Upload
marta-flores
View
13
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
� ������� ����� �� ����� ��� ��� ��������� ���� �� ����� � �������� ��� ���� ������ �������
nalysis of PCR* prod-ucts is traditionallyperformed by labor-in-
tensive gel electrophoresis. Wereport here the use of ion-pairreversed-phase high perfor-mance liquid chromatography(IP RP HPLC) – DNA chromatog-raphy – using the WAVE® NucleicAcid Fragment Analysis System,for automated gender determi-nation with amelogenin specificPCR* products. Analysis by DNAchromatography is fully auto-mated. No sample preparationafter PCR* is required. Purifiedsamples can be quantified bypeak integration and collectedby peak capture for downstreamapplications. Unlabeled andfluorescein labeled primerswere separated and purified.One primer labeled with an iso-meric fluorescein mixture wasresolved. Primer, labeled with asingle isomer, was purified foramelogenin specific PCR*.Amplification of a segment ofthe X-Y homologous geneamelogenin yields a 212-bp X-specific and a 218-bp Y-specificPCR* product. Products are wellresolved by DNA chromatogra-phy in the presence and ab-sence of a fluorescein tag.
�������������� �
Gender Determination by Amelogenin Specific PCR*and Product Analysis by DNA ChromatographyKaoru Kobayashi and Karl H. Hecker, Transgenomic Inc., San Jose, CA 95035
Introduction
���� ���������� � �� ������
����� ��� ���� �������������� ��
���� �� ����� � ������ �����
���������������� ������������
� ����������� ���� ��� ��������
��� � � ����� �� ������ �����
�!"��� #� $���� �� "��� � �������
��� ����� ����"�� � ������� �� ���
������ ��� ���� ����� %&#� ''(�� ���� ��
����� ����"�� � � ��"��� � ���������
� � ����� �� ���� ������������ � %&#
''(#� ����"��� ��� ��� ������ ���
������������ � %��)*(� %'#� +(#� ��
������� � ������������ � %�*(� %',(�
*����������� � ����!"� � ���� ���
�� "��������� � ��!"��
�� ����������"��� ��������-���#� $�
����"��� �� �"�������� �������� #
$����������"��� �������#� ���
������ ��������� " �����
������������� � ������ ���������
��� �� ����� ��� ����.�/���������"
���� ��������
0���1�2*3�� ���� � "������ ���
���"����� ��� ����� ��� ��� ��"����
������� %� (����� ������� � %4#� 5#
6(��7���� ������"��� �����
� ������������ 8���������"�� ����
��������� � �� �!"���� �����
��������� � ����� ������������
�� �%9�����-�:�(�����������3
��������� %0�� �����#� ��� ;� �#
��(�� 0��� ������ � ��� �� � ��
��������� � �� �����" � ��< �����
��� � % � ������ ������(
������� ������������� � � ����
������� " �� �� �$����"��� ����
*�"����� � �!"��" �,�'�=
����� �����"�� �������� %0*��(� ��
�-� 6�,� ��� ��"��� >� � �!"��" � ,�'
=�0*�������-�6�,�������+5?��
���"��� ���������� %���(����!"��
���������� ���� @������ ������ #
$���"�� ���� ���� ���� ������ ������
����#� ����A� �"������� ������
$��� �������"������� ����� � ��"���
� �� �!"���� �������#� �"�� ��
������������� $��� �� ������
���� �� � ��"���>�� 0�" #� ����
���� ������� � ��"��� ��� �� ��$������
���������� ���$��� �� ������
������� ���� %�0(� ���� �����
������� �� ������������ � ���
��������� ��� ������ +&,� �� %72(� ��� ��
���� �� �� $��������� ��� ���
��"��� ���� � �� " ��� ���� �������
9�������� ��� ���<� ���� � ������ � �
��� � ��� !"�������� %B(�
)����� ��������� �� �"��
���������� ����� � ��� ��
���������� � � ����� �� �� �����
��� ����.�/� ��������" � ���
�������� " �� ����)�����C
���� 9��������� � ���� ����
�������� %'#� +(�� 0��� �������
������ ������ ��� � �� � ���
������ � �� +'+��� �� ���� %��(�.�
������ ��� �� +'B����/� �����
����"��� %&(�� 0���)�����C
���� 9��������� � ���� � ��������
���� ����� �������� %+(� ��� ���
��"��� ����� �������� %'(�� 0��� ������
���� � �� ��� ��� �������� �����
����� � �$���� ��� ��� ���� �����
� ��������$��� ��"��� ���� >���
��� � ���� "������ $��� ���
����������� �������� �������� -���#
$�� ��$� ����� ����1�2*3� � ����
"������ ���� ���� ��� ��������
����"�� � ����������)�����C����
9��������� � ��� �
� ������� ����� �� ����� ��� ��� ��������� ���� �� ����� � �������� ��� ���� ������ �������
Results and DiscussionSex Identification withUnlabeled Primers
���������� ��� �� ������ ��� ���
.�/� ��������" � ���� �������
" �� ���� ����� � "������ $��� ���
)�����C����� 9��������
� ���� ���� �� +'+����.� ������ ��
�� +'B����/� ������ ����"���� ����
����"�� � $���� ��� ���� �� ���
1�2*3� � ���� " �� ���� ������
��$� � 0����� '�� 0$�� ���< �$��
������� ��� � ��� 5�,,��� %D8�� ,�,+
�(� ��� 5�'&��� %D8�� ,�,E��(� ���
��������� ��� ���� ���������
������� ���������� ���� � %F��� '�(�
F�"��� '>� ��$ � ��� ���0���� 5�,,��
%D8�� ,�,+��(� �� ���<� ����� ������
���� ����.� ������ +'+��������
����"��� �������� ����� �����
������� �� �������� 0��� ������
��� � ��� ���� +'+�� ��� +'B���� �����
��� � ���������� $���� $��� ���� �����
��� ��� � ��� �$�� �������� ��
������ � %'64� ��� +54� ��� G� F��� '�(
� � $���� � � $��� ���� �������
������� %F��� '�(� �������� �
��������
9�� � �������� �����F�"��� '� %�#�>(
����� ���� +'+�� ��� +'B��������
����"�� � ���� "������ � ��� ������
�"��� � �� ������ �� ����������3
���������� 0�" #� ����1�2*3� � ���
�� � ��� " ��� ���� ������ ��������
� ��������$��� ����)�����C
���� 9��������� � ������� �#� ���<
���� ��� � ��� ��������� �������
!"�������� ��� �������� �������
%B(�� 9�� ���� ������ �������� ������
����� ���"� � � ���� ��������
��� �� ��� ���� ����#� ���� ��� � "����
��� �������� ��� � � ���� �����
�� � ��� ������� �� ��� �� ���
�� � � ��� ���� ����"��� ���<�
Analysis and Purification ofFluorescein Labeled Primers
��� � ��� �������H � �������
������� "��������� � ��������� ���
��� ���� ��� ��"������ �������
$��� ������ � �������� ������
��� � %F��� +�(�� 0��� ���� ������
��� ���� � � ����"��� ��)*� %'(
����� � �� � �$�� ��� � ����� ����
�� ��� ���� ��������� +'+�� ��� +'B���
���������"�� �� 0��������#� ��$�
" ������� ����� ���� �������� ���<
������� � � !�"� #� � $ � �� ��� %� �� &������� ������� � '�( � ��������� ����� $ � � � ���)� ���*)��� ���+� ����� �� $���� �� ����� ',-(� ���.�� � '/(� ���)��� ���+� ����� � $���� �� $�����',,(� ���.�� � '�(� 0" ����� � �1��� � ���� 2� �34)� �� �53)��� ��� ��� ��� $����� �� $����� 6��###� ���� �� �&��*� ������� '�(� ��������� ����� '�������7� 8����7� 9#(7� ���)�� ��*)��� $����� � � � ���+� ���� ���� %���� ���$����� �� �� �:�)�;;<� ������ ������ '8=������ ��7� #� 7 � 9� �� �%7� 8�(� ����� �����:�><� ���� ����������� '���?�� 0����7� ��� ���� �7 � ��( � �����"��� ���� �;;� �� �$� ����� ������� ���� %��� ���� ���� ���� �� � ���+��� ����� �� ��� � � @AB�C� '�� ��� � � @4B�7� �� ��� � � A;B�7� � 5� ��� � � 3;B�(� $��� �5� ��� ��� C3� ��� � � 3;B�7� 4� B�� ���? � 5� µD� ���>�� �� �$ � ��� ���+� %���� ����� ���� �� 7 � %� ��� � �������� ����� ��7� � �� ��� �� ��������� �$ � ��� 9�E0F� !�� �� � :��� ����� � �� ������ ���� ��� �� �� �� :����� � � :��� ������ ���� $��� ������ ��� %��� 55B�� '�)�� ����� ��� ���(�� ������ ������� %���� ������� � � �A;� �
� ���� ������������� ��� ���
�������� ������� ��"��� ��� �"�� ��
���������� � � ���� ��"��� ���
���������� � ��� ���� ������ ���
"������ $��� ���� ��"��� ����
�������� <�#� ����#� ��������� ���
��� ���� ��� �$�� �����������������
� ���� ���� � ��� ���� ��"��� ����
�������� �������1���� ���� ���������
����� ��� ���� ������ ���� ������� ��� +&,
�� %F��� E�(� ��$ � ������ ���< #� ���
������������� ��������� ��� ���
�� �� $��������� ��� ��"��� ��
%5+B� �(� %F��� E>(� ��$ � �� � �$�
���< �� �� ���� ��� ���� ���<� $��� ���
����� �� ������� ���� %E�64��(�
���� ��"��� ����� ������������#� �
��������� ��� ����72� ������������#
����� � �� � ���<� � � ���� "�������
������� 0�" #� ���< � ��� 4�B5� ��� 5�+'
�� � ����72� ������������� ������
��� �$�� � ���� ����� � ��� ���
�������� ������
0��� ��"��� ��� �������� ������ ��
�� ������ � ������ ������� ���
���� "�������� ������� 0� � � �"�� ��
���� � ��������� ��"��� ��� ���
��"��� ��������"��#� $���� ���� �
Gradient Program for Primer Analysis and PurificationTable 2
Time [min] Eluent A [%] Eluent B [%] Flow Rate [ml/min]0.1 M TEAA 0.1 M TEAA, 25% ACN
0.0 95 5 0.90.5 80 205.0 47 535.1 0 1005.6 0 1005.7 95 58.2 95 5
Table 1
Time [min] Eluent A [%] Eluent B [%] Flow Rate [ml/min]0.1 M TEAA 0.1 M TEAA, 25% ACN
0.0 54 46 0.90.5 49 515.0 40 605.1 0 1005.6 0 1005.7 54 468.2 54 46
Gradient Program for Unlabeled PCR* Product Analysis
� ������� ����� �� ����� ��� ��� ��������� ���� �� ����� � �������� ��� ���� ������ �������
������� � � �������� �� ���� $ � �� ��� �$� ��������� �� D������ ������� � &E� ������ ������������ � � �A;� �� ' ��(� �� $ ����������� ������ ������ ������� � � 5�*� �� '�� ��(�$ � ��� $ �������� �� ������� ��������� ����� $ � � � ������� ���� � ���?� '�(� �������� ������7���?�� '�(� �� '�(� $ ���� ���� �� ������� ������ � ���� �� ��� �������� �$ � %�� �������� �$$ ���������� %� �� � $ $��� � ������ ��������� ������ ���� ��� � ����� $��� ��� $ ���������� ������������� ��� ��� � � � �� %�� ���?� � !������ �������� � �$� &E� '$��� (� �� $ ����������� � �� ��'����(� ����� �� �� �� �� �� �G�� ��� $ � �$ � �� � ��� ����� �� ��� $ ����������� ������ ������ �$H; �� ��7� � � � � G��� G������ �� %��� ��� � �� ���� ��� �3;� µD � :��� ����� � �������� ���$��� ������� �������� ��� � �� �� �� :����� � � ������ ������ ���� $��� ������ ��� %��� 5;B�
���� �������� ���� � ��� ���� �������#� �
��������� ��� ���� "�������#� �����
"�������� ���� ���� � ��������
������ ��� ����������3� ���������
������ �� ������ � ����� ���
��������� � ���� ������"��� ���� �����
��"��� ���� ����� � %I(�
9� ������ ��� ���"��� �����
��������� " �� ���� ��"��� ��
�������� �����#� �� $� � ��� �� � ��
�"�� � ���� ����� � "������ �
���������������" �� ������� 9�����#
�� ������ ���"�� ��� ��������� %5,�µ:($� � ��������� � ����� ������������
�� � ��� ���< � ��� E�64� ��� 5�+'��
$���� ������������"��� �� ���<
������ �$���� ���� ����� ��
�� " ������ �0*� �"����#� ����<��
���� �"�� � � ����� ������������� #
!"�����#� ���" ��� �������J����
"������� � �������� $��� ���
��"�������� � 5������� ���"��� ��#
+H#6H�������� �4H#5H���������&�
������ ��"��� ��#��#�#�H#�H�
��������� ��&������� �������#� ��
&������� �.��������� %F�=#� ;J*#
0�=��#� ����J.(� ���� ���� ���<
���� �������� ����"�������� ��� ���
����� ����� ����� ����"�� � ��
��"��� ��� �� ������ � � ���������
��� ��"��� ��� ���� ������� %I#� E(�
Sex Identification with PurifiedLabeled Primers
������������� ����.�/��������
��" � ���� �������� " �� ���
�"����� ����� � ������ ���� ���
������� +'+����.� ������ ��� ���
+'B����/� ������ ����� ����"��
%F��� +�#�>(���� ���� ���<�$��� �
������� ���� ��� 6�5E��� %D8�� ,�,I
�(� %F��� +>(� ����� �� � ���
��"��� ��� ��������.� ������ +'+���
����� ����"��� �������� ����� ���
����������� ������� ���� �� ���<
$��� ������� ��� � ��� 6�5+��� %D8�
,�,5��(� ��� 6�64��� %D8�� ,�,&
�(� ����� ��� ���� +'+���� ��� +'B�
��� ��"��� ���� � ��������.�� ���/�
������ ����� ����"�� � ������� �����
���������� ����� ������������
����� ���� �� ������������ ��� ��
>� � F�"��� +� ������ � ��$� ����� ���
��"��� ��� �������� ����� ����"�� #
������� � ��� � � �� � &� ��#� ���
"������ � ��� ������"��� � �� �����
� ����� ������������� � �� ���
1�2*3�� ����
Gradient Program for Labeled PCR* Product AnalysisTable 3
Time [min] Eluent A [%] Eluent B [%] Flow Rate [ml/min]0.1 M TEAA 0.1 M TEAA, 25% ACN
0.0 54 46 0.90.5 49 516.5 42 586.6 0 1007.1 0 1007.2 54 468.7 54 46
������� � � !�"� #� � $ � �� ��� %� �� ���� $ ��� D������ ������� � '�(� ��������� ����� $ � � � ���)�� ��*)��� ���+� ����� �� $���� �� ����� ',-(� ���.�� � '/(� ��������� ����� $ � � � ���)�����+� ����� � $���� �� $������ ',,(� ���.�� � '�(� ����������� ������� ��������� ����� $����������� %� �� ���?� ������� ��� �� ��� �������� �$ � %�� �������� �$� ��� $ �������� �� ����� ���+� � ��� ���� %�� �� ���$����� %� �� #�� ��� 6�D�� ���� $ ��� �������� ���� ��� ��� ����������� �� ������� � � :��� ����� � �������� ���� ��� � �� �� �� :����� � � :��� ������ ���� $�������� ��� %��� 55B�� '�)�� ����� ��� ���(� �� ������ ������� %���� ������� � 5�*� �
4 ������� ����� �� ����� ��� ��� ��������� ���� �� ����� � �������� ��� ���� ������ �������
12325 Emmet Street • Omaha, NE 68164 • Tel 402.452.5400 • Fax 402.452.5401 • www.transgenomic.com
© 2000 Transgenomic, Inc. Printed in the U.S.A.
* PCR is a process covered by patents issued and applicable incertain countries. Transgenomic does not encourage or supportthe unauthorized or unlicensed use of the PCR process.
WAVE® and DNASep® are registered trademarks ofTransgenomic, Inc.
Transgenomic, Transforming the World, and the logo aretrademarks of Transgenomic, Inc.
Conclusion0���1�2*3�� ���� � "������ ���
��� �� ��� �������� ��� "�������
��� �������� � ����� ������� � ����
������ � ��� � � �� � �� ��$� ���� 0�" #
�� � ������ � ��� " ��� ���� ����"��
��� � � ����� �� ��� � � � ����� ���
�� ���� ��������������������"�� ���
�������� ������ �#����������"��
�� � ��� !"������ � � �������� ��
���<� ���� � ��� ��" #� ������ ����"�
� � ���"�� ���� ������ ������ ���
"���� � ��� ���� ���� �������
��������
��������� $��� �"����� ������ ��
������ #� ����� ��� �������� ��
����������� ��� ����1�2*3�� ���
��� � ������ ���������� %���
$��� ������ �"����(#� ���� ���������#
������#� ������������ #� � "�����
��� ������#� ������������ �������#
��� �����"���7�<�� ��� � " �
������ ��� ��������� #� ����"��
��� � �� ����1�2*3� � ���
References� � ��������� � ��������� ���
������� 0�������=�"��#
�����������������#�=�� �#
19#�7��#�����A88
$$$������������8�� 8���,,&8
���,,&������
�� ��������� ���� ������ %�����
�����������(� 0������
=�"��#� �����������������#
=�� �#�19#�7��#�����A88
$$$������������8�� 8���,,48
���,,4������
�� �������� ��� ���� ��� ���� ��� ���
���� � ������ ��� ��� %'III(
="����� �������� � � ����"��
���� ������������� � " �
��"��� ���� � �������� ��� ���� �
���� ������� ����"�� �� ����
/������ � �!�# � '5&�'&4�
"� �������� ��� ���� ���#���� $��� ���
��� ���� %�� %'III(�J�������
��� ����� ������ � � � ��������
���� ����������� �
/��:����>���� �&%+(#� +'&�
'� ��(���� )�� ���� *�+����� ��� ,��
���� $���� ��� ��� %'II5(� ����
��� ���"����� ��� ������
������� � � � ������ ����������
���� � �� ��< ������ �����"
��� � % � ����� ������(
������� �� ��� � ���� � &!#� 56B�
&� -��������� %��� �� �.���� ��� -��
/.���.�� ��� 0��� ���� �� �� ��
%'II4(� F��� �� ��������� ��� �
����� ��� !"������������ ��
�� �� � � ���������� ��� ����.�/
��������" � ���� ��������
# � = � D����� 8� � �1&%4(#� 'I,�
'IE�
!� -������� ���� ���+� ��� ���
��� ���� %��� � ������ ���� ���
��� ������� %'IIB(� ���� �� ����
������� �$�������1�2*3����
F������� ��� � � ����
0�� �����#� 9��#� ��� ;� �#����
��������������K�',6#�����A88
$$$���� ���������8���8
��',6�����
2� -������� ���� ���+� ��� ���� ���
��� ���� ��� %'IIB(� ���������
!"�������������������1�2*3
����F���������� � � ����
0�� �����#� 9��#� ��� ;� �#����
��������������K',5#�����A88
$$$���� ���������8���8
��',5�����
3� *�+����� ��� ,��� ��(���� )�� ���
4� ��+������$��������5��
���#+ �� 6��� ���� $����� ��� ��
%'II4(�-����� ��"��� �!"�
������������� � ��� ��"��� ���
� ���������� "����� ��� �����
/������ � ���%'(#� EI�4&�
�1 � ����7����.�� 8�� ���� �7.���� 6�
���� ���� 5�.���.�� ��� /�� %'IIB(
���� ���������� ��� ���� �
����� � � � ��� ���� �� ���
������� ��� ���� �������� ���
��� ��� � � � ������� � ��������
����� � $��� ��� ����������
0��� ����������� �3 # � 6&�
� � � �� �.���� ��� -��� -��������� %��
���#���� )�� ���� ���� �� �� ��
%'IIE(� �� ����� ��� !"�������
���� ��� �� �A� ��"��� ������� ��
���� ��� � ���.�/���������"
���� ��������� /��:����>���
�'%4(#� &E&�&EB#� &4,�&4'�
��!"�� � �� ��"�� � �����"��
���"����� ���� "�� ��� 'I+� ����� �
*���� ������ ��� ��� ��� ���� � ��
���� ',��"�� �� 0��������#� ��
�������� � ������ � �� �������#� �� �
��� ������ ��������� ���������� ��
��)*�����*����� �����������
$��� ����)�����C� � ���� ��
�������� �������� � ����� ��� � �� ��
�� ��� �������� ������� ������� �