1

2

DNS: dezoxiribonukleinsav, DNA <ang.>: olyan nukleotidegységekből felépülő nukleinsavak gyűjtőneve,

amelyek dezoxiribóz cukorrészt tartalmaznak. A gének kódolására, és továbbadására szolgálnak.

RNS: ribonukleinsav, RNA <ang.>: olyan nukleotid egységekből felépülő nukleinsav, amely

cukorrészként ribózt tartalmaz, előfordul minden élő sejtben, valamint egyes vírusokban.

Nukleotidok: (= bázis + cukor + foszfát) a nukleozidok foszforsav-észtereinek gyűjtőneve. A bennük szereplő

cukorrész (D-ribóz v. 2-dezoxi-D-ribóz) alapján megkülönböztetik a ribonukleotidok és a

dezoxiribonukleotidok csoportját.

Nukleozidok: (= bázis + cukor) szűkebb értelemben a nukleinsavakban előforduló pirimidin- és purinbázisok

N-ribozid, ill. N-2’-dezoxiribozid típusú glikozidjainak gyűjtőneve (citidin, uridin, timidin,

adenozin, guanozin). A ~okban a cukorrész mindig furanóz szerekezetű, az N-glikozidos

szénatom pedig -konfigurációjú.

Nukleinsavak (DNS, RNS): <lat. nucleus ‘mag’>: (= bázis+cukor+foszfát -> polimer) nukleotidokból felépülő

óriásmolekulák (biopolimerek), amelyek minden sejtben és a virusokban is megtalálhatók, azoknak

esszenciális alkotórészei. ~akat először F. Miescher (1869) különített el a genny fehérvérsejtjeiből.

Watson–Crick-modell: a DNS térszerkezetét leíró térszerkezeti modell. A ~ szerint a DNS-molekula kettős

hélixét két, ellentétes lefutású (antiparalel) polinukleotid-lánc alkotja. A két láncot a

komplementer bázispárok (adenin–timin, guanin–citozin) között létrejött hidrogénkötések

tartják össze. A kettőshélix-szerkezetet J. D. Watson és F. Crick javasolta 1953-ban. A ~ szerint a

polinukleotid-láncokat helikális szerkezetű cukorfoszfátváz építi fel; a hélix tengelyére merőleges

irányban, a hélix belseje felé helyezkednek el a nukleinsavbázisok. A ~ alapján jól magyarázható a

genetikai információ megőrzése és átadása.

DNS kettős hélix/spirál: → Watson–Crick-modell DNS-replikáció: A DNS mindkét szálának megduplázódása, amely során egy DNS kettős spirálból létrejön

kettő, az eredetivel azonos DNS kettős spirál.

Transzkripció: Atírás (DNS->RNS) amely során a DNS-függő RNS polimeráz a rendelkezésére álló nukleozid

5’-trifoszfátokból RNS-t hoz létre. Fontosabb lépései: iniciáció, elongáció és termináció.

Transzláció: Fehérje bioszintézis (RNS->Fehérje), amely során a riboszóma az RNS alapján, a rendelkezésre

álló (és megfelelő aminosavat hordozó) tRNS-ek segítségével megszintetizálja az adott fehérjét.

A nukleinsavkémiai kisszótár:

3

Mutáció: Az eredetihez képesti elváltozás a DNS-ben (más vagy hiányzó nukleotid(ok))

Riboszóma: A fehérjeszintézist = transzlációt végző ribozim, mely 2 rRNS és több fehérjéből áll.

Ribozim: sejtszervecske, ribonukleo-protein komplex: egy bizonyos enzimatikus feladatot ellátó

(egy bizonyos reakciót katalizáló) RNS.

Enzim: Egy bizonyos enzimatikus feladatot ellátó (bizonyos reakciót katalizáló) fehérje.

mRNS: hírvivő vagy messenger RNS: átmeneti adathordozóként szolgál (DNS -> mRNS ->

Fehérje)

rRNS: riboszomális RNS: a riboszóma fő alkotóeleme, a katalitikusan aktív része.

tRNS: átvivő vagy transzfer RNS: Antikodont és az annak megfelelő aminosavat (ill. kötőhelyét)

tartalmazó RNS. Az aminosavakat a riboszómához szállítja, az mRNS-en lévő kodonokat

antikodonja segítségével ismeri fel (bázispárosodás elve)

aminoacil-tRNS szintetáz: adott aminosavat a megfelelő tRNS-hez kapcsoló enzim

genetikai kód: a nukleinsavszekvenciák aminosavszekvenciára „fordítását” meghatározó

szabályrendszer, az mRNS 3 bázisa alkot egy kodont, ami egy aminosavat határoz meg oly módon,

hogy adott antikodonú tRNS ismeri fel a transzláció során

Kodon: Nukleotid-hármas a DNS/RNS-en, mely egy-egy aminosavat kódol

Kromoszóma: (a görög chroma=színes és soma=test) egyetlen hosszú DNS, amely számos gént,

szabályozó és egyéb szekvenciákat tartalmaz.

Kromatin: a kromoszóma anyaga, mely eukarióta sejtekben DNS (rendszerint kettős szálú) és

fehérje komplexe. (Festhető, innen a neve.) Antikodon: Nukleotid-hármas a tRNS-en, mely reverz-komplementje a kodonnak (tehát Watson-

Crick párosítással illeszkedik a kodonhoz transzláció közben)

Gén: Az öröklődő DNS egy fehérjét kódoló része.

Genom: A gének összesége (egy egyedben/fajban), pl. a humán (emberi) genom.

Exon: Egy gén/mRNS azon része(i), mely(ek) tényleges fehérjeszekvenciát kódól(nak)

Intron: Egy gén/mRNS azon része(i), mely(ek) nem kódolnak fehérjeszekvenciát, és az

RNS érés során (transzkripció és transzláció között) kivágódnak, pre-mRNS -> m-RNS.

4

Restrikciós endonukleáz: DNS-hasító enzim, mely csak egy meghatározott szekvencia

egy meghatározott pontján hasítja a DNS-t.

Palindrom szekvencia: DNS szekvencia, mely megegyezik a reverz-komplementjével,

pl. AATT, GGATCC, stb.

Antiszensz oligonukleotid: A kódoló DNS szálhoz kapcsolódó oligonukleotid, amely speciális

szakaszhoz kötődve gátolhatja a DNS átíródását (transzkipciót).

PCR: Polimerase-Chain-Reaction: polimeráz-láncreakció, egy eljárás a sejten-kívüli (in vitro)

DNS sokszorosítására. (templát DNS + primer + polimeráz +

+ nukleotidok(monomerek) + hőmérsékletváltakozás = sokszorozódás)

RNS- polimeráz: egy enzim amely széttekeri a DNS kettős spirált

Promoter: a DNS-nek az a része ahova az RNS-polimeráz kötődik és

ahol megkezdi a transzkripciót

RNS nukleotidok, mint építőelemek

Terminátor: prokarióták azon DNS része ami jezi a transzkripció végét

Transzkripciós egység: Az a DNS darab ami RNS-é átíródik.

Transzkripcós factorok: az eukarióta sejtek azon fehérjéi amelyek az

RNS-polimeráz kötését, illetve a transzkripció megkezdését elősegítik.

Transzkripciós Iniciációs Komplex: A transzkripciós faktorok és a

promoter régióhoz kapcsolódó RNS-polimeráz II együttese.

TATA Box: A DNS promoter része

5

A nukleinsavkémia koronázatlan királyai:

Johannes Friedrich

Miescher

svájci orvos-kémikus

1869-ban felfedezi és

izolálja a DNS-t.

Lord Alexander

R. Todd (angol biokémikus)

1957 Nobel-díj

A nukleotidok és a

nukleotid koenzimek

felfedezéséért

Francis Harry

Compton Crick

James Dewey

Watson

Maurice Hugh

Frederick Wilkins

1962 Nobel-díj a DNS molekuláris

szerkezetének felismeréséért

Oswald T. Avery (DNS a kromószóma anyaga)

Rosalind Franklin

Picture

51

6

A nukleinsavkémia koronázatlan királyai,

kémiai és orvosi Nobel-díjak:

Paul

Berg

Walter

Gilbert

Frederick

Sanger 1980

rekombináns-DNS A nukleinsavak

szekvenálásáért 1972 Nobel-díj

a ribonukleáz aktív centrumának

katalitikus aktivitása és kémiai szerkezete

közötti kapcsolat feltárásáért

Stanford Moore és William H. Stein

amerikai biokémikusok

Aaron Klug (angol kémikus ) 1982 Nobel-díj a krisztallográfiai elektronmikroszkóp kifejlesztéséért

illetve a bilológiai szempontból fontos nukleinsav-

fehérjekomplexek szerkezetfelderítéséért

Luis Federico Leloir (argentín biokkémikus)

1970 Nobel-díj

a cukor nukleotidok

felfedezéséért és a

szénhidrátok

bioszintézise kapcsán

elért eredményeiért

7

Sidney Altman és Thomas R. Cech

Amerikai/kanadai és amerikai kémikus

1989 Nobel-díj az RNS katalitikus

tulajdonságainak felfedezéséért.

Polimeráz

láncreakció (PCR)

Kary B. Mullis Michael Smith

1993 Nobel-díj Irányított

mutagenezis

Sir James

W. Black

Gertrude

B. Elion

George H.

Hitchings

1988 Nobel-díj a purin alapú kemoterápiás

gyógyszerek kifejlesztéséért

Venkatraman

Ramakrishnan

Thomas

Steitz Ada Yonath

2009 Nobel-díj

a riboszóma szerkezetének és

funkciójának tanulmányozásáért

8

9

Nukleinsavak:

1) A kromoszóma és felépítése

2) DNS- RNS építőelemek:

Nukleozidok, nukleotidok, nukleinsavak

Nem-RNS és -DNS alkotó purinszármazékok

A DNS térszerkezete, a bázispárok

3) DNS nanorendszerek

4) DNS (RNS) reaktivitása:

hidrolízise

az építőelemek kémiai szintézise

kémiai (szilárdfázisú) szintézis

enzimatikus szintézis: a replikáció

5) Transzkripció

6) Transzláció

7) DNS analitika: szekvenálás

8) Bioenergetika

10

A prokarióták, körülhatárolt sejtmag

nélküli élőlények, tipikusan

egysejtűek, ilyenek az archeák és a

baktériumok

Az eukarióták olyan élőlények, amelyek valódi

sejtmaggal (a mag anyagát a citoplazmától egy

maghártya választja el) rendelkező sejtekből

épülnek fel (eu = valódi, karyon = sejtmag).

Mind a prokatiota-, mind az eukarióta-

sejtekben az információtárolásra a DNS

hivatott.

Egy eukarióta sejt genetikai anyagának többsége a

sejtmagban, kromoszómák formájában van tárolva. papucsállatka Escherichia coli

baktérium

1) A kromoszóma és felépítése

11

Fajfüggő az eukarióta sejtek

kromoszómáinak a száma:

rozs 14

galamb 16

giliszta 36

mezei nyúl 46

ember 46

csimpánz 48

kutya 78

ponty 104

pillangó 380

páfrány 1200

A szexuális úton szaporodó fajok mind testi

1) diploid (két kromoszómakészlet; 44+2)

vagy poliploid (több készlet; triploid –

magnélküli dinnye, stb.),

mind

2) haploid (egy készlet; 22+1) ivari

sejtekkel rendelkeznek.

Egy férfi diploid sejt kariogramja:

22*2 testi kromoszóma = 44

2 nemi kromoszóma: X és Y = 2

Σ= 46

Egy női diploid sejt kariogramja:

22*2 testi kromoszóma = 44

2 nemi kromoszóma: X + X = 2

Σ= 46

22*2+2 szabály

12

Egy női diploid sejt kariogramja:

22*2 testi kromoszóma = 44

2 nemi kromoszóma (X és X) = 2

kromoszóma gének

száma

bázispárok

száma

1 2 968 245 203 898

2 2 288 243 315 028

13 7 48 114 151 656

21 303 46 976 537

22 288 49 476 972

X (ivari kromoszóma) 1184 152 634 166

Y (ivari kromoszóma) 231 50 961 097

összesen = 46 ~30.000 ~3,2 109

„örökségünk”:

minden diploid sejt

kromoszóma-párja egy

anyai és egy apai

kromoszómát tartalmaz

apai anyai

3,2 gigabyte-nyi betűt

13

Egy eukarióta sejtciklusa: a sejtosztódás lépései: A G0 fázisban a sejtek változatlan

állapotba kerülnek, várva a sejtciklusba

vezető jelre.

- G1 fázis: első növekedési szakasz,

- S fázis: a DNS replikálódik

(46-ból 92 kromószóma lesz)

- G2 fázis: második növekedési szakasz,

és felkészülés az osztódásra,

- M fázis (vagy mitózis + citokinézis):

a sejt két utódsejtre válik szét

14

Egy kromoszómapár

vélelmezett

hierarchikus

szerkezeti

elrendeződése.

A feladat:

az eukarióta sejtek

mintegy 3.2 milliárdnyi

bázispárját feltekerve, azt

néhány mikrométerbe

tömöríteni.

0,2

-2 μ

m

15

A kódolo DNS aránya a

teljes genomhoz

viszonyított (%)

mindig jobb menetes, antiparallel, (kivéve a Z-DNS)

az egészet a H-hidak tartják egyben.

A nukleoszóma

a 8 histon fehérjét

körülölelő 146

bázispárnyi DNS-ből

áll. A komplexet a

H1 linker fehérjék

stabilizálják.

Eukarióta sejtek génjében van nem-

kódoló rész; intronok. (prokarióta

sejtekben tipikusan nincs intron.) Az

intron a pre-mRNS-be átíródik, majd

az RNS érés során az kivágódik.

A „supercoiling” 15000*

kondenzációt tesz lehetővé

kromatin

centromer

telomer régiók

A nukleoszóma

146bp DNS-t

tartalmaz

egy 8 hisztonból álló

fehérjemag köré

csavarva

16

1) Giemsa-festés: a „bázikus” festék a P-O−

gerinchez kötődik, de különösen az A-T

bázispárban gazdag régiókhoz (A-T résznél

sötétebb a szín)

2) Quinacrine-festés

fluoreszcens festés

Kromoszóma: (a görög chroma=színes és soma=test) egyetlen hosszú DNS, amely számos gént,

szabályozó és egyéb szekvenciákat tartalmaz.

Gustav Giemsa

(1867 – 1948),

német mikrobiológus

17

A nukleinsavak két fő fajtája a - dezoxiribonukleinsavak (DNS)

- ribonukleinsavak (RNS)

Kémiai építőelemek: nukleotidok és nukleozidok

N

OH OH

O

OP

O

HO

OH -N-glikozidos kötés

heterociklusos

bázis

egy nukleotid

1'2'3'4'

5'

hidrolízis

•heterociklusos bázis: purin vagy pirimidin

•ötszénatomos monoszacharid: D-ribóz vagy 2-dezoxi-D-ribóz

•foszfátion

- Savanyú jellegű (híg lúgban oldódó), nagy molekulasúlyú polimer vegyület.

- Olyan molekulák, amelyek az átörökítendő információ tárolására, annak átírására

(transzkripció) és átfordítására (transzláció) alkalmasak, aminek köszönhetően a sejt

összes fehérjéje meg tud szintetizálódni . (Alkalmasak továbbá reakciók katalízisére is.)

memo: nucleus = sejtmag 2) DNS- RNS építőelemek

18

Nukleinsav (polinukleotid) Foszforsavészterek hidrolízise:

Nukleozid (glikozid) + H3PO4

cc. NH3, 180 °C

HO

O

HO Q

NN

N

N

NH2

Q=OH adenozinQ=H dezoxiadenozin

nukleotidáz

H+

Nukleotidbázis + pentóz

(nucleobase)

A N-glikozidkötés hidrolízise:

purin

nukleozid

foszforiláz*

* Ez a foszforiláz

valójában egy hidroláz

enyhe degradáció

1N NaOH, 25 °C

Nukleotid (monomer)

PO

O

HO Q

NN

N

N

NH2

Q=OH adenozin-5'-monofoszf átQ=H dezoxiadenozin-5'-monofoszf át

OH

OHO nukleáz

19

D-ribóz D-arabinóz D-xilóz D-lixóz

O Opirán furán

O O

tetrahidro-2H -pirán tetrahidrofurán

memo:

Ciklusos félacetál képződése, avagy hogyan rajzoljuk a furanózokat:

C

C C

C

CH2OH

H

OHOH

H

H

HO

O

nyílt láncú D-ribóz

1

23

4

5

C

C

CH

H

H OH

OH

OH

H

C O

HOCH2

CH

OH

H

OH

HHCC

C

O

-D-ribofuranóz -D-ribofuranóz

HC

C C

C

O

H

OHOH

H

H2COH

H

23

4

5 H

O

1H

1

23

4

5

OH

HOCH2

COH

H

H

OH

HHCC

C

O1

23

4

5

OH

A nyílt láncú D-fruktóz különbözö konformációi

CH2OH nyílt láncú D-ribóz

1

2

3

4

5

Nukleozidokban

mindig 5 tagú

(furanóz) gyűrű

formájában van

a ribóz vagy

dezoxi-ribóz

jelen.

Nukleinsav építőelemek; a D-ribóz

20

két heteroatomos hattagú gyűrűk (Bruckner. III/1 .)

Aromás vegyületek:

Nem aromás származékok

memo: gyenge bázisok: a piperazin 10%-os vizes

oldatának pH-ja 10.8-11.8.

Nukleinsav építőelemek; a heterociklus

21

Az uracil keto-enol tautomer egyensúlyi formái:

memo: csak a laktim-

laktám vagy a dilaktám

forma jöhet szóba, az N-

glikozid kötés miatt.

Pirimidinszármazékok, nukleinsav építőelemek; a barbitursav

fontosabb tautomerjei

22

N

N NH

N

OH

H2N

2-amino-6-hidroxi-purin

guanin

N

N NH

N

NH2

6-amino-purin

adenin

A guanin keto-enol tautomer egyensúlyi formái:

Melyik tautomer forma a stabilabb?

Nukleinsav építőelemek; purinszármazékok

23

HO

O

HO OH

N

NN

N

NH2

adenozin

9-(-D-ribofuranozil)-adenin op= 235oC

N

NN

N

NH2

O

OHOH

HH

HH

HO

N

NN

N

NH2

O

OHOH

HH

HH

OP-O

O-

O

N

NN

N

NH2

O

OHO

HH

HH

PO

O-

HO

O-adenozin-5'-foszfát5'-AMP

adenozin-3'-foszfát3'-AMP

adenozin

adenozid

HO

O

HO

N

NN

N

NH2

dezoxiadenozin

9-(2'-dezoxi--D-ribofuranozil)-adenin op= 190oC

N

NN

N

NH2

O

HOH

HH

HH

HO

N

NN

N

NH2

O

HOH

HH

HH

OP-O

O-

O

N

NN

N

NH2

O

HO

HH

HH

PO

O-

HO

O-dezoxiadenozin-5'-foszfát5'-dAMP

dezoxiadenozin-3'-foszfát3'-dAMP

dezoxiadenozin

dezoxiadenozid

DNS építőelem

RNS építőelem

24

HO

O

HO OH

N

NN

N

OH

guanozin

9-(-D-ribof uranozil)-guanin op= 240oC

N

NN

N

OH

O

OHOH

HH

HH

HO

N

NN

N

OH

O

OHOH

HH

HH

OP-O

O-

O

N

NN

N

OH

O

OHO

HH

HH

PO

O-

HO

O-guanozin-5'-foszfát5'-GMP

guanozin-3'-foszfát3'-GMP

guanozin

guanozid

NH2NH2

NH2NH2

HO

O

HO

N

NN

N

OH

dezoxiguanozin9-(2'-dezoxi--D-ribofuranozil)-guanin

N

NN

N

OH

O

HOH

HH

HH

HO

N

NN

N

OH

O

HOH

HH

HH

OP-O

O-

O

N

NN

N

OH

O

HO

HH

HH

PO

O-

HO

O-dezoxiguanozin-5'-foszfát5'-dGMP

dezoxiguanozin-3'-foszfát3'-dGMP

dezoxiguanozin

dezoxiguanozid

NH2 NH2

NH2 NH2

DNS építőelem

RNS építőelem

25

RNS építőelem H

OO

HO OHcitidin

3-(-D-ribof uranozil)-citozin op= 230oC

O

OHOH

HH

HH

HO

O

OHOH

HH

HH

OP-O

O-

O

O

OHO

HH

HH

PO

O-

HO

O-citidin-5'-foszfát5'-CMP

citidin-3'-foszfát3'-CMP

citidin

citidinf oszfátok

N

N

NH2

ON

N

NH2

O

N

N

NH2

O

N

N

NH2

O

HO

O

HO

dezoxicitidin3-(2'-dezoxi--D-ribofuranozil)-citozin

O

HOH

HH

HH

HO

O

HOH

HH

HH

OP-O

O-

O

O

HO

HH

HH

PO

O-

HO

O-dezoxicitidin-5'-foszfát5'-dCMP

dezoxicitidin-3'-foszfát3'-dCMP

dozoxicitidin

dezoxicitidinfoszfátok

N

N

NH2

O

N

N

NH2

O

N

N

NH2

O

N

N

NH2

O

DNS építőelem

26

HO

O

HO OH uridin

3-(-D-ribofuranozil)-uracil op= 165oC

O

OHOH

HH

HH

HO

O

OHOH

HH

HH

OP-O

O-

O

O

OHO

HH

HH

PO

O-

HO

O-uridin-5'-foszfát5'-UMP

uridin-3'-foszfát3'-UMP

uridinn

uridinnfoszfátok

N

N

OH

O

N

N

OH

O

N

N

OH

O

N

N

OH

O

HO

O

HO

timidin

3-(2'-dezoxi--D-ribofuranozil)-timin op= 183o

O

HOH

HH

HH

HO

O

HOH

HH

HH

OP-O

O-

O

O

HO

HH

HH

PO

O-

HO

O-timidin-5'-foszfát5'-TMP

timidin-3'-foszfát3'-TMP

timidin

timidinfoszfátok

N

N

OH

O

N

N

OH

O

N

N

OH

O

N

N

OH

O

H3C H3C

H3CH3C

RNS építőelem

DNS építőelem

27

Nem-RNS és -DNS alkotó purinszármazékok: A purin degradációs út: PNPáz:= Purin nukleozid foszforiláz

PNPáz

Adenozin

dezamináz

AMP →

GMP →

nu

kleo

tidáz

memo: purinvázas alkaloidok: di- és trimetil xantinok:

28

A DNS

kémiai szerkezete

Az RNS

kémiai szerkezete

foszforsavdiészter típusú,

nem-elágazó, lineáris polimer,

amit az 5’→3’ irányba írunk:

..-5’-C-G-T-A-3’-..

5’

3’

29

Erwin Chargaff 1905 - 2002

A Chargaff-szabály megadja a nukleotidok belső

arányait a DNS-ben:

Σ(pur.)/Σ(pir.) ≈ (G+A)/(C+T) ≈ 1

és A/T ≈ 1 és G/C ≈ 1 memo: (G+C)/(A+T) változik: ez adja a DNS

termostabilitását (lásd később)

C

P

G

P

T

P

A

P

C

P

A

P

T

P

G

P

3’

5’

3’

5’

30

A DNS jobbmenetes kettős hélix téralkatú, körülbelül 10 nukleotidpárral hélix menetenként. A

spirálokat H-hidak tartják össze, az egyik a kódoló a másik a templát szál. Az adenint és a

timint 2, míg a guanint és a citozint 3-H híd köti össze. Ezt a téralkatot először James Watson

and Francis Crick becsülték (határozták) meg helyesen 1953-ban Rosalind Franklin

diffrakciós méréseinek köszönhetően.

A DNS térszerkezete, a bázispárok

31

Wats

on

-Cri

ck p

árk

épzé

s H

oog

stee

n p

árk

épzé

s

G C A T

d+

d- parciális

töltés

színkódja: interface: kedvező elektrosztatikus kcs.

interface: kedvező elektrosztatikus kcs. interface: kedvezőtlen elektrosztatikus kcs.

A DNS térszerkezete, a bázispárok

32

Watson-Crick Hoogsteen

33

Watson-Crick Hoogsteen

34

G is C is amino-laktám forma A amino (aromás) míg T dilaktám forma

Francis Harry

Compton Crick

James Dewey

Watson

- a hidrofil és negatív töltésű

„foszfodezoxiribóz” gerinc

„kifelé” mutat

- a bázisok befelé állnak,

intermolekuláris H-hidakkal

stabilizáltak,

- a cukor-foszforsav diészter

gerinc teljesen konzervatív,

míg a heterociklusok

permutálódnak,

- a bázispárok miatt a DNS két

szála komplementer jellegű

- a heterociklusok pontos

szekvenciája hordozza az

információt.

A kettős hélix

(double helix, duplex)

1953

Watson-Crick párképzés: fontos, ez található elsősorban a duplexekben

Rosalind Franklin

krisztallográfia (1952)

DNS elektronsörűség-

eloszlása

35

Normális és „abnormális” bázispár képzés

-G-

-C-

-G- -G-

-C- -C-

-G- -G-

-C- -C-

-G-

-C-

-G*- -A-

-T- -T-

-G- -G-

-C- -C-

szülő gyerek unoka

mutáció

Mutáció I:

memo: ugyanúgy megvan a „3. H-híd” is, ám míg a normál esetben (felső) a purin bázis a 3. H-

hídban az akceptor, addig a mutációra vezető esetben ugyanitt a H-híd donor szerepét tölti be. A két

tautomer eltérő H-híd mintázatú, s ezért eltérő partnerrel (pirimidin bázissal) képez WC párt.

Replikáció #1 Replikáció #2

36

37

magyarázat:

mutáció

-A-

-T-

-A- -A-

-T- -T-

-A- -A-

-T- -T-

szülő gyerek unoka

-A-

-T-

-H*- -G-

-C- -C-

-A- -A-

-T- -T-

indukált mutáció:

memo: ugyanúgy megvan a 2.

H-híd, ám míg a normál

esetben (alsó) a purin bázis a

2. H-hídban donor, addig a

mutációra vezető esetben

(felső) az akceptor szerepét

tölti be. A két tautomer eltérő

H-híd mintázatú, s ezért

eltérő partnerrel (pirimidin

bázissal) képez WC párt.

Mutáció II: a kémiai reagensek kiváltotta mutációk:

Pl. salétromossav (NaNO2 + HCl)

38

A leggyakoribb forma a B-DNS, amely jobbmenetes, a két szál antiparallel elhelyezkedésű

nagyárok

kisárok

memo: Az A olyan mint a B-forma, csak „tömörebb”.

A

P

C

P

C

P

C

P

G

P

G

P

G

P

T

P 3’

5’

3’

5’

A DNS térszerkezete, a bázispárok

memo: Legtöbb DNS téralkata a B-forma amikor vízzel egyensúlyt tart a molekula.

Ha lecsökken a víz tenziója (pl. tömény NaCl oldattal tart egyensúlyt a DNS, s ezért kisebb

a tenzió), akkor megjelenhet az A-forma. Kérdés: mi lehet a helyzet a kromoszómába

becsomagolt DNS esetén?

39

jobbmenetes

hélix

balmenetes

hélix

jobbmenetes

hélix

Az A-DNS hélix

tömzsibb és rövidebb,

mint a B-DNS,

a főtengelyhez képest a

bázispárok síkja

döntött ( ┴ képest 19o).

R

HO H

H

O

O

C-3' a sík felettC-3' endo

R

H

O H

HO

O

C-2' a sík felettC-2' endo

Az Z-DNS hélix

karcsúbb,

főtengelyhez képest a

bázispárok síkja

döntött (┴ képest 9o).

Az B-DNS hélixben

a főtengelyhez

képest a bázispárok

síkja merőleges (┴

képest 1o).

40

A DNS 3 fő formájának szerkezeti jellemzői:

gemetriai jellemzők: A-DNS B-DNS Z-DNS

hélix típús jobbmenetes jobbmenetes balmenetes

ismétlödő egység 1 bp 1 bp 2 bp

bp-onkénti elcsvarodás 32.7° 35.9° 60°/2

1 menetre eső bp száma 11 10.5 12

főtengelytől vett „eltérés” +19° −1.2° −9°

emelkedés/bp 2.3 Å (0.23 nm) 3.32 Å (0.332 nm) 3.8 Å (0.38 nm)

menethossz 28.2 Å (2.82 nm) 33.2 Å (3.32 nm) 45.6 Å (4.56 nm)

átmérő 23 Å (2.3 nm) 20 Å (2.0 nm) 18 Å (1.8 nm)

Milyen hosszú az emberi

genom (kihúzva és

„egyesítve”)?

A teljes genom (44 +2

kromoszóma) összesen

mintegy 3,2 milliárd

bázispárból épül fel:

3,2 109 * 3.32 10-10 m =

1, 06 m

A kettős spirál szétválasztása

szuperspiralizációt indukál

41

N

N

O

OH3C

timinoxo-f orma

N

N

N

NN

adenin

H

H

H

ribóz

ribóz

N

N

O

N

citozinoxo-f orma

N

N

N

NO

N guaninoxo-f ormaH

H

H

H

H

ribóz

ribóz

Atkins de Paula 118

A DNS hőstabilitása / denaturálása

DNS termostabilitás

y = 39,7x + 324R2 = 0,996

y = 39,7x + 344R2 = 0,996

335

340

345

350

355

360

365

370

375

380

0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

GC- frakcióT

m (

K)

0 NaCl

150mM NaClLineáris (0 NaCl)

Lineáris (150mM NaCl)

megjegyzés:

- Minnél több a belső H-híd a DNS 2 szála között az

annál stabilabb dimert képez. (Fehérjék esetében ez nem

igaz, ott a belső H-hidakkal nem nő lineárisan a fehérje

termostabilitása!)

- A DNS Tm (60-80oC) pontja lényegesen magasabb mint

a testhőmérsékletünk, és jelentősen magasabb mint a

legtöbb fehérjénkké!

tétel: A DNS Tm pontja nő a GC frakció

növekedésével;

Tm1 < Tm

2 ha GC1/total<GC2/total! memo: mivel a GC-ben 3, míg az AT-párban csak 2

H-híd van bázispáronként.

kérdés: mennyi a Tm pont ha GC= 0,4?

válasz: Tm ≈ 340K (ha c(NaCl= 0))

kérdés: mennyi a Tm pont ha GC = 0,4, de teszünk

mellé NaCl?

válasz:Tm≈ 360 K (ha c(NaCl= 150 mMol))

kérdés: miért nő a Tm pont ugyanolyan GC

frakció mellett akkor, ha magasabb az oldat só

koncentrációja?

válasz: a DNS felszíni negatív töltései P-O–

kompenzálódnak.

memo:

- magas pH

- magas T (K)

A-T gazdag

régió

42

Nem-klasszikus DNS szerkezetek:

triplex DNS: háromszálú DNS

quadruplex DNS: négyszálú DNS

előfordul: pl. telomerek (kromoszómavégek)

4xG: négy guanidin helyezkedik el egy síkban,

egy kation + 4x 2 hidrogénhíd (a purinváz 7-es N-jével is) stabilizálja a szerkezetet.

43

Nukleinsavak:

1) A kromoszóma és felépítése

2) DNS- RNS építőelemek:

Nukleozidok, nukleotidok, nukleinsavak

Nem-RNS és -DNS alkotó purinszármazékok

A DNS térszerkezete, a bázispárok

3) DNS nanorendszerek

4) DNS (RNS) reaktivitása:

hidrolízise

az építőelemek kémiai szintézise

kémiai (szilárdfázisú) szintézis

enzimatikus szintézis: a replikáció

5) Transzkripció

6) Transzláció

7) DNS analitika: szekvenálás

8) Bioenergetika

44

3) DNS nanorendszerek I: Holliday-junction, H-elágazás

(„kocka csúcsa”) hogyan

csináljunk ilyen alakzatot?

5’

5’ 3’

3’ 5’

5’

3’

3’

5’

5’ 3’

3’

180°

5’

5’ 3’

3’

TCTGCACATA AGACGTGTAT

5’

5’

3’ 3

’

azonos

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

„helikáz”

„helikáz”

memo: a kétszálú hélix és a „kereszt

forma” egyensúlyban lehet, (DS!)

1) vegyünk egy tompa végű DNS kettős hélixet:

Holliday, R. (1964). A mechanism for

gene conversion in fungi.

Genetical Research, 5, 282–304.

45

2) A DNS két szála nem feltétlenül egyforma hosszú:

ilyenkor van túlnyúló szakasz

(3’ overhang, 5’ overhang):

Az ilyen DNS is továbbalakítható:

3) Készíthetünk olyan

DNS-t melynek

1) egy részében a két szál

egymásnak nem

komplementere, valamint

2) amelynek mindkét

oldalán van egy-egy

túlnyúló szakasz:

Az ilyen DNS is

továbbalakítható:

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

Az összes H-hidak száma:

CG =3

AT=2

4*(CG =3) → 12

6*(AT =2) → 12

10*(CG =3) → 30

10*(AT =2) → 20

46

4) Készítsünk olyan DNS szálakat, ahol a túlnyúló

szakaszok szekvenciáit alkalmasan választjuk meg:

4.1) barna-barna (a 8 H-híd összetartja majd a ligáz összeköti)

barna-hegyesvég

barna-tompavég

4.2) lila-lila (a 12 H-híd összetartja majd a ligáz összeköti)

4.3) fekete-fekete (a 10 H-híd összetartja,

ligáz összeköti)

47

5) Készítsünk ennek fényében olyan DNS

szálakat amelyek spontán módon, s a túlnyúló

szakaszaik révén egyértelműen asszociálódnak:

6) Készíthetünk ilyen módon kockát, vagy

komplexebb idomokat, minden csak tervezés

kérdése ezután? :

a) DNS nano-kocka, b) poliéder, c) csomó, stb.

N.C.Seeman,

MolBiotechnol, 2007,37,246-57

48

DNS nanorendszerek II:

T-elágazás („kocka csúcsa”)

TAGCAGTTCCTATGAG 5’ 3’

ACGACGTCAACTGCTA 5’ 3’

CTCATAGGGACGTCGT 5’ 3’

TAGCAGTT 5’

AACTGCTA 3’

CTCATAGGGACGTCGT 5’ 3’ CTCATAGGGACGTCGT

5’ 3’

TAGCAGTT 5’

AACTGCTA 3’

CTCATAGG 5’

3’

CCTATGAG

Összefoglalva:

49

50

1) Savas hidrolízis

az eredmény: „depurinálás” (A v. G)

DNS és RNS hidrolízise:

memo: az RNS és a DNS kb. egyforma

sebességgel hidrolízál savban

kérdés: a 2-deoxi D-ribóz félacetálja

savban felnyílik-e?

Ez nem

ribóz,

hanem

2-dezoxi-

D-ribóz!

51

memo: ezért az RNS kevésbé, míg a DNS jobban ellenáll a lúgos hidrolízisnek

eredmény: lánchasadás

2) Lúgos hidrolízis (az RNS lúgos hidrolízise):

memo: azért van DNS és nem csak RNS(?), mert az előbbi jobban ellenáll a lúgos

hidrolízisnek, azaz stabilabb!

Rib

52

DNS, RNS építőelemek kémiai szintézise:

1) Nukleozid szintézis I: a Hilbert-Johnson-nukleozid szintézis

T.B. Johnson, G. E. Hilbert, Science 69, 579 (1929)

G. E. Hilbert, T. B. Johnson, J. Am. Chem. soc. 52, 2001, 4489 (1930).

53

2) Nukleozid szintézis II: kapcsolás ribozilaminnal

A reakció javasolt mechanizmusa:

54

R

adenozin

N

N

N

N

NH2

OH OH

O

HON

N

N

N

Cl

R

N

N

N

N

S

R

N

N

N

N

H

H

NH3 H2SH2 / Ni

R: -D-ribofuranozil

3) Szubsztituált nukleozid (purin) származékok továbbalakítása:

55

P

H2C

H2C

O

Cl

dibenzil-foszfokloridát

4) Nukleotid szintézis: nukleozidok foszforilezése (pl. dibenzil-foszfokloridáttal)

N

N

N

N

SH

H

6-merkapto-purin

N

N

N

N

OH

Hallopurinol

N

N

N

N

O

H

H2N

O

OH

aciklovir

Orvosi alkalmazások:

Gyerekeknél akut leukémia

kezelésére

80%-os gyógyulás köszvény kezelésére

Herpes virus kezelésére

2 C-atom hiányzik a ribózból

Oligonukleotid szintézis:foszforamidit kapcsolási módszer

McBridge és Caruthers 1983.

1. Dmtr hasítás

(dimetoxi-tritil) 1.

2. Aktiválás és

kapcsolás

2.

4. Lánczárás

(az elreagálatlan

5’-OH-t acetilezzük)

3. Oxidálás I2

(H2O vagy THF) 4.

3.

57

Védőcsoportok I:

a bázisok védelme

„permanens”

csoportokkal

Cél: a primer aminok

védelme, avagy a

nukleofil csoportok

álcázása, hogy a

majdani kapcsolásnál

már csak a ribóz HO-5’

legyen csupán az

egyetlen Nu.

N

NN

N

HN

N

N

HN

N

N

HN

NH

NN

N

O

NH

C

O

C

O

RibRib

CCH3

O

vagy

A

C

G

T

Rib

Rib

C

O

N6-benzoilezés

N4-benzoilezés N4-acetilezés

N2-izobutiril

nem kell védeni

OO

N

N

O

Rib

O

CH3H

DNS kémiai (szilárdfázisú) szintézise: észter kötés(ek) kialakítása, SN foszfor centrumon

58

B

O

HO

HH

HH

PO

O

O

B

O

HO

HH

HH

CN

cianoetilészter

formában

CNE

Mindkét típusú permanens védőcsoport típus

(N-benzoil vagy N-acetil és a CNE) is eltávolítható: vizes NH3-val

memo: a szintézis végén az összes állandó védőcsoport

vizes ammóniával kvantitatíve eltávolítható

Védőcsoportok II:

a foszfodiészter védelme „permanens” csoporttal

59

B

O

HO

HH

HH

PO

O

O

OCN

OMeMeO

B

O

HO

HH

HH

PO

O

HO

OCN

MeO

OMe

narancs szín

CCl3-COOH

3%

CH2Cl2 +

(enyhén savas rendszer)

Dmtr

Védőcsoportok III: az 5’-OH csoport „ideiglenes” védelme

60

A szilárd hordozó:

CPG (controlled pore glass)

kontrolált pórusú üveg

-kémiailag inert

-nem duzzad

-amino funkcionalizált

SiCPG

OMe

OMe

(CH2)n NH2

A „linker”:

COOHH2C

H2C COOH

Pl. borostyánkősav Si(CH2)n

OMe

OMe

CPGN

H

C

O

CO

O

O

NH3 / H2O hasító hely

61

A DNS szintézis lépésről lépésre : -szilárdfázisú szintézis 3’-től 5’ irányba halad

a „Caruthers”-módszer

Si(CH2)n

OMe

OMe

CPGN

H

C

O

CO

O

HO

HH

HH

O B1Dmtr

Si(CH2)n

OMe

OMe

CPGN

H

C

O

CO

O

HO

HH

HH

O B1H

enyhe savas detritilezés (3% TCA)

1. Dmtr hasítás

(dimetoxi-tritil)

2. Aktiválás és

kapcsolás

memo: a bioszintézis menete

az 5’-től 3’ irányba halad

62

Si(CH2)n

OMe

OMe

CPGN

H

C

O

CO

O

HO

HH

HH

O B1H

SN (5' OH SN reakciója)

NP

O

O

HO

HH

HH

O B2Dmtr

CNE

foszforamidit

MeCN

NN

NN

H

tetrazol(gyenge sav)+

2. Aktiválás és

kapcsolás

63

3. Lánczárás (az elreagálatlan

5’-OH-t acetilezzük)

4. Oxidálás I2

(H2O vagy THF)

Ciklus végén NH4OH-val:

- minden permanens védőcsoport eltávolítása

- gyantáról való lehasítás

Legvégén: kromatográfiás tisztítás

64

Összefoglalás: oligonukleotidok laboratóriumi szintézisére

B2

O

O

HO

B1

O

O

OP

O

RO

CPG

B3

O

O

O

OP

ROB

2

O

O

B1

O

O

OP

O

RO

CPG

DMTr

B3

O

O

O

NiPr2

PRO

DMTr

tetrazol

1. lépés Kapcsolás

B1,B

2,B

3: védett bázisok

R:

-cianoetil

egy savra stabil, de bázisra érzékeny védõcsoport

CPG: "controlled pore glass" (porózus üveg)

N C CH2 CH2

O O

dimetoxitritil

egy savra érzékeny védõcsoport

DMTr :tetrazol:

N

N

N

N

H

H

Foszforamidit kapcsolási módszer

65

B3

O

O

O

OP

O

ROB

2

O

O

B1

O

O

OP

O

RO

CPG

B3

O

O

HO

OP

O

ROB

2

O

O

B1

O

O

OP

O

RO

CPG

DMTr

3. lépés Védõcsoport

eltávolítása

2. lépés Oxidáció

I2 HA

memo: A PCR-től eltérően a kémiai szintézis nem igényel „templátot”

66 Aldous Huxley Szép új világ

J. Craig Ven Science 2 July 2010:

Vol. 329 no. 5987 pp. 52-56

Creation of a Bacterial Cell Controlled by a Chemically Synthesized Genome

2003-ban még „csak” egy alig több mint 5000 bázispárt,

2010-ben már 1 millió bázispárt lehet szintetikusan „összerakni”!

„íme az első olyan élő szervezet amely atyja

egy számítógép, s amely megalkotása az

emberi elme és egynéhány robot műve volt”

http://www.youtube.com/watch?v=QHIocNOHd7A

A szintetikus biológia hajnala

67

A DNS enzimatikus szintézis: a replikáció

cél: a genetikai kód megkettőződése:

A kettős hélix az egyik pontján kitekeredik, majd a templátok

mentén a komplementer szálak megszintetizálódnak.

68

DNS polimeráz: 5’ => 3’ irányban szintetizálja az új láncot.

Leading strand = „vezető” szál, folyamatos szálszintézis

Lagging strand = „követő, sántikáló” szál, darabonkénti

szálszintézis, majd utólagos összekötés (DNS ligáz)

A DNS enzimatikus szintézis: a replikáció

69

1. ciklus

PCR vagy Polymerase Chain Reaction (magyar polimeráz láncreakció)

egyszerű és hatékony enzimatikus módszer a DNS-molekulák számának - adott

láncvégek (primerek ) közötti – növelésére. (VIDEO)

T=72°C: nukleotidok bekapcsolódnak,

majd a polimeráz enzim összeligálja

azokat egy-egy lánccá

memo: praktikus termostabil

polimerázt használni, ekkor nem kell

az enzimet ciklusonként pótolni

fütés T=95°C és alkalmas

2 primer hozzáadása

T=55°C: a primerek

helyrekerülnek

(letapadnak, annelláció)

A feladat: [ ]n

Kary B. Mullis

1993 Nobel-díj

70

fütés T=95°C és alkalmas

primerek hozzáadása

2. ciklus

T=55°C (helyre kerülnek

az új primerek)

T=72°C-on a nukleotidok

bekapcsolódnak, s a polimeráz

összeligálja az új szálakat

memo: 4 kópia van de ebből még mind csak közti termék, tehát egyik sem jó még!

71

3. ciklus végén 8 kópia van s ebből már 2 jó!

4. ciklus végén 16 kópia van, ebből 8 rossz, de 8 jó!

5. ciklus végén 32 kópia van, ebből 10 rossz, 22 jó!

6. ciklus végén 64 kópia van, ebből 12 rossz 52 jó!

10. ciklus végén 1024 kópia van, ebből 20 rossz, 1004 jó!

összes kópiák száma: 2n, ebből rossz 2n, jó (2n −2n)

Kary B. Mullis USA biokém.

1983-ban kifejleszti a PCR-t,

1993-ban megkapja a Nobel-d.

72

30. ciklus után

a helyes kópiák száma

(a várt termék) >1 milliárd

tehát: [ ]n>109 *30

Lényegében tiszta terméket kapunk, mert 2n << (2n −2n)

73

Nukleinsavak:

1) A kromoszóma és felépítése

2) DNS- RNS építőelemek:

Nukleozidok, nukleotidok, nukleinsavak

Nem-RNS és -DNS alkotó purinszármazékok

A DNS térszerkezete, a bázispárok

3) DNS nanorendszerek

4) DNS (RNS) reaktivitása:

hidrolízise

az építőelemek kémiai szintézise

kémiai (szilárdfázisú) szintézis

enzimatikus szintézis: a replikáció

5) Transzkripció

6) Transzláció

7) DNS analitika: szekvenálás

8) Bioenergetika

74

DNS

mRNS

fehérje

„átírás”, „másolás”

RNS polimeráz (enzim)

„fordítás”, „dekódolás”

riboszóma (ribozim)

5) Transzkripció A DNS-ről mint információhordozóról a gének leolvasása,

a hírvivő RNS szintézise:

(transzlokáció és

mRNS érés)

transzkripció

transzláció

A DNS-ről RNS-re átírás kezdete:

Folyamata:

a bioszintézis menete

az 5’-től 3’ irányba halad

RNA-Polimerase

Transzkripciós faktor

(fehérje complex)

75

Transzkripció lépései:

elongáció

terminálás

5’CATCCAATTGG 3’ kódoló DNS szál 5’CAUCCAAU3’ születő RNS szál 3’GTAGGTTAACC 5’ templát DNS szál

A transzkripció iránya

RNS polimeráz

iniciáció: promoter régió

76

Ribonukleinsav (RNS) és fehérjeszintézis

gén: olyan DNS szegmens amely tartalmazza mindazon információk összességét amely az adott

polipeptid vagy fehérje szintéziséhez szükséges. (pl. egy egyszerű bacilus DNS-e is legalább 3000

különböző enzimfehérjét kódol.)

A transzkipció folyamatának szereplői:

RNS-polimeráz: egy enzim amely széttekeri a DNS kettős spirált

Promoter: a DNS-nek az a része ahova az RNS-polimeráz kötődik és

ahol megkezdi a transzkripciót

RNS nukleotidok, mint építőelemek

Terminátor: prokarióták azon DNS része ami jelzi a transzkripció végét

Transzkripciós egység: az a DNS darab amely RNS-é átíródik.

Transzkripcós faktorok: az eukarióta sejtek azon fehérjéi amelyek az

RNS-polimeráz kötését, illetve a transzkripció megkezdését elősegítik.

Transzkripciós iniciációs komplex: a transzkripciós faktorok és a

promoter régióhoz kapcsolódó RNS-polimeráz II együttese.

TATA „box”: A DNS promoter része

77

A hírvivő-RNS (messenger-RNS, röviden mRNS) szintézise:

A

C

C

G

etc.

P

P

P

DNS

U

P

C

P

G

P

G

P

komple-

menter RNS

etc. U

G

G

C

P

P

P

komple-

menter RNS.

etc.

P

P

P

DNS

A

C

C

G

etc.

etc.

P

P

P

DNS

P

P

P

A

C

C

G

U

G

G

C

RN

S p

olim

erá

z

láncszétv

álá

s

dezoxiribóz: ribóz:

Transzkripció a sejtmagban történik, a szintetizálódott RNS-

nek van fehérjét kódoló (exon: „expressed sequence”) és nem-

kódoló része (intron: „intervening sequence”).

Az intron a pre-mRNS-be átíródik, majd az RNS érés során

kivágódik. A kész m-RNS elvándorol a citoplazmába ahol a

fehérjeszintézis templátjaként szerepel.

78

DNS:

- nem kódoló részek

- kódoló részek (gének) >>>>>> mRNS:

- nem kódoló részek (intron: „intervening sequence”)

- kódoló részek (exon: „expressed sequence”) >>>>>>> fehérje

fehérje

79

RNS fajták és funkciójuk:

kódoló RNS:

• mRNS: hírvivő (angol: messenger) RNS: DNS-ből másolt RNS, mely a genetikai

információt hordozza, és ezt a riboszómához szállítja, ahol a rajta lévő információ

alapján a fehérjék szintetizálódnak. Három egymás melletti bázis alkot egy-egy

kodon-t, amely egy-egy aminosavat kódol.

• pre-mRNS: éretlen mRNS. Az érés során a nem-kódoló részek (intronok)

kivágódnak, csak a kódoló részek (exonok) maradnak az érett mRNS-ben.

nem-kódoló RNS:

• tRNS: transzfer RNS: segít az mRNS-en található kód (kodon) leolvasásában.

Minden létező kodonhoz külön tRNS tartozik, mely a kodonnak megfelelő

aminosavat hordozza, és a riboszómához szállítja, majd ott részt vesz a

fehérjeszintézisben

• rRNS: riboszomális RNS: a riboszóma alkotóeleme, mely a fehérjeszintézis

katalitikus centrumát alkotja.

léteznek további nem-kódoló RNS-ek is, mint például:

• siRNS: (small interfering RNA): gének kikapcsolásáért felelős rövid RNS részek

(a DNS-hez kötődnek, és így meggátolják annak átíródását)

80

Az RNS térszerkezete: általában egyszálú, de Watson-Crick-féle párképzés a szálon belül,

azaz önmagával itt is kialakulhat:

tRNS térszerkezete

E.coli rRNS kis-

alegységének téralkata

egy „hairpin” RNS téralkat

81

Szállító RNS (transzfer RNS, tRNS)

feladata: hogy a megfelelő helyre eljuttassa az aminosavat

antikodon hurok

A tRNS aminosav

akceptor karja 3’

82

Szállító RNS (transzfer RNS, tRNS)

jellemzői:

- 70-90 nukleotidból áll,

- mindig a CCA- véghez kapcsolódik

észterkötéssel az aminosav (pl. Tyr),

- minden aminosavnak saját tRNS-e van, amelyen az

annak az aminosavnak megfelelő antikodon található

(egy aminosavhoz egy vagy akár több tRNS is tartozhat)

- például:

Met

UAC ….tRNS: antikodon (CAU)

AUG ….mRNS: kodon

83

As. m-RNS As. m-RNS As. m-RNS

5’→3’ 5’→3’ 5’→3’

Ala GCA His CAC Ser AGC

GCC CAU AGU

GCG Ile AUA UCA

GCU AUC UCG

Arg AGA AUU UCC

AGG Leu CUA UCU

CGA CUC Thr ACA

CGC CUG ACC

CGG CUU ACG

CGU UUA ACU

Asn AAC UUG Trp UGG

AAU Lys AAA Tyr UAC

Asp GAC AAG UAU

GAU Met AUG Val GUA

Cys UGC Phe UUU GUG

UGU UUC GUC

Gln CAA Pro CCA GUU

CAG CCC

Glu GAA CCG lánckezdő

GAG CCU fMet AUG

Gly GGA

GGC lánczárás UAA

GGG UAG

GGU UGA

A mRNS tripletjei a genetikai kód: egy aminosavhoz egynél több kodon

(egynél több antikodonnal ellátott t-RNS) tarozik:

antikodon

X

Y Z

kodon

84

Transzláció, az információ lefordítása “fehérje nyelvre”, mely lépés során

a citoszólban a ribószómán megtörténik a fehérjeszintézis.

A szintézis

- résztvevői: mRNS (kodon) + tRNS (antikodon + aminosav)

- helyszíne: a riboszóma

- eredménye: a fehérje

85

Összefoglaló: az információáramlás hierarchiája:

DNS kodon → mRNS kodon → tRNS antikodon→ aminosav 5’ACCTTTCTAAAG → ACCTTTCTAAAG

UGGAAAGAUUUC5’ → UGGAAAGAUUUC

5’ACCUUUCUAAAG ACCUUUCUAAAG

TrpLysAspPhe Kodon „táblázat” az mRNS tripletjeinek kódját rendeli az aminosavakhoz

86

50S 30S

S: (Svedberg egység)

centrifugálás során a

szedimentációs

sebesség

Prokarióta riboszóma térszerkezete a riboszóma egy RNS-fehérje komplex:

két alegység

funkciója: kisalegység: köti az m-RNS-t

nagy alegység: katalitikus aktivitás,

fehérje szintézis

mérete:

- prokarióta esetén 70S (30S és 50S), MW~ 2.6MDa,

- eukarióta esetén 80S (40S és 60S), MW~ 4MDa,

összetétele: RNS és 30-50 fehérje (L1,..L34)

szintézis sebessége: 15-40 amidkötés/sec

szintézis megbízhatósága: ~1 hiba/106 amidkötés

memo: nem a fehérjék hanem az RNS végzi a katalízist:

ezért a riboszóma nem enzim hanem ribozim.

87

Transzláció

1. lépés: (itt kezdődjön a transzláció) mindig az „AUG” mRNS triplet.

2. ide mindig az N-For-Met aminosav kerül

3. szintézis irány N-term.-től a C-term. felé

4. lánczáró kodonok az mRNS-en: UAA, UAG és UGA. („a mondat végi pontot jelölik”)

5. a szintézis legvégén a For-csoportot egy enzim lehidrolizálja .

88

89

90

A ribozim katalizálta peptidszintézis elemi kémiai lépései:

az 50S alegység 2486 adeninje segíti

a nukleofil addiciót :

1) Az adenin nemkötő

elektronpárjának protonvonzása

részlegesen deprotonálja az

aminocsoportot, ezzel fokozva

annak nukleofil jellegét.

2) A tertaéderes köztitermék

elbomlását a proton visszaadása

iniciálja, kialakítva így a

peptidkötést. (Science 289; 920-30, 2000)

91

Transzláció áttekintése:

92

Kérdés: mi a következő DNS templáthoz szekvenciához

tartozó fehérje aminosav-sorrendje?

DNS: 5’ – TGA TTC GTA TTG CTC GTG – 3’

memo1: Ügyeljünk tehát a bázissorrend irányultságára (5’→3’ ≠ 3’→5’)

memo2: minden enzim az 5’ oldal felől olvas!

DNS: 5’ – TGA TTC GTA TAG CTC GTG – 3’

mRNS:3’ – ACU AAG CAU AUC GAG CAC – 5’

Peptid: – Ser -Glu -Tyr - Leu - Glu - His –

– S - E - Y - L - E - H –

5’CATCCAATTGG 3’ kódoló DNS szál 5’CAUCCAAU3’ születő RNS szál 3’GTAGGTTAACC 5’ tempát DNS szál

A transzkripció iránya

DNS → mRNS

5’A…3’T → 5’U

T… A → A

G… C → C 3’C…5’G → 3’G

kérdés: helyes-e ez az átírás?

93 Nature 413, 814-821 (2001)

A Clindamycin az amidkötés

kialakítását gátolja meg a

ribószóma felületén erre a

helyre kötődve

Az Erythromycin A kölcsönhat az

50S (nagy alegység) 2058-as

Adeninjével, s igy beül és blokkolja

azt a csatornát amelyen keresztűl

bújik ki a fehérje. Meggátolja tehát a

bakteriális fehérje szintézisét és a

baktérium elpusztúl. A Eukarióták

riboszómájának 2058 nukleotidja

nem A hanem G, s ehhez nem köt az

antibiotikum, igy lesz szelektív a

hatás

Az antibiotikumok egy jelentős hányada a riboszómához kötve fejti ki szelektív hatását:

A tetraciklinek a 2. tRNS helyére ülnek be, s ezzel gátolják a fehérjeszintézist

94

Nukleinsavak:

1) A kromoszóma és felépítése

2) DNS- RNS építőelemek:

Nukleozidok, nukleotidok, nukleinsavak

Nem-RNS és -DNS alkotó purinszármazékok

A DNS térszerkezete, a bázispárok

3) DNS nanorendszerek

4) DNS (RNS) reaktivitása:

hidrolízise

az építőelemek kémiai szintézise

kémiai (szilárdfázisú) szintézis

enzimatikus szintézis: a replikáció

5) Transzkripció

6) Transzláció

7) DNS analitika: szekvenálás

8) Bioenergetika

95

cél egy DNS fragmens bázissorrendjének meghatározása:

megoldás: A lánczáró festékkel jelölt didezoxynukleotid (ddNTP) vagy

Sanger-féle módszer

7) DNS analitika: a szekvenálás

alapgondolata: a 3'-hidroxi-csoport hiánya megakadályozza a PCR-ezés

során a lánc továbbépülését: lánctörést okoz. Frederick

Sanger

Chain Termination Method

(Sanger, F., et al: PNAS, 1977,

74, 5463.)

3’C-G-A-A-T-A-T-G-C-G-A-G-T-C-T-G-G-C-A-A-C-T5’

A szekvenálandó (templát) DNS

amelyre mint templátra PCR –rel komplementer szálakat fogunk előállítani, de

szintézis során nem csak ATP, GTP, CTP és TTP használunk,

hanem ddATP, ddGTP, ddCTP és ddTTP-t is.

96

3’C-G-A-A-T-A-T-G-C-G-A-G-T-C-T-G-G-C-A-A-C-T5’

G-C-T-T-A-T-A-C-G-C-T-C-A-G-A

G-C-T-T-A-T-A-C-G-C-T-C

G-C-T-T-A-T-A-C-G-C-T-C-A-G-A-C-C-G-T

G-C-T

G-C-T-T-A

G-C-T-T-A-T-A-C

G-C-T-T-A-T-A-C-G-C-T-C-A-G-A-C-C-G

G-C

G-C-T-T

G-C-T-T-A-T-A-C-G-C

G-C-T-T-A-T-A-C-G-C-T-C-A-G-A

G-C-T-T-A-T-A-C-G-C-T-C-A-G-A-C

G-C-T-T-A-T-A-C-G-C

stb.

minden lehetséges fragmenst előállítunk

templát DNS és alatta a különböző PCR termék típusok:

agaróz gélen

(oszlopon)

megfuttatjuk,

amely méret

szerint szeparál,

s az oszlop alján

az éppen

„kifolyó”

fragmenst színe

alapján

azonosítjuk

G-C-T-T-A-T-A-C-G-C-T-C-A-G-A-C-C-G-T-T-G-A

bizonytalan szegmens

97

egy valódi szekvenálás végeredménye:

98

Elektromágneses energia forrása lehet hőerőgép és belsőégésű motor,

amelyekben a hőenergia égésből, azaz kémiai átalakulásból származik, ami

az atomok és molekulák elektronszerkezetéhez köthető átalakulás, azaz

elektromágneses folyamat. Az élőlények számára is kémiai folyamatok, azaz

az elektromágneses kölcsönhatás biztosítja az energiatárolást és

energiafelhasználást, tehát a biológiai energiák is elektromágneses

eredetűek.

Memo: Az energiaformákat vissza lehet vezetni a

fizika négy alapvető kölcsönhatásának

valamelyikére. A négy alapvető kölcsönhatás a

gravitációs, az elektromágneses, a gyenge és az

erős kölcsönhatás.

8) Bioenergetika

99

ATP: adenozin -5’- trifoszfát

DG~ –30.5 kJ mol-1

ATP + H2O → ADP + Pi ΔG˚ = −30.5 kJ/mol (−7.3 kcal/mol)

ATP + H2O → AMP + PPi ΔG˚ = −45.6 kJ/mol (−10.9 kcal/mol)

DG~ –45.6 kJ mol-1

foszfátészter foszforsavanhidrid

ATP is an unstable molecule in unbuffered water, which hydrolyses to ADP and phosphate. This is

because the strength of the bonds between the phosphate residues in ATP are less than the

strength of the "hydration" bonds between its products (ADP + phosphate), and water. Thus, if ATP

and ADP are in chemical equilibrium in water, almost all of the ATP will eventually be converted to

ADP. A system that is far from equilibrium contains Gibbs free energy, and is capable of doing work.

Living cells maintain the ratio of ATP to ADP at a point ten orders of magnitude from equilibrium,

with ATP concentrations a thousandfold higher than the concentration of ADP. This displacement

from equilibrium means that the hydrolysis of ATP in the cell releases a great amount of energy

Two phosphoanhydride bonds (those that connect adjacent phosphates) in an ATP molecule are

responsible for the high energy content of this molecule. In the context of biochemical reactions,

these anhydride bonds are frequently—and sometimes controversially—referred to as high-energy

bonds. Energy stored in ATP maybe released upon hydrolysis of the anhydride bonds. The bonds

formed after hydrolysis—or the phosphorylation of a residue by ATP—are lower in energy than the

phosphoanhydride bonds of ATP. During enzyme-catalyzed hydrolysis of ATP or phosphorylation by

ATP, the available free energy can be harnessed by a living system to do work.

Any unstable system of potentially reactive molecules could potentially serve as a way of storing

free energy, if the cell maintained their concentration far from the equilibrium point of the reaction.

However, as is the case with most polymeric biomolecules, the breakdown of RNA, DNA, and ATP

into simpler monomers is driven by both energy-release and entropy-increase considerations, in

both standard concentrations, and also those concentrations encountered within the cell.

8) Bioenergetika

100

ATP és GTP mint energiahordozók:

„elem” / „akkumulátor” (újrafeltölthető!)

(ATP) feltöltés:

direkt módon:

szubsztrát szintű foszforiláció:

a metabolizmus (ételek, raktározott zsírsavak,

egyéb anyagok lebontása) során az exoterm

ill. exergonikus reakciókban történő

ADP/GDP foszforilációja.

indirekt módon: oxidatív foszforiláció

a metabolizmus során redox-reakciókban

redukált koenzimek keletkeznek:

NADH+ és FADH2

Ezek a redukált koenzimek

elektrontranszporttal egybekötött,

szabályozott regenerálása (oxidációja) során

keletkezik ATP.

(ATP) felhasználás:

direkt módon: kapcsolt reakció

A sejtben igényelt anyagok szintézisében

az endoterm ill. endergonikus

reakciókhoz a kapcsolódó ATP/GTP

hidrolízis adja a megfelelő hajtóerőt a

reakció lefutásához.

pl.a felhasználásra:

- transzláció (fehérjeszintézis)

- kreatin (energiaraktár az

izomban)

- …

8) Bioenergetika

101

kérdés: mennyi glükóz elégetése teszi lehetővé egy 30 g össztömegű madár számára,

hogy 10 m magasra repüljön?

válasz: az elvégezendő munka nagysága mgh= (30*10-3 kg)* (9,81*ms-2)* (10 m) = 2,943 kg m2s-2 = 2,943 J

mivel 1 mol glükóz → DG ~ 2,828 106 J munka végzéséhez elegendő,

2,943 J munka elvégzéséhez 2,943 / 2,828 106 mol glükózra van szükség,

ami 1,04 μmol cukrot jelent.

Mivel a glükóz MW-je ~180 g/mol ezért ez hozzávetőlegesen (180 g/mol * 1,04*10-6 mol) = 0,19 mg

Atkins & de Paula 99

kérdés: a koncentráló emberi agy ~25 J energiát igényel másodpercenként. Mennyi cukor

(glükóz) elégetése szükséges ehhez óránként?

tapasztalat: 1 mol glükóz oxidációja 25 °C-on ~ 2828 kJ szabadentalpia (DG) felszabadulását eredményezi.

válasz: az elvégezendő munka nagysága óránként = (25 Js-1)* (3,6*103s) = 90000 J = 90 kJ

mivel 1 mol glükóz → DG ~ 2,828 10-3 kJ munka végzéséhez elegendő,

90 kJ munka elvégzéséhez 90 / 2,828 10-3 mol glükózra van szükség,

ami 32 mmol glükózt jelent.

Mivel a glükóz MW-je ~180g mol-1 ezért ez hozzávetőlegesen (180 * 32*10-3 g ) = 5,7 g/óra

Tehát az emberi agy naponta ~ 24 * 5,7g ~140g glükózt igényel.

tapasztalat: 1 mol szilárd glükóz CO2 gázzá és folyékony vízzé való oxidációja 25 °C-on

~ 2828 kJ (2,8 E6 J) szabadentalpia (DG) felszabadulást eredményez.

8) Bioenergetika

102

A napi 140 – 160 g glükóz többsége ATP-vé alakul és így hasznosul a sejtekben.

Aerob körülmények között 1 mol glükóz mintegy 38 mol ATP eredményez.

mivel Mw(ATP)/ Mw(glükóz) ≈ 507/180 = 2,82 ezért 2,82 * 38 * 160g ≈ 17,1 kg ATP

Ténylegesen egy 70 kg-os ember napi ATP „fogyasztása” ~ 145 kg

(mivel nem csak szénhidrátot, de zsírt és fehérjét is fogyasztunk!)

Ám a szervezetben egyszerre kb. 51 g össz ATP áll rendelkezésre,

ami a teljes szükséglet (51 g /1,45 105 g) kb. 0,035% -a.

Ez az tartalékolt ATP mennyiség tehát kb. (24* 3600s) * (3,5 10-4) ~ 30 s-ra elegendő mindössze!

Tehát az ember ATP szükséglete ~ 100g / perc (aktív mozgás esetén 500g /perc)

ADP/ATP ciklus (a foszforiltranszfer)

A kémiai reakció:

A biokémiai rész ciklus:

ATP4–(aq) + H2O → ADP2– (aq) +HPO42–(aq) DG~ –30 kJ mol-1

½ O2 H2O

– DG

ADP2– + HPO42– ATP4–

103

A teljes biokémiai ciklus:

foszforilátvitel

elektronátvitel

NAD+ (Nikotinamid-adenin-dinukleotid)

FAD (Flavin-adenin-dinukleotid)

½ O2 H2O

– DG

ADP2– + HPO42– ATP4–

– DG

NADH + H+ NAD+

FADH2 FAD

CO2 „C” +2H2O

+ DG

+ DG

– DG

memo: a félkövér résztvevők

(„C”, NADH+H+, FADH2, ATP)

azok a nagyobb energiájú

molekulák a megfelelő párokban.

memo: A negatív DG-s reakciók

hajtják a velük összekapcsolt

(„csatolt”) pozitív DG-s (piros

nyíl) reakciókat.

Tűz, ami melegíti a

levest csatolt

rendszert képeznek

a levegőn keresztül.

”égetés”

104

Néhány fontosabb foszfátvegyület

foszfátcsoport(jai) hidrolízisének DG- értékei

37 oC-on:

foszfoenol-piruvát DG~ –62 kJ mol-1

ATP → ADP DG~ –31 kJ mol-1

ADP → AMP DG~ –28 kJ mol-1

AMP DG~ –14 kJ mol-1

glükóz-1-foszfát DG~ –21 kJ mol-1

glükóz-6-foszfát DG~ –14 kJ mol-1

fruktóz-6-foszfát DG~ –16 kJ mol-1

memo:

kérdés: mit takar az ATP DG~ –31 kJ mol-1?

A hidrolízis exergonikus DG< 0 és éppen 31 kJ mol-1 energiát ad más csatolt ,

esetleg endergonikus reakciók lefolytatásához. Ezért hívjuk a megfelelő

savanhidrid kötést „nagyenergiájú” kötésnek.

memo: vegyük észre hogy az ATP „középen” helyezkedik el, ezért lehet foszfát

donor és akceptor is.

105

Az ATP hidrolízise felhasználható olyan csatolt endergonikus reakciókhoz, amelyek DG-je nem

nagyobb mint +31 kJ mol-1 .

pl. a peptidkötés szintézise erősen endergonikus:

DG~ +17 kJ mol-1

memo: az 1 mol víz a hidrát burok része, mivel a

reakció nem vákuumban megy. Innen a nagy entrópia

csökkenés (2-ből 1-re), a komplexitás növekedés.

DG ezért is ilyen kedvezőtlen.

memo: nem csak az entalpiaváltozás, de a szint entrópia csökkenése (komplexitás növekedése) is jelentős!

kérdés: hogy mehet végbe a reakció 37 oC-on?

válasz: ATP csatolt a reakció.

memo: a csatolt rendszer értelmében a két reakció össze van kapcsolva! (Ha a két reakció elkülönítve (2

edényben) megy végbe, vagy ha csak úgy összeöntjük a reagenseket, akkor a folyamat nem fog

végbemenni.)

memo: az 1 mol víz a hidrát burok része, mivel a reakció nem vákuumban megy. Innen a

formális mólszám növekedés (1-ből 2-re), emiatt van az entrópia növekedés, avagy a

komplexitás csökkenése is, ami egy további kedvező komponens.

A DG értéke (–31 kJ mol-1) ezért is ilyen kedvező.

ATP4–(aq) + H2O → ADP2– (aq) +HPO42–(aq)

tény: az ATP DG~ –31 kJ mol-1 valamint a DH~ –20 kJ mol-1 és DS~ +34 JK-1mol-1

TDS~ 310 K *34 JK-1mol-1~ +11 kJ mol-1 ) memo: mivel DG = DH – TDS

106

megfigyelés: Itt nem részletezett okok miatt 1 peptidkötés kialakításához 3 ATP szükséges.

kérdés: hány gramm glükóz kell 1 mol mioglobin bioszintéziséhez, ha az 153 aminosavból épül fel?

válasz: 153*3 = 459 ATP szükséges. 1 mol glükóz 38 ATP eredményez,

tehát 459/38~ 12 mol glükóz szükséges.

tehát: (12*180 g)~ 2,2 kg cukor kell 1 mol (16,7 kDa) fehérje szintéziséhez (~16,7 kg)

107

How to safely store genetic material:

cable reels in the cell nucleus...

Legend: The nucleosome

Nucleosomes are cable reels for genetic material. In the cell’s nucleus, the genetic

material (DNA) is organized in different chromosomes and protectively packaged. In

this storage packing, the DNA is wound around nucleosomes, just as a cable on a reel.

Each nucleosome consists of four pairs of proteins called histones. Apart from their

role as cable reels, nucleosomes are also involved in gene regulation as they prevent

DNA from being read at wrong positions.

Érdekes nano-rendszerek

108

I am not giving away the original data!

A copy is good enough...

Legend: RNA polymerase

RNA polymerase is essential for each cell. This protein reads the genetic code from the

genetic material in the cell nucleus and copies it onto so-called mRNA molecules. These

copies are then shipped to the ribosomes where they serve as blueprints for proteins.

Thus, the precious original always stays in the vault of the nucleus, and only copies are

shipped. Because RNA polymerase is so important, its function is constantly monitored

and controlled by a multitude of other molecules.

Érdekes nano-rendszerek

109

DNA is long…

where does a gene begin and how to find it?

Legend: The TATA-box binding protein (TBP) in yellow

The repetition of the amino acids threonine (T) and alanine (A) T-A-T-A marks the beginning

of a gene. The TATA-box binding protein (TBP) recognizes this specific genetic start

sequence and allows correct positioning of RNA polymerase. Without TBP, genes could not

be copied to mRNA and would, hence, not be read out. If the tail of TBP is too long, it causes

some of the most severe neurodegenerative diseases

Érdekes nano-rendszerek

110

Replikáció

Szemidiszkontinuus Azaz a DNS megkettőződése mindkét fonal mellett, ugyanabba az irányba történik

Ez azt feltételezi, hogy a replikációs mechanizmus mind 5’->3’ , mind 3’->5’

irányban képes DNS-t szintetizálni

De a DNS-polimeráz csak 5’->3’ irányban képes haladni, vagyis elsőként az 5’

helyen levő nukleotidot építi be, majd 3’ irányba folytatja a láncot

Vezető szál: folyamatosan szintetizálódik

Követő szál: szakaszosan szintetizálódik (Okazaki-fragmentumok)

Itt a szintézis iránya ellentétes a replikációs villa mozgásának irányával

A követő szál a villától távolodva szintetizálódhat

Ismétlés

111

Transzkripció

Iniciáció Az RNS polimeráz felismeri a DNS promoter szakaszát, hozzákötődve szétválaszt

12bp-nyi szakaszt, és megkezdi az RNS szál felépítését: ATP, UTP, GTP, CTP

Elongáció Az RNS-polimeráz 5’->3’ irányban építi be a ribonuleotidokat, működése során a

DNS-lánc mentén mozog

Termináció

A terminátor szakaszok lényegében lazítják a DNS és RNS közötti kapcsolatot

memo: a folyamat aszimmetrikus: csak az egyik szál másolódik,

a DNS két szála csak rövid ideig távolodik el egymástól

Ismétlés

112

Transzláció

Iniciáció Egy riboszóma, amelyik már befejezte egy másik mRNS transzlációját, alegységeire

disszociál (IF-3)

IF-3 kötődik 30S-hez és egy új RNS-hez

IF-2 hozzákapcsolja 30S-hez az első aminoacil-tRNS-t

Ehhez az iniciációs komplexhez kötődik GTP, majd 30S, ezután IF-3 leválik

GTP -> GDP: IF-2 is leválik

Ismétlés

113

Elongáció A transzláció iránya = transzkripció iránya = 5’ -> 3’

Az aa-tRNS minőségét az mRNS második kodonja határozza meg, amely az üres

A-helyen van (Katalizátor: EF-Tu, Energia: GTP

A peptidil transzferáz az fMet-t a P-helyen levő tRNS-ről az A-helyen levő aa-tRNS-re

kapcsolja, így egy dipeptid alakul ki az A hely tRNS-én

A transzlokáció során az mRNS az A-helyre kapcsolódó peptidil-tRNS-sel együtt egy

kodonnal továbblép balra (EF-G)

A P-helyen levő dezacilált tRNS leválik a riboszómáról

Az A-helyen levő dipeptidil-tRNS az A-helyre lép

A következő kodon az A-helyre kerül

Transzláció Ismétlés

114

Transzláció

Termináció RF-1 és RF-2 ismeri fel a STOP kodonokat

RF-3-mal és GTP-vel leállítják a transzlációt

Ismétlés