6

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Tanaman Trembesi

Tanaman trembesi (Samanea saman (Jacq.) Merr.) merupakan tanaman

asli Amerika Selatan bagian utara yang merupakan daerah tropis dan sekarang

dibudidayakan secara luas di daerah tropis, seperti Asia Tenggara. Tanaman

trembesi mempunyai batang yang besar, bulat dan tinggi antara 10-20 meter.

Permukaan batangnya beralur, kasar, dan berwarna coklat kehitam-hitaman

dengan bentuk pohon seperti kanopi. Trembesi memiliki daun majemuk dengan

panjang tangkai sekitar 7-15 cm dan menyirip ganda. Tiap helai daun berbentuk

bulat memanjang dengan panjang antara 2-6 cm dan lebar antara 1-4 cm dengan

tepi daun rata (Staples and Elevitch, 2006). Warna daun hijau dengan permukaan

daun bagian bawah memiliki beludru.

Tanaman trembesi juga merupakan tanaman berbunga dan berbuah

musiman yang umumnya berlangsung pada bulan Mei dan Juni. Bunga trembesi

berwarna putih gradasi merah muda pada bagian ujung atasnya dengan panjang

mencapai 10 cm dari pangkal bunga hingga ujung bulu bunga. Tabung mahkota

berukuran 3,7 cm dan memiliki kurang lebih 20-30 benang sari dengan panjang 3-

5 cm. Buah trembesi berbentuk polong coklat kehitaman dengan panjang 10-20

cm, mempunyai lebar 1,5-2 cm, dan tebal sekitar 0,6 cm. Buah yang berbentuk

polong mengandung sekitar 5-25 biji dengan panjang 1,3 cm. Karakteristik

tanaman trembesi seperti terlihat pada Gambar 2.1.

6

7

Gambar 2.1

Karakteristik Bagian Tanaman Trembesi (a) pohon, (b) bunga, (c) daun, (d) buahberbentuk polong (Staples and Elevitch, 2006)

Ciri-ciri daun trembesi dengan bentuk tulang daun menyirip menunjukkan

bahwa trembesi termasuk ke dalam keluarga tanaman polong-polongan (Fabaceae

atau Leguminosae) dengan klasifikasi berikut (Staples and Elevitch, 2006).

Kerajaan : Plantae

Divisi : Magnoliophyta

Kelas : Magnoliopsida

Ordo : Fabales

Famili : Fabaceae

Subfamili : Mimosoideae

Genus : Samanea

Spesies : Samanea saman; Nama binomial: Samanea saman (Jacq.) Merr.

(a) (b)

(c) (d)

8

Tanaman dari keluarga Leguminosae telah diketahui mengandung

berbagai senyawa aktif yang secara farmakologi memiliki aktivitas sebagai

antiinflamasi, antirematik, antidiare, antimikroba, dan antimuntah (Trease and

Evans, 1987 dalam Ferdous et al., 2010). Berdasarkan penelitian yang dilakukan

oleh Ferdous et al. (2010), fraksi karbon tetraklorida dari ekstrak metanol

trembesi diketahui memiliki beberapa aktivitas diantaranya antimikroba terhadap

beberapa jenis bakteri gram negatif dan gram positif, serta jamur. Aktivitas

antibakteri dan antijamur dari fraksi karbon tetraklorida tersebut memiliki daya

hambat sedang terhadap E. coli dan S. aureus dengan zona penghambatan masing-

masing 7 mm dan 8 mm pada konsentrasi 1,5%. Sebagai antijamur, fraksi karbon

tetraklorida pada konsentrasi yang sama yaitu 1,5% menghasilkan zona hambat 7

mm pada C. albicans

Kumar et al. (2013) telah melakukan skrining fitokimia terhadap ekstrak

etanol daun trembesi dengan hasil positif terhadap alkaloid, flavonoid,

karbohidrat, glikosida, dan tanin. Prasad et al. (2008) juga telah melakukan

skrining fitokimia dan uji aktivitas antimikroba terhadap bakteri Escherichia coli

dan Staphylococcus aureus serta jamur Candida albicans dari ekstrak air daun

trembesi. Skrining fitokimia menunjukkan adanya tanin, flavonoid, saponin,

steroid, glikosida kardiak, dan terpenoid dalam ekstrak air daun trembesi. Hasil

terhadap uji antibakteri menunjukkan bahwa ekstrak air daun trembesi dapat

menghambat pertumbuhan semua bakteri uji. Daya hambat terhadap pertumbuhan

E.coli dapat terjadi pada konsentrasi minimal 5 mg/mL namun daya hambat

9

terhadap S. aureus and C. albicans dapat terjadi pada konsentrasi minimal 10

mg/mL.

Raghavendra et al. (2008) melaporkan bahwa ekstrak air daun trembesi

dapat menghambat bakteri patogen tanaman (Xanthomonas pathovars,

Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum, dan Xanthomonas campestris pv.

vesicatoria) dan 14 bakteri patogen pada manusia. Thippeswamy et al. (2011)

melaporkan aktivitas antibakteri dari enam ekstrak daun trembesi dengan pelarut

yang berbeda terhadap 21 mikroorganisme, dengan hasil menunjukkan ekstrak

metanol memiliki aktivitas antibakteri dengan zona inhibisi mulai dari 11 mm

hingga 3.5 mm pada konsentrasi 1 mg/mL. Ekstrak etanol memberikan hasil

maksimal untuk uji antijamur dengan persentase penghambatan mulai dari 20,4%

hingga 81,6% pada konsentrasi 1 mg/mL

Aktivitas trembesi sebagai antibakteri juga telah dilaporkan oleh Arulpriya

dan Hemalatha (2010), trembesi yang diekstrak dengan pelarut petroleum eter, etil

asetat, kloroform, dan larutan HCl difraksinasi menggunakan asam klorida,

diklorometana, heksana, dan aseton. Keempat fraksi yang diperoleh tersebut

diujikan pada bakteri E.coli dan S. aureus, serta jamur Aspergillus flavus dan

Candida albicans. Fraksi diklorometana menunjukkan aktivitas antimikroba

terbaik terhadap E. coli dan S. aureus. Sedangkan fraksi kloroform dan fraksi

diklorometana menunjukkan aktivitas yang baik terhadap Aspergillus niger.

Sebaliknya semua fraksi ini menunjukkan aktivitas baik terhadap Candida

albicans.

10

2.2 Kandungan Kimia Tumbuhan

Senyawa kimia yang terkandung dalam tumbuhan merupakan hasil

metabolisme dari tumbuhan itu sendiri. Senyawa kimia yang dihasilkan tersebut

secara umum disebut sebagai metabolit primer dan metabolit sekunder (Sitorus,

2010). Senyawa metabolit sekunder lebih dikenal bermanfaat dalam bioaktivitas

tumbuhan dan merupakan hasil metabolisme yang tidak merupakan kebutuhan

pokok untuk hidup dan tumbuh

Metabolit sekunder berfungsi sebagai nutrien darurat untuk

mempertahankan eksistensi tumbuhan dalam berinteraksi dengan ekosistem

(Sitorus, 2010). Secara khusus, senyawa metabolit sekunder mempunyai fungsi

sebagai alat pengikat (attractant) bagi serangga atau hewan lainnya sehingga

dapat membantu penyerbukan, sebagai alat penolak (repellant) terhadap gangguan

hama atau hewan pemangsanya, dan sebagai alat pelindung (protectant) terhadap

kondisi lingkungan fisik yang ekstrim (Cowan, 1999).

Penelitian mengenai senyawa metabolit sekunder yang bertanggungjawab

sebagai antibakteri telah banyak dilaporkan. Nadhila (2014) melaporkan bahwa

senyawa yang bertanggungjawab pada madu sebagai antibakteri Staphylococcus

aureus adalah flavonoid. Kurniawan dan Aryana (2015) melaporkan daun

binahong (Cassia alata L) memiliki kandungan flavanoid, saponin, terpenoid, dan

alkaloid yang berperan sebagai antibakteri.

2.2.1 Alkaloid

Alkaloid merupakan senyawa bersifat basa yang mengandung satu atau

lebih atom nitrogen dan bersifat optis aktif (Sitorus, 2010). Alkaloid umumnya

11

diisolasi dalam bentuk padatan kristal yang amorf yang memiliki titik didih

berkisar 87-238oC dan rasa pahit. Beberapa alkaloid juga berbentuk cairan,

contohnya adalah nikotin dan konini (Harborne, 1987). Sebagian besar alkaloid

tidak berwarna namun beberapa senyawa alkaloid berupa senyawa kompleks

aromatik berwarna. Pada umumnya alkaloid larut dalam pelarut organik namun

ada beberapa yang larut dalam air seperti pseudoalkaloid dan protoalkaloid,

bahkan garam alkaloid dan alkaloid kuartener sangat larut dalam air (Sitorus,

2010).

Terkait dengan adanya aktivitas antibakteri pada alkaloid, mekanisme

alkaloid sebagai antibakteri diduga terjadi melalui perusakan ikatan silang

komponen penyusun peptidoglikan pada dinding sel bakteri sehingga lapisan

dinding sel tidak terbentuk secara utuh dan menyebabkan sel bakteri lisis dan

mati. Selain itu, mekanisme alkaloid sebagai antibakteri terjadi melalui

penghambatan enzim topoisomerase yang mempunyai peran sangat penting dalam

proses replikasi, transkripsi, dan rekombinasi DNA dengan cara memotong

dan menyambungkan untai tunggal atau untai ganda DNA (Campbell, 2010 dalam

Taufiq dkk., 2015 dan Cowan, 1999).

Alkaloid dapat dideteksi salah satunya dengan metode Culvenor Fitsgerald

menggunakan pereaksi Mayer, Dragendorf, dan Bouchardat (Harborne, 1987).

Pada penambahan Mayer, hasil positif ditandai dengan terbentuknya endapan

berwarna putih atau kuning. Hasil positif Dragendorff ditunjukkan dengan

terbentuknya endapan berwarna merah bata. Penambahan Bouchardat

memberikan hasil positif jika terbentuk endapan coklat sampai hitam.

12

2.2.2 Terpenoid dan steroid

Terpenoid adalah senyawa yang kerangka karbonnya tersusun dari

penyambungan dua atau lebih isoprena (CH2=C-(CH3)-CH-CH2) (Harborne,

1987). Senyawa ini dibagi menjadi beberapa golongan berdasarkan jumlah satuan

isoprena yang terdapat dalam senyawa tersebut yaitu monoterpenoid (C10),

seskuiterpenoid (C15), diterpenoid (C20), triterpenoid (C25), tetraterpenoid (C30),

dan poliisoprena (Cn). Terpenoid memiliki sifat larut dalam lemak (Harborne,

1987)

Steroid adalah terpenoid yang kerangka dasarnya berupa sistem cincin

siklopentana perhidrofenantren dengan 17 atom karbon membentuk tiga cincin

sikloheksana dan satu cincin siklopentana (Sitorus, 2010). Steroid merupakan

golongan senyawa metabolit sekunder yang banyak dimanfaatkan sebagai obat

serta lebih dikenal berfungsi sebagai hormon. Hormon steroid pada umumnya

diperoleh dari senyawa-senyawa steroid alam terutama dalam tumbuhan (Sitorus,

2010).

Terpenoid dan steroid dapat dideteksi salah satunya dengan cara

pengendapan menggunakan pereaksi Liebermann-Burchard (asam asetat anhidrida

dan H2SO4 pekat dalam kloroform) (Harborne, 1987). Perubahan warna menjadi

kemerahan atau merah muda serta violet menunjukkan bahwa suatu tumbuhan

mengandung terpenoid. Apabila perubahan warna menjadi biru kehijauan maka

tumbuhan positif mengandung steroid.

Mekanisme terpenoid sebagai antibakteri adalah bereaksi dengan protein

transmembran atau porin pada membran luar dinding sel bakteri, membentuk

13

ikatan polimer yang kuat (Cowan, 1999). Adanya reaksi polimerisasi tersebut

mengakibatkan rusaknya porin. Rusaknya porin menyebabkan fungsi dinding sel

sebagai pintu keluar masuk senyawa mengalami gangguan akibat berkurangnya

permeabilitas dinding sel. Mekanisme tersebut mengakibatkan sel bakteri

kekurangan nutrisi, sehingga pertumbuhan bakteri terhambat atau mati (Cowan,

1999). Selain itu, menurut laporan Daisy et al. (2008), aktivitas yang dapat terjadi

adalah penghambatan aktivitas enzim autolisin pada S. aureus dengan membentuk

interaksi yang kuat pada sisi aktif residu enzim. Enzim autolisin merupakan enzim

yang terdapat pada peptidoglikan dinding sel bakteri yang berperan dalam proses

pertumbuhan sel, peremajaan dinding sel, pembentukan peptidoglikan, dan

pembelahan sel. Penghambatan aktivitas autolisin dapat mengurangi permeabilitas

dinding sel bakteri yang merupakan pintu keluar masuknya senyawa sehingga sel

bakteri kekurangan nutrisi, pertumbuhannya terhambat, dan mati.

2.2.3 Senyawa fenolik

Senyawa fenol meliputi aneka ragam senyawa yang berasal dari

tumbuhan, yang mengandung satu atau lebih gugus hidroksil yang terikat pada

cincin aromatik. Zat ini berperan dalam memberi warna pada tumbuhan. Senyawa

fenol cenderung larut dalam air karena umumnya berikatan dengan gula sebagai

glikosida dan biasanya terdapat pada vakuola sel (Sitorus, 2010).

Uji kualitatif senyawa fenol dapat dilakukan dengan menggunakan pereaksi

FeCl3 (Harborne, 1987 dan Sitorus, 2010). Bila terbentuk warna biru ungu

kehitaman maka uji positif terhadap senyawa fenolik.

14

2.2.4 Flavonoid

Flavonoid merupakan suatu senyawa terbesar di alam dan merupakan

kelompok senyawa fenol. Senyawa ini memiliki kerangka dasar yang terdiri atas

15 atom karbon. Markham (1988) menyatakan bahwa golongan flavonoid dapat

digambarkan sebagai deretan senyawa C6-C3-C6 yang berarti bahwa kerangka

karbonnya terdiri atas dua gugus C6 (cincin benzena tersubtitusi) disambungkan

oleh rantai alifatik tiga-karbon (rantai propana).

Flavonoid yang terdapat di alam dapat berupa flavonoid glikosida dan

aglikon, namun sebagian besar ditemukan dalam bentuk glikosida. Flavonoid

aglikon merupakan flavonoid yang tidak mengikat gula dan bersifat kurang polar

sehingga lebih mudah larut dalam pelarut eter atau kloroform. Sedangkan

flavonoid glikosida pada umumnya mudah larut dalam air atau campuran pelarut

yang polar karena adanya pengaruh gula yang terikat pada inti flavonoid. Ikatan

glikosida dapat terbentuk apabila gugus hidroksil dari alkohol diadisi oleh gugus

karbonil dari gula (Harborne, 1987).

Flavonoid memiliki mekanisme kerja hampir sama dengan senyawa

fenolik lain seperti tanin dalam menghambat pertumbuhan bakteri. Mekanisme

yang dilakukan yaitu dengan cara inaktivasi protein (enzim) pada membran sel

bakteri (Cowan, 1999). Adanya inaktivasi ini mengakibatkan struktur protein

menjadi rusak sehingga dinding sel dan membran sitoplasma tidak stabil.

Ketidakstabilan tersebut menyebabkan fungsi permeabilitas selektif, fungsi

pengangkutan aktif, pengendalian susunan protein dari sel bakteri menjadi

15

terganggu, yang berakibat pada hilangnya makromolekul dan ion dari sel,

sehingga sel bakteri menjadi kehilangan bentuk dan terjadi lisis (Cowan, 1999).

Uji fitokimia flavonoid dilakukan dengan test Wilstatter, Bate Smith-

Metcalfe, dan reaksi menggunakan NaOH 0,1M (Harborne, 1987). Test Wilstatter

dapat dilakukan dengan penambahan HCl pekat dan 2-3 potong kecil logam Mg

atau serbuk Mg, Reaksi positif apabila memberikan warna orange-merah. Test

Bate Smith-Metcalfe dilakukan dengan penambahan HCl pekat dan pemanasan

selama 15 menit diatas penangas air. Reaksi positif ditunjukkan oleh terbentuknya

warna merah. Pengujian dengan NaOH 0,1 M, memberikan hasil positif yang

ditandai dengan perubahan warna menjadi kuning.

2.2.5 Saponin

Saponin merupakan glikosida dari steroid, steroid alkaloid, atau steroid

dengan suatu fungsi nitrogen maupun triterpenoid yang ditemukan pada tanaman.

Saponin tersebar luas diantara tanaman tinggi yang memberikan rasa pahit

menusuk, menyebabkan bersin dan sering mengakibatkan iritasi terhadap selaput

lendir (Sitorus, 2010).

Senyawa saponin melakukan mekanisme penghambatan dengan cara

membentuk senyawa kompleks dengan membran sel melalui ikatan hidrogen,

sehingga dapat menghancurkan sifat permeabilitas dinding sel dan akhirnya dapat

menimbulkan kematian sel (Cowan, 1999). Selain itu, Zahro dan Agustini (2013)

melaporkan bahwa saponin mampu menurunkan tegangan permukaan dinding sel

bakteri karena saponin memiliki sifat sama seperti surfaktan yang dapat menarik

air dan melarutkan lemak pada dinding sel (Zahro dan Agustini, 2013). Apabila

16

tegangan permukaan dinding sel bakteri menurun, maka saponin membentuk

kompleks dengan sterol menghasilkan single ion channel. Adanya single ion

channel menyebabkan ketidakstabilan membran sel sehingga menghambat

aktivitas enzim, terutama enzim-enzim yang berperan dalam transpor ion yang

sangat berperan dalam kehidupan bakteri. Selain itu, penurunan tegangan

permukaan juga menyebabkan hancurnya protein dinding sel sehingga bakteri

mengalami lisis dan kematian (Zahro dan Agustini, 2013).

Keberadaan saponin dapat dideteksi berdasarkan kemampuanya

membentuk busa atau uji busa. Suatu sampel ekstrak tumbuhan dapat dinyatakan

positif saponin apabila sampel yang dilarutkan dalam air menimbulkan buih yang

stabil ketika dikocok (Harbone, 1987).

2.3 Bakteri

Bakteri adalah mikroorganisme uniseluler yang tidak memiliki klorofil, sel

bakteri mirip dengan sel tumbuhan atau hewan terdiri atas sitoplasma dan dinding

sel (Pratiwi, 2008). Bakteri berkembang biak dengan cara pembelahan diri yang

hanya dapat dilihat menggunakan mikroskop. Berdasarkan pewarnaan Gram,

bakteri dibedakan menjadi bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif.

Prosedur pewarnaan Gram ditemukan oleh ilmuwan Denmark bernama Christian

Gram dan merupakan prosedur penting dalam klasifikasi bakteri. (Jawetz et al.,

1995). Bakteri Gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna

kristal violet pada proses pewarnaan gram sehingga berwarna ungu di bawah

mikroskop. Sedangkan bakteri Gram negatif merupakan bakteri yang tidak

17

mampu mempertahankan warna kristal violet pada dinding selnya saat

perwarnaan gram dilakukan (Jawetz et al., 1995).

Perbedaan bakteri Gram positif dan negatif didasarkan pada perbedaan

struktur dinding. Secara umum perbedaan bakteri Gram positif dan bakteri Gram

negatif dapat dilihat dari beberapa karakteristik dan sifat seperti yang tersedia

pada Tabel 2.1.

Tabel 2.1Perbedaan Bakteri Gram Negatif dan Bakteri Gram Positif

SifatBakteri Gram

PositifBakteri Gram

NegatifDinding sel :Lapisan PeptidoglikanKadar Lipid

Lebih tebal1 – 4%

Lebih tipis11 – 22%

Toksin yang dibentuk Eksotoksin EndotoksinSifat tahan asam Ada yang tahan asam Tidak tahan

asamSensitifitas terhadap antibiotik Sensitif terhadap

penisilinSensitif terhadap

streptomisinSensitifitas terhadap senyawaalkali

Resisten terhadapsenyawa alkali

Sensitif terhadapalkali

Kelarutannya oleh 1% KOH Tidak larut oleh 1%KOH

Larut oleh 1% KOH

Sumber: Pelczar dan Chan, 2010

Selain itu, penggolongan kedua jenis bakteri ini dapat dijelaskan dengan

menggunakan dua teori yaitu Teori Salton dan Teori Permeabilitas Sel (Pelczar

dan Chan, 2010).

a) Teori Salton

Teori ini menjelaskan perbedaan bakteri Gram positif dan Gram negatif

berdasarkan kadar lipid yang terkandung dalam dinding sel nya. Pada bakteri

gram negatif dinding sel tersusun oleh kandungan lipid tinggi (20%). Zat lipid ini

18

larut selama pencucian dengan alkohol. Pori–pori pada dinding sel membesar,

sehingga zat warna yang sudah diserap mudah dilepaskan dan bakteri menjadi

tidak berwarna. Bakteri Gram positif mengalami denaturasi protein pada dinding

selnya oleh pencucian dengan alkohol. Protein menjadi keras dan beku serta pori-

pori mengecil sehingga kompleks ungu kristal iodium dipertahankan dan sel

bakteri tetap berwarna ungu. Bila dinding sel dilarutkan dengan lisosim maka

terbentuklah protoplasma. Sel melepaskan kompleks ungu kristal iodium setelah

dicuci dengan alkohol. Jadi dinding sel menahan keluarnya zat warna ungu. Teori

inilah yang dapat menjelaskan alasan bakteri Gram positif dapat mempertahankan

warna ungu dengan uji menggunakan iodium (Pelczar dan Chan, 2010).

b) Permeabilitas dinding sel

Teori ini menjelaskan perbedaan kedua jenis bakteri menjadi Gram positif

dan Gram negatif berdasarkan tebal tipisnya lapisan peptidoglikan dalam dinding

sel. Bakteri Gram positif mempunyai susunan dinding sel yang kompak dengan

lapisan peptidoglikan yang terdiri dari 30 lapisan. Peptidoglikan adalah komponen

utama dinding sel bakteri yang bersifat kaku dan bertanggungjawab untuk

menjaga integritas sel serta menentukan bentuknya. Tebalnya lapisan

peptidoglikan tersebut menyebabkan permeabilitas kurang dan komplek ungu

kristal iodium tidak dapat keluar sel. Bakteri gram negatif mempunyai lapisan

peptidoglikan yang tipis, hanya 1-2 lapisan dan susunan dinding sel tidak kompak.

Tipisnya lapisan tersebut menyebabkan permeabilitas dinding sel lebih besar,

sehingga masih memungkinkan terlepasnya kompleks ungu kristal iodium

(Pelczar dan Chan, 2010).

19

2.4 Bakteri Escherichia coli

Escherichia coli (E. coli) merupakan bakteri Gram negatif berbentuk

batang pendek yang memiliki panjang sekitar 2 µm; diameter 0,7 µm; lebar 0,4-

0,7 µm, bersifat anaerob fakultatif. E. coli membentuk koloni yang bundar,

cembung, dan halus dengan tepi yang nyata (Jawetz et al., 1995). E. coli

merupakan bakteri heterotrof yang memperoleh makanan berupa zat organik dari

lingkungannya karena tidak dapat menyusun sendiri zat organik yang dibutuhkana

sehingga diperoleh dari sisa organisme lain.

Bentuk mikroskopis E. coli dapat dilihat pada Gambar 2.2 dengan

klasifikasi berikut.

Kingdom : Eubacteria

Divisi : Proteobacteria

Class : Gamma Proteobacteria

Ordo : Enterobacteriales

Famili : Enterobacteriaceae

Genus : Escherichia

Species : Escherichia coli (Todar, 2008)

Escherichia coli merupakan flora normal usus yang berperan penting

dalam sintesis vitamin K, konversi pigmen-pigmen empedu, asam-asam empedu,

dan penyerapan zat-zat makanan (Haribi dan Yusron, 2010). Apabila jumlahnya

meningkat, maka E. coli akan menjadi patogen sehingga dapat menimbulkan

penyakit. Beberapa penyakit yang disebabkan oleh terlalu banyaknya jumlah E.

coli dalam tubuh yaitu infeksi saluran kemih, diare atau gangguan pencernaan

20

lainnya, sepsis, meningitis (E. coli dan S. aureus adalah penyebab utama

meningitis pada bayi) (Jawetz et al., 1995).

Peningkatan jumlah E. coli dapat terjadi melalui air yang terkontaminasi

kotoran manusia yang terinfeksi. Selain itu penularan juga dapat terjadi melalui

kontak dari pekerja yang terinfeksi selama proses pembuatan makanan sehingga

E. coli dapat menjadi salah satu penyebab penularan penyakit melalui makanan

(Foodborne disease) (Sanjaya dan Apriliana, 2009).

2.5 Bakteri Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus merupakan bakteri Gram positif yang tersusun

dalam rangkaian seperti anggur yang tidak beraturan dengan diameter 0,7-1,2 µm,

fakultatif anaerob, tidak membentuk spora, dan tidak bergerak. Bakteri ini tumbuh

pada suhu optimum 37ºC, tetapi membentuk pigmen paling baik pada suhu kamar

(20-25ºC) (Paryati, 2002 dalam Dewi, 2013).

Bentuk mikroskopis S. aureus dapat dilihat pada Gambar 2.3, dengan

klasifikasi sebagai berikut.

Gambar 2.2Bentuk Mikroskopis Koloni E. coli (Sciencedaily, 2009)

21

Kingdom : Bacteria

Divisi : Firmicutes

Class : Bacili

Ordo : Bacillales

Famili : Staphylococcaceae

Genus : Staphylococcus

Species : Staphylococcus Aureus (Seubert, 2008)

Staphylococcus aureus dapat memproduksi toksin dan dapat

mengkontaminasi dan meracuni makanan dan merupakan merupakan flora normal

pada lapisan mukosa kulit dan selaput mukosa manusia. Apabila jumlahnya

terlalu banyak dan terjadi luka maka dapat menyebabkan penanahan dan abses

(Jawetz et al., 1995). S. aureus yang patogen bersifat invasif, menyebabkan

hemolisis, membentuk koagulase, dan mampu meragikan manitol sehingga

menyebabkan infeksi (Elliot et al., 2013). Infeksi oleh S. aureus ditandai dengan

kerusakan jaringan yang disertai abses bernanah seperti pada penyakit infeksi

ringan yaitu jerawat dan bisul. S. aureus bahkan dapat menyebabkan infeksi berat

Gambar 2.3Bentuk Mikroskopis Koloni S. aureus (Afshinnekoo et al., 2015)

22

seperti osteomielitis, endokarditis, dan furunkulosis. S. aureus juga merupakan

penyebab utama infeksi nosokomial pada luka pasca operasi (Jawetz et al., 1995).

2.6 Zat Antibakteri

Zat antibakteri adalah zat yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri

dan dapat digunakan untuk kepentingan pengobatan infeksi pada manusia, hewan,

dan tumbuhan (Schunack 1990 dalam Aulya, 2012). Aktivitas antibakteri

ditentukan oleh interaksi zat tersebut dengan bakteri sehingga kualitas zat

antibakteri dapat ditentukan berdasarkan afinitas obat terhadap reseptor yang

terdapat dalam sel bakteri (Martina et al., 2012).

Aktivitas antibakteri yang dihasilkan oleh suatu senyawa dapat terjadi

karena adanya beberapa mekanisme antara zat antibakteri tersebut dengan bakteri.

Secara umum, aktivitas dari zat antibakteri terjadi melalui beberapa mekanisme

(Chusni & Lamb, 2005) yaitu:

a) Mengganggu proses sintesis dinding sel

Zat antibakteri dapat mengganggu sintesis dinding sel bakteri dengan cara

merusak lapisan peptidoglikan. Perusakan terjadi melalui pencegahan ikatan

silang peptidoglikan pada tahap akhir sintesis dinding sel dengan cara

menghambat protein pengikat penisilin (penicillin binding protein). Protein ini

merupakan enzim dalam membran plasma bakteri yang secara normal terlibat

dalam penambahan asam amino yang berikatan silang dengan peptidoglikan

dinding sel bakteri. Rusaknya lapisan penyusun ini menyebabkan dinding sel yang

terbentuk menjadi kurang sempurna dan tidak tahan terhadap tekanan osmosis,

23

sehingga menyebabkan mudah pecahnya sel atau lisis (de Kruijff et al., 2008;

Yount and Yeaman, 2013 dalam Guilhelmelli et al., 2013).

b) Merusak membran plasma

Zat antibakteri bekerja langsung pada membran plasma mikroorganisme,

meningkatkan permeabilitas dan menyebabkan kebocoran sel intraselular.

Membran plasma bersifat semipermiabel dan mengendalikan transport berbagai

metabolit ke dalam dan luar sel. Adanya kerusakan struktur pada membran plasma

sebagai penghalang osmosis dan mengganggu sejumlah proses biosintesis yang

diperlukan dalam membran (Chusni & Lamb, 2005).

c) Mengganggu sintesis protein sel

Enzim dan struktur selular bakteri tersusun dari protein. Sintesis protein

adalah proses penting yang diperlukan untuk multiplikasi dan kelangsungan hidup

semua sel bakteri. Beberapa jenis zat antibakteri menargetkan sintesis protein

bakteri dengan mengikat baik subunit 30S atau 50S dari ribosom intraseluler.

Mekanisme ini mengakibatkan terganggunya sintesis asam-asam amino dan

menghasilkan protein yang inaktif yang selanjutnya mengganggu metabolisme sel

normal bakteri, dan menyebabkan kematian organisme atau penghambatan

pertumbuhan dan multiplikasi (Pratiwi, 2008).

d) Mengganggu sintesis asam nukleat

Deoxyribonucleic acid (DNA) dan Ribonucleic acid (RNA) adalah kunci

untuk replikasi semua bentuk hidup, termasuk bakteri. Beberapa zat antibakteri

bekerja dengan mengikat komponen yang terlibat dalam proses sintesis DNA atau

24

RNA, yang menyebabkan gangguan proses sel normal yang pada akhirnya akan

mengganggu multiplikasi bakteri dan kelangsungan hidup (Pratiwi, 2008).

e) Antimetabolit

Antimetabolit merupakan substansi yang secara kompetitif menghambat

metabolit mikroorganisme, karena memiliki struktur yang mirip dengan substrat

normal untuk proses metabolisme sehingga proses metabolisme terhenti (Chusni

& Lamb, 2005).

2.7 Uji Aktivitas Antibakteri

Menurut Pratiwi (2008) pengujian aktivitas antibakteri dapat dilakukan

dengan dua metode yaitu dilusi dan difusi agar.

2.7.1. Metode dilusi

a) Dilusi cair (broth dilution test)

Dilusi cair dilakukan dengan mencampurkan zat antibakteri pada media

cair dengan pH 7-7,4 kemudian diencerkan dengan menggunakan beberapa

tabung reaksi. Campuran dimasukkan pada suspensi bakteri yang mengandung

bakteri uji yang telah disuspensikan dengan NaCl steril atau dengan TSB, yang

tiap milimeternya mengandung kurang lebih 105-106 bakteri (Pratiwi 2008).

Suspensi tersebut kemudian diinkubasikan pada suhu 37oC selama 18-24

jam dan diamati pertumbuhan bakterinya berdasarkan pada kekeruhan suspensi.

Tabung yang keruh menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri, sedangkan tabung

yang lebih bening menunjukkan bahwa zat antibakteri dapat menghambat

pertumbuhan bakteri yang diuji (Jawetz et al., 1995).

25

b) Dilusi padat (solid dilution test)

Zat antibakteri dicampur sampai homogen pada agar steril yang masih cair

dengan suhu serendah mungkin pada berbagai konsentrasi. Larutan tersebut

kemudian dituangkan ke dalam cawan petri steril dan setelah memadat dioleskan

bakteri uji pada permukaannya. Pertumbuhan bakteri ditandai oleh adanya

kekeruhan setelah 18-24 jam diinkubasi. Apabila media semakin bening artinya

zat antibakteri tersebut semakin efektif dalam menghambat pertumbuhan bakteri

(Pratiwi 2008).

2.7.2 Difusi agar

Metode difusi agar dapat dilakukan melalui beberapa teknik (Pratiwi,

2008) berikut.

a) Cakram kertas

Teknik cakram kertas dilakukan pada medium agar dalam cawan petri

yang diinokulasi dengan bakteri uji. Zat antibakteri yang akan diuji ditambahkan

pada cakram kertas dan didiamkan hingga mengering, kemudian cakram-cakram

tersebut diletakkan pada permukaan media agar dan diinkubasi 18-24 jam. Selama

inkubasi maka zat uji yang ditambahkan dalam cakram berdifusi ke dalam agar.

Apabila terdapat aktivitas antibakteri zat uji, maka akan terlihat zona inhibisi

(zona bening) di sekeliling kertas cakram. Diameter zona inhibisi ini sebanding

dengan konsentrasi, kelarutan, koefisien difusi, dan efektivitas antibakteri zat uji

(Pelczar dan Chan, 2011).

26

b) Silinder

Teknik ini dilakukan dengan meletakkan silinder pada permukaan agar

padat yang telah diinokulasi bakteri. Zat uji dimasukkan ke dalam silinder,

kemudian diinkubasi. Aktivitas antibakteri terlihat sebagai zona inhibisi atau zona

bening di sekeliling silinder (Pratiwi, 2008).

c) Teknik perforasi

Teknik perforasi menggunakan perforator untuk membuat lubang-lubang

pada agar padat yang telah diinokulasi dengan bakteri uji, lalu zat uji dimasukkan

ke dalam lubang-lubang tersebut. Aktivitas antibakteri dapat terlihat sebagai

daerah inhibisi atau zona bening yang terbentuk di sekeliling lubang (Pratiwi,

2008).

2.8 Media Uji Antibakteri

Media adalah bahan atau campuran bahan yang digunakan untuk

menumbuhkan dan mengembangbiakkan mikroba. Media yang digunakan harus

dalam keadaan steril dengan tujuan agar tidak ada mikroba lain yang tidak

diharapkan tumbuh sebelum media tersebut ditumbuhi mikroba yang akan

diujikan. Sterilisasi media di laboratorium memanfaatkan tekanan yang

disebabkan uap air pada suhu mencapai 121oC. Sterilisasi dapat terlaksana bila

mencapai tekanan 15 psi dengan suhu 121oC selama 15 menit. Media biakan yang

telah disterilkan harus diberi penutup agar tidak dicemari oleh mikroorganisme

yang terdapat disekelilingnya (Pratiwi, 2008).

27

Media dibedakan menjadi tiga jenis yaitu sebagai berikut :

a) Media cair, yang dapat digunakan untuk berbagai tujuan termasuk

membiakkan dan menumbuhkan mikroba misalnya Laktosa Broth, Nutrient

Broth dan lain sebagainya

b) Media padat, yang dapat digunakan untuk menumbuhkan mikroba pada

permukaannya sehingga membentuk koloni yang dapat dilihat, dihitung atau

diisolasi misalnya Nutrient Agar, Mueller Hinton Agar, dan lain-lain.

c) Media Setengah Padat, yang mempunyai kosistensi diantara media cair dan

media padat

2.9 Konsentrasi Hambat Minimum

Konsentrasi hambat minimum (KHM) adalah konsentrasi terkecil suatu zat

atau obat yang masih dapat menghambat pertumbuhan bakteri (Mahon dan

Manuselis, 1995 dalam Efendi dan Hertiani, 2013). KHM sangat penting

ditentukan untuk mengetahui dosis efektif terkecil dari obat dan memberikan

indek perbandingan dengan obat yang lain.

Menurut Mahon dan Manuselis (1995) dalam Efendi dan Hertiani (2013),

aktivitas antibakteri tertentu dapat ditingkatkan dari bakteriostatik menjadi

bakteriosida apabila kadar antibakteri ditingkatkan melebihi harga KHM. Respon

hambat pertumbuhan dari zat antibakteri dapat digolongkan seperti pada Tabel

2.2.

28

Tabel 2.2Klasifikasi Respon Hambatan Pertumbuhan Mikroba

Sumber: Ardiansyah (2005)

2.10 Toksisitas Akut

Toksisitas adalah efek merugikan yang timbul setelah pemberian suatu

bahan sebagai dosis tunggal yang diberikan dalam 24 jam (Ngatidjan, 2006).

Toksisitas akut ditentukan dengan melakukan penelitian pada hewan percobaan

untuk evaluasi keamanan dari kandungan kimia bahan uji. Evaluasi keamanan

melalui uji toksisitas akut dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan informasi

tentang rentang dosis yang mematikan hewan uji (Lethal dose atau LD)

(Ngatidjan, 2006).

Hewan uji yang dapat digunakan adalah mencit, tikus, dan anjing yang

sehat dan berasal dari satu galur yang jelas. Menurut Weil dalam Ngatidjan

(2006), untuk uji toksisitas minimal digunakan empat peringkat dosis, yang mana

untuk tiap peringkat dosis minimal terdiri dari empat ekor hewan uji. Jumlah

kematian hewan uji dipakai sebagai ukuran untuk efek toksik suatu bahan pada

sekelompok hewan uji. Jika hewan uji merupakan subjek maka respon berupa

kematian merupakan suatu respon diskretik yang berarti hanya ada dua macam

respon yaitu ada atau tidak ada kematian (Ngatidjan, 2006). Pemberian bahan

yang diteliti harus disesuaikan pemberiannya pada manusia, sehingga dapat

Diameter ZonaBening

Respon HambatanPertumbuhan

< 5 mm5 – 10 mm

>10 – 20 mm> 20 mm

LemahSedangKuat

Sangat kuat

29

mempermudah dalam melakukan ekstrapolasi dari hewan ke manusia (Ngatidjan,

2006).

Sediaan yang akan diuji dipersiapkan menurut cara yang sesuai dengan

karakteristik bahan kimia tersebut, dan tidak diperbolehkan adanya perubahan

selama waktu pemberian. Untuk pemberian per oral ditentukan standar volume

maksimal yang sesuai dengan hewan uji seperti Tabel 2.3. Selanjutnya, penentuan

LD50 dilakukan dengan cara menghitung jumlah kematian hewan uji yang terjadi

dalam 24 jam pertama sesudah pemberian dosis tunggal bahan. Namun demikian,

kematian dapat terjadi sesudah 24 jam pertama karena proses keracunan dapat

berjalan lambat. Gejala keracunan yang muncul sesudah 24 jam menunjukkan

bahwa bahan obat mempunyai titik tangkap kerja pada tingkat yang lebih bawah

sehingga gejala keracunan dan kematian seolah-olah tertunda (delayed toxicity).

Oleh karena itu banyak ahli berpendapat bahwa gejala keracunan perlu diamati

sampai 7 hari (Ngatidjan, 2006).

Tabel 2.3Daftar Volume Maksimal Bahan Uji pada Pemberian Secara Oral

Sumber : Ngatidjan, 2006

Jenis Hewan Berat Rerata Volume Maksimal

MencitTikus putih

HamsterMarmotKelinciKucingAnjing

20-30 g100 g50g

250 g2500 g3000 g5000 g

1 mL5 mL

2,5 mL10 mL20 mL50 mL100 mL

30

2.11 Metode Pengujian Toksisitas Akut

Pengujian toksisitas akut LD50 dapat dilakukan salah satunya dengan metode

C.S Weil (1952). Ketepatan dengan taraf kepercayaan tertentu dapat tercapai

dengan memanfaatkan tabel yang dibuat oleh Thompson dan Weil (1952). Pada

penggunaan tabel itu, percobaan harus memenuhi beberapa syarat berikut.

1. Jumlah hewan uji tiap kelompok peringkat dosis sama.

2. Interval merupakan kelipatan (d) atau faktor geometrik (R) tetap.

3. Jumlah kelompok paling tidak 4 peringkat dosis.

LD50 dapat dihitung dengan rumus :

Log (LD50 ) = log D + d (f+1)

D = dosis terendah

d = logaritma kelipatan dosis

f = faktor yang diperoleh dari tabel Thompson dan Weil (dilihat dari nilai r

yaitu banyaknya hewan coba yang mati tiap perlakuan)

Harga LD50 menunjukkan nilai ketoksikan suatu bahan yang ditunjukkan

pada Tabel 2.4.

Tabel 2.4Klasifikasi Zat Kimia Sesuai dengan Toksisitas Relatifnya

Kategori LD50

Supertoksik < 5 mg/kgBBAmat sangat toksik 5 - 50 mg/kg BB

Sangat toksik 50-500 mg/kg BBToksik sedang 0,5 -5 g/kgBBToksik ringan 5 - 15 g/kgBB

Praktis tidak toksik >15 g/kg BB

Sumber : Canadian Centre for Occupational Health & Safety, 2016

31

2.12 Ekstraksi

Ekstraksi adalah teknik pemisahan suatu campuran beberapa komponen

menjadi komponen yang terpisah (Wonorahardjo, 2013). Pada umumnya senyawa

aktif pada tanaman diperoleh dengan cara ekstraksi menggunakan pelarut. Pada

proses ekstraksi, senyawa metabolit sekunder dapat tertarik ke luar dari dalam

tumbuhan oleh pelarut karena terjadi pembengkakan dinding sel dan pelonggaran

kerangka selulosa dinding sel sehingga pori-pori dinding sel menjadi melebar.

Pelebaran dinding sel menyebabkan pelarut dapat dengan leluasa masuk

ke dalam sel. Bahan isi sel, yang mana di dalamnya terdapat senyawa-senyawa

metabolit sekunder yang memiliki bioaktivitas tertentu kemudian terlarut dalam

pelarut sesuai dengan tingkat kelarutannya lalu berdifusi keluar akibat adanya

gaya yang ditimbulkan perbedaan konsentrasi bahan terlarut yang terdapat di

dalam dan di luar sel (Pambayun dkk., 2007).

Perbedaan struktur kimia akan mempengaruhi kelarutan serta stabilitas

senyawa-senyawa tersebut terhadap pemanasan, udara, cahaya, logam berat, dan

derajat keasaman. Metode ekstraksi dipilih berdasarkan beberapa faktor seperti

sifat dari bahan organik, senyawa yang ingin diisolasi, dan daya penyesuaian

dengan tiga macam metode ekstraksi yaitu metode maserasi, sokhletasi, dan

perkolasi.

Maserasi merupakan metode yang paling banyak dipergunakan karena

relatif sederhana, dan tidak membutuhkan pemanasan sehingga aman untuk

komponen yang tidak stabil pada pemanasan. Metode ini digunakan dengan cara

merendam sampel dengan pelarut yang sesuai, baik murni maupun campuran dan

32

terlindung dari cahaya langsung sehingga mencegah reaksi yang dikatalisis

cahaya atau perubahan warna (Harborne, 1987). Setiap waktu tertentu, misalnya

24 jam filtrat diambil dan residu sampel ditambahi pelarut baru. Peristiwa tersebut

berulang sampai terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di

dalam sel karena hampir semua metabolit yang diperkirakan ada dalam sampel

terekstrak. Proses tersebut umumnya ditandai dengan warna filtrat yang lebih

bening. Hasil dari proses ekstraksi dikumpulkan untuk penelitian tahap

selanjutnya.

Metode sokhletasi digunakan untuk mengekstrak komponen kimia dengan

menggunakan serangkaian alat sokhlet. Penggunaan sokhlet dapat menghemat

pelarut yang digunakan, umumnya digunakan untuk mengekstrak komponen yang

jumlahnya sedikit, namun komponen yang akan diekstrak harus relatif tahan

terhadap panas (Harborne, 1987). Pada metode sokhlet, pelarut (dalam labu yang

direndam penangas air pada suhu tertentu) dipanaskan, kemudian uap pelarut

akan naik ke bagian atas sokhlet dan didinginkan oleh air dingin yang mengalir

secara terus menerus pada kondensor. Uap pelarut akan mengembun kembali

dan mengalir ke bawah membasahi atau merendam sampel. Sampel akan

terendam secara kontinyu dalam pelarut yang selalu dalam keadaan bersih.

Metode perkolasi dilakukan dengan cara melewatkan pelarut yang tidak

mudah menguap tetes demi tetes pada sampel yang diekstrak. Prosesnya

dilakukan secara terus menerus hingga filtrat yang dihasilkan bening. Metode

perkolasi jarang digunakan dalam ekstraksi karena membutuhkan pelarut yang

lebih banyak.

33

Persiapan yang umumnya dilakukan sebelum ekstraksi adalah dengan

melakukan proses pengeringan tanpa adanya peran sinar matahari yang dapat

menimbulkan reaksi yang merusak senyawa aktif dalam sampel. Setelah kering,

dilakukan penghalusan atau penghancuran dengan derajat kehalusan tertentu,

kemudian diekstraksi dengan salah satu metode ekstraksi serta pelarut yang telah

ditentukan. Hasil ekstraksi dari ketiga metode berupa filtrat. Untuk mendapatkan

larutan ekstrak yang pekat dari filtrat maka pelarut dari ekstrak dapat diuapkan

dengan menggunakan alat rotary evaporator (Harborne, 1987). Pada umumnya

ekstrak yang dihasilkan dari ekstraksi awal disebut ekstrak kasar (crude extract)

yang mengandung campuran senyawa-senyawa metabolit sekunder dari sampel

uji.

Pemilihan pelarut sangat penting untuk mengekstraksi senyawa aktif yang

bermanfaat sebagai antibakteri. Menurut Cowan (1999), senyawa polifenol yang

terdapat pada tumbuhan dan banyak dilaporkan berfungsi sebagai antibakteri

umumnya diekstrak dengan metanol dan etanol. Sementara itu, penelitian yang

dilakukan Thippeswamy (2011) mengenai aktivitas antibakteri daun trembesi

menggunakan beberapa pelarut yaitu air, petroleum eter, kloroform, metanol, dan

etanol, memberikan hasil bahwa pelarut etanol dan metanol merupakan pelarut

yang dapat memberikan aktivitas antibakteri yang lebih baik terhadap beberapa

jenis bakteri serta mampu mengekstraksi senyawa golongan polifenol, khususnya

flavonoid

Senyawa aktif antibakteri yang sebagian besar berupa polifenol memiliki

spektrum luas dengan sifat kelarutan pada suatu pelarut yang berbeda-beda. Hal

34

ini disebabkan oleh gugus hidroksil yang dimiliki oleh senyawa tersebut berbeda

jumlah dan posisinya. Dengan demikian, ekstraksi menggunakan berbagai pelarut

akan menghasilkan komponen polifenol dan keaktifan yang berbeda (Pambayun

dkk., 2007).