKI 1 Aeromonas + - + + ΒAKIS 1 Aeromonas + + - + ΒAKIS 3 Aeromonas + - + + ΒAKIA 1 Aeromonas - - + + ΒAKC Aeromonas - + + + ΒAKB 1 Aeromonas + - + - ΒAKT 1 Aeromonas - + + + Β

Nama isolat

Hasil deteksi gen lip

Hasil Blast Hasil Pohon filogeni

ATCC 7966

A.hydrophila A.hydrophila A.hydrophila

K.35 A.hydrophila A.hydrophila A.hydrophilaAKG 1 -* A.veronii A.veroniiAKI 1 - A.veronii A.veroniiAKIS 1 A.hydrophila A.hydrophila -AKIS 3 A.hydrophila A.hydrophila -AKIA 1 - A.hydrophila -AKC A.hydrophila A.hydrophila -AKB 1 A.hydrophila A.hydrophila A.hydrophilaAKT 1 - A.veronii -

Terdapat hasil yang berbeda dari identifikasi dengan uji SNI, uji biokimia, deteksi gen lipase, hasil blast, dan hasil pohon filogenetika (Tabel 3). Namun dari

perbedaan tersebut dapat dikatakan bahwa metode deteksi gen lipase sudah mampu membedakan spesies Aeromonassebesar 70%. Sedangkan hasil uji biokimia tambahan memberikan hasil yang tidak terlalu signifikan sehingga kedepannya identifikasi bakteri Aeromonas dapat langsung menggunakan metode deteksi gen lipase setelah uji SNI. Dari hasil tabel 4.11 dapat dilihat bahwa kelompok pertama pada pohon filogenetika tidak termasuk Aeromonas hydrophila maupun Aeromonas veronii meskipun pada hasil deteksi gen lipase tiga isolat positif memiliki gen lipase pada posisi 760pb, sehingga kelompok satu masih belum dipastikan hubungannya dengan spesies Aeromonas yang lain. Hal ini diduga karena gen 16S rRNA terlalu universal sehingga sekuen 16S rRNA pada Aeromonas terlalu mirip dan hanya dibedakan pada sebagian kecil nukleotida (Martinez-Murcia et al.,1992).

Oleh karena itu untuk identifikasi dan analisis kekerabatan Aeromonas spp., disarankan melakukan sikuensing dari dua arah, selain itu perlu dilakukan sikuensing dengan menggunakan multi gen penanda. Beberapa peneliti melakukan identifikasi filogenetika bakteri Aeromonas hydrophila selain menggunakan penanda gen 16S rRNA, juga digunakan gen housekeeping yaitu gen gen gyrB dan gen rpoD (Yanez, et al., 2004; Kupfer et al., 2006; Morandi et al., 2005). Perbandingan sikuen genom beberapa strain dari masing-masing spesies dibutuhkan untuk menyelesaikan sejarah evolusi yang kompleks yang berhubungan dengan duplikasi gen, transfer gen, dan terjadinya rekombinasi (Morandi et al., 2005).

KESIMPULANHasil penelitian mengenai identifikasi

bakteri Aeromonas spp. didapatkan informasi bahwa pada umumnya bakteri Aeromonas merupakan bakteri Gram negatif berbentuk basil, memiliki koloni berwarna kuning pada medium


RS+novobiosin, bersifat motil, memiliki kemampuan oksidatif dan fermentatif, dan positif uji oksidase. Dari sepuluh isolat terpilih, 60% memiliki gen lipase pada posisi 760pb, 20% memiliki gen lipase pada posisi lebih dari 760pb, dan 20% tidak memiliki gen lipase.Melalui hasil analisis sikuensing didapatkan dua kelompok spesies yaitu Aeromonas hydrophila dan Aeromonas Veronii. Secara filogenetika, hubungan kekerabatan sepuluh isolat yang diuji terbagi menjadi tiga kelompok. Kelompok pertama kelima isolat yang diuji mengelompok tersendiri, sedangkan kelompok kedua terdapat dua isolat yang berdekatan dengan Aeromonas veronii. Kelompok ketiga yang terdiri dari satu isolat dan dua isolat kontrol memiliki kekerabatan dengan Aeromonas hydrophila strain ATCC 7966.

DAFTAR PUSTAKA

Abbot, SL., Sharon, W., Cheung, K.W., and Janda J.M. (2003). The Genus Aeromonas : Biochemical Characteristics, Atypical Reaction, and Phenotypic Identification Schemes. J. Clin. Microbiol. 41(6):2348

Al-Fatllawy, H.,N.,K., and Al-Ammar, M.,H. (2013). Molecular Study of Aeromonas hydrophila isolated from Stool sample in Najaf (Iraq). International Journal of Microbiology Research. ISSN: 0975-5276 & E-ISSN : 0975-9174, Volume 5, Issue 1.

Arthi, K., Appalaraju, B., & Parvathi, S. (2003). Vancomicin sensitivity and KOH String Test as an Alternative to Gram Staining of Bacteria. Indian Journal of Medical Microbiology. 21,(2),121-123

Austin, B., and Austin, D.A. ( 2007). Bacterial Fish Patogen Disease of Farm and Wild Fish Forth Edition. Praxis Publishing Ltd. Chisester,UK.

Awan, B.M., Ahmed M.M., Barii, A., and Saad, A.M. (2005). Biochemical Characterization Of The Aeromonas Species Isolated From Food And Environment. Pak J Physiol;1(1-2)

Beaz-Hidalgo, R., Alperi, R., Buján, N., Romalde, J.L., Figueras, M.J., (2010). Comparison of phenotypical and genetic identification of Aeromonas strains isolated from diseased fish. Systematic and Applied Microbiology 33, 149–153.

Cascon, A., Anguita, J., Hernanz, C., Sa’nchez, M., Ferna´ndez, M., And Naharro, G. (1996). Identification of aeromonas hydrophila hybridization group 1 by PCR assays. Applied and environmental microbiology, apr. p. 1167–1170

EPA. (2006). Aeromonas : Human Health Criteria Document. Health and Ecological Criteria Division Office of Science and Technology Office of Water. U.S Enviromental Protection Agency : Wahington.

Erdem, B., Kariptas, E., Cil, E., Isik, I. (2011). Biochemial Identifications and Numerical Taxonomy of Aeromonas spp. isolated from Food Sample in Turkey. Turk J Biol 35. 463-472



Figueras, M.J., Soler, L., Chacón, M.R., Guarro, J., Martinez-Murcia, A.J., (2000). Extended method for discrimination of Aeromonas spp. by 16S rDNA RFLP analysis. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 50, 2069–2073.

Graf, J. (1999). Diverse Restriction Fragmen Length Polymorphism Pattern of the PCR-Amplified 16S rRNA Genes in Aeromonas veronii Strain and Possible Misidentification of Aeromonas Species. Journal of Clinical Microbiology,Oct., p. 3194-3297

Hill, K. E., Davies, C. E., Wilson, M. J., Stephen, P., Harding, K. G., & Thomas, D. W. (2003). Moleculer Analysis of the Microflora in Chronic Venous Leg Ulceration. Journal of Medical Microbiology, 52: 365-369

Janda, J.M., Abbott, S.L., (2010). The genus Aeromonas: taxonomy, patogenicity, and infection. Clinical Microbiology Reviews 23, 35–73.

Jayavignesh, V., Kannan, K.K., Bath, A.D. (2011). Biochemial Characterization and Citotoxicity of the Aeromonas hydrophila Isolated from Catfish. CODEN (USA) AASRC9 ISSN 0975-508x

Kupfer, M., Kuhnert, P., Bozena, M., Peduzzi, R., and Demarta, A. (2006). Genetic Relationship of Aeromonas Strain Inferred from 16S rRNA, gyrB, and rpoD gene sequence. Int. J. Syst. 56, 2743-2751.

Lee, S., Kim, S., Oh, Y., Lee, Y. (2000). Characterization of Isolated Aeromonas hydrophila from Rainbow Trouts in Korea. The Journal of Microbiology, March, p1-7.S

Martinez-Murcia,A.J., Benlloch, S., and Colllins, M.D. (1992). Phylogenetic Interrelationship of member of genera Aeromonas and Plesiomonas as determine by 16S ribosomal DNA sequencing; lack of congruence result of DNA-DNA hybridization. Int. J. of Systematic Bacteriology, P. 412-421

Martinez-Murcia,A.J., Soler, L., Saavedra, M.J., Chacon, M.R., Guarro, J.,Stackebrandt, E., Figueras, M.J. (2005). Phenotypic, genotypic, and phylogenetic discrepancies to differentiate Aeromonas salmonicida from Aeromonas bestiarum. International Mycrobiology 8: 259-269.

Monfort, P., & Beleux, B. (1991).

Distribution and Survival of Motil Aeromonas spp. in Brackish Water Receiving Sewage Treatment Effluent. Appn. Environt. Microbiol, 57(9),2459.

Morandi, A., Zhaxybayeva, O., Gogarten, J.P., Graf, J. (2005). Evolutionary and diagnostic implications of intragenomic heterogeneity in the 16S rRNA gene of Aeromonas strains. J Bacteriol 187: 6561–6564.

Ottaviani, D., Parlani, C., Cittero, B., Massini, L., Leoni, F., Canonico, C., Sabatini, L.,


Bruscolini, F., Pianetti, A. (2011). Putative Virulence Properties of Aeromonas Strain Isolatd from Food, Environmental, and Clinical Sources in Italy: Comparative Study. Int J Food Microbiol, 144 (3): 538-45.

Puthucheary, S.D., Puah, S.M., Chua, K.H. (2012). Moleculer Characterization of Clinical Isolate of Aeromonas Species from Malaysia. Plus One Vol. 7, Issue 2 : e30205

Sahu, I., Das, B.K., Marhua, N.P., Pradhan, J., Sahoo, D.R., Behra, B., Mishra, B.K. (2012). Phenotipic and Genotipic Method for Identification Aeromonas hydrophila Strain from Carp Labeo rohita and Their Virulence Study.International Journal of Fisheries and Aquaculture Sciences. ISSN 2248-9975 Volume 2, Number 2 pp. 141-156

Soler L., Yanez, M.A., Chacon, M.R., Aguilera-Arreola, M.G., Catalan, V., Figueras, M.J., and Martinez-Murcia, A.J. (2004). Phylogenetic analysis of the genus Aeromonas based on two housekeeping genes. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology , 54,1511-1519

SNI. (2009). Metode Identifikasi Bakteri Aeromonas hydrophila secara Biokimia. SNI 7303: 2009

Wulandari, R. (2012). Deteksi gen Virulen dan Uji Patogenitas Bakteri Aeromonas hydrophila Isolat Air Sukabumi Pada Ikan Gurami (Osphronemus gourami). Skripsi. Jurusan Pendidikan Biologi. FPMIPA. Universitas Pendidikan Indonesia. Bandung.

Yanez, M.A., Catalan, V., Apraiz, D., Figueraz, M.J., & Martinez-Murcia, A.J. (2003). Philogenetic analysis of member of the genus Aeromonas based on gyrB gene sequences. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 53, 875-883.

Documents

87-166-1-SM