8 : 18 G. 1 - biology21.ru- Биофармацевтика - Биофизика и радиобиология - Биохимия - Математическая биология и

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Пущинский научный центр Российской академии наук

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

Пущинский государственный естественно-научный институт

Администрация города Пущино УДК 57.08; 573.4; 574.24; 574.6; 577.1; 577.2; 577.3; 578,5; 579,6; 581.1; 591.1; 631.4 БИОЛОГИЯ – НАУКА ХХI ВЕКА: 18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 21 - 25 апреля 2014 г.). Сборник тезисов.

Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века» - научное мероприятие, проводимое для ознакомления молодых ученых с перспективами и новейшими достижениями в различных областях биологии.

Работа школы-конференции проводится в следующих секциях: - Биотехнология - Биофармацевтика - Биофизика и радиобиология - Биохимия - Математическая биология и биоинформатика - Микробиология и вирусология - Молекулярная биология - Почвоведение и агроэкология - Физиология животных и биомедицина - Физиология растений и фотобиология - Экология

В программу школы-конференции, кроме устных и стендовых докладов участников, входят лекции ведущих российских и зарубежных ученых, круглые столы, мастер-классы, тренинги, экскурсии по институтам Пущинского научного центра, научные и творческие конкурсы, насыщенная культурная и спортивная программа.

ISBN 978-5-600-00210-4

18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА»

The 18th INTERNATIONAL PUSHCHINO SCHOOL CONFERENCE OF YOUNG SCIENTISTS

“BIOLOGY – THE SCIENCE OF THE XXI CENTURY”

Россия, г. Пущино, 21 – 25 апреля 2014 г.

Пущино, 2014

ПРЕДСЕДАТЕЛЬ ОРГКОМИТЕТА Мирошников Анатолий Иванович, академик РАН, председатель ПНЦ РАН, директор ФИБХ РАН

ПРОГРАММНО-НАУЧНЫЙ КОМИТЕТ: Боронин Александр Михайлович, член-корр. РАН, директор ИБФМ РАН Вайнштейн Михаил Борисович, д.б.н., зам директора ИБФМ РАН, ректор ПущГЕНИ Дагкесаманский Рустам Давудович, д.ф-м.н., директор ПРАО АКЦ ФИАН Иваницкий Генрих Романович, член-корр. РАН, директор ИТЭБ РАН Кудеяров Валерий Николаевич, член-корр. РАН, проф., директор ИФХБПП РАН Лахно Виктор Дмитриевич, д.ф-м.н., директор ИМПБ РАН Овчинников Лев Павлович, академик РАН, директор ИБ РАН Пермяков Евгений Анатольевич, д.б.н., проф., директор ИБП РАН Фесенко Евгений Евгеньевич, член-корр. РАН, директор ИБК РАН Шувалов Владимир Анатольевич, академик РАН, директор ИФПБ РАН Назарова Галина Николаевна, к.б.н., заместитель председателя ПНЦ РАН Хаустов Сергей Анатольевич, к.б.н., заместитель председателя ПНЦ РАН

ЗАМЕСТИТЕЛИ ПРЕДСЕДАТЕЛЯ: Шапырина Екатерина Валерьевна, н.с., ИБФМ РАН

СЕКРЕТАРИ: Назарова Галина Николаевна, к.б.н., заместитель председателя ПНЦ РАН, учёный секретарь оргкомитета Леонова Мария Михайловна, к.б.н., с.н.с., ИФПБ РАН Никонова Юлия Александровна, аспирант, ИТЭБ РАН, ПНЦ РАН Никифорова Анна Борисовна, и.о. м.н.с., ИТЭБ РАН Ельцова Зинаида Александровна, н.с., ИФПБ РАН

РУКОВОДИТЕЛИ СЕКЦИЙ: Абдуллаев Серажутдин Абдуллаевич, к.б.н., н.с., ИТЭБ РАН, «Биофизика и радиобиология» Бобылев Александр Геннадьевич, к.б.н., с.н.с., ИТЭБ РАН, «Физиология животных и биомедицина» Вологжанникова Алиса Андреевна, н.с., ИБП РАН, «Биохимия» Гудков Сергей Владимирович, д.б.н., с.н.с., ИТЭБ РАН, СМУ ПНЦ, «Биофизика и радиобиология» Иващенко Кристина Викторовна, аспирант, инженер, ИФХиБПП РАН, «Почвоведение и агроэкология» Ивличева Наталья Александровна, к.б.н., н.с., ИБК РАН, «Физиология животных и биомедицина» Квиткина Анна Константиновна, инженер, ИФХиБПП РАН, «Экология» Козулева Марина Алексеевна, к.б.н., н.с., ИФПБ РАН, «Физиология растений и фотобиология» Кондратьев Максим Сергеевич, к.ф-м.н., н.с., ИБК РАН, СМУ ПНЦ, «Математическая биология и биоинформатика» Москаленко Светлана Валентиновна, инженер, ИФХиБПП РАН, «Экология» Овчинников Андрей Юрьевич, к.б.н., н.с., ИФХиБПП РАН, «Почвоведение и агроэкология» Поливцева Валентина Николаевна, к.б.н., инженер, ИБФМ РАН, СМУ ПНЦ, «Микробиология и вирусология» Розова Ольга Николаевна, инженер, к.б.н., ИБФМ РАН, «Микробиология и вирусология» Соболев Егор Васильевич, н.с., ИМПБ РАН, «Математическая биология и биоинформатика» Согорин Евгений Анатольевич, аспирант, ИБ РАН, «Молекулярная биология» Фадеев Роман Сергеевич, к.б.н., н.с., ИТЭБ РАН, «Биотехнология» Фадеева Ирина Сергеевна, к.б.н., н.с., ИТЭБ РАН, «Биотехнология» Фурсова Ксения Константиновна, к.б.н., н.с., ФИБХ РАН, «Биофармацевтика»

ТЕХНИЧЕСКИЙ КОМИТЕТ: Бутенко Александр Вячеславович, м.н.с., аспирант ПРАО АКЦ ФИАН, информационная поддержка Запрудина Мария Вадимовна, к.б.н., редактор сборника Мязгова Наталия Владимировна, ЦЭПЛ РАН, дизайн Попов Антон Леонидович, м.н.с., ИТЭБ РАН, ПНЦ РАН, координатор конкурса «Умник» Шавкунов Константин Сергеевич, к.б.н., н.с., ИБК РАН, перевод

18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века» СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»

3

СЕКЦИЯ «Биотехнология»

EVALUATION OF ANTIMICROBIAL AND ANTIOXIDANT ACTIVITY OF ISOLATED CULTURE OF ST.-JOHN’S WORT ELONGATED

(HYPERICUM ELONGATUM LEDEB.)

Babayan A., Petrosyan M.T., Sahakyan N.Zh., Trchounian A.H. Yerevan State University, Yerevan, Armenia

[email protected]

The isolated culture of Hypericum elongatum Ledeb. with high biosynthetic activity was obtained. The first signs of callus formation on explants were observed at 18-20 days of cultivation on the medium with 1 mg/l kinetin, 0,5 mg/l NAA and 0,2 mg/l GA. But further cultivation of callus was carried out on the MS (Murashige-Skoog) medium which was stimulating stem organogenesis (under the light). Root formation was observed on the nutrient medium of MS-basis with 0.1 mg/ml NAA. All of the in vitro cultures were incubated at temperature 25±1°C under the light (with the photoperiod of 16 h (natural daylight, supplemented with artificial light of approx. 150 µmol quanta m–2 s –1 provided by white fluorescent and dark conditions). Metabolic features of this isolated culture were studied. The agar-diffusion method was used to determine the antibacterial activity of products of the secondary metabolism of the H. elongatum isolated culture against some gram-positive and gram-negative microorganisms. The conclusion can be done that the callus cultures of H.elongatum have the ability to the synthesis of substances with antibiotic activity against Escherichia coli VKPM M-17, Salmonella typhimurium TA 100, Staphylococcus aureus WDC M 5233, St. citreus WT, Bacillus subtilis A1WT, B. mesentericus WDCM 1873. At the same time the synthesis of the substances with antibacterial activity was under the hormonal control, and these substances selectively affect on the test-microorganisms. In order to measure antioxidant activity of this cultures, growing under the different conditions (composition of nutrient medium, light conditions), 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging assay was used. It was revealed that different concentrations of extracted substances of H. elongatum tissue cultures (1000 µg/ml, 500 µg/ml, 100 µg/ml and 50 µg/ml) growing in the dark conditions was shown higher (approximately three- fold) antioxidant activity: 95%, 54.6%, 39.7%, 10.8%, than cultures in the same concentrations , growing under the light. Their antioxidant activity was 28.7%, 22.7%, 2.834%, 2.421%. Thus, biotechnologically obtained isolated culture of H. elongatum Ledeb. may be offered as a source of substances with high antioxidant and antibacterial activity.

THE INFLUENSE OF NA AND FORMATE CONTENT ON HYDROGEN PRODUCTIONBY HYPERTHERMOPHILIC ARCHAEA THERMOCOCCUS ONNURINEUS NA1 UNDER ORGANO-AND MIXOTROPHIC CONDITIONS

Tekucheva D.N. Institute of Basic Biological problems RAS, Pushchino, Russia

[email protected]

Currently, the majority of hydrogen is produced from fossil fuels, but from environmental perspective, sustainable H2 production should be considered. Biohydrogen production has many desirable properties, among others, environmental friendliness and renewability.

Thermococcus onnurineus NA1 is a hyperthermophilic achaea which is able to produce H2 utilizing toxic CO gas via water-gas shift reaction, and organic substances (for example formate, disaccharides, and proteins). In the case of CO and formate utilization H2 production yield is closed to 1 mol of H2/mol of C1 substrate.

In our investigation of H2 production by batch T. onnurineus NA1 cultures different concentrations of sodium formate were used as a sole substrate (organotrophic) or together with CO (mixotrophic conditions). H2 production was strongly affected by formate content under both studied conditions. The maximum H2 production under organo- and mixotrophic conditions (112.8±5.3 and 143.5±5.0 mmol H2/L broth) could be achieved at 800 mM Na-formate in the absence of NaCl (or KCl).


4

Both high (1000 mM) and low (450 mM) Na+ concentrations were unfavorable even if formate content was sufficient. At sodium formate concentration of 15 mM addition of 750 mM NaCl (standard concentration) did not improve the hydrogen production. The addition of 350 mM KCl at 750 mM formate (in absence of NaCl) produced the strong inhibitory effect as well. Obviously inhibition is not strongly connected with particular ion; it is caused by ionic strength of medium. It should be noted that all described effects were shown both for organo- and mixotrophic conditions.

When the Na+ concentration was fixed at 750 mM, the utilization of formate was a function of its initial concentration (15-800 mM was tested). At formate content of 450-750 mM, its utilization by T.onnurineus NA1 reached a maximal level 115.2±8.5 and 108.0±9.3 mM under organo- and mixotrophic conditions, respectively. The availability of CO caused a minor inhibitory effect on formate utilization. However, the H2 production in the presence of CO was higher as indicated above. It suggested that CO was used for H2 production.

Together with H2 production and, respectively, formate utilization, changes in pH value occurred and reached about 1.7. Further increase of H2 production by 20% (136.6 mmol H2/L broth) under organotrophic conditions (but not mixotrophic) could be achieved by 60 mM PIPES-buffer addition. Perhaps, mixotrophic culture could partly stabilize pH consuming CO together with formate.

НОВЫЕ РАСТВОРИТЕЛИ ДЛЯ ФЕРМЕНТНЫХ ВОДОРОДНЫХ ЭЛЕКТРОДОВ

Абдуллатыпов А.В., Шастик Е.С. ФГБУН Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино, Россия

[email protected]

Водородные электроды применяются в водородных топливных элементах и датчиках водорода. На сегодняшний день в мире наблюдается большой интерес к использованию в водородных электродах ферментов – гидрогеназ. Их основным преимуществом в сравнении с традиционными катализаторами, такими, как платиновые металлы, никель и сульфиды переходных металлов, является обратимость ингибирования сопутствующими газами (примесями, содержащимися в водороде) и высокая селективность. В нашей лаборатории в течение длительного времени изучается гидрогеназа из бактерии Thiocapsa roseopersicina. Она отличается от большинства других гидрогеназ высокой термостабильностью (температурный оптимум 75-80°С) и достаточно высокой устойчивостью к воздействию ингибиторов (кислорода и угарного газа). На основе этой гидрогеназы были изготовлены электроды, показавшие свою применимость в качестве сенсоров водорода и компонентов топливных элементов. Данная гидрогеназа также показала свою устойчивость к органическим растворителям; более того, такие растворители, как ацетон и ацетонитрил, даже повышали ее активность.

В рамках предложенного исследования планируется применение в гидрогеназных электродах новых растворителей – ионных жидкостей и их смесей с органическими растворителями. Ионные жидкости – это соли, находящиеся при комнатной температуре в жидком состоянии. Их преимущество состоит в том, что они обладают хорошей проводимостью, широким температурным диапазоном жидкого состояния и низкой растворимостью сопутствующих газов.

Задачи исследования: 1) Подбор растворителей для гидрогеназных электродов на основе двух типов ионных жидкостей – смешивающихся и не смешивающихся с водой;

2) Оценка активности и стабильности гидрогеназы в данных растворителях; 3) Подбор оптимального метода изоляции камеры гидрогеназного электрода (анодной

камеры) от внешней среды – подбор мембран, иммобилизация в полимер. Ожидается, что результаты исследования будут способствовать расширению

температурного диапазона применимости гидрогеназных электродов как сенсоров водорода и компонентов топливных элементов.


5

ВЫДЕЛЕНИЕ ИЗ РИЗОСФЕРЫ КАРТОФЕЛЯ ШТАММА OCHROBACTRUM SP. IPA7.2 И ЕГО ХАРАКТЕРИСТИКА

Авдеева Е.С.1, Попова И.А.2, Серкебаева Ю.М.3, Евсеева Н.В.2, Матора Л.Ю.2, Бурыгин Г.Л.2

1ФГБОУ ВПО Саратовский государственный университет им. Н.Г.Чернышевского; 2ФГБУН Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН,

Саратов; 3ФГБУН Институт микробиологии им. С.Н.Виноградского РАН, Москва, Россия

[email protected]

Почвенные ростстимулирующие ризобактериии активно участвуют в жизненном цикле растений, стимулируя их рост и развитие, а также повышая устойчивость растительного организма к стрессовым факторам. В связи с этим, актуальным является поиск новых природных бактерий-ассоциантов различных видов растений, в том числе, картофеля, как одной из важнейших сельскохозяйственных культур. Целью данной работы были выделение и характеристика бактерий из ризосферы картофеля.

Из ризосферной почвы картофеля сорта Невский на стадии начала формирования клубней был изолирован штамм IPA7.2, способный расти на безазотистой синтетической среде. Биохимическое исследование показало возможность культивирования данных бактерий на малате, глюкозе, сахарозе, мальтозе, лактозе и маните в качестве источников углерода. Тесты на активность каталазы и оксидазы дали положительный результат. Бактерии штамма IPA7.2 были подвижны в среде Пешкова, а при микроскопировании препаратов «раздавленной капли» – способны к плаванию в жидких питательных средах. Электронная микроскопия показала, что клетки IPA7.2 имеют форму слегка вытянутых изогнутых палочек с длиной клеток примерно 1,5 мкм и шириной – 0,7 мкм. Из клеток штамма IPA7.2 было выделена ДНК. Методом ПЦР был наработан ген 16S рРНК, секвенирование которого показало 99,5% идентичность с типовым штаммом Ochrobactrum lupine LUP21 и 99,3% с типовым штаммом Ochrobactrum cytisi ESC1, являющихся, в свою очередь, симбионтами люпина белого (Lupinus albus L.) и ракитника венечного (Cytisus scorparius (L.) Link). Таким образом, бактерии, выделенные из ризосферы картофеля, по анализу последовательности нуклеотидов гена 16S рРНК отнесёны нами к роду Ochrobactrum. В дальнейшей работе планируется более точное видовое определение штамма Ochrobactrum sp. IPA7.2.

Большой интерес представляется оценка способности выделенного штамма стимулировать рост и развитие растений картофеля, что в случае положительного результата позволит использовать данные бактерии в различных агробиотехнологиях выращивания ценной сельскохозяйственной культуры.

ХРАНЕНИЕ И СТРАТИФИКАЦИЯ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА IN VITRO

Азарова А.Б., Шестибратов К.А., Лебедев В.Г. Филиал ФГБУН Института биоорганической химии им. акад. М.М.Шемякина и

Ю.А.Овчинникова РАН, Пущино, Россия

[email protected]

В России существует проблема посадочного материала плодовых и декоративных культур, примерно 70% ввозится из стран ЕС. Большая часть ввозимого посадочного материала производится с использованием методов клонального микроразмножния. Спрос на посадочный материал в нашей стране неравномерный в течение года, существует потребность в хранение продукции. При адаптации древесные культуры часто впадают в покой и не получается достичь стандартного товарного вида.

В данной работе мы использовали низкие положительные температуры для сокращения затрат при культивировании, для улучшения качества посадочного материала. Депонирование культур in vitro при пониженной температуре обеспечивает возможность быстрого восстановления любого сорта, утраченного вследствие возникновения сомаклональных изменений или контаминации.


6

Нами установлено, что значение имеет стадия, на которой растение переносится в холод. Так, например, травянистые культуры (нивяник, эхинацея, примула) при депонировании на стадии мультипликации некротизируют в течение месяца, а при переносе на стадии укоренения сохраняют жизнеспособность в течение 3 и более месяцев. Большинство древесных культур (сирень, рододендроны, боярышник) сохраняют жизнеспособность более года при депонировании на любой стадии.

При адаптации древесных культур (сирень, алыча, береза), укорененных в условиях in vitro, растения часто впадают в состояние покоя. Предварительная холодовая стратификация позволяет частично решить данную проблему. Так, выдерживание микрорастений сирени сорта Анна Шиач при +10°С в течение месяца позволяло увеличить долю растений с приростом с 70 до 90%.

Изучая стратификацию, адаптированных растений in vitro было показано, что выдерживание растений в течение месяца при пониженных температурах, уже позволило вывести их из покоя, и растения давали прирост. Было замечено, что длительность стратификации повлияла на пробудимость боковых побегов, так на сорте алычи Злато Скифов только 40% растений давали боковые побеги после месяца стратификации, а при стратификации в течение 5 месяцев уже все растения были с боковыми побегами. Жизнеспособность растений снижалась со временем стратификации. Для лимонника стратификация это практически единственный способ стимулировать рост побегов. Не более 10% растений дают прирост без переноса в холодильные камеры.

Мы продемонстрировали возможность разнообразного применения стратификации на стадиях микроклонального размножения, что может улучшить качество посадочного материала и уменьшить влияние сезонности на производство растений in vitro.

БИОСИНТЕЗ ИЗОЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МУТАНТНЫХ И РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ

ДРОЖЖЕЙ YARROWIA LIPOLYTICA

Аллаяров Р.К., Моргунов И.Г. ФГБОУ ВПО Пущинский государственный естественно-научный институт;

ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН, Пущино, Россия

[email protected]

В последние годы усилиями нескольких научных коллективов (ИБФМ РАН, ФМБА России и ИТЭБ РАН) получены данные, что изолимонная кислота (ИЛК) обладает гепатопротекторным, актопротекторным и антигипоксическим действием и может быть использована в качестве основы лекарственных средств для спортивного питания. Узким местом на пути внедрения этого простого и нетоксичного препарата является отсутствие не только в России, но и в мире производства ИЛК, а также дороговизна препарата. С 1980 года, компания Sigma-Aldrich производит небольшое количество монокалиевой соли ИЛК из сока растения Sedum spectabile и продает по цене $ 704 за 1 г.

Целью настоящей работы явилась разработка способа микробиологического получения ИЛК с помощью мутантных и рекомбинантных штаммов дрожжей Yarrowia lipolytica.

Проведена серия работ по получению мутантных и рекомбинантных штаммов, способных к сверхсинтезу ИЛК с минимальным содержанием побочных продуктов и стойко сохраняющих это свойство. Получены мутанты, неспособные к росту на ацетате с измененной способностью к кислотообразованию, среди которых селекционирован продуцент 704-UV4-A/NG50 с эффективностью биосинтеза ИЛК на 40% выше, чем у природного штамма. Проведено конструирование рекомбинантных штаммов – суперпродуцентов ИЛК путем суперэкспрессии гена ACO1, контролирующего синтез ИЛК. На основе мутантных и рекомбинантных штаммов разработаны способы получения ИЛК в ферментерах объемом 10 л; достигнуты высокие концентрации ИЛК в среде (до 90 г/л). Разрабатываемые процессы не имеют аналогов в Российской Федерации и в мире.


7

Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки России по государственному контракту № 14.512.11.0045 в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007 – 2013 годы».

ВЛИЯНИЕ БАКТЕРИЗАЦИИ СЕМЯН НА РЕДОКС-АКТИВНОСТЬ ПЛАЗМАЛЕММЫ ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩИХ КЛЕТОК В ПРИСУТСТВИИ

ФИТОПАТОГЕНА

Апёнышева М.В. ФГБОУ ВПО Национальный исследовательский Томский государственный

университет, Томск, Россия

[email protected]

Биологические препараты для подавления численности фитофагов и фитопатогенных микроорганизмов являются экологически безопасной альтернативой химическим пестицидам, так как разрабатываются на основе природных регуляторов численности вредителей и возбудителей болезней растений.

Целью работы являлось изучение влияния бактеризации семян на редокс-активность плазмалеммы фотосинтезирующих клеток кукурузы в присутствии фитопатогена.

Эксперименты проводили с использованием метода малых наземных экосистем. В качестве продуцентов использована кукуруза. В эксперименте использованы следующие варианты бактеризации: Pseudomonas fluorescens АР-33, Pseudomonas sp. В-6798, Ps. aureofaciens BS 1393. В качестве фитопатогена использован гриб Fusarium охysporum. Контролем служили растения, выращенные без бактериальной инокуляции как в условиях фитопатогенной нагрузки, так и без нее.

У растений в контрольном варианте в отсутствии фитопатогенной нагрузки наблюдается меньшая red-ox активность мембран, чем в присутствии патогенна. Это может объясняться усилением активности дыхательных ферментов. Известно, что интенсивность дыхания обычно повышается в результате инфицирования растения патогенном. Это сопровождается нарушением сопряжения окисления и фосфорилирования и возрастанием доли анаэробного дыхания, что снижает запасание энергии в виде АТФ и увеличивает рассеивание в виде тепла. Увеличение интенсивности дыхания, как правило, является защитной реакцией организма.

У бактеризованных Pseudomonas sp. В-6798 растений интенсивность дыхания в отсутствии патогенна, находится на уровне дыхания контрольных растений в присутствии фитопатогенной нагрузки. Можно предположить, что растениям как бы сообщается необходимость увеличения активности ферментной системы бактериями. При бактеризации растений Ps. aureofaciens BS 1393 дыхательная активность фотосинтетической ткани растений также несколько выше контрольных показателей, однако ниже, чем при бактеризации Pseudomonas sp. В-6798. В варианте с бактериями Ps. fluorescens AP-33 наблюдается самая низкая интенсивность дыхания, и именно в данном варианте наблюдается наибольшее ингибирование роста растений под действием фузариума.

ВЛИЯНИЕ ПЛОТНОСТИ КЛЕТОЧНОЙ ПОПУЛЯЦИИ НА УРОВЕНЬ ТРАНЗИЕНТНОЙ ЭКСПРЕССИИ АНТИТЕЛ

Аникина А.В., Черных Ю.С. ЗАО «Биокад», Санкт-Петербург, Россия

[email protected]

TGE (transient gene expression) – широко используемый в современной биотехнологии метод, позволяющий в сжатые сроки производить необходимые белки в культуре клеток животных. Для TGE широко применяются протоколы трансфекции с использованием поликатионных полимеров (полифекция), в частности, полиэтиленимина. Тенденцией последнего времени стало проведение подобных трансфекций на культурах с высокой клеточной плотностью (до 20*106кл/мл), что позволяет получать до 1 грамма антител в литре


8

культуры. Однако такой метод требует наработки большого количества клеточной массы, что зачастую бывает затруднительно.

Мы проанализировали возможность проведения транзиентных наработок антител при умеренно увеличенной клеточной плотности на момент полифекции – при 4*106кл/мл (стандартный протокол предполагает проведение полифекции при клеточной плотности 2*106кл/мл).

В работе были использованы модифицированная EBNA-1 (Epstein-Barr virus Nuclear AG1) клеточная линия CHO, и вектора для транзиентной экспрессии содержащие последовательности OriP вируса Epstein-Barr. Полифекция проводилась с использованием линейного полиэтиленимина 25кДа (LPEI). Клетки котрансфецировали 3-мя независимыми векторами, содержащими последовательности LC и HC IgG человека, а также красного флуоресцентного белка (RFP). Последний, использовали для оценки эффективности трансфекции, методом проточной цитофлуорометрии спустя 18–20 часов после трансфекции. Количество вносимого комплекса ДНК-LPEI было увеличено в 2 раза по сравнению со стандартным протоколом. Через 24 часа после трансфекции культуру разводили в 2 раза свежей питательной средой, т.о. восстанавливали исходные объем культуры и концентрацию клеток. Клетки культивировали в бессывороточной среде, в колбах на орбитальном шейкере, при 5% СО2. Титр антител определяли на приборе ForteBioOctetRed согласно рекомендациям производителя.

Анализ эффективности трансфекции показал, что при проведении полифекции при клеточной плотности 4*106 кл/мл доля RFP-позитивных клеток сопоставима с уровнем, получаемым при проведении процедуры по стандартному протоколу (50–56% против 55–70%). В тоже время существенно возрастала продукция антител. Увеличение продуктивности составляло в среднем 2,1 раза (1,6–2,6 раз, в зависимости от конкретного антитела).

Т.о., при транзиентной наработке белков, концентрация клеток при трансфекции является параметром, способным значительно влиять на продуктивность культуры. В частности, удвоение концентрации клеток СНО (до 4*106кл/мл) при полифекции приводило к возрастанию продукции антител в 2,1 раза, при прочих равных условиях.

ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ В ГИБРИДНУЮ КРЕМНИЙОРГАНИЧЕСКУЮ ЗОЛЬ-ГЕЛЬ МАТРИЦУ УКСУСНОКИСЛЫЕ БАКТЕРИИ GLUCONOBACTER

OXYDANS КАК ОСНОВА БИОСЕНСОРА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПИРТОВ

Афонина Е.Л., Каманина О.А., Рогова Т.В. ФГБОУ ВПО Тульский государственный университет, Тула, Россия

[email protected]

Иммобилизованные живые клетки микроорганизмов широко используются в различных биотехнологических процессах, в аналитических приборах при формировании биорецепторных элементов биосенсоров. В последнее десятилетие стремительно развивается метод иммобилизации биоматериалов, прежде всего ферментов, в кремнийорганические золь-гель матрицы. Благодаря своим свойствам эти матрицы могут применяться для иммобилизации целых клеток при создании гетерогенных биокатализаторов.

Целью работы являлось создание стабильных гетерогенных биокатализаторов путем инкапсулирования уксуснокислых бактерий Gluconobacter oxydans ВКМ В-1280 в золь-гель матрицы на основе тетраэтоксисилана (ТЭОС), метилтриэтоксисилана (МТЭС) и полиэтиленгликоля. В работе исследовали влияние концентрации гидрофобной добавки МТЭС на свойства гетерогенных биокатализаторов, которые определяются структурой и свойствами золь-гель матрицы, и физиолого-биохимическое поведением иммобилизованных микроорганизмов. Для исследования свойств иммобилизованного биоматериала использована биосенсорная установка амперометрического типа, интегрированная с персональным компьютером. В качестве аналитического сигнала, характеризующего иммобилизованный биокатализатор, использовали дыхательную активность уксуснокислых бактерий в присутствии этилового спирта. Сравнительный анализ характеристик биосенсоров на основе созданных гетерогенных биокатализаторов с разным содержанием гидрофобной добавки показал, что увеличение доли МТЭС в составе матрицы до 50% повышает окислительную


9

способность бактерий, что влечет за собой увеличение коэффициента чувствительности(118±3 нА*дм3/мин*моль) и уменьшение предела обнаружения(0,003 мкмоль/дм3). Долговременная стабильность составила от 6 до 9 суток, а относительное стандартное отклонение – 0,5%.

Работа выполнена в рамках Государственного Задания Минобрнауки РФ и гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых – кандидатов наук, заявка № МК-330.2014.4.

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СОРТОВ ALOPECURUS PRATENSIS L. (POACEAE)

Ахмедов Р.Б., Нам И.Я., Заякин В.В. ФГБОУ ВПО Брянский государственный университет им. академика И.Г.Петровского,

Брянск, Россия

[email protected]

Молекулярно-генетический анализ с использованием метода ISSR-PCR – один из наиболее современных и информативных подходов для определения молекулярно-генетического разнообразия и паспортизации сортов культурных растений. Основа данного метода состоит в сравнении полиморфизма длин фрагментов ДНК, находящихся между микросателлитными повторами. Alopecurus pratensis является высокопитательным кормовым злаком с высокой скороспелостью, что определяет его ценность для животноводства и интерес для селекционной работы.

Исследования проводились на образцах ДНК, полученных из отдельных зерновок 4 сортов лисохвоста лугового: Донской 2, Обский, 1/5, 3/3. ДНК выделяли с использованием лизирующего СТАВ-буфера, денатурирующей смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24/1) и осаждающего агента – этанола (96%). Концентрацию ДНК определяли методом спектроскопии в УФ-области.

После выделения ДНК проводили экспериментальный подбор ISSR-праймеров из раннее выбранных путем анализа литературных данных: IS1, IS2, IS3, IS4, IS5, IS6, UBC810, U840, HB12, B4. Для экспериментального подбора ISSR-праймеров проводили ПЦР по следующей температурной схеме:

1. первичная денатурация – 94°С – 4 мин.; 2. денатурация – 94°С – 35 сек. – 37 циклов; 3. отжиг – 30 сек. – 37 циклов, (оптимальную температуру отжига для каждого праймера

определяли экспериментально); 4. элонгация – 72°С – 2 мин. – 37 циклов; 5. финальный синтез – 72°С – 4 мин. После амплификации проводили электрофоретическое разделение продуктов реакции в 2%

агарозном геле в ТВЕ-буфере. В ходе исследования были выбраны 4 ISSR-праймера (IS3, IS6, UBC810, B4) для

проведения молекулярно-генетического анализа. В дальнейшем данные праймеры будут использованы для установления уровня генетического полиморфизма и паспортизации сортов лисохвоста.

БИОХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ИСКУССТВЕННЫХ МАТРИЦ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ГЕПАТОЦИТОВ

Белините М.А., Ахмадеева Л.А., Фаттахова А.Н. ФГАОУ ВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия

[email protected]

Цель работы - установить эффективность культивирования гепатоцитов на матрицах из модифицированного ионно-лучевым методом стекла.

Материалы и методы. Проводили выделение гепатоцитов мыши по известной методике. Культивировали клетки на модифицированном стекле в течение 5 дней с разным временем обработки. Анализировали рост клеток с помощью светового инвертированного микроскопа


10

при увеличении 20 и 40. Разрушали гепатоциты ультразвуком для дальнейшего изучения белков методом электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях. Анализ концентрации белков проводили с помощью прибора NanoDrop 2000.

Результаты. После 5 дней культивирования обнаружили, что количество клеток, выросших на модифицированном стекле значительно выше, чем на контрольном стекле. Кроме того, на 3 сутки клетки начинают образовывать агрегаты. Следует отметить, что гепатоциты на модифицированном стекле имели нормальную для этого типа клеток конфигурацию. Матрица на основе модифицированного стекла экологически безопасна, не требует дорогих методов стерилизации. Установили, что на стеклах, обработанных в течение 30 минут, клетки растут значительно лучше, чем на стеклах, обработанных 5, 10 и 20 минут. Обнаружили, что белки с молекулярной массой 40 кДа содержатся в большей концентрации в гепатоцитах, культивированных на стеклах с периодом обработки 30 минут.

Заключение. Проведенное исследование позволило сделать вывод об эффективности культивирования гепатоцитов на стекле, модифицированном ионно-лучевым методом. Полученные результаты представляют большой интерес для разработки новых технологичных и недорогих субстратов для культивирования клеточных культур для целей медицины и биотехнологии.

ИЗУЧЕНИЕ АДАПТОГЕННЫХ СВОЙСТВ РАСТЕНИЙ, ПРОДУЦЕНТОВ ЭКДИСТЕРОИДОВ, С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИКРОБНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ

Безматерных К.В.1, Володин В.В.2, Володина С.О.2, Смирнова Г.В.1, Октябрьский О.Н.1

1ФГБУН Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь; 2ФГБУН Институт биологии Коми НЦ УрО РАН, Сыктывкар, Россия

[email protected]

Одним из классов биологически активных веществ растительного происхождения являются фитоэкдистероиды, которые способны оказывать положительное влияние на обменные процессы в организме животных и человека, повышая устойчивость к различным стрессовым воздействиям. На основе экстрактов растений, богатых экдистероидами, созданы препараты, обладающие адаптогенными свойствами. К ним относится экдистероидсодержащая субстанция Серпистен, разработанная коллективом лаборатории биохимии и биотехнологии ИБ Коми НЦ УрО РАН. Серпистен представляет собой смесь 20-гидроксиэкдизона (20Е) и инокостерона (In). В комплексе исследований воздействия экдистероидов на организм человека представляется необходимым изучение влияния этих соединений на микробиоту человека, имеющую важное значение для физиологии и иммунитета организма.

Адаптогенный эффект экстрактов серпухи венценосной и пажитника сенного, а также Серпистена и 20Е на бактерии Escherichia coli изучали при действии антибиотиков разных классов, определяя скорость наступления лизиса, способность к образованию колоний и МИК антибиотика. Показано, что присутствие экстрактов серпухи и пажитника в среде культивирования повышало МИК для антибиотиков стрептомицина, канамицина и цефотаксима, но не оказывало значительного влияния на МИК для ципрофлоксацина. Серпистен и 20Е не изменяли МИК для всех антибиотиков. В тесте на способность к образованию колоний экстракты серпухи и пажитника не влияли на действие ципрофлоксацина, а Серпистен и 20Е производили слабый протекторный эффект. Устойчивость бактерий к цефотаксиму не изменялась в результате добавления Серпистена и 20Е, экстракт пажитника повышал количество колонии образующих единиц (КОЕ) в 32 раза при дозе цефотаксима 5 мкг/мл и в 7,7 раз при дозе антибиотика 10 мкг/мл. При воздействии канамицина экстракт серпухи увеличивал КОЕ в 1,5 раза. В наибольшей степени модифицирующее влияние исследуемых субстанций на КОЕ проявлялось при действии стрептомицина. Серпистен и 20Е полностью предотвращали гибель клеток после добавления этого антибиотика. При высокой дозе стрептомицина все исследуемые субстанции значительно (до 100 раз) снижали гибель бактерий.

Таким образом, наибольший протекторный эффект от действия различных антибиотиков в микробных тестах демонстрировали экстракты серпухи и пажитника. Серпистен и 20Е


11

оказывали выраженное защитное действие только в случае стрептомицина и слабое – в случае ципрофлоксацина.

Исследования поддержаны грантами № 12-И-4-2072, № 14-04-96031, № 14-4-НП-126.

ВЛИЯНИЕ ТРЕХМЕРНЫХ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА ОРГАНИЗАЦИЮ СОКРАТИТЕЛЬНОГО АППАРАТА КАРДИОМИОЦИТОВ

Бильдюг Н.Б., Юдинцева Н.М. ФГБУН Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия

[email protected]

Работа посвящена изучению организации сократительного аппарата кардиомиоцитов (КМЦ) при их культивировании в трехмерных условиях. Известно, что при переводе КМЦ в монослойную культуру происходит обратимое преобразование типичных миофибрилл в структуры немышечного типа. Причины таких перестроек неизвестны. Ранее нами было показано, что при культивировании КМЦ на отдельных белках внеклеточного матрикса (ВКМ), а также на матриксе, синтезированном другими КМЦ, происходит сокращение периода нахождения их сократительного аппарата в перестроенном состоянии. Однако непрерывного поддержания миофибриллярной организации не наблюдается. Мы предположили, что для сохранения сократительного аппарата КМЦ в исходном состоянии в процессе их культивирования помимо наличия внеклеточного матрикса может быть существенна его трехмерная организация.

Работу проводили на кардиомиоцитах, полученных из желудочков сердец новорожденных крыс. Кардиомиоциты культивировали в течение 3 недель в трехмерных гелях на основе коллагена I типа, который является основным компонентом ВКМ нормального сердца. С помощью метода непрямой иммунофлуоресценции мы показали, что на всех сроках культивирования КМЦ в гелях сохраняется миофибриллярная организация их сократительного аппарата. Полученные данные соответствует нашим предположениям о том, что трехмерные условия являются более подходящими для поддержания естественного состояния кардиомиоцитов в культуре. Однако, несмотря на сохранение типичной организации сократительного аппарата и жизнеспособность КМЦ в гелях, мы не наблюдали спонтанных сокращений в культуре. Мы предполагаем, что важным фактором может являться конечная концентрация коллагеновых гелей, а также отсутствие в гелях механического натяжения. Эти предположения планируется проверить в ходе дальнейшей работы.

СОЗДАНИЕ ГИБРИДНЫХ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ НА ОСНОВЕ VP6 И VP8 РОТАВИРУСА ЧЕЛОВЕКА ГРУППЫ А И ИЗУЧЕНИЕ ИХ

АНТИГЕННОСТИ

Богомолова Е.Г., Федорова Е.А. ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых

биопрепаратов» ФМБА России, Санкт-Петербург, Россия

[email protected]

По данным ВОЗ практически каждый ребенок в течение первых 5 лет жизни переносит ротавирусный гастроэнтерит, являющийся причиной около 450000 смертей детей ежегодно, особенно в развивающихся странах. В России заболеваемость ротавирусной инфекцией постоянно растет, что объясняется увеличением числа случаев инфицирования и совершенствованием способов диагностики. Существующие вакцины для профилактики заболевания основаны на живых аттенуированных штаммах ротавируса человеческого и/или животного происхождения, размножающихся в кишечнике человека. Использование вакцин на основе рекомбинантных белков позволяет избежать рисков, связанных с введением вируса в организм, пусть и аттенуированного.

Целью данной работы было создание 2 белков – Rota и RotaFliC и определение их антигенности. RotaFliC включает участки белков VP6 и VP8 ротавируса А и компоненты флагеллина Salmonella в качестве адъюванта, соединенные гибкими мостиками. Белок Rota


12

содержит перечисленные элементы, кроме компонентов флагеллина. Представленные фрагменты являются консервативными частями белков VP6, VP8, к которым в процессе естественной инфекции образуются специфические антитела, перекрестно реагирующие с гомологичными эпитопами различных штаммов ротавирусов А, B и C. Использование эпитопов нескольких белков позволяет увеличить эффективность вакцины, а использование гибких мостиков – сохранить правильную пространственную укладку белка, обеспечивающую полноценное функционирование каждого эпитопа.

Аминокислотные последовательности смоделированных белков были переведены в нуклеотидные и оптимизированы для экспрессии в клетках E.coli. Синтез генов rota и rota-flic осуществляли методом ПЦР с использованием перекрывающихся олигонуклеотидов, синтезированных химическим методом с помощью синтезатора ДНК ASM-800. Полученные гены клонировали в экспрессирующий вектор pET-28a(+). Созданы штаммы на основе клеток E.coli DH10B/R для амплификации векторов pET-28a(+)-rota и pET-28a(+)-rota-flic. Для экспрессии гибридных рекомбинантных белков создали штаммы-продуценты на основе E.coli BL21 (DE3). Подобран оптимальный протокол индукции экспрессии гибридных генов с использованием 0,2% лактозы (по Штудиеру). С помощью металлоаффинной хроматографии получены очищенные препараты белков Rota и Rota-FliC. В настоящий момент изучаются их антигенные свойства путем иммунизации самок мышей линии BALB/с и последующей оценки титра антител на вводимые белки. Планируется провести исследование протективности полученных белков.

ОПТИМИЗАЦИЯ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МАГНИТОТАКТИЧЕСКОЙ БАКТЕРИИ

MAGNETOSPIRILLUM SO1

Бурганская Е.И., Дзюба М.В. ФГБУН Центр «Биоинженерия» РАН, Москва, Россия

[email protected]

Магнетосомы – внутриклеточные магнитные структуры, синтезируемые магнитотактическими бактериями (МТБ) и представляющие собой наноразмерные кристаллы магнетита (Fe3O4) или грейгита (Fe3S4), покрытые липопротеиновой мембраной. Наличие однодоменного магнитного кристалла, малый разброс размеров и форм, низкая токсичность и наличие биосовместимой поверхности – мембраны магнетосом – обуславливают высокий биотехнологический потенциал этих бактериальных магнитных наночастиц (БМЧ). Во множестве исследований показана перспективность применения магнетосом в медицине: в качестве носителей для направленной доставки лекарств; контрастирующих агентов в МРТ; для терапии опухолей методом гипертермии и т.д. Основной проблемой применения магнетосом на практике является низкая и нестабильная продуктивность большинства штаммов и недостаточная разработанность методов культивирования МТБ.

Целью настоящего исследования являлся подбор оптимальной среды для роста штамма Magnetospirillum SO1 и синтеза магнетосом. Ранее нами было показано, что данный штамм является стабильным продуцентом БМЧ. Схему эксперимента по оптимизации протокола выращивания проводили с использованием метода анализа поверхности отклика. Было выявлено, что наибольшее влияние на рост оказывали следующие компоненты среды: источник углерода (карбоновые кислоты), питательные добавки (пептоны, гидролизаты, экстракты), источник азота (аммоний/нитраты). Наиболее значимым параметром для синтеза магнетосом являлась концентрация железа. Предложенная моделью оптимизированная среда содержала: 0.80 г/л натрия янтарнокислого, 1.00 г/л кукурузного экстракта, 0.10 г/л дрожжевого экстракта, 0.35 г/л нитрата натрия, 100 мкМ Fe3+. Далее был проведен эксперимент, в ходе которого сравнивали выход биомассы и магнетосом при культивировании SO1: (1) на оптимизированной среде, (2) на контрольной среде (FSM), использующейся для выращивания Magnetospirillum gryphiswaldense (3.00 г/л лактата калия, 3.00 г/л соевого пептона, 0.35 г/л нитрата натрия, 100 мкМ Fe3+), (3) на использовавшейся нами ранее среде для SO1 (0.50 г/л натрий янтарнокислого, 0.10 г/л дрожжевого экстракта, 0.35 г/л нитрата натрия, 100 мкМ Fe3+). Оптические плотности


13

(OD565) культуры на 3 день выращивания составили: 0.2; 0.17; 0.1; а выход магнетосом – 4.8 мг, 1.2 мг и 2.0 мг с литра культуры для сред (1), (2) и (3), соответственно.

Таким образом, предложена оптимальная среда для культивирования штамма Magnetospirillum SO1, обеспечивающая наибольший выход БМЧ.

ВЛИЯНИЕ МИНЕРАЛЬНОГО СОСТАВА СРЕДЫ И ТИПА УГЛЕВОДА НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ РЕГЕНЕРАЦИИ ПЕРСИКА

Вагапова Т.И.1,2, Сидорова Т.Н.2, Долгов С.В.1,2 1ФГБОУ ВПО Пущинский государственный естественно-научный институт; 2Филиал

ФГБУН Института биоорганической химии им. акад. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Пущино, Россия

[email protected]

Персик (Prunus persica) – одна из самых ценных плодовых культур. В мировом плодоводстве персик занимает второе после яблони место по объему производимой продукции. Однако в настоящее время существует большая угроза для культивирования косточковых плодовых культур, обусловленная наиболее опасным среди вирусных заболеваний – вирусом оспы сливы (Plum Pox Virus, PPV). PPV поражает все части растения, вызывает преждевременное опадение плодов. Ввиду практического отсутствия природных доноров устойчивости использование современных методов генной инженерии дает возможность значительно ускорить процессы создания устойчивых высокопродуктивных сортов персика. Но несмотря на это получение трансгенных сортов косточковых культур тормозится отсутствием надежных методик, способных обеспечить высокую частоту регенерации побегов из соматических тканей коммерческих сортов.

Одним из моментов, определяющих успех регенерации, является подбор минерального состава питательной среды. Индукцию каллусообразования осуществляли на питательной среде MS с добавлением 6-БАП и ИМК. Образовавшийся каллус помещали на среду регенерации. В наших экспериментах оценивали эффективность регенерации побегов из морфогенного каллуса подвоя «Bailey» на 5 средах: DKW, MS, N&N, QL, WPM. В результате исследований выявлено существенное преимущество среды MS при адвентивном органогенезе из морфогенного каллуса, частота регенерации составила 31,6%. Самая низкая частота регенерации наблюдалась на среде QL – 11,1%.

Подобрав оптимальный минеральный состав, мы перешли к изучению влияния вида и концентрации углевода на частоту регенерации из морфогенного каллуса. В экспериментах использовали сахарозу, глюкозу, мальтозу в концентрациях 10, 20, 30, 40, 50, 60 г/л. Наиболее интенсивно закладка меристематических очагов происходила на среде с сахарозой (30 г/л), где эффективность регенерации составила 30,0%. На мальтозе частота регенерации была минимальной из всех исследованных вариантов 2,8 – 7,9%.

В настоящее время продолжаются эксперименты по оптимизации гормонального состава питательной среды. Начаты исследования по агробактериальной и биобаллистической трансформации подвоя «Bailey» с применением выше описанной методики регенерации.

ARABIDOPSIS THALIANA С ИНТЕГРИРОВАННЫМ ГЕНОМ ФИТАЗЫ BACILLUS GINSENGIHUMI

Валеева Л.Р., Нямсурэн Ч. ФГАОУ ВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия

[email protected]

Фосфор – один из важнейших элементов в составе вирусов, клеток про- и эукариот. В почве фосфор в основном представлен нерастворимыми органическими соединениями – фитатами, тогда как содержание легкодоступных неорганических фосфатов неуклонно понижается. Многие почвенные микроорганизмы переводят органические фосфорные соединения в неорганические, секретируя внеклеточные фосфатазы. Растения не способны расщеплять органические соединения фосфора почв, что обусловливает проблему фосфорного


14

голодания, требующую поиска новых путей ее решения. Перспективным является использование ферментов микробного происхождения – фитаз, гидролизующих фитат с высвобождением неорганического фосфата и делающих фосфор доступным для растений.

Цель данной работы – получение модельных трансгенных растений Arabidopsis thaliana с интегрированным геном бактериальной фитазы phyCg Bacillus ginsengihumi. Трансформацию растений A. thaliana проводили с помощью бактерий Agrobacterium tumefaciens GV3101. В качестве вектора использовали плазмиду pCBK05 с химерной последовательностью ex::phyCg::His-tag, состоящей из сигнальной последовательности гена экстенсина AtExt3, гена фитазы phyCg и His-tag последовательности, находящихся в одной рамке считывания под контролем специфичного для корней A. thaliana индуцибельного промотора Pht1;2. Индукция промотора происходит в условиях дефицита фосфора. Также вектор содержал ген устойчивости к селективному гербициду BASTA. Трансформацию проводили маканием цветов в агробактериальную суспензию. Полученные от трансформированных растений семена высевали на полноценную питательную среду MS с добавлением BASTA и проводили селекцию проростков. В результате анализа трех поколений трансгенных растений были отобраны линии, гомозиготные по трансгенной вставке. Наличие трансгенной вставки в геноме растений было подтверждено с помощью ПЦР. Для экспрессии гена фитазы трансгенные растения выращивали на минеральной среде без добавления источника фосфора. Из общей РНК клеток корней трансгенных растений методом обратной транскрипции получали кДНК. Экспрессия модифицированного гена фитазы с последовательностью гена экстенисна на транскрипционном уровне была также подтверждена секвенированием продуктов амплификации кДНК гена фитазы.

Дальнейшее исследование трансгенных растений и активности модифицированной микробной фитазы, синтезируемой данными растениями, позволит выяснить влияние трансгенной вставки и фермента на морфологию и физиологию растительного организма.

СОЗДАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ НА ОСНОВЕ ОПУХОЛЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ И ПРОТИВОРАКОВОГО БЕЛКА

ЛАКТАПТИНА

Васькова А.А., Кулигина Е.В., Рихтер В.А. ФГБУН Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН,

Новосибирск, Россия

[email protected]

Одной из причин развития злокачественных опухолей является нарушение регуляции апоптоза, поэтому индукторы апоптоза раковых клеток рассматриваются в качестве возможных противоопухолевых препаратов. Одним из таких индукторов является пептид лактаптин, выделенный из молока человека. На основе лактаптина был сконструирован рекомбинантный аналог (RL2), который вызывает апоптотическую гибель ряда линий опухолевых клеток человека в культуре, а также подавляет рост перевиваемых опухолей мышей и человека и развитие метастазов. В настоящее время лекарственное средство на основе RL2 – «Лактаптин» прошло доклинические испытания.

Цель работы – повышение эффективности противоопухолевого действия Лактаптина путем разработки адресной доставки препарата в опухоль. Адресная доставка позволит увеличить специфичность действия Лактаптина и уменьшить терапевтическую дозу (за счет увеличения локальной концентрации препарата в опухоли), необходимую для достижения противоопухолевого ответа.

В качестве молекулярных адресных агентов выбраны опухолеспецифические пептиды, которые благодаря небольшому размеру имеют ряд преимуществ по сравнению с традиционно используемыми антителами: высокие коэффициенты проникновения в опухоль и низкую иммуногенность.

С помощью пептидной фаговой библиотеки в системе in vitro на культурах раковых клеток мыши (гепатоаденокарциномы-1 (ГA-1) и аденокарциномы легких (АЛ)) и в системе in vivo на мышиной модели перевиваемой опухоли ГА-1 (линия мышей A/Sn) были отобраны опухолеспецифические пептиды, экспонированные в составе поверхностного белка pIII


15

нитчатого бактериофага M13. Определены последовательности отобранных экспонированных пептидов. Среди отобранных клонов были выявлены два одинаковых (GLHTSATNLYLH и SGVYKVAYDWQH), которые встретились как в экспериментах in vitro, так и in vivo, причем в обоих случаях частота их встречаемости была наибольшей. Изучена возможность связывания двух отобранных фаговых клонов с другими опухолями в системе in vivo. Показано достоверное связывание обоих клонов с аденокарциномой легких (A/Sn), меланомой В16 (C57 Black), опухолью Кребса (C57 Black) и аденокарциномой легких Льюиса (CBA).

На основе отобранных опухолеспецифических пептидов и рекомбинантного аналога лактаптина RL2 были сконструированы две рекомбинантные плазмиды pet15B для продукции фьюжен-белков. Разработаны способы выделения и очистки фьюжен-белков.

Проверка цитотоксичности полученных фьюжен-белков показала, что они обладают дозозависимых эффектом снижения жизнеспособности раковых клеток молочной железы человека MCF-7 и MDA-MB-237.

ВЫДЕЛЕНИЕ ПЕРСПЕКТИВНЫХ КЛОНОВ РАСТЕНИЙ ОСИНЫ С РЕКОМБИНАНТНЫМ ГЕНОМ SP-XEG

Видягина Е.О., Ковалицкая Ю.А., Шестибратов К.А. Филиал ФГБУН Института биоорганической химии им. акад. М.М.Шемякина и

Ю.А.Овчинникова РАН; ФГБОУ ВПО Пущинский государственный естественно-научный институт, Пущино, Россия

[email protected]

Ксилоглюканаза – один из ферментов, который, гидролизуя ксилоглюк�

Documents

8 : 18 G. 1 - biology21.ru- Биофармацевтика - Биофизика и радиобиология - Биохимия - Математическая биология и