4
1 AN113: Gender Determination by Amelogenin PCR and Product Analysis by DNA Chromatography nalysis of PCR* prod- ucts is traditionally performed by labor-in- tensive gel electrophoresis. We report here the use of ion-pair reversed-phase high perfor- mance liquid chromatography (IP RP HPLC) – DNA chromatog- raphy – using the WAVE ® Nucleic Acid Fragment Analysis System, for automated gender determi- nation with amelogenin specific PCR* products. Analysis by DNA chromatography is fully auto- mated. No sample preparation after PCR* is required. Purified samples can be quantified by peak integration and collected by peak capture for downstream applications. Unlabeled and fluorescein labeled primers were separated and purified. One primer labeled with an iso- meric fluorescein mixture was resolved. Primer, labeled with a single isomer, was purified for amelogenin specific PCR*. Amplification of a segment of the X-Y homologous gene amelogenin yields a 212-bp X- specific and a 218-bp Y-specific PCR* product. Products are well resolved by DNA chromatogra- phy in the presence and ab- sence of a fluorescein tag. Application Note 113 Gender Determination by Amelogenin Specific PCR* and Product Analysis by DNA Chromatography Kaoru Kobayashi and Karl H. Hecker, Transgenomic Inc., San Jose, CA 95035 Introduction Sex determination is an integral part of the characterization of forensic samples containing genomic DNA. PCR* offers an efficient and sensitive method for sex determina- tion by amplifying gender specific sequences, which result in different size PCR* products depending on the gender of the donor (6, 11). Sizing of PCR* products is routinely performed by agarose gel electrophoresis (6, 11), denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) (1, 2), or capillary electrophoresis (CE) (10). Electrophoresis techniques are time consuming methods requiring considerable manual effort. Here, we introduce an automated technology, with minimal manual intervention, for gender identification using DNA chromatography after amplification of a section of the X-Y homologous gene amelogenin. The WAVE ® System is suitable for accurate and rapid sizing of double- stranded (ds) DNA fragments (4, 5, 7). Under non-denaturing conditions ds DNA fragments/PCR* products are separated in a sequence indepen- dent manner by DNA chromatogra- phy (IP RP HPLC) on a DNASep ® cartridge (Transgenomic, San Jose, CA). The stationary phase in this cartridge is a nonporous alkylated poly (styrene-divinylbenzene) matrix. Chromatography is per- formed using a two-eluent system. Eluent A is aqueous 0.1 M triethylammonium acetate (TEAA) at pH 7.0 and eluent B is aqueous 0.1 M TEAA at pH 7.0 containing 25% by volume acetonitrile (ACN). Aliquots from PCR* are injected directly, without the need for sample prepa- ration, e.g.: purification or mixing with loading buffer. Ds DNA is eluted in a sequence independent, but size dependent manner with a gradient increasing in eluent B. Thus, short DNA fragments elute at a lower ACN concentration and with a shorter retention time (RT) than longer fragments. Chromatograms are recorded at either 260 nm (UV) or at the emission wavelength of the fluorescent dye used for labeling. Integration of peak areas provides a means of quantification (8). Gender identification on human genomic DNA samples can be performed by amplifying a segment of the X-Y homologous gene amelogenin using the GenePrint Sex Identification System from Promega (1, 2). The amelogenin specific primer set in this system amplifies a 212-base pair (bp) X- specific and a 218-bp Y-specific product (6). The GenePrint Sex Identification System is available for silver detection (2) and for fluorescence detection (1). The latter contains a set of amelogenin specific primers in which one of the primers is labeled with fluorescein. Both systems are supplied with the appropriate amelogenin ladder. Here, we show that the WAVE ® System is suitable for the analysis of PCR* products from both GenePrint Sex Identification Systems.

612013

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: 612013

� ������� ����� �� ����� ��� ��� ��������� ���� �� ����� � �������� ��� ���� ������ �������

nalysis of PCR* prod-ucts is traditionallyperformed by labor-in-

tensive gel electrophoresis. Wereport here the use of ion-pairreversed-phase high perfor-mance liquid chromatography(IP RP HPLC) – DNA chromatog-raphy – using the WAVE® NucleicAcid Fragment Analysis System,for automated gender determi-nation with amelogenin specificPCR* products. Analysis by DNAchromatography is fully auto-mated. No sample preparationafter PCR* is required. Purifiedsamples can be quantified bypeak integration and collectedby peak capture for downstreamapplications. Unlabeled andfluorescein labeled primerswere separated and purified.One primer labeled with an iso-meric fluorescein mixture wasresolved. Primer, labeled with asingle isomer, was purified foramelogenin specific PCR*.Amplification of a segment ofthe X-Y homologous geneamelogenin yields a 212-bp X-specific and a 218-bp Y-specificPCR* product. Products are wellresolved by DNA chromatogra-phy in the presence and ab-sence of a fluorescein tag.

�������������� �

Gender Determination by Amelogenin Specific PCR*and Product Analysis by DNA ChromatographyKaoru Kobayashi and Karl H. Hecker, Transgenomic Inc., San Jose, CA 95035

Introduction

���� ���������� � �� ������

����� ��� ���� �������������� ��

���� �� ����� � ������ �����

���������������� ������������

� ����������� ���� ��� ��������

��� � � ����� �� ������ �����

�!"��� #� $���� �� "��� � �������

��� ����� ����"�� � ������� �� ���

������ ��� ���� ����� %&#� ''(�� ���� ��

����� ����"�� � � ��"��� � ���������

� � ����� �� ���� ������������ � %&#

''(#� ����"��� ��� ��� ������ ���

������������ � %��)*(� %'#� +(#� ��

������� � ������������ � %�*(� %',(�

*����������� � ����!"� � ���� ���

�� "��������� � ��!"��

�� ����������"��� ��������-���#� $�

����"��� �� �"�������� �������� #

$����������"��� �������#� ���

������ ��������� " �����

������������� � ������ ���������

��� �� ����� ��� ����.�/���������"

���� ��������

0���1�2*3�� ���� � "������ ���

���"����� ��� ����� ��� ��� ��"����

������� %� (����� ������� � %4#� 5#

6(��7���� ������"��� �����

� ������������ 8���������"�� ����

��������� � �� �!"���� �����

��������� � ����� ������������

�� �%9�����-�:�(�����������3

��������� %0�� �����#� ��� ;� �#

��(�� 0��� ������ � ��� �� � ��

��������� � �� �����" � ��< �����

��� � % � ������ ������(

������� ������������� � � ����

������� " �� �� �$����"��� ����

*�"����� � �!"��" �,�'�=

����� �����"�� �������� %0*��(� ��

�-� 6�,� ��� ��"��� >� � �!"��" � ,�'

=�0*�������-�6�,�������+5?��

���"��� ���������� %���(����!"��

���������� ���� @������ ������ #

$���"�� ���� ���� ���� ������ ������

����#� ����A� �"������� ������

$��� �������"������� ����� � ��"���

� �� �!"���� �������#� �"�� ��

������������� $��� �� ������

���� �� � ��"���>�� 0�" #� ����

���� ������� � ��"��� ��� �� ��$������

���������� ���$��� �� ������

������� ���� %�0(� ���� �����

������� �� ������������ � ���

��������� ��� ������ +&,� �� %72(� ��� ��

���� �� �� $��������� ��� ���

��"��� ���� � �� " ��� ���� �������

9�������� ��� ���<� ���� � ������ � �

��� � ��� !"�������� %B(�

)����� ��������� �� �"��

���������� ����� � ��� ��

���������� � � ����� �� �� �����

��� ����.�/� ��������" � ���

�������� " �� ����)�����C

���� 9��������� � ���� ����

�������� %'#� +(�� 0��� �������

������ ������ ��� � �� � ���

������ � �� +'+��� �� ���� %��(�.�

������ ��� �� +'B����/� �����

����"��� %&(�� 0���)�����C

���� 9��������� � ���� � ��������

���� ����� �������� %+(� ��� ���

��"��� ����� �������� %'(�� 0��� ������

���� � �� ��� ��� �������� �����

����� � �$���� ��� ��� ���� �����

� ��������$��� ��"��� ���� >���

��� � ���� "������ $��� ���

����������� �������� �������� -���#

$�� ��$� ����� ����1�2*3� � ����

"������ ���� ���� ��� ��������

����"�� � ����������)�����C����

9��������� � ��� �

Page 2: 612013

� ������� ����� �� ����� ��� ��� ��������� ���� �� ����� � �������� ��� ���� ������ �������

Results and DiscussionSex Identification withUnlabeled Primers

���������� ��� �� ������ ��� ���

.�/� ��������" � ���� �������

" �� ���� ����� � "������ $��� ���

)�����C����� 9��������

� ���� ���� �� +'+����.� ������ ��

�� +'B����/� ������ ����"���� ����

����"�� � $���� ��� ���� �� ���

1�2*3� � ���� " �� ���� ������

��$� � 0����� '�� 0$�� ���< �$��

������� ��� � ��� 5�,,��� %D8�� ,�,+

�(� ��� 5�'&��� %D8�� ,�,E��(� ���

��������� ��� ���� ���������

������� ���������� ���� � %F��� '�(�

F�"��� '>� ��$ � ��� ���0���� 5�,,��

%D8�� ,�,+��(� �� ���<� ����� ������

���� ����.� ������ +'+��������

����"��� �������� ����� �����

������� �� �������� 0��� ������

��� � ��� ���� +'+�� ��� +'B���� �����

��� � ���������� $���� $��� ���� �����

��� ��� � ��� �$�� �������� ��

������ � %'64� ��� +54� ��� G� F��� '�(

� � $���� � � $��� ���� �������

������� %F��� '�(� �������� �

��������

9�� � �������� �����F�"��� '� %�#�>(

����� ���� +'+�� ��� +'B��������

����"�� � ���� "������ � ��� ������

�"��� � �� ������ �� ����������3

���������� 0�" #� ����1�2*3� � ���

�� � ��� " ��� ���� ������ ��������

� ��������$��� ����)�����C

���� 9��������� � ������� �#� ���<

���� ��� � ��� ��������� �������

!"�������� ��� �������� �������

%B(�� 9�� ���� ������ �������� ������

����� ���"� � � ���� ��������

��� �� ��� ���� ����#� ���� ��� � "����

��� �������� ��� � � ���� �����

�� � ��� ������� �� ��� �� ���

�� � � ��� ���� ����"��� ���<�

Analysis and Purification ofFluorescein Labeled Primers

��� � ��� �������H � �������

������� "��������� � ��������� ���

��� ���� ��� ��"������ �������

$��� ������ � �������� ������

��� � %F��� +�(�� 0��� ���� ������

��� ���� � � ����"��� ��)*� %'(

����� � �� � �$�� ��� � ����� ����

�� ��� ���� ��������� +'+�� ��� +'B���

���������"�� �� 0��������#� ��$�

" ������� ����� ���� �������� ���<

������� � � !�"� #� � $ � �� ��� %� �� &������� ������� � '�( � ��������� ����� $ � � � ���)� ���*)��� ���+� ����� �� $���� �� ����� ',-(� ���.�� � '/(� ���)��� ���+� ����� � $���� �� $�����',,(� ���.�� � '�(� 0" ����� � �1��� � ���� 2� �34)� �� �53)��� ��� ��� ��� $����� �� $����� 6��###� ���� �� �&��*� ������� '�(� ��������� ����� '�������7� 8����7� 9#(7� ���)�� ��*)��� $����� � � � ���+� ���� ���� %���� ���$����� �� �� �:�)�;;<� ������ ������ '8=������ ��7� #� 7 � 9� �� �%7� 8�(� ����� �����:�><� ���� ����������� '���?�� 0����7� ��� ���� �7 � ��( � �����"��� ���� �;;� �� �$� ����� ������� ���� %��� ���� ���� ���� �� � ���+��� ����� �� ��� � � @AB�C� '�� ��� � � @4B�7� �� ��� � � A;B�7� � 5� ��� � � 3;B�(� $��� �5� ��� ��� C3� ��� � � 3;B�7� 4� B�� ���? � 5� µD� ���>�� �� �$ � ��� ���+� %���� ����� ���� �� 7 � %� ��� � �������� ����� ��7� � �� ��� �� ��������� �$ � ��� 9�E0F� !�� �� � :��� ����� � �� ������ ���� ��� �� �� �� :����� � � :��� ������ ���� $��� ������ ��� %��� 55B�� '�)�� ����� ��� ���(�� ������ ������� %���� ������� � � �A;� �

� ���� ������������� ��� ���

�������� ������� ��"��� ��� �"�� ��

���������� � � ���� ��"��� ���

���������� � ��� ���� ������ ���

"������ $��� ���� ��"��� ����

�������� <�#� ����#� ��������� ���

��� ���� ��� �$�� �����������������

� ���� ���� � ��� ���� ��"��� ����

�������� �������1���� ���� ���������

����� ��� ���� ������ ���� ������� ��� +&,

�� %F��� E�(� ��$ � ������ ���< #� ���

������������� ��������� ��� ���

�� �� $��������� ��� ��"��� ��

%5+B� �(� %F��� E>(� ��$ � �� � �$�

���< �� �� ���� ��� ���� ���<� $��� ���

����� �� ������� ���� %E�64��(�

���� ��"��� ����� ������������#� �

��������� ��� ����72� ������������#

����� � �� � ���<� � � ���� "�������

������� 0�" #� ���< � ��� 4�B5� ��� 5�+'

�� � ����72� ������������� ������

��� �$�� � ���� ����� � ��� ���

�������� ������

0��� ��"��� ��� �������� ������ ��

�� ������ � ������ ������� ���

���� "�������� ������� 0� � � �"�� ��

���� � ��������� ��"��� ��� ���

��"��� ��������"��#� $���� ���� �

Gradient Program for Primer Analysis and PurificationTable 2

Time [min] Eluent A [%] Eluent B [%] Flow Rate [ml/min]0.1 M TEAA 0.1 M TEAA, 25% ACN

0.0 95 5 0.90.5 80 205.0 47 535.1 0 1005.6 0 1005.7 95 58.2 95 5

Table 1

Time [min] Eluent A [%] Eluent B [%] Flow Rate [ml/min]0.1 M TEAA 0.1 M TEAA, 25% ACN

0.0 54 46 0.90.5 49 515.0 40 605.1 0 1005.6 0 1005.7 54 468.2 54 46

Gradient Program for Unlabeled PCR* Product Analysis

Page 3: 612013

� ������� ����� �� ����� ��� ��� ��������� ���� �� ����� � �������� ��� ���� ������ �������

������� � � �������� �� ���� $ � �� ��� �$� ��������� �� D������ ������� � &E� ������ ������������ � � �A;� �� ' ��(� �� $ ����������� ������ ������ ������� � � 5�*� �� '�� ��(�$ � ��� $ �������� �� ������� ��������� ����� $ � � � ������� ���� � ���?� '�(� �������� ������7���?�� '�(� �� '�(� $ ���� ���� �� ������� ������ � ���� �� ��� �������� �$ � %�� �������� �$$ ���������� %� �� � $ $��� � ������ ��������� ������ ���� ��� � ����� $��� ��� $ ���������� ������������� ��� ��� � � � �� %�� ���?� � !������ �������� � �$� &E� '$��� (� �� $ ����������� � �� ��'����(� ����� �� �� �� �� �� �G�� ��� $ � �$ � �� � ��� ����� �� ��� $ ����������� ������ ������ �$H; �� ��7� � � � � G��� G������ �� %��� ��� � �� ���� ��� �3;� µD � :��� ����� � �������� ���$��� ������� �������� ��� � �� �� �� :����� � � ������ ������ ���� $��� ������ ��� %��� 5;B�

���� �������� ���� � ��� ���� �������#� �

��������� ��� ���� "�������#� �����

"�������� ���� ���� � ��������

������ ��� ����������3� ���������

������ �� ������ � ����� ���

��������� � ���� ������"��� ���� �����

��"��� ���� ����� � %I(�

9� ������ ��� ���"��� �����

��������� " �� ���� ��"��� ��

�������� �����#� �� $� � ��� �� � ��

�"�� � ���� ����� � "������ �

���������������" �� ������� 9�����#

�� ������ ���"�� ��� ��������� %5,�µ:($� � ��������� � ����� ������������

�� � ��� ���< � ��� E�64� ��� 5�+'��

$���� ������������"��� �� ���<

������ �$���� ���� ����� ��

�� " ������ �0*� �"����#� ����<��

���� �"�� � � ����� ������������� #

!"�����#� ���" ��� �������J����

"������� � �������� $��� ���

��"�������� � 5������� ���"��� ��#

+H#6H�������� �4H#5H���������&�

������ ��"��� ��#��#�#�H#�H�

��������� ��&������� �������#� ��

&������� �.��������� %F�=#� ;J*#

0�=��#� ����J.(� ���� ���� ���<

���� �������� ����"�������� ��� ���

����� ����� ����� ����"�� � ��

��"��� ��� �� ������ � � ���������

��� ��"��� ��� ���� ������� %I#� E(�

Sex Identification with PurifiedLabeled Primers

������������� ����.�/��������

��" � ���� �������� " �� ���

�"����� ����� � ������ ���� ���

������� +'+����.� ������ ��� ���

+'B����/� ������ ����� ����"��

%F��� +�#�>(���� ���� ���<�$��� �

������� ���� ��� 6�5E��� %D8�� ,�,I

�(� %F��� +>(� ����� �� � ���

��"��� ��� ��������.� ������ +'+���

����� ����"��� �������� ����� ���

����������� ������� ���� �� ���<

$��� ������� ��� � ��� 6�5+��� %D8�

,�,5��(� ��� 6�64��� %D8�� ,�,&

�(� ����� ��� ���� +'+���� ��� +'B�

��� ��"��� ���� � ��������.�� ���/�

������ ����� ����"�� � ������� �����

���������� ����� ������������

����� ���� �� ������������ ��� ��

>� � F�"��� +� ������ � ��$� ����� ���

��"��� ��� �������� ����� ����"�� #

������� � ��� � � �� � &� ��#� ���

"������ � ��� ������"��� � �� �����

� ����� ������������� � �� ���

1�2*3�� ����

Gradient Program for Labeled PCR* Product AnalysisTable 3

Time [min] Eluent A [%] Eluent B [%] Flow Rate [ml/min]0.1 M TEAA 0.1 M TEAA, 25% ACN

0.0 54 46 0.90.5 49 516.5 42 586.6 0 1007.1 0 1007.2 54 468.7 54 46

������� � � !�"� #� � $ � �� ��� %� �� ���� $ ��� D������ ������� � '�(� ��������� ����� $ � � � ���)�� ��*)��� ���+� ����� �� $���� �� ����� ',-(� ���.�� � '/(� ��������� ����� $ � � � ���)�����+� ����� � $���� �� $������ ',,(� ���.�� � '�(� ����������� ������� ��������� ����� $����������� %� �� ���?� ������� ��� �� ��� �������� �$ � %�� �������� �$� ��� $ �������� �� ����� ���+� � ��� ���� %�� �� ���$����� %� �� #�� ��� 6�D�� ���� $ ��� �������� ���� ��� ��� ����������� �� ������� � � :��� ����� � �������� ���� ��� � �� �� �� :����� � � :��� ������ ���� $�������� ��� %��� 55B�� '�)�� ����� ��� ���(� �� ������ ������� %���� ������� � 5�*� �

Page 4: 612013

4 ������� ����� �� ����� ��� ��� ��������� ���� �� ����� � �������� ��� ���� ������ �������

12325 Emmet Street • Omaha, NE 68164 • Tel 402.452.5400 • Fax 402.452.5401 • www.transgenomic.com

© 2000 Transgenomic, Inc. Printed in the U.S.A.

* PCR is a process covered by patents issued and applicable incertain countries. Transgenomic does not encourage or supportthe unauthorized or unlicensed use of the PCR process.

WAVE® and DNASep® are registered trademarks ofTransgenomic, Inc.

Transgenomic, Transforming the World, and the logo aretrademarks of Transgenomic, Inc.

Conclusion0���1�2*3�� ���� � "������ ���

��� �� ��� �������� ��� "�������

��� �������� � ����� ������� � ����

������ � ��� � � �� � �� ��$� ���� 0�" #

�� � ������ � ��� " ��� ���� ����"��

��� � � ����� �� ��� � � � ����� ���

�� ���� ��������������������"�� ���

�������� ������ �#����������"��

�� � ��� !"������ � � �������� ��

���<� ���� � ��� ��" #� ������ ����"�

� � ���"�� ���� ������ ������ ���

"���� � ��� ���� ���� �������

��������

��������� $��� �"����� ������ ��

������ #� ����� ��� �������� ��

����������� ��� ����1�2*3�� ���

��� � ������ ���������� %���

$��� ������ �"����(#� ���� ���������#

������#� ������������ #� � "�����

��� ������#� ������������ �������#

��� �����"���7�<�� ��� � " �

������ ��� ��������� #� ����"��

��� � �� ����1�2*3� � ���

References� � ��������� � ��������� ���

������� 0�������=�"��#

�����������������#�=�� �#

19#�7��#�����A88

$$$������������8�� 8���,,&8

���,,&������

�� ��������� ���� ������ %�����

�����������(� 0������

=�"��#� �����������������#

=�� �#�19#�7��#�����A88

$$$������������8�� 8���,,48

���,,4������

�� �������� ��� ���� ��� ���� ��� ���

���� � ������ ��� ��� %'III(

="����� �������� � � ����"��

���� ������������� � " �

��"��� ���� � �������� ��� ���� �

���� ������� ����"�� �� ����

/������ � �!�# � '5&�'&4�

"� �������� ��� ���� ���#���� $��� ���

��� ���� %�� %'III(�J�������

��� ����� ������ � � � ��������

���� ����������� �

/��:����>���� �&%+(#� +'&�

'� ��(���� )�� ���� *�+����� ��� ,��

���� $���� ��� ��� %'II5(� ����

��� ���"����� ��� ������

������� � � � ������ ����������

���� � �� ��< ������ �����"

��� � % � ����� ������(

������� �� ��� � ���� � &!#� 56B�

&� -��������� %��� �� �.���� ��� -��

/.���.�� ��� 0��� ���� �� �� ��

%'II4(� F��� �� ��������� ��� �

����� ��� !"������������ ��

�� �� � � ���������� ��� ����.�/

��������" � ���� ��������

# � = � D����� 8� � �1&%4(#� 'I,�

'IE�

!� -������� ���� ���+� ��� ���

��� ���� %��� � ������ ���� ���

��� ������� %'IIB(� ���� �� ����

������� �$�������1�2*3����

F������� ��� � � ����

0�� �����#� 9��#� ��� ;� �#����

��������������K�',6#�����A88

$$$���� ���������8���8

��',6�����

2� -������� ���� ���+� ��� ���� ���

��� ���� ��� %'IIB(� ���������

!"�������������������1�2*3

����F���������� � � ����

0�� �����#� 9��#� ��� ;� �#����

��������������K',5#�����A88

$$$���� ���������8���8

��',5�����

3� *�+����� ��� ,��� ��(���� )�� ���

4� ��+������$��������5��

���#+ �� 6��� ���� $����� ��� ��

%'II4(�-����� ��"��� �!"�

������������� � ��� ��"��� ���

� ���������� "����� ��� �����

/������ � ���%'(#� EI�4&�

�1 � ����7����.�� 8�� ���� �7.���� 6�

���� ���� 5�.���.�� ��� /�� %'IIB(

���� ���������� ��� ���� �

����� � � � ��� ���� �� ���

������� ��� ���� �������� ���

��� ��� � � � ������� � ��������

����� � $��� ��� ����������

0��� ����������� �3 # � 6&�

� � � �� �.���� ��� -��� -��������� %��

���#���� )�� ���� ���� �� �� ��

%'IIE(� �� ����� ��� !"�������

���� ��� �� �A� ��"��� ������� ��

���� ��� � ���.�/���������"

���� ��������� /��:����>���

�'%4(#� &E&�&EB#� &4,�&4'�

��!"�� � �� ��"�� � �����"��

���"����� ���� "�� ��� 'I+� ����� �

*���� ������ ��� ��� ��� ���� � ��

���� ',��"�� �� 0��������#� ��

�������� � ������ � �� �������#� �� �

��� ������ ��������� ���������� ��

��)*�����*����� �����������

$��� ����)�����C� � ���� ��

�������� �������� � ����� ��� � �� ��

�� ��� �������� ������� ������� �