LibroFundamentos y Técnicas de Análisis Hematológicos y CitológicosEd. Paraninfo: Pág. 473

IES Miguel de Cervantes. MurciaCiclo Laboratorio de Diagnóstico ClínicoFundamentos y Técnicas de Análisis Hematológicos

José Ángel Pina Alburquerque

54 – Técnicas de Biología Molecular2ª parte de tres

Amplificación de ácidos nucleicos in vitro.Amplificación de ácidos nucleicos in vitro.

Reacción en Cadena de la PolimerasaReacción en Cadena de la Polimerasa• PCRPCR: 

Polymerase Chain Reaction.• Técnica de biología

molecular desarrollada en 1985 por Kary Mullis.

• Su objetivo es obtener in vitro un gran número de copias (millones) de un fragmento de ADN concreto, partiendo de una muestra mínima (ADN molde).

Reacción en Cadena de la PolimerasaReacción en Cadena de la Polimerasa

•En 1993, Mullis ganó el premio Nobel de Química por su trabajo sobre la PCR.

•http://www.dnalc.org/view/15138-Naming-PCR.html•http://www.dnalc.org/view/15139-Finding-DNA-to-copy-Kary-Mullis.html

• Utilidad: Tras la amplificación (y a veces en combinación con técnicas de secuenciación) se utiliza para:– Identificar virus o bacterias

patógenos.– Identificar enfermedades genéti

cas.– Medicina forense (Identificar

personas o cadáveres).– Pruebas de paternidad– Investigación científica.

Reacción en Cadena de la PolimerasaReacción en Cadena de la Polimerasa

RecuerdaRecuerda::Replicación del ADNReplicación del ADN•En sentido 5' → 3'

•Hebra adelantada (leading strand )

•Hebra retrasada (lagging strand ) y formación de los fragmentos de OkazaKi (≈ 2 Kb)

•http://es.wikipedia.org/wiki/Sintesis_de_ADN

•http://www.youtube.com/watch?v=-EGKrYdQEHQ

3’3’5’5’5’5’ 3’3’

PCR: ReactivosPCR: Reactivos• ADN molde (diana o

template):• Desoxinucleótidos

(dNTP).• Oligonucleótidos

(Cebadores o primers).• ADN Polimerasa.• Tampón: Con MgCl2 y

pH 8,4.

PCR: ReactivosPCR: Reactivos

ADN molde ADN molde (diana):(diana):

• DNA bicatenario: Se necesita su extracción previa a partir de la muestra biológica.

PCR: ReactivosPCR: ReactivosDesoxinucleótidos (dNTP):• dATP, dTTP, dCTP, dGTP

PCR: ReactivosPCR: Reactivos

• Son cadenas breves de nucleótidos (20 - 30) capaces de reconocer una secuencia complementaria del ADN diana y unirse ella por hibridación.

• Se necesitan dos cebadores por PCR: Uno para cada cadena del ADN.

• Delimitan los extremos del fragmento a replicar.• Tienen una Tm (Melting Temperature) característica.

Oligonucleótidos (cebadores o primers):Oligonucleótidos (cebadores o primers):

•Tm es la temperatura a la que la mitad de las cadenas de ADN están en forma de doble cadena y la otra mitad como simple cadena.

PCR: ReactivosPCR: ReactivosOligonucleótidos (cebadores o primers):Oligonucleótidos (cebadores o primers):

PCR: ReactivosPCR: Reactivos ADN PolimerasaADN Polimerasa• Enzima que elonga un cebador (primer) fijado en el

extremo 3’ de una cadena molde ADN.• Añade desoxinucleótidos al extremo 3’ del cebador y en

dirección 5’ del ADN molde.(DNA)n + dNTP → (DNA)n+1 + PPi(DNA)n + dNTP → (DNA)n+1 + PPi

5’ 3’5’3’

3’ 5’5’ 3’

PCR: ReactivosPCR: Reactivos ADN PolimerasaADN Polimerasa

• Thermus aquaticus (Taq polimerasa)

• Pyrococcus furiosus (Pfu)• Thermococcus litoralis

(Vent)• Thermus termophilus (Tth)

•Se utilizan ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a altas temperaturas.

•A veces se emplean mezclas de polimerasas rápidas (Taq) con otras capaces de hacer corrección de errores (Pfu, Vent).

PCRPCR• La reacción es muy

sencilla:– Necesita cantidades de

ADN muy pequeñas como diana.

– Un tubo de ensayo (tubo eppendorf)

– Los reactivos mencionados (dNTPs, polimerasa)

– Pequeñas cadena de nucleótidos que actúan como cebadores (primers).

– Una fuente de calor: El termociclador

Proceso de la PCR:Proceso de la PCR:Consiste en una serie de cambios de temperaturaConsiste en una serie de cambios de temperatura• La molécula de ADN que va a copiarse se calienta a 94ºC para que

se desnaturalice y se separen las dos hebras.• Después se someten a cambios de temperatura que se repiten 25 -

40 veces, llamados ciclos, donde cada uno posee un mínimo de tres etapas:

1. DESNATURALIZACIÓN → A 94°C: Permite la separación de las dos cadenas de ácidos nucleicos formados en el ciclo anterior.

2. ALINEAMIENTO (annealing) → A 50-60 °C: Permite la hibridación de los cebadores al ADN molde (la temperatura depende de la Tm de los oligos).

3. POLIMERIZACIÓN → A 68 - 72 °C : La Taq-polimerasa trabaja a 72ºC, con una velocidad de 1000 bases por minuto).

• Vuelve al punto 1 (unos 25 a 40 ciclos).

• Tras una polimerización final, el ADN formado se mantiene en frío (4ºC)

Ejemplo de programa de PCREjemplo de programa de PCR

PCR• http://www.dnalc.org/view/15924-Making-many-copies-of-DNA.html

• http://www.dnalc.org/view/15475-The-cycles-of-the-polymerase-chain-reaction-PCR-3D-animation-with-no-audio.html

Detección del ADN amplificado (amplicones)Detección del ADN amplificado (amplicones)

• Electroforesis en gel:– Gel de agarosa– Gel de poliacrilamida

• Hibridación con sondas.• Secuenciación.

PCR cuantitativaPCR cuantitativa(o PCR en tiempo real)(o PCR en tiempo real)

• qPCR, Q-PCR (quantitative polymerase chain reaction) o PCR en tiempo real (real time PCR)

• Variante de la PCR utilizada para amplificar y simultáneamente simultáneamente cuantificarcuantificar de forma absoluta el ADN en el mismo vial cerrado, sin necesidad de ninguna acción posterior.

Ver en: http://external.elsevier.es/espacioformacion/eimc/temas/m2t12.pdf

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1360278/pdf/0060-04.pdf

PCR cuantitativaPCR cuantitativa(o PCR en tiempo real)(o PCR en tiempo real)

• Se incorporan fluorocromos:– La emisión de fluorescencia

producida en la reacción es proporcional a la cantidad de ADN formado.

• Se usa un termociclador con sensores:– Miden la fluorescencia

después de cada ciclo de amplificación, tras excitar el fluorocromo a la longitud de onda apropiada.

• Dos tipos de fluorocromos:– Agentes intercalantes.– Sondas específicas marcadas

con fluorocromos.Ciclo umbral (Ct, de threshold cycle):Ciclo en el que se empieza a detectar un aumento de fluorescencia significativo respecto a la señal base.

Una variante de la PCR:Una variante de la PCR:PCR tras transcripción inversa (PCR tras transcripción inversa (RT-PCR)RT-PCR)

• RT-PCR: Reverse Transcriptase PCR

• Una hebra de ARN es retrotranscrita en cADN usando una transcriptasa inversa, y el resultado, se amplifica en una PCR tradicional.

• (RT-PCR no debe ser confundido con la PCR en tiempo real)

•También existe RT-PCR cuantitativa (RT-PCR en tiempo real o RT-Q-PCR): Permite cuantificar carga viral en virus ARN.

PCR MultiplexPCR Multiplex • PCR en la cual se

amplifica más de una secuencia en una misma reacción.

• Emplea dos o más pares de cebadores en único tubo con el fin de amplificar al mismo tiempo múltiples segmentos de ADN

• Permite detectar microsatélites y SNPs

Técnicas de Biología MolecularFin de la 2ª parte de tres

Continúa en:

Técnicas de Biología Molecular: 3ª parte de tres