UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

DECANATO

PROYECTO DE TESISTTULO:Efecto inhibitorio in Vitro a diferentes concentraciones del extracto metanlico de Caesalpinia spinosa (Taya) sobre Leishmania braziliensis peruviana

AUTOR (es):Rmulo Aycachi Inga

Juan Jos Augusto Moyano Muoz

PATROCINADOR:Mblga. M. Teresa Silva Garca

APROBADO POR:

PRESIDENTE DEL JURADOMIEMBRO SECRETARIO

MIEMBRO VOCALJEFE CENTRO INVESTIGACIN

JEFE DEPARTAMENTODECANO

Lambayeque, 22 de abril de 2008.UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGIAS

DECANATO

I. GENERALIDADES:

1. TTULO: Efecto inhibitorio in Vitro a diferentes concentraciones del extracto metanlico de Caesalpinia spinosa (Taya) sobre Leishmania braziliensis peruviana

2. PERSONAL INVESTIGADOR:

2.1. Autores: Est. Rmulo Aycachi Inga

Est. Juan Jos A. Moyano Muoz

2.2. Patrocinador: Mblga. M. Teresa Silva Garca3. CARRERA PROFESIONAL/ESPECIALIDAD: Carrera Profesional de Biologa

Especialidad de Microbiologa y Parasitologa

4. TIPO DE INVESTIGACIN:4.1. De acuerdo al fin que persigue : Aplicada

4.2. De acuerdo a la tcnica de contrastacin: Explicativa

5. RGIMEN DE INVESTIGACIN: Libre6. LUGAR DE EJECUCIN: Laboratorio de Microbiologa y Parasitologa U.N.P.R.G. Lambayeque.

7. DURACIN ESTIMADA: 7 meses8. FECHAS DE INICIO Y TERMINACIN:

8.1. Inicio : 22 de enero de 2008.

8.2. Terminacin : 30 de setiembre de 2008.

9. CRONOGRAMA DE TRABAJO:ACTIVIDADES2008

EFMAMyJJlAS

FASE DE PLANEAMIENTO

Revisin BibliogrficaXX

Elaboracin del proyectoXX

Aprobacin del proyectoX

Implementacin del proyectoXX

FASE DE EJECUCION

Recoleccin de muestrasXX

Procesamiento de muestrasXX

Registro de datosXX

Anlisis estadstico de datosXX

FASE DE COMUNICACIN

Anlisis e interpretacinXX

Elaboracin del informe finalXX

Presentacin del informe finalX

10. RECURSOS DISPONIBLES:

10.1. Personal: Personal docente y administrativo de la Facultad de Ciencias Biolgicas U.N.P.R.G. Lambayeque.

Personal de servicio tcnico del Laboratorio de Microbiologa y Parasitologa U.N.P.R.G. Lambayeque.

10.2. Equipos e Instrumentos:

EQUIPOSMARCA

Autoclave Vertical Mod. 415FANEM

EstufaTHELLO PRECISION

HornoTHELLO PRECISION

RefrigeradoraFAEDA

Balanza DigitalEXCELL

CentrfugaMANN

Hornilla ElctricaSURGE

Microscopio binocularZEISS PRIMO STAR

Pipeta Automtica 10 - 100 LBRAND

Computadora de EscritorioTOSHIBA

Cmara DigitalCANON

MATERIALESMARCA

Placas de PetriPIREX

Tubos de ensayo tapa roscaPIREX

Matraz ErlenmeyerPIREX

BalonesPIREX

Pipetas de 1 mL y 10 mLPIREX

EmbudoPIREX

VialesPIREX

LminasWHELL BRAND

LaminillasWHELL BRAND

10.3. Materiales y Reactivos:

MATERIALMARCA

Medio Novy McNeal NicolleMERCK

Solucin Salina FisiolgicaLUSA

PenicilinaLAB. MEDROCK

StreptomicinaLAB. MEDROCK

LidocanaSHERFARMA

Metanol comercial (CH3OHCl)MERCK

Alcohol de 70LAB. C y R AKY

Colorante de GiemsaMERCK

Aceite de CedroMERCK

Agua OxigenadaLAB. ALKOFARMA

Agujas hipodrmicas descartables N 21 y 25. TERUMO

Jeringas descartables de 1, 5 y 10 mLTERUMO

Cmara de NeubauerMARIENFELD

LancetaTERUMO

AlgodnCKF INDUSTRIAL

Pinzas

Papel Watman N 3

Gotero

Soporte de Tincin

10.4. Local:

Laboratorio de Microbiologa de la Facultad de Ciencias Biolgicas.11. PRESUPUESTO:Bienes .S/. 950. 00

Material de escritorio .S/. 100. 00

1 millar de papel Bond

25 unid. de flderes Manila

4 lapiceros, 2 plumones indelebles, 2 correctores, 2 resaltadores, 2 borradores

Material de laboratorio ...S/. 600. 00

50 unid. Tubos de ensayo tapa rosca

3 matraces, 3 fiolas

1 caja de lminas porta y cubre objetos

1 lb. de agar agar

5 lb. De medio NNN

Penicilina

Streptomicina

Lidocana

Material para procesamiento de datos.S/. 250. 00

1 memoria USB Kingstong 1 GB

01 caja de CD Room Princo

02 cartuchos tinta para impresora Canon iP1800

Servicios ....S/. 1500. 00

Pasajes y Subvenciones ..S/. 500. 00

1 viaje a Trujillo, 06 das

Viajes internos: Lambayeque Chiclayo Distritos (Inkahuasi, Salas)

Publicaciones ....S/. 200. 00

Publicacin de informacin final, 08 ejemplares

Pruebas Moleculares ..S/. 600. 00

Identificacin de sp. por PCR

Otros ...S/. 200. 00

Procesado de fotografas y Diapositivas

Imprevistos

TOTAL.S/. 2450. 00

12. FINANCIACIN:

Ser financiado por los responsables del trabajo de investigacin.II. PLAN DE INVESTIGACIN:1. REALIDAD PROBLEMTICA:

Leishmania braziliensis peruviana es un protozoario dimrfico, hemoflagelado, perteneciente a la familia Trypanosomatidae (orden Kinetoplastida), que junto con otras 20 especies en el mundo, son causantes de la enfermedad conocida como Leishmaniosis (Borda et. al., 2005; Arvalo et. al 2005). sta es una enfermedad crnica, de baja patogenicidad, alta morbilidad, metaxnica y zoontica que se caracteriza por comprometer piel, mucosas y vsceras dependiendo de la especie de Leishmania causante y de la respuesta inmune del husped. Esta protozoosis es transmitida por la picadura de un insecto flebotomino hembra del gnero Phlebotomus, en Europa, Asia y frica, y Lutzomyia en Amrica. La afinidad de este protozoario por los tejidos hace que se manifieste una reaccin inflamatoria caracterstica (Snchez et. al. 2004).La leishmaniosis cutnea y mucocutnea es una enfermedad de alta prevalencia en muchas reas tropicales y subtropicales del mundo. Descrita en 24 pases de Amrica, extendindose del sur de los Estados Unidos (Texas) hasta el norte de Argentina. Esta enfermedad constituye un grave problema de salud pblica por los altos costos que representa a nivel psicolgico, socio-cultural y econmico y es considerada, conjuntamente con la malaria, esquistosomiosis, filariosis, tripanosomiosis y hanseniosis, como una de las seis enfermedades tropicales de mayor importancia en el mundo (Ampuero, 2000; OPS, 1996).

En el Per la leishmaniosis constituye la segunda endemia de tipo tropical y es la tercera causa de morbilidad por enfermedades transmisibles luego de la Malaria y Tuberculosis, teniendo como zona endmica aproximadamente el 74% del rea total del pas, extendindose a travs de los Andes y los valles interandinos para la leishmaniosis cutnea y a las zonas de selva alta y selva baja en la leishmaniosis mucocutnea (MINSA, 2006; Ampuero, 2000).

Adems de los problemas en si de la enfermedad, estn tambin los problemas del tratamiento actual, por los efectos secundarios causados por los medicamentos utilizados en el tratamiento. Los antimoniales pentavalentes usados en el tratamiento de la leishmaniosis cutnea andina (Uta) y como primer tratamiento de la leishmaniosis mucocutnea (Espundia) a dosis elevadas y/o prolongadas puede causar nuseas, vmitos, prurito, fiebre, cefalea, mareos, insomnio, nerviosismo, shock pirognico, edema y herpes zster. Es tambin muy conocida su alta cardiotoxicidad y, a veces, acompaada de nefrotoxicidad. La anfotericina B, usado en caso de falla consecutiva del tratamiento con antimoniales en la leishmaniosis mucocutnea y en los casos de compromiso mucoso severo, es muy conocido por sus efectos colaterales, siendo los ms graves la aparicin de shock anafilctico, arritmias cardacas, falla heptica, mialgias y convulsiones (Rojas, et. al. 2005, MINSA 2006). Se conoce adems, que muchos pobladores usan para su tratamiento, ya sea por su desconocimiento u otro motivo, todo tipo de agentes corrosivos, estando entra los ms extremos el uso de polvo de pilas, cido de bateras, petrleo y aceite quemado.

2. PROBLEMA:

Tendr efecto inhibitorio in Vitro a diferentes concentraciones el extracto metanlico de Caesalpinia spinosa (Taya) sobre el crecimiento de Leishmania braziliensis peruviana?

3. HIPTESIS:

El extracto metanlico de Caesalpinia spinosa (Taya) tiene efecto inhibitorio in Vitro sobre el crecimiento de Leishmania braziliensis peruviana.

4. JUSTIFICACIN E IMPORTANCIA:

La leishmaniosis cutnea y mucocutnea es una enfermedad de alta prevalencia en muchas reas tropicales y subtropicales del mundo y es la segunda endemia de tipo tropical en el Per (74% del territorio nacional), razones que la convierten en una entidad de gran inters nacional (Ampuero, 2000). Es una enfermedad en la cual quedan an muchas interrogantes por resolver. No existe vacuna y para su tratamiento se usan an terapias de principios de siglo que consisten en saturar al cuerpo con inyecciones de antimonio. Adems, por las caractersticas geogrficas de la enfermedad (selvas y valles interandinos) est mas difundida en gente de bajos recursos econmicos, en la que adems de mermar su salud y economa, tambin causa indirectamente problemas psicolgicos (baja autoestima) por las deformaciones que genera.

La medicina tradicional o alternativa usa desde hace mucho tiempo diversos tipos de plantas para el tratamiento de una gran variedad de enfermedades. Para el tratamiento de Leishmaniosis por estos mtodos, se usan por ejemplo, de acuerdo a la zona, plantas tan diversas como maz, eucalipto, sbila, llantn, malva, matico, taya y muchos otros (Rojas et. al., 2005).

La Taya (Caesalpinia spinosa (Mol.) O. Kuntz), tambin conocida como Tara, es una leguminosa muy utilizada para estos fines, sobre todo en los departamentos de Amazonas, Cajamarca y San Martn (Basurto, 2003; Llatas, 2005). Esta planta muy utilizada en la actualidad en la industria por sus altas concentraciones de tanino y cido glico, es conocida adems por su alto poder astringente por coagular las albminas de las mucosas y de los tejidos, creando una capa aislante y protectora que reduce la irritacin y el dolor; por tal motivo son usados externamente para detener pequeas hemorragias locales; en inflamaciones de la cavidad bucal, catarros, bronquitis, quemaduras, hemorroides, e internamente contra la diarrea, enfriamiento intestinal, afecciones vesiculares, y como contraveneno en caso de intoxicacin por alcaloides vegetales. (De La Cruz, 2004; Quispe, 2006). Otras sustancias presentes en esta planta son el cido galotnico, pirocatecol, pirogalol, elgicos e hidrocoloides, tambin de mucha importancia (Lpez et.al. 1998).

Adems, el uso de medicamentos de origen qumico para el tratamiento de enfermedades como la Leishmaniosis ha demostrado un efecto cada vez ms comn, la saturacin farmacolgica, sobre todo en nios y personas de avanzada edad, que llegan a causar, en la mayor parte de los casos, efectos secundarios graves. Gran cantidad de cientficos han encontrado en el uso teraputico de flores, races, hojas y frutos de las plantas un valioso aliado, ya que ayudan, de forma contundente, a combatir todo tipo de trastornos sin que, por ello, aporten ningn tipo de contraindicacin o efecto nocivo para la salud, adems de ser un tratamiento econmico y de fcil acceso, sobre todo para la poblacin de bajos recursos. (Innatia, 2007).

5. OBJETIVOS:

Aislar e identificar Leishmania braziliensis peruviana de muestras clnicas.

Determinar el efecto inhibitorio del extracto metanlico de C. espinosa (taya) sobre L. braziliensis peruviana.

Determinar la concentracin mnima inhibitoria del extracto metanlico de C. espinosa (taya) sobre L. braziliensis peruviana.

6. ANTECEDENTES:

La leishmaniosis cutnea y mucocutnea es una enfermedad de alta prevalencia en muchas reas tropicales y subtropicales del mundo. En el Per constituye la segunda endemia de tipo tropical y la tercera causa de morbilidad por enfermedades transmisibles, luego de la malaria y al tuberculosis, teniendo como zona endmica aproximadamente el 74% del total del rea del pas (Ampuero, 2000; OPS, 1996; Torres y Barroeta, 1996).

Se usan diferentes esquemas teraputicos contra las diversas formas clnicas de leishmaniosis. Aunque muchas investigaciones coinciden en considerar a los antimoniales pentavalentes como las drogas ms efectivas, se usan adems otros medicamentos como: anfotericina B, licochalcone A, miconazol, isoniazida, dapsona, rifampicina, trimetoprim, sulfametoxazol e interfern gamma (Prez et. al. 2005). Estos tratamientos presenta tres dificultades fundamentales: 1. escases y alto costo de las drogas; 2. elevada toxicidad y 3. grandes diferencias en la respuesta individual, dependiendo de la especie de parsito involucrado y sobre todo del estado inmunolgico del hospedador. (Torres y Barroeda, 1996; Muoz y Pareja, 2003, Monzote et. al. 2004).

Muoz y Pareja. 2004, reportaron que en la actualidad en el Per, pobladores de la sierra y tribus selvticas como los Ashaninkas utilizan plantas con propiedades curativas contra la leishmaniasis, siendo de gran inters el valor de stas como fuentes de agentes medicinales debido a sus constituyentes qumicos , especficamente los metabolitos secundarios. Entre las plantas reportadas estn el tahuar (Tabebuia serratifolia), pin (Jatropa curcas), oj (Ficus insipida), barbasco (Lonchocarpus nicou), cedro (Cederla fissilis) y mito (Carica candicans).

Delorenzi et. al. en Monzote et. al. (2004) reportaron el efecto de un extracto de Pescheria australis frente a promastigotes de L. braziliensis en el cual obtuvieron un 30% de inhibicin del crecimiento al incubar los parsitos con 100 g/mL, sin embargo, al purificar el alcaloide indlico coronaridina obtuvieron un 97% de inhibicin del crecimiento de los promastigotes a una concentracin de 12.5 g/mL.

La maca, Lepidium peruvianum, es una Brassicaceae de los andes peruanos en la cual se ha determinado la presencia de alcaloides imidazlicos, benzil glocosinolatos, taninos, flavonoides y saponinas, compuestos, todos ellos, muy activos frente a Leishmania y a trofozoitos de Giardia intestinales. El efecto leishmanicida podra deberse a la presencia de isotiocianatos biolgicamente activos: benzil-isotiocianato y p-metoxibenzil isotiocianato (Li et. al. 2001); adems se ha demostrado que las concentraciones de dichos compuestos contenidos el L. peruvianum difieren entre ecotipos y seran las causas de las diferencias en el efecto leishmanicida (Alzadora et. al 2007).

La tara, Caesalpinia espinosa, es un rbol de hasta 5 m de alto cuyo hbitat abarca desde Venezuela hasta Bolivia. En el Per, desarrolla en forma silvestre o cultivada, en las lomas costeras y en los valles interandinos, entre 1,000 y 3,100 msnm. De esta Caesalpinaceae se obtiene el polvo de tara que contiene un gran porcentaje de taninos y adems cido tnico, cido glico y cido galotnico. Los taninos son sustancias que se producen en diversas partes de la planta, como son: corteza, frutos, hojas, races y semillas (Unten en Bazurto, 2006).

Los taninos tiene la propiedad de formar complejos con macromolculas, particularmente con las protenas; as forman enlaces colocndose entre las fibras de colgeno de la piel, emplendolos en medicina en tratamientos de escoriaciones y quemaduras de la piel donde las protenas forman una capa protectora antisptica bajo la cual se regeneran los tejidos, adems los preparados a base de drogas ricas en taninos, como las decocciones, se emplean para detener pequeas hemorragias locales; en inflamaciones de la cavidad bucal, catarros, bronquitis, hemorroides y otros (Siccha en Bazurto, 2006).

7. MATERIALES Y PROCEDIMIENTO:

7.1. Material: Una cepa de L. braziliensis peruviana identificada mediante Pruebas Moleculares identificadas en el Laboratorio del Instituto de Biologa Molecular de la F. CC. BB. U.N.P.R.G. Lambayeque.

Las vainas y hojas de C. espinosa (Taya) sern recolectadas en la comunidad de Chiribamba, distrito de Huambos (Regin Cajamarca).

En el laboratorio se proceder a seleccionar las mejores hojas y frutos, quedando aptos para su procesamiento.

7.2. Mtodos:

7.2.1. Poblacin y Muestra de Estudio:

La poblacin objeto de estudio estar representada por cepas de L. braziliensis peruviana.

La muestra estar constituida por una cepa de L. braziliensis peruviana enfrentada a cinco concentraciones de extracto metanlico de C. espinosa (Taya) (50, 100, 200, 400 y 800 mg/mL) y tres tipos de extracto (de hoja, semilla y hoja + semilla); haciendo un total de 15.

7.2.2. Tcnica e Instrumentos de Recoleccin de Datos:

Identificacin del Parsito (Ampuero, 2000):

Para identificar Leishmania braziliensis peruviana se realizarn los siguientes pasos:

Observacin Directa por Frotis de la Lesin: en la cual se confirmar la presencia del parsito.

Obtencin de la muestra:

1. Lavar la lesin con agua y jabn

2. Desinfectar con alcohol al 70% los bordes de la lesin.

3. Presionar con firmeza los bordes de la lesin hasta que empalidezca; en el borde interno, hacer una pequea incisin con hoja de bistur tratando de levantar la piel, secar la sangre con gasa y raspar el tejido.

4. Con el material obtenido en la hoja de bistur, hacer el frotis en una lmina, procurando que este sea delgado y evitando pasar dos veces por el mismo sitio.

5. Rotular la lmina y dejar secar al medio ambiente.

Procesamiento de la muestra:

1. Fijar la lmina que contiene el frotis con alcohol metlico durante 3 minutos. Descartar el alcohol y dejar secar a temperatura ambiente.

2. Cubrir la lmina con solucin de trabajo Giemsa (una gota de solucin Giemsa stock por cada mL de solucin buffer pH 7,2 7,4) por 30 minutos.

3. Descartar el colorante y lavar ligeramente con agua corriente.

4. Secar al medio ambiente y hacer la lectura con lente de inmersin. Obtencin de cultivos de L. braziliensis peruviana: la positividad de la prueba anterior nos permitir extraer con seguridad una muestra para la posterior obtencin de los cultivos de L. braziliensis peruviana, para esto se realizar el siguiente procedimiento: 1. Lavar la lesin con agua y jabn.

2. Desinfectar la zona elegida con alcohol al 70% y agua oxigenada.

3. Con una jeringa de tuberculina, la cual, ha sido cargada previamente con 0,2 mL de solucin salina estril con antibiticos, se punza y se inyecta el contenido suavemente dentro del rea decolorada de la ppula o dentro del margen no necrotizado de la lcera.

4. Enseguida se aspira. La aguja y jeringa son retiradas aplicando ligera presin hacia atrs, al mismo tiempo que se gira suavemente hacia derecha e izquierda. El procedimiento es relativamente indoloro, sin embargo, puede utilizarse un anestsico local (Lidocana al 2%).

5. Dos a tres gotas del material aspirado son inoculados en tubos con tapa rosca que contienen medio de cultivo Novy McNeal Nicolle (NNN), al cual se le ha aadido 0,1 mL de solucin salina que contiene 500 IU de penicilina y 500 mg de streptomicina/mL para prevenir la contaminacin.

6. Mantener los tubos de cultivo a 24C y revisarlos diariamente. Si no se dispusiera de estufa, los cultivos se pueden mantener a temperatura ambiente, siempre que sta no exceda los 26C.

7. Se realizarn recuentos diarios a fin de determinar la fase logartmica del parsito.

Identificacin Especfica de Especie por Tcnicas Moleculares: L. braziliensis peruviana ser identificada especficamente mediante las tcnicas de PCR y RFLP.

Obtencin del Extracto Metanlico de Caesalpinia spinosa (Taya) (Alzadora et. al., 2007):

Se prepararn extractos metanlicos de hoja, fruto y hoja y fruto (1:1) de Caesalpinia spinosa (Taya), para lo cual se seguir el siguiente procedimiento:

Se recolectarn las hojas y frutos de Taya teniendo en cuenta su tamao, color y estado.

Luego, se obtendr un kilogramo de muestra fresca, la cual se pondr a secar al horno a una temperatura de 45 C/24 36 h. con la finalidad de eliminar de forma eficiente la humedad.

Luego, se proceder a moler las muestras secas utilizando un mortero, hasta obtener un pulverizado homogneo.

Luego, se pesarn 50 gr de la muestra molida y se colocar en un baln con 500 mL de metanol comercial (CH3 OH Cl), para posteriormente llevarlo a maceracin por 10 das.

Luego se filtrar el macerado utilizando papel Watman N 3 en un matraz estril para luego colocarlo en un crisol y llevarlo a estufa de aire circulante a 40 C, hasta obtener del volumen inicial.

Luego se sec en estufa a 40 C, hasta la evaporacin total del solvente.

El extracto seco y en polvo ser recibido en viales estriles.

Estandarizacin de la Solucin Stock (Rimarachn y Vasquz, 2004):

Se pesar 4 g de extracto puro en un recipiente estril y luego se agregar 5 mL de Solucin Salina Fisiolgica Estril (SSFE), para obtener la Solucin Stock cuya concentracin final ser 800 mg/mL.

Luego de obtenida la Solucin Stock se proceder a preparar las concentraciones de 50, 100, 200, 400 y 800 mg/mL.

Prueba de Efecto Inhibitorio in Vitro (Alzadora et. al., 2007):

Para esta prueba se utilizarn cultivos de promastigotes de Leishmania braziliensis peruviana en fase log.

Pasado 5 das de cultivo a la fase lquida se le aadir el extracto metanlico de cada tipo (hoja, fruto y hoja + fruto).

Se emplearn concentraciones de 50, 100, 200, 400 y 800 mg/mL de Extracto Metanlico.

Los ensayos se realizarn por triplicado para cada tipo de extracto, considerando como controles cultivos sin Extracto Metanlico.

El recuento de parsitos se realizar diariamente desde el primer hasta el quinto da de incubacin con el Extracto Metanlico.

Para el recuento del parsito se emplear cmara de Neubauer (400x) lo que adems permitir evaluar la morfologa y la supervivencia del parsito, sta ltima, relacionada con su movimiento.

El efecto inhibitorio in Vitro del Extracto Metanlico de C. espinosa (Taya) se demostrar a travs de la Actividad Leishmanicida (reduccin en la cantidad de promastigotes). sta se determinar aplicando la siguiente frmula:

Actividad Leishmanicida=[100 (L2/L1)] x 100)

Donde L1 ser el nmero de clulas viables en el cultivo control y L2 ser el nmero de clulas viables despus del tratamiento con los extractos.

El porcentaje de viabilidad se determinar por comparacin con el nmero de promastigotes de los controles.

7.2.3. Diseo de contrastacin de Hiptesis:

La investigacin a realizar es experimental y corresponde al diseo de estmulo creciente (Alzadora et. al., 2007). Para este diseo se utilizar una cepa experimental y una cepa control. A la cepa experimental se le inocularn dosis de 50, 100, 200, 400 y 800 mg/mL del extracto metanlico. La cepa control quedar sin inocular. Este procedimiento se realizar para los tres tipos de extracto (hoja, fruto y hoja + fruto). Se compararn los resultados antes y despus de inocular los extractos metanlicos a travs de la determinacin de la Actividad Leishmanicida. Se realizarn 3 repeticiones por cada tipo de extracto. 7.2.4. Anlisis Estadstico de los Datos:

Se utilizar un diseo con arreglo factorial 1 x 5 x 3, correspondiendo el primer factor al nmero de cepas, el segundo factor a las concentraciones del extracto metanlico (50, 100, 200, 400 y 800 mg/mL) y el tercer factor a los tipos de extractos (hoja, fruto y hoja + fruto). El experimento se realizar con 3 repeticiones (Grfico N 1), lo que harn un total de 45 unidades experimentales.

El diseo factorial se aplicar para cada tipo de extracto (hoja, fruto y hoja + fruto).

Para el anlisis estadstico de los datos se utilizar la prueba de t de Student y la prueba de Significacin de Tuckey a 0,05 de nivel de significacin.

Para la mejor interpretacin, los resultados de los datos sern presentados en tablas y grficos.

8. REFERENCIAS: Alzadora, L.; Solis H.; Rojas, M. 2007. Actividad leishmanicida de los extractos metablicos de cuatro ecotipos de Lepidium peruvianum, Chacn (Brassicaceae) Rev. Peru. Biol. Nmero especial 13(3): 211-214.

Ampuero, J. 2000. Leishmaniasis. Mdulos Tcnicos. Serie de Documentos Monogrficos N 8. MINSA. 2000. 80 pp.

Bazurto, L. 2006. Todo sobre la Tara: Caesalpinia spinosa o Caesalpinia tinctoria. ALNICOLSA del Per. Universidades Latinoamericanas. Monzote, L. y cols. 2004. Propiedades antiprotozoarias de aceites esenciales extrados de plantas cubanas. Instituto de Medicina Tropical Pedro Kour.

Muoz, A. y B., Pareja. 2003. Plantas medicinales empleadas en el tratamiento de la leishmaniasis. Folia Dermatolgica Peruana. Crculo Dermatolgico del Per. 14 pp.

Organizacin Panamericana de la Salud. 1996. Epidemiologa y Control de la Leishmaniasis en las Ameritas por Pas o por Territorio. Cuaderno Tcnico N 44. 1 3, 18 19 pp.

Prez, J.; J., Prez y Castanys, S. 2007. Estrategias teraputicas y bases moleculares de la resistencia a frmacos frente a la leishmaniasis. Instituto de Parasitologa y Biomedicina Lpez-Neyra (CSIC).

Rimarachn, J. y M. Vasquz. 2004. Sensibilidad in vitro de Candida albicans, Sthaphylococcus aureus y Salmonella Typha al extracto etanlico de Bidens pilosa L. Amor seco. Facultad de Ciencias Biolgicas. Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Lambayeque. Torres, R, y S., Barroeta. 1996. Tratamiento de la Leishmaniasis Cutnea Localizada con Infiltraciones Perilesionales de Glucantime y Lidocana. Facultad de Medicina. Universidad del Zulla.

GRAFICO N 1: Diseo experimental para determinar

TIPOS DE EXTRACTO

CONCENTRACIONESEXTRACTO METANOLICO HOJAEXTRACTO METANOLICO FRUTOEXTRACTO METANOLICO HOJA + FRUTO

Leishmania braziliensis - peruviana en fase log

50 mg/mLR1

R2

R3

100 mg/mLR1

R2

R3

200 mg/mLR1

R2

R3

400 mg/mLR1

R2

R3

800 mg/mLR1

R2

R3

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