7/28/2019 774-1576-1-SM

1/9

Jayantidkk. : Isolasidanujitoksisitas

100

ISOLASI DAN UJI TOKSISITAS SENYAWA AKTIF DARI EKSTRAK

METILENA KLORIDA (MTC) LENGKUAS PUTIH (Alpinia galanga (L)Willd)

Nolika Wiji Jayanti1*

, Maria Dewi Astuti, Noer Komari , Kholifatu Rosyidah

1Program Studi Kimia Fakultas MIPA Universitas Lambung Mangkurat

ABSTRAK

Jayanti dkk., 2012. Isolasi dan uji toksisitas senyawa aktif dari ekstrak metilena klorida (MTC) lengkuas putihAlpinia galanga (L) Willd

Penelitian ini bertujuan untuk melakukan karakterisasi senyawa hasil isolasi ekstrak metilena klorida lengkuasputih,Alpinia galanga (L) Willd berdasarkan data spektra UV-Vis dan spektra IR, serta menentukan nilai LethalConcentration (LC)50senyawa aktif hasil isolasi. Pemisahan ekstrak metilena kloridamenggunakan kromatografikolom gravitasi (KKG) menghasilkan 220 vial yang digabung menjadi 12 fraksi gabungan (fraksi A-L). Uji BrineShrimps Lethality Test (BSLT) menunjukkan fraksi I berpotensi sebagai antikanker. Fraksi I dimurnikan lebihlanjut menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) preparatif hingga didapatkan 3 fraksi (I1, I2, dan I3). FraksiI1 dan I2 diuji kemurniannya dengan KLT tiga sistem eluen dan KLT dua dimensi, menghasilkan senyawamurni, I1 dan I2. Senyawa I1 didapat sebanyak 3,67 mg padatan berwarna kuning dan senyawa I2 didapatsebanyak 6,97 mg padatan berwarna putih. Spektra UV-Vis senyawa I1 menunjukkan adanya cincin aromatik.Spektra IR senyawa I1 menunjukkan adanya gugus OH, -C=O, -CH alifatik dan C-O. Senyawa I1 didugakuat sebagai senyawa flavonoid golongan flavon. Spektra UV-Vis senyawa I2 menunjukkan adanya kromofor -C=C yang tidak terkonjugasi. Spektra IR senyawa I2 menunjukkan adanya gugus CH alifatik, C=O, C=C danCO. Senyawa I2 diduga kuat golongan triterpenoid. Uji toksisitas dilakukan pada senyawa I2 dengan metodeBrine Shrimps Lethality Test (BSLT) diperoleh nilai LC50 sebesar 62,4979 ppm. Senyawa I2 berpotensi sebagaiantikanker.

Kata kunci :Alpinia galanga (L) Willd, flavonoid, triterpenoid

ABSTRACT

Jayanti et al., 2012. Isolation and Toxicity Test of Active Compounds From Methylene Chloride Extract OfWhite Galanga (Alpiniagalanga(L)Willd).

This study aimed to characterize the compounds isolated methylene chloride extracts of white ginger,Alpiniagalanga (L) Willd based on UV-Vis spectra and IR spectra, as well as determine the Lethal Concentration (LC)50 the isolation of active compounds. Separation of methylene chloride extracts using gravity columnchromatography (KKG) produced 220 vials are combined into 12 fractions combined (A-L fraction). BrineShrimps Lethality Test (BSLT) shows the fraction of the I potential as anticancer. Fraction I was purified furtherusing Thin Layer Chromatography (TLC) preparative to obtain three fractions (I1, I2, and I3). Fraction I1 and I2purity tested by TLC eluent system and three two-dimensional TLC, yielding pure compounds, I1 and I2compounds. Compound I1 obtained as much as 3.67 mg of yellow solid and I2 compound obtained as a whitesolid 6.97 mg. UV-Vis spectra of compounds I1 indicate the presence of aromatic rings. IR spectra ofcompounds I1 indicate the presence of-OH groups,-C = O, aliphatic-CH and-CO. Compound I1 is stronglysuspected as the flavone class of flavonoids. UV-Vis spectra indicate the presence of chromophore compoundsI2-C =C which is not conjugated. IR spectra of compounds indicate the presence of I2-CH aliphatic group,-C =O,-C =C and-C-O. I2 compounds allegedly triterpenoid group. Toxicity tests conducted on the compound by themethod of Brine Shrimps I2 Lethality Test (BSLT) LC50 values obtained at 62.4979 ppm. I2 potential asanticancer compounds.

Keywords :Alpinia galanga (L) Willd, flavonoids , triterpenoid

PENDAHULUAN

Tanaman mengandung senyawa aktif dalam

bentuk metabolit sekunder, seperti alkaloid, flavonoid,fenilpropanoid, steroid, triterpenoid, tanin, dankumarin (Adfa, 2005). Tanaman Alpinia galanga

(L)Willd merupakan anggota Zingiberaceae yangkaya senyawa metabolit sekunder. Tanaman ini

dikenal dengan nama laos atau lengkuas. Beberapa

penelitian sebelumnya melaporkan bahwa lengkuasmemiliki aktivitas antifungi, antitumor, analgetikum,antikembung (Matsuda et al., 2003), antiplasmid(Latha et al., 2009), antibakteri (Phongphaichit et al.,

2006) dan antioksidan (Mayachiew et al., 2008).Yasuhara et al. (2009) melaporkan bahwa senyawaasetoksicavikol asetat pada lengkuas memiliki

Korespondensi dialamatkan kepada yang bersangkutan :*E-mail : nolika_wj7@yahoo.com, noerkomari@yahoo.com

http://us-mg5.mail.yahoo.com/yab-fe/mu/MainView?.src=neo&themeName=fresh&bn=6745&s=0&isFresh=1&bucketId=0&stab=1350887574027http://us-mg5.mail.yahoo.com/yab-fe/mu/MainView?.src=neo&themeName=fresh&bn=6745&s=0&isFresh=1&bucketId=0&stab=1350887574027http://us-mg5.mail.yahoo.com/yab-fe/mu/MainView?.src=neo&themeName=fresh&bn=6745&s=0&isFresh=1&bucketId=0&stab=1350887574027http://us-mg5.mail.yahoo.com/yab-fe/mu/MainView?.src=neo&themeName=fresh&bn=6745&s=0&isFresh=1&bucketId=0&stab=1350887574027

7/28/2019 774-1576-1-SM

2/9

Chem. Prog. Vol. 5, No.2. November2012

101

aktivitas antitumor dan anti alergi. Asetoksikavikol

asetat (ACA) adalah salah satu senyawa kimia yangdiisolasi dari rimpang lengkuas yang memilikikeaktifan terhadap beberapa bakteri dan spesiesdermatofit (Azuma et al., 2005). Penelitian lainmelaporkan lengkuas memiliki potensi sebagai obatbagi pasien AIDS (Voravuthikunchai et al., 2005).

Penelitian uji toksisitas telah dilakukansebelumnya terhadap ekstrak rimpang lengkuas putih

dengan proses ekstraksi bertahap menggunakanpelarut n-heksana, metilena klorida (MTC), etil asetat,dan metanol. Hasil uji menunjukkan bahwa ekstrak

dari rimpang lengkuas putih bersifat aktif dalammengontrol perkembangbiakan larva udang Artemiasalina. Ekstrak paling aktif adalah ekstrak MTCdengan nilai Lethal Concentration (LC)50 sebesar40,49 ppm. Ekstrak n-heksana merupakan ekstrak

yang kurang aktif dibandingkan ketiga ekstrak lainnyadengan nilai LC50 sebesar 425,70 ppm. Ekstrak etil

asetat dengan nilai LC50 sebesar 194,53 ppm danekstrak metanol dengan LC50 sebesar 105,75 ppm

(Jayanti et al., 2010).Berdasarkan hasil penelitian tersebut, maka

dilakukan penelitian lanjutan terhadap rimpanglengkuas putih dari hasil ekstrak MTC. Ekstrak MTCdifraksinasi dan diisolasi dengan menggunakanberbagai metode kromatografi. Senyawa murnidikarakterisasi dengan spektrofotometri ultraviolet(UV), dan spektrofotometri inframerah (IR) serta

dilakukan uji toksisitas dengan metode BSLT (BrineShrimpLethality Test).

BAHAN DAN METODE

Bahan dan Alat

Bahan-bahan yang dipergunakan dalam

penelitian ini berkualitas analytical grade danlangsung dipergunakan tanpa pemurnian lebih lanjutyang meliputi 2-iodida thiopen, 4-iodida, N,N-dimetil

anilin, 5-metil-2-iodothiopen, paladium tersiertributilfosfin, gas argon, tetrahidrofuran, 1,4-diazabicyclo[2,2,2]octane (DABCO), pelat TLCsilika, etil asetat, diklorometan, heptan, heksan,metanol, serta akuades.

Alat-alat yang dipergunakan dalam penelitianini meliputi seperangkat alat gelas kimia standarseperti beker gelas, pipet tetes dan gelas ukur.Peralatan sintesis meliputi labu Schlenk 50 mL,syringe 5 mL, 10 mL dan 25 mL, rotary evaporator,labu vakum dan pompa vakum. Peralatan analisisyang meliputi NMR Bruker 500 MHz untuk 1H dan125 MHz untuk

13C dengan pelarut CDCl3, GC-MS

Shimadzu serta melting pointFischer Jones.

Isolasi Senyawa Aktif dari Ekstrak MTC

Lengkuas PutihProses pemisahan senyawa dilakukan dengan

menggunakan kromatografi kolom grafitasi (KKG)yang berdiameter 2,50 cm. Sebanyak 100,00 gram

silika gel G 60 dikeringkan dalam oven selama 1 jamdengan temperatur 100C. Kolom kaca (diameter 2,50cm) diisi dengan silika gel yang telah dipanaskan.Kolom silika dikemas dengan cara basah dandipadatkan. Setelah padat dilihat kolom terdapatkeretakan atau tidak. Ekstrak MTC dibuat impreg

dengan cara dilarutkan dalam 2,00 ml aseton,kemudian diteteskan ke dalam 2,00 gram silika gel 60diaduk sampai homogen dan kering. Impreg

dimasukkan di atas kolom KKG yang telah siap pakaikemudian diratakan. Elusi diawali dengan eluen nonpolar yaitu n-heksana kemudian elusi dilanjutkan

dengan kombinasi eluen dengan polaritas meningkatsesuai hasil KLT. Eluat yang dihasilkan kemudianditampung dalam vial berbeda sehingga akandihasilkan beberapa fraksi. Semua fraksi yangdiperoleh setelah proses elusi pada KKG diamatidengan KLT. Setiap fraksi ditotolkan pada plat KLTsesuai urutan. Penggabungan fraksi dilakukan

berdasarkan pola kromatogram KLT.

Uji Toksisitas Fraksi Menggunakan BSLTTelur udang ditetaskan ke dalam gelas piala

berisi air laut dan dilengkapi dengan aerator. Setelah

24 jam telur udang akan menetas menjadi larva udang.Larva udang yang baik digunakan untuk ujibioaktivitas adalah larva yang baru menetas (Rosyidah& Ariyani, 2009). Sebanyak 10,00 mg sampel

dilarutkan dalam 10,00 ml air laut. Bila sampel tidaklarut dapat ditambahkan 50,00 l tween-80. Darilarutan sampel tersebut 1000,00; 500,00; 50,00; 5,00

l dimasukkan ke dalam vial dan ditambahkan air lautsampai volumenya menjadi 1,00 ml, sehinggakonsentrasi larutan menjadi 1000, 100, 10, dan 1 ppm.Kemudian sebanyak 10 ekor larva udang dimasukkandalam setiap vial kemudian diamati selama 24 jam(Rosyidah & Ariyani, 2009). Setelah 24 jam, jumlahudang yang mati dihitung dan dianalisis menggunakanProgram analisis Probit Finney untuk menentukan

LC50 dengan selang kepecayaan 95%.

Pemurnian Fraksi AktifPemurnian fraksi aktif dari ekstrak MTC

dilakukan dengan menggunakan cara kromatografilapis tipis preparatif (KLT Preparatif) dengan eluenyang sesuai dengan metode seperti penentuan eluenuntuk KKG. Senyawa tunggal dari fraksi yang aktif,

dilakukan uji kemurnian. Uji kemurnian dilakukandengan KLT sampai tampak satu noda pada minimal

7/28/2019 774-1576-1-SM

3/9

Jayantidkk. : Isolasidanujitoksisitas

102

tiga sistem eluen. Selain itu, uji kemurnian juga

dilakukan dengan KLT dua dimensi yang apabilamurni akan menampakkan satu noda

Analisis spektrofotometri UV dan IR

Analisis spektra UV Vis menggunakanspektofotometer UV Shimadzu UV-pharmaSpec 1700dan analisis spektra IR menggunakan spektofotometerIR Buck Scientific Model 500.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Fraksinasi Ekstrak MTCFraksinasi ekstrak MTC lengkuas putih

dilakukan dengan menggunakan metode kromatografikolom gravitasi (KKG). Sebelum melakukanfraksinasi, dicari terlebih dahulu eluen yang sesuaidengan metode KLT. Eluen yang dicoba yaitu n-

heksana : MTC, n-heksana : etil asetat, n-heksana :metanol, MTC : etil asetat, MTC : kloroform dalam

berbagai perbandingan. Eluen n-heksana : etil asetat(8:2) memiliki pola pemisahan yang paling baikdaripada eluen lain karena memberikan noda

terbanyak dan terpisah baik serta jarak antar nodacukup terpisah. Eluen tersebutkemudian digunakansebagai fase gerak KKG. Sebelum proses elusi,ekstrak MTC terlebih dahulu diimpreg dengan silikagel G 60. Tujuan dari proses impregnasi adalah agar

sampel yang akan difraksinasi dapat tersebar dengan

homogen dan diharapkan hasil pemisahannya baik.Selanjutnya dilakukan proses fraksinasi menggunakan

KKG. Sebelumnya kolom harus dikemas terlebih

dahulu, ekstrak yang digunakan sebanyak 1,00 gram,oleh karena itu digunakan kolom dengan diameter 2,5

cm.Proses elusi dilakukan dengan metode

bergradien, sehingga elusi diawali dengan eluen

tunggal n-heksana yang bersifat non polar kemudiandivariasi dengan eluen yang lebih polar. Fase gerakdibiarkan mengalir melalui kolom yang disebabkan

oleh gaya dorong gravitasi, dimana pita senyawaterlarut akan bergerak dengan laju yang berbeda,memisah dan dikumpulkan berupa fraksi ketika keluardari kolom (Gritter, 1991). Fraksi yang diperolehditampung dalam botol vial yang telah diberi nomor

secara berurutan dan diperoleh sebanyak 220 vial.dimana pemantauan noda yang dilakukanmenggunakan KLT menghasilkan 12 fraksi.

Berdasarkan pola kromatogram KLT tersebut, maka

vial 2-23 dapat digabungkan sebagai fraksi A (26,3mg), vial 24-61 sebagai fraksi B (1,8 mg), vial 62-86sebagai fraksi C (4,3 mg), vial 88-105 sebagai fraksi D(6,2 mg), vial 106-112 sebagai fraksi E (10 mg), vial

113-146 sebagai fraksi F (200 mg), vial 147-164sebagai fraksi G (10 mg), vial 165-173 sebagai fraksiH (50 mg), vial 174-182 sebagai fraksi I (340 mg),vial 183-193 sebagai fraksi J (10 mg), vial 194-205sebagai fraksi K (53 mg), vial 206-220 sebagai fraksi

L (20 mg). Kromatogram KLT fraksi gabungan hasilKKG dapat dilihat pada Gambar 1.

Gambar 1. Kromatogram KLT fraksi gabungan A-L hasil KKGdengan eluen n-heksana : etil asetat (6 : 4)

Masing-masing fraksi gabungan tersebutkemudian diuji toksisitasnya menggunakan metodeBSLT (Brine Shrimps Lethality Test). Fraksi yangnilai toksisitasnya paling tinggi selanjutnya akan

dimurnikan

Uji Toksisitas Fraksi Menggunakan BSLT

Kemampuan mematikan larva udang dapatdigunakan sebagai uji pendahuluan yang cepat dan

sederhana untuk mengetahui bioaktivitas suatu

senyawa secara in vivo (Kristanti et al., 2004).Kisarankonsentrasi fraksi yang dapat memberikan efek toksikyaitu konsentrasi yang dapat menyebabkan kematiansebesar 50% dari jumlah hewan uji setelah 24 jam

perlakuan, yang disebut sebagai LC50. Jumlah larvaudang yang mati dihitung dan dianalisis menggunakanprogram analisis Probit Finney untuk menentukan

LC50. Setiap sampel diuji dalam tiga kali ulangan.Fraksi-fraksi yang didapatkan dilakukan uji toksisitas

dengan menggunakan metode BSLT. Berdasarkan

7/28/2019 774-1576-1-SM

4/9

Chem. Prog. Vol. 5, No.2. November2012

103

massa fraksi yang dihasilkan, maka yang dapat

dilakukan uji toksisitas adalah fraksi A, fraksi E,

fraksi F, fraksi G, fraksi H, fraksi I, fraksi J, fraksi K,

dan fraksi L.

Tabel 1. Hasil uji pendahuluan fraksi aktif terhadap larvaArtemiasalina.

No Fraksi LC50 (ppm) Keterangan123

456789

AEF

GHIJKL

293,887369,256208,630

231,27820,44841,61472,27257,77170,686

AktifAktifAktif

AktifAktifAktifAktifAktifAktif

Berdasarkan Tabel 1 diketahui bahwa semuafraksi aktif terhadap uji BSLT dengan nilai LC50